ペプチドの製造方法
【課題】アミノ酸リガーゼの基質特異性の制約を克服することのできる、Ｎ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドの新規な製造方法の提供。
【解決手段】（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるＮＴＡ１タンパク質等のＮ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドとを用意するステップと、（Ｂ）前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドとを含む反応液中で、前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質を前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドに対して作用させるステップとを含む、Ｎ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドの製造方法。
【解決手段】（Ａ）特定のアミノ酸配列からなるＮＴＡ１タンパク質等のＮ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドとを用意するステップと、（Ｂ）前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドとを含む反応液中で、前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質を前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドに対して作用させるステップとを含む、Ｎ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの製造方法に関し、より具体的には、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質を利用する、Ｎ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸性アミノ酸は、中性付近のｐＨにおいて複数のカルボキシル基が解離することにより負に帯電する。この特性を利用して、ペプチドのＮ末端に酸性アミノ酸を付与することによりペプチドの細胞内への取込、生体内への移行等を制御する試みが行われる。また、中性付近のｐＨにおいて正に帯電する塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸との間に静電引力が生ずることを利用して、Ｎ末端に酸性アミノ酸を含み、かつ、Ｃ末端に塩基性アミノ酸を含むペプチドが、ナノファイバーの原料として提案されている。Ｎ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドはこのような特性を有するために有用であり、その効率的な製造方法を開発する必要性がある。
【０００３】
ペプチドの大量合成方法としては、固相法又は液相法のような化学的合成法と、酵素合成法と、発酵法とが知られている。このうちアミノ酸残基数が２個〜数個の短鎖ペプチドについては化学的又は酵素的合成法が主に用いられている。
【０００４】
化学的合成法は、官能基の保護及び脱保護等の操作が必要であり、またラセミ体の副生を防止するには光学活性中間体を使用する必要があるため、経済的、効率的な方法とはいえない。特に酸性アミノ酸の場合には、２つのカルボキシル基のうち側鎖に結合したカルボキシル基を保護し、α位の炭素に隣接したカルボキシル基は活性化試薬と結合させる必要があり、短鎖ペプチドの大量合成を行ううえで問題となる。
【０００５】
ペプチドの酵素的合成法としては、タンパク質分解酵素の逆反応を利用する方法（非特許文献１）、エステル転移酵素を利用する方法（非特許文献２）、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特許文献１）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）を利用する方法（非特許文献３）、ジペプチド合成酵素を利用する方法（特許文献２）等が知られている。
【特許文献１】特開昭５８−１４６５３９号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／０７４８５８号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１５，２１１−２２０（２００５）
【非特許文献３】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）
【０００６】
これらのペプチドの酵素的合成法のうち、タンパク質分解酵素の逆反応を利用する方法には、基質となるアミノ酸の官能基の保護及び脱保護を要し、ペプチド形成反応の効率化が困難であるという問題点がある。エステル転移酵素を利用する方法にも、一方の基質となるアミノ酸を誘導体化（エステル化）する必要があり、反応の工程数が増大するという問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、目的産物以外の副生成物生成の阻止が困難であるという問題点がある。ＮＲＰＳを利用する方法は、補酵素４’−ホスフォパンテテインの供給が必要であるなど効率的ではない。これらは上述した化学的合成法と共通する問題点である。
【０００７】
これに対し、アミノ酸リガーゼは、保護基を持たないアミノ酸のα位のカルボキシル基でのペプチド結合をＡＴＰ分解と共役して触媒することができる。そこで、アミノ酸リガーゼを利用するペプチド合成法には、前記化学的合成法及び酵素的合成法の問題点がないため、効率的なペプチドの大量合成法として有望である。
【０００８】
しかし、アミノ酸リガーゼを利用するペプチド合成法には酵素の基質特異性のために合成可能なアミノ酸の種類に制約がある。これまでに知られたアミノ酸リガーゼは、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−アスパラギン酸のカルボキシル末端にＬ−メチオニン以外の天然Ｌ−アミノ酸との間でペプチド結合を形成させることができない。したがって、酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に含む任意のペプチドを前記アミノ酸リガーゼによって直接合成することは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、化学的合成法及び酵素的合成法の問題点を解消するために、酸性Ｌ−アミノ酸のカルボキシル末端にペプチド結合を行わせる反応を含まない、Ｎ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドの新規な製造方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドの製造方法を提供する。本発明のペプチドの製造方法は、（Ａ）Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドとを用意するステップと、（Ｂ）前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質を前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドに対して作用させて前記アミド基含有アミノ酸残基を脱アミド化するステップとを含む。
【００１１】
本発明のペプチドの製造方法において、前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は、（Ａ）（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるＮＴＡ１タンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列と９９％、９８％、９５％、９０％、８５％又は８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１のヌクレオチド配列と９９％、９８％、９５％、９０％、８５％又は８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。
【００１２】
本発明のペプチドの製造方法において、前記アミド基含有アミノ酸残基はＬ−アスパラギン残基又はＬ−グルタミン残基の場合がある。
【００１３】
本発明のペプチドの製造方法において、前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、以下の化学式（Ｉ）で表される化合物の場合がある。
【化１】
上記化学式（Ｉ）において、ＡＡ0はＡｓｎ又はＧｌｎを表し、ＡＡ1はいずれかのＬ−アミノ酸残基又はその誘導体を表し、Ｒ1、Ｒ2、・・・Ｒn（ｎは１又は２以上の自然数）はいずれかのＬ−アミノ酸残基又はその誘導体か、Ｄ−アミノ酸残基又はその誘導体かを表す。
【００１４】
本発明のペプチドの製造方法において、前前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドはジペプチド又はトリペプチドか、これらの誘導体かの場合がある。
【００１５】
本発明の製造方法において、前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｙ、Ａｓｎ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ−Ｍｅｔ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｇｌｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｃｙｓ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｍｅｔ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏか、これらの誘導体かの場合がある。
【００１６】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００１７】
本明細書でアミノ酸を表す場合、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（Ｌ−又はＤ−）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物を指す。本明細書におけるアミノ酸は、生体内でメッセンジャーＲＮＡからリボゾームで合成されるタンパク質の翻訳に用いられる２０種類のＬ−アミノ酸とこれらの立体異性体であるＤ−アミノ酸とを含むがこれらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。
【００１８】
また、本明細書でペプチドを表す場合、ペプチドを構成するアミノ酸残基は、慣用の３文字表記で示され、ハイフンで結んで表される。例えば２個のアミノ酸の３文字表記がハイフンで結ばれて表される場合には、左側のアミノ酸のカルボキシル基と右側のアミノ酸のアミノ基とがペプチド結合したジペプチドであることを表す。したがってＡｓｎ−Ａｌａは、Ｌ−アスパラギンのカルボキシル基とＬ−アラニンのアミノ基とがペプチド結合したジペプチドであって、Ｌ−アスパラギンのアミノ基とＬ−アラニンのカルボキシル基は修飾されていないことを意味する。
【００１９】
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明のタンパク質は、Ｎ末端アミダーゼ活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明のペプチドの製造方法に使用されてもよく、あるいは、精製された状態で本発明のペプチドの製造方法に使用されてもよい。
【００２０】
本明細書において、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質とは、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸残基の側鎖のアミド基を脱アミド化する酵素活性（以下、「Ｎ末端アミダーゼ活性」という。）を有するいずれかのタンパク質をいう。本発明のＮ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は、いかなる生物種に由来するタンパク質であってもよい。本発明のＮ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＮ末端アミダーゼ酵素ＮＴＡ１をコードする遺伝子（Ｌｏｃｕｓ：Ｚ４９５６２）の産物を含むが、これに限られない。
【００２１】
配列番号１のヌクレオチド配列は、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＮ末端アミダーゼ酵素ＮＴＡ１をコードする遺伝子（Ｌｏｃｕｓ：Ｚ４９５６２）のヌクレオチド配列である。配列番号１のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースにアクセッション番号Ｚ４９５６２ Ｙ１３１３６として登録されている。
【００２２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりエンコードされＮ末端アミダーゼ活性を有するＮＴＡ１タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔのデータベースにＰ４０３５４として登録されている。
【００２３】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００２４】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００２５】
本明細書において「Ｎ末端アミダーゼ活性」とは、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドに対して作用し、前記Ｎ末端のアミド基含有アミノ酸の脱アミド化反応を行う能力である。
【００２６】
本明細書において「脱アミド化」又は「脱アミド化反応」とは、以下の化学式１に示すアミド基含有アミノ酸のアミド基が加水分解され、カルボキシル基及びＮＨ3が生成されることにより、アミド基含有アミノ酸が酸性アミノ酸に変換される反応である。
【００２７】
【化２】
【００２８】
本明細書において「アミド基含有アミノ酸」とは、アミノ酸の側鎖にアミド基を含むアミノ酸である。アミド基含有アミノ酸は、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルタミン等を含むがこれらに限定されない。好ましくは前記アミド基含有アミノ酸はＬ−アスパラギン又はＬ−グルタミンである。
【００２９】
本明細書において「酸性アミノ酸」とは、アミノ酸分子内に２個以上のカルボキシル基を含むアミノ酸である。前記酸性アミノ酸は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−２−アミノアジピン酸、Ｄ−２−アミノアジピン酸、Ｌ−２−アミノピメリン酸、Ｄ−２−アミノピメリン酸等を含むがこれらに限定されない。好ましくは前記酸性アミノ酸はＬ−アスパラギン酸又はＬ−グルタミン酸である。
【００３０】
本発明のＮ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は、（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるＮＴＡ１タンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列と９９％、９８％、９５％、９０％、８５％又は８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１のヌクレオチド配列と９９％、９８％、９５％、９０％、８５％又は８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。
【００３１】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。
【００３２】
本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質がＮ末端アミダーゼ活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００３３】
本明細書において、「Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチド」とはペプチド鎖のＮ末端アミノ酸残基がアミド基含有アミノ酸残基であるペプチドを指し、「Ｎ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチド」とはペプチド鎖のＮ末端アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基であるペプチドを指す。本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、２個のアミノ酸残基から構成される(ジペプチド)場合と、３個のアミノ酸残基から構成される(トリペプチド)場合と、４個又は５個のアミノ酸残基から構成場合と、６、７、８又は９個のアミノ酸残基から構成される場合と、少なくとも１０個のアミノ酸残基から構成される場合と、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個又は少なくとも１００個のアミノ酸残基から構成される場合とを含むが、これらに限定されない。また本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、本発明のＮ末端アミダーゼ活性を阻害しないことを条件として、Ｌ−アミノ酸の他、Ｄ−アミノ酸、非天然型アミノ酸等であってもよい。また本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、カルボキシル末端にオキソ酸を含むデプシペプチドであってもよい。さらに本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、その構成アミノ酸残基の側鎖か、あるいは、カルボキシル末端かが共有結合によって誘導体化又は修飾される場合がある。誘導体化は、例えばアミノ基に対してＮ−フェニルアセチル基、ヒドロキシル基に対して４，４'−ジメチトキシトリチル（ＤＭＴ）基というように当業者に周知の保護基で誘導体化される場合があり、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かと結合される場合がある。本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、天然樹脂、合成樹脂、金属、複合材料その他の固体支持体に結合又は吸着している場合がある。
【００３４】
本発明のＮ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドの誘導体は、該ペプチドのＮ末端のアミド基含有アミノ酸残基以外のアミノ酸残基、すなわち、Ｎ末端を第１のアミノ酸残基とするとき、第ｎ番目のアミノ酸残基（ｎは２又は３以上の自然数）がエステル基その他の原子団によって修飾される場合がある。前記エステル基は、例えば、メチルエステル、エチルエステルその他の脂肪族エステルか、芳香族エステルかを含む場合がある。また、前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドの誘導体は、Ｃ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基にオキソ酸又はその誘導体が結合する場合がある。
【００３５】
本発明の製造方法におけるＮ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、固相法又は液相法のような化学的合成法と、酵素合成法と、発酵法のような生物学的合成法とのような当業者に周知の方法を使用して調製される。前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、実質的に特定のアミノ酸配列からなる単一のペプチド分子種の場合の他、天然タンパク質含有材料から加水分解処理を施された複数のアミノ酸配列のペプチド分子種の混合物の場合がある。前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドの誘導体は、前記加水分解処理を施される前に誘導体化される場合と、前記加水分解処理を施された後に誘導体化される場合とがある。前記ペプチド分子種の混合物を加水分解処理は、ペプチダーゼ、プロテアーゼ等を用いる酵素的方法や、酸加水分解等の化学的方法によって行われる場合がある。前記加水分解処理に用いられる酵素は、精製タンパク質の場合の他、当該酵素を発現する細胞か、該細胞由来の細胞成分又は粗抽出物であって前記酵素活性を有するものかの場合がある。
【００３６】
本発明の製造方法のステップ（Ｂ）の脱アミド化反応のインキュベーション温度は１５〜４０°Ｃ、好ましくは２０〜３５°Ｃ、最も好ましくは２５〜３０°Ｃの場合があるがこれらに限定されない。インキュベーション時間は５時間以上、好ましくは１０〜４０時間、最も好ましくは２５〜３５時間の場合があるがこれらに限定されない。
【００３７】
本発明の製造方法のステップ（Ｂ）は、反応液を加熱し本発明のタンパク質を失活させることにより停止される場合がある。
【００３８】
本発明の製造方法により取得されるＮ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドは、イオン交換樹脂その他の担体への特異的吸着、薄層クロマトグラフィ法、高速液体クロマトグラフィ法その他のクロマトグラフィ法、有機溶媒による抽出、結晶化等の当業者に周知の方法により回収される。また、前記ペプチドは、ＨＰＬＣ又はＨＰＬＣ／ＭＳのような当業者に周知の分析技術を使用して生産量又は純度が評価される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
１．ＮＴＡ１タンパク質の取得
１−１．方法
（遺伝子増幅の鋳型）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８Ｃ由来のＹＫＯ ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｔｒａｉｎであるＢＹ４７４１（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＢＹ４７４１はその遺伝子型（ＭＡＴαｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ１ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）から明らかなとおり一部の遺伝子が破壊されている。しかし目的遺伝子ｎｔａ１はインタクトに保たれていることから、遺伝子増幅の鋳型ＤＮＡの出所として使用した。
【００４１】
（目的遺伝子の抽出及び増幅）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのゲノムＤＮＡの抽出とＲＮＡ除去とは、ＩＳＯＰＬＡＮＴ ＩＩ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を使用し、製品添付のプロトコールに従って行なった。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｎｔａ１遺伝子にはイントロンが含まれていないことから、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりｎｔａ１遺伝子を増幅した。ポリメラーゼは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を製品添付のプロトコールに従い使用した。ＰＣＲ反応のアニーリング温度は５３°Ｃに設定した。プライマーの配列は表１配列番号３及び４に示される。プライマーの配列は、目的とするタンパク質のＣ末端にＨｉｓタグが付加されるように設計した。ＰＣＲ産物の精製にはｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（組換えプラスミドの取得）
ＰＣＲ産物及びベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を使用して切断した。これらを、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２．１（Ｔａｋａｒａ）を使用して連結した。ライゲーション産物の精製にはｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。精製後のライゲーション産物を、エレクトロポレーション法により遺伝子クローニング用の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９へ導入した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９形質転換体からの抽出により、目的長の組換えプラスミドｐＥＴ２１−ＮＴＡ１（＋１）を取得した。プラスミドの抽出にはｉｌｌｕｓｔｒａ ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。
【００４４】
（ｎｔａ１遺伝子の導入及び発現）
取得した組換えプラスミドをエレクトロポレーション法により遺伝子発現用の宿主大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ λ（ＤＥ３）に導入し、遺伝子発現用組換え大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ λ（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１−ＮＴＡ１（＋１）を取得した。前記組換え大腸菌を、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ及びクロラムフェニコール３０μｇ／ｍＬを添加したＬＢ培地中で培養した。前記組換え大腸菌を、まず３ｍＬのＬＢ培地を使用して３７°Ｃ、１２０ｒｐｍで５時間シード培養した。前記シード培養液１ｍＬを、１００ｍＬの新しいＬＢ培地へ植菌し、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍで２時間培養した後、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、２５°Ｃで２０時間培養を継続した。培養終了後、約１３００×ｇ、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体を、１回目は培養液と等量の、２回目は半量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して２回洗菌を行なった。
【００４５】
（酵素タンパク質の精製（Ｎｉ2+アフィニティークロマトグラフィー））
集洗菌した菌体のペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＬに懸濁し、１０分間の超音波破砕を行なった。破砕した菌体を、１７７００×ｇで３０分遠心分離し、上清を回収して無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を、１０ｍＬの結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ供し、吸着したタンパク質を同じく結合バッファー１０ｍＬで洗浄した。その後、５ｍＬの溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で溶出し、１ｍＬずつのフラクションに分画した。２番目及び３番目のフラクションから各１ｍＬを、１番目のフラクションから０．５ｍＬを回収して脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ供し、３．５ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へ溶出することで、精製酵素を取得した。
【００４６】
１−２．結果
上述の方法により取得されたＨｉｓタグ融合型ＮＴＡ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、該Ｈｉｓタグ融合型ＮＴＡ１タンパク質のアミノ酸とをそれぞれ配列番号５及び６に示す。配列番号５のヌクレオチド配列を有する遺伝子の導入及び発現と、発現したタンパク質のアフィニティー精製とにより、配列番号６のアミノ酸からなるＮＴＡ１タンパク質を取得することができた。取得されたＮＴＡ１タンパク質を、以下の実験に使用した。
【実施例２】
【００４７】
２．ＮＴＡ１酵素によるアミド基含有アミノ酸の脱アミド化
２−１．方法
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中に、１２．５ｍＭのアスパラギン又はグルタミンと、０．１ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素とを含む反応液を調製した。これらの反応液を３０°Ｃで２０時間インキュベーションすることにより脱アミド化反応を行なった。反応終了後、１０分間煮沸した後に遠心分離（約２１，０００×ｇ、１０分、４°Ｃ）を行い、上清を回収した。この上清１００μＬをＦＤＡＡ（１−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル−５−アラニンアミド）により誘導体化し、メタノール７７０μＬで希釈して総量１ｍＬとした上で、ＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析条件は、ＨＩＴＡＣＨＩ ＴＥＣＨＩＣＡＬ ＤＡＴＡ シートＮｏ．１３１（４．グラジエントモードでの測定例）に従った。
【００４８】
２−２．結果
上述の反応の結果得られたアスパラギン酸及びグルタミン酸の生成量は共に０．１ｍＭ以下（収率０．８％以下）であった。この結果から、ＮＴＡ１タンパク質は単一アミノ酸としてのアスパラギン又はグルタミンの脱アミド化反応を行なう能力が低いことが確認された。ＮＴＡ１タンパク質がタンパク質のＮ末端のアスパラギン又はグルタミンの脱アミド化反応を触媒する酵素であることは既に報告がある。しかし本実施例の結果によれば、ＮＴＡ１タンパク質の基質特異性、すなわち、遊離のアスパラギン又はグルタミンとか、Ｎ末端にアスパラギン又はグルタミンを含む短鎖のペプチドとかを基質として脱アミド化反応を触媒することができるかどうかは前記報告から予測することはできないことが明らかである。
【実施例３】
【００４９】
３．ＮＴＡ１酵素によるアミド基含有アミノ酸を含むジペプチドの脱アミド化
３−１．方法
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中に、１２．５ｍＭのＡｓｎ−Ｖａｌ又はＧｌｎ−Ｇｌｙと、０．１ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素とを含む反応液を調製した。これらの反応液を３０°Ｃで２０時間インキュベーションすることにより脱アミド化反応を行なった。反応終了後、反応液を１０分間煮沸した後に遠心分離（約２１，０００×ｇ、１０分、４°Ｃ）を行い上清を回収した。この上清１００μＬをＦＤＡＡにより誘導体化し、メタノール７７０μｌで希釈して総量１ｍＬとした上で、ＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析条件は、ＨＩＴＡＣＨＩ ＴＥＣＨＩＣＡＬ ＤＡＴＡ シートＮｏ．１３１（４．グラジエントモードでの測定例）に従った。
【００５０】
３−２．結果
上述の反応及びＨＰＬＣ分析の結果、Ａｓｎ−Ｖａｌを基質とする反応からは６．８ｍＭのＡｓｐ−Ｖａｌ（収率５４％）が、Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質とする反応からは２．２ｍＭのＧｌｕ−Ｇｌｙ（収率１８％）の生成が確認された。
【００５１】
また別の実験において、ＴＬＣ分析により、Ｇｌｎ−Ｇｌｎを基質とする反応の結果Ｇｌｕ−Ｇｌｎと考えられるスポットが出現することが確認されている。
【００５２】
さらに別の実験において、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析により、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｙ、Ａｓｎ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ−Ｍｅｔ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｃｙｓ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｍｅｔ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ又はＧｌｎ−Ｖａｌを基質とする反応の結果、Ａｓｐ−Ａｌａ、Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｍｅｔ、Ａｓｐ−Ｔｒｐ、Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ又はＧｌｕ−Ｖａｌに相当するｍ／ｚピークがそれぞれ生成することが確認された。
【００５３】
これらの結果からＮＴＡ１タンパク質は、Ｎ末端にＬ−アスパラギン又はＬ−グルタミンを含む種々のジペプチドにおいてＮ末端のＬ−アスパラギン又はＬ−グルタミンの脱アミド化反応を行なう能力を有することが確認された。
【実施例４】
【００５４】
４．ＮＴＡ１酵素によるアミド基含有アミノ酸を含むトリペプチドの脱アミド化
４−１．方法
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中に、１２．５ｍＭのＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏと、０．１ｍｇ／ｍＬ又は０．２ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素とを含む反応液を調製した。これらの反応液を３０°Ｃで２０時間インキュベーションすることにより脱アミド化反応を行なった。また陰性対照として、１２．５ｍＭのＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを前記バッファー中に含むがＮＴＡ１酵素は含まない反応液も調製し、酵素を含む反応液と同様に３０°Ｃで２０時間インキュベーションした。インキュベーションの終了後、各反応液についてＨＰＬＣ／ＭＳ分析を行った。
【００５５】
４−２．結果
ＨＰＬＣ／ＭＳ分析の結果を図１に示す。陰性対照の反応液のＭＳチャート（図１−Ａ）では基質であるＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏに対応するｍ／ｚピーク（［ｍ＋Ｈ］＝３０１）が主に確認された。それに対して０．１ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素で反応を行った反応液のＭＳチャート（図１−Ｂ）と、０．２ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素で反応を行った反応液のＭＳチャート（図１−Ｃ）とからは、ＮＴＡ１酵素の使用濃度が高くなるにつれて脱アミド化生成物であるＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏに対応するｍ／ｚピーク（［ｍ＋Ｈ］＝３０２）が顕著になっていくことが確認された。この結果からＮＴＡ１タンパク質は、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むトリペプチドにおいてＮ末端のアミド基含有アミノ酸の脱アミド化反応を行なう能力を有することが確認された。
【実施例５】
【００５６】
５．Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドに対するＮＴＡ１酵素の脱アミド化反応の反応性と、該ペプチドのアミノ酸残基数との関係
５−１．方法
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中に、１２．５ｍＭのＧｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏと、０．１ｍｇ／ｍＬ又は０．２ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素とを含む反応液を調製した。これらの反応液を３０°Ｃで２０時間インキュベーションすることにより脱アミド化反応を行なった。また陰性対照として、１２．５ｍＭのＧｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを前記バッファー中に含むがＮＴＡ１酵素は含まない反応液も調製し、酵素を含む反応液と同様に３０°Ｃで２０時間インキュベーションした。インキュベーションの終了後、前記反応液についてＴＬＣ分析を行った。ＴＬＣではｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）を使用し、酢酸：１−ブタノール：水＝１：３：１の展開液を使用して分析した。
【００５７】
５−２．結果
ＴＬＣ分析の結果を図２に示す。Ｇｌｎを基質とする反応液の分析結果（レーン１−４）では、酵素反応後液においても基質由来のスポットが主に観察されＧｌｕと考えられるスポットは僅かに確認されたのみであった（レーン３及び４）。Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質とする反応液の分析結果（レーン５−８）では、酵素反応後液において基質由来のスポットの上部にＧｌｕ−Ｇｌｙと考えられるスポットが確認された（レーン７及び８）。Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを基質とする反応液の分析結果（レーン９−１２）では、酵素反応後液において基質由来のスポットはほぼ消失し、その上部にＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏと考えられるスポットが確認された（レーン１１及び１２）。この結果から、基質であるＮ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドにおけるアミノ酸残基の数が多いほど、ＮＴＡ１酵素の脱アミド化反応の反応性が高いことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１−Ａ】インキュベーション後の、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含むがＮＴＡ１酵素は含まない反応液（陰性対照）のＭＳチャート。
【図１−Ｂ】Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを基質として０．１ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素で反応を行なった反応液のＭＳチャート。
【図１−Ｃ】Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを基質として０．２ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素で反応を行なった反応液のＭＳチャート。
【図２−Ａ】Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを基質としてＮＴＡ１酵素で反応を行なった反応液のＴＬＣ分析結果を示すクロマトグラム。
【図２−Ｂ】図２−Ａのクロマトグラムの各レーンの試料の処理条件を示す表。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドの製造方法に関し、より具体的には、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質を利用する、Ｎ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸性アミノ酸は、中性付近のｐＨにおいて複数のカルボキシル基が解離することにより負に帯電する。この特性を利用して、ペプチドのＮ末端に酸性アミノ酸を付与することによりペプチドの細胞内への取込、生体内への移行等を制御する試みが行われる。また、中性付近のｐＨにおいて正に帯電する塩基性アミノ酸と酸性アミノ酸との間に静電引力が生ずることを利用して、Ｎ末端に酸性アミノ酸を含み、かつ、Ｃ末端に塩基性アミノ酸を含むペプチドが、ナノファイバーの原料として提案されている。Ｎ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドはこのような特性を有するために有用であり、その効率的な製造方法を開発する必要性がある。
【０００３】
ペプチドの大量合成方法としては、固相法又は液相法のような化学的合成法と、酵素合成法と、発酵法とが知られている。このうちアミノ酸残基数が２個〜数個の短鎖ペプチドについては化学的又は酵素的合成法が主に用いられている。
【０００４】
化学的合成法は、官能基の保護及び脱保護等の操作が必要であり、またラセミ体の副生を防止するには光学活性中間体を使用する必要があるため、経済的、効率的な方法とはいえない。特に酸性アミノ酸の場合には、２つのカルボキシル基のうち側鎖に結合したカルボキシル基を保護し、α位の炭素に隣接したカルボキシル基は活性化試薬と結合させる必要があり、短鎖ペプチドの大量合成を行ううえで問題となる。
【０００５】
ペプチドの酵素的合成法としては、タンパク質分解酵素の逆反応を利用する方法（非特許文献１）、エステル転移酵素を利用する方法（非特許文献２）、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特許文献１）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（ＮＲＰＳ）を利用する方法（非特許文献３）、ジペプチド合成酵素を利用する方法（特許文献２）等が知られている。
【特許文献１】特開昭５８−１４６５３９号公報
【特許文献２】ＷＯ２００７／０７４８５８号公報
【非特許文献１】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）
【非特許文献２】Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１１５，２１１−２２０（２００５）
【非特許文献３】Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）
【０００６】
これらのペプチドの酵素的合成法のうち、タンパク質分解酵素の逆反応を利用する方法には、基質となるアミノ酸の官能基の保護及び脱保護を要し、ペプチド形成反応の効率化が困難であるという問題点がある。エステル転移酵素を利用する方法にも、一方の基質となるアミノ酸を誘導体化（エステル化）する必要があり、反応の工程数が増大するという問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、目的産物以外の副生成物生成の阻止が困難であるという問題点がある。ＮＲＰＳを利用する方法は、補酵素４’−ホスフォパンテテインの供給が必要であるなど効率的ではない。これらは上述した化学的合成法と共通する問題点である。
【０００７】
これに対し、アミノ酸リガーゼは、保護基を持たないアミノ酸のα位のカルボキシル基でのペプチド結合をＡＴＰ分解と共役して触媒することができる。そこで、アミノ酸リガーゼを利用するペプチド合成法には、前記化学的合成法及び酵素的合成法の問題点がないため、効率的なペプチドの大量合成法として有望である。
【０００８】
しかし、アミノ酸リガーゼを利用するペプチド合成法には酵素の基質特異性のために合成可能なアミノ酸の種類に制約がある。これまでに知られたアミノ酸リガーゼは、Ｌ−グルタミン酸及びＬ−アスパラギン酸のカルボキシル末端にＬ−メチオニン以外の天然Ｌ−アミノ酸との間でペプチド結合を形成させることができない。したがって、酸性Ｌ−アミノ酸をＮ末端に含む任意のペプチドを前記アミノ酸リガーゼによって直接合成することは困難である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、化学的合成法及び酵素的合成法の問題点を解消するために、酸性Ｌ−アミノ酸のカルボキシル末端にペプチド結合を行わせる反応を含まない、Ｎ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドの新規な製造方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明はＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドの製造方法を提供する。本発明のペプチドの製造方法は、（Ａ）Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドとを用意するステップと、（Ｂ）前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質を前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドに対して作用させて前記アミド基含有アミノ酸残基を脱アミド化するステップとを含む。
【００１１】
本発明のペプチドの製造方法において、前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は、（Ａ）（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるＮＴＡ１タンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列と９９％、９８％、９５％、９０％、８５％又は８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１のヌクレオチド配列と９９％、９８％、９５％、９０％、８５％又は８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。
【００１２】
本発明のペプチドの製造方法において、前記アミド基含有アミノ酸残基はＬ−アスパラギン残基又はＬ−グルタミン残基の場合がある。
【００１３】
本発明のペプチドの製造方法において、前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、以下の化学式（Ｉ）で表される化合物の場合がある。
【化１】
上記化学式（Ｉ）において、ＡＡ0はＡｓｎ又はＧｌｎを表し、ＡＡ1はいずれかのＬ−アミノ酸残基又はその誘導体を表し、Ｒ1、Ｒ2、・・・Ｒn（ｎは１又は２以上の自然数）はいずれかのＬ−アミノ酸残基又はその誘導体か、Ｄ−アミノ酸残基又はその誘導体かを表す。
【００１４】
本発明のペプチドの製造方法において、前前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドはジペプチド又はトリペプチドか、これらの誘導体かの場合がある。
【００１５】
本発明の製造方法において、前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｙ、Ａｓｎ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ−Ｍｅｔ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｇｌｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｃｙｓ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｍｅｔ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏか、これらの誘導体かの場合がある。
【００１６】
本明細書において「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した化合物である。「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、メチル基を含むアルキル基、リン酸基、糖鎖、及び／又は、エステル結合その他の共有結合による修飾を含む場合がある。また、「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」は、金属イオン、補酵素、アロステリックリガンドその他の原子、イオン、原子団か、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かを共有結合又は非共有結合により結合又は会合している場合がある。
【００１７】
本明細書でアミノ酸を表す場合、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン等の化合物名で表す場合と、Ａｓｎ、Ｇｌｎ等の慣用の３文字表記で表す場合とがある。化合物名で表す場合には、アミノ酸のα炭素に関する立体配置を示す接頭辞（Ｌ−又はＤ−）を用いて表す。慣用の３文字表記で表す場合には、該３文字表記は特に断りのない限りＬ体のアミノ酸を表す。本明細書において、アミノ酸は、アミノ基とカルボキシル基とが少なくとも１個の炭素原子を介して結合した化合物であって、ペプチド結合により重合することが可能ないずれかの化合物を指す。本明細書におけるアミノ酸は、生体内でメッセンジャーＲＮＡからリボゾームで合成されるタンパク質の翻訳に用いられる２０種類のＬ−アミノ酸とこれらの立体異性体であるＤ−アミノ酸とを含むがこれらに限定されない、いずれかの天然又は非天然のアミノ酸を含む場合がある。
【００１８】
また、本明細書でペプチドを表す場合、ペプチドを構成するアミノ酸残基は、慣用の３文字表記で示され、ハイフンで結んで表される。例えば２個のアミノ酸の３文字表記がハイフンで結ばれて表される場合には、左側のアミノ酸のカルボキシル基と右側のアミノ酸のアミノ基とがペプチド結合したジペプチドであることを表す。したがってＡｓｎ−Ａｌａは、Ｌ−アスパラギンのカルボキシル基とＬ−アラニンのアミノ基とがペプチド結合したジペプチドであって、Ｌ−アスパラギンのアミノ基とＬ−アラニンのカルボキシル基は修飾されていないことを意味する。
【００１９】
本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質のアミノ酸配列をエンコードするヌクレオチド配列からなるＤＮＡを、無生物発現系か、宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系かで発現させることにより産生される。前記宿主生物は、大腸菌、枯草菌等のような原核生物と、酵母、菌類、植物、動物等のような真核生物とを含む。本発明の宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系は、細胞や組織のような生物の一部か、生物の個体全体かの場合がある。本発明のタンパク質は、Ｎ末端アミダーゼ活性を有することを条件として、無生物発現系又は宿主生物及び発現ベクターを使用する発現系の他の成分が混在する状態で本発明のペプチドの製造方法に使用されてもよく、あるいは、精製された状態で本発明のペプチドの製造方法に使用されてもよい。
【００２０】
本明細書において、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質とは、ペプチドのアミノ末端のアミノ酸残基の側鎖のアミド基を脱アミド化する酵素活性（以下、「Ｎ末端アミダーゼ活性」という。）を有するいずれかのタンパク質をいう。本発明のＮ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は、いかなる生物種に由来するタンパク質であってもよい。本発明のＮ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＮ末端アミダーゼ酵素ＮＴＡ１をコードする遺伝子（Ｌｏｃｕｓ：Ｚ４９５６２）の産物を含むが、これに限られない。
【００２１】
配列番号１のヌクレオチド配列は、出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＮ末端アミダーゼ酵素ＮＴＡ１をコードする遺伝子（Ｌｏｃｕｓ：Ｚ４９５６２）のヌクレオチド配列である。配列番号１のヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋのデータベースにアクセッション番号Ｚ４９５６２ Ｙ１３１３６として登録されている。
【００２２】
配列番号２に記載のアミノ酸配列は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによりエンコードされＮ末端アミダーゼ活性を有するＮＴＡ１タンパク質のアミノ酸配列である。配列番号２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔのデータベースにＰ４０３５４として登録されている。
【００２３】
本明細書においてヌクレオチド配列の相同性は、本発明のヌクレオチド配列と、比較対象のヌクレオチド配列との間でヌクレオチド配列が一致する部分が最も多くなるように整列させて、ヌクレオチド配列が一致する部分のヌクレオチドの数を本発明のヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数で割った商の百分率で表される。同様に、本明細書においてアミノ酸配列の相同性は、本発明のアミノ酸配列と、比較対象のアミノ酸配列との間で配列が一致するアミノ酸残基の数が最も多くなるように整列させて、配列が一致するアミノ酸残基の数の合計を本発明のアミノ酸配列のアミノ酸残基の総数で割った商の百分率で表される。本発明のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の相同性は、当業者に周知の配列整列プログラムＣＬＵＳＴＡＬＷを使用することにより算出することができる。
【００２４】
本明細書において「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明されるサザンブロット法で以下の実験条件で行うことを指す。比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドをアガロース電気泳動によりバンドを形成させた上で毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。６Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化された比較対象のポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６Ｘ ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２Ｘ ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。本明細書において「ストリンジェントな条件」でハイブリダイゼーションをするとは、比較対象のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した固相に残存するプローブの量が、本発明のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを不動化した陽性対照実験の固相に残存するプローブの量の少なくとも２５％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％以上であることを指す。
【００２５】
本明細書において「Ｎ末端アミダーゼ活性」とは、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドに対して作用し、前記Ｎ末端のアミド基含有アミノ酸の脱アミド化反応を行う能力である。
【００２６】
本明細書において「脱アミド化」又は「脱アミド化反応」とは、以下の化学式１に示すアミド基含有アミノ酸のアミド基が加水分解され、カルボキシル基及びＮＨ3が生成されることにより、アミド基含有アミノ酸が酸性アミノ酸に変換される反応である。
【００２７】
【化２】
【００２８】
本明細書において「アミド基含有アミノ酸」とは、アミノ酸の側鎖にアミド基を含むアミノ酸である。アミド基含有アミノ酸は、Ｌ−アスパラギン、Ｄ−アスパラギン、Ｌ−グルタミン、Ｄ−グルタミン等を含むがこれらに限定されない。好ましくは前記アミド基含有アミノ酸はＬ−アスパラギン又はＬ−グルタミンである。
【００２９】
本明細書において「酸性アミノ酸」とは、アミノ酸分子内に２個以上のカルボキシル基を含むアミノ酸である。前記酸性アミノ酸は、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｄ−グルタミン酸、Ｌ−２−アミノアジピン酸、Ｄ−２−アミノアジピン酸、Ｌ−２−アミノピメリン酸、Ｄ−２−アミノピメリン酸等を含むがこれらに限定されない。好ましくは前記酸性アミノ酸はＬ−アスパラギン酸又はＬ−グルタミン酸である。
【００３０】
本発明のＮ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は、（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるＮＴＡ１タンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列と９９％、９８％、９５％、９０％、８５％又は８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１のヌクレオチド配列と９９％、９８％、９５％、９０％、８５％又は８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択される場合がある。
【００３１】
本発明の融合タンパク質は、特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質のアミノ末端又はカルボキシル末端に連結したものである。
【００３２】
本発明の特異的結合タグペプチドは、前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質を調製する際に、発現したタンパク質の検出、分離又は精製をより容易に行うことを可能にするために、他のタンパク質、多糖類、糖脂質、核酸及びこれらの誘導体、樹脂等と特異的に結合するポリペプチドである。特異的結合タグと結合するリガンドは、水溶液中に溶解した遊離状態の場合も固体支持体に不動化される場合もある。そこで、本発明の融合タンパク質は固体支持体に不動化されたリガンドに特異的に結合するため、発現系の他の成分を洗浄除去することができる。その後、遊離状態のリガンドを添加したり、ｐＨ、イオン強度その他の条件を変えることにより、固体支持体から前記融合タンパク質を分離して回収することができる。本発明の特異的結合タグは、Ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、インテインタグ、ＭＢＰ、ＧＳＴその他これらに類するポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特異的結合タグは、融合タンパク質がＮ末端アミダーゼ活性を保持することを条件としていかなるアミノ酸配列を有してもかまわない。
【００３３】
本明細書において、「Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチド」とはペプチド鎖のＮ末端アミノ酸残基がアミド基含有アミノ酸残基であるペプチドを指し、「Ｎ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチド」とはペプチド鎖のＮ末端アミノ酸残基が酸性アミノ酸残基であるペプチドを指す。本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、２個のアミノ酸残基から構成される(ジペプチド)場合と、３個のアミノ酸残基から構成される(トリペプチド)場合と、４個又は５個のアミノ酸残基から構成場合と、６、７、８又は９個のアミノ酸残基から構成される場合と、少なくとも１０個のアミノ酸残基から構成される場合と、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも５０個又は少なくとも１００個のアミノ酸残基から構成される場合とを含むが、これらに限定されない。また本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、本発明のＮ末端アミダーゼ活性を阻害しないことを条件として、Ｌ−アミノ酸の他、Ｄ−アミノ酸、非天然型アミノ酸等であってもよい。また本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、カルボキシル末端にオキソ酸を含むデプシペプチドであってもよい。さらに本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、その構成アミノ酸残基の側鎖か、あるいは、カルボキシル末端かが共有結合によって誘導体化又は修飾される場合がある。誘導体化は、例えばアミノ基に対してＮ−フェニルアセチル基、ヒドロキシル基に対して４，４'−ジメチトキシトリチル（ＤＭＴ）基というように当業者に周知の保護基で誘導体化される場合があり、他の「タンパク質」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」又は「ポリペプチド」か、糖、脂質、核酸等の生体高分子か、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリビニル、ポリエステルその他の合成高分子かと結合される場合がある。本明細書において、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドと、該ペプチドから本発明の製造方法によって生産されるＮ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドとは、天然樹脂、合成樹脂、金属、複合材料その他の固体支持体に結合又は吸着している場合がある。
【００３４】
本発明のＮ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドの誘導体は、該ペプチドのＮ末端のアミド基含有アミノ酸残基以外のアミノ酸残基、すなわち、Ｎ末端を第１のアミノ酸残基とするとき、第ｎ番目のアミノ酸残基（ｎは２又は３以上の自然数）がエステル基その他の原子団によって修飾される場合がある。前記エステル基は、例えば、メチルエステル、エチルエステルその他の脂肪族エステルか、芳香族エステルかを含む場合がある。また、前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドの誘導体は、Ｃ末端のアミノ酸残基のカルボキシル基にオキソ酸又はその誘導体が結合する場合がある。
【００３５】
本発明の製造方法におけるＮ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、固相法又は液相法のような化学的合成法と、酵素合成法と、発酵法のような生物学的合成法とのような当業者に周知の方法を使用して調製される。前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、実質的に特定のアミノ酸配列からなる単一のペプチド分子種の場合の他、天然タンパク質含有材料から加水分解処理を施された複数のアミノ酸配列のペプチド分子種の混合物の場合がある。前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドの誘導体は、前記加水分解処理を施される前に誘導体化される場合と、前記加水分解処理を施された後に誘導体化される場合とがある。前記ペプチド分子種の混合物を加水分解処理は、ペプチダーゼ、プロテアーゼ等を用いる酵素的方法や、酸加水分解等の化学的方法によって行われる場合がある。前記加水分解処理に用いられる酵素は、精製タンパク質の場合の他、当該酵素を発現する細胞か、該細胞由来の細胞成分又は粗抽出物であって前記酵素活性を有するものかの場合がある。
【００３６】
本発明の製造方法のステップ（Ｂ）の脱アミド化反応のインキュベーション温度は１５〜４０°Ｃ、好ましくは２０〜３５°Ｃ、最も好ましくは２５〜３０°Ｃの場合があるがこれらに限定されない。インキュベーション時間は５時間以上、好ましくは１０〜４０時間、最も好ましくは２５〜３５時間の場合があるがこれらに限定されない。
【００３７】
本発明の製造方法のステップ（Ｂ）は、反応液を加熱し本発明のタンパク質を失活させることにより停止される場合がある。
【００３８】
本発明の製造方法により取得されるＮ末端に酸性アミノ酸を含むペプチドは、イオン交換樹脂その他の担体への特異的吸着、薄層クロマトグラフィ法、高速液体クロマトグラフィ法その他のクロマトグラフィ法、有機溶媒による抽出、結晶化等の当業者に周知の方法により回収される。また、前記ペプチドは、ＨＰＬＣ又はＨＰＬＣ／ＭＳのような当業者に周知の分析技術を使用して生産量又は純度が評価される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
以下の実施例によって本発明について詳細な説明を行なうが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。
【実施例１】
【００４０】
１．ＮＴＡ１タンパク質の取得
１−１．方法
（遺伝子増幅の鋳型）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｓ２８８Ｃ由来のＹＫＯ ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｔｒａｉｎであるＢＹ４７４１（Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。ＢＹ４７４１はその遺伝子型（ＭＡＴαｈｉｓ３Δ１ ｌｅｕ２Δ１ ｍｅｔ１５Δ０ ｕｒａ３Δ０）から明らかなとおり一部の遺伝子が破壊されている。しかし目的遺伝子ｎｔａ１はインタクトに保たれていることから、遺伝子増幅の鋳型ＤＮＡの出所として使用した。
【００４１】
（目的遺伝子の抽出及び増幅）
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのゲノムＤＮＡの抽出とＲＮＡ除去とは、ＩＳＯＰＬＡＮＴ ＩＩ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を使用し、製品添付のプロトコールに従って行なった。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｎｔａ１遺伝子にはイントロンが含まれていないことから、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりｎｔａ１遺伝子を増幅した。ポリメラーゼは、ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ）を製品添付のプロトコールに従い使用した。ＰＣＲ反応のアニーリング温度は５３°Ｃに設定した。プライマーの配列は表１配列番号３及び４に示される。プライマーの配列は、目的とするタンパク質のＣ末端にＨｉｓタグが付加されるように設計した。ＰＣＲ産物の精製にはｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
（組換えプラスミドの取得）
ＰＣＲ産物及びベクターｐＥＴ−２１ａ（＋）を、制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ（Ｎｉｐｐｏｎｇｅｎｅ）を使用して切断した。これらを、ＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２．１（Ｔａｋａｒａ）を使用して連結した。ライゲーション産物の精製にはｉｌｌｕｓｔｒａ ＧＦＸ ＰＣＲ ＤＮＡ ａｎｄ Ｇｅｌ Ｂａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。精製後のライゲーション産物を、エレクトロポレーション法により遺伝子クローニング用の宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９へ導入した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９形質転換体からの抽出により、目的長の組換えプラスミドｐＥＴ２１−ＮＴＡ１（＋１）を取得した。プラスミドの抽出にはｉｌｌｕｓｔｒａ ｐｌａｓｍｉｄ Ｐｒｅｐ Ｍｉｎｉ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。
【００４４】
（ｎｔａ１遺伝子の導入及び発現）
取得した組換えプラスミドをエレクトロポレーション法により遺伝子発現用の宿主大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ λ（ＤＥ３）に導入し、遺伝子発現用組換え大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ λ（ＤＥ３）／ｐＥＴ２１−ＮＴＡ１（＋１）を取得した。前記組換え大腸菌を、アンピシリン５０μｇ／ｍＬ及びクロラムフェニコール３０μｇ／ｍＬを添加したＬＢ培地中で培養した。前記組換え大腸菌を、まず３ｍＬのＬＢ培地を使用して３７°Ｃ、１２０ｒｐｍで５時間シード培養した。前記シード培養液１ｍＬを、１００ｍＬの新しいＬＢ培地へ植菌し、３７°Ｃ、１２０ｒｐｍで２時間培養した後、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、２５°Ｃで２０時間培養を継続した。培養終了後、約１３００×ｇ、１０分間の遠心分離により菌体を回収した。回収した菌体を、１回目は培養液と等量の、２回目は半量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を使用して２回洗菌を行なった。
【００４５】
（酵素タンパク質の精製（Ｎｉ2+アフィニティークロマトグラフィー））
集洗菌した菌体のペレットを、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＬに懸濁し、１０分間の超音波破砕を行なった。破砕した菌体を、１７７００×ｇで３０分遠心分離し、上清を回収して無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液を、１０ｍＬの結合バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）で平衡化したＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ １ｍＬカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ供し、吸着したタンパク質を同じく結合バッファー１０ｍＬで洗浄した。その後、５ｍＬの溶出バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で溶出し、１ｍＬずつのフラクションに分画した。２番目及び３番目のフラクションから各１ｍＬを、１番目のフラクションから０．５ｍＬを回収して脱塩カラムＰＤ−１０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）へ供し、３．５ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）へ溶出することで、精製酵素を取得した。
【００４６】
１−２．結果
上述の方法により取得されたＨｉｓタグ融合型ＮＴＡ１タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、該Ｈｉｓタグ融合型ＮＴＡ１タンパク質のアミノ酸とをそれぞれ配列番号５及び６に示す。配列番号５のヌクレオチド配列を有する遺伝子の導入及び発現と、発現したタンパク質のアフィニティー精製とにより、配列番号６のアミノ酸からなるＮＴＡ１タンパク質を取得することができた。取得されたＮＴＡ１タンパク質を、以下の実験に使用した。
【実施例２】
【００４７】
２．ＮＴＡ１酵素によるアミド基含有アミノ酸の脱アミド化
２−１．方法
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中に、１２．５ｍＭのアスパラギン又はグルタミンと、０．１ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素とを含む反応液を調製した。これらの反応液を３０°Ｃで２０時間インキュベーションすることにより脱アミド化反応を行なった。反応終了後、１０分間煮沸した後に遠心分離（約２１，０００×ｇ、１０分、４°Ｃ）を行い、上清を回収した。この上清１００μＬをＦＤＡＡ（１−フルオロ−２，４−ジニトロフェニル−５−アラニンアミド）により誘導体化し、メタノール７７０μＬで希釈して総量１ｍＬとした上で、ＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析条件は、ＨＩＴＡＣＨＩ ＴＥＣＨＩＣＡＬ ＤＡＴＡ シートＮｏ．１３１（４．グラジエントモードでの測定例）に従った。
【００４８】
２−２．結果
上述の反応の結果得られたアスパラギン酸及びグルタミン酸の生成量は共に０．１ｍＭ以下（収率０．８％以下）であった。この結果から、ＮＴＡ１タンパク質は単一アミノ酸としてのアスパラギン又はグルタミンの脱アミド化反応を行なう能力が低いことが確認された。ＮＴＡ１タンパク質がタンパク質のＮ末端のアスパラギン又はグルタミンの脱アミド化反応を触媒する酵素であることは既に報告がある。しかし本実施例の結果によれば、ＮＴＡ１タンパク質の基質特異性、すなわち、遊離のアスパラギン又はグルタミンとか、Ｎ末端にアスパラギン又はグルタミンを含む短鎖のペプチドとかを基質として脱アミド化反応を触媒することができるかどうかは前記報告から予測することはできないことが明らかである。
【実施例３】
【００４９】
３．ＮＴＡ１酵素によるアミド基含有アミノ酸を含むジペプチドの脱アミド化
３−１．方法
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中に、１２．５ｍＭのＡｓｎ−Ｖａｌ又はＧｌｎ−Ｇｌｙと、０．１ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素とを含む反応液を調製した。これらの反応液を３０°Ｃで２０時間インキュベーションすることにより脱アミド化反応を行なった。反応終了後、反応液を１０分間煮沸した後に遠心分離（約２１，０００×ｇ、１０分、４°Ｃ）を行い上清を回収した。この上清１００μＬをＦＤＡＡにより誘導体化し、メタノール７７０μｌで希釈して総量１ｍＬとした上で、ＨＰＬＣ分析に供した。ＨＰＬＣ分析条件は、ＨＩＴＡＣＨＩ ＴＥＣＨＩＣＡＬ ＤＡＴＡ シートＮｏ．１３１（４．グラジエントモードでの測定例）に従った。
【００５０】
３−２．結果
上述の反応及びＨＰＬＣ分析の結果、Ａｓｎ−Ｖａｌを基質とする反応からは６．８ｍＭのＡｓｐ−Ｖａｌ（収率５４％）が、Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質とする反応からは２．２ｍＭのＧｌｕ−Ｇｌｙ（収率１８％）の生成が確認された。
【００５１】
また別の実験において、ＴＬＣ分析により、Ｇｌｎ−Ｇｌｎを基質とする反応の結果Ｇｌｕ−Ｇｌｎと考えられるスポットが出現することが確認されている。
【００５２】
さらに別の実験において、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析により、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｙ、Ａｓｎ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ−Ｍｅｔ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ｇｌｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｃｙｓ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｍｅｔ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ又はＧｌｎ−Ｖａｌを基質とする反応の結果、Ａｓｐ−Ａｌａ、Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｙ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｍｅｔ、Ａｓｐ−Ｔｒｐ、Ｇｌｕ−Ａｌａ、Ｇｌｕ−Ｃｙｓ、Ｇｌｕ−Ｇｌｙ、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、Ｇｌｕ−Ｍｅｔ、Ｇｌｕ−Ｐｈｅ、Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、Ｇｌｕ−Ｔｈｒ又はＧｌｕ−Ｖａｌに相当するｍ／ｚピークがそれぞれ生成することが確認された。
【００５３】
これらの結果からＮＴＡ１タンパク質は、Ｎ末端にＬ−アスパラギン又はＬ−グルタミンを含む種々のジペプチドにおいてＮ末端のＬ−アスパラギン又はＬ−グルタミンの脱アミド化反応を行なう能力を有することが確認された。
【実施例４】
【００５４】
４．ＮＴＡ１酵素によるアミド基含有アミノ酸を含むトリペプチドの脱アミド化
４−１．方法
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中に、１２．５ｍＭのＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏと、０．１ｍｇ／ｍＬ又は０．２ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素とを含む反応液を調製した。これらの反応液を３０°Ｃで２０時間インキュベーションすることにより脱アミド化反応を行なった。また陰性対照として、１２．５ｍＭのＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを前記バッファー中に含むがＮＴＡ１酵素は含まない反応液も調製し、酵素を含む反応液と同様に３０°Ｃで２０時間インキュベーションした。インキュベーションの終了後、各反応液についてＨＰＬＣ／ＭＳ分析を行った。
【００５５】
４−２．結果
ＨＰＬＣ／ＭＳ分析の結果を図１に示す。陰性対照の反応液のＭＳチャート（図１−Ａ）では基質であるＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏに対応するｍ／ｚピーク（［ｍ＋Ｈ］＝３０１）が主に確認された。それに対して０．１ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素で反応を行った反応液のＭＳチャート（図１−Ｂ）と、０．２ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素で反応を行った反応液のＭＳチャート（図１−Ｃ）とからは、ＮＴＡ１酵素の使用濃度が高くなるにつれて脱アミド化生成物であるＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏに対応するｍ／ｚピーク（［ｍ＋Ｈ］＝３０２）が顕著になっていくことが確認された。この結果からＮＴＡ１タンパク質は、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むトリペプチドにおいてＮ末端のアミド基含有アミノ酸の脱アミド化反応を行なう能力を有することが確認された。
【実施例５】
【００５６】
５．Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドに対するＮＴＡ１酵素の脱アミド化反応の反応性と、該ペプチドのアミノ酸残基数との関係
５−１．方法
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）バッファー中に、１２．５ｍＭのＧｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏと、０．１ｍｇ／ｍＬ又は０．２ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素とを含む反応液を調製した。これらの反応液を３０°Ｃで２０時間インキュベーションすることにより脱アミド化反応を行なった。また陰性対照として、１２．５ｍＭのＧｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを前記バッファー中に含むがＮＴＡ１酵素は含まない反応液も調製し、酵素を含む反応液と同様に３０°Ｃで２０時間インキュベーションした。インキュベーションの終了後、前記反応液についてＴＬＣ分析を行った。ＴＬＣではｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）を使用し、酢酸：１−ブタノール：水＝１：３：１の展開液を使用して分析した。
【００５７】
５−２．結果
ＴＬＣ分析の結果を図２に示す。Ｇｌｎを基質とする反応液の分析結果（レーン１−４）では、酵素反応後液においても基質由来のスポットが主に観察されＧｌｕと考えられるスポットは僅かに確認されたのみであった（レーン３及び４）。Ｇｌｎ−Ｇｌｙを基質とする反応液の分析結果（レーン５−８）では、酵素反応後液において基質由来のスポットの上部にＧｌｕ−Ｇｌｙと考えられるスポットが確認された（レーン７及び８）。Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを基質とする反応液の分析結果（レーン９−１２）では、酵素反応後液において基質由来のスポットはほぼ消失し、その上部にＧｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏと考えられるスポットが確認された（レーン１１及び１２）。この結果から、基質であるＮ末端にアミド基含有アミノ酸を含むペプチドにおけるアミノ酸残基の数が多いほど、ＮＴＡ１酵素の脱アミド化反応の反応性が高いことが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１−Ａ】インキュベーション後の、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを含むがＮＴＡ１酵素は含まない反応液（陰性対照）のＭＳチャート。
【図１−Ｂ】Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを基質として０．１ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素で反応を行なった反応液のＭＳチャート。
【図１−Ｃ】Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを基質として０．２ｍｇ／ｍＬのＮＴＡ１酵素で反応を行なった反応液のＭＳチャート。
【図２−Ａ】Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏを基質としてＮＴＡ１酵素で反応を行なった反応液のＴＬＣ分析結果を示すクロマトグラム。
【図２−Ｂ】図２−Ａのクロマトグラムの各レーンの試料の処理条件を示す表。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ）Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドとを用意するステップと、
（Ｂ）前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質を前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドに対して作用させて前記アミド基含有アミノ酸残基を脱アミド化するステップとを含むことを特徴とする、Ｎ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は、（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるＮＴＡ１タンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アミド基含有アミノ酸残基はＬ−アスパラギン残基又はＬ−グルタミン残基であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、以下の化学式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【化１】
上記化学式（Ｉ）において、ＡＡ0はＡｓｎ又はＧｌｎを表し、ＡＡ1はいずれかのＬ−アミノ酸残基又はその誘導体を表し、Ｒ1、Ｒ2、・・・Ｒn（ｎは１又は２以上の自然数）はいずれかのＬ−アミノ酸残基又はその誘導体か、Ｄ−アミノ酸残基又はその誘導体かを表す。
【請求項５】
前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、ジペプチド又はトリペプチドか、これらの誘導体かであることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｙ、Ａｓｎ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ−Ｍｅｔ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｇｌｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｃｙｓ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｍｅｔ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏか、これらの誘導体かであることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【請求項１】
（Ａ）Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドとを用意するステップと、
（Ｂ）前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質を前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドに対して作用させて前記アミド基含有アミノ酸残基を脱アミド化するステップとを含むことを特徴とする、Ｎ末端に酸性アミノ酸残基を含むペプチドの製造方法。
【請求項２】
前記Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質は、（１）配列番号２のアミノ酸配列からなるＮＴＡ１タンパク質と、（２）配列番号２のアミノ酸配列に１個若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（３）配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を示すアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（４）配列番号１のヌクレオチド配列と８０％以上の相同性を示すヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（５）配列番号１のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションをするポリヌクレオチドによってエンコードされるアミノ酸配列からなり、かつ、Ｎ末端アミダーゼ活性を有するタンパク質と、（６）特異的結合タグペプチドが前記（１）ないし（５）のいずれかのタンパク質に連結した融合タンパク質とからなるグループから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アミド基含有アミノ酸残基はＬ−アスパラギン残基又はＬ−グルタミン残基であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、以下の化学式（Ｉ）で表される化合物であることを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【化１】
上記化学式（Ｉ）において、ＡＡ0はＡｓｎ又はＧｌｎを表し、ＡＡ1はいずれかのＬ−アミノ酸残基又はその誘導体を表し、Ｒ1、Ｒ2、・・・Ｒn（ｎは１又は２以上の自然数）はいずれかのＬ−アミノ酸残基又はその誘導体か、Ｄ−アミノ酸残基又はその誘導体かを表す。
【請求項５】
前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、ジペプチド又はトリペプチドか、これらの誘導体かであることを特徴とする、請求項１ないし３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記Ｎ末端にアミド基含有アミノ酸残基を含むペプチドは、Ａｓｎ−Ａｌａ、Ａｓｎ−Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ−Ｇｌｙ、Ａｓｎ−Ｈｉｓ、Ａｓｎ−Ｍｅｔ、Ａｓｎ−Ｔｒｐ、Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｇｌｎ−Ａｌａ、Ｇｌｎ−Ｃｙｓ、Ｇｌｎ−Ｇｌｎ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、Ｇｌｎ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｍｅｔ、Ｇｌｎ−Ｐｈｅ、Ｇｌｎ−Ｓｅｒ、Ｇｌｎ−Ｔｈｒ、Ｇｌｎ−Ｖａｌ又はＧｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏか、これらの誘導体かであることを特徴とする、請求項５に記載の製造方法。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【図２−Ｂ】
【図２−Ａ】
【公開番号】特開２００９−２７８９２８（Ｐ２００９−２７８９２８Ａ）
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３５０７３（Ｐ２００８−１３５０７３）
【出願日】平成２０年５月２３日（２００８．５．２３）
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月３日（２００９．１２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２３日（２００８．５．２３）
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
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