ペプチドトキシンＡＰＥＴｘ２の鎮痛作用
本発明は、ＡＳＩＣ３陽イオンチャネルを阻害する、アンソプレウラ エレガンティシマ（Anthopleura elegantissima）イソギンチャク由来のペプチドトキシンＡＰＥＴｘ２、ならびにその類似体および誘導体の薬剤としての利用に関し、特に、ＡＳＩＣ３（Acid Sensing Ion Channel 3：酸感受性イオンチャネル３）の活性と関連のある痛み（具体的には、炎症時、また、場合により組織アシドーシス（虚血、骨折、血腫、浮腫、疱疹、フリクテン、局所感染、組織損傷、眼障害、腫瘍など）を伴う任意の痛みのある状態の時）に対する鎮痛剤としての利用に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＳＩＣ３陽イオンチャネルを阻害する、アンソプレウラ エレガンティシマ（Anthopleura elegantissima）イソギンチャク由来のＡＰＥＴｘ２ペプチドの、痛みの鎮痛作用のための利用に関し、当該痛みは、炎症時、また、場合により組織アシドーシス（虚血、骨折、血腫、浮腫、疱疹、局所感染、組織損傷、眼障害および腫瘍など）に伴う任意の痛みのある状態の時の、同位体ＡＳＩＣ３（Acid Sensing Ion Channel 3：酸感受性イオンチャネル３）の活性と関連がある。
【背景技術】
【０００２】
痛み（特に、炎症性の痛み）の検討および治療では、患者のクオリティ・オブ・ライフを向上させることが基本的な捉え方であり、実質的には、抗炎症剤（非ステロイド系の抗炎症剤（non-steroidal anti-inflammatory drugs：ＮＳＡＩＤ’ｓ）またはステロイド系の抗炎症剤のいずれであれ）の処方を基盤としている。ＮＳＡＩＤ’ｓおよび／またはコルチコステロイドが炎症性の痛みの緩和に適当でない場合、処方者は抗炎症性鎮痛剤（パラセタモールなど）と、弱いまたは強いオピオイドとを組み合わせる。しかしながら、現在の治療手段の多様性にも関わらず、ＮＳＡＩＤ’ｓに関するケースのように、多くのタイプの痛みは、望ましくない副作用をさらに引き起こし得る既知の薬に対してわずかな反応しか示さない。そのため、この状況では、新規の鎮痛ターゲットの発見が本当の発展を意味することになる。イオンチャネルは、侵害受容繊維による痛みシグナルの検出および伝達に直接関与するため、過去数年間に特定された分子ターゲットのうち特に重要な位置を占める。
【０００３】
ＡＳＩＣ’ｓ（Acid Sensing Ion Channels：酸感受性イオンチャネル）は、細胞外アシドーシスによって活性化される陽イオンチャネルである（参照１および２を参照のこと）。今日では、哺乳類において、少なくとも７つのサブユニット（ＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ１ｂ２、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３およびＡＳＩＣ４）をコードする４つの遺伝子が特定されている。機能性ＡＳＩＣチャネルは三量体の異なるＡＳＩＣサブユニットの連携から生じ（参照３）、ホモマーチャネルまたはヘテロマーチャネルになる（参照４、５および６）。ＡＳＩＣチャネルは神経チャネルの大部分を占めるため、中枢神経系および末梢神経系の両方に発現する。ＡＳＩＣ１ａチャネルおよびＡＳＩＣ２チャネルが中枢神経系および末梢神経系に広く現れるのに対して、ＡＳＩＣ１ｂチャネルおよびＡＳＩＣ３チャネルの発現は感覚ニューロンに限定される（参照７、５７および８）。
【０００４】
ＡＳＩＣ’ｓは、虚血、炎症、血腫、骨折、障害、外科手術（術後痛）またはいくつかの腫瘍発達の間に生じる傾向にある細胞外酸性化を検出する能力があると仮定されている（参照９）。ここ数年、細胞外アシドーシスが痛みを生み出すことが実際にわかるようになっており（参照１１および１２）、健康なヒト志願者にて行なった実験（参照１３および１４）では、アミロリドを用いた酸性皮膚痛覚におけるＡＳＩＣ’ｓの関与、およびいくつかのＮＳＡＩＤ’ｓ（ＡＳＩＣ’ｓの非特異的インヒビター）の関与が証明されている（参照１５および１７）。
【０００５】
感覚ニューロンに発現するすべてのＡＳＩＣサブユニットのうち、ＡＳＩＣ３は侵害受容性ニューロンにおいて広く発現し（上記で引用されている参照７、参照１７および１８）、適度な酸性化（約ｐＨ７．０）を受けて、持続性の非不活性化電流を生み出すこと（参照１９）を考えると、特有の影響力がある。ＡＳＩＣ３電流は実際に２つの成分を有する：（１）高いｐＨ感受性（ｐＨ0.5＝６．５−６．７）（上記で引用されている参照７、参照２０）のある一過性の成分であって、急速に活性化したり（ｔ0.5＜５ｍｓｅｃ）不活性化したり（ｔ0.5＝０．３２ｍｓｅｃ）する（上記で引用されている参照２０）成分、ならびに（２）持続成分であって、適度な酸性化である場合、チャネルの活性曲線および不活性曲線の部分的な重なりに起因する窓電流（window current）から生じ、また、さらに酸性のｐＨ値（ｐＨ＜６．０）の場合、明らかに異なる機構から生じる成分。一過性の電流は、ｐＨが中性に戻った後（ｔ0.5＝０．５８ｍｓｅｃ）の不活性化に続いて急速に元に戻る（上記で引用されている参照２０）。比較として、ＡＳＩＣ１ａは非常に長い回復期間（ｔ0.5＝１３ｍｓｅｃ）が必要になる（上記で引用されている参照２０）。安定時のｐＨが酸性であるとき、一過性の電流は急速に不活性化される。反対に、ｐＨが安定時のｐＨの相対的な酸性度よりも低い（＜ｐＨ６）とき、持続電流は活性化されたままであり、また、細胞外のｐＨが徐々に下がるときにも、同様に活性化される（上記で引用されている参照７）。近年のノックアウトマウスにおける研究は、炎症によって、または筋肉内へ酸を繰り返し注入することによって誘発される二次機械的な疼痛過敏のモデルにおいて、筋肉および関節の組織アシドーシスを検出したときのＡＳＩＣ３の役割を示す（参照２１、２２、２３または６０）。また、広範囲の感覚ニューロンの機械感受性におけるＡＳＩＣ３の関与が主張された（参照２１）。一方、正常マウスとノックアウトマウスとの比較では、酸性皮膚痛覚または皮膚感受性における、炎症に付随する痛みに対するＡＳＩＣ３の重要な役割は示されていなかった（上記で引用されている参照２１、および参照２５）。
【０００６】
したがって、過去の研究ではせいぜいＡＳＩＣ３活性の阻害が直ちに痛みを及ぼすに違いないと予測することはできるが、酸に対する侵害受容器のインビボ感受性における、および正常状態または炎症状態の酸性皮膚痛覚における、ＡＳＩＣ’ｓの実際の関与、ならびに感覚ニューロン（特にＡＳＩＣ３）に存在する様々なイソ型の相対的な関与は、さらに今後示されることになる。また、痛覚過敏または無痛核、すなわちＡＳＩＣ’ｓ（特にＡＳＩＣ３）活性の阻害がいかにして痛みに作用する可能性があるかは、まだ実証されていない。しかしながら、要求される追加の分析には、選り抜きの薬理手段が必要になる。
【０００７】
最近まで、ＡＳＩＣ３の阻害能を有する活性リガンドのレパートリーは、主に、アミロリドおよび非ステロイド抗炎症剤（non-steroidal anti-inflammatory drugs：ＮＡＳＩＤ'ｓ）に限られていた（上記で引用されている参照７および参照１７）。しかしこれらの薬は、ＡＳＩＣチャネルに対して、またはＡＳＩＣチャネルの特定のタイプ（具体的にはＡＳＩＣ３）に対して確実に特有であるわけではない。
【０００８】
ここ数年間、動物毒は、電位依存性Ｃａ2+、Ｋ+およびＮａ+電流（参照２８、２９、３０、３１、３２、３３）、Ｃａ2+依存性カリウムチャネル（参照３４および３５）、ならびに機械感受性カリウムチャネル（参照５８）を高い親和性で特異的に改変する能力のある、数多くのトキシンを産生している。ＡＳＩＣ１ａチャネル（参照３６）およびＡＳＩＣ３チャネル（参照３８）をそれぞれ特異的に阻害する能力のある２つの動物トキシン（ＰｃＴｘ１およびＡＰＥＴｘ２）が近年特定されている。
【０００９】
非常に多くの数のサソリ、ハチ、クモ、ヘビおよびイソギンチャクの毒（１／１０００希釈物）またはペプチド画分（０．１ｍｇ／ｍｌ）が、ＡＳＩＣ３チャネルの特異エフェクターを特定する目的で、ゼノパス卵母細胞に発現されるＡＳＩＣ３チャネルに関してスクリーニングされている。アンソプレウラ エレガンティシマ イソギンチャクのペプチド分画はｐＨ６で刺激されるラットＡＳＣＩ３の電流の８０％以上を阻害することが実証されている。活性ペプチドを逆相クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーで均一に精製し、ＡＳＩＣ３上の活性な分画を観察して判断することによって、ＡＰＥＴｘ２を特定する（参照３８）。
【００１０】
ＡＰＥＴｘ２は、電位感受性カリウムチャネルおよび電位感受性ナトリウムチャネルを阻害する他のイソギンチャクトキシンの構造機構と類似する構造機構を有する、３つのジスルフィド結合を含む４２個のアミノ酸を含むペプチドである。ＡＰＥＴｘ２の完全な配列はエドマンズＮ末端分解によって確定され、測定されたモノアイソトピック質量（４５５７．９６Ｄａ）は遊離Ｃ末端を示す配列データ（４５５７．８８Ｄａ、精度１７．５ｐｐｍ）に基づいて算出された質量と完全に一致する。ＡＰＥＴｘ２は、ＡＰＥＴｘ１と６４％の配列同一性（７６％相同）を示し（参照４０）、また、イソギンチャクのトキシンＢＤＳ−ＩおよびＢＤＳ−ＩＩとわずか３４％の配列同一性（それぞれ５７％および５５％の相同）を示す。このＡＰＥＴｘ２は、電位依存性カリウム電流ｋｖ３．４を阻害する（参照４１）。ナトリウム電流を活性化するペプチド（アンソプレウラｓｐ．からのＡＰ−Ａ、ＡＰ−Ｂ、ＡＰ−Ｃ、ＡＰＥ１−１およびＡＰＥ−２など（参照３９））との配列同一性は、わずか２５〜２９％である（４１〜４７％相同）。さらに、ＡＰＥＴｘ２は、イソ型ＡＳＩＣ１ａの特異的インヒビターであるＰｃＴｘ１と、いかなる配列相同性も示さない（上記で引用されている参照３６）。
【００１１】
ＡＰＥＴｘ２はＡＳＩＣ３の外部で作用することによってＡＳＩＣ３を直接阻害し、また、そのチャネルのユニットコンダクタンスを修飾しない。今のところ、ＡＰＥＴｘ２はＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ１ｂおよびＡＳＩＣ２ａのイソ型に対していかなる影響も及ぼさないが、ＡＰＥＴｘ２は持続電流に影響を与えることなく、一過性の電流（ＩＣ50＝６３ｎＭ）を遮断することによってＡＳＩＣ３を可逆的に阻害する。また、ＡＰＥＴｘ２はヘテロマーＡＳＩＣ２ｂ＋３の電流を阻害するのに対し、ヘテロマーＡＳＩＣ１ｂ＋３およびヘテロマーＡＳＩＣ１ａ＋３に対する親和性はほとんどなく、ヘテロマーＡＳＩＣ２ａ＋３にはいかなる作用も有していない（上記で引用されている参照３８）。
【００１２】
驚くことに、発明者らは、今日、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの末梢注射（特に、皮下注射）が、痛みのラットモデルにおけるイソ型ＡＳＩＣ３の活性化に関連する痛みを緩和することができる（鎮痛作用）ことを示している。当該ラットモデルにおける痛みは、炎症に伴う、および組織アシドーシス（虚血、骨折、組織損傷および腫瘍など）に関連するすべての痛みのある状態を模倣する酸性溶液の皮下注射に伴うものである。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、従来技術の問題を解決することを目的としており、特に、望ましくない副作用をほとんどまたは全く有さず、使用、具体的には末梢投与（皮下投与、筋内投与、経皮投与、皮膚投与など）での使用が容易である、標的に特異的な新規の鎮痛分子を提供する。
【００１４】
本発明の第１の態様は、薬剤を得るための、イソギンチャク アンソプレウラ エレガンティシマのＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシン、ならびにその類似体および誘導体の利用に関する。
【００１５】
用語“ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの類似体”とは、他のイソギンチャク毒、またはＡＳＩＣ３様チャネルを阻害するという同一の性質を示す同じファミリーの他の海洋生物種から単離したペプチドを意味する。例えば、当該用語には、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの４２個のアミノ酸配列と６０〜９９％の配列同一性を有するペプチドを含む。
【００１６】
用語“ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの誘導体”は、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの４２個のアミノ酸配列のうち、１つまたは数個のアミノ酸が欠失および／もしくは付加されており、ならびに／またはＡＳＩＣ３様チャネルを阻害する性質が抑制されたまま保っている、同一の毒から単離したペプチドを意味する。例えば、当該用語には、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの４２個のアミノ酸配列における３位、５位、８位、９位、１０位、１５位、１６位、１７位、２３位、３１位、３２位、３３位、３６位、３９位および／または４１位での置換を示すペプチドバリアントを含む。また、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの配列のうち、Ｎ末端またはＣ末端において１つもしくは数個のアミノ酸の伸張を示すペプチドバリアントも含み得る。
【００１７】
本発明の具体的な実施形態によれば、上記薬剤は、ＡＳＩＣ３様チャネルに関連する疾患の予防または治療を目的とする。例えば、上記病的状態は、胃炎、虚血（筋肉、心臓、腸間膜など）、骨折、血腫、浮腫、フリクテン（または疱疹もしくは水疱）、局所感染、組織損傷（外科手術に関連する切開など）、眼障害、掻痒、および腫瘍（骨腫瘍および骨転移を含む）を含む炎症からなる群において選択される。
【００１８】
具体的に、上記薬剤は鎮痛剤であり、好ましくはＡＳＩＣ３様チャネルの活性化によって誘発される痛みの予防または治療を目的とした鎮痛剤であり、より好ましくは炎症によってもたらされる痛みの予防または治療を目的とした鎮痛剤である。
【００１９】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、上記鎮痛剤は、ＡＳＩＣ３様チャネルの活性化に関連する酸性の痛みの予防または治療を目的とする。例えば、組織アシドーシスに関連する痛みある状態は、虚血（筋肉、心臓、腸間膜など）、骨折、血腫、浮腫、フリクテン（または疱疹もしくは水疱）、局所感染、組織損傷（外科手術に関連する切開など）、眼障害、および腫瘍（骨腫瘍および骨転移を含む）よりなる群の中から選択される。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ＡＳＩＣ３様チャネルの活性化に関連のある痛みと同様の感覚経路（参照６１）に影響を及ぼす病的な過程が原因の治療である場合、上記鎮痛剤は掻痒の予防および治療を目的とする。
【００２１】
本発明の具体的な実施形態によれば、上記薬剤は、例えば皮下経路、筋肉経路、経皮経路または皮膚経路などの末梢経路を介して投与される。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、以下の説明の記載から理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】逆行性標識された脊髄神経節の皮膚ニューロン、およびこれらニューロンにおいて記録されたＡＳＩＣ電流の蛍光画像である。
【図２】ｐＨ７．０で誘発される野生型ＡＳＩＣ電流における、浸透圧（高浸透圧）およびアラキドン酸の影響を示す。
【図３】組み換え型ＡＳＩＣ１ａの高浸透圧による増強作用、および適度な酸性化により誘発されるＡＳＩＣ３電流を示す。
【図４】炎症性メディエーター（アラキドン酸（arachidonic acid：ＡＡ））による活性化されていないＡＳＩＣ３窓電流の増加、ならびにこのアラキドン酸電流および高浸透圧における、緩慢なアシドーシス時の相乗効果を示す。
【図５】酸性皮膚痛覚におけるＡＳＩＣ３のインビボでの役割、炎症性ファクター（アラキドン酸および高浸透圧）によるＡＳＩＣ３のポジティブ調節、および炎症性温熱痛覚過敏における炎症性ファクターの役割を表す。
【図６】ＡＳＩＣチャネルの各レベルにおけるＡＳＩＣ３メッセンジャーＲＮＡおよび脊髄神経節のＴＲＰＶ１チャネルメッセンジャーＲＮＡｓに対して方向づけて髄膜注射される干渉ＲＮＡ（interfering RNA：ｉＲＮＡ）の特異的な作用、ならびにこのｉＲＮＡの炎症性の痛みモデルにおける鎮痛作用を表す。
【図７】感覚ニューロン系Ｆ１１に発現する、ヒトＡＳＩＣ３チャネルの活性化におけるＡＰＥＴｘ２トキシンの作用を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
〔実施例〕
＜実施例１：材料および方法＞
（イソギンチャク アンソプレウラ エレガンティシマのＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの精製）
イソギンチャク アンソプレウラ エレガンティシマ（上記で引用されている参照３９）の水アルコール粗抽出物（水とメタノールの混合液）から、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５（４．５×４００ｎｍ）における陽イオン交換クロマトグラフィーによって酢酸アンモニウム（ｐＨ８．３）で溶出させて、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０（１２×１４０ｎｍ）における１Ｍ酢酸での排除拡散クロマトグラフィーによって、ポリペプチドプールを単離した。
【００２５】
６つの分画を、ゼノパス卵母細胞（上記で引用されている参照４１）中に発現するＡＳＩＣ３チャネルで試験した。８０％以上のＡＳＩＣ３電流が抑制されている１つの分画を逆相高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography：ＨＰＬＣ）（ウォーターズ シンメトリー Ｃ１８、４．６×２５０ｎｍ）で、線形グラジエント１０〜４０％の溶液Ｂ（アセトニトリル／０．１％ＴＥＡ）により３０分間（１ｍｌ／分）精製した。分離は、２２０ｎｍおよび２８０ｎｍでＵＶ吸収度を読み取るダイオードアレイ検出器に結合されるＨＰ１１００システム（ヒューレットパッカード、米国）で実施した。
【００２６】
次に、活性ペプチド分画を陽イオン交換カラムＴＳＫ−ＳＰ５ＰＷ（７．５×７５ｍｍ）（東ソー、日本）で、線形グラジエント０〜１００％の１Ｍ酢酸アンモニウムを用いて５０分間（１ｍｌ／分）水／１％酢酸の混合物で均衡化させて、精製した。ＡＰＥＴｘ２の最終精製は、同じ逆相ＨＰＬＣカラムにおいて、線形グラジエント２０〜３０％を１０分間用いた後、線形グラジエント３０〜４０％の溶液Ｂを２０分間用いて行なった。
【００２７】
ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンを２メルカプトエタノールで還元し、４−ビニルピリジンでアルキル化した後に、自動エドマンズＮ末端シーケンシング（４７７Ａ、バイオシステム（米国）を使用）によってシーケンスした。トリプシンで分解した後、ペプチドＣ末端の配列をアルギニン残基のシトラコニル化によって確認した。トリプシン残留物をＨＰＬＣ（ウォーターズ Ｃ１８、２×１５０ｍｍ）によって分離した。このとき、水／０．１％ＴＦＡ混合液において、２００μｌ／分で４０分間、線形グラジエント５〜５０％のアセトニトリル／０．１％を用いた。配列相同はＢＬＡＳＴプログラムによって決定した。分子量の決定は、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の充填剤（シグマ−アルドリッチ、米国）を含み、国内標準規格である、反射モードのＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ ｓｙｓｔｅｍ（バイオシステム（米国）を使用）におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定によって行なった。質量スペクトルはデータ探索ソフトによって分析し、理論上の分子量はＧＰＭＡＷソフトウェアを用いた配列データに基づいて算出した。
【００２８】
ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンのジスルフィド結合の配列は、シアニル化による部分的な還元および開裂のプロセス（参照４２および５６）によって決定した。
【００２９】
ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの分子モデルは、上述したＡＰＥＴｘ１座標（上記で引用されている参照４０）に基づき、Ｄｅｅｐ−Ｖｉｅｗ Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒ ｖ３．７ソフトウェアを用いて算出した。このモデルをＳｗｉｓｓモデルサーバによって最適化した。ＢＤＳ−Ｉ座標（１ＢＤＳ）はＰＤＢデータベースから得た。最後に、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの空間的構造を核磁気共鳴によって決定し、その結果、４つのらせん構造βシートからなる小型のジスルフィド結合を本質的に含む（参照４３）。
【００３０】
（Ｆ−１１細胞株の培養および導入）
Ｆ−１１細胞（参照文献４４、４５、４６、４７）は、５％のＣＯ2において、３５ｍｍのペトリ皿毎に５０，０００セルの密度で培養した。ＨＡＭ Ｆ−１２培地（インビトロジェン）を含む培養培地に、１５％ウシ胎児血清（ＩＣＮ バイオメディカルズ）、１×ＨＡＴ（ナトリウムヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）、２００μｇ／ｍｌのアロ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（シグマ−アルドリッチ）および１％の抗生物質を加えた。接種してから１日後、ベクターｐＣＩ−ＡＳＩＣ１ａｒ＋ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（比率１：２）またはｐＣＩ−ＡＳＩＣ３ｒ＋ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（比率１：１０）（上記で引用されている参照３６）を使用し、製造業者の指示に従ってリポフェクタミン（登録商標）（インビトロジェン）を用いて、細胞にＡＳＩＣ１ａ ＤＮＡｃまたはＡＳＩＣ３ ＤＮＡｃ（ラットクローン）を導入した。ヒトＡＳＩＣ３クローンについて実験するために（ヒト型のＡＳＩＣ３チャネルにおけるＡＰＥＴｘ２トキシンの作用の実験に関する）、ベクターｐＡＳＩＣ３ｈ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの補助を伴って、製造業者の指示に従い導入剤ＪｅｔＰＥＩ（ポリプス トランスフェクション）を使用し、細胞にヒトＡＳＩＣ３のＤＮＡｃを導入した。導入から２〜４日後、当該細胞をパッチクランプ実験（電気生理学的な方法であり、細胞膜を介して移動するイオンの流れを記録するための方法である）のために使用した。
【００３１】
（皮膚求心性神経の逆行性標識）
ラットの後足背面に５×１μｌのディル蛍光色素（５％ＤＭＳＯ、分子プローブ）を皮下注射することによって、表皮を刺激する後根神経節（脊髄神経節またはＤＲＧ（dorsal root ganglion））のニューロンを標識した。この色素を２週間注射した後、ラットを屠殺して後根神経節の第１培養組織を調製した。
【００３２】
（標識された後根神経節からのニューロンの第１培養組織）
ウィスターラット（８〜１１週齢）の腰椎後根神経節を左右対称に解剖し、０．１％コラゲナーゼによって酵素分解した。次に、コラーゲンで覆われた３５ｍｍのペトリ皿に細胞を設置し、５％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地において３７℃（９５％空気／５％ＣＯ2）で培養した。接種して１〜８日後に、電気生理学的実験を行なった。
【００３３】
（電気生理学）
パッチクランプ法の細胞構成全体を用いて（参照４８）、膜電流（付加電圧）または膜電位（付加電流）を測定した。記録は、室温で、３ｋＨｚローパスフィルター（クローン−ハイト）を備えるＲＫ−４００増幅器（バイオ−ロジック サイエンス インストラメンツ）を用いて行なった。データは１０ｋＨｚで採取し、デジデータ１３２２Ａ Ａ−Ｄ／Ｄ−Ａコンバータ（アクソン インストラメンツ）を用いてデジタル化し、ｐＣｌａｍｐソフトウェア（バージョン９．２．０．１１、アクソン インストラメンツ）によってハードディスクに記録した。記録プローブ（１−４ＭＯｈｍｓ）には：１３ＫＣｌ、２．５Ｎａ2−ＡＴＰ、２ＭｇＣｌ2、２．１ＣａＣｌ2、５ＥＧＴＡ、１０ＨＥＰＥＳ（ＫＯＨによりｐＨ７．２５）が含まれる（ｍＭにおいて）。導入された細胞に、多様な異なるバッファおよび関連のある薬剤を加えた。この細胞を、国内で開発され、溶液を急速に交換させるマイクロインフュージョンシステム（マイクロエレクトロウェーブ（シライ、イタリア）によって制御される）を用いて個別に考察した。コントロール浴液は：１４５ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、２ＭｇＣｌ2、２ＣａＣｌ2、１０ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨによりｐＨ７．４）が含まれる（ｍＭにおいて）。ＨＥＰＥＳ培地の代わりにＭＥＳ培地を使用してｐＨ６〜５の範囲に溶液を中和し、マイクロインフュージョンシステムを用いてｐＨ７．４でコントロール溶液から酸性試験溶液に急速に交換することによって、ＡＳＩＣ電流を誘発した。ＤＲＧニューロンにおいて行なう実験のため、コントロール浴液にグルコース（１０ｍＭ）を加えた。テキストに示されるように、マンニトールまたはスクロースを外部の浴液に加えることによって、高浸透圧状態にした。
【００３４】
（ラットの侵害受容行動）
７〜８週齢の成体の雄ウィスターラット（カールスリバー、フランス）をプラスチック製のケージに収容した。暗期間は１２時間（点灯は午前８時から午後８時）とし、餌および水は自由に入手させた。実験前に、少なくとも１週間ラットを順応させるために放置した。行動実験のために、透明な観察室にラットを２０〜３０分間収納して順応させた。続いて、ラットを固定し、その間に、２０μｌの食塩水（０．９％または２％のＮａＣｌ＋２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０μＭのアラキドン酸および／または１０μＭのＡＰＥＴｘ２トキシンもしくは６０ｎＭのＰｃＴｘ１トキシンを加えて、またはなしで７．４≦ｐＨ≦６．６）を、１００μｌハミルトンシリンジに接続した３０Ｇ針によって右の後足背面に皮下注射した。注射後すぐに記録を開始して、侵害受容行動（すなわち、後足が震える数）を５分間記録した（参照５９）。
【００３５】
（炎症を誘発するラットの温熱痛覚過敏）
成体の雄ウィスターラット（カールスリバー、フランス）の熱に対する感受性を試験した。試験は、５０℃のホットプレート（バイオセブ、フランス）に乗せたときに、動物が一方の後足を引っ込めるために要した時間を、完全フロインドアジュバント溶液（ＣＦＡ（Freund's complete adjuvant）、シグマ−アルドリッチ、フランス）の皮下注射による炎症の誘発前後に測定することによって行なった。ラットを少なくとも３０分間実験室に馴れさせて、各測定を繰り返し行なった。最初の測定は、炎症を誘発させる前に行なった。次に、ラットを麻酔し、その間に、トキシン（ＰｃＴｘ１またはＡＰＥＴｘ２、それぞれ１２０ｎＭおよび２０μＭ）または媒体のいずれかを含む食塩水（０．９％ＮａＣｌ）によって１：１に希釈したＣＦＡ１５０μｌを一方の後足底面に皮下注射した（１ｍｌシリンジに２６Ｇ針を取付けた）。そして、ＣＦＡの注射後２時間、４時間および２５時間に、注射した後足を持ち上げるのに動物が要した時間を５０℃で測定した。
【００３６】
（ラットにおける干渉ＲＮＡの髄膜注射）
ＡＳＩＣ３チャネルに特異的なｉＲＮＡ（番号１１２１；ＣＴＡＣＡＣＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびそのコントロール（番号１１２１ｓ；ＧＣＴＣＡＣＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を実験室で設計し、ＭＷＧバイオテック カンパニー（ドイツ）によって合成した。ＡＳＩＣ３に特異的なｉＲＮＡを、ＡＳＩＣチャネルおよびＴＲＰＶ１チャネルそれぞれのために、定量ＲＴ−ＰＣＲによるメッセンジャーＲＮＡレベルの定量化によって確認した後、３日間連続して１日１注射の割合でラットの脊髄の要部に髄膜注射してから動物を屠殺した。同様の手順を、ＣＦＡによって炎症を誘発する前に行なった。各注射は容積１０μｌであり、１対４の比率で誘導試薬ｉ−Ｆｅｃｔ（ニューロミクス）と混合した２μｇのｉＲＮＡを含んでいた。
【００３７】
（化学製品）
ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）１−ピペラジンエタンスルホン酸）およびＭＥＳ培地（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸；Ｃ6Ｈ13ＮＯ4Ｓ・Ｈ2Ｏ）、マンニトール、カプサゼピン、ならびにアラキドン酸はシグマから購入した。
【００３８】
（データの分析）
マイクロカル（登録商標）オリジン６．０（商標登録）およびグラフパッドプリズム４．０３ソフトウェアを用いてデータを分析した。当該データを平均±標準誤差として表し、スチューデントのｔ検定、または一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）（必要であればポストホック試験の後に）のいずれかを用いて、一連のデータ間の統計に基づく差分を算出した。
【００３９】
＜実施例２：表皮を刺激する脊髄神経節のニューロンにおけるＡＳＩＣ３型電流＞
ラットの表皮を刺激する脊髄神経節のニューロンにおいて、細胞外の適度な酸性化によって活性化されたＡＳＩＣ電流を記録し、ディル蛍光色素を使用して逆行性標識することによって同定した（図１）。
【００４０】
これら実験に用いられる適度なｐＨの値（すなわち、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．０）を選択してＡＳＩＣ１型電流およびＡＳＩＣ３型電流を主に活性化させた。これは、ＡＳＩＣ２型電流およびＴＲＰＶ１型電流がより激しい酸性化によって活性化されるとして説明されている実情のためである（上記で引用されている参照４９および参照２）
図１Ａは、パッチクランプ法のために細胞構成全体において用いられる脊髄神経節の典型的なディル−陽性皮膚ニューロン（矢印）を示す。これらのニューロンは、−５５．０±１．８ｍＶの静止膜電位、および３９．６±１．８ｐＦの膜容量を有している（ｎ＝４２および４３ニューロン、それぞれ、４つの異なる培養組織からのデータである）。
【００４１】
図１Ｂは、試験した骨髄神経節の皮膚ニューロン（４／７、８／１１、８／１０、および８／１５、４つの異なる培養組織からのデータ）のうち６５．８±６．３％が、ｐＨ６．６で平均振幅−６０．３±１６．０ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝２８）にて誘発される、一過性のＡＳＩＣ型電流を見せることを示す。骨髄神経節の皮膚ニューロンの残り（３４．２±６．３％）のうちｐＨ６．６の外部利用は、いかなる電流も誘発しないか（ｎ＝１１）、わずかに維持電流を誘発するか（−１．２±０．５ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝４）である。
【００４２】
骨髄神経節の皮膚ニューロンにおいてｐＨ６．６で誘発されるＡＳＩＣ型電流の間で区別するため、ホモマーチャネルＡＳＩＣ１ａの選択的インヒビターとして、ＡＳＩＣ１ａに特異的なＰｃＴｘ１トキシンを用いた（上記で引用されている参照３６）。
【００４３】
図１Ｂ（右のパネル）から、これらニューロンの４．７％（２／４３）が上記トキシンによって広範囲に阻害される電流（＞９０％阻害；すなわち、ＡＳＩＣ１ａホモマー電流）を示し、２３．３％（１０／４３）がトキシンに対して電流感受性（阻害＜１０％；すなわち、ＡＳＩＣ１３型電流）を示し、３７．２％（１６／４３）が部分的に阻害された電流（１０％≦阻害≦９０％；すなわち、ＡＳＩＣ３型およびＡＳＩＣ１ａホモマー電流の混合）を示すことがわかる。図１Ｃでは、これらの電流において、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシン（イソ型ＡＳＩＣ３を含むチャネルを特異的に阻害する）に対する部分的な感受性によるＳＩＣ３の関与を確認している（上記で引用されている参照３８）。
【００４４】
さらに、骨髄神経節の皮膚ニューロンにＡＳＩＣ電流を誘発させるために適度な酸性化（ｐＨ６．６）を用いることは、ＡＳＩＣ２型電流およびＴＲＰＶ１電流のすべてではないが、その大多数の排除を可能にした。よって、骨髄神経節の皮膚ニューロンにおいて適度な酸性化によって活性化される最も多くのＡＳＩＣ電流は、６０．５％（２６／４３）のスコアを有するＳＡＩＣ３型電流であった。
【００４５】
＜実施例３：適度な酸性化によって活性化される骨髄神経節の皮膚ニューロンのＡＳＩＣ電流の２つの炎症性刺激（浸透圧およびアラキドン酸）による増強作用＞
損傷した組織または炎症を起こした組織において、いくつかの電位緩衝液が間質液に含まれており、その中身が酸と高浸透圧とである（参照５１）、炎症性の浸出液になっている（参照５０）。そのため、適度な酸性化により活性化される脊髄神経節の皮膚ニューロンのＡＳＩＣ電流における高浸透圧の作用を研究した。
【００４６】
図２Ａ、２Ｄおよび２Ｅは、高浸透圧（hyperosmolarity）（外液の適度な酸性化に同時に適用される（ｐＨ７．０、図２Ｅの矢印を参照））が、これらニューロンにおいてｐＨ７．０で誘発されるＡＳＩＣ型電流を著しく増加させることが可能であり（９５％±３５％の増加、ｎ＝８、ｐ＜０．０１、対応のあるスチューデントのｔ検定）、より多く活動電位を誘発することによって神経細胞の興奮を増加させる結果になることを示す（図２Ｂ）。
【００４７】
ＡＳＩＣ電流における炎症性メディエーター（アラキドン酸（ＡＡ））のポジティブ作用についてはすでに説明した（参照５２および５３）。この作用を、骨髄神経節の皮膚ニューロンにおいて、本来のｐＨ７．０で誘発されたＡＳＩＣ電流によって確認した（図２Ｄ；１７２±６５％で増加、ｎ＝６、ｐ＝０．０６、対応のあるスチューデントのｔ検定）。重要なことに、図２Ｃでは、このアラキドン酸の作用は、活動電位のトリガーを増加させることによって、結果として骨髄神経節の皮膚ニューロンの興奮もまた増加させることを示す。
【００４８】
双方の作用の反応速度は異なる。実際、図２Ｅには、天然のＡＳＩＣ電流の高浸透圧によって誘発される増強作用が瞬時（ｐＨの急上昇による同時利用）であるのに対し、ＡＳＩＣ電流におけるアラキドン酸の作用は、十分に使用可能になるために数分を要することを示す。さらに、同じ細胞に対する高浸透圧の繰り返しの利用は上記増強作用を低減させることにつながるが（矢印で示す）、一方、アラキドン酸の作用は細胞に利用される限り最大まで増加する（灰色に塗られた四角）。したがって、双方を考慮して、これらの結果は、（ｉ）骨髄神経節の皮膚ニューロンにおいて適度な酸性化（ｐＨ７．０）によって活性化されるＡＳＩＣ電流は、膜浸透圧を活動電位のトリガー閾値まで達するのに十分なレベルであり、（ｉｉ）アラキドン酸の高浸透圧など２つの炎症性シグナルは、適度な酸性化によって活性化されるＡＳＩＣ電流における増強作用によって神経細胞の興奮を高めることを示す。
【００４９】
＜実施例４：脊髄神経節由来のＦ−１１細胞における浸透圧に対する、組換えＡＳＩＣ３チャネルの感受性＞
様々なイソ型ＡＳＩＣにおける浸透圧の作用をより正確に分析するため、ＡＳＩＣ１ａおよびＡＳＩＣ３チャネルをＦ−１１細胞株において非相同的に発現させた（上記で引用されている参照４４、４５、４６、４７）。
【００５０】
ＡＳＩＣ１ａおよびＡＳＩＣ３チャネルは（ｉ）ラットの骨髄神経節のニューロンに現れる典型的なＡＳＩＣ電流であり（上記で引用されている参照５４および参照５５）（また、図１にて示す）、（ｉｉ）興奮に対するそれらの閾値ｐＨがｐＨ７．０に近いため（上記で引用されている参照２）に使用した。
【００５１】
図３Ａは、高浸透圧（マンニトールを有する６００ｍオスモル．ｋｇ-1）がｐＨ７．２で活性化されるＡＳＩＣ３電流を著しく増強させる能力があることを示す（１４８±２０％の上昇、ｎ＝２０、ｐ＜０．００１、対応のあるスチューデントのｔ検定）。一方、ｐＨ７．２までの外液の酸性化はＡＳＩＣ１ａによって導入される細胞からのＡＳＩＣ１ａ電流を目立って産生することはなく、高浸透圧は影響がない。面白いことに、図３Ｂは、ｐＨ６．６で活性化されるＡＳＩＣ１ａ電流に影響がない高浸透圧（６００ｍオスモル．ｋｇ-1）は、ｐＨ６．６で活性化されるＡＳＩＣ３電流を増強させないことを示す。このことは、不活性化しない、すなわち持続するＡＳＩＣ３窓電流における作用を示唆する（上記で引用されている参照１９）。
【００５２】
ＡＳＩＣ３電流が高浸透圧の衝撃による増強作用があることを確認するため、続いて、導入したＦ−１１細胞から記録された、ｐＨ７．２で誘発される電流のＩ／Ｖ曲線をプロットした（図３Ｃ、上部パネル）。ｐＨ７．２のコントロールによって誘発される電流と（等浸透圧環境にて測定）、増強される電流と（高浸透圧環境にて測定）は、実際に高浸透圧がＡＳＩＣ３電流を増強させることを示す、同じ逆電位を有する（それぞれ４９．４±０．７ｍＶおよび４５．９±３．４ｍＶ、対応のあるスチューデントのｔ検定）（図３Ｃ、下部パネル）。
【００５３】
図３Ｄは、ｐＨ７．２で誘発されるＡＳＩＣ３電流の増加率が、外液の浸透圧が６００ｍオスモル．ｋｇ-1に達するときに略最大であることを示す。さらに、高浸透圧の外液がスクロースによって調整されている場合、振幅がわずかであるにも関わらず、観察される範囲において、高浸透圧がこの作用の第一のファクターである（図３Ｄ）。
【００５４】
これらの結果は、高浸透圧が、おそらくＡＳＩＣ３窓電流における作用によって、中程のｐＨ範囲内（すなわち、ｐＨ７．２付近）においてＡＳＩＣ３電流を増強させることを示す。
【００５５】
＜実施例５：アラキドン酸による非不活性化ＡＳＩＣ３窓電流の増強作用＞
ＡＳＩＣ型電流におけるアラキドン酸（ＡＡ）の増強作用を検討するために、アラキドン酸（ＡＡ）の作用を、ＡＳＩＣ１ａおよびＡＳＩＣ３を導入したＦ−１１細胞において観察した。
【００５６】
ＡＳＩＣチャネルの活性におけるアラキドン酸の作用は、その作用メカニズムは未だよく理解されていないが、既に説明している（上記で引用されている参照５２および参照５３）。
【００５７】
図４Ａは、アラキドン酸が、ｐＨ７．２で活性化されるＡＳＩＣ３電流に大幅な可逆的増加をもたらし、一方、同じｐＨでのＡＳＩＣ１ａでは全く作用しないことを示す。アラキドン酸はｐＨ７．２およびｐＨ７．０で活性化されるＡＳＩＣ３電流を著しく増強させるが（５４７±１０３％の増加、ｐ＜０．０００１、ｎ＝２３、および４９３±８４％の増加、ｐ＜０．０００１、ｎ＝９、それぞれウィルコクソン検定）、一方、ｐＨ６．６で活性化されるＡＳＩＣ３電流ではわずかに増強させるのみである（＋４０±２２％、ｎ＝７、ｐ＝０．４５、対応のあるスチューデントのｔ検定）（図４Ｂ参照）。前の結果に続いて（上記で引用されている参照５３）、アラキドン酸はｐＨ７．０（＋１８３±５４％、ｎ＝５、ｐ＝０．０６、ウィルコクソン検定）でＡＳＩＣ１ａ電流を同様に増加させて、また、ｐＨ６．６（＋２１±１５％、ｎ＝２）ではより低い値にさせる。しかし、その作用はＡＳＩＣ３に関するよりも未だ明白ではない（図４Ｂ）。
【００５８】
図４Ｃには、ＡＳＩＣ３電流におけるアラキドン酸の強力な作用が、より生理的な値に向かう活性化ｐＨに対する依存度の変化を生み、一方、特筆すべきでない作用がｐＨ依存性不活性化曲線において観察されることを示す。
【００５９】
結果として、不活性化していないＡＳＩＣ３窓電流は、アラキドン酸の存在下で明らかに増加し（図４Ｄ、上部パネル）、残りの生理的ｐＨに近いｐＨ値でチャネルの活性化を生じる（図４Ｄ、下部パネル）。
【００６０】
これらの結果は、不活性化していない窓電流に対する強い影響によって、適度な酸性化により活性化されるＡＳＩＣ３電流を、アラキドン酸が選択的に増強させることを示す。極めて重要なことに、図４Ｅはこのアラキドン酸の作用が同じＡＳＩＣ３電流における高浸透圧の作用に追加されることを示す。この結果は、ＡＳＩＣ３が異なる炎症性シグナル（適度な酸性化、高浸透圧およびアラキドン酸など）を組み込み得ることを強く示唆する。
【００６１】
＜実施例６：適度な酸性化によって誘発される皮膚の痛みに対するＡＳＩＣ３の寄与＞
脊髄神経節の皮膚ニューロンにおけるＡＳＩＣ３の高い発現、および炎症刺激（高浸透圧およびアラキドン酸など）による適度なｐＨ値での調節は、正常状態および炎症状態での皮膚酸性痛覚におけるＡＳＩＣ３の役割を研究することにつながる。
【００６２】
図５Ａは、一方の後足に適度な酸性溶液（ｐＨ７．４、ｐＨ７．２、ｐＨ６．９およびｐＨ６．６）を皮下注射した後の、痛みに対するラットの行動を示す。痛みに応じた顕著な行動はｐＨ６．９で見られる（振動スコアはｐＨ７．４で２．１１±０．６７からｐＨ６．９で１１．１１±２．５４へ増加、それぞれｎ＝１４および２２、ｐ＜０．０５、この後にダン検定が続くクラスカリ・ワリス検定）。この痛み行動は、ＡＰＥＴｘ２トキシンの存在下において抑制されるため、それによって皮下酸性痛覚の検出におけるＡＳＩＣ３の関与を証明する。
【００６３】
骨髄神経節の皮膚ニューロン、および組換えチャネルに存在するＦ−１１細胞の双方において、高浸透圧およびアラキドン酸が、適度なｐＨでのＡＳＩＣ３チャネルの強力な共同作用アクチベーターに見えるという点で（図２、３および４を参照）、これらの炎症性シグナルは適度なｐＨにおいて同時に注入される（２％ＮａＣｌ、〜６００ｍオスモル．ｋｇ-1および１０ｍＭ ＡＡ）（図５Ａ）。炎症性カクテルのこれら３つの必須要素の組み合わせは、ｐＨ６．８とだけ関連のあるラットの振動スコアを上昇させる（１１．１±２．５４（ｎ＝２２）〜２０．４２±２．５３（ｎ＝２５）、Ｐ＜０．０５、クラスカリ・ワリス検定、その後にダン検定）（図５Ａ）。
【００６４】
この酸性痛覚に応じた行動は、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシン（ＡＳＩＣ３の特異的なインヒビター（上記で引用されている参照３８））によって明らかに減少するが、一方ＰｃＴｘ１トキシン（ＡＳＩＣ１ａの特異的なインヒビター）は有意な影響が全くない（図５Ａ）。
【００６５】
双方を考慮すると、これらの結果は、ＡＳＩＣ３が適度な酸性化によって誘発される皮膚の痛みの主なレセプターであり、ラットにおける炎症性の痛みに関与することを強く示唆する。
【００６６】
＜実施例７：完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）によってもたらされる炎症で誘発されて、ラットにおいて発現する温熱痛覚過敏に対するＡＳＩＣ３の寄与＞
ペプチドトキシンＡＰＥＴｘ２（ＡＳＩＣ３イソ型を含むチャネルのインヒビター）およびＰｃＴｘ１（ＡＳＩＣ１ａホモマーチャネルのインヒビター）の作用を、ラットの皮膚痛覚モデル（ＣＦＡによって誘発される温熱痛覚過敏）において試験して、炎症性の痛みにおけるＡＳＩＣ３の特異的な役割を確認した。
【００６７】
図５Ｂは、有意な温熱痛覚過敏が、ＣＦＡを後足に注射して炎症を誘発してから４時間後に現れることを示す。
【００６８】
これに対し、ＣＦＡと共にＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンを注射した場合、温熱痛覚過敏は発現しないが、ＣＦＡと共にＰｃＴｘ１トキシンを注射した場合、有意な影響が全くない。
【００６９】
ＣＦＡを注射して２０時間後、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンによって処理された動物は、温熱痛覚過敏に関する媒体を注射されたコントロール動物とは異なり、たいていトキシンの作用が時間をかけて段階的に衰えることを示し、いずれの行動も示さない。
【００７０】
これらの結果は、ＡＳＩＣａではなく、ＡＳＩＣ３がラットの末梢レベルでの炎症性の痛みの認識に重要な役割を果たすことを示す。
【００７１】
＜実施例８：インビボでのＡＰＥＴｘ２トキシンの特異的な阻害作用＞
細胞レベルでのＡＰＥＴｘ２トキシンによるＡＳＩＣ３チャネル阻害の特異性を実証すること（培養されたニューロンおよび導入されたＦ−１１細胞株において）は、ラットで観察されるＡＰＥＴｘ２の鎮痛作用が、独占的に、ＡＳＩＣ３型チャネル活性を阻害する結果となることの１つの証明につながる。ＡＳＩＣ３チャネルの遺伝的阻害に関連するアプローチがこの目的のために適用され、ラットのＡＳＩＣ３チャネルにて特異的に方向づけられる干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）の髄膜注射の作用を観察することを含む。
【００７２】
図６Ａは、後足に神経を分布するラットの感覚ニューロンにおける様々なイオンチャネルの発現レベルにおいて、ＡＳＩＣ３チャネルに特異的であるｉＲＮＡの髄膜注射の影響を示す。この結果は、ＡＳＩＣ３チャネル特異的ｉＲＮＡの髄膜注射が、ラットの感覚ニューロンにおけるＡＳＩＣ３チャネルの発現において際立った、また、独占的に減少させることを示す（黒矢印で示す）。
【００７３】
図６Ｂには、ＡＳＩＣ３チャネルに特異的なｉＲＮＡを３日間髄膜注射した後に完全フロイドアジュバント（ＣＦＡ）で炎症を起こさせた（挿入部分で示す）ラットは、同じ組成のｉＲＮＡ（任意の配列ではないが）で処理されたコントロールラット（コントロール、白塗りの柱）に比べて、少しも炎症性温熱痛覚過敏を発現しないことを示す（ｉＲＮＡ、黒塗りの柱）。この結果は、ＡＰＥＴｘ２トキシンによって処理された動物で得られる結果と同じである（実施例７を参照）。
【００７４】
これらの結果は、ＡＳＩＣ３チャネルが炎症性痛覚のメディエーターであること、および、ＡＰＥＴｘ２トキシンの鎮痛作用が、動物のこれらチャネルを阻害することにもっぱら起因することを証明する。
【００７５】
＜実施例９：ヒトＡＳＩＣ３クローンにおけるＡＰＥＴｘ２トキシンの阻害作用＞
ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの阻害作用をヒトＡＳＩＣ３チャネルにおいて試験した。この目的のため、ヒトＡＳＩＣ３電流の振幅を上述したパッチクランプ法によって記録した。このとき、上述した方法に従いヒトＡＳＩＣ３クローンを導入したＦ−１１感覚ニューロンからの細胞外培地を、ＡＰＥＴｘ２トキシン１μＭの非存在下または存在下において酸性化（ｐＨ８．０〜ｐＨ７．０、二方向の矢印で示す）してから行なった。
【００７６】
図７は、ヒトＡＳＩＣ３チャネル由来の電流の振幅が、ＡＰＥＴｘ２トキシンの存在下で有意に減少することを示す（左から始めて第３ピークから第５ピーク）。
【００７７】
これらの結果は、ＡＰＥＴｘ２トキシンがヒトＡＳＩＣ３チャネルの活性を阻害する能力があり、ヒトに対する新規の鎮痛剤としてのＡＰＥＴｘ２トキシンおよびその誘導体の利用可能性が認められることを明白に示す。
【００７８】
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【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＳＩＣ３陽イオンチャネルを阻害する、アンソプレウラ エレガンティシマ（Anthopleura elegantissima）イソギンチャク由来のＡＰＥＴｘ２ペプチドの、痛みの鎮痛作用のための利用に関し、当該痛みは、炎症時、また、場合により組織アシドーシス（虚血、骨折、血腫、浮腫、疱疹、局所感染、組織損傷、眼障害および腫瘍など）に伴う任意の痛みのある状態の時の、同位体ＡＳＩＣ３（Acid Sensing Ion Channel 3：酸感受性イオンチャネル３）の活性と関連がある。
【背景技術】
【０００２】
痛み（特に、炎症性の痛み）の検討および治療では、患者のクオリティ・オブ・ライフを向上させることが基本的な捉え方であり、実質的には、抗炎症剤（非ステロイド系の抗炎症剤（non-steroidal anti-inflammatory drugs：ＮＳＡＩＤ’ｓ）またはステロイド系の抗炎症剤のいずれであれ）の処方を基盤としている。ＮＳＡＩＤ’ｓおよび／またはコルチコステロイドが炎症性の痛みの緩和に適当でない場合、処方者は抗炎症性鎮痛剤（パラセタモールなど）と、弱いまたは強いオピオイドとを組み合わせる。しかしながら、現在の治療手段の多様性にも関わらず、ＮＳＡＩＤ’ｓに関するケースのように、多くのタイプの痛みは、望ましくない副作用をさらに引き起こし得る既知の薬に対してわずかな反応しか示さない。そのため、この状況では、新規の鎮痛ターゲットの発見が本当の発展を意味することになる。イオンチャネルは、侵害受容繊維による痛みシグナルの検出および伝達に直接関与するため、過去数年間に特定された分子ターゲットのうち特に重要な位置を占める。
【０００３】
ＡＳＩＣ’ｓ（Acid Sensing Ion Channels：酸感受性イオンチャネル）は、細胞外アシドーシスによって活性化される陽イオンチャネルである（参照１および２を参照のこと）。今日では、哺乳類において、少なくとも７つのサブユニット（ＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ１ｂ、ＡＳＩＣ１ｂ２、ＡＳＩＣ２ａ、ＡＳＩＣ２ｂ、ＡＳＩＣ３およびＡＳＩＣ４）をコードする４つの遺伝子が特定されている。機能性ＡＳＩＣチャネルは三量体の異なるＡＳＩＣサブユニットの連携から生じ（参照３）、ホモマーチャネルまたはヘテロマーチャネルになる（参照４、５および６）。ＡＳＩＣチャネルは神経チャネルの大部分を占めるため、中枢神経系および末梢神経系の両方に発現する。ＡＳＩＣ１ａチャネルおよびＡＳＩＣ２チャネルが中枢神経系および末梢神経系に広く現れるのに対して、ＡＳＩＣ１ｂチャネルおよびＡＳＩＣ３チャネルの発現は感覚ニューロンに限定される（参照７、５７および８）。
【０００４】
ＡＳＩＣ’ｓは、虚血、炎症、血腫、骨折、障害、外科手術（術後痛）またはいくつかの腫瘍発達の間に生じる傾向にある細胞外酸性化を検出する能力があると仮定されている（参照９）。ここ数年、細胞外アシドーシスが痛みを生み出すことが実際にわかるようになっており（参照１１および１２）、健康なヒト志願者にて行なった実験（参照１３および１４）では、アミロリドを用いた酸性皮膚痛覚におけるＡＳＩＣ’ｓの関与、およびいくつかのＮＳＡＩＤ’ｓ（ＡＳＩＣ’ｓの非特異的インヒビター）の関与が証明されている（参照１５および１７）。
【０００５】
感覚ニューロンに発現するすべてのＡＳＩＣサブユニットのうち、ＡＳＩＣ３は侵害受容性ニューロンにおいて広く発現し（上記で引用されている参照７、参照１７および１８）、適度な酸性化（約ｐＨ７．０）を受けて、持続性の非不活性化電流を生み出すこと（参照１９）を考えると、特有の影響力がある。ＡＳＩＣ３電流は実際に２つの成分を有する：（１）高いｐＨ感受性（ｐＨ0.5＝６．５−６．７）（上記で引用されている参照７、参照２０）のある一過性の成分であって、急速に活性化したり（ｔ0.5＜５ｍｓｅｃ）不活性化したり（ｔ0.5＝０．３２ｍｓｅｃ）する（上記で引用されている参照２０）成分、ならびに（２）持続成分であって、適度な酸性化である場合、チャネルの活性曲線および不活性曲線の部分的な重なりに起因する窓電流（window current）から生じ、また、さらに酸性のｐＨ値（ｐＨ＜６．０）の場合、明らかに異なる機構から生じる成分。一過性の電流は、ｐＨが中性に戻った後（ｔ0.5＝０．５８ｍｓｅｃ）の不活性化に続いて急速に元に戻る（上記で引用されている参照２０）。比較として、ＡＳＩＣ１ａは非常に長い回復期間（ｔ0.5＝１３ｍｓｅｃ）が必要になる（上記で引用されている参照２０）。安定時のｐＨが酸性であるとき、一過性の電流は急速に不活性化される。反対に、ｐＨが安定時のｐＨの相対的な酸性度よりも低い（＜ｐＨ６）とき、持続電流は活性化されたままであり、また、細胞外のｐＨが徐々に下がるときにも、同様に活性化される（上記で引用されている参照７）。近年のノックアウトマウスにおける研究は、炎症によって、または筋肉内へ酸を繰り返し注入することによって誘発される二次機械的な疼痛過敏のモデルにおいて、筋肉および関節の組織アシドーシスを検出したときのＡＳＩＣ３の役割を示す（参照２１、２２、２３または６０）。また、広範囲の感覚ニューロンの機械感受性におけるＡＳＩＣ３の関与が主張された（参照２１）。一方、正常マウスとノックアウトマウスとの比較では、酸性皮膚痛覚または皮膚感受性における、炎症に付随する痛みに対するＡＳＩＣ３の重要な役割は示されていなかった（上記で引用されている参照２１、および参照２５）。
【０００６】
したがって、過去の研究ではせいぜいＡＳＩＣ３活性の阻害が直ちに痛みを及ぼすに違いないと予測することはできるが、酸に対する侵害受容器のインビボ感受性における、および正常状態または炎症状態の酸性皮膚痛覚における、ＡＳＩＣ’ｓの実際の関与、ならびに感覚ニューロン（特にＡＳＩＣ３）に存在する様々なイソ型の相対的な関与は、さらに今後示されることになる。また、痛覚過敏または無痛核、すなわちＡＳＩＣ’ｓ（特にＡＳＩＣ３）活性の阻害がいかにして痛みに作用する可能性があるかは、まだ実証されていない。しかしながら、要求される追加の分析には、選り抜きの薬理手段が必要になる。
【０００７】
最近まで、ＡＳＩＣ３の阻害能を有する活性リガンドのレパートリーは、主に、アミロリドおよび非ステロイド抗炎症剤（non-steroidal anti-inflammatory drugs：ＮＡＳＩＤ'ｓ）に限られていた（上記で引用されている参照７および参照１７）。しかしこれらの薬は、ＡＳＩＣチャネルに対して、またはＡＳＩＣチャネルの特定のタイプ（具体的にはＡＳＩＣ３）に対して確実に特有であるわけではない。
【０００８】
ここ数年間、動物毒は、電位依存性Ｃａ2+、Ｋ+およびＮａ+電流（参照２８、２９、３０、３１、３２、３３）、Ｃａ2+依存性カリウムチャネル（参照３４および３５）、ならびに機械感受性カリウムチャネル（参照５８）を高い親和性で特異的に改変する能力のある、数多くのトキシンを産生している。ＡＳＩＣ１ａチャネル（参照３６）およびＡＳＩＣ３チャネル（参照３８）をそれぞれ特異的に阻害する能力のある２つの動物トキシン（ＰｃＴｘ１およびＡＰＥＴｘ２）が近年特定されている。
【０００９】
非常に多くの数のサソリ、ハチ、クモ、ヘビおよびイソギンチャクの毒（１／１０００希釈物）またはペプチド画分（０．１ｍｇ／ｍｌ）が、ＡＳＩＣ３チャネルの特異エフェクターを特定する目的で、ゼノパス卵母細胞に発現されるＡＳＩＣ３チャネルに関してスクリーニングされている。アンソプレウラ エレガンティシマ イソギンチャクのペプチド分画はｐＨ６で刺激されるラットＡＳＣＩ３の電流の８０％以上を阻害することが実証されている。活性ペプチドを逆相クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーで均一に精製し、ＡＳＩＣ３上の活性な分画を観察して判断することによって、ＡＰＥＴｘ２を特定する（参照３８）。
【００１０】
ＡＰＥＴｘ２は、電位感受性カリウムチャネルおよび電位感受性ナトリウムチャネルを阻害する他のイソギンチャクトキシンの構造機構と類似する構造機構を有する、３つのジスルフィド結合を含む４２個のアミノ酸を含むペプチドである。ＡＰＥＴｘ２の完全な配列はエドマンズＮ末端分解によって確定され、測定されたモノアイソトピック質量（４５５７．９６Ｄａ）は遊離Ｃ末端を示す配列データ（４５５７．８８Ｄａ、精度１７．５ｐｐｍ）に基づいて算出された質量と完全に一致する。ＡＰＥＴｘ２は、ＡＰＥＴｘ１と６４％の配列同一性（７６％相同）を示し（参照４０）、また、イソギンチャクのトキシンＢＤＳ−ＩおよびＢＤＳ−ＩＩとわずか３４％の配列同一性（それぞれ５７％および５５％の相同）を示す。このＡＰＥＴｘ２は、電位依存性カリウム電流ｋｖ３．４を阻害する（参照４１）。ナトリウム電流を活性化するペプチド（アンソプレウラｓｐ．からのＡＰ−Ａ、ＡＰ−Ｂ、ＡＰ−Ｃ、ＡＰＥ１−１およびＡＰＥ−２など（参照３９））との配列同一性は、わずか２５〜２９％である（４１〜４７％相同）。さらに、ＡＰＥＴｘ２は、イソ型ＡＳＩＣ１ａの特異的インヒビターであるＰｃＴｘ１と、いかなる配列相同性も示さない（上記で引用されている参照３６）。
【００１１】
ＡＰＥＴｘ２はＡＳＩＣ３の外部で作用することによってＡＳＩＣ３を直接阻害し、また、そのチャネルのユニットコンダクタンスを修飾しない。今のところ、ＡＰＥＴｘ２はＡＳＩＣ１ａ、ＡＳＩＣ１ｂおよびＡＳＩＣ２ａのイソ型に対していかなる影響も及ぼさないが、ＡＰＥＴｘ２は持続電流に影響を与えることなく、一過性の電流（ＩＣ50＝６３ｎＭ）を遮断することによってＡＳＩＣ３を可逆的に阻害する。また、ＡＰＥＴｘ２はヘテロマーＡＳＩＣ２ｂ＋３の電流を阻害するのに対し、ヘテロマーＡＳＩＣ１ｂ＋３およびヘテロマーＡＳＩＣ１ａ＋３に対する親和性はほとんどなく、ヘテロマーＡＳＩＣ２ａ＋３にはいかなる作用も有していない（上記で引用されている参照３８）。
【００１２】
驚くことに、発明者らは、今日、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの末梢注射（特に、皮下注射）が、痛みのラットモデルにおけるイソ型ＡＳＩＣ３の活性化に関連する痛みを緩和することができる（鎮痛作用）ことを示している。当該ラットモデルにおける痛みは、炎症に伴う、および組織アシドーシス（虚血、骨折、組織損傷および腫瘍など）に関連するすべての痛みのある状態を模倣する酸性溶液の皮下注射に伴うものである。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、従来技術の問題を解決することを目的としており、特に、望ましくない副作用をほとんどまたは全く有さず、使用、具体的には末梢投与（皮下投与、筋内投与、経皮投与、皮膚投与など）での使用が容易である、標的に特異的な新規の鎮痛分子を提供する。
【００１４】
本発明の第１の態様は、薬剤を得るための、イソギンチャク アンソプレウラ エレガンティシマのＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシン、ならびにその類似体および誘導体の利用に関する。
【００１５】
用語“ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの類似体”とは、他のイソギンチャク毒、またはＡＳＩＣ３様チャネルを阻害するという同一の性質を示す同じファミリーの他の海洋生物種から単離したペプチドを意味する。例えば、当該用語には、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの４２個のアミノ酸配列と６０〜９９％の配列同一性を有するペプチドを含む。
【００１６】
用語“ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの誘導体”は、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの４２個のアミノ酸配列のうち、１つまたは数個のアミノ酸が欠失および／もしくは付加されており、ならびに／またはＡＳＩＣ３様チャネルを阻害する性質が抑制されたまま保っている、同一の毒から単離したペプチドを意味する。例えば、当該用語には、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの４２個のアミノ酸配列における３位、５位、８位、９位、１０位、１５位、１６位、１７位、２３位、３１位、３２位、３３位、３６位、３９位および／または４１位での置換を示すペプチドバリアントを含む。また、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの配列のうち、Ｎ末端またはＣ末端において１つもしくは数個のアミノ酸の伸張を示すペプチドバリアントも含み得る。
【００１７】
本発明の具体的な実施形態によれば、上記薬剤は、ＡＳＩＣ３様チャネルに関連する疾患の予防または治療を目的とする。例えば、上記病的状態は、胃炎、虚血（筋肉、心臓、腸間膜など）、骨折、血腫、浮腫、フリクテン（または疱疹もしくは水疱）、局所感染、組織損傷（外科手術に関連する切開など）、眼障害、掻痒、および腫瘍（骨腫瘍および骨転移を含む）を含む炎症からなる群において選択される。
【００１８】
具体的に、上記薬剤は鎮痛剤であり、好ましくはＡＳＩＣ３様チャネルの活性化によって誘発される痛みの予防または治療を目的とした鎮痛剤であり、より好ましくは炎症によってもたらされる痛みの予防または治療を目的とした鎮痛剤である。
【００１９】
本発明の別の具体的な実施形態によれば、上記鎮痛剤は、ＡＳＩＣ３様チャネルの活性化に関連する酸性の痛みの予防または治療を目的とする。例えば、組織アシドーシスに関連する痛みある状態は、虚血（筋肉、心臓、腸間膜など）、骨折、血腫、浮腫、フリクテン（または疱疹もしくは水疱）、局所感染、組織損傷（外科手術に関連する切開など）、眼障害、および腫瘍（骨腫瘍および骨転移を含む）よりなる群の中から選択される。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態によれば、ＡＳＩＣ３様チャネルの活性化に関連のある痛みと同様の感覚経路（参照６１）に影響を及ぼす病的な過程が原因の治療である場合、上記鎮痛剤は掻痒の予防および治療を目的とする。
【００２１】
本発明の具体的な実施形態によれば、上記薬剤は、例えば皮下経路、筋肉経路、経皮経路または皮膚経路などの末梢経路を介して投与される。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、添付の図面を参照して、以下の説明の記載から理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】逆行性標識された脊髄神経節の皮膚ニューロン、およびこれらニューロンにおいて記録されたＡＳＩＣ電流の蛍光画像である。
【図２】ｐＨ７．０で誘発される野生型ＡＳＩＣ電流における、浸透圧（高浸透圧）およびアラキドン酸の影響を示す。
【図３】組み換え型ＡＳＩＣ１ａの高浸透圧による増強作用、および適度な酸性化により誘発されるＡＳＩＣ３電流を示す。
【図４】炎症性メディエーター（アラキドン酸（arachidonic acid：ＡＡ））による活性化されていないＡＳＩＣ３窓電流の増加、ならびにこのアラキドン酸電流および高浸透圧における、緩慢なアシドーシス時の相乗効果を示す。
【図５】酸性皮膚痛覚におけるＡＳＩＣ３のインビボでの役割、炎症性ファクター（アラキドン酸および高浸透圧）によるＡＳＩＣ３のポジティブ調節、および炎症性温熱痛覚過敏における炎症性ファクターの役割を表す。
【図６】ＡＳＩＣチャネルの各レベルにおけるＡＳＩＣ３メッセンジャーＲＮＡおよび脊髄神経節のＴＲＰＶ１チャネルメッセンジャーＲＮＡｓに対して方向づけて髄膜注射される干渉ＲＮＡ（interfering RNA：ｉＲＮＡ）の特異的な作用、ならびにこのｉＲＮＡの炎症性の痛みモデルにおける鎮痛作用を表す。
【図７】感覚ニューロン系Ｆ１１に発現する、ヒトＡＳＩＣ３チャネルの活性化におけるＡＰＥＴｘ２トキシンの作用を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
〔実施例〕
＜実施例１：材料および方法＞
（イソギンチャク アンソプレウラ エレガンティシマのＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの精製）
イソギンチャク アンソプレウラ エレガンティシマ（上記で引用されている参照３９）の水アルコール粗抽出物（水とメタノールの混合液）から、ＱＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ−２５（４．５×４００ｎｍ）における陽イオン交換クロマトグラフィーによって酢酸アンモニウム（ｐＨ８．３）で溶出させて、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ５０（１２×１４０ｎｍ）における１Ｍ酢酸での排除拡散クロマトグラフィーによって、ポリペプチドプールを単離した。
【００２５】
６つの分画を、ゼノパス卵母細胞（上記で引用されている参照４１）中に発現するＡＳＩＣ３チャネルで試験した。８０％以上のＡＳＩＣ３電流が抑制されている１つの分画を逆相高速液体クロマトグラフィー（high performance liquid chromatography：ＨＰＬＣ）（ウォーターズ シンメトリー Ｃ１８、４．６×２５０ｎｍ）で、線形グラジエント１０〜４０％の溶液Ｂ（アセトニトリル／０．１％ＴＥＡ）により３０分間（１ｍｌ／分）精製した。分離は、２２０ｎｍおよび２８０ｎｍでＵＶ吸収度を読み取るダイオードアレイ検出器に結合されるＨＰ１１００システム（ヒューレットパッカード、米国）で実施した。
【００２６】
次に、活性ペプチド分画を陽イオン交換カラムＴＳＫ−ＳＰ５ＰＷ（７．５×７５ｍｍ）（東ソー、日本）で、線形グラジエント０〜１００％の１Ｍ酢酸アンモニウムを用いて５０分間（１ｍｌ／分）水／１％酢酸の混合物で均衡化させて、精製した。ＡＰＥＴｘ２の最終精製は、同じ逆相ＨＰＬＣカラムにおいて、線形グラジエント２０〜３０％を１０分間用いた後、線形グラジエント３０〜４０％の溶液Ｂを２０分間用いて行なった。
【００２７】
ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンを２メルカプトエタノールで還元し、４−ビニルピリジンでアルキル化した後に、自動エドマンズＮ末端シーケンシング（４７７Ａ、バイオシステム（米国）を使用）によってシーケンスした。トリプシンで分解した後、ペプチドＣ末端の配列をアルギニン残基のシトラコニル化によって確認した。トリプシン残留物をＨＰＬＣ（ウォーターズ Ｃ１８、２×１５０ｍｍ）によって分離した。このとき、水／０．１％ＴＦＡ混合液において、２００μｌ／分で４０分間、線形グラジエント５〜５０％のアセトニトリル／０．１％を用いた。配列相同はＢＬＡＳＴプログラムによって決定した。分子量の決定は、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸の充填剤（シグマ−アルドリッチ、米国）を含み、国内標準規格である、反射モードのＶｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＰＲＯ ｓｙｓｔｅｍ（バイオシステム（米国）を使用）におけるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光測定によって行なった。質量スペクトルはデータ探索ソフトによって分析し、理論上の分子量はＧＰＭＡＷソフトウェアを用いた配列データに基づいて算出した。
【００２８】
ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンのジスルフィド結合の配列は、シアニル化による部分的な還元および開裂のプロセス（参照４２および５６）によって決定した。
【００２９】
ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの分子モデルは、上述したＡＰＥＴｘ１座標（上記で引用されている参照４０）に基づき、Ｄｅｅｐ−Ｖｉｅｗ Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ ｖｉｅｗｅｒ ｖ３．７ソフトウェアを用いて算出した。このモデルをＳｗｉｓｓモデルサーバによって最適化した。ＢＤＳ−Ｉ座標（１ＢＤＳ）はＰＤＢデータベースから得た。最後に、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの空間的構造を核磁気共鳴によって決定し、その結果、４つのらせん構造βシートからなる小型のジスルフィド結合を本質的に含む（参照４３）。
【００３０】
（Ｆ−１１細胞株の培養および導入）
Ｆ−１１細胞（参照文献４４、４５、４６、４７）は、５％のＣＯ2において、３５ｍｍのペトリ皿毎に５０，０００セルの密度で培養した。ＨＡＭ Ｆ−１２培地（インビトロジェン）を含む培養培地に、１５％ウシ胎児血清（ＩＣＮ バイオメディカルズ）、１×ＨＡＴ（ナトリウムヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）、２００μｇ／ｍｌのアロ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（シグマ−アルドリッチ）および１％の抗生物質を加えた。接種してから１日後、ベクターｐＣＩ−ＡＳＩＣ１ａｒ＋ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（比率１：２）またはｐＣＩ−ＡＳＩＣ３ｒ＋ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（比率１：１０）（上記で引用されている参照３６）を使用し、製造業者の指示に従ってリポフェクタミン（登録商標）（インビトロジェン）を用いて、細胞にＡＳＩＣ１ａ ＤＮＡｃまたはＡＳＩＣ３ ＤＮＡｃ（ラットクローン）を導入した。ヒトＡＳＩＣ３クローンについて実験するために（ヒト型のＡＳＩＣ３チャネルにおけるＡＰＥＴｘ２トキシンの作用の実験に関する）、ベクターｐＡＳＩＣ３ｈ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの補助を伴って、製造業者の指示に従い導入剤ＪｅｔＰＥＩ（ポリプス トランスフェクション）を使用し、細胞にヒトＡＳＩＣ３のＤＮＡｃを導入した。導入から２〜４日後、当該細胞をパッチクランプ実験（電気生理学的な方法であり、細胞膜を介して移動するイオンの流れを記録するための方法である）のために使用した。
【００３１】
（皮膚求心性神経の逆行性標識）
ラットの後足背面に５×１μｌのディル蛍光色素（５％ＤＭＳＯ、分子プローブ）を皮下注射することによって、表皮を刺激する後根神経節（脊髄神経節またはＤＲＧ（dorsal root ganglion））のニューロンを標識した。この色素を２週間注射した後、ラットを屠殺して後根神経節の第１培養組織を調製した。
【００３２】
（標識された後根神経節からのニューロンの第１培養組織）
ウィスターラット（８〜１１週齢）の腰椎後根神経節を左右対称に解剖し、０．１％コラゲナーゼによって酵素分解した。次に、コラーゲンで覆われた３５ｍｍのペトリ皿に細胞を設置し、５％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地において３７℃（９５％空気／５％ＣＯ2）で培養した。接種して１〜８日後に、電気生理学的実験を行なった。
【００３３】
（電気生理学）
パッチクランプ法の細胞構成全体を用いて（参照４８）、膜電流（付加電圧）または膜電位（付加電流）を測定した。記録は、室温で、３ｋＨｚローパスフィルター（クローン−ハイト）を備えるＲＫ−４００増幅器（バイオ−ロジック サイエンス インストラメンツ）を用いて行なった。データは１０ｋＨｚで採取し、デジデータ１３２２Ａ Ａ−Ｄ／Ｄ−Ａコンバータ（アクソン インストラメンツ）を用いてデジタル化し、ｐＣｌａｍｐソフトウェア（バージョン９．２．０．１１、アクソン インストラメンツ）によってハードディスクに記録した。記録プローブ（１−４ＭＯｈｍｓ）には：１３ＫＣｌ、２．５Ｎａ2−ＡＴＰ、２ＭｇＣｌ2、２．１ＣａＣｌ2、５ＥＧＴＡ、１０ＨＥＰＥＳ（ＫＯＨによりｐＨ７．２５）が含まれる（ｍＭにおいて）。導入された細胞に、多様な異なるバッファおよび関連のある薬剤を加えた。この細胞を、国内で開発され、溶液を急速に交換させるマイクロインフュージョンシステム（マイクロエレクトロウェーブ（シライ、イタリア）によって制御される）を用いて個別に考察した。コントロール浴液は：１４５ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、２ＭｇＣｌ2、２ＣａＣｌ2、１０ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨによりｐＨ７．４）が含まれる（ｍＭにおいて）。ＨＥＰＥＳ培地の代わりにＭＥＳ培地を使用してｐＨ６〜５の範囲に溶液を中和し、マイクロインフュージョンシステムを用いてｐＨ７．４でコントロール溶液から酸性試験溶液に急速に交換することによって、ＡＳＩＣ電流を誘発した。ＤＲＧニューロンにおいて行なう実験のため、コントロール浴液にグルコース（１０ｍＭ）を加えた。テキストに示されるように、マンニトールまたはスクロースを外部の浴液に加えることによって、高浸透圧状態にした。
【００３４】
（ラットの侵害受容行動）
７〜８週齢の成体の雄ウィスターラット（カールスリバー、フランス）をプラスチック製のケージに収容した。暗期間は１２時間（点灯は午前８時から午後８時）とし、餌および水は自由に入手させた。実験前に、少なくとも１週間ラットを順応させるために放置した。行動実験のために、透明な観察室にラットを２０〜３０分間収納して順応させた。続いて、ラットを固定し、その間に、２０μｌの食塩水（０．９％または２％のＮａＣｌ＋２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０μＭのアラキドン酸および／または１０μＭのＡＰＥＴｘ２トキシンもしくは６０ｎＭのＰｃＴｘ１トキシンを加えて、またはなしで７．４≦ｐＨ≦６．６）を、１００μｌハミルトンシリンジに接続した３０Ｇ針によって右の後足背面に皮下注射した。注射後すぐに記録を開始して、侵害受容行動（すなわち、後足が震える数）を５分間記録した（参照５９）。
【００３５】
（炎症を誘発するラットの温熱痛覚過敏）
成体の雄ウィスターラット（カールスリバー、フランス）の熱に対する感受性を試験した。試験は、５０℃のホットプレート（バイオセブ、フランス）に乗せたときに、動物が一方の後足を引っ込めるために要した時間を、完全フロインドアジュバント溶液（ＣＦＡ（Freund's complete adjuvant）、シグマ−アルドリッチ、フランス）の皮下注射による炎症の誘発前後に測定することによって行なった。ラットを少なくとも３０分間実験室に馴れさせて、各測定を繰り返し行なった。最初の測定は、炎症を誘発させる前に行なった。次に、ラットを麻酔し、その間に、トキシン（ＰｃＴｘ１またはＡＰＥＴｘ２、それぞれ１２０ｎＭおよび２０μＭ）または媒体のいずれかを含む食塩水（０．９％ＮａＣｌ）によって１：１に希釈したＣＦＡ１５０μｌを一方の後足底面に皮下注射した（１ｍｌシリンジに２６Ｇ針を取付けた）。そして、ＣＦＡの注射後２時間、４時間および２５時間に、注射した後足を持ち上げるのに動物が要した時間を５０℃で測定した。
【００３６】
（ラットにおける干渉ＲＮＡの髄膜注射）
ＡＳＩＣ３チャネルに特異的なｉＲＮＡ（番号１１２１；ＣＴＡＣＡＣＧＣＴＡＴＧＣＣＡＡＧＧＡ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびそのコントロール（番号１１２１ｓ；ＧＣＴＣＡＣＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＧＡＴ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）を実験室で設計し、ＭＷＧバイオテック カンパニー（ドイツ）によって合成した。ＡＳＩＣ３に特異的なｉＲＮＡを、ＡＳＩＣチャネルおよびＴＲＰＶ１チャネルそれぞれのために、定量ＲＴ−ＰＣＲによるメッセンジャーＲＮＡレベルの定量化によって確認した後、３日間連続して１日１注射の割合でラットの脊髄の要部に髄膜注射してから動物を屠殺した。同様の手順を、ＣＦＡによって炎症を誘発する前に行なった。各注射は容積１０μｌであり、１対４の比率で誘導試薬ｉ−Ｆｅｃｔ（ニューロミクス）と混合した２μｇのｉＲＮＡを含んでいた。
【００３７】
（化学製品）
ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）１−ピペラジンエタンスルホン酸）およびＭＥＳ培地（２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸；Ｃ6Ｈ13ＮＯ4Ｓ・Ｈ2Ｏ）、マンニトール、カプサゼピン、ならびにアラキドン酸はシグマから購入した。
【００３８】
（データの分析）
マイクロカル（登録商標）オリジン６．０（商標登録）およびグラフパッドプリズム４．０３ソフトウェアを用いてデータを分析した。当該データを平均±標準誤差として表し、スチューデントのｔ検定、または一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）（必要であればポストホック試験の後に）のいずれかを用いて、一連のデータ間の統計に基づく差分を算出した。
【００３９】
＜実施例２：表皮を刺激する脊髄神経節のニューロンにおけるＡＳＩＣ３型電流＞
ラットの表皮を刺激する脊髄神経節のニューロンにおいて、細胞外の適度な酸性化によって活性化されたＡＳＩＣ電流を記録し、ディル蛍光色素を使用して逆行性標識することによって同定した（図１）。
【００４０】
これら実験に用いられる適度なｐＨの値（すなわち、ｐＨ６．６〜ｐＨ７．０）を選択してＡＳＩＣ１型電流およびＡＳＩＣ３型電流を主に活性化させた。これは、ＡＳＩＣ２型電流およびＴＲＰＶ１型電流がより激しい酸性化によって活性化されるとして説明されている実情のためである（上記で引用されている参照４９および参照２）
図１Ａは、パッチクランプ法のために細胞構成全体において用いられる脊髄神経節の典型的なディル−陽性皮膚ニューロン（矢印）を示す。これらのニューロンは、−５５．０±１．８ｍＶの静止膜電位、および３９．６±１．８ｐＦの膜容量を有している（ｎ＝４２および４３ニューロン、それぞれ、４つの異なる培養組織からのデータである）。
【００４１】
図１Ｂは、試験した骨髄神経節の皮膚ニューロン（４／７、８／１１、８／１０、および８／１５、４つの異なる培養組織からのデータ）のうち６５．８±６．３％が、ｐＨ６．６で平均振幅−６０．３±１６．０ｐＡ／ｐＦ（ｎ＝２８）にて誘発される、一過性のＡＳＩＣ型電流を見せることを示す。骨髄神経節の皮膚ニューロンの残り（３４．２±６．３％）のうちｐＨ６．６の外部利用は、いかなる電流も誘発しないか（ｎ＝１１）、わずかに維持電流を誘発するか（−１．２±０．５ｐＡ／ｐＦ、ｎ＝４）である。
【００４２】
骨髄神経節の皮膚ニューロンにおいてｐＨ６．６で誘発されるＡＳＩＣ型電流の間で区別するため、ホモマーチャネルＡＳＩＣ１ａの選択的インヒビターとして、ＡＳＩＣ１ａに特異的なＰｃＴｘ１トキシンを用いた（上記で引用されている参照３６）。
【００４３】
図１Ｂ（右のパネル）から、これらニューロンの４．７％（２／４３）が上記トキシンによって広範囲に阻害される電流（＞９０％阻害；すなわち、ＡＳＩＣ１ａホモマー電流）を示し、２３．３％（１０／４３）がトキシンに対して電流感受性（阻害＜１０％；すなわち、ＡＳＩＣ１３型電流）を示し、３７．２％（１６／４３）が部分的に阻害された電流（１０％≦阻害≦９０％；すなわち、ＡＳＩＣ３型およびＡＳＩＣ１ａホモマー電流の混合）を示すことがわかる。図１Ｃでは、これらの電流において、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシン（イソ型ＡＳＩＣ３を含むチャネルを特異的に阻害する）に対する部分的な感受性によるＳＩＣ３の関与を確認している（上記で引用されている参照３８）。
【００４４】
さらに、骨髄神経節の皮膚ニューロンにＡＳＩＣ電流を誘発させるために適度な酸性化（ｐＨ６．６）を用いることは、ＡＳＩＣ２型電流およびＴＲＰＶ１電流のすべてではないが、その大多数の排除を可能にした。よって、骨髄神経節の皮膚ニューロンにおいて適度な酸性化によって活性化される最も多くのＡＳＩＣ電流は、６０．５％（２６／４３）のスコアを有するＳＡＩＣ３型電流であった。
【００４５】
＜実施例３：適度な酸性化によって活性化される骨髄神経節の皮膚ニューロンのＡＳＩＣ電流の２つの炎症性刺激（浸透圧およびアラキドン酸）による増強作用＞
損傷した組織または炎症を起こした組織において、いくつかの電位緩衝液が間質液に含まれており、その中身が酸と高浸透圧とである（参照５１）、炎症性の浸出液になっている（参照５０）。そのため、適度な酸性化により活性化される脊髄神経節の皮膚ニューロンのＡＳＩＣ電流における高浸透圧の作用を研究した。
【００４６】
図２Ａ、２Ｄおよび２Ｅは、高浸透圧（hyperosmolarity）（外液の適度な酸性化に同時に適用される（ｐＨ７．０、図２Ｅの矢印を参照））が、これらニューロンにおいてｐＨ７．０で誘発されるＡＳＩＣ型電流を著しく増加させることが可能であり（９５％±３５％の増加、ｎ＝８、ｐ＜０．０１、対応のあるスチューデントのｔ検定）、より多く活動電位を誘発することによって神経細胞の興奮を増加させる結果になることを示す（図２Ｂ）。
【００４７】
ＡＳＩＣ電流における炎症性メディエーター（アラキドン酸（ＡＡ））のポジティブ作用についてはすでに説明した（参照５２および５３）。この作用を、骨髄神経節の皮膚ニューロンにおいて、本来のｐＨ７．０で誘発されたＡＳＩＣ電流によって確認した（図２Ｄ；１７２±６５％で増加、ｎ＝６、ｐ＝０．０６、対応のあるスチューデントのｔ検定）。重要なことに、図２Ｃでは、このアラキドン酸の作用は、活動電位のトリガーを増加させることによって、結果として骨髄神経節の皮膚ニューロンの興奮もまた増加させることを示す。
【００４８】
双方の作用の反応速度は異なる。実際、図２Ｅには、天然のＡＳＩＣ電流の高浸透圧によって誘発される増強作用が瞬時（ｐＨの急上昇による同時利用）であるのに対し、ＡＳＩＣ電流におけるアラキドン酸の作用は、十分に使用可能になるために数分を要することを示す。さらに、同じ細胞に対する高浸透圧の繰り返しの利用は上記増強作用を低減させることにつながるが（矢印で示す）、一方、アラキドン酸の作用は細胞に利用される限り最大まで増加する（灰色に塗られた四角）。したがって、双方を考慮して、これらの結果は、（ｉ）骨髄神経節の皮膚ニューロンにおいて適度な酸性化（ｐＨ７．０）によって活性化されるＡＳＩＣ電流は、膜浸透圧を活動電位のトリガー閾値まで達するのに十分なレベルであり、（ｉｉ）アラキドン酸の高浸透圧など２つの炎症性シグナルは、適度な酸性化によって活性化されるＡＳＩＣ電流における増強作用によって神経細胞の興奮を高めることを示す。
【００４９】
＜実施例４：脊髄神経節由来のＦ−１１細胞における浸透圧に対する、組換えＡＳＩＣ３チャネルの感受性＞
様々なイソ型ＡＳＩＣにおける浸透圧の作用をより正確に分析するため、ＡＳＩＣ１ａおよびＡＳＩＣ３チャネルをＦ−１１細胞株において非相同的に発現させた（上記で引用されている参照４４、４５、４６、４７）。
【００５０】
ＡＳＩＣ１ａおよびＡＳＩＣ３チャネルは（ｉ）ラットの骨髄神経節のニューロンに現れる典型的なＡＳＩＣ電流であり（上記で引用されている参照５４および参照５５）（また、図１にて示す）、（ｉｉ）興奮に対するそれらの閾値ｐＨがｐＨ７．０に近いため（上記で引用されている参照２）に使用した。
【００５１】
図３Ａは、高浸透圧（マンニトールを有する６００ｍオスモル．ｋｇ-1）がｐＨ７．２で活性化されるＡＳＩＣ３電流を著しく増強させる能力があることを示す（１４８±２０％の上昇、ｎ＝２０、ｐ＜０．００１、対応のあるスチューデントのｔ検定）。一方、ｐＨ７．２までの外液の酸性化はＡＳＩＣ１ａによって導入される細胞からのＡＳＩＣ１ａ電流を目立って産生することはなく、高浸透圧は影響がない。面白いことに、図３Ｂは、ｐＨ６．６で活性化されるＡＳＩＣ１ａ電流に影響がない高浸透圧（６００ｍオスモル．ｋｇ-1）は、ｐＨ６．６で活性化されるＡＳＩＣ３電流を増強させないことを示す。このことは、不活性化しない、すなわち持続するＡＳＩＣ３窓電流における作用を示唆する（上記で引用されている参照１９）。
【００５２】
ＡＳＩＣ３電流が高浸透圧の衝撃による増強作用があることを確認するため、続いて、導入したＦ−１１細胞から記録された、ｐＨ７．２で誘発される電流のＩ／Ｖ曲線をプロットした（図３Ｃ、上部パネル）。ｐＨ７．２のコントロールによって誘発される電流と（等浸透圧環境にて測定）、増強される電流と（高浸透圧環境にて測定）は、実際に高浸透圧がＡＳＩＣ３電流を増強させることを示す、同じ逆電位を有する（それぞれ４９．４±０．７ｍＶおよび４５．９±３．４ｍＶ、対応のあるスチューデントのｔ検定）（図３Ｃ、下部パネル）。
【００５３】
図３Ｄは、ｐＨ７．２で誘発されるＡＳＩＣ３電流の増加率が、外液の浸透圧が６００ｍオスモル．ｋｇ-1に達するときに略最大であることを示す。さらに、高浸透圧の外液がスクロースによって調整されている場合、振幅がわずかであるにも関わらず、観察される範囲において、高浸透圧がこの作用の第一のファクターである（図３Ｄ）。
【００５４】
これらの結果は、高浸透圧が、おそらくＡＳＩＣ３窓電流における作用によって、中程のｐＨ範囲内（すなわち、ｐＨ７．２付近）においてＡＳＩＣ３電流を増強させることを示す。
【００５５】
＜実施例５：アラキドン酸による非不活性化ＡＳＩＣ３窓電流の増強作用＞
ＡＳＩＣ型電流におけるアラキドン酸（ＡＡ）の増強作用を検討するために、アラキドン酸（ＡＡ）の作用を、ＡＳＩＣ１ａおよびＡＳＩＣ３を導入したＦ−１１細胞において観察した。
【００５６】
ＡＳＩＣチャネルの活性におけるアラキドン酸の作用は、その作用メカニズムは未だよく理解されていないが、既に説明している（上記で引用されている参照５２および参照５３）。
【００５７】
図４Ａは、アラキドン酸が、ｐＨ７．２で活性化されるＡＳＩＣ３電流に大幅な可逆的増加をもたらし、一方、同じｐＨでのＡＳＩＣ１ａでは全く作用しないことを示す。アラキドン酸はｐＨ７．２およびｐＨ７．０で活性化されるＡＳＩＣ３電流を著しく増強させるが（５４７±１０３％の増加、ｐ＜０．０００１、ｎ＝２３、および４９３±８４％の増加、ｐ＜０．０００１、ｎ＝９、それぞれウィルコクソン検定）、一方、ｐＨ６．６で活性化されるＡＳＩＣ３電流ではわずかに増強させるのみである（＋４０±２２％、ｎ＝７、ｐ＝０．４５、対応のあるスチューデントのｔ検定）（図４Ｂ参照）。前の結果に続いて（上記で引用されている参照５３）、アラキドン酸はｐＨ７．０（＋１８３±５４％、ｎ＝５、ｐ＝０．０６、ウィルコクソン検定）でＡＳＩＣ１ａ電流を同様に増加させて、また、ｐＨ６．６（＋２１±１５％、ｎ＝２）ではより低い値にさせる。しかし、その作用はＡＳＩＣ３に関するよりも未だ明白ではない（図４Ｂ）。
【００５８】
図４Ｃには、ＡＳＩＣ３電流におけるアラキドン酸の強力な作用が、より生理的な値に向かう活性化ｐＨに対する依存度の変化を生み、一方、特筆すべきでない作用がｐＨ依存性不活性化曲線において観察されることを示す。
【００５９】
結果として、不活性化していないＡＳＩＣ３窓電流は、アラキドン酸の存在下で明らかに増加し（図４Ｄ、上部パネル）、残りの生理的ｐＨに近いｐＨ値でチャネルの活性化を生じる（図４Ｄ、下部パネル）。
【００６０】
これらの結果は、不活性化していない窓電流に対する強い影響によって、適度な酸性化により活性化されるＡＳＩＣ３電流を、アラキドン酸が選択的に増強させることを示す。極めて重要なことに、図４Ｅはこのアラキドン酸の作用が同じＡＳＩＣ３電流における高浸透圧の作用に追加されることを示す。この結果は、ＡＳＩＣ３が異なる炎症性シグナル（適度な酸性化、高浸透圧およびアラキドン酸など）を組み込み得ることを強く示唆する。
【００６１】
＜実施例６：適度な酸性化によって誘発される皮膚の痛みに対するＡＳＩＣ３の寄与＞
脊髄神経節の皮膚ニューロンにおけるＡＳＩＣ３の高い発現、および炎症刺激（高浸透圧およびアラキドン酸など）による適度なｐＨ値での調節は、正常状態および炎症状態での皮膚酸性痛覚におけるＡＳＩＣ３の役割を研究することにつながる。
【００６２】
図５Ａは、一方の後足に適度な酸性溶液（ｐＨ７．４、ｐＨ７．２、ｐＨ６．９およびｐＨ６．６）を皮下注射した後の、痛みに対するラットの行動を示す。痛みに応じた顕著な行動はｐＨ６．９で見られる（振動スコアはｐＨ７．４で２．１１±０．６７からｐＨ６．９で１１．１１±２．５４へ増加、それぞれｎ＝１４および２２、ｐ＜０．０５、この後にダン検定が続くクラスカリ・ワリス検定）。この痛み行動は、ＡＰＥＴｘ２トキシンの存在下において抑制されるため、それによって皮下酸性痛覚の検出におけるＡＳＩＣ３の関与を証明する。
【００６３】
骨髄神経節の皮膚ニューロン、および組換えチャネルに存在するＦ−１１細胞の双方において、高浸透圧およびアラキドン酸が、適度なｐＨでのＡＳＩＣ３チャネルの強力な共同作用アクチベーターに見えるという点で（図２、３および４を参照）、これらの炎症性シグナルは適度なｐＨにおいて同時に注入される（２％ＮａＣｌ、〜６００ｍオスモル．ｋｇ-1および１０ｍＭ ＡＡ）（図５Ａ）。炎症性カクテルのこれら３つの必須要素の組み合わせは、ｐＨ６．８とだけ関連のあるラットの振動スコアを上昇させる（１１．１±２．５４（ｎ＝２２）〜２０．４２±２．５３（ｎ＝２５）、Ｐ＜０．０５、クラスカリ・ワリス検定、その後にダン検定）（図５Ａ）。
【００６４】
この酸性痛覚に応じた行動は、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシン（ＡＳＩＣ３の特異的なインヒビター（上記で引用されている参照３８））によって明らかに減少するが、一方ＰｃＴｘ１トキシン（ＡＳＩＣ１ａの特異的なインヒビター）は有意な影響が全くない（図５Ａ）。
【００６５】
双方を考慮すると、これらの結果は、ＡＳＩＣ３が適度な酸性化によって誘発される皮膚の痛みの主なレセプターであり、ラットにおける炎症性の痛みに関与することを強く示唆する。
【００６６】
＜実施例７：完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）によってもたらされる炎症で誘発されて、ラットにおいて発現する温熱痛覚過敏に対するＡＳＩＣ３の寄与＞
ペプチドトキシンＡＰＥＴｘ２（ＡＳＩＣ３イソ型を含むチャネルのインヒビター）およびＰｃＴｘ１（ＡＳＩＣ１ａホモマーチャネルのインヒビター）の作用を、ラットの皮膚痛覚モデル（ＣＦＡによって誘発される温熱痛覚過敏）において試験して、炎症性の痛みにおけるＡＳＩＣ３の特異的な役割を確認した。
【００６７】
図５Ｂは、有意な温熱痛覚過敏が、ＣＦＡを後足に注射して炎症を誘発してから４時間後に現れることを示す。
【００６８】
これに対し、ＣＦＡと共にＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンを注射した場合、温熱痛覚過敏は発現しないが、ＣＦＡと共にＰｃＴｘ１トキシンを注射した場合、有意な影響が全くない。
【００６９】
ＣＦＡを注射して２０時間後、ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンによって処理された動物は、温熱痛覚過敏に関する媒体を注射されたコントロール動物とは異なり、たいていトキシンの作用が時間をかけて段階的に衰えることを示し、いずれの行動も示さない。
【００７０】
これらの結果は、ＡＳＩＣａではなく、ＡＳＩＣ３がラットの末梢レベルでの炎症性の痛みの認識に重要な役割を果たすことを示す。
【００７１】
＜実施例８：インビボでのＡＰＥＴｘ２トキシンの特異的な阻害作用＞
細胞レベルでのＡＰＥＴｘ２トキシンによるＡＳＩＣ３チャネル阻害の特異性を実証すること（培養されたニューロンおよび導入されたＦ−１１細胞株において）は、ラットで観察されるＡＰＥＴｘ２の鎮痛作用が、独占的に、ＡＳＩＣ３型チャネル活性を阻害する結果となることの１つの証明につながる。ＡＳＩＣ３チャネルの遺伝的阻害に関連するアプローチがこの目的のために適用され、ラットのＡＳＩＣ３チャネルにて特異的に方向づけられる干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）の髄膜注射の作用を観察することを含む。
【００７２】
図６Ａは、後足に神経を分布するラットの感覚ニューロンにおける様々なイオンチャネルの発現レベルにおいて、ＡＳＩＣ３チャネルに特異的であるｉＲＮＡの髄膜注射の影響を示す。この結果は、ＡＳＩＣ３チャネル特異的ｉＲＮＡの髄膜注射が、ラットの感覚ニューロンにおけるＡＳＩＣ３チャネルの発現において際立った、また、独占的に減少させることを示す（黒矢印で示す）。
【００７３】
図６Ｂには、ＡＳＩＣ３チャネルに特異的なｉＲＮＡを３日間髄膜注射した後に完全フロイドアジュバント（ＣＦＡ）で炎症を起こさせた（挿入部分で示す）ラットは、同じ組成のｉＲＮＡ（任意の配列ではないが）で処理されたコントロールラット（コントロール、白塗りの柱）に比べて、少しも炎症性温熱痛覚過敏を発現しないことを示す（ｉＲＮＡ、黒塗りの柱）。この結果は、ＡＰＥＴｘ２トキシンによって処理された動物で得られる結果と同じである（実施例７を参照）。
【００７４】
これらの結果は、ＡＳＩＣ３チャネルが炎症性痛覚のメディエーターであること、および、ＡＰＥＴｘ２トキシンの鎮痛作用が、動物のこれらチャネルを阻害することにもっぱら起因することを証明する。
【００７５】
＜実施例９：ヒトＡＳＩＣ３クローンにおけるＡＰＥＴｘ２トキシンの阻害作用＞
ＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシンの阻害作用をヒトＡＳＩＣ３チャネルにおいて試験した。この目的のため、ヒトＡＳＩＣ３電流の振幅を上述したパッチクランプ法によって記録した。このとき、上述した方法に従いヒトＡＳＩＣ３クローンを導入したＦ−１１感覚ニューロンからの細胞外培地を、ＡＰＥＴｘ２トキシン１μＭの非存在下または存在下において酸性化（ｐＨ８．０〜ｐＨ７．０、二方向の矢印で示す）してから行なった。
【００７６】
図７は、ヒトＡＳＩＣ３チャネル由来の電流の振幅が、ＡＰＥＴｘ２トキシンの存在下で有意に減少することを示す（左から始めて第３ピークから第５ピーク）。
【００７７】
これらの結果は、ＡＰＥＴｘ２トキシンがヒトＡＳＩＣ３チャネルの活性を阻害する能力があり、ヒトに対する新規の鎮痛剤としてのＡＰＥＴｘ２トキシンおよびその誘導体の利用可能性が認められることを明白に示す。
【００７８】
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（参照６１）Stander and Sehmelz, Eur. J. Pain, 10: 473-478
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鎮痛剤を調製するための、アンソプレウラ エレガンティシマ イソギンチャクのＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシン、その類似体および誘導体の利用。
【請求項２】
ＡＳＩＣ３型チャネルの活性化によって誘発される痛みの予防または治療を対象とした鎮痛剤を調製するための、請求項１に記載の利用。
【請求項３】
上記痛みが炎症に起因する、請求項２に記載の利用。
【請求項４】
上記痛みが組織アシドーシスに起因する、請求項２に記載の利用。
【請求項５】
上記痛みのある状態が、虚血（筋肉、心臓、腸間膜など）、骨折、血腫、浮腫、フリクテン（または疱疹もしくは水疱）、局所感染、組織損傷（外科手術に伴う切開を含む）、眼障害ならびに腫瘍（骨腫瘍および骨転移を含む）よりなる群から選択される、請求項４に記載の利用。
【請求項６】
掻痒の予防または治療を対象とした鎮痛剤を調製するための、請求項１に記載の利用。
【請求項７】
上記鎮痛剤が末梢経路で投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の利用。
【請求項８】
上記鎮痛剤が皮下経路で投与される、請求項７に記載の利用。
【請求項９】
上記鎮痛剤が筋内経路で投与される、請求項７に記載の利用。
【請求項１０】
上記鎮痛剤が経皮経路で投与される、請求項７に記載の利用。
【請求項１１】
上記鎮痛剤が皮膚経路で投与される、請求項７に記載の利用。
【請求項１】
鎮痛剤を調製するための、アンソプレウラ エレガンティシマ イソギンチャクのＡＰＥＴｘ２ペプチドトキシン、その類似体および誘導体の利用。
【請求項２】
ＡＳＩＣ３型チャネルの活性化によって誘発される痛みの予防または治療を対象とした鎮痛剤を調製するための、請求項１に記載の利用。
【請求項３】
上記痛みが炎症に起因する、請求項２に記載の利用。
【請求項４】
上記痛みが組織アシドーシスに起因する、請求項２に記載の利用。
【請求項５】
上記痛みのある状態が、虚血（筋肉、心臓、腸間膜など）、骨折、血腫、浮腫、フリクテン（または疱疹もしくは水疱）、局所感染、組織損傷（外科手術に伴う切開を含む）、眼障害ならびに腫瘍（骨腫瘍および骨転移を含む）よりなる群から選択される、請求項４に記載の利用。
【請求項６】
掻痒の予防または治療を対象とした鎮痛剤を調製するための、請求項１に記載の利用。
【請求項７】
上記鎮痛剤が末梢経路で投与される、請求項１〜６のいずれかに記載の利用。
【請求項８】
上記鎮痛剤が皮下経路で投与される、請求項７に記載の利用。
【請求項９】
上記鎮痛剤が筋内経路で投与される、請求項７に記載の利用。
【請求項１０】
上記鎮痛剤が経皮経路で投与される、請求項７に記載の利用。
【請求項１１】
上記鎮痛剤が皮膚経路で投与される、請求項７に記載の利用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１１−５２２０１２（Ｐ２０１１−５２２０１２Ａ）
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２１７３（Ｐ２０１１−５１２１７３）
【出願日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０００６５７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４７３２６
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０６０６６７７７）サントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティ フィック セーエヌエールエス (22)
【出願人】（５１０３２０５１９）ウニヴェルシテー ニース ソフィア アンティポリス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＮＩＣＥ ＳＯＰＨＩＡ ＡＮＴＩＰＯＬＩＳ
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｎｄ Ｃｈａｔｅａｕ Ｐａｒｃ Ｖａｌｒｏｓｅ，２８，Ａｖｅｎｕｅ Ｖａｌｒｏｓｅ，Ｆ−０６１０８ Ｎｉｃｅ Ｃｅｄｅｘ ２，Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年７月２８日（２０１１．７．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年６月４日（２００９．６．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００９／０００６５７
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４７３２６
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（５０６０６６７７７）サントゥル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシュ シアンティ フィック セーエヌエールエス (22)
【出願人】（５１０３２０５１９）ウニヴェルシテー ニース ソフィア アンティポリス (1)
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥ ＮＩＣＥ ＳＯＰＨＩＡ ＡＮＴＩＰＯＬＩＳ
【住所又は居所原語表記】Ｇｒａｎｄ Ｃｈａｔｅａｕ Ｐａｒｃ Ｖａｌｒｏｓｅ，２８，Ａｖｅｎｕｅ Ｖａｌｒｏｓｅ，Ｆ−０６１０８ Ｎｉｃｅ Ｃｅｄｅｘ ２，Ｆｒａｎｃｅ
【Ｆターム（参考）】
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