ペプチドまたはタンパク質の制御放出送達
【課題】ペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出のための方法および組成物を、そしてペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出に有用な組成物および装置の製造方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、ペプチドまたはタンパク質の制御放出のための組成物であって、ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックス相が中に分散されている生物適合性、生物侵食性ポリマーを含み、前記ガラス状マトリックス相は前記ポリマーの融点より高いガラス転移温度を有する組成物を提供する。
【解決手段】本発明は、ペプチドまたはタンパク質の制御放出のための組成物であって、ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックス相が中に分散されている生物適合性、生物侵食性ポリマーを含み、前記ガラス状マトリックス相は前記ポリマーの融点より高いガラス転移温度を有する組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
［発明の背景］
本発明は、ペプチドまたはタンパク質の制御送達の分野に、ならびにペプチドまたはタンパク質の制御送達に有用な組成物に関する。
【０００２】
典型的には微小球、棒、シートまたはペレット形態の高分子マトリックスが、薬剤製品の持続性放出または制御放出に用いられてきた。活性剤がポリマーマトリックス中に混入され得る種々の技術が知られている。それらの例は、溶剤蒸発、噴霧乾燥、乳化であり、あるいは個々のサイズまたは形状の粒子の単純な物理的混合による。ペプチドおよびタンパク質の壊れやすい性質のために、これらのアプローチのうち、ポリマーへのペプチドまたはタンパク質薬剤の混入に容易に適合され得るものはない。ペプチドおよびタンパク質は、溶剤によるか、乳化によるかまたは熱による変性を受けやすい。不安定性の問題を回避するために、特許文献１は、制御放出ポリマーマトリックス中へのタンパク質の混入のための極低温注型法を記載している。低温加工は非常に厄介で、特 別な設備を要し、そして工程中の結露は潜在的問題となるため、この技法はいくつかの欠点を有する。
【０００３】
限定された形状およびサイズに注型され得る溶融ポリマー中にペプチドまたはタンパク質薬剤を混合し得ることが望ましい。残念ながら、ほとんどのタンパク質がポリマーの融点よりはるかに低い温度で変性する。
【０００４】
身体内で高分子マトリックスから放出される条件下で、ペプチドまたはタンパク質薬剤が安定であることも望ましい。ほとんどの生物侵食性ポリマーが、エステル結合の加水分解により身体内で脱重合される。この加水分解は高酸性の局所領域を生じ得る。多数のペプチドまたはタンパク質薬剤は酸性条件で不安定であるため、これは、薬剤が放出される前にその不活性化を生じ得る。酸性条件下で不安定であるこのような一タンパク質薬剤は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である。種々の長さの形態で、例えば１４６、１５４および１５７アミノ酸形態で単離されているこのタンパク質は、有効な血管形成剤ならびに創傷治癒中の細胞増殖および移動の刺激剤である。ヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列およびその推定上のアミノ酸配列が、特許文献２に開示されている。その血管形成特性のため、それは、冠状動脈疾患および末梢血管疾患のようなアテローム性動脈硬化症状を有する個体の動脈における閉塞を迂回するために新規の毛細血管床の局所性増殖を促進するのに有用である。このタンパク質は、創傷治癒に必要なマトリックスの放出に関与する主細胞である繊維芽細胞に対して走化性でもあり、その例としては治癒創傷の引張強さを確定するコラーゲンが挙げられる。ｂＦＧＦを所望の部位に有効に送達し、このような症状の処置に際してｂＦＧＦの全身性送達に関連するあらゆる考え得る副作用を回避するためには、血管形成または創傷治癒活性が必要な部位またはその付近に移植のための制御放出装置を提供することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第5,019,400号
【特許文献２】米国特許第5,514,566号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
［発明の要約］
本発明は、ペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出のための方法および組成物を、そしてペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出に有用な組成物および装置（device）の製造方法を提供する。
本発明の一実施態様では、ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックス相が中に分散された生物適合性、生物侵食性ポリマーを含むペプチドまたはタンパク質の制御放出のための組成物であって、前記のガラス状マトリックス相が前記のポリマーの融点より高いガラス転移温度を有する組成物が提供される。ペプチドまたはタンパク質薬剤は組成物中で安定であるため、それは、その溶融状態で、薬剤送達インプラントとして用いられる適切に造形された装置中に、例えば棒、フィルム、ビーズまたはその他の所望の形状で形成されるのが便利である。
【０００７】
本発明の別の実施態様では、このような投与を必要とする動物への生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与の方法であって、このような動物に本発明の組成物から形成される装置を移植することを含む方法が提供される。
本発明のさらに別の実施態様では、生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出送達のための組成物の製造方法であって、以下の（ａ）ポリマーの融点より高く、ガラス状マトリックスのガラス転移温度より低い温度で生物適合性、生物侵食性ポリマー中に生理活性ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックスを分散し、そして（ｂ）ポリマーが固体である温度に分散体を冷却する工程を含む方法が提供される。所望により、冷却前に、所望の形状を有する送達装置中に分散体は形成されるかまたは注型され得る。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様では、熱保護剤は、トレハロース、メレチトース、セロビオース、メリビオース、ラフィノースおよびラクトースからなる群から選択される。本発明の組成物および装置中に用いるための好ましいポリマーは、約６５℃より低い融点を有するポリ（ε−カプロラクトン）である。
【０００９】
本発明の組成物および装置は、in vivoでのタンパク質の製造または送達中にタンパク質の有意の分解を伴わずに、ｂＦＧＦまたは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の優れた制御放出を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１） ペプチドまたはタンパク質の制御放出のための組成物であって、ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックス相が中に分散されている生物適合性、生物侵食性ポリマーを含み、前記ガラス状マトリックス相は前記ポリマーの融点より高いガラス転移温度を有する組成物。
（項目２） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは生分解性である項目１記載の組成物。
（項目３） ガラス状マトリックス相のガラス転移温度は６５℃より高い項目１記載の組成物。
（項目４） 熱保護剤は、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メレチトース、メリビオースおよびラフィノースからなる群から選択される項目１記載の組成物。
（項目５） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリカプロラクトンである項目１記載の組成物。
（項目６） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、６５℃より低い融点を有するポリ（ε−カプロラクトン）である項目１記載の組成物。
（項目７） 生理活性ペプチドまたはタンパク質は、塩基性繊維芽細胞増殖因子または血管内皮増殖因子である項目１記載の組成物。
（項目８） 熱保護剤は、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メレチトース、メリビオースおよびラフィノースから選択される項目７記載の組成物。
（項目９） 熱保護剤はスクロースであり、そしてガラス状マトリックス相は１％より低い含水量を有する項目７記載の組成物。
（項目１０） 熱保護剤はトレハロースである項目７記載の組成物。
（項目１１） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である項目７記載の組成物。
（項目１２） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である項目８記載の組成物。
（項目１３） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、６５℃より低い融点を有するポリ（ε−カプロラクトン）である項目９記載の組成物。
（項目１４） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、６５℃より低い融点を有するポリ（ε−カプロラクトン）である項目１０記載の組成物。
（項目１５） 生理学的条件下でのポリマーの加水分解は、組成物内の局所ｐＨを４より低く下げさせない速度で起こる項目７記載の組成物。
（項目１６） 動物への生理活性ペプチドまたはポリマーの制御放出送達のための装置であって、造形インプラントの形態での項目１記載の組成物を含む装置。
（項目１７） 動物への生理活性ペプチドまたはポリマーの制御放出送達のための装置であって、造形インプラントの形態での項目７記載の組成物を含む装置。
（項目１８） 造形インプラントは、棒、ディスクおよび球から選択される形態である項目１６記載の装置。
（項目１９） 生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与を必要とする動物への生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与の方法であって、このような動物に項目１６記載の装置を移植することを含む方法。
（項目２０） 生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与を必要とする動物への生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与の方法であって、このような動物に項目１７記載の装置を移植することを含む方法。
（項目２１） 生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与を必要とする動物への生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与の方法であって、このような動物に項目１８記載の装置を移植することを含む方法。
（項目２２） 生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出送達のための組成物の製造方法であって、以下の（ａ）ポリマーの融点より高く、ガラス状マトリックスのガラス転移温度より低い温度で生物適合性、生物侵食性ポリマー中に生理活性ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックスを分散し、そして（ｂ）ポリマーが固体である温度に分散体を冷却する工程を含む方法。
（項目２３） ガラス状マトリックスは、凍結乾燥粉末の形態である項目２２記載の方法。
（項目２４） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、生分解性である項目２２記載の方法。
（項目２５） ガラス状マトリックス相のガラス転移温度は、６５℃より高い項目２２記載の方法。
（項目２６） 熱保護剤は、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メレチトース、メリビオースおよびラフィノースからなる群から選択される項目２２記載の方法。
（項目２７） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である項目２２記載の方法。
（項目２８） 生理活性ペプチドまたはタンパク質は、塩基性繊維芽細胞増殖因子または血管内皮増殖因子である項目２２記載の方法。
（項目２９） 熱保護剤は、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メレチトース、メリビオースおよびラフィノースから選択される項目２８記載の方法。
（項目３０） 熱保護剤は、スクロースであり、そしてガラス状マトリックスは０．５％より低い含水量を有する項目２８記載の方法。
（項目３１） 熱保護剤はトレハロースである項目２８記載の方法。
（項目３２） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である項目２８記載の方法。
（項目３３） 血管遮断による動物中の血流低減の軽減方法であって、このような遮断の部位またはその付近に項目１７記載の薬剤送達装置を移植することを含む方法。
（項目３４） 前記装置は、約２５μg〜約２５０μgのｂＦＧＦを含有する項目３３記載の方法。
（項目３５） 前記動物は、冠状動脈疾患または末梢血管疾患を有するヒトである項目３３記載の方法。
（項目３６） 動物における創傷治癒の促進方法であって、新脈管形成および繊維芽細胞蓄積に有効な量の項目７記載の組成物を創傷に適用することを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｂＦＧＦの送達のための制御放出装置を製造するための本発明の方法の一実施態様の略図である。
【図２】本発明の３つの処方物からのｂＦＧＦのin vitro放出をプロットしたグラフである。
【図３】ポリカプロラクトン棒から回収されたＶＥＧＦの長期in vitro生理活性をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［発明の詳しい説明］
本発明によれば、ペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出送達のための組成物および装置を製造するための有効な手段が提供される。ペプチドまたはタンパク質薬剤はポリマーの融点より高いガラス転移温度を有するガラス状マトリックス相中に分散される時、ペプチドまたはタンパク質薬剤は溶融段階で生物侵食性、生分解性ポリマーマトリックス中に分散され得ることを、本発明者等は確定している。特定の制御放出送達装置を製造するための本発明の方法は、図１に示されている。この図は、ポリマーとしてポリ（ε−カプロラクトン）を用いるｂＦＧＦの送達のための制御放出装置の製造の略図である。
本発明の方法および組成物は、有利であることに、熱による不活性化を受けやすいあらゆるタンパク質またはペプチドの制御放出送達のために用いられる。一般的に、その活性がその三次構造の保持による、あらゆるタンパク質またはペプチド薬剤は、熱による不活性化を被りやすい。いくつかの小ペプチドは活性のために三次構造の保持を必要としないが、一方、ほとんどすべてのタンパク質薬剤は熱による不活性化を受けやすい。したがって、本発明の方法および組成物は、広範囲のタンパク質、例えば増殖因子、造血因子、ホルモン、サイトカイン、リンホカインおよび免疫機能を刺激または抑制する因子を用い得る。本発明の方法および組成物がヒトｂＦＧＦおよび血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の局所送達に特に良好に適していることを、本発明者等は見出した。
【００１２】
ガラス状マトリックス相は、ペプチドまたはタンパク質薬剤および適切な熱保護剤の水性溶液を凍結乾燥することにより作成され得る。選択される特定の熱保護剤およびペプチドまたはタンパク質に対するその濃度は、凍結乾燥物の正確なガラス転移温度を確定するであろう。一般に、熱保護剤対ペプチドまたはタンパク質薬剤の重量比は、約２〜２００である。当業者は、あらゆる組合せの必要なガラス転移温度を確定し得るであろう。ガラス転移は、粘性ゴム状態から（または粘性ゴム状態への）、硬くそして比較的脆性の状態への（または硬くそして比較的脆性の状態からの）非晶質物質の可逆的変化と定義される（American Society for Testing and Materials（ASTM）E 1142）。ガラス転移温度（Ｔｇ）は、ガラス転移が起こる温度範囲のほぼ中点であると定義される（ASTM D 4092）。ペプチドまたはタンパク質薬剤および熱保護剤を含有するガラス状マトリックス相のガラス転移温度は種々の技法により確定し得るが、その最も一般的なものは示差走査熱量測定（ＤＳＣ）である。ガラス状物質が一定の速度で加熱される場合、熱流およびその温度に関連して基線移動が見出され得る。２つの基線の中点に対応する温度がガラス転移温度と考えられる。
【００１３】
トレハロース、メレチトース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メリビオースおよびラフィノースは好ましい熱保護剤である。水分はガラス状マトリックス相のＴｇに影響を及ぼすため、ガラス状マトリックス相の含水量は、好ましくは１％未満、さらに好ましくは０．５％未満である。これは、余分な水分がスクロース含有マトリックスのＴｇを好ましいポリマーであるポリ（ε−カプロラクトン）の融点より下に下げ得るために、熱保護剤としてスクロースを用いたい場合に特に当てはまる。本発明者等はＴＡ2910およびＴＡ2920示差走査熱量計を用いて、ｂＦＧＦを含有する種々の凍結乾燥マトリックスに関するＴｇを確定した。約５mgの各試料を計量し、クリンププレスを用いてアルミニウム鍋中に密封した。ＤＳＣデータを、１０℃／分の加熱速度での加熱方式で収集した。温度勾配（ramp）の開始前に、３０℃の温度または実験開始前の予測Ｔｇより低い温度で５分間、等温的に試料を平衡させた。ガラス転移がエンタルピー緩和に関連した場合には、Ｔｇを越えて試料を加熱し、出発温度に冷却し、再加熱して二次走査におけるＴｇを測定した。下記の表１は、種々の賦形剤を用いたｂＦＧＦの凍結乾燥物に関するガラス転移温度を示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】
ペプチドまたはタンパク質薬剤の他に、ガラス状マトリックス相は、通常の有効濃度で、その他の慣用的製剤賦形剤も含有し得る。典型的に用いられる賦形剤としては、例えば湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、緩衝塩、保存剤（抗細菌剤）、酸化防止剤およびキレート化剤が挙げられる。当業界で既知のように、ペプチドまたはタンパク質薬剤の濃度が制御放出装置中では比較的高く、このような賦形剤の非存在下ではペプチドまたはタンパク質の凝集が起こり得るため、賦形剤として抗凝集剤の使用が特に望まれ得る。それらが慣用的に用いられる濃度である場合の有効な抗凝集剤は当業者には周知である。それらの例としては、例えば、イノシトール、キシリトール、マンニトール、マルトース、アラビノースおよびガラクトース等のポリオールが挙げられる。
【００１６】
熱保護剤、ペプチドまたはタンパク質薬剤ならびに、もしあれば、その他の賦形剤を含有する水性溶液の凍結乾燥は、製薬業界で周知の技法を用いて実行される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed., p.1538参照）
。凍結乾燥は粉末またはケークの形態でガラス状マトリックス相を生じ、これが細砕されてポリマー中での分散に適した粉末を作成する。
【００１７】
ペプチドまたはタンパク質薬剤を含有するガラス状マトリックス相は次に、ガラス状マトリックス相のガラス転移温度より低い融点を有する生物侵食性、生物適合性ポリマー中に分散される。本明細書中で用いる場合、「生物侵食性」という用語は、生理学的環境中でポリマーが、ペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出を可能にするのに十分に分解可能であることを意味する。「生物適合性」という用語は、ポリマーの分解生成物が非毒性であり、ペプチドまたはタンパク質薬剤を不活性化しないことを意味する。好ましくは、ポリマーは生分解性でもあり、即ち、それは生理学的環境中で完全に分解され、再吸収され、したがって、薬剤を送達した後に装置のいかなる残存構成成分をも物理的に除去する必要がない。
【００１８】
本発明の組成物中に用いるための好ましいポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である。さらに好ましくは、本発明の組成物中に用いられるポリ（ε−カプロラクトン）は、約２，０００〜３０，０００、最も好ましくは約１０，０００〜２０，０００の分子量を有する。この範囲の分子量のポリ（ε−カプロラクトン）は、約５９〜６５℃の融点を有する。ポリ（ε−カプロラクトン）はさらに、送達されるペプチドまたはタンパク質薬剤が酸安定性でないもの、例えばｂＦＧＦである場合には、非常に望ましいポリマーである。生理学的条件下でのポリ（ε−カプロラクトン）の加水分解速度は、ペプチドまたはタンパク質を不活性化する低ｐＨの局所領域をポリマーの分解が生じないように十分に遅い。タンパク質はｐＨ３〜４では約２０〜３０分で完全に不活性化されるため、これは、例えばｂＦＧＦを放出する場合には、特に重要である。本発明の好ましい熱保護剤は、それらが生理学的環境に存在する水中に溶解するので、ペプチドまたはタンパク質薬剤の放出を制御するのに役立つポロシゲン(porocigen)としても作用し得る。
【００１９】
再び図１を参照すると、熱保護剤、ペプチドまたはタンパク質薬剤および／または含入したいと思う任意のその他の賦形剤を含有する凍結乾燥体が、ポリマー中に分散される。ポリマーはその融点に加熱される。ポリ（ε−カプロラクトン）の場合、ポリマーは約６５℃に加熱される。ガラス状マトリックス相は、あらゆる好都合な混合手段を用いて溶融ポリマー中に分散される。装置の薬剤放出速度を制御するためにポリマー中に付加的添加剤を分散することは有益であり得る。特に、当業界で既知のポロシゲンがポリマー中に混入されて、薬剤の放出速度が制御され得る。既知のポロシゲンとしては、例えば糖、アミノ酸、マンニトール、ソルビトール、キシリトールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。これらは、既知の有効量でポリマー中に混入され得る。
【００２０】
ガラス状マトリックス相は、通常は、組成物の全重量の約５％〜約２５％、好ましくは約１０％〜約２０％の量で存在する。組成物中に存在するガラス状マトリックス相の正確な量は、ガラス状マトリックス相中に含入されるペプチドまたはタンパク質薬剤の濃度、所望の放出速度、移植したい装置のサイズ、ならびに局所部位に送達したい薬剤の用量に大いに影響される。
【００２１】
図１に示したように、ガラス状マトリックス相を含有するポリマーは、インプラントとして用いるために、冷却前に適切な形状に、例えば棒、ディスク、シート、球に成形され得る。あるいは、ペプチドまたはタンパク質は組成物中では安定であるため、後で再加熱され、所望の形状に成形され得る。
【００２２】
本発明の薬剤送達装置は、慣用的方式で、ペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出送達を必要とする動物に移植され得る。ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦを含有する装置の場合、装置は有利なことに、血管閉塞または血管損傷の部位またはその付近に移植される。このようにして、例えば、末梢血管疾患または冠状動脈疾患に罹患した動物、例えばヒトのような哺乳類を治療し得る。ｂＦＧＦが放出されると、それは閉塞の部位を通って血液を運ぶために新規の毛細血管の形成を引き起こす新脈管形成を促す。典型的には、このような用途に用いるための装置は、約２５μg〜約２５０μgのｂＦＧＦを含有する。in vivoでの実験では、十分量のｂＦＧＦが５日間放出されて、新脈管形成を促す。本発明の薬剤送達装置は、創傷治癒を促すために、例えば褥瘡、糖尿病性潰瘍、手術および／または事故性外傷に起因する切開創傷等の治療において、あるいは骨組織の治癒において、ｂＦＧＦを送達するためにも用いられ得る。このような使用に関しては、装置は適切なサイズおよび形状に成形されて、創傷部位中に挿入され得る。あるいは、本発明の組成物は、粉末形態に粉砕され、これが創傷部位に適用され得る。このような場合、適切な投与量は、創傷床における新脈管形成を促し、それにより治癒を促す量である。適切な投与量は当業者に確定され得るし、そして少なくとも一部は、治療される創傷の性質およびサイズにより影響される。
【００２３】
以下の実施例は本明細書中に記載した本発明をさらに説明することを意図するが、本発明はそれらに限定されない。
【実施例】
【００２４】
［実施例］
実施例１
ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒の調製
Ａ．ガラス状マトリックス相の調製
４．４２gのトレハロース二水和物を１００ｍLメスフラスコ中に入れた。組換えヒトｂＦＧＦ（１５４アミノ酸形態）の８．３７mg/ｍL水性溶液８４mLをフラスコに加えた。水で溶液を１００ｍLとした後、０．２μmの滅菌アロディスク(Arodisc)（登録商標）１３フィルター（Gelman Science）を通して濾過した。濾過した溶液を次に、凍結乾燥のために小瓶（２mL／小瓶）に入れた。
各小瓶中のアリコートを、保存温度を−４５℃に２時間保持することにより先ず凍結させ、その後−１０℃で２時間アニーリングさせて、−４０℃でさらに３時間冷却した。６０mTorrで−２０℃および−２５℃でそれぞれ５時間および１５時間、一次乾燥を実施した。二次乾燥は、６０mTorrで２５〜３０℃で１０時間実施した。
【００２５】
Ｂ．ｂＦＧＦ凍結乾燥物のＰＣＬへの混入
１．１９２gの市販のポリ（ε−カプロラクトン）（分子量１０，０００〜２０，０００）を、油浴中の滅菌ビーカー中に入れた。油浴を９０℃で１時間加熱した後、６５℃に冷却した。前記と同様に作成した一小瓶からのｂＦＧＦ凍結乾燥物を、溶融ＰＣＬに添加した。凍結乾燥物を粘性ＰＣＬ中に懸濁し、攪拌して、均質分散体を得た。
【００２６】
Ｃ．ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒の調製
１６Ｇ滅菌針を用いてｂＦＧＦ凍結乾燥物−ＰＣＬ混合物を延伸して、直径約１mmの棒を形成した。棒を室温に冷却して、１０mm切片に切断した。
【００２７】
実施例２
ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒の調製
実施例１に記載したのと同様の方法で、異なる使用量のｂＦＧＦおよび異なる熱保護剤物質を用いて、ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒を調製した。各々の場合、ｂＦＧＦ（低用量に関しては２mg、高用量に関しては５０mg）、熱保護剤（８０mg〜３７０mg）、２０mMのクエン酸塩緩衝液および１mMのＥＤＴＡを含有する２mLの水性溶液を、凍結乾燥のために各小瓶に充填した。使用した熱保護剤は、トレハロース、メレチトースおよびスクロースであった。これらの溶液を凍結乾燥し、溶融ＰＣＬ中に分散させて、実施例１と同様の方法で棒に成形した。スクロース含有溶液の場合、凍結乾燥物のＴｇがＰＣＬの融点より確実に高くするために、凍結乾燥を実施して含水量を０．５％とした。
【００２８】
実施例３
棒からのｂＦＧＦのin vitro放出
実施例１と同様の方法で、熱保護剤としてトレハロース、メレチトースまたはスクロースを用いて、ｂＦＧＦを含有するＰＣＬ棒（１mm×１０mm）を調製した。トレハロースとメレチトースの場合、棒を調製するために用いた凍結乾燥物は４％の濃度の熱保護剤（凍結乾燥前w/w）を含有し、凍結乾燥物を８．３％（w/w）の濃度でＰＣＬ中に分散させた。スクロースの場合は、棒を調製するために用いた凍結乾燥物は９％の濃度のスクロース（凍結乾燥前w/w）を含有し、凍結乾燥物を１３．８％（w/w）の濃度でＰＣＬ中に分散させた。
【００２９】
棒からのｂＦＧＦのin vitro放出の測定を５℃で確定した。棒を１mLのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に入れ、溶液を攪拌棒で攪拌した。ＰＢＳ溶液を１日おきに回収し、新鮮なＰＢＳ溶液と入れ換えて容積を保持した。イオン交換ＨＰＬＣを用いて、回収ＰＢＳ溶液中のｂＦＧＦを定量し、棒から放出された累積ｂＦＧＦを計算した。棒からのｂＦＧＦの放出を時間を追って、図２のグラフにプロットした。図では、トレハロース含有処方物に関するデータ点を白丸で、メレチトース含有処方物に関するデータ点を中黒三角で、そしてスクロース含有処方物に関するデータ点を中黒丸で表している。
【００３０】
実施例４
ｂＦＧＦ−ＰＣＬインプラントによる新脈管形成の促進
雄および雌のスプラーグ ダウレイ（Sprague Dawley）ラット（体重２２５〜４２５g）をイソフルランの吸入により簡単に麻酔した。腹部域を剃り、７０％エタノールで清浄した。実施例１と同様に作成したＰＣＬ中にｂＦＧＦ（組換え的に産生したヒトｂＦＧＦ、１５４アミノ酸形態）を含有する棒（１mm×１０mm）を、１４ゲージ静脈内カテーテル配置針中に挿入した。腹部皮膚を組織鉗子で把持し、骨盤の約２cm上を正中線に沿って針を刺し通した。細いワイヤを用いて、皮膚と腹筋層との間の位置にペレットを進行させた。針を除去し、動物を計量して、適切なケージに戻した。イソフルランの吸入中止のほとんど直後に、動物は敏捷に動くことができた。
【００３１】
ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒の最初の設置後５日目に、二酸化炭素吸入またはフェノバルビタール過剰投与により動物を安楽死させた。体重を記録し、腹部皮膚を穏やかに切開して、反転させて、腹筋を露呈させた。位置に関するコメントおよび血管分布、ならびに顆粒形成組織累積を記録し、そして各動物の写真を撮った。腹筋層を取りだして、１０％緩衝化ホルマリン中に入れた。組織試料を５mm間隔で切片にして、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【００３２】
以下の処方物を、新脈管形成を促すそれらの能力に関して試験した。
対照
1. 生理的食塩水中のｂＦＧＦ（皮下注入）、０．５ml容積の滅菌等張生理的食塩水中の７０μgのｂＦＧＦ。
2. ＰＣＬ棒：９％スクロース凍結乾燥物。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．１６。
3. ＰＣＬ棒：４％トレハロース凍結乾燥物。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．０９。
【００３３】
ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒
1. ９％スクロース凍結乾燥物中のｂＦＧＦ。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．１７。ｂＦＧＦ添加＝１００μg／棒。
2. ４％トレハロース凍結乾燥物中のｂＦＧＦ。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．０９。ｂＦＧＦ添加＝２５μg／棒。
3. ４％トレハロース凍結乾燥物中のｂＦＧＦ。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．０９。ｂＦＧＦ添加＝１００μg／棒。
4. ４％メレチトース凍結乾燥物中のｂＦＧＦ。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．０９。ｂＦＧＦ添加＝１００μg／棒。
【００３４】
棒を含入する皮下領域の視覚的検査は、ｂＦＧＦが処方物中に含まれる場合、棒周囲に組織の蓄積が認められ、組織は血管化の様相を示した。ｂＦＧＦが処方物中に含まれない場合は、局所組織蓄積は非常にわずかであったか、または認められなかった。ｂＦＧＦを棒処方物を用いずに生理的食塩水中で投与した場合、注射領域の皮下組織に及ぼす明白な作用は認められなかった。棒処方物中のｂＦＧＦの作用は、それらの作用の効力に対するｂＦＧＦの充填量に依存した。
組織の組織学的分析は、ｂＦＧＦが処方物中に含まれる場合、棒周囲に繊維芽細胞および血管の蓄積が認められることを示した。ｂＦＧＦが処方物中に含まれない場合には、繊維芽細胞および血管の蓄積は非常にわずかであるか、または認められなかった。棒処方物中のｂＦＧＦに伴って観察された繊維芽細胞および血管の蓄積は、創傷治癒のために、ならびに血管機能不全（例えば、末梢血管性疾患または虚血性心臓疾患）の場合の組織中の側副血管の発生を刺激するために有益である。
【００３５】
実施例５
ＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒の調製および棒から回収されるＶＥＧＦの生理活性
実施例１および実施例２と同様の方法で、薬剤としてＶＥＧＦを、そして熱保護剤としてスクロースを用いて、ＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒を調製した。調製に際しては、２mLの水性溶液を凍結乾燥した。溶液は６．８mgのＶＥＧＦ、８０mgのスクロース、２０mMのクエン酸緩衝液および１mMのＥＤＴＡを含有する。凍結乾燥ケークを次に溶融ＰＣＬ中に分散させて、実施例１と同様の方法でＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒に成形した。凍結乾燥物対ＰＣＬの重量比は、０．０７〜０．１７に制御した。
【００３６】
棒から回収されたＶＥＧＦの生理活性を確定した。ＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒を、０．１％プロテアーゼ無含有ＢＳＡおよび１０μ／mLゲンタマイシンを含有するＰＢＳ緩衝液中で３７℃でインキュベートした。各時点で、ＰＣＬ棒を溶液から取り出して、同一組成を有する新鮮な溶液中に入れた。バイオアッセイ法を用いて、除去溶液を分析した。その結果を図３にプロットした。in vitro結果は、ＶＥＧＦが５週間インキュベーション後に棒中で活性を有することを示す。
【００３７】
スプラーグ ダウレイ（Sprague Dawley）ラットに及ぼすＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒の新脈管形成の促進を、実施例４と同様の方法で調べた。ＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒を含有する皮下領域の視覚的検査および組織学的分析は、棒周囲に組織の蓄積が認められることを示し、組織は血管化の様相を実証した。ＶＥＧＦが処方物に含まれない場合には、局所組織蓄積は認められなかった。
【背景技術】
【０００１】
［発明の背景］
本発明は、ペプチドまたはタンパク質の制御送達の分野に、ならびにペプチドまたはタンパク質の制御送達に有用な組成物に関する。
【０００２】
典型的には微小球、棒、シートまたはペレット形態の高分子マトリックスが、薬剤製品の持続性放出または制御放出に用いられてきた。活性剤がポリマーマトリックス中に混入され得る種々の技術が知られている。それらの例は、溶剤蒸発、噴霧乾燥、乳化であり、あるいは個々のサイズまたは形状の粒子の単純な物理的混合による。ペプチドおよびタンパク質の壊れやすい性質のために、これらのアプローチのうち、ポリマーへのペプチドまたはタンパク質薬剤の混入に容易に適合され得るものはない。ペプチドおよびタンパク質は、溶剤によるか、乳化によるかまたは熱による変性を受けやすい。不安定性の問題を回避するために、特許文献１は、制御放出ポリマーマトリックス中へのタンパク質の混入のための極低温注型法を記載している。低温加工は非常に厄介で、特 別な設備を要し、そして工程中の結露は潜在的問題となるため、この技法はいくつかの欠点を有する。
【０００３】
限定された形状およびサイズに注型され得る溶融ポリマー中にペプチドまたはタンパク質薬剤を混合し得ることが望ましい。残念ながら、ほとんどのタンパク質がポリマーの融点よりはるかに低い温度で変性する。
【０００４】
身体内で高分子マトリックスから放出される条件下で、ペプチドまたはタンパク質薬剤が安定であることも望ましい。ほとんどの生物侵食性ポリマーが、エステル結合の加水分解により身体内で脱重合される。この加水分解は高酸性の局所領域を生じ得る。多数のペプチドまたはタンパク質薬剤は酸性条件で不安定であるため、これは、薬剤が放出される前にその不活性化を生じ得る。酸性条件下で不安定であるこのような一タンパク質薬剤は、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）である。種々の長さの形態で、例えば１４６、１５４および１５７アミノ酸形態で単離されているこのタンパク質は、有効な血管形成剤ならびに創傷治癒中の細胞増殖および移動の刺激剤である。ヒトｂＦＧＦをコードするＤＮＡ配列およびその推定上のアミノ酸配列が、特許文献２に開示されている。その血管形成特性のため、それは、冠状動脈疾患および末梢血管疾患のようなアテローム性動脈硬化症状を有する個体の動脈における閉塞を迂回するために新規の毛細血管床の局所性増殖を促進するのに有用である。このタンパク質は、創傷治癒に必要なマトリックスの放出に関与する主細胞である繊維芽細胞に対して走化性でもあり、その例としては治癒創傷の引張強さを確定するコラーゲンが挙げられる。ｂＦＧＦを所望の部位に有効に送達し、このような症状の処置に際してｂＦＧＦの全身性送達に関連するあらゆる考え得る副作用を回避するためには、血管形成または創傷治癒活性が必要な部位またはその付近に移植のための制御放出装置を提供することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第5,019,400号
【特許文献２】米国特許第5,514,566号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
［発明の要約］
本発明は、ペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出のための方法および組成物を、そしてペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出に有用な組成物および装置（device）の製造方法を提供する。
本発明の一実施態様では、ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックス相が中に分散された生物適合性、生物侵食性ポリマーを含むペプチドまたはタンパク質の制御放出のための組成物であって、前記のガラス状マトリックス相が前記のポリマーの融点より高いガラス転移温度を有する組成物が提供される。ペプチドまたはタンパク質薬剤は組成物中で安定であるため、それは、その溶融状態で、薬剤送達インプラントとして用いられる適切に造形された装置中に、例えば棒、フィルム、ビーズまたはその他の所望の形状で形成されるのが便利である。
【０００７】
本発明の別の実施態様では、このような投与を必要とする動物への生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与の方法であって、このような動物に本発明の組成物から形成される装置を移植することを含む方法が提供される。
本発明のさらに別の実施態様では、生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出送達のための組成物の製造方法であって、以下の（ａ）ポリマーの融点より高く、ガラス状マトリックスのガラス転移温度より低い温度で生物適合性、生物侵食性ポリマー中に生理活性ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックスを分散し、そして（ｂ）ポリマーが固体である温度に分散体を冷却する工程を含む方法が提供される。所望により、冷却前に、所望の形状を有する送達装置中に分散体は形成されるかまたは注型され得る。
【０００８】
本発明の好ましい実施態様では、熱保護剤は、トレハロース、メレチトース、セロビオース、メリビオース、ラフィノースおよびラクトースからなる群から選択される。本発明の組成物および装置中に用いるための好ましいポリマーは、約６５℃より低い融点を有するポリ（ε−カプロラクトン）である。
【０００９】
本発明の組成物および装置は、in vivoでのタンパク質の製造または送達中にタンパク質の有意の分解を伴わずに、ｂＦＧＦまたは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の優れた制御放出を提供する。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１） ペプチドまたはタンパク質の制御放出のための組成物であって、ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックス相が中に分散されている生物適合性、生物侵食性ポリマーを含み、前記ガラス状マトリックス相は前記ポリマーの融点より高いガラス転移温度を有する組成物。
（項目２） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは生分解性である項目１記載の組成物。
（項目３） ガラス状マトリックス相のガラス転移温度は６５℃より高い項目１記載の組成物。
（項目４） 熱保護剤は、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メレチトース、メリビオースおよびラフィノースからなる群から選択される項目１記載の組成物。
（項目５） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリカプロラクトンである項目１記載の組成物。
（項目６） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、６５℃より低い融点を有するポリ（ε−カプロラクトン）である項目１記載の組成物。
（項目７） 生理活性ペプチドまたはタンパク質は、塩基性繊維芽細胞増殖因子または血管内皮増殖因子である項目１記載の組成物。
（項目８） 熱保護剤は、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メレチトース、メリビオースおよびラフィノースから選択される項目７記載の組成物。
（項目９） 熱保護剤はスクロースであり、そしてガラス状マトリックス相は１％より低い含水量を有する項目７記載の組成物。
（項目１０） 熱保護剤はトレハロースである項目７記載の組成物。
（項目１１） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である項目７記載の組成物。
（項目１２） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である項目８記載の組成物。
（項目１３） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、６５℃より低い融点を有するポリ（ε−カプロラクトン）である項目９記載の組成物。
（項目１４） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、６５℃より低い融点を有するポリ（ε−カプロラクトン）である項目１０記載の組成物。
（項目１５） 生理学的条件下でのポリマーの加水分解は、組成物内の局所ｐＨを４より低く下げさせない速度で起こる項目７記載の組成物。
（項目１６） 動物への生理活性ペプチドまたはポリマーの制御放出送達のための装置であって、造形インプラントの形態での項目１記載の組成物を含む装置。
（項目１７） 動物への生理活性ペプチドまたはポリマーの制御放出送達のための装置であって、造形インプラントの形態での項目７記載の組成物を含む装置。
（項目１８） 造形インプラントは、棒、ディスクおよび球から選択される形態である項目１６記載の装置。
（項目１９） 生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与を必要とする動物への生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与の方法であって、このような動物に項目１６記載の装置を移植することを含む方法。
（項目２０） 生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与を必要とする動物への生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与の方法であって、このような動物に項目１７記載の装置を移植することを含む方法。
（項目２１） 生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与を必要とする動物への生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出投与の方法であって、このような動物に項目１８記載の装置を移植することを含む方法。
（項目２２） 生理活性ペプチドまたはタンパク質の制御放出送達のための組成物の製造方法であって、以下の（ａ）ポリマーの融点より高く、ガラス状マトリックスのガラス転移温度より低い温度で生物適合性、生物侵食性ポリマー中に生理活性ペプチドまたはタンパク質および熱保護剤を含むガラス状マトリックスを分散し、そして（ｂ）ポリマーが固体である温度に分散体を冷却する工程を含む方法。
（項目２３） ガラス状マトリックスは、凍結乾燥粉末の形態である項目２２記載の方法。
（項目２４） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、生分解性である項目２２記載の方法。
（項目２５） ガラス状マトリックス相のガラス転移温度は、６５℃より高い項目２２記載の方法。
（項目２６） 熱保護剤は、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メレチトース、メリビオースおよびラフィノースからなる群から選択される項目２２記載の方法。
（項目２７） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である項目２２記載の方法。
（項目２８） 生理活性ペプチドまたはタンパク質は、塩基性繊維芽細胞増殖因子または血管内皮増殖因子である項目２２記載の方法。
（項目２９） 熱保護剤は、トレハロース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メレチトース、メリビオースおよびラフィノースから選択される項目２８記載の方法。
（項目３０） 熱保護剤は、スクロースであり、そしてガラス状マトリックスは０．５％より低い含水量を有する項目２８記載の方法。
（項目３１） 熱保護剤はトレハロースである項目２８記載の方法。
（項目３２） 生物適合性、生物侵食性ポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である項目２８記載の方法。
（項目３３） 血管遮断による動物中の血流低減の軽減方法であって、このような遮断の部位またはその付近に項目１７記載の薬剤送達装置を移植することを含む方法。
（項目３４） 前記装置は、約２５μg〜約２５０μgのｂＦＧＦを含有する項目３３記載の方法。
（項目３５） 前記動物は、冠状動脈疾患または末梢血管疾患を有するヒトである項目３３記載の方法。
（項目３６） 動物における創傷治癒の促進方法であって、新脈管形成および繊維芽細胞蓄積に有効な量の項目７記載の組成物を創傷に適用することを含む方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ｂＦＧＦの送達のための制御放出装置を製造するための本発明の方法の一実施態様の略図である。
【図２】本発明の３つの処方物からのｂＦＧＦのin vitro放出をプロットしたグラフである。
【図３】ポリカプロラクトン棒から回収されたＶＥＧＦの長期in vitro生理活性をプロットしたグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［発明の詳しい説明］
本発明によれば、ペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出送達のための組成物および装置を製造するための有効な手段が提供される。ペプチドまたはタンパク質薬剤はポリマーの融点より高いガラス転移温度を有するガラス状マトリックス相中に分散される時、ペプチドまたはタンパク質薬剤は溶融段階で生物侵食性、生分解性ポリマーマトリックス中に分散され得ることを、本発明者等は確定している。特定の制御放出送達装置を製造するための本発明の方法は、図１に示されている。この図は、ポリマーとしてポリ（ε−カプロラクトン）を用いるｂＦＧＦの送達のための制御放出装置の製造の略図である。
本発明の方法および組成物は、有利であることに、熱による不活性化を受けやすいあらゆるタンパク質またはペプチドの制御放出送達のために用いられる。一般的に、その活性がその三次構造の保持による、あらゆるタンパク質またはペプチド薬剤は、熱による不活性化を被りやすい。いくつかの小ペプチドは活性のために三次構造の保持を必要としないが、一方、ほとんどすべてのタンパク質薬剤は熱による不活性化を受けやすい。したがって、本発明の方法および組成物は、広範囲のタンパク質、例えば増殖因子、造血因子、ホルモン、サイトカイン、リンホカインおよび免疫機能を刺激または抑制する因子を用い得る。本発明の方法および組成物がヒトｂＦＧＦおよび血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の局所送達に特に良好に適していることを、本発明者等は見出した。
【００１２】
ガラス状マトリックス相は、ペプチドまたはタンパク質薬剤および適切な熱保護剤の水性溶液を凍結乾燥することにより作成され得る。選択される特定の熱保護剤およびペプチドまたはタンパク質に対するその濃度は、凍結乾燥物の正確なガラス転移温度を確定するであろう。一般に、熱保護剤対ペプチドまたはタンパク質薬剤の重量比は、約２〜２００である。当業者は、あらゆる組合せの必要なガラス転移温度を確定し得るであろう。ガラス転移は、粘性ゴム状態から（または粘性ゴム状態への）、硬くそして比較的脆性の状態への（または硬くそして比較的脆性の状態からの）非晶質物質の可逆的変化と定義される（American Society for Testing and Materials（ASTM）E 1142）。ガラス転移温度（Ｔｇ）は、ガラス転移が起こる温度範囲のほぼ中点であると定義される（ASTM D 4092）。ペプチドまたはタンパク質薬剤および熱保護剤を含有するガラス状マトリックス相のガラス転移温度は種々の技法により確定し得るが、その最も一般的なものは示差走査熱量測定（ＤＳＣ）である。ガラス状物質が一定の速度で加熱される場合、熱流およびその温度に関連して基線移動が見出され得る。２つの基線の中点に対応する温度がガラス転移温度と考えられる。
【００１３】
トレハロース、メレチトース、ラクトース、マルトース、セロビオース、メリビオースおよびラフィノースは好ましい熱保護剤である。水分はガラス状マトリックス相のＴｇに影響を及ぼすため、ガラス状マトリックス相の含水量は、好ましくは１％未満、さらに好ましくは０．５％未満である。これは、余分な水分がスクロース含有マトリックスのＴｇを好ましいポリマーであるポリ（ε−カプロラクトン）の融点より下に下げ得るために、熱保護剤としてスクロースを用いたい場合に特に当てはまる。本発明者等はＴＡ2910およびＴＡ2920示差走査熱量計を用いて、ｂＦＧＦを含有する種々の凍結乾燥マトリックスに関するＴｇを確定した。約５mgの各試料を計量し、クリンププレスを用いてアルミニウム鍋中に密封した。ＤＳＣデータを、１０℃／分の加熱速度での加熱方式で収集した。温度勾配（ramp）の開始前に、３０℃の温度または実験開始前の予測Ｔｇより低い温度で５分間、等温的に試料を平衡させた。ガラス転移がエンタルピー緩和に関連した場合には、Ｔｇを越えて試料を加熱し、出発温度に冷却し、再加熱して二次走査におけるＴｇを測定した。下記の表１は、種々の賦形剤を用いたｂＦＧＦの凍結乾燥物に関するガラス転移温度を示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】
ペプチドまたはタンパク質薬剤の他に、ガラス状マトリックス相は、通常の有効濃度で、その他の慣用的製剤賦形剤も含有し得る。典型的に用いられる賦形剤としては、例えば湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤、緩衝塩、保存剤（抗細菌剤）、酸化防止剤およびキレート化剤が挙げられる。当業界で既知のように、ペプチドまたはタンパク質薬剤の濃度が制御放出装置中では比較的高く、このような賦形剤の非存在下ではペプチドまたはタンパク質の凝集が起こり得るため、賦形剤として抗凝集剤の使用が特に望まれ得る。それらが慣用的に用いられる濃度である場合の有効な抗凝集剤は当業者には周知である。それらの例としては、例えば、イノシトール、キシリトール、マンニトール、マルトース、アラビノースおよびガラクトース等のポリオールが挙げられる。
【００１６】
熱保護剤、ペプチドまたはタンパク質薬剤ならびに、もしあれば、その他の賦形剤を含有する水性溶液の凍結乾燥は、製薬業界で周知の技法を用いて実行される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th Ed., p.1538参照）
。凍結乾燥は粉末またはケークの形態でガラス状マトリックス相を生じ、これが細砕されてポリマー中での分散に適した粉末を作成する。
【００１７】
ペプチドまたはタンパク質薬剤を含有するガラス状マトリックス相は次に、ガラス状マトリックス相のガラス転移温度より低い融点を有する生物侵食性、生物適合性ポリマー中に分散される。本明細書中で用いる場合、「生物侵食性」という用語は、生理学的環境中でポリマーが、ペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出を可能にするのに十分に分解可能であることを意味する。「生物適合性」という用語は、ポリマーの分解生成物が非毒性であり、ペプチドまたはタンパク質薬剤を不活性化しないことを意味する。好ましくは、ポリマーは生分解性でもあり、即ち、それは生理学的環境中で完全に分解され、再吸収され、したがって、薬剤を送達した後に装置のいかなる残存構成成分をも物理的に除去する必要がない。
【００１８】
本発明の組成物中に用いるための好ましいポリマーは、ポリ（ε−カプロラクトン）である。さらに好ましくは、本発明の組成物中に用いられるポリ（ε−カプロラクトン）は、約２，０００〜３０，０００、最も好ましくは約１０，０００〜２０，０００の分子量を有する。この範囲の分子量のポリ（ε−カプロラクトン）は、約５９〜６５℃の融点を有する。ポリ（ε−カプロラクトン）はさらに、送達されるペプチドまたはタンパク質薬剤が酸安定性でないもの、例えばｂＦＧＦである場合には、非常に望ましいポリマーである。生理学的条件下でのポリ（ε−カプロラクトン）の加水分解速度は、ペプチドまたはタンパク質を不活性化する低ｐＨの局所領域をポリマーの分解が生じないように十分に遅い。タンパク質はｐＨ３〜４では約２０〜３０分で完全に不活性化されるため、これは、例えばｂＦＧＦを放出する場合には、特に重要である。本発明の好ましい熱保護剤は、それらが生理学的環境に存在する水中に溶解するので、ペプチドまたはタンパク質薬剤の放出を制御するのに役立つポロシゲン(porocigen)としても作用し得る。
【００１９】
再び図１を参照すると、熱保護剤、ペプチドまたはタンパク質薬剤および／または含入したいと思う任意のその他の賦形剤を含有する凍結乾燥体が、ポリマー中に分散される。ポリマーはその融点に加熱される。ポリ（ε−カプロラクトン）の場合、ポリマーは約６５℃に加熱される。ガラス状マトリックス相は、あらゆる好都合な混合手段を用いて溶融ポリマー中に分散される。装置の薬剤放出速度を制御するためにポリマー中に付加的添加剤を分散することは有益であり得る。特に、当業界で既知のポロシゲンがポリマー中に混入されて、薬剤の放出速度が制御され得る。既知のポロシゲンとしては、例えば糖、アミノ酸、マンニトール、ソルビトール、キシリトールおよびポリエチレングリコールが挙げられる。これらは、既知の有効量でポリマー中に混入され得る。
【００２０】
ガラス状マトリックス相は、通常は、組成物の全重量の約５％〜約２５％、好ましくは約１０％〜約２０％の量で存在する。組成物中に存在するガラス状マトリックス相の正確な量は、ガラス状マトリックス相中に含入されるペプチドまたはタンパク質薬剤の濃度、所望の放出速度、移植したい装置のサイズ、ならびに局所部位に送達したい薬剤の用量に大いに影響される。
【００２１】
図１に示したように、ガラス状マトリックス相を含有するポリマーは、インプラントとして用いるために、冷却前に適切な形状に、例えば棒、ディスク、シート、球に成形され得る。あるいは、ペプチドまたはタンパク質は組成物中では安定であるため、後で再加熱され、所望の形状に成形され得る。
【００２２】
本発明の薬剤送達装置は、慣用的方式で、ペプチドまたはタンパク質薬剤の制御放出送達を必要とする動物に移植され得る。ｂＦＧＦまたはＶＥＧＦを含有する装置の場合、装置は有利なことに、血管閉塞または血管損傷の部位またはその付近に移植される。このようにして、例えば、末梢血管疾患または冠状動脈疾患に罹患した動物、例えばヒトのような哺乳類を治療し得る。ｂＦＧＦが放出されると、それは閉塞の部位を通って血液を運ぶために新規の毛細血管の形成を引き起こす新脈管形成を促す。典型的には、このような用途に用いるための装置は、約２５μg〜約２５０μgのｂＦＧＦを含有する。in vivoでの実験では、十分量のｂＦＧＦが５日間放出されて、新脈管形成を促す。本発明の薬剤送達装置は、創傷治癒を促すために、例えば褥瘡、糖尿病性潰瘍、手術および／または事故性外傷に起因する切開創傷等の治療において、あるいは骨組織の治癒において、ｂＦＧＦを送達するためにも用いられ得る。このような使用に関しては、装置は適切なサイズおよび形状に成形されて、創傷部位中に挿入され得る。あるいは、本発明の組成物は、粉末形態に粉砕され、これが創傷部位に適用され得る。このような場合、適切な投与量は、創傷床における新脈管形成を促し、それにより治癒を促す量である。適切な投与量は当業者に確定され得るし、そして少なくとも一部は、治療される創傷の性質およびサイズにより影響される。
【００２３】
以下の実施例は本明細書中に記載した本発明をさらに説明することを意図するが、本発明はそれらに限定されない。
【実施例】
【００２４】
［実施例］
実施例１
ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒の調製
Ａ．ガラス状マトリックス相の調製
４．４２gのトレハロース二水和物を１００ｍLメスフラスコ中に入れた。組換えヒトｂＦＧＦ（１５４アミノ酸形態）の８．３７mg/ｍL水性溶液８４mLをフラスコに加えた。水で溶液を１００ｍLとした後、０．２μmの滅菌アロディスク(Arodisc)（登録商標）１３フィルター（Gelman Science）を通して濾過した。濾過した溶液を次に、凍結乾燥のために小瓶（２mL／小瓶）に入れた。
各小瓶中のアリコートを、保存温度を−４５℃に２時間保持することにより先ず凍結させ、その後−１０℃で２時間アニーリングさせて、−４０℃でさらに３時間冷却した。６０mTorrで−２０℃および−２５℃でそれぞれ５時間および１５時間、一次乾燥を実施した。二次乾燥は、６０mTorrで２５〜３０℃で１０時間実施した。
【００２５】
Ｂ．ｂＦＧＦ凍結乾燥物のＰＣＬへの混入
１．１９２gの市販のポリ（ε−カプロラクトン）（分子量１０，０００〜２０，０００）を、油浴中の滅菌ビーカー中に入れた。油浴を９０℃で１時間加熱した後、６５℃に冷却した。前記と同様に作成した一小瓶からのｂＦＧＦ凍結乾燥物を、溶融ＰＣＬに添加した。凍結乾燥物を粘性ＰＣＬ中に懸濁し、攪拌して、均質分散体を得た。
【００２６】
Ｃ．ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒の調製
１６Ｇ滅菌針を用いてｂＦＧＦ凍結乾燥物−ＰＣＬ混合物を延伸して、直径約１mmの棒を形成した。棒を室温に冷却して、１０mm切片に切断した。
【００２７】
実施例２
ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒の調製
実施例１に記載したのと同様の方法で、異なる使用量のｂＦＧＦおよび異なる熱保護剤物質を用いて、ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒を調製した。各々の場合、ｂＦＧＦ（低用量に関しては２mg、高用量に関しては５０mg）、熱保護剤（８０mg〜３７０mg）、２０mMのクエン酸塩緩衝液および１mMのＥＤＴＡを含有する２mLの水性溶液を、凍結乾燥のために各小瓶に充填した。使用した熱保護剤は、トレハロース、メレチトースおよびスクロースであった。これらの溶液を凍結乾燥し、溶融ＰＣＬ中に分散させて、実施例１と同様の方法で棒に成形した。スクロース含有溶液の場合、凍結乾燥物のＴｇがＰＣＬの融点より確実に高くするために、凍結乾燥を実施して含水量を０．５％とした。
【００２８】
実施例３
棒からのｂＦＧＦのin vitro放出
実施例１と同様の方法で、熱保護剤としてトレハロース、メレチトースまたはスクロースを用いて、ｂＦＧＦを含有するＰＣＬ棒（１mm×１０mm）を調製した。トレハロースとメレチトースの場合、棒を調製するために用いた凍結乾燥物は４％の濃度の熱保護剤（凍結乾燥前w/w）を含有し、凍結乾燥物を８．３％（w/w）の濃度でＰＣＬ中に分散させた。スクロースの場合は、棒を調製するために用いた凍結乾燥物は９％の濃度のスクロース（凍結乾燥前w/w）を含有し、凍結乾燥物を１３．８％（w/w）の濃度でＰＣＬ中に分散させた。
【００２９】
棒からのｂＦＧＦのin vitro放出の測定を５℃で確定した。棒を１mLのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に入れ、溶液を攪拌棒で攪拌した。ＰＢＳ溶液を１日おきに回収し、新鮮なＰＢＳ溶液と入れ換えて容積を保持した。イオン交換ＨＰＬＣを用いて、回収ＰＢＳ溶液中のｂＦＧＦを定量し、棒から放出された累積ｂＦＧＦを計算した。棒からのｂＦＧＦの放出を時間を追って、図２のグラフにプロットした。図では、トレハロース含有処方物に関するデータ点を白丸で、メレチトース含有処方物に関するデータ点を中黒三角で、そしてスクロース含有処方物に関するデータ点を中黒丸で表している。
【００３０】
実施例４
ｂＦＧＦ−ＰＣＬインプラントによる新脈管形成の促進
雄および雌のスプラーグ ダウレイ（Sprague Dawley）ラット（体重２２５〜４２５g）をイソフルランの吸入により簡単に麻酔した。腹部域を剃り、７０％エタノールで清浄した。実施例１と同様に作成したＰＣＬ中にｂＦＧＦ（組換え的に産生したヒトｂＦＧＦ、１５４アミノ酸形態）を含有する棒（１mm×１０mm）を、１４ゲージ静脈内カテーテル配置針中に挿入した。腹部皮膚を組織鉗子で把持し、骨盤の約２cm上を正中線に沿って針を刺し通した。細いワイヤを用いて、皮膚と腹筋層との間の位置にペレットを進行させた。針を除去し、動物を計量して、適切なケージに戻した。イソフルランの吸入中止のほとんど直後に、動物は敏捷に動くことができた。
【００３１】
ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒の最初の設置後５日目に、二酸化炭素吸入またはフェノバルビタール過剰投与により動物を安楽死させた。体重を記録し、腹部皮膚を穏やかに切開して、反転させて、腹筋を露呈させた。位置に関するコメントおよび血管分布、ならびに顆粒形成組織累積を記録し、そして各動物の写真を撮った。腹筋層を取りだして、１０％緩衝化ホルマリン中に入れた。組織試料を５mm間隔で切片にして、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【００３２】
以下の処方物を、新脈管形成を促すそれらの能力に関して試験した。
対照
1. 生理的食塩水中のｂＦＧＦ（皮下注入）、０．５ml容積の滅菌等張生理的食塩水中の７０μgのｂＦＧＦ。
2. ＰＣＬ棒：９％スクロース凍結乾燥物。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．１６。
3. ＰＣＬ棒：４％トレハロース凍結乾燥物。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．０９。
【００３３】
ｂＦＧＦ−ＰＣＬ棒
1. ９％スクロース凍結乾燥物中のｂＦＧＦ。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．１７。ｂＦＧＦ添加＝１００μg／棒。
2. ４％トレハロース凍結乾燥物中のｂＦＧＦ。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．０９。ｂＦＧＦ添加＝２５μg／棒。
3. ４％トレハロース凍結乾燥物中のｂＦＧＦ。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．０９。ｂＦＧＦ添加＝１００μg／棒。
4. ４％メレチトース凍結乾燥物中のｂＦＧＦ。凍結乾燥物対ＰＣＬ比＝０．０９。ｂＦＧＦ添加＝１００μg／棒。
【００３４】
棒を含入する皮下領域の視覚的検査は、ｂＦＧＦが処方物中に含まれる場合、棒周囲に組織の蓄積が認められ、組織は血管化の様相を示した。ｂＦＧＦが処方物中に含まれない場合は、局所組織蓄積は非常にわずかであったか、または認められなかった。ｂＦＧＦを棒処方物を用いずに生理的食塩水中で投与した場合、注射領域の皮下組織に及ぼす明白な作用は認められなかった。棒処方物中のｂＦＧＦの作用は、それらの作用の効力に対するｂＦＧＦの充填量に依存した。
組織の組織学的分析は、ｂＦＧＦが処方物中に含まれる場合、棒周囲に繊維芽細胞および血管の蓄積が認められることを示した。ｂＦＧＦが処方物中に含まれない場合には、繊維芽細胞および血管の蓄積は非常にわずかであるか、または認められなかった。棒処方物中のｂＦＧＦに伴って観察された繊維芽細胞および血管の蓄積は、創傷治癒のために、ならびに血管機能不全（例えば、末梢血管性疾患または虚血性心臓疾患）の場合の組織中の側副血管の発生を刺激するために有益である。
【００３５】
実施例５
ＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒の調製および棒から回収されるＶＥＧＦの生理活性
実施例１および実施例２と同様の方法で、薬剤としてＶＥＧＦを、そして熱保護剤としてスクロースを用いて、ＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒を調製した。調製に際しては、２mLの水性溶液を凍結乾燥した。溶液は６．８mgのＶＥＧＦ、８０mgのスクロース、２０mMのクエン酸緩衝液および１mMのＥＤＴＡを含有する。凍結乾燥ケークを次に溶融ＰＣＬ中に分散させて、実施例１と同様の方法でＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒に成形した。凍結乾燥物対ＰＣＬの重量比は、０．０７〜０．１７に制御した。
【００３６】
棒から回収されたＶＥＧＦの生理活性を確定した。ＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒を、０．１％プロテアーゼ無含有ＢＳＡおよび１０μ／mLゲンタマイシンを含有するＰＢＳ緩衝液中で３７℃でインキュベートした。各時点で、ＰＣＬ棒を溶液から取り出して、同一組成を有する新鮮な溶液中に入れた。バイオアッセイ法を用いて、除去溶液を分析した。その結果を図３にプロットした。in vitro結果は、ＶＥＧＦが５週間インキュベーション後に棒中で活性を有することを示す。
【００３７】
スプラーグ ダウレイ（Sprague Dawley）ラットに及ぼすＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒の新脈管形成の促進を、実施例４と同様の方法で調べた。ＶＥＧＦ−ＰＣＬ棒を含有する皮下領域の視覚的検査および組織学的分析は、棒周囲に組織の蓄積が認められることを示し、組織は血管化の様相を実証した。ＶＥＧＦが処方物に含まれない場合には、局所組織蓄積は認められなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【請求項１】
本明細書中に記載の発明。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００９−２８６８０３（Ｐ２００９−２８６８０３Ａ）
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１２５３７（Ｐ２００９−２１２５３７）
【出願日】平成２１年９月１４日（２００９．９．１４）
【分割の表示】特願２０００−５２９２２９（Ｐ２０００−５２９２２９）の分割
【原出願日】平成１１年１月２８日（１９９９．１．２８）
【出願人】（５００３５０９５５）サイオス，インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１４日（２００９．９．１４）
【分割の表示】特願２０００−５２９２２９（Ｐ２０００−５２９２２９）の分割
【原出願日】平成１１年１月２８日（１９９９．１．２８）
【出願人】（５００３５０９５５）サイオス，インコーポレーテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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