説明

ペグ化持続型インスリン

ペグ化持続型インスリンは、ヒトインスリンと比較して、Ａ１、Ｂ１、Ａ２１及び／又はＢ３０位から伸長した一又は複数の伸長部を有するインスリンであり、該伸長部はアミノ酸残基からなり、ＰＥＧ部分が、リンカーを介して、伸長部中の一又は複数のアミノ酸残基に結合している。ＰＥＧはポリエチレングリコールである。このようなペグ化持続型インスリンは、レギュラーインスリンよりも高い生物学的利用能と、より長時間の作用プロファイルを有し、特に肺投与に適しており、糖尿病の治療に簡便に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン活性を有し、糖尿病の治療に使用できるペグ化持続型インスリンに関する。ペグ化持続型インスリンは、レギュラーインスリンよりも高い生物学的利用能と、長時間の作用プロファイルを有し、特に肺投与に適している。また、それらは、高い物理的安定性と低いフィブリル化傾向を有し、中性ｐＨで可溶性である。またこの発明は、ペグ化持続型インスリンを含む薬学的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリン分子が遺伝物理的及び化学的に安定していることは、真性糖尿病のインスリン療法にとっての基本条件である。これらの基本的特性は、インスリンの製剤化及びインスリン投与方法、並びに薬学的製剤の有効期間及び保存条件にとっては基本的なことである。インスリンの投与において溶液を使用すると、分子を様々な組合せ要因、例えば高温、様々な気液固境界相、並びに剪断力にさらし、フィブリル化等の不可逆的な高次構造変化を生じるおそれがある。
残念なことに、多くの糖尿病患者は、グルコースレベルの密なコントロールを維持するために必要とされる多くの注射に伴う不快のために集中的な治療を受けるのを嫌がる。この種の治療は精神的痛み及び肉体的痛みの双方を伴いうる。経口投与では、インスリンは胃腸管で急速に分解され、血流中に吸収されない。よって、多くの研究者は、インスリン投与の代替経路、例えば経口、直腸、経皮、及び経鼻経路について研究している。しかしながら、今までのところ、これらの投与経路では、インスリンを効果的に吸収する結果には至っていない。
【０００３】
タンパク質の効果的な肺送達は、深部肺胞上皮にタンパク質を送達する能力に依存する。上気道上皮に付着されるタンパク質は有意な度合いでは吸収されない。これは、約３０〜４０μｍ厚で、吸収に対する障壁として作用する、上部を覆っている粘液のためである。さらに、この上皮に付着したタンパク質は、粘液線毛輸送により気道までに除去され、ついで胃腸管を経由して排除される。また、このメカニズムは、ある種のタンパク質粒子が低吸収であることの実質的な一因となっている。タンパク質が吸収されないで、代わりにこれらの経路により排除される度合いは、その溶解度、そのサイズ、並びに他のあまり理解されていない特徴に依存する。
【０００４】
しかしながら、ペプチドの性質を、それに有機鎖様分子をグラフトすることにより高めることができることはよく認識されている。かかるグラフト化により、薬学的特性、例えば血清中の半減期、タンパク質分解に対する安定性、及び免疫原性の低下を改善することができる。
性質を高めるためにしばしば使用される有機鎖様分子は、ポリエチレングリコールベース鎖、すなわち繰り返し単位-ＣＨ２ＣＨ２Ｏ-をベースにした鎖である。以下、「ＰＥＧ」なる略語をポリエチレングリコールに使用する。
【０００５】
古典的なＰＥＧ技術は、ポリペプチドに可溶性有機分子を付着させることにより、増加したサイズ(ストーク半径)のポリペプチドが提供されることを利用している(Kochendoerfer, Gら, Science (299) 884 以下参照, 2003)。この技術により、天然ペプチドと比較して、ホルモンポリペプチドのヒト及び動物におけるクリアランスの低減に至る。しかしながら、この技術は、この技術を施したホルモンポリペプチドの作用強度の低下によってしばしば妨げられる(Hinds, Kら, Bioconjugate Chem. (11), 195-201, 2000)。
ポリエチレングリコールを含む非天然の親水性ポリマーの一又は複数の分子に、共有的に結合させた二本鎖インスリンコンジュゲートを含有する肺投与用のインスリン組成物とその調製方法は、国際公開第02/094200号及び国際公開第03/022996号に開示されている。
【発明の目的】
【０００６】
現在までに知られているインスリン誘導体よりもさらに長時間の作用プロファイルを有し、同時に生理学的ｐＨで可溶性であり、ヒトインスリンに匹敵する作用強度を有するインスリンが必要とされている。さらに、肺投与に十分に適したインスリン製剤が必要とされている。
【０００７】
この発明の態様は、糖尿病患者を治療するために、肺に簡便に投与することができる薬剤の提供を取り扱う。
この発明の他の態様は、糖尿病患者を治療し、糖尿病にしばしば伴う後期合併症のいくらかの又は全ての危険性を低減するために、肺に簡便に投与することができる薬剤の提供を取り扱う。
この発明の他の態様は、糖尿病患者を治療するために、肺に簡便に投与することができ、注射を使用する多くの患者が使用するのにさらに便利な薬剤の提供を取り扱う。
【０００８】
この発明の他の態様は、糖尿病患者を治療するために、肺に簡便に投与することができ、十分な化学的安定性を有する薬剤の提供を取り扱う。
この発明の他の態様は、糖尿病患者を治療するために、肺に簡便に投与することができ、十分な物理的安定性を有する薬剤の提供を取り扱う。
この発明の他の態様は、十分に高いインスリンレセプター親和性を有する薬剤の提供を取り扱う。
この発明の目的は、従来技術の不具合の少なくとも一を克服又は改善するか、又は有用な代替法を提供することである。
【０００９】
(定義)
インスリンは、膵臓のβ-細胞から分泌されるポリペプチドホルモンであり、２つの鎖間ジスルフィド架橋によって互いに結合されたＡ鎖及びＢ鎖と命名された二つのポリペプチド鎖からなる。該ホルモンは、次の立体配置：プレペプチドＢ-Ａｒｇ-Ａｒｇ-Ｃ-Ｌｙｓ-Ａｒｇ-Ａ（ここで、Ｃは３１のアミノ酸の連結ペプチドであり、Ａ及びＢは、それぞれインスリンのＡ及びＢ鎖である）において、２４のアミノ酸のプレペプチドに８６のアミノ酸を含むプロインスリンが続いてなる単鎖前駆体プロインスリン(プレプロインスリン)として合成される。 Ａｒｇ-Ａｒｇ及びＬｙｓ-Ａｒｇは、Ａ鎖及びＢ鎖間の連結ペプチドを切断するための切断部位であり、二本鎖インスリン分子が形成される。インスリンは正常な代謝調節の維持に必須である。
【００１０】
ここで、インスリンなる用語は、天然に生じるインスリン、例えばヒトインスリン、並びにそのインスリンアナログを包含する。
ここで、アミノ酸残基なる用語は、水素原子がアミノ基から除去された、及び／又はヒドロキシ基がカルボキシ基から除去された、及び／又は水素原子がメルカプト基から除去されたアミノ酸を包含する。不正確であるが、アミノ酸残基はアミノ酸とも表示されうる。
ここで、インスリンアナログなる用語は、天然インスリン中に生じる一又は複数のアミノ酸残基を欠失及び／又は置換する(置き換える)ことにより、及び／又は一又は複数のアミノ酸残基を付加することにより、例えばヒトインスリン等の天然に生じるインスリンの構造体から形式上誘導可能な分子構造体を有するポリペプチドを包含する。付加及び／又は置換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じるアミノ酸残基又は純粋に合成されたアミノ酸残基のいずれかとすることができる。
【００１１】
ここで、持続型インスリンなる用語は、インスリンのＡ鎖又はＢ鎖に、Ｃ又はＮ末端のいずれかに、一又は複数のアミノ酸残基が付加された(ヒトインスリンと比較)インスリンアナログを包含する。例えば、Ａ鎖はそのＣ末端が、例えば１、２、３又は４のアミノ酸残基(ヒトインスリンと比較)だけ伸長していてもよく、伸長部は、それぞれＡ２２、Ａ２３、Ａ２４及びＡ２５と示される。例えば、Ａ２３位にあるアミノ酸残基がペグ化されている場合、Ａ２２位にあるアミノ酸は、Ｃｙｓ及びＬｙｓを除く任意のアミノ酸等であってよい。例えば、Ａ鎖は、そのＮ末端で、例えば１、２、３又は４のアミノ酸残基(ヒトインスリンと比較)だけ伸長していてもよく、伸長部は、それぞれＡ-１、Ａ-２、Ａ-３及びＡ-４と示される。例えば、Ａ-２位にあるアミノ酸残基がペグ化されている場合、Ａ-１位にあるアミノ酸は、Ｃｙｓ及びＬｙｓを除く任意のアミノ酸残基でありうる。持続型インスリンは４つの末端の一つに伸長部を有しているが、該持続型インスリンの他に位置に欠失があってもよい。ヒトインスリンの場合と同様に、持続型インスリンは２つの鎖、すなわちＡ鎖及びＢ鎖からなる。持続型インスリンには６つのシステイン残基が存在し、そのうちの２つ(ヒトインスリンのＡ６及びＡ１１に対応)は鎖間ジスルフィド架橋を形成するＡ鎖に存在し、そのうちの４つ(ヒトインスリンのＡ７、Ａ２０、Ｂ７及びＢ１９位に対応)は２つの鎖間ジスルフィド架橋を形成する。ここで、最後に述べた４つのシステイン残基は、鎖間システイン残基と命名される。各鎖(Ａ及びＢ鎖)において、鎖間システイン残基の一方は、各鎖のＮ末端に最も近接しており、他方の鎖間システイン残基は各鎖のＣ末端に最も近接しており、ここでこのような鎖間システイン残基は、それぞれＮ末端鎖間システイン残基及びＣ末端鎖間システイン残基と命名される。インスリンアナログが持続型インスリンであるかどうかを決定する場合、Ｎ末端鎖間システイン残基のＮ末端側における各鎖に存在するアミノ酸残基の数を計数し、Ｃ末端鎖間システイン残基のＣ末端側における各鎖に存在するアミノ酸残基の数を計数しなければならない。これらの数(数字)の一つがヒトインスリンの対応する数よりも大きいならば、そのインスリンは持続型インスリンであると考えられる。ヒトインスリンでは、６個のアミノ酸残基がＡ鎖のＮ末端鎖間システイン残基のＮ末端側に存在し、一つのアミノ酸がＡ鎖のＣ末端鎖間システイン残基のＣ末端側に存在し、６つのアミノ酸残基がＢ鎖のＮ末端鎖間システイン残基のＮ末端側に存在し、１１のアミノ酸残基がＢ鎖のＣ末端鎖間システイン残基のＣ末端側に存在している。
【００１２】
ここで、親インスリンなる用語は、ＰＥＧ部分が付加されていない持続型インスリンを意味する。
ここで、変異なる用語は、アミノ酸配列における任意の変化を包含する(コード可能アミノ酸の挿入及び置換、並びに欠失)。
ここで、ヒトインスリンのＡ鎖のアナログ及びＢ鎖のアナログなる用語は、それぞれ、ヒトインスリンのＡ及びＢ鎖に対して、Ａ及びＢアミノ酸の一又は複数の置換、欠失及び／又は伸長(付加)を有するヒトインスリンのＡ鎖及びＢ鎖を包含する。
【００１３】
ここで、Ａ１、Ａ２、Ａ３等の用語は、それぞれ(Ｎ末端から数えて)インスリンのＡ鎖の位置１、２及び３を示す。同様に、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３等の用語は、それぞれ(Ｎ末端から数えて)インスリンのＢ鎖の位置１、２及び３を示す。アミノ酸に対する１文字コードを使用すると、Ａ２１Ａ、Ａ２１Ｇ及びＡ２１Ｑ等の用語は、Ａ２１位にあるアミノ酸が、それぞれＡ、Ｇ及びＱであることを示す。アミノ酸に対する３文字コードを使用すると、対応する表現は、それぞれＡｌａＡ２１、ＧｌｙＡ２１及びＧｌｎＡ２１となる。
ここで、Ａ-１、Ｂ-１等の用語は、Ａ１及びＢ１位に対し、それぞれＮ末端の第１アミノ酸の位置を示す。
ここで、ｄｅｓＢ２９及びｄｅｓＢ３０等の用語は、それぞれＢ２９又はＢ３０アミノ酸残基を欠くインスリンアナログを示す。
【００１４】
ここで、単鎖インスリンなる用語は、Ａがヒトインスリン又はそのアナログのＡ鎖であり、Ｂがヒトインスリン又はそのアナログのＢ鎖であり、Ｃが結合又はいわゆる連結ペプチド、Ａ鎖のＮ末端アミノ酸残基、例えばＡ１に、Ｂ鎖のＣ末端アミノ酸残基、例えばＢ３０を連結する約１−３５のアミノ酸残基のペプチド鎖である、一般構造Ｂ-Ｃ-Ａのポリペプチド配列を包含する。Ｂ鎖がｄｅｓＢ３０鎖である場合、連結ペプチド(Ｃ)はＢ２９をＡ１と連結する。単鎖インスリンは、ＣｙｓＡ７とＣｙｓＢ７の間及びＣｙｓＡ２０とＣｙｓＢ１９の間、及びＣｙｓＡ６とＣｙｓＡ１１の間に、ヒトインスリンにおけるように正しく位置決めされた３つのジスルフィド架橋を含む。
【００１５】
連結ペプチドなる用語は、インスリンにおいてＡ鎖のＮ末端アミノ酸残基にＢ鎖のＣ末端アミノ酸残基を連結させることができるペプチド鎖を包含する。ここで、表現Ｂ'Ａは、連結ペプチドがアミノ酸からなるものではく単に結合である、すなわちＢ鎖Ｃ末端とＡ鎖Ｎ末端の間の結合である単鎖インスリンを意味する。
速効型インスリンとは、通常の又はレギュラーのヒトインスリンよりも作用発現が速いインスリンを意味する。
長時間作用するインスリンとは、通常の又はレギュラーのヒトインスリンよりも作用の持続期間が長いインスリンを意味する。
インスリンアナログ、持続型インスリン、及びＡ及びＢ鎖における位置の番号付けは、親化合物がそのために使用される番号を有するヒトインスリンであるようになされる。
ここで使用される基礎インスリン(ベイサルインスリン)なる用語は、８時間を超え、特に少なくとも９時間の作用時間を有するインスリンペプチドを意味する。好ましくは、基礎インスリンは少なくとも１０時間の作用時間を有する。基礎インスリンはよって約８〜２４時間の範囲、好ましくは約９〜約１５時間の範囲の作用時間を有しうる。
【００１６】
ここで、リンカーなる用語は、ＰＥＧ部分の-Ｏ-基に持続型インスリンの-ＮＨ-基を連結した化学部分を包含する。該リンカーは、最終のペグ化持続型インスリンの所望される作用に何の影響も与えないものであり、特に何らの悪影響も持たないものである。
ここで使用される場合、「ＰＥＧ」又はポリエチレングリコールとは、任意の水溶性ポリ(エチレングリコール)又はポリ(エチレンオキシド)を意味する。ＰＥＧなる表現は-（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ-なる構造を含み、ここでｎは２から約１０００の整数である。よく使用されるＰＥＧは、ＰＥＧ末端の一端が比較的不活性な基、例えばアルコキシで末端キャップされる一方、他端はリンカー部分でさらに修飾されていてもよいヒドロキシル基である末端キャップＰＥＧである。しばしば使用されるキャップ基はメトキシであり、対応する末端キャップＰＥＧはしばしばmＰＥＧと標記される。よって、ｍＰＥＧはＣＨ３Ｏ(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ-であり、ここで、ｎは、全ＰＥＧ部分に対して示される平均分子量を付与するのに十分な２から約１０００の整数であり、例えばｍＰＥＧがＭｗ２０００の場合、ｎは約４４(バッチ間変動を受けた数)である。ＰＥＧなる標記はしばしばｍＰＥＧの代わりに使用される。「ＰＥＧ」に続く数字(下付き文字ではない)は、その数字と等しいおおよその分子量を有するＰＥＧ部分を示す。よって、「ＰＥＧ２０００」とは、２０００のおおよその分子量を有するＰＥＧ部分である。
【００１７】
この発明の特定のＰＥＧは、分枝状、直鎖状、フォーク状、ダンベル状ＰＥＧ等であり、ＰＥＧ基は、典型的には約１．０５未満の低い多分散度を有する多分散系である。持続型インスリン中に存在するＰＥＧ部分は、与えられた分子量によって、典型的には、ある範囲のエチレングリコール(又はエチレンオキシド)モノマーからなる。例えば、分子量２０００のＰＥＧ部分は、典型的には４４±１０のモノマーからなり、平均は約４４のモノマーである。分子量(及びモノマー数)は、典型的にはバッチ間変動を受ける。
他の特定のＰＥＧ形態は、同じく分枝状、直鎖状、フォーク状、又はダンベル状の形状となりうる単分散系である。単分散系とは、ＰＥＧポリマーの長さ(又は分子量)が特定的に定まっており、様々な長さ(又は分子量)の混合物ではないことを意味する。ここで、ｍｄＰＥＧなる標記は、「discrete」の「ｄ」を使用し、ｍＰＥＧ分子が単分散系であることを示すために使用される。ｍｄＰＥＧの後の下付き数字、例えばｍｄＰＥＧ１２の「１２」は、多分散ポリマー(オリゴマー)内のエチレングリコールモノマーの数を示す。
【００１８】
ペグ化なる用語は、リンカーを介して一又は複数のＰＥＧ部分を付着させるインスリンの修飾を包含する。ＰＥＧ部分は、例えばＯＳｕ-活性化エステルを用い、ガンマ位置のリジン残基に、又はＮ末端αアミノ基に求核置換(アシル化)によって付着させることができ、又はＰＥＧ部分は、シアノ水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤及びＰＥＧ-アルデヒド試薬を使用し、持続型インスリン分子中に存在するアミノ基に、還元的アルキル化によって付着させることができ、又は別法では、ＰＥＧ部分は、例えばＰＥＧマレイミド試薬を使用するマイケル付加反応で不対システイン残基の側鎖に付着させることができる。
インスリン活性を有するペグ化持続型インスリンは、ラット、ウサギ、又はブタモデルであってよい、適切な動物モデルにおいて測定して、例えば静脈内、皮下、又は肺投与によって適切に投与した後、哺乳動物の血中グルコースを低下させる能力、又はインスリンレセプター結合親和性を有する、ペグ化持続型インスリンを意味する。
【００１９】
ここで、アルキルなる用語は、飽和した分枝状又は直鎖状の炭化水素基を包含する。
ここで、アルコキシなる用語は、基「アルキル-Ｏ-」を包含する。代表例はメトキシ、エトキシ、プロポキシ(例えば、１-プロポキシ及び２-プロポキシ)、ブトキシ(例えば、１-ブトキシ、２-ブトキシ、及び２-メチル-２-プロポキシ)、ペントキシ(１-ペントキシ及び２-ペントキシ)、ヘキソキシ(１-ヘキソキシ及び３-ヘキソキシ)等である。
ここで、アルキレンなる用語は、１〜１２の炭素原子を有する飽和した分枝状又は直鎖状の二価炭化水素基を包含する。代表例には、限定されるものではないが、メチレン、１,２-エチレン、１,３-プロピレン、１,２-プロピレン、１,３-ブチレン、１,４-ブチレン、１,４-ペンチレン、１,５-ペンチレン、１,５-ヘキシレン、１,６-ヘキシレン等が含まれる。
【００２０】
高い物理的安定性とは、フィブリル化傾向がヒトインスリンの５０％未満であることを意味する。フィブリル化は、原繊維形成が与えられた条件で開始される前のラグタイムにより記述されうる。
インスリンレセプター及びＩＧＦ-１レセプター親和性を有するポリペプチドは、適切な結合アッセイにおいてインスリンレセプター及びＩＧＦ-１レセプターと相互作用し得るポリペプチドである。このようなレセプターアッセイは、当該分野ではよく知られており、実施例にさらに記載する。本ペグ化持続型インスリンは、ＩＧＦ-１レセプターに結合しないか、又は該レセプターに対してかなり低い親和性しか有さない。より厳密には、この発明の持続型インスリンは、ヒトインスリンと実質的同程度の大きさ又はそれ以下の大きさのＩＧＦ-１レセプターに対する親和性を有する。
【００２１】
ここで使用される治療及び治療するなる用語は、病気、疾患又は病状に抗する目的で、患者を管理及びケアすることを意味する。本用語は、病気、疾患又は病状の進行の遅延化、徴候及び合併症の緩和及び軽減、及び／又は病気、疾患又は病状の治癒又は除去を含むことを意図している。治療される患者は、好ましくは哺乳動物、特にヒトである。
ここで使用される病気の治療なる用語は、病気、病状又は疾患を発症した患者の管理及びケアを意味する。治療の目的は、病気、病状又は疾患に抗することである。治療には、病気、病状又は疾患の除去又は管理、並びに病気、病状又は疾患に付随する徴候又は合併症を緩和するために、活性化合物を投与することを含む。
ここで使用される病気の予防なる用語は、病気の臨床的発症の前に、病気を発症する危険性を、個々に管理及びケアすることと定義される。予防の目的は、病気、病状又は疾患の発症に抗することであり、徴候又は合併症の発症を予防又は遅延化させるため、関連する病気、病状又は疾患の発症を予防又は遅延化させるために、活性化合物を投与することを含む。
【００２２】
ここで使用される有効量なる用語は、患者の治療を、治療しない場合と比較して効果的とするのに十分な用量を意味する。
ＰＯＴは、分裂酵母トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、ＴＰＩ１は出芽酵母トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
リーダーとは、プレペプチド(シグナルペプチド)及びプロペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。
【００２３】
シグナルペプチドなる用語は、タンパク質の前駆型において、Ｎ末端配列として存在するプレペプチドを意味すると理解される。シグナルペプチドの機能は、異種タンパク質の小胞体への転位置を容易にできることである。シグナルペプチドは該プロセス中に通常は切断される。シグナルペプチドはタンパク質を生成する酵母生物体に対して異種性又は同族性でありうる。この発明のＤＮＡコンストラクトを用いて使用され得る多くのシグナルペプチドには、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３(ＹＡＰ３)シグナルペプチド、又は任意の機能的アナログ(Egel-Mitaniら、(1990) YEAST 6:127-137及びUS5726038)、及びＭＦα１遺伝子のα因子シグナル(Thorner(1981)、The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces cerevisiae, Strathernら編, pp 143-180, Cold Spring Harbor Laboratory, NY、及びUS487000)が含まれる。
【００２４】
プロペプチドなる用語は、その機能が、発現されたポリペプチドを小胞体からゴルジ体へ、さらには培養培地中への分泌のために分泌小胞へ向けること（すなわち、細胞壁又は少なくとも細胞膜を通しての酵母細胞のペリプラズム空間中へのポリペプチドの排出）を可能にすることであるポリペプチド配列を意味する。プロペプチドは酵母α-因子プロペプチドであってよい。米国特許第4,546,082号及び同4,870,008号を参照。またプロペプチドは、つまりは天然には見出されないプロペプチドである合成プロ-ペプチドであってもよい。適切な合成プロペプチドは米国特許第5,395,922号；同5,795,746号；同5,162,498号及び国際公開第98/32867号に開示されているものである。好ましくは、プロペプチドは、Ｃ末端にエンドペプチダーゼプロセシング部位、例えばＬｙｓ-Ａｒｇ配列又はその任意の機能的類似体を含む。
【００２５】
本明細書において、アミノ酸の３文字又は１文字表示は、次に示すようなその一般的な意味で使用されている。明示的に示さない限り、ここに記載するアミノ酸はＬアミノ酸である。さらに、他に特定しない限り、ペプチドのアミノ酸配列の左又は右末端は、それぞれＮ及びＣ末端である。
アミノ酸に対する略語
【表１】

【００２６】
この発明のペグ化インスリン中に存在するアミノ酸は、好ましくは核酸によりコードされうるアミノ酸である。
次の略語が明細書及び実施例において使用される：Ｄａはダルトン(分子量)であり、ｋＤａはキロダルトン(＝１０００Ｄａ)であり、ｍＰＥＧ-ＳＢＡはｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２-ＣＯ-ＯＳｕ(ｍＰＥＧ-ブタン酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル)であり、ｍＰＥＧ-ＳＭＢはｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)-ＣＯ-ＯＳｕ( ｍＰＥＧ-α-メチルブタン酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミジルエステル)であり、ｍＰＥＧ-ＳＰＡはｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２-ＣＯ-ＯＳｕ(ｍＰＥＧ-プロピオン酸のＮ-ヒドロキシスクシンイミジルエステ)であり、Ｍｗは分子量であり、ＯＳｕは１-スクシンイミジルオキシ=２,５-ジオキソピロリジン-１-イルオキシであり、Ｒは室温であり、ＳＡはシナピン酸であり、ＳＵは１-スクシンイミジル=２,５-ジオキソピロリジン-１-イルである。
【発明の概要】
【００２７】
一態様では、この発明は、ヒトインスリンと比較して、Ａ１、Ｂ１、Ａ２１及び／又はＢ３０位から伸長した一又は複数の伸長部を有するペグ化インスリンアナログに関し、該伸長部はアミノ酸残基からなり、ＰＥＧ部分がリンカーを介して、伸長部の一又は複数のアミノ酸残基に結合している。
親インスリンのＮ末端アミノ基又は双方の場所に存在又は付着される場合、適切なリンカー基を介して、ＰＥＧ基はリジン又はシステイン残基の側鎖に付着されうる。リンカーは、典型的にはカルボン酸官能基がアミド結合を介しての親インスリンへの結合に使用されるカルボン酸の誘導体である。リンカーは、リンカーモチーフ（連結モチーフ）：-ＣＨ２ＣＯ-を有する酢酸部分、リンカーモチーフ：-ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-又は-ＣＨＣＨ３ＣＯ-を有するプロピオン酸部分、又はリンカーモチーフ：-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-又は-ＣＨ２ＣＨＣＨ３ＣＯ-を有する酪酸でありうる。また、リンカーは-ＣＯ-基でありうる。
【００２８】
ヒトインスリンＢ鎖のＢ２９位に存在するリジン残基のペグ化は望まれないため、このアミノ酸残基は他のアミノ酸残基により置き換えられる。適切な置換アミノ酸残基は、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｇｌｎ及びＨｉｓである。さらに、Ａ鎖の１位から２１位(Ａ１-Ａ２１)のいずれかにＬｙｓが存在せず、Ｂ鎖の１位から３０位(Ｂ１-Ｂ３０)のいずれかにＬｙｓが存在しないことが望ましい。
親インスリン分子は、明細書の詳細な部分で説明されるように、他のアミノ酸残基で置換された天然に生じるアミノ酸残基を限定数有していてもよい。
【００２９】
一実施態様では、この発明はペグ化持続型インスリンに関し、ここで親インスリンアナログは、次の欠失又は置換の一又は複数の点でヒトインスリンから逸脱している：Ａ１４位のＥ又はＤ、Ａ１８位のＱ、Ａ２１位のＡ、Ｇ又はＱ、Ｂ１位のＧ又はＱ、又はＢ１位のアミノ酸残基なし、Ｂ３位のＱ、Ｓ又はＴ、又はＢ３位のアミノ酸残基なし、Ｂ１３位のＱ、Ｂ２５位のＨ、又はＢ２５位のアミノ酸残基なし、Ｂ２７位のアミノ酸残基なし、Ｂ２８位のＤ、Ｅ又はＲ、Ｂ２９位のＰ、Ｑ又はＲ、又はＢ２９位のアミノ酸残基なし、Ｂ３０位のアミノ酸残基なし。
【００３０】
ＰＥＧ基は、当該分野でよく知られている大きさの範囲内でサイズが変わりうる。しかしながら、ＰＥＧ基があまりに大きいと、ペグ化持続型インスリン分子の生物活性をマイナスの形で妨害するおそれがある。
【００３１】
さらなる態様では、この発明は、この発明のペグ化持続型インスリンと、適切なアジュバント及び添加剤、例えば安定化、保存又は等張化に適した一又は複数の薬剤、特に亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール又はマンニトールを含有する薬学的製剤に関する。本製剤の亜鉛含量は、インスリン六量体当たり０から約６個の亜鉛原子でありうる。薬学的製剤のｐＨ値は約４から約８．５の間、約４から約５の間、又は約６．５から約７．５の間でありうる。
【００３２】
さらなる態様では、この発明は、哺乳動物の血糖値を低減するため、特に糖尿病を治療するための医薬としてのペグ化持続型インスリンの使用に関する。
さらなる態様では、この発明は、哺乳動物の血糖値を低減する、特に糖尿病を治療する薬学的製剤の調製におけるペグ化持続型インスリンの使用に関する。
さらなる態様では、本発明は、治療を必要とする患者に、この発明のペグ化持続型インスリンの治療的活性用量を投与することにより、哺乳動物の血糖値を低減する方法に関する。
この発明のさらなる態様では、ペグ化持続型インスリンは、任意の適切な比で一又は複数種のさらなる活性物質と併用されて投与される。かかるさらなる活性剤は、ヒトインスリン、速効型インスリンアナログ、抗糖尿病剤、抗脂質異常症剤、抗肥満剤、抗高血圧剤、糖尿病から生じるか糖尿病に伴う合併症の治療剤から選択されうる。
一実施態様では、２つの活性成分は、混合薬学的製剤として投与される。他の実施態様では、２つの成分は、同時か逐次のいずれかで別個に投与される。
【００３３】
一実施態様では、この発明のペグ化持続型インスリンは、速効型インスリン又はヒトインスリンアナログと共に投与されうる。かかる速効型インスリンアナログは、Ｂ２８位のアミノ酸残基がＡｓｐ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、又はＡｌａであり、Ｂ２９位のアミノ酸残基がＬｙｓ又はＰｒｏであるようなもの、ｄｅｓ(Ｂ２８-Ｂ３０)、ｄｅｓ(Ｂ２７)又はｄｅｓ(Ｂ３０)ヒトインスリン、及びＢ３位のアミノ酸残基がＬｙｓであり、Ｂ２９位のアミノ酸残基がＧｌｕ又はＡｓｐであるアナログでありうる。この発明のペグ化持続型インスリンと速効型ヒトインスリン又はヒトインスリンアナログは、約９０／１０％；約７０／３０％又は約５０／５０％の比で混合されうる。
この発明のペグ化持続型インスリンは、また抗糖尿病剤と共に併用治療に使用されうる。
【００３４】
抗糖尿病剤には、インスリン、国際公開第98/0887号、国際公開第99/4370号、米国特許第5424286号、及び国際公開第WO00/09666号に記載されたＧＬＰ-１(１-３７)(グルカゴン様ペプチド-１)、ＧＬＰ-２、エキセンディン-４(１-３９)、そのインスリン分泌促進断片、そのインスリン分泌促進類似体及びそのインスリン分泌促進誘導体が含まれる。ＧＬＰ-１(１-３７)のインスリン分泌促進断片は、全配列がＧＬＰ-１(１-３７)の配列に見出すことができ、少なくとも一つの末端アミノ酸が欠失されているインスリン分泌促進ペプチドである。
【００３５】
この発明のペグ化持続型インスリンは、またチアゾリジンジオン、メトホルミンのような経口抗糖尿病剤及び経口治治療のための他の２型糖尿病薬学的製剤との併用治療に使用することもできる。
さらに、この発明のペグ化持続型インスリンは、一又は複数の抗肥満剤又は食欲調節剤と併用されて投与されうる。
一実施態様では、この発明は、この発明のペグ化持続型インスリン、及び適切なアジュバント及び添加剤、例えば安定化、防腐又は等張化に適した一又は複数の薬剤、特に亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール又はマンニトールを含有する肺用の薬学的製剤に関する。
食事制限及び／又は運動、上述の化合物の一又は複数及び場合によっては一又は複数の他の活性物質と、ペグ化持続型インスリンとの任意の適切な組合せがこの発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
インスリンの安定性及び溶解性は、現在のインスリン療法にとって根本にある重要な側面である。この発明は、安定したペグ化持続型インスリンアナログを提供することにより、これらの問題点に取り組むものであり、ここで伸長部におけるペグ化により、分子の可動性が低減し、同時にフィブリル化傾向が低下し、ｐＨ降下域が制限又は変更される。
この発明のペグ化持続型インスリンは、例えばヒトインスリンと比較して、相対的に高い生物学的利用能であるために、特に肺投与を意図している。さらに、ペグ化持続型インスリンは、遅延性インスリン活性を有しているであろう。
【００３７】
実質的に全てのＰＥＧポリマーが、多くの大分子の混合物であるために、分子量を記載するには平均に頼らなければならない。平均を記載する多くの可能な方法の中でも、３つのもの：数平均、重量平均、及びｚ-平均分子量が一般的に使用されている。重量平均は、ポリマーの全体的な挙動に対する異なった大きさの鎖の寄与を良好に説明し、関心ある物理特性の大抵のものと最も良く相関しているため、３つのうちでおそらくは最も有用である。
【数１】



上式中、Ｎｉは、ポリマー混合物中における分子量Ｍｉの分子のモル分率(又は数-分率)である。Ｍｎに対するＭｗの比率は多分散度(ＰＤＩ)として知られており、分布幅の目安を提供する。ＰＤＩは、非常に狭いＭＷ分布の特定のポリマーでは１．０(下限)に近づく。
【００３８】
低分子量ＰＥＧ基は、生物学的利用能を増加させるには好ましいが、高分子量ＰＥＧ鎖、例えば４０００-６０００ダルトン又はそれ以上の平均分子量を有するものは、一般的に、インスリン分子の生物活性を低下させることが見出されているが、例えば肺投与される製剤の場合では、半減期を増加させるために好ましい。
【００３９】
この発明のＰＥＧ基は、典型的には多くの(-ＯＣＨ２ＣＨ２-)サブユニットを含む。
本発明のＰＥＧ基は、与えられた分子量に対して、典型的には、ある範囲のエチレングリコール(又はエチレンオキシド)モノマーからなる。例えば、分子量２０００ダルトンのＰＥＧ基は、典型的には４３±のモノマーからなり、平均は約４３−４４モノマーである。
【００４０】
この発明においてペグ化される親インスリン分子は、持続型インスリン分子である。すなわち、ヒトインスリンにおいて、親Ａ及び／又はＢ鎖のＮ末端、例えばＡ１及び／又はＢ１に結合して、及び／又は親Ａ及び／又はＢ鎖のＣ末端、例えばＡ２１及び／又はＢ３０に結合して一又は複数のアミノ酸残基を有するインスリン分子である。好ましくは、持続型インスリン分子、すなわち親インスリンは、少なくとも５２のアミノ酸残基を含んでいる。
【００４１】
この発明のペグ化持続型インスリンは、親インスリン分子のリジンアミノ酸残基、又はＮ末端アミノ酸残基に結合した一つだけのＰＥＧ基を有する一置換されたものでありうる。あるいは、この発明のペグ化持続型インスリンは、２、３又は４のＰＥＧ基を有していてもよい。持続型インスリンが一より多くのＰＥＧ基を有している場合、典型的には、各リジン残基、又はＮ末端アミノ酸残基に付着した同じＰＥＧ部分を有しているであろう。しかしながら、個々のＰＥＧ基は大きさ及び長さが互いに変わりうる。
【００４２】
例えば、ヒトインスリンと比較して、逸脱：Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０を有し、例えばｍＰＥＧ-ＳＰＡを使用し、２ｋＤａの、ｍＰＥＧ-プロピオン酸でＡ２２位のリジン残基がペグ化された持続型インスリンは、Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリンと命名される。例えば酪酸リンカー等の他のリンカーを含んでいる対応する他のペグ化試薬(Ｍｗ２０００Ｄａ)の任意のものが、特定の化合物の調製に使用された場合、特定の化合物の「正確な」名称は異なるが、小さな分子差は、生物学的特性に何の差異も生じさせないことは明らかである。この出願では、ペグ化持続型インスリンは、大部分は実際のリンカーと関係なく、リンカー部分がプロピオン酸リンカーであるように命名される。実際、タンパク質のペグ化の文献では、どのリンカー基が使用されるかは殆ど特定されない。生物学的特性に関して重要な変数は、サイズ(ダルトン)、及びＰＥＧ部分の形状、及びタンパク質内におけるＰＥＧ付着の位置である。
【００４３】
親インスリンは、例えば米国特許第6500645号に開示されたようなよく知られた技術によって適当な宿主細胞中で当該持続型インスリンをコードするＤＮＡ配列を発現させることによって生成される。親インスリンは、直接又はＢ鎖にＮ末端伸長を有する前駆体分子として発現される。このＮ末端伸長は直接発現される産物の収率を増大させる機能を有している場合があり、１５アミノ酸残基長まででありうる。Ｎ末端伸長は培養ブロスからの単離後にインビトロで切断されることになり、従ってＢ１の隣に切断部位を有している。この発明に適したタイプのＮ末端伸長は米国特許第5,395,922号及び欧州特許第765,395A号に開示されている。
【００４４】
親インスリンをコードするポリヌクレオチド配列は、確立された標準的な方法、例えばBeaucage等 (1981) Tetrahedron Letters 22:1859-1869に記載されているホスホアミジテ(phosphoamidite)法、又はMatthes等 (1984) EMBO Journal 3:801-805に記載されている方法によって、合成的に調製することができる。ホスホアミジテ法によれば、オリゴヌクレオチドは、例えば自動ＤＮＡ合成器において合成され、精製され、二本鎖にされ、ライゲーションされて、合成ＤＮＡコンストラクトが形成される。ＤＮＡコンストラクトを調製する現在の好ましい方法はポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ)による。
【００４５】
ポリヌクレオチド配列は、また混合ゲノム、ｃＤＮＡ、及び合成由来であってもよい。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列を、Ａ鎖及びＢ鎖をコードするゲノム又はｃＤＮＡ配列に結合させた後、よく知られた手順に従って相同組換えのために所望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入し、又は好ましくは適当なオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって所望の配列を生産することによって、ＤＮＡ配列を改変させることができる。
【００４６】
組換え法は、典型的には、選択された微生物又は宿主細胞中で複製可能であり、親インスリンをコードするポリヌクレオチド配列を担持するベクターを使用してなされる。組換えベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外実体として存在するベクター、染色体複製とは独立した複製、例えばプラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体でありうる。ベクターは自己複製を確実にする任意の手段を含みうる。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるものでありうる。さらに、トランスポゾン、又は宿主細胞のゲノムに導入されるために、全ＤＮＡを含有する単一のベクター又はプラスミド、又は２つ又はそれ以上のベクター又はプラスミドが使用されてもよい。ベクターは直鎖又は閉環状プラスミドであってよく、宿主細胞のゲノムへの安定した組込、又はゲノムとは独立した細胞におけるベクターの自己複製を可能にするエレメント(類)を、好ましくは含有する。
組換え発現ベクターは酵母中で複製可能である。ベクターを酵母中で複製させることができる配列の例は酵母プラスミド２μｍ複製遺伝子ＲＥＰ１−３及び複製起点である。
【００４７】
ベクターは、形質転換細胞の選択を容易にする一又は複数の選択可能マーカーを含みうる。選択可能マーカーは、その産物が殺生物剤又はウイルス耐性、重金属、原栄養体、独立栄養体等に対する耐性を提供する遺伝子である。細菌性選択可能マーカーの例は、Bacillus subtilis又は Bacillus licheniformis, 由来のｄａｌ遺伝子、あるいはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール又はテトラサイクリン耐性等の抗生物質耐性を付与するマーカーである。糸状菌宿主細胞における使用に適切なマーカーには、ａｍｄＳ(アセタミダーゼ)、ａｒｇＢ(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、ｐｙｒＧ(オロチジン-５'-ホスファートデカルボキシラーゼ)及びｔｒｐＣ(アントラニル酸シンターゼ)が含まれる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３である。酵母によく適した選択可能マーカーは分裂酵母ＴＰＩ遺伝子(Russell (1985) Gene 40:125-130)である。
【００４８】
ベクター中において、ポリヌクレオチド配列は適切なプロモーター配列に作用可能に結合している。プロモーターは、変異、切断、及びハイブリッドプロモーターを含む選択宿主細胞中で転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞に相同か又は異種性である細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
細菌宿主細胞において転写を行わしめるのに適切なプロモーターの例は、大腸菌ｌａｃオペロン、ストレプトマイセス・セリカラーアガラーゼ(agarase)遺伝子(ｄａｇＡ)、枯草菌レバンスクラーゼ(levansucrase)遺伝子(ｓａｃＢ)、バチルス・リケニホルミスアルファ-アミラーゼ遺伝子(ａｍｙＬ)、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトゲンアミラーゼ遺伝子(ａｍｙＭ)、バチルス・アミロリケファシエンスアルファ-アミラーゼ遺伝子(ａｍｙＱ)、バチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子(ｐｅｎＰ)から得られるプロモーターである。糸状菌宿主細胞において転写を行わしめるのに適切なプロモーターの例は、コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ(miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、クロコウジカビ天然アルファ-アミラーゼ、及びクロコウジカビ酸安定性アルファ-アミラーゼから得られるプロモーターである。酵母宿主では、有用なプロモーターは、出芽酵Ｍａ１、ＴＰＩ、ＡＤＨ又はＰＧＫプロモーターである。
親インスリンをコードするポリヌクレオチド配列は、典型的には適切なターミネーターに作用可能に連結される。酵母において、適切なターミネーターはＴＰＩターミネーター(Alber等 (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434)である。
【００４９】
親インスリンをコードするポリヌクレオチド配列、プロモーター及びターミネーターをそれぞれライゲーションし、選択宿主での複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するのに使用される手順は、当業者によく知られている。ベクターは、まずこの発明の持続型インスリンをコードする全ＤＮＡ配列を含有するＤＮＡコンストラクトを調製し、続いて適切な発現ベクターにこの断片を挿入するか、又は個々のエレメント(例えば、シグナル、プロ-ペプチド、連結ペプチド、Ａ及びＢ鎖)についての遺伝的情報を含むＤＮＡ断片を挿入し、続いてライゲーションすることにより構築されることが理解される。
【００５０】
親インスリンをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターを、ベクターが染色体組み込み体として又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入する。「宿主細胞」なる用語は、複製中に生じる変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞は、単細胞生物、例えば原核生物、又は非単細胞生物、例えば真核生物であってよい。有用な単核生物は細菌細胞、例えば限定されるものではないが、バチルス細胞、ストレプトマイセス細胞を含むグラム陰性菌、又はグラム陽性菌、例えば大腸菌及びシュードモナス属である。真核細胞は、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞であってよい。一実施態様において、宿主細胞は酵母細胞である。酵母生物は、培養で多量の本発明の単鎖インスリンを多量に生産する任意の適切な酵母生物でありうる。適切な酵母生物の例は、酵母種出芽酵母、サッカロマイセス・クルイベリ(kluyveri)、分裂酵母、サッカロマイセス・ウバルム(uvarum)、クルイベロマイセス・ラクチス、ハンゼヌラ・ポリモルファ、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・クルイベリ、ヤロウイア・リポリティカ(lipolytica)、カンジダ種、トルラ酵母、カンジダ・カカオイ(cacaoi)、ゲオトリクム種、及びゲオトリクム・フェルメンタンス(fermentans)から選択される株である。
【００５１】
酵母細胞の形質転換は、例えば原形質形成と続く形質転換によりそれ自体知られている形でなされうる。細胞を培養するのに使用される培地は酵母生物を増殖させるのに適した任意の一般的な培地であり得る。分泌される持続型インスリンは、その有意な割合が正しくプロセシングされた形態で培地中に存在するが、遠心分離、濾過による培地からの酵母細胞の分離、又はイオン交換マトリックス又は逆相吸収マトリックスによるインスリン前駆体の捕捉、例えば硫酸アンモニウムのような塩による上清又は濾液のタンパク質性成分の沈殿と、続く例えばイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のような様々なクロマトグラフィー法による精製を含む、一般的な手順により培地から回収されうる。
【００５２】
薬学的組成物
この発明のペグ化持続型インスリンは、皮下的、経口的、又は経肺的に投与されうる。
皮下投与用として、この発明のペグ化持続型インスリンは、公知のインスリンの処方物と同じように処方される。さらに、皮下投与用として、この発明のペグ化持続型インスリンは、公知のインスリンの投与と同じように投与され、医者はこの手順に通じている。
この発明のペグ化持続型インスリンは、循環インスリンレベルを増加させ、及び／又は循環グルコースレベルを低下させるのに効果的な用量で、吸入により投与されてよい。このような投与は、糖尿病又は高血糖等の疾患を治療するのに効果的である。インスリンの効果的な投与を達成するには、この発明のペグ化持続型インスリンを、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５０μｇ／ｋｇ以上の吸入量で投与することが必要である。治療的有効量は、インスリンレベル、血糖値、患者の身体コンディション、患者の肺の状態を含む種々の要因を考慮し、博識な実施者により決定することができる。
【００５３】
この発明のペグ化持続型インスリンは、吸収の遅延化、及び／又はその全身クリアランスの低減を達成するために、吸入により送達されてもよい。同様の粒子径及び同様の肺沈着レベルで比較される場合、典型的には、種々の吸入装置により、同様の薬物動態が提供される。
この発明のペグ化持続型インスリンは、吸入による治療剤の投与において、当該技術で公知の任意の様々な吸入装置により送達され得る。これらの装置には、定量噴霧式吸入器、ネブライザー、乾燥パウダー発生器、、スプレー等が含まれる。好ましくは、このペグ化持続型インスリンは、乾燥パウダー吸入器又はスプレーにより送達される。この発明のペグ化持続型インスリンを投与するための吸入装置には、いくつかの所望される特徴がある。例えば、吸入装置による送達には、有利には信頼性、再現性及び正確性がある。良好な呼吸性のためには、吸入装置は、小粒子又はエアゾール、例えば約１０μｍ、例えば約１-５μｍ未満のものを送達すべきである。この発明の実施に適した商業的に入手可能な吸入装置のいくつかの特定の例は、Cyclohaler、TurbohalerＴＭ(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、SpirosＴＭ吸入器(Dura)、吸入治療用に市販されている装置、AERxＴＭ(Aradigm)、Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)、Acorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)、Ventolin(登録商標)定量噴霧式吸入器(Glaxo)、Spinhaler(登録商標)パウダー吸入器(Fisons)等である。
【００５４】
当業者は、この発明のペグ化持続型インスリンの処方、送達される処方物の量、単一用量の投与の持続時間は、使用される吸入装置の種類に依存することを認識しているであろう。ネブライザー等、いくつかのエアゾール送達システムにとって、投与頻度及びシステムが稼働している時間の長さは、主として、エアゾール中のペグ化持続型インスリンの濃度に依存するであろう。例えば、投与時間が短いと、ネブライザー溶液においては、より高い濃度のペグ化持続型インスリンを使用することができる。定量噴霧式吸入器等の装置は、高濃度のエアゾールを生成することができ、所望の量のペグ化持続型インスリンの送達を、より短い時間で作動させることができる。パウダー吸入器等の装置は、付与された充填量の薬剤が装置から排出されるまで、活性剤を送達させる。この種の吸入器において、付与されたパウダー量における、この発明のペグ化持続型インスリンのインスリン量は、一回の投与で送達される用量を決定する。
【００５５】
吸入装置で送達される処方物における、この発明のペグ化持続型インスリンの粒子径は、肺、好ましくは気道下部及び肺胞内においてなされる、インスリンの能力に関して重要である。好ましくは、この発明のペグ化持続型インスリンは、送達される少なくとも約１０％、好ましくは約１０％〜２０％、又はそれ以上のペグ化持続型インスリンが肺に沈着するように処方される。口呼吸するヒトにとって、肺沈着の最大効率は、約２μｍ〜約３μｍの粒子径で得られる。粒子径が約５μｍ以上になると、肺沈着はかなり低減する。粒子径が約１μｍ以下であると、肺沈着の低下が引き起こされ、治療に有効な十分な量の粒子を送達することが困難になる。よって、吸入器により送達されるペグ化持続型インスリンの粒子は、好ましくは約１０μｍ未満、より好ましくは約１μｍ〜５μｍの範囲を有する。ペグ化持続型インスリンの処方は、選択された吸入装置において所望される粒子径が生じるように選択される。
【００５６】
乾燥パウダーとしての投与に有利には、この発明のペグ化持続型インスリンは、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの粒子径を有する微粒子型に調製される。より好ましい粒子径は、患者の肺の肺胞に送達するのに効果的なものである。好ましくは、乾燥パウダーは、多くの粒子が所望する範囲のサイズを有するように生成された粒子から、ほとんどなる。有利には、乾燥パウダーの少なくとも５０％が、約１０μｍ未満の直径を有する粒子から作製される。このような処方は、この発明のペグ化持続型インスリン及び他の所望する成分を含有する溶液を、噴霧乾燥、製粉、微粒子化、又は臨界点濃縮することにより達成可能である。また、本発明に有用な粒子を作製するのに適切な他の方法も、当該技術で公知である。
【００５７】
粒子は、通常、容器中で乾燥パウダー処方物から分離され、ついで運搬気流を介して患者の肺に移送される。典型的には。現在の乾燥パウダー吸入器において、固形物を破壊する力は、単に、患者の吸入により提供される。他の種類の吸入器においては、患者の吸入により生じる気流が、粒子を凝集させない推進モーターを駆動させる。
【００５８】
乾燥パウダー吸入器から投与されるこの発明のペグ化持続型インスリンの処方物は、典型的には、誘導体を含有する微細に分割された乾燥パウダーを含むが、パウダーは、さらに増量剤、担体、賦形剤、他の添加剤等をさらに含むことができる。例えば特定のパウダー吸入器から送達させるのに必要なパウダーを希釈するため、処方のプロセシングを容易にするため、処方物に有利なパウダー性を付与するため、吸入装置からのパウダーの分散を容易にするため、処方物を安定させるため(例えば、酸化防止剤又はバッファー)、処方物に味を付与するため等に、添加剤をペグ化持続型インスリンの乾燥パウダー処方物に含有させることができる。有利には、添加剤は患者の気道に悪影響を与えないものである。ペグ化持続型インスリンは分子レベルで添加剤と混合することができ、又は固体状処方物は添加剤の粒子と混合、又はこれでコーティングされて、ペグ化持続型インスリンの粒子を含有することができる。典型的な添加剤には、単糖類、二糖類、及び多糖類；糖アルコール類及び他のポリオール類、例えばラクトース、グルコース、ラフィノース、メレジトース、ラクチトール(lactitol)、マルチトール、トレハロース、スクロース、マンニトール、デンプン、又はそれらの組合せ；界面活性剤、例えばソルビトール類、ジホスファチジルコリン、又はレシチン等が含まれる。典型的には、添加剤、例えば増量剤は、上述した目的に対して有効な量、多くの場合は処方物の重量に対して約５０％〜約９０％の量で存在している。インスリンアナログタンパク質等の、タンパク質の処方物について、当該技術で公知の添加剤も、本処方物に含めることができる。
【００５９】
この発明のペグ化持続型インスリンを含むスプレーは、ペグ化持続型インスリンの懸濁液又は溶液を、加圧下にて、強いてノズルを通過させることにより製造することができる。ノズルサイズ及び構造、適用圧力、及び液体供給速度は、所望する出量及び粒子径が達成されるように選択することができる。例えば、キャピラリー又はノズルフィード部に接続した電場により、電気スプレーを製造することができる。有利には、スプレーにより送達されるインスリンコンジュゲートの粒子は、約１０μｍ未満、好ましくは約１μｍ〜約５μｍの範囲の粒子径を有する。
【００６０】
スプレーを用いて使用するのに適したこの発明のペグ化持続型インスリンの処方物は、典型的には、溶液１ｍｌ当たり、約１ｍｇ〜約２０ｍｇのペグ化持続型インスリン濃度で、水溶液中にペグ化持続型インスリンを含有している。選択されるペグ化インスリン及び医者に公知の他の要因に応じて、溶液１ｍｌ当たりのペグ化インスリンの上限は、例えば４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１２０、１００又は５０ｍｇの以下であってよい。処方物は、賦形剤、バッファー、等張剤、防腐剤、界面活性剤、好ましくは亜鉛等の薬剤を含有することができる。また処方物は、賦形剤、又はペグ化持続型インスリンを安定化させるための薬剤、例えばバッファー、還元剤、バルクタンパク質、又は炭水化物をさらに含有可能である。インスリンコンジュゲートの処方に有用なバルクタンパク質には、アルブミン、プロタミン等が含まれる。ペグ化持続型インスリンの処方に有用な典型的な炭水化物には、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、グルコース等が含まれる。またペグ化持続型インスリン製剤は、エアゾールの形成において、溶液の噴霧化により生じるインスリンコンジュゲートの表面誘起凝集を低減又は防止可能な界面活性剤を、さらに含有することができる。種々の従来からの界面活性剤、例えばポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール類、及びポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステルを使用することができる。量は、一般的には、処方物の重量に対して約０．００１〜約４％の範囲である。
【００６１】
この発明のペグ化持続型インスリンを含有する薬学的組成物は、このような治療が必要な患者に非経口的に投与されてよい。非経口投与は、シリンジ、場合によってはペン状シリンジにより、皮下、筋肉内又は静脈内注射することにより実施されてよい。または、非経口投与は、輸液ポンプにより実施することもできる。
【００６２】
この発明のペグ化持続型インスリンの注射用組成物は、所望する最終生成物が付与されるように、適切であるならば、成分を溶解及び混合することを含む、製薬工業の従来からの技術を使用して調製することができる。よって、一手順において、ペグ化持続型インスリンは、調製される組成物の最終容量よりも幾分少ない量の水に溶解される。必要に応じて、亜鉛、等張剤、防腐剤及び／又はバッファーが添加され、必要ならば、塩酸等の酸、又は水酸化ナトリウム水等の塩基を使用して、溶液のｐＨ値が調節される。最後に、溶液の容量は、所望の濃度の成分が付与されるように、水を用いて調節される。
【００６３】
この発明のさらなる実施態様において、バッファーは酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、シタラート、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、及びトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ビシン(bicine)、トリシン、リンゴ酸、スクシナート、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸、又はそれらの混合物からなる群から選択される。これらの特定のバッファーのそれぞれ一つは、この発明の別の実施態様を構成する。
【００６４】
この発明のさらなる実施態様において、処方物は、フェノール、ｏ-クレゾール、ｍ-クレゾール、ｐ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ-ヒドロキシ安息香酸プロピル、２-フェノキシエタノール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸ブチル、２-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びチオメロサル(thiomerosal)、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン(chlorphenesine)(３-(４-クロロフェノキシ)-１,２-プロパンジオール)又はそれらの混合物からなる群から選択され得る、製薬的に許容可能な防腐剤をさらに含有する。この発明のさらなる実施態様において、防腐剤は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、防腐剤は約０．１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、防腐剤は約５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、防腐剤は約１０ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の防腐剤各自は、本発明の別の態様を構成する。薬学的組成物に防腐剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が挙げられる。
【００６５】
この発明のさらなる実施態様において、処方物は、塩(例えば塩化ナトリウム)、糖又は糖アルコール、アミノ酸(例えば、Ｌ-グリシン、Ｌ-ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、又はスレオニン)、アルジトール(例えばグリセロール(グリセリン)、１,２-プロパンジオール(プロピレングリコール)、１,３-プロパンジオール、又は１,３-ブタンジオール)、ポリエチレングリコール(例えばＰＥＧ４００)、又はそれらの混合物からなる群から選択され得る等張剤をさらに含有する。任意の糖、例えば単糖類、二糖類又は多糖類、又は水溶性グルカン類、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、及びカルボキシメチルセルロース-Ｎａを使用してもよい。一実施態様において、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一の-ＯＨ基を有するＣ４-Ｃ８炭化水素と定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール(galactitol)、ズルシトール、キシリトール、及びアラビトールを含む。一実施態様において、糖アルコール添加剤はマンニトールである。上述した糖又は糖アルコールは、個々に又は組合せて使用されてよい。使用される量は、糖又は糖アルコールが液状調製物に溶解し、この発明の方法を使用して得られた安定化効果に悪影響を与えない限りは、限定されて固定されるものではない。一実施態様において、糖又は糖アルコールの濃度は、約１ｍｇ／ｍｌ〜約１５０ｍｇ／ｍｌである。この発明のさらなる実施態様において、等張剤は約１ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している、この発明のさらなる実施態様において、等張剤は約１ｍｇ／ｍｌ〜７ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、等張剤は約８ｍｇ／ｍｌ〜２４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。この発明のさらなる実施態様において、等張剤は約２５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在している。これらの特定の等張剤各自は、この発明の別の実施態様を構成する。薬学的組成物に等張剤を使用することは、当業者によく知られている。便宜的な参照として、Remington：The Science and Practice of Pharmacy, 第19版, 1995が挙げられる。
【００６６】
典型的な等張剤は、塩化ナトリウム、マンニトール、ジメチルスルホン及びグリセロールであり、典型的な防腐剤は、フェノール、ｍ-クレゾール、ｐ-ヒドロキシ安息香酸メチル及びベンジルアルコールである。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ(４-(２-ヒドロキシエチル)-１-ピペラジンエタンスルホン酸)及びリン酸ナトリウムである。
【００６７】
この発明のペグ化持続型インスリンの鼻投与用の組成物は、例えば、欧州特許第272097号に記載されているようにして調製されてよい。
【００６８】
この発明のペグ化持続型インスリンを含有する組成物は、インスリンに対して敏感な状態の治療に使用することができる。例えば、それらは、１型糖尿病、２型糖尿病、及び高血糖症で、重症を負ったヒト及び大手術を受けたヒトに時折見られるようなものの治療に使用することができる。任意の患者に対する適量レベルは、使用される特定のインスリン誘導体の有効性、年齢、体重、身体活動、患者の食習慣、他の薬剤との組合せの可能性、及び治療される状態の重篤度を含む種々の要因に依存する。この発明のペグ化持続型インスリンの毎日の投与量は、公知のインスリン組成物と同様にして、当業者により、個々の患者に対して決定されることが推奨される。
【００６９】
(発明の好ましい特徴)
要約すれば、この発明の特徴は以下の通りである：
１．ヒトインスリンに匹敵し、Ａ１、Ｂ１、Ａ２１及び／又はＢ３０位から伸長した、一又は複数のＰＥＧ含有伸長部を有するペグ化インスリンアナログであって、該伸長部(類)がアミノ酸残基(類)からなり、ＰＥＧ部分が、リンカーを介して、伸長部(類)の一又は複数のアミノ酸残基に結合しているペグ化されたされたインスリンアナログ。
２．１の伸長部に１のみのアミノ酸残基がＰＥＧ部分を担持している、第１項のペグ化インスリンアナログ。
３．２のみの伸長部がＰＥＧ部分を担持しており、好ましくは２のみのＰＥＧ部分が存在している、第１項のペグ化インスリンアナログ。
【００７０】
４．ＰＥＧ部分を担持する伸長部が、Ａ１位に対してＮ末端的位置に位置している、第１項のペグ化インスリンアナログ。
５．ＰＥＧ部分を担持する伸長部が、Ｂ１位に対してＮ末端的位置に位置している、第１項のペグ化インスリンアナログ。
６．ＰＥＧ部分を担持する伸長部が、Ａ２１位に対してＣ末端的位置に位置している、第１項のペグ化インスリンアナログ。
７．ＰＥＧ部分を担持する伸長部が、Ｂ３０位に対してＮ末端的位置に位置している、第１項のペグ化インスリンアナログ。
【００７１】
８．インスリン分子当たりの伸長部の数が４である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
９．インスリン分子当たりの伸長部の数が３である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
１０．インスリン分子当たりの伸長部の数が２である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
１１．インスリン分子当たりの伸長部の数が１である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００７２】
１２．親インスリンアナログが、次の伸長部の一又は複数において、ヒトインスリンから逸脱していおり：それは、ヒトインスリンと比較して、Ａ-３位でＧ、Ａ-２位でＧ、Ａ-１位でＫ又はＲ、Ａ２２位でＧ又はＫ、Ａ２３位でＧ又はＫ、Ａ２４位でＧ又はＫ、Ａ２５位でＫ、Ｂ３１位でＫであり、場合によっては、アミノ酸残基の欠失、置換及び付加の中でも、１２までのさらなる変異があり、好ましくは、インスリンアナログにさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００７３】
１３．伸長部が一又は複数の以下の式：
− ｘ１が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(さらに、ここでＫはリジンである)ＡＡｘ１Ｋ(Ｃ末端伸長部に対して)、
− ｘ２が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(さらに、ここでＫはリジンである)Ｋ-ＡＡｘ２-(Ｎ末端伸長部に対して)、
− ｘ３が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(さらに、ここでＣはシステインである)ＡＡｘ３Ｃ(Ｃ末端伸長部に対して)、
− ｘ４が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(さらに、ここでＣはシステインである)Ｃ-ＡＡｘ４-(Ｎ末端伸長部に対して)、
− ｘ５が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、ｙが０又は１である(さらに、ここでＲはアルギニンである)ＡＡｘ５-Ｒｙ-(Ｎ末端伸長部に対して)、
[ここでＡＡは、Ｌｙｓ及びＣｙｓを除く任意のコード性アミノ酸残基であり、好ましくはＡＡはペプチド鎖であり、各コード性アミノ酸は同一又は異なっている]
のものからなり、ここでＰＥＧ部分は、存在する場合はリジン又はシステイン残基(類)の側鎖(類)又はＮ末端アミノ基(類)(又はその双方)に結合している、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００７４】
１４．ＡＡが、グリシン、アラニン又はグルタミンの残基であり、好ましくはＡＡはペプチド鎖であり、各コード性アミノ酸残基が同一又は異なっている、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
１５．ＡＡがグリシン残基である、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
１６．ＡＡがアラニン残基である、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
１７．ＡＡがグルタミン残基である、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
【００７５】
１８．伸長部が一又は複数の以下の式：
− ｘ１が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(さらに、ここでＧ及びＫは、それぞれグリシン及びリジンである)Ｇｘ１Ｋ(Ｃ末端伸長部に対して)、
− ｘ２が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(さらに、ここでＧ及びＫは、それぞれグリシン及びリジンである)ＫＧｘ２-(Ｎ末端伸長部に対して)、
− ｘ３が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(さらに、ここでＧ及びＣは、それぞれグリシン及びシステインである)-Ｇｘ３Ｃ(Ｃ末端伸長部に対して)、
− ｘ４が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(さらに、ここでＧ及びＣは、それぞれグリシン及びｃｙｓｔｅｉｎｅである)Ｃ-Ｇｘ４−(Ｎ末端伸長部に対して)、
− ｘ５が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、ｙが０又は１である(さらに、ここでＧ及びＲは、それぞれグリシン及びアルギニンである)Ｇｘ５-Ｒｙ-(Ｎ末端伸長部に対して)、
のものからなり、ここでＰＥＧ部分は、存在する場合はリジン又はシステイン残基(類)の側鎖(類)又はＮ末端アミノ基(類)(又はその双方)に結合している、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００７６】
１９．親インスリンが、場合によっては次の変異：Ａ１４Ｅ／Ｄ、Ａ１８Ｑ、Ａ２１Ｇ／Ａ／Ｑ、ｄｅｓＢ１、Ｂ１Ｇ／Ｑ、Ｂ３Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｂ１３Ｑ、ｄｅｓＢ２５、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２７、Ｂ２８Ｄ／Ｅ／Ｒ、ｄｅｓＢ２９、Ｂ２９Ｐ／Ｑ／Ｒ又はｄｅｓＢ３０の一又は複数を含んでいてもよい、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリン。
２０．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
２１．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
２２．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００７７】
２３．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
２４．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
２５．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｓ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００７８】
２６．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｔ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
２７．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ１Ｑ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
２８．親インスリンアナログが、Ａ１８Ｑ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００７９】
２９．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ１及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
３０．親インスリンアナログが、Ｂ２９Ｑ及びＢ３１Ｋを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
３１．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｇ、Ｂ２９Ｑ及びＢ３１Ｋを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８０】
３２．親インスリンアナログが、Ａ２１Ａ、Ｂ２９Ｑ及びＢ３１Ｋを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
３３．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｑ、Ｂ２９Ｑ及びＢ３１Ｋを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
３４．親インスリンアナログが、Ａ-１Ｋ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８１】
３５．親インスリンアナログが、Ａ-１Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
３６．親インスリンアナログが、Ａ-３Ｇ、Ａ-２Ｇ、Ａ-１Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
３７．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８２】
３８．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ２８Ｄ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
３９．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ２７及びｄｅｓＢ３０Ａを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
４０．親インスリンアナログが、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｑ及びＢ３１Ｋを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８３】
４１．親インスリンアナログが、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｑ、Ｂ３１Ｋ及びｄｅｓＢ２７を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
４２．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ２８Ｒ、ｄｅｓＢ２９及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
４３．親インスリンアナログが、Ｂ２８Ｒ、Ｂ２９Ｐ及びＢ３１Ｋを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８４】
４４．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
４５．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｇ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｑ及びＢ３１Ｋを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
４６．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ１３Ｑ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８５】
４７．親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ１及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
４８．親インスリンアナログが、Ａ１４Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ及びｄｅｓＢを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
４９．親インスリンアナログが、Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｑ及びＢ３１Ｋを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８６】
５０．親インスリンアナログが、Ａ１３Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
５１．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
５２．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８７】
５３．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
５４．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
５５．親インスリンアナログが、Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８８】
５６．親インスリンアナログが、Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
５７．親インスリンアナログが、Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｓ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
５８．親インスリンアナログが、Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００８９】
５９．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
６０．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
６１．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００９０】
６２．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
６３．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
６４．親インスリンアナログが、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００９１】
６５．親インスリンアナログが、Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
６６．親インスリンアナログが、Ａ１４Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００９２】
６７．前記ＰＥＧ含有基が、伸長部(類)に存在するシステイン残基及び／又はリジン残基の-ＮＨ-基、及び／又は伸長部(類)に対してＮ末端的に結合している、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
６８．ｎが、２〜約１０００、好ましくは２〜約５００、好ましくは２〜約２５０、好ましくは２〜約１２５、好ましくは２〜約５０、及び好ましくは２〜約２５の範囲の整数である、部分-(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｎ-を含有する、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００９３】
６９．ポリエチレングリコール部分が、約２００〜約４００００、好ましくは約２００〜約３００００、好ましくは約２００〜約２００００、好ましくは約２００〜約１００００、好ましくは約２００〜約５０００、好ましくは約２００〜約２０００、好ましくは約２００〜約１０００、及び好ましくは約２００〜約７５０の範囲の名目上の分子量を有する、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
７０．ポリエチレングリコール部分が単分散である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
７１．ポリエチレングリコールが一般式-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ-を有するものであり、ここでｎは、少なくとも約６、好ましくは少なくとも約１０、及び約１１０を越えず、好ましくは約７５を越えない整数であり、さらに好ましくは、ｎは約６〜約３０の範囲、好ましくは約１０〜約４８の範囲にある、上述した可能な項のペグ化インスリンアナログ。
７２．ポリエチレングリコール部分が多分散である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００９４】
７３．ポリエチレングリコール部分が、直鎖状、分枝状、フォーク状又はダンベル状である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
７４．一般式-Ｑ１-(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｎ-Ｒ１の基を有し、Ｑ１が、伸長部において、アミノ酸のα-又はγ-ＮＨ-基に、好ましくはアミド又はカルバメート結合を介して、ポリエチレングリコール部分を連結させるリンカーであり、ｎは２〜約１０００の範囲の整数であり、Ｒ１はアルコキシ又はヒドロキシル、好ましくはメトキシである、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
７５．ｎが、２〜約５００、好ましくは２〜約５００、好ましくは２〜約２５０、好ましくは２〜約１２５、好ましくは２〜約５０、及び好ましくは２〜約２５の範囲の整数である、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
【００９５】
７６．Ｑ１が-アルキレン-ＣＯ-であり、カルボニル基を介して持続型インスリンの-ＮＨ-残基に連結している、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
７７．Ｑ１がエチレンカルボニル(-(ＣＨ２)２-ＣＯ-)であり、カルボニル基を介して-ＮＨ-残基に連結している、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
７８．Ｑ１が-アルキレン-ＮＨＣＯ-アルキレン-ＣＯ-であり、カルボニル基を介して持続型インスリンの-ＮＨ-残基に連結している、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
７９．Ｑ１が-ＣＯ-アルキレン-ＣＯ-である、最後の３つを除く、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
８０．Ｑ１が-ＣＯ-(４-ニトロフェノキシ)である、最後の４つを除く、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００９６】
８１．Ｑ１が(-アルキレン-ＮＨＣＯ-アルキレン-Ｏ-アルキレン-)ｐＣＨｑ-ＮＨＣＯ-アルキレン-(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｒ-ＮＨＣＯ-アルキレン-ＣＯ-であり、ｐが１、２又は３であり、ｑが０、１又は２であり、ｐ＋ｑが３であり、ｒが１〜約１２の範囲の整数であり、カルボニル基を介して持続型インスリンの-ＮＨ-残基に連結している、最後の５つを除く、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
８２．Ｑ１が、-ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-、-ＣＯ-(４-ニトロフェノキシ)、(-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２)３ＣＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２(ＯＣＨ２ＣＨ２)４ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-又は(-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２)３ＣＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２(ＯＣＨ２ＣＨ２)４ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
【００９７】
８３．Ｒ１がアルコキシである、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
８４．Ｒ１がメトキシである、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
【００９８】
８５．上述の明細書、例えば特定の実施例に特に記載されている化合物の任意の一つ、特に上述した実施例１の任意の一つである、上述した生産項のいずれか一つの化合物。
８６．糖尿病を治療する薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
８７．糖尿病を治療するために肺投与可能な薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
８８．糖尿病を治療するために肺投与可能で、長時間の作用降下を付与する薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
８９．糖尿病を治療するために肺投与可能なパウダー状薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
９０．糖尿病を治療するために肺投与可能な液状薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
９１．上述した生産項のいずれか一つの化合物を治療的有効量、それを必要とする患者に投与することを含む、糖尿病の治療方法。
【００９９】
９２．ヒトインスリン、並びに上述した項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログを含有する組成物。
９３．インスリンアスパルト(insulin aspart)、並びに上述した項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログを含有する組成物。
９４．インスリンリスプロ(Lispro)、並びに上述した項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログを含有する組成物。
９５．インスリングルリシン(Glulisine)、並びに上述した項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログを含有する組成物。
９６．任意の新規の特徴、又はここに記載した特徴の組合せ。
【０１００】
(概評)
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりその全内容がここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決してこの発明を限定するものと解してはならない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語（例えば「等」）の使用は、単にこの発明をより明らかに例証することを意図しており、特に請求項に記載がない限り、この発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素がこの発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び／又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
【０１０１】
ここで、「含有する」なる単語は、広義には「含む」、「有する」又は「包含する」を意味すると解釈される(ＥＰＯガイドラインＣ４.１３)。
場合によっては、一又は複数の以下の請求項と、ここに記載の一又は複数の実施態様とを組合せることで、さらなる実施態様が得られ、この発明は該実施態様及び請求項の全ての可能な組合せに関する。
完全性の目的のために、この発明は、親インスリンアナログがいわゆる単鎖インスリンである、ペグ化インスリンアナログに関しない(Danish appl. No.: 2005/00400 and WO appl. No.: 欧州特許第2006/060816号; our ref.: 7148)。よって、この発明において、我々は、出典明記により援用されるその内容を、これにより請求放棄する。
【０１０２】
以下の実施例は例証のためのものであって、制限するものではない。
以下の列挙において、選択されたペグ化試薬は、活性化されたＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ＯＳｕ)として列挙される。また明らかに、他の活性エステル、例えば４-ニトロフェノキシ、及び当業者に公知の多くの他の活性剤を使用してよい。ＰＥＧ(又はｍＰＥＧ)部分、ＣＨ３Ｏ-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ-は、Ｍｗ４００００Ｄａまでの任意のサイズ、例えば７５０Ｄａ、２０００Ｄａ、５０００Ｄａ、２００００Ｄａ、及び４００００Ｄａのものとすることができる。ｍＰＥＧ部分は多分散であるが、ｍ：メチル／メトキシの末端キャップ、ｄ：分離、及びｘは例えば１２〜２４等、エチレングルコール残基の数である、ｍｄＰＥＧｘと示される、例えば１２〜２４の繰り返しエチレングリコール単位の良く定められた鎖長さ(例えば分子量)を有するｍＰＥＧからなる単分散であってもよい。ＰＥＧ部分は直鎖状又は分枝状のいずれかであってよい。持続型インスリンのＰＥＧ残基の構造／配列は、形式的には、「ＮＨインスリン」で、種々のペグ化試薬から離脱基(例えば「-ＯＳｕ」)を繰り返すことにより得ることができ、ここでインスリンは、Ａ又はＢ鎖(又は双方)のアルファ-アミノ位置、又はリジン残基のイプシロン位置のいずれかでペグ化されている：
ｍＰＥＧ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍＰＥＧ-ＣＯ-(４-ニトロフェノキシ)、
(ｍｄＰＥＧ１２-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２)３ＣＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２(ＯＣＨ２ＣＨ２)４ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ(又は、短くは：(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-ＯＳｕ)、
(ｍｄＰＥＧ１２-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２)３ＣＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２(ＯＣＨ２ＣＨ２)４ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ(又は、短くは：(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-ＯＳｕ)、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ-ＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ-ＯＳｕ、
ｍｄＰＥＧｘ-ＣＯ-(４-ニトロフェノキシ)、
上式中、ｘは約６〜約４８の範囲の整数、例えば１２又は２４である。
【０１０３】
さらに、より大きなペグ化試薬は、２又はそれ以上のより小さなＰＥＧ試薬を会合させることにより調製することができる。例えば、上述した任意のものの一つ、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル等の末端キャップされたＰＥＧ試薬は、場合によっては保護されていてもよい、一端がアミノ基、他端がカルボン酸(エステル)により官能化されたＰＥＧ部分にカップリングさせることができる。(必要ならば)カルボン酸の脱保護後、カルボン酸を活性化させることで、例えばＮ-ヒドロキシスクシンイミドエステル等、より長いペグ化試薬が提供される。所望するならば、得られたＰＥＧ試薬は、一又は複数回のサイクルを繰り返すことにより、さらに伸長させることができる。この原則及び方法論は、実施例に例証されている。
この方法論により、さらに大きな単分散(及び多分散)の仕立てサイズのペグ化試薬の構築が可能となる。
【０１０４】
本発明のＰＥＧ残基の例には、以下のものが含まれる：
ｍＰＥＧ７５０(ここで、「７５０」は、Ｄａでの平均分子量を示す)、
ｍＰＥＧ２０００、
ｍＰＥＧ５０００、
ｍＰＥＧ１００００、
ｍＰＥＧ２００００、
ｍＰＥＧ３００００、
ｍＰＥＧ４００００、
ｍｄＰＥＧ１２(ここで、下付き文字「１２」は、ここで定義されるように、ＰＥＧ分子の数を示し、例えばQuanta BioDesign Ltd)、
ｍｄＰＥＧ２４、
ｍｄＰＥＧ３ｘ１２ (ここで、下付き文字「３ｘ１２」は、ここで定義されるように、ＰＥＧが分枝状で、それぞれ１２のＰＥＧモノマーからなる３つのアームからなることを示し、例えばQuanta BioDesign Ltd)、
ｍｄＰＥＧ１２-ｄＰＥＧ１２、
ｍｄＰＥＧ１２-ｄＰＥＧ２４、
ｍｄＰＥＧ２４-ｄＰＥＧ１２、
ｍｄＰＥＧ２４-ｄＰＥＧ２４、
ｍｄＰＥＧ２４-ｄＰＥＧ２４-ｄＰＥＧ２４、
ｍｄＰＥＧ３ｘ１２-ｄＰＥＧ１２、
ｍｄＰＥＧ３ｘ１２-ｄＰＥＧ２４-ｄＰＥＧ２４。
【０１０５】
以下、選択されたペグ化試薬は、マレイミド誘導体として列挙される。また明らかに、マレイミド基の代替として、他のマイケルアセプター、例えばビニルスルホン類、及び当業者に公知の多くの他のマイケルアセプターを使用してもよい。ＰＥＧ(又はｍＰＥＧ)部分、ＣＨ３Ｏ-(ＣＨ２ＣＨ２Ｏ)ｎ-は、Ｍｗ約４００００Ｄａまでの任意のサイズとすることができる。持続型インスリンにおけるＰＥＧ残基の構造／配列は、形式的には、「３-チオ-スクシンイミジル-ＡｌＡ-インスリン」で、種々のペグ化試薬から、マレイミド「ＭＡＬ」を置き換えることにより得ることができ、ここでインスリンは以下の概略式に従い、遊離のシステイン残基でペグ化される。
【化１】

この概略式は、末端Ｃｙｓにおけるペグ化を例証している。Ｃｙｓは、ペグ化可能とするために、末端に配される必要はない。
ＰＥＧ-ＭＡＬの例：ｍＰＥＧ-ＭＡＬ。
【０１０６】
この発明のペグ化持続型インスリンは、全てのケースにおいて、インスリンにＰＥＧ部分を連結させるリンカーが、(３-)プロピオニルリンカー(-ＣＨ２-ＣＨ２-ＣＯ-)であるように命名されている。多くの種類のリンカーが商業的に入手可能であることは上述より明らかであり、それは、標準的なインスリンの配列外の残基に、ＰＥＧ部分が配されることの有益な効果に影響を付与するリンカーの正確な構造／組成ではないため、全ての種類のリンカー(例えば上述したもの)は、この発明の範囲内に入ると理解される。
【０１０７】
本発明の親持続型インスリンは、以下のものを含む：
Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ｂ２９Ｑ、Ｂ３１Ｋヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｓ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｔ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、Ｂ１Ｑ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１８Ｑ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、ｄｅｓＢ１、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ｂ２９Ｑ、Ｂ３１Ｋヒトインスリン；
Ａ２１Ａ、Ｂ２９Ｑ、Ｂ３１Ｋヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ｂ２９Ｑ、Ｂ３１Ｋヒトインスリン；
Ａ-１Ｋ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ-１Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ-３Ｇ、Ａ-２Ｇ、Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；(Ｎ末端Ａ-３-ペグ化)
Ａ２２Ｋ、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、Ｂ２８Ｄ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、ｄｅｓＢ２７、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｑ、Ｂ３１Ｋヒトインスリン；
ｄｅｓＢ２７、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｑ、Ｂ３１Ｋヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、Ｂ２８Ｒ、ｄｅｓＢ２９、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ｂ２８Ｒ、Ｂ２９Ｐ、Ｂ３１Ｋヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２８Ｅ、Ｂ２９Ｑ、Ｂ３１Ｋヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、Ｂ１３Ｑ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２２Ｋ、ｄｅｓＢ１、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ１４Ｅ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｑ、Ｂ３１Ｋヒトインスリン；
Ａ１３Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｋ、Ｂ３Ｑ、Ｂ２９Ｒ、ｄｅｓＢ３０ ヒトインスリン。
【実施例】
【０１０８】
一般的手順：
発現ベクターの構築、酵母細胞の形質転換、及び本発明のインスリン前駆体の発現
全ての発現プラスミドは、出芽酵母におけるプラスミドの選択及び安定化を目的とし、分裂酵母トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(ＰＯＴ)を含有することで特徴付けられる、欧州特許第171142号に記載のものに類似した、Ｃ-ＰＯＴ型のものである。またプラスミドは、出芽酵母トリオースリン酸イソメラーゼプロモータ及びターミネーターをさらに含有する。これらの配列は、インスリン生成物及びリーダーの融合タンパク質をコードするＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントの配列を除く全ての配列であるとして、プラスミドｐＫＦＮ１００３における対応配列に類似している(国際公開第90/10075号に記載)。種々の融合タンパク質を発現させるために、ｐＫＦＮ１００３のＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントは、関心あるリーダー-インスリン融合体をコードするＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントで簡単に置き換えられる。このようなＥｃｏＲＩ-ＸｂａＩフラグメントは、標準的な手順に従い、合成オリゴヌクレオチド及びＰＣＲを使用して合成されてよい。
【０１０９】
酵母形質転換体を、宿主株出芽酵母株ＭＴ６６３(ＭＡＴａ／ＭＡＴα ｐｅｐ４-３／ｐｅｐ４-３ ＨＩＳ４／ｈｉｓ４ ｔｐｉ：：ＬＥＵ２／ｔｐｉ：：ＬＥＵ２ Ｃｉｒ＋)の形質転換により調製した。酵母株ＭＴ６６３を、国際公開第92/11378号に関連して、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenに寄託し、寄託番号ＤＳＭ６２７８が付与された。
ＭＴ６６３を、６００ｎｍでの光学密度が０．６になるまで、ＹＰＧａＬ(１％のバクト酵母抽出物、２％のバクトペプトン、２％のガラクトース、１％のラクタート)において増殖させた。１００ｍｌの培養体を遠心分離により収集し、１０ｍｌの水で洗浄し、再度遠心分離し、１．２Ｍのソルビトール、２５ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ=８．０及び６．７ｍｇ／ｍｌのジチオトレイトール(dithiotreitol)を含有する１０ｍｌの溶液に再懸濁させた。懸濁液を３０℃で１５分インキュベートし、遠心分離し、１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．１Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．８、及び２ｍｇのNovozym(登録商標)234を含有する１０ｍｌの溶液に、細胞を再懸濁させた。懸濁液を３０℃で３０分インキュベートし、遠心分離により細胞を収集し、１０ｍｌの１．２Ｍソルビトール及び１０ｍｌのＣＡＳ(１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ(ｐＨ＝７．５))で洗浄し、２ｍｌのＣＡＳに再懸濁させた。形質転換のために、１ｍｌのＣＡＳ-懸濁細胞を、約０．１ｍｇのプラスミドＤＮＡと混合し、室温に１５分間放置した。１ｍｌの(２０％のポリエチレングリコール４０００、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５)を添加し、混合物をさらに３０分、室温で放置した。混合物を遠心分離し、ペレットを、０．１ｍｌのＳＯＳ(１．２Ｍのソルビトール、３３％ｖ／ｖのＹＰＤ、６．７ｍＭのＣａＣｌ２)に再懸濁させ、３０℃で２時間インキュベートした。ついで、懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを０．５ｍｌの１．２Ｍソルビトールに再懸濁させた。ついで、６ｍｌの上層寒天(１．２Ｍのソルビトールと２．５％の寒天を含有する、ShermanらのＳＣ番地 (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory)を５２℃で添加し、同様の寒天で凝固した、ソルビトール含有培地を収容するプレートの頂部に、懸濁液を注いだ。発現プラスミドで形質転換された出芽酵母株ＭＴ６６３を、３０℃で７２時間、ＹＰＤにおいて増殖させた。
【０１１０】
本発明のペグ化インスリン誘導体の生成、精製及び特徴付け
上述したようにして多くのインスリン前駆体を生成し、培地から単離して、精製した。インスリン前駆体をペグ化させ、以下の実施例に記載したようにしてプロセシングし、最終的なインスリン誘導体を生成した(一般的手順(Ａ))。場合によっては、ペグ化の前に、トリプシンにより、前駆体をプロセシングすることもできる(一般的手順(Ｂ))。これらのインスリン誘導体を、以下に記載するようなヒトインスリンと比較し、ヒトインスリンレセプターに対する結合親和性により測定されるように、生物学的インスリン活性についてテストした。
【０１１１】
以下の実施例は、明細書及び実施例において同定される中間化合物及び最終生成物について言及する。この発明のインスリン誘導体の調製は、以下の実施例を使用して詳細に記載されるが、記載された化学反応及び精製スキームは、本発明のインスリン誘導体を調製するための一般的な適用性に関して開示するものである。時折、反応は、本発明の開示されている範囲内に含まれる各化合物に対して、記載されたように適用されない場合もある。ここで生じる化合物は、当業者に容易に認識されるであろう。これらのケースにおいて、反応は当業者に公知に従来からの修飾法により、すなわち干渉基を適切に保護することにより、他の従来からの試薬を変えることにより、又は反応条件を常套的に改変することにより成功裏に実施することができる。また、ここに開示されている他の反応、又は他の従来的なものが、本発明の対応する化合物の調製に適用されるであろう。全ての調製方法において、全ての出発物質は公知であるか、又は公知の出発物質から容易に調製されてもよい。全ての温度は摂氏で説明されており、そうでない場合は示しており、全ての部及びパーセンテージは、収率に関しては重量であり、全ての部は、溶媒及び溶離液に関して容量である。
【０１１２】
この発明のインスリン誘導体は、当該技術で典型的な、一又は複数の以下の手順を使用することにより精製可能である。これらの手順は、必要であるならば、勾配、ｐＨ、塩、濃度、流量、カラム等に関して変えることができる。当該問題の種々のインスリンの不純物プロファイル、溶解度等の要因に応じて、これらの変更は容易に認識可能であり、また当業者によってなされるであろう。
【０１１３】
実施例１
一般的手順(Ａ)
Ａ２２Ｋ(Ｎε-ｍＰＥＧ２０００-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化２】

工程１：インスリン前駆体ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ Ｂ'Ａの調製及び精製
インスリン前駆体Ａ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０,Ｂ'Ａ単鎖インスリンは、以下の精製工程ＡないしＣに記載したようにして精製することができる。
【０１１４】
精製工程Ａ：捕捉
工程Ａにおいて、１０．７５リットルの清浄な培地を、４．５リットルの９９％エタノールを添加することにより希釈し、３０ｖｏｌ％のエタノールを含有する、全体容量１５．２５リットルとした(伝導率：２．７ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ＝３．４)。３００ｍｌのＳＰビッグ・ビーズセファロースカラム(１００-３００μｍ、Amersham Biosciences)を、朝まで、１５．２５リットルの調製された培養培地(流量近似(flow app.)：１０ｍｌ／分)を充填する前に、１リットルの０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．５(流量近似：２０ｍｌ／分)で平衡にした。カラムに充填させた後、再度、１リットルの０．１Ｍクエン酸、ｐＨ３．５、続いて１リットルの４０ｖｏｌ％エタノール(流量近似：２０ｍｌ／分)で洗浄した。ついで、結合していたインスリン前駆体Ａ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０,Ｂ'Ａ単鎖インスリンを、１．５リットルの０．２Ｍ酢酸ナトリウム、３５ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ ５．７５で溶出させた(流量：１．５ｍｌ／分、溶出した前駆体容量：４００ｍｌ、前駆体の量：２２０ｍｇ)。
【０１１５】
精製工程Ｂ：逆相ＨＰＬＣ
工程Ｂにおいて、溶出液を所定の乾燥度になるまで蒸発させ、ペレットを０．２５Ｍの酢酸に再溶解させた。Ｃ１８カラム(ＯＤＤＭＳ Ｃ１８、２０ｘ２５０ｍｍ、２００Å、１０μｍ、FeF Chemicals A/S)において逆相ＨＰＬＣにより精製する直前に、ｐＨをさらに１．５まで低下させた。カラムに適用する前に、前駆体溶液を滅菌濾過した(２２μｍ、Low Protein Binding Durapore(登録商標)(ＰＶＤＦ)、Millipore)。１５％Ｂ〜５０％Ｂの勾配をカラムに流し、ここでバッファーＡ：０．２Ｍの(ＮＨ４)２ＳＯ４、０．０４Ｍのオルト-リン酸、１０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ２．５、及びバッファーＢ：７０ｖｏｌ％のエタノールである。５ｍｌ／分の流量、４０℃のカラム温度で、勾配を１２０分流した。インスリン前駆体Ａ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０,Ｂ'Ａ単鎖インスリンを溶出させ、プールした(全量量：７５ｍｌ)。
【０１１６】
精製工程Ｃ：ゲル濾過による脱塩
工程Ｃにおいて、逆相ＨＰＬＣからの溶出液におけるエタノール含有量を、ロータリーエバポレータを使用して、５ｖｏｌ％以下に低減させた(新規容量：〜５０ｍｌ)。１０００ｍｌのＧ２５セファデックスカラム(５ｘ５５ｃｍ、Amersham Biosciences)を、０．５Ｍの酢酸で洗浄し、ついでインスリン前駆体Ａ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０,Ｂ'Ａ単鎖インスリンをカラムに適用し、０．５Ｍの酢酸においてゲル濾過することにより脱塩した。ついで、インスリン前駆体を２８０ｎｍでのＵＶ検出にかけ、さらに、塩を伝導率測定にかけた。脱塩直後に、インスリン前駆体を凍結乾燥させた。
【０１１７】
工程２：Ａ２２Ｋ(Ｎε-ｍＰＥＧ２０００-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ Ｂ'Ａヒトインスリン前駆体
０．１５ｍｍｏｌの凍結乾燥されたインスリン前駆体ＬｙｓＡ２２ ＡｒｇＢ２９ ｄｅｓＢ３０ Ｂ'Ａを、炭酸ナトリウム水(３ｍｌ、１００ｍＭ)に溶解させる。アセトニトリルにペグ化試薬ｍＰＥＧ２０００-ＳＰＡ-ＯＳｕが入った溶液(３ｍｌに０．１５ｍｍｏｌ)を前駆体溶液に添加し、混合物をゆっくりと１時間攪拌する。混合物を凍結乾燥させ、ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥して、ペグ化された前駆体を提供する。
【０１１８】
工程３：Ａ２２Ｋ(Ｎε-ｍＰＥＧ２０００-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンへの転換
ペグ化インスリン前駆体Ａ２２Ｋ(Ｎε-ｍＰＥＧ２０００-プロピオニル),ｄｅｓＢ３０ Ｂ'Ａ単鎖ヒトインスリン前駆体(３．９ｍｍｏｌ)を、４．２ｍｌの５０ｍＭグリシン、２０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ１０．０に溶解させる。また、３．６ｍｇの凍結乾燥されたブタトリプシン(Novo Nordisk A/S)を、３．５ｍｌの５０ｍＭグリシン、２０ｖｏｌ％のエタノール、ｐＨ１０．０に溶解させる。ついで、このトリプシン溶液の０．５ｍｌをインスリン前駆体溶液に添加する(よって、インスリン前駆体は２００倍超になる)。ついで、混合物を室温で１５分インキュベートし、その後、トリプシン活性をｐＨ＜３(０．５Ｍの酢酸を用いてｐＨ＝２．０８)に低下させることにより停止される。ついで、ペグ化インスリンアナログＡ２２Ｋ(Ｎε-ｍＰＥＧ２０００-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリンを、逆相ＨＰＬＣにより精製(トリプシン、及び任意のアシル化されていない、二重にアシル化された、又は決断されていないインスリン分子を除去)し、凍結乾燥することで、表題のインスリンが提供される。
【０１１９】
この発明のペグ化持続型インスリンを調製するための一般的手順(Ｂ)
この手順は、一般的手順(Ａ)と非常に類似している。個々の工程の順番は、Ｂ'Ａ前駆体が、ペグ化の前にトリプシンにより切断されるように変えられる。一般的手順(Ｂ)は第１の実施例において例証される。
【０１２０】
実施例２
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０００-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化３】

Ａ２２Ｋ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン(１２５ｍｇ)を、０．１ＭのＮａ２ＣＯ３(２．８ｍｌ)に溶解させた。アセトニトリル(１．２５ｍｌ)に溶解させたＭＰＥＧ-ＳＰＡ２０００(５０ｍｇ)を添加した。０．１ＮのＮａＯＨを用いて、ｐＨを１０．２〜１０．４に調節した。５０分後、アセトニトリル(１．２５ｍｌ)に溶解させたＭＰＥＧ-ＳＰＡ２０００(２５ｍｇ)を添加した。８０分、ゆっくりと攪拌させた後、水(４．５ｍｌ)を添加し、１ＮのＨＣｌを用いて、ｐＨを５に調節した。混合物を凍結乾燥させた。調製用のＨＰＬＣ精製により、表題の化合物が得られた。カラム：Ｃ４．２ｃｍ、Ａバッファー：MiliQ水に０．１％のＴＦＡが入ったもの；Ｂバッファー：アセトリトリルに０．１％のＴＦＡが入ったもの。勾配３０-６５％Ｂ、３０分以上。収率４３ｍｇ。
ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：８１１４。
【０１２１】
実施例３
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化４】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：５８６２。
【０１２２】
実施例４
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化５】

ＭＡＬＤＩ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：６４３２。
【０１２３】
実施例５
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化６】

ＭＡＬＤＩ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：６９６２。
【０１２４】
実施例６
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化７】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：８１６７。
【０１２５】
実施例７
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｇ,Ａ２３Ｇ,Ａ２４Ｇ,Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化８】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：６８０７。
【０１２６】
実施例８
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｇ,Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０００-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化９】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：８１７０
【０１２７】
実施例９
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ８-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化１０】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：６２５８。
【０１２８】
実施例１０
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ４-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化１１】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：６０８２。
【０１２９】
実施例１１
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５０００-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化１２】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：約１１６００。
【０１３０】
実施例１２
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２００００-プロピオニル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化１３】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：約２１５００
【０１３１】
実施例１３
Ａ１４Ｅ,Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル),Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化１４】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：７５２０。
【０１３２】
実施例１４
一般的手順(Ｂ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-ｄＰＥＧ２４-プロピオニル),Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化１５】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：７５２０。
【０１３３】
ペグ化試薬を以下のようにして調製した：
オメガ-(メトキシ-ＰＥＧ１１-プロパノイルアミノ)-ＰＥＧ２４-プロパン酸(ｍｄＰＥＧ１２-ｄＰＥＧ２４酸)の調製
【化１６】

ｍｄＰＥＧ１２ＮＨＳエステル(０．４５７ｍｍｏｌ、Quanta BioDesign Ltd. 製品番号10262)及びアミノ-ｄＰＥＧ２４ tert-ブチルエステル(０．４１６ｍｍｏｌ、Quanta BioDesign、製品番号10311)を、アセトニトリル(各１０ｍＬ)に別々に溶解させ、ついで、２つの溶液を混合し、ＤＩＰＥＡを用いて、ｐＨを８に調節した(ｐＨの測定は湿った表示ストリップを使用して実施した)。得られた混合物を室温で一晩攪拌し、続いて、所定の乾燥度になるまで蒸発させ、その後、室温で１時間、１０ｍＬのＴＦＡ／ＤＣＭ(１／１)で処理した。ついで、混合物を所定の乾燥度になるまで蒸発させ、ＤＣＭで２回取り除いた。溶離液として、アセトニトリル(ＡｃＣＮ)／０．１％のＴＦＡ、及びｗａｔｅｒ／０．１％のＴＦＡを使用し、勾配：１０-８０％のＡｃＣＮ／ＴＦＡ、５-２０分のＨＰＬＣ(２ｃｍ、Ｃ１８カラム)により、残留物を精製した。所望の化合物を含有するフラクションを収集し、組合せ、所定の乾燥度になるまで蒸発させたところ、油として、オメガ-(メトキシ-ＰＥＧ１１-プロパノイルアミノ)ＰＥＧ２３-プロパン酸(２４９ｍｇ、３５％)が得られた。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ：１７１８(Ｍ＋１)＋。
【０１３４】
オメガ-(メトキシ-ＰＥＧ１１-プロパノイルアミノ)-ＰＥＧ２４-プロパン酸-Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル(ｍｄＰＥＧ１２-ｄＰＥＧ２４-ＮＨＳ又はＭｄＰＥＧ１２-ｄＰＥＧ２４-プロパン酸ＯＳｕエステル)の調製
【化１７】

オメガ-(メトキシ-ＰＥＧ１１-プロパノイルアミノ)ＰＥＧ２４-プロパン酸(２４９ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ)を、アセトニトリル(１０ｍＬ)に溶解させ、ＤＩＰＥＡを添加することにより、ｐＨを８に調節した(ｐＨの測定は湿った表示ストリップを使用して実施した)。アセトニトリル(１０ｍＬ)にＴＳＴＵ(４８ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ)が入ったものを添加し、混合物を室温で１．５時間攪拌し、所定の乾燥度になるまで蒸発させた。残留物をＤＣＭに溶解させ、塩酸(０．０１Ｍ)で洗浄し、有機相を乾燥させ(ＭｇＳＯ４)、濾過し、濾液を所定の乾燥度になるまで蒸発させた。得られたオメガ-(メトキシ-ＰＥＧ１１-プロパノイルアミノ)ＰＥＧ２４ プロパン酸-Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを、さらなる精製をすることなく、インスリンへのカップリングに使用した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ １８１３．８(Ｍ＋１)＋。
【０１３５】
実施例１５
一般的手順(Ｂ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-ｄＰＥＧ１２-プロピオニル),Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化１８】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：７５１９。
【０１３６】
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド活性化ＰＥＧ試薬を、ｍｄＰＥＧ２４ ＮＨＳエステル(Quanta BiodDesign Ltd. 製品番号10304)及びアミノ-ｄＰＥＧ１２ tert-ブチルエステル(Quanta BioDesign Ltd. 製品番号10281)から、オメガ-(メトキシ-ＰＥＧ２３-プロパノイルアミノ)ＰＥＧ１２プロパン酸-tert-ブチルエステル、オメガ-(メトキシ-ＰＥＧ２３-プロパノイルアミノ)ＰＥＧ１２ プロパン酸、及びオメガ-(メトキシ-ＰＥＧ２３-プロパノイルアミノ)ＰＥＧ１２ プロパン酸ＮＨＳエステルを介して、上述したようにして調製した。
ＬＣＭＳ：ｍ／ｚ １８１４(Ｍ＋１)＋。
【０１３７】
実施例１６
一般的手順(Ｂ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０００-プロピオニル),Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化１９】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：約８２００。
【０１３８】
実施例１７
一般的手順(Ｂ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル),Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化２０】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：８１２３。
このインスリンは、ＰＥＧ試薬ＮＨＳ-ｄＰＥＧ４-(ｍ-ｄＰＥＧ１２)３エステル(Quanta BioDesign Ltd. 製品番号10401)を使用して調製した。
【０１３９】
実施例１８
一般的手順(Ｂ)：
Ａ１４Ｅ,Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４- イル-ｄＰＥＧ１２-イル),Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化２１】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：８７２４。
このインスリンは、ＰＥＧ試薬ＮＨＳ-ｄＰＥＧ４-(ｍ-ｄＰＥＧ１２)３エステル(Quanta BioDesign Ltd. 製品番号10401)及びアミノ-ｄＰＥＧ１２ tert-ブチルエステル(Quanta BioDesign 製品番号10281)を使用して調製した。
【０１４０】
実施例１９
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル-ｄＰＥＧ１２-イル),Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化２２】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：８７６８
このインスリンは、上述したようにして、ＰＥＧ試薬ＮＨＳ-ｄＰＥＧ４-(ｍ-ｄＰＥＧ１２)３エステル(Quanta BioDesign Ltd. 製品番号10401)及びアミノ-ｄＰＥＧ１２ tert-ブチルエステル(Quanta BioDesign 製品番号10281)を使用して調製した。
【０１４１】
実施例２０
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化２３】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：６９１８。
【０１４２】
実施例２１
一般的手順(Ｂ)：
Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)),Ａ１４Ｅ,Ｂ２５Ｈ,Ｂ２９Ｒ,ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【化２４】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：約１１４００。
【０１４３】
実施例２２
一般的手順(Ｂ)：
Ｂ２９Ｑ,Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍＰＥＧ２０００-プロピオニル))ヒトインスリン
【化２５】

ＭＡＬＤＩ-ＭＳ(マトリックス：シナピン酸)；ｍ／ｚ：約８２６８。
【０１４４】
実施例２３
この発明のインスリン誘導体のインスリンレセプター結合性
ヒトインスリンレセプターについての、この発明のインスリン誘導体の親和性は、ＳＰＡアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより測定される。ＳＰＡ-ＰＶＴ抗体-結合ビーズ、抗-マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号 PRNQ0017)を、２５ｍｌの結合バッファー(１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、０．０２５％のトゥイーン(Tween)-２０)と混合した。単一のPackard Optiplate(Packard No.6005190)用の試薬混合物は、２．４μｌの１：１５０００に希釈された精製組換えヒトインスリンレセプター(エクソン１１を有する又は有さない)、１００μｌの試薬混合物当たり５００ｃｐｍに相当するＡ１４Ｔｙｒ[１２５Ｉ]-ヒトインスリンの所定量の保存溶液、１２μｌの１：１０００に希釈されたＦ１２抗体、３ｍｌのＳＰＡ-ビーズ、全体を１２ｍｌにする結合バッファーからなる。ついで、全体で１００μｌの試薬混合物を、Packard Optiplateの各ウェルに添加し、インスリン誘導体の希釈シリーズを、適切なサンプルからOptiplateにおいて作製する。ついで、ゆっくりと振揺させつつ、サンプルを１６時間インキュベートする。ついで、１分間遠心分離することにより相分離させ、プレートをトップカウンターで計測する。GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego、CA)における非線状回帰アルゴリズムを使用し、結合データを適合させた。
【０１４５】
この発明の選択された化合物のインスリンレセプター結合親和性
実施例番号 インスリンレセプター結合性
Ａイソ型(エクソン１１なし)
ヒトインスリンに対する
１，２ ９０％
３ １２３％
４ １８８％
６ １２０％
５ １１８％
７ ４４％
８ ５８％
９ １２８％
１０ １２３％
１５ ２０％
１３ ２４％
１４ １６％
１７ １９％
１８ １６％
１９ １０６％
２０ ２４％
２２ １４％
１６ １５％
【０１４６】
実施例２４
発明のインスリン誘導体のラットにおける静脈内ボーラス注射後の血中グルコース低下の影響
ハイプノルム-ドルミカム(Hypnorm-Dormicum)皮下注射(１．２５ｍｇ／ｍｌのドルミカム、２．５ｍｇ／ｍｌのフルアニソン、０．０７９ｍｇ／ｍｌのクエン酸フェンタニル)を、プライミング用量(試験物質の投与前〜３０分の時点)として２ｍｌ／ｋｇ、及び付加的に２０分毎に１ｍｌ／ｋｇを使用し、オスのウィスターラット、２００〜３００ｇ、１８時間絶食に麻酔をかける。
動物に、１ｍｌ／ｋｇの対照体及びテスト用化合物(通常の用量範囲：０．１２５-２０ｎｍｏｌ／ｋｇ)を、静脈注射(尾静脈)を用いて投与する。全血中グルコース濃度を決定するための血液サンプルを、−２０分及び０分(投与前)、投与後１０、２０、３０、４０、６０、８０、１２０及び１８０分の時点で、尾端の毛細管の刺し傷より、ヘパリン処理された１０μｌのガラスチューブにて収集する。EBIO Plus自動分析器(Eppendorf, Germany)を使用する、固定化グルコースオキシダーゼ法により、分析バッファーにおいて希釈した後、血中グルコース濃度を測定する。平均血漿グルコース濃度コース(平均±ＳＥＭ)を、各用量及び各化合物について作製する。
【０１４７】
実施例２５
ヒトインスリンに対するこの発明のインスリン誘導体の作用強度
実験日に２３８-３８３ｇのオスのスプラーグドーリーラットを、クランプ実験に使用する。制御された周囲条件下、ラットは餌に自由に接近し、クランプ実験の前には一晩(３ｐｍから)絶食させる。
【０１４８】
実験プロトコル：
外科手順の少なくとも１週間前に、ラットを動物施設に順化させる。クリンプ実験の約１週間前、ハロタン麻酔下で、頸静脈(注入のため)及び頸動脈(血液のサンプリングのため)にタイゴンカテーテルを挿入し、露出させ、頸部の後ろに固定する。外科手術後、ラットをStreptocilin vet.(Boehringer Ingelheim；０．１５ｍｌ／ラット、筋肉内)に付与し、回復期間中、動物ケアユニット(２５℃)におく。無痛覚とするために、麻酔中にアノルフィン(Anorphin)(０．０６ｍｇ／ラット、皮下)を投与し、麻酔から十分に回復した後(２-３時間)、再度２日に１回、リマダイル(Rimadyl)(１．５ｍｇ／ｋｇ、皮下)を投与する。
【０１４９】
実験日の７ａｍに一晩(前日の３ｐｍから)絶食させたラットを計量し、サンプリング用シリンジ及び注入システム(Harvard 22 Basic pumps, Harvard, 及びPerfectum Hypodermic glass syringe, Aldrich)につなぎ、ついで個々のクランプ用ゲージに配し、実験開始前の約４５分、そこで休ませる。全実験中、それらの通常の寝具上を、ラットは自由に動くことができ、水を飲むために、自由に接近することもできる。血漿グルコースレベルを１０分間隔で測定する、３０分の基本期間後、テストされるインスリン誘導体及びヒトインスリン(ラット当たり１回の投与レベル、投与レベル当たりｎ＝６-７)を、３００分、一定の速度で注入する(静脈内)。１０分の間隔中、血漿グルコースレベルを測定し、正常血糖値を維持するために、２０％水性グルコースの注入を調節する。再懸濁させた赤血球のサンプルを、各ラットからプールし、頸動脈カテーテルを介して、約１／２ｍｌ容量を戻す。
【０１５０】
各実験日において、テストされる個々のインスリン誘導体溶液及びヒトインスリン溶液のサンプルを、クリンプ実験の前及び終了時に取り出し、ペプチド濃度をＨＰＬＣにより確認する。ラットインスリン及びＣ-ペプチド、並びにテストされるインスリン誘導体及びヒトインスリンの血漿濃度を、研究の前及び終了の時点で測定する。ペントバルビタール過剰投与を使用し、実験の終了時にラットを殺す。
【０１５１】
実施例２６：
ラットへのインスリン誘導体の肺送達
試験物質は、滴下注入法により肺投与されるであろう。簡単に述べると、雄ウィスターラット(約２５０ｇ)に、６．６ｍｌ／ｋｇの皮下プライミング用量で、続いて３０分の間隔を開けて、３．３ｍｌ／ｋｇの維持用量を３回投与する、約６０ｍｌのフェンタニル／デヒドロデンズペリドール／-ドルミカムで麻酔した。麻酔誘導の１０分後、基礎試料を尾静脈(ｔ＝−２０分)から得、続いて試験物質の投与直前(ｔ＝０)、基礎試料を得た。ｔ＝０において、試験物質を一方の肺に、気管内投与した。丸くなった端部を有する特別なカニューレを、２００μｌの空気と試験物質(１ｍｇ／ｋｇ)を含むシリンジに搭載する。開口を介して、カニューレを気管内に導入し、二分枝部を丁度通過するように、主気管支の一方に送る。挿入中、頸部を外側から触診し、気管内位置決めを担保する。シリンジの内容物を注射し、２秒中断する。その後、カニューレをゆっくりと引き抜く。試験中(４又は８時間までの血液試料)、ラットは麻酔をかけられたままであり、実験後、安楽死させる。
次の実施例のペグ化持続型インスリンは、上述と同様にして調製される：
【０１５２】
実施例２７−４１９
実施例＃：ペグ化持続型インスリン：
２７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４３ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４４ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４５ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４６ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４７ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４８ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４９ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５０ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５１ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５２ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５３ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
５９ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６０ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６１ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６２ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ３Ｓ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｓ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｓ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｓ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｓ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｓ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
６９ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ３Ｓ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７０ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ３Ｓ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７１ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ３Ｓ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７２ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ３Ｔ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｔ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｔ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｔ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｔ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｔ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ３Ｔ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
７９ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ３Ｔ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８０ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ３Ｔ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８１ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ１Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８２ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ１Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ１Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ１Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ１Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ１Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ１Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ１Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
８９ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ１Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９０ Ａ１８Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９１ Ａ１８Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９２ Ａ１８Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９３ Ａ１８Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９４ Ａ１８Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９５ Ａ１８Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９６ Ａ１８Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９７ Ａ１８Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９８ Ａ１８Ｑ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
９９ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１００ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１０１ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１０２ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１０３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１０４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１０５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１０６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１０７ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ｄｅｓＢ１ Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１０８ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ヒトインスリン；
１０９ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１１０ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１１１ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１１２ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１１３ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１１４ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ヒトインスリン；
１１５ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ヒトインスリン；
１１６ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ヒトインスリン；
１１７ Ａ２１Ｇ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ヒトインスリン；
１１８ Ａ２１Ｇ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１１９ Ａ２１Ｇ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１２０ Ａ２１Ｇ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１２１ Ａ２１Ｇ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１２２ Ａ２１Ｇ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１２３ Ａ２１Ｇ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ヒトインスリン；
１２４ Ａ２１Ｇ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ヒトインスリン；
１２５ Ａ２１Ｇ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ヒトインスリン；
１２６ Ａ２１Ａ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ヒトインスリン；
１２７ Ａ２１Ａ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１２８ Ａ２１Ａ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１２９ Ａ２１Ａ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１３０ Ａ２１Ａ ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１３１ Ａ２１Ａ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１３２ Ａ２１Ａ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ヒトインスリン；
１３３ Ａ２１Ａ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ヒトインスリン；
１３４ Ａ２１Ａ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ヒトインスリン；
１３５ Ａ２１Ｑ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ヒトインスリン；
１３６ Ａ２１Ｑ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１３７ Ａ２１Ｑ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１３８ Ａ２１Ｑ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１３９ Ａ２１Ｑ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１４０ Ａ２１Ｑ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
１４１ Ａ２１Ｑ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ヒトインスリン；
１４２ Ａ２１Ｑ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ヒトインスリン；
１４３ Ａ２１Ｑ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ヒトインスリン；
１４４ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１４５ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１４６ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１４７ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１４８ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１４９ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５０ Ａ-１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５１ Ａ-１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５２ Ａ-１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５３ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５４ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５５ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５６ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５７ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５８ Ａ-１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１５９ Ａ-１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６０ Ａ-１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６１ Ａ-１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６２ Ａ-３Ｇ(ＮαｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ａ-２Ｇ Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６３ Ａ-３Ｇ(ＮαｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ａ-２Ｇ Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６４ Ａ-３Ｇ(ＮαｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ａ-２Ｇ Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６５ Ａ-３Ｇ(ＮαｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ａ-２Ｇ Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６６ Ａ-３Ｇ(ＮαｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ａ-２Ｇ Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６７ Ａ-３Ｇ(ＮαｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ａ-２Ｇ Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６８ Ａ-３Ｇ(ＮαｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ａ-２Ｇ Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１６９ Ａ-３Ｇ(ＮαｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ａ-２Ｇ Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７０ Ａ-３Ｇ(Ｎａ(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ａ-２Ｇ Ａ-１Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７１ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７２ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１７９ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８０ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２８Ｄ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８１ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｄ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８２ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｄ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｄ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｄ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｄ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２８Ｄ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２８Ｄ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８８ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２８Ｄ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１８９ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１９０ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１９１ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１９２ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１９３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１９４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１９５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１９６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１９７ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
１９８ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ヒトインスリン；
１９９ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２００ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２０１ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２０２ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２０３ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２０４ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ヒトインスリン；
２０５ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ヒトインスリン；
２０６ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ヒトインスリン；
２０７ ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ヒトインスリン；
２０８ ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２０９ ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２１０ ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２１１ ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２１２ ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２１３ ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ヒトインスリン；
２１４ ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ヒトインスリン；
２１５ ｄｅｓＢ２７ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４- イル)ヒトインスリン；
２１６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２８Ｒ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２１７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｒ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２１８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｒ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２１９ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｒ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２２０ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｒ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２２１ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２８Ｒ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２２２ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２８Ｒ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２２３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２８Ｒ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２２４ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２８Ｒ ｄｅｓＢ２９ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２２５ Ｂ２８Ｒ Ｂ２９Ｐ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ヒトインスリン；
２２６ Ｂ２８Ｒ Ｂ２９Ｐ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２２７ Ｂ２８Ｒ Ｂ２９Ｐ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２２８ Ｂ２８Ｒ Ｂ２９Ｐ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２２９ Ｂ２８Ｒ Ｂ２９Ｐ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２３０ Ｂ２８Ｒ Ｂ２９Ｐ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２３１ Ｂ２８Ｒ Ｂ２９Ｐ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ヒトインスリン；
２３２ Ｂ２８Ｒ Ｂ２９Ｐ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ヒトインスリン；
２３３ Ｂ２８Ｒ Ｂ２９Ｐ Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ヒトインスリン；
２３４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２３５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２３６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２３７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２３８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２３９ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２４０ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２４１ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２４２ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２４３ Ａ２１Ｇ Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ヒトインスリン；
２４４ Ａ２１Ｇ Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２４５ Ａ２１Ｇ Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２４６ Ａ２１Ｇ Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２４７ Ａ２１Ｇ Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２４８ Ａ２１Ｇ Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２４９ Ａ２１Ｇ Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ヒトインスリン；
２５０ Ａ２１Ｇ Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ヒトインスリン；
２５１ Ａ２１Ｇ Ｂ３Ｑ Ｂ２８Ｅ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ヒトインスリン；
２５２ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ１３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２５３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ１３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２５４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ１３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２５５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ１３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２５６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ１３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２５７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ１３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２５８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ１３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２５９ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ１３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６０ Ａ２２Ｋ(Ｎε((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ１３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６１ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６２ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６３ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６４ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６５ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６６ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６７ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６８ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ｄｅｓＢ１ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２６９ Ａ２２Ｋ(Ｎε((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ｄｅｓＢ１ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７０ Ａ１４Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７１ Ａ１４Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７２ Ａ１４Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７３ Ａ１４Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７４ Ａ１４Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７５ Ａ１４Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７６ Ａ１４Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７７ Ａ１４Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７８ Ａ１４Ｅ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２７９ Ａ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)ヒトインスリン；
２８０ Ａ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２８１ Ａ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２８２ Ａ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２８３ Ａ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２８４ Ａ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)ヒトインスリン；
２８５ Ａ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)ヒトインスリン；
２８６ Ａ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)ヒトインスリン；
２８７ Ａ１４Ｅ Ｂ２５Ｈ Ｂ２９Ｑ Ｂ３１Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)ヒトインスリン；
２８８ Ａ１３Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２８９ Ａ１３Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９０ Ａ１３Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９１ Ａ１３Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９２ Ａ１３Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９３ Ａ１３Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９４ Ａ１３Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９５ Ａ１３Ｅ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９６ Ａ１３Ｅ Ａ２２Ｋ(Ｎε(ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２５Ｈ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９７ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９８ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
２９９ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３００ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０１ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０２ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０３ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０４ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０５ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０６ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０７ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０８ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３０９ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１０ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１１ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１２ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１３ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１４ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１５ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１６ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１７ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１８ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３１９ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２０ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２１ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２２ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２３ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２４ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２５ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２６ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２７ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２８ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３２９ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３０ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３１ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３２ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３３ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３４ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３５ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３６ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３７ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３８ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３３９ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４０ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４１ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４２ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４３ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４４ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４５ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４６ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４７ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４８ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３４９ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５０ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５１ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５２ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５３ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５４ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５５ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５６ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５７ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５８ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３５９ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６０ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６１ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６２ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６３ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６４ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６５ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６６ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６７ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６８ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３６９ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７０ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７１ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７２ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７３ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７４ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７５ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７６ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７７ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７８ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３７９ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８０ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８１ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８２ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８３ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８４ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８５ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８６ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８７ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８８ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３８９ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９０ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９１ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９２ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９３ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９４ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９５ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９６ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９７ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９８ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
３９９ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４００ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０１ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０２ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０３ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０４ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｇ Ａ２３Ｇ Ａ２４Ｇ Ａ２５Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０５ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０６ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０７ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０８ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４０９ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１０ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１１ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１２ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１３ Ａ２１Ｑ Ａ２２Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１４ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１５ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１６ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１７ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１８ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４１９ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２０ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２１ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２２ Ａ２１Ｇ Ａ２２Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２３ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ７５０-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２４ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２５ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ５．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２６ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ１０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２７ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ２０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２８ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍＰＥＧ４０．０００-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４２９ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ１２-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４３０ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ(ＮεｍｄＰＥＧ２４-プロピオニル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン；
４３１ Ａ２１Ａ Ａ２２Ｋ((ｍｄＰＥＧ１２)３-ｄＰＥＧ４-イル)Ｂ３Ｑ Ｂ２９Ｒ ｄｅｓＢ３０ヒトインスリン
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】図１は、実施例１及び２のインスリンの、ラットの気管内滴下注入である。
【図２】図２は、実施例１及び２のインスリンの、ラットの気管内滴下注入である。
【図３】図３は、実施例６のインスリンのラットの気管内滴下注入である。
【図４】図４は、実施例５のインスリンのラットの気管内滴下注入である。
【図５】図５は、実施例１６のインスリンのラットの気管内滴下注入である。
【図６】図６は、実施例１８のインスリンのラットの気管内滴下注入である。
【図７】図７は、実施例１７のインスリンのラットの気管内滴下注入である。
【図８】図８は、実施例１９のインスリンのラットの気管内滴下注入である。
【図９】図９は、実施例２２のインスリンのラットの気管内滴下注入である。
【図１０】図１０は、実施例１及び２のインスリンの噴霧乾燥パウダーをミニブタに肺投与した場合の血中グルコースプロファイルであり、ここでの平均送達量は０．０３７±０．００９ｍｇ／ｋｇであった。
【図１１】図１１は、実施例１及び２のインスリンの噴霧乾燥パウダーをミニブタに肺投与した場合の薬物動態プロファイルであり、ここでの平均送達量は０．０３７±０．００９ｍｇ／ｋｇであった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリンと比較して、Ａ１、Ｂ１、Ａ２１及び／又はＢ３０位から伸長した一又は複数のＰＥＧ含有伸長部を有するペグ化インスリンアナログであって、該伸長部がアミノ酸残基からなり、ＰＥＧ部分がリンカーを介して伸長部のアミノ酸残基に結合しており、但し、好ましくは親インスリンアナログがリジン残基を一つだけ含んでいる、ペグ化インスリンアナログ。
【請求項２】
伸長部の一つだけがＰＥＧ部分を担持しており、好ましくは伸長部が一つだけ存在する、請求項１に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項３】
ＰＥＧ部分を担持している伸長部が、Ａ２１位のＣ末端の位置に位置している、請求項１に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項４】
ＰＥＧ部分を担持している伸長部が、Ｂ３０位のＣ末端の位置に位置している、請求項１に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項５】
親インスリンアナログが、Ａ-３位のＧ、Ａ-２位のＧ、Ａ-１位のＫ又はＲ、Ａ２２位のＧ又はＫ、Ａ２３位のＧ又はＫ、Ａ２４位のＧ又はＫ、Ａ２５位のＫ、Ｂ３１位のＫである伸長部の一又は複数においてヒトインスリンから逸脱していおり、ヒトインスリンと比較して、アミノ酸残基の欠失、置換及び付加の中から、場合によっては、１２まで、好ましくは８まで、さらに好ましくは４までの、さらなる変異があり、好ましくは、前記インスリンアナログにさらなる変異がなく、但し好ましくは、親インスリンアナログが唯一のリジン残基を含んでいる、先の可能な請求項のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項６】
伸長部が、次の式：
− ｘ１が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(ここでＫはリジンである)ＡＡｘ１Ｋ(Ｃ末端伸長部に対して)、
− ｘ２が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(ここでＫはリジンである)Ｋ-ＡＡｘ２-(Ｎ末端伸長部に対して)、
− ｘ３が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(ここでＣはシステインである)ＡＡｘ３Ｃ(Ｃ末端伸長部に対して)、
− ｘ４が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８である(ここでＣはシステインである)Ｃ-ＡＡｘ４-(Ｎ末端伸長部に対して)、
− ｘ５が、０、１、２、３、４、５、６、７又は８であり、ｙが０又は１である(ここでＲはアルギニンである)ＡＡｘ５-Ｒｙ-(Ｎ末端伸長部に対して)
[ここで、ＡＡは、各アミノ酸残基が同一又は異なっており、それぞれがＬｙｓ及びＣｙｓを除く任意のコード可能アミノ酸であるペプチド鎖の残基である]
の一又は複数からなり、ＰＥＧ部分が、存在する場合はリジン又はシステイン残基の側鎖に又はＮ末端アミノ基(又はその双方)に結合している、先の可能な請求項のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項７】
ＡＡが、グリシン、アラニン又はグルタミンのアミノ酸残基からなるペプチド残基である、先の請求項のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項８】
ＡＡがグリシン残基である、先の請求項に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項９】
ＡＡがアラニン残基である、先の請求項に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項１０】
ＡＡがグルタミン残基である、先の請求項の一に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項１１】
親インスリンが、場合によっては変異：Ａ１４Ｅ／Ｄ、Ａ１８Ｑ、Ａ２１Ｇ／Ａ／Ｑ、ｄｅｓＢ１、Ｂ１Ｇ／Ｑ、Ｂ３Ｑ／Ｓ／Ｔ、Ｂ１３Ｑ、ｄｅｓＢ２５、Ｂ２５Ｈ、ｄｅｓＢ２７、Ｂ２８Ｄ／Ｅ／Ｒ、ｄｅｓＢ２９、Ｂ２９Ｐ／Ｑ／Ｒ又はｄｅｓＢ３０の一又は複数を含む、先の可能な請求項のいずれか一項に記載のペグ化インスリン。
【請求項１２】
親インスリンアナログが、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにさらなる変異がない、先の可能な請求項のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項１３】
親インスリンアナログが、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにさらなる変異がない、先の可能な請求項のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項１４】
ｎが、２から約１０００、好ましくは２から約５００、好ましくは２から約２５０、好ましくは２から約１２５、好ましくは２から約５０、及び好ましくは２から約２５の範囲の整数である、部分-(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｎ-を含有する、先の可能な請求項のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
【請求項１５】
次のペグ化インスリンアナログ：ａ）親インスリンアナログが、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにさらなる変異がないペグ化インスリンアナログ、ｂ）親インスリンアナログが、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｇ、Ａ２４Ｇ、Ａ２５Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにさらなる変異がないペグ化インスリンアナログ、ｃ）親インスリンアナログが、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにさらなる変異がないペグ化インスリンアナログ、ｄ）親インスリンアナログが、Ａ２１Ｑ、Ａ２２Ｇ、Ａ２３Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにさらなる変異がないペグ化インスリンアナログ、ｅ）親インスリンアナログが、Ａ２１Ａ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにさらなる変異がないペグ化インスリンアナログ、ｆ）親インスリンアナログが、Ａ２１Ｇ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにさらなる変異がないペグ化インスリンアナログ、ｇ）一般式-Ｑ１-(ＯＣＨ２ＣＨ２)ｎ-Ｒ１の基を有し、Ｑ１が、伸長部のアミノ酸のα-又はγ-ＮＨ-基に、好ましくはアミド又はカルバメート結合を介して、ポリエチレングリコール部分を連結するリンカーであり、ｎは２から約１０００の範囲の整数であり、Ｒ１はアルコキシ又はヒドロキシル、好ましくはメトキシであるペグ化インスリンアナログ、ｈ）親インスリンアナログが、Ａ１４Ｅ、Ａ２２Ｋ、Ｂ２５Ｈ、Ｂ２９Ｒ及びｄｅｓＢ３０を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにさらなる変異がないペグ化インスリンアナログの一つである、先の可能な請求項のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【公表番号】特表２００９−５４５５５０（Ｐ２００９−５４５５５０Ａ）
【公表日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５２２２０５（Ｐ２００９−５２２２０５）
【出願日】平成１９年７月１６日（２００７．７．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５７３２１
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０１５０９９
【国際公開日】平成２０年２月７日（２００８．２．７）
【出願人】（５９６１１３０９６）ノボ・ノルデイスク・エー／エス (241)
【Ｆターム（参考）】

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