ペリオスチンに誘導される膵臓再生
本願は、組換えペリオスチンタンパク質、前記ペリオスチンをコードする核酸、及び前記ペリオスチンを含む医薬組成物を用いた膵臓組織再生法を開示する。また、ペリオスチンのアイソフォームであるｐａｎｃをコードする核酸も教示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓組織再生のためのペリオスチンの使用全般に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、インスリン、グルカゴン、及びソマトスタチンといったいくつかの重要なホルモンと同様に消化酵素を産生する。前記ホルモン産生細胞はランゲルハンス島内でグループ化されており、該島は膵臓の約１〜２％を占めている。健常な膵臓では、インスリンは血糖値の上昇に応答してランゲルハンス島内のβ細胞において産生される。膵臓組織の損失に起因する、又は膵臓組織の損失を引き起こす疾患は数多く存在する。これらの疾患には糖尿病（１型及び２型の両方）及び膵外分泌機能不全が含まれている。
【０００３】
１型糖尿病（インスリン依存型糖尿病）は、体の免疫系がβ細胞を攻撃し、該細胞を破壊もしくは該細胞に十分なダメージを与える結果、インスリンがほとんど又は全く産生されなくなる自己免疫性疾患である。インスリン補充療法、極端な食事制限、及び血糖値の注意深いモニタリングによって糖尿病に伴う合併症を制限することができるが、膵臓を移植又は再生することが好ましい。
【０００４】
２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）はメタボリック病であり、最初はインスリン抵抗性を特徴としていたが、最終的には膵臓の細胞がインスリン要求量に見合ったインスリン量を産生できないことを特徴としている。
【０００５】
膵外分泌機能不全（ＥＰＩ）は、膵臓が産生する消化酵素が欠損しているために食物を適切に消化できない病気である。ＥＰＩは、濾胞性線維症及びシュバッハマン・ダイアモンド症候群を煩っている患者で認められる。それは、消化酵素を産生する膵細胞の進行性消失によって引き起こされる。ヒトでは、慢性膵炎はＥＰＩの最大の発症要因である。消化酵素の欠損は、栄養分の消化不良及び吸収不良をもたらす。
【０００６】
当該技術分野では、膵臓組織を再生するための方法及び薬剤開発の必要性がある。
前記（ランゲルハンス）島の外科的移植はまだ有効性が証明されていないが、膵細胞には再生能力があることが知られている。ＨＩＰ、ＩＮＧＡＰ、ＧＬＰ−１、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のような膵臓再生促進因子が研究されている（例えば、ＷＯ ２００６／０９６５６５、ＵＳ６,１１４,３０７、及びＵＳ ＲＥ３９２９９）。
【０００７】
ペリオスチンは約９０ｋＤａの分泌性タンパク質で、骨組織中の骨膜において優先的に発現している。（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９４，２７１−２７８（１９３３）；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１４，１２３９−１２４９（１９９９））。ペリオスチンは、Ｎ末端の分泌シグナルペプチド、システィン残基に富んだドメイン、４つの内部相同性リピート配列、及びＣ末端の親水性ドメインから構成されている。各リピートドメイン内では、２つの領域が高度に保存されている。ペリオスチンは種々の癌において同定されており、ペリオスチンの発現は癌の指標及び治療上の標的として提案されている（Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２２，１７０７−１７１８（２００８））。また、ペリオスチンは膵星細胞（ＰＳＣｓ）によっても分泌され、ストレス下で膵臓腫瘍細胞の増殖を支援する一方でＰＳＣの線維形成能も持続させることが示されている（Ｅｒｋａｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３２，１４４７−１４６４（２００７））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
最初の形態として、本発明はペリオスチンの投与によって膵臓組織を再生する方法を提供する。前記再生された組織はβ細胞を含むことができる。本発明に係る方法は、１型糖尿病、２型糖尿病、及びＥＰＩのような膵臓組織の欠損によって引き起こされる、又は膵臓組織の欠損を引き起こす疾患の治療に用いることができる。
【０００９】
別の形態では、前記投与はペリオスチンタンパク質をコードする塩基配列であってもよい。
【００１０】
さらなる形態として、本発明はペリオスチンタンパク質をコードする塩基配列を提供する。前記配列は、ｐａｎｃ遺伝子の配列（図１）、ｐａｎｃ配列に相同な塩基配列、又はｐａｎｃの相補鎖にハイブリダイズする塩基配列である。
【００１１】
本添付の図面と併せ、以下の本発明の具体的な実施形態の記載を参照することにより、本発明のその他の態様及び特徴は当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
次に、添付した図を参照して、例として本発明の実施形態を説明する。
【図１】図１Ａ−Ｃは、５つの異なる塩基配列にコードされるペリオスチンタンパク質の模式図を示す。図１Ｄは、図１Ａ−Ｃに示したペリオスチンタンパク質アイソフォームの可変部位をコードする、５つのペリオスチン塩基配列のアラインメントを示す。
【図２】図２は、図１Ｄの別の表記である。
【図３】図３は、ヒトペリオスチン組換えタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４】図４Ａ−Ｂは、対マウスの一方にストレプトゾソシン及びペリオスチンを、もう一方にはペリオスチンのみを投与した、１５の実験結果の総括である。図４Ａにおいて、ひし形は、ペリオスチン投与マウスでは正常血糖値だがペリオスチン非投与マウスではＳＴＺ誘発性糖尿病となったマウス対を示す。図４Ａにおいて、三角は、ペリオスチン投与及び非投与の両方においてＳＴＺ誘発性糖尿病となったマウス対を示す。図４Ｂは、４０〜６０μｇ／ｋｇ体重のペリオスチンを投与した図４Ａのマウス対の血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【図５】図５Ａは、図１Ｂで図示されたペリオスチンタンパク質アイソフォームをコードする塩基配列を示す。図５Ｂは、図１Ｂで図示され、且つ図５Ａにコードされるペリオスチンタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、移植された膵星細胞と膵臓の組織学的データを示す。図６Ａ及び６Ｃは、注入から３日後及び１週間後のＧＦＰ発現野生型ドナー細胞の浸入を示している。図６Ａは、図６Ｂにおいて矢印で示された部位の拡大図である。図６Ｄ−Ｆは、間葉系細胞を注入された膵臓は以下の様相を呈することを示している：（Ｄ）Ｅ−カドヘリン及びＮｇｎ３を発現する管状複合体の形成、（Ｅ）サイトケラチン−７陽性管構造の周囲のＧＦＰ発現細胞、及び（Ｆ）Ｐｄｘ１は発現していないＧＦＰ発現細胞。
【図７】図７は、直接注射されたペリオスチンが膵臓再生及びインスリン発現に与える影響を図示したものである。７Ａ−Ｇは、（Ａ）ペリオスチン注射から１週間後にＮｇｎ３＋細胞が注射跡近辺に認められること、（Ｂ）インスリンの発現がサイトケラチン−７＋管状複合体構造内に観察されること、（Ｃ）生理的食塩水の注射ではインスリンの発現は検出されないこと、（Ｄ及びＥ）注射から４週間後には、インスリンの発現が導管構造の内部及び周辺に観察されること、（Ｆ）前記インスリン＋細胞塊はグルカゴン発現細胞を含むこと、（Ｇ）前記インスリン＋細胞塊はＮｇｎ３発現細胞を含むこと、を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、概してペリオスチンを用いた膵臓組織の再生方法を提供する。特定の実施例においては、本発明はペリオスチンを用いたランゲルハンス島の種々の膵細胞の再生方法を提供する。さらなる実施例では、本発明はペリオスチンを用いたランゲルハンス島β細胞の再生方法を提供する。別の実施形態では、本発明は新規アイソフォームをコードする核酸も含めて、ペリオスチンの新規アイソフォームを包含する。
【００１４】
ペリオスチンにはさまざまなアイソフォームが存在する。本発明で使用するにあたって、“アイソフォーム”とは“機能的に類似し、類似しているが同一ではないアミノ酸配列を有し、且つ、異なる遺伝子もしくは同じ遺伝子に由来するが異なるエクソンが除去されたＲＮＡ転写物にコードされる２以上のタンパク質のうちのいずれか”と定義する（Ｍｅｒｒｉａｍ−Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ＯｎＬｉｎｅ）。
【００１５】
図１に示したように、ペリオスチンをコードする塩基配列は保存されたＥＭＩドメイン（〜７５アミノ酸からなるシステインに富んだ小モジュールで、ＥＭＩＬＩＮファミリータンパク質中に見出されたことから名づけられた）と４つのファシクリンリピート配列からなる。前記カルボキシル末端は多くのエクソンを含んでいる。これらのエクソンがどのようにスプライスアウトされるかによって、ペリオスチンアイソフォームの多様性がもたらされる。
【００１６】
図１及び２は、ネズミ科の既知のペリオスチンアイソフォーム４種類をコードする４種類の塩基配列を図示している。これらの配列はマウスより単離された核酸から決定されたが、他の哺乳類種も類似したペリオスチン遺伝子を有していると信じられている。アイソフォーム１は最も長い既知のペリオスチンアイソフォームで、２３個全てのエクソンを含んでいる（図２では塩基配列ＰＮ１によってコードされている）。アイソフォーム２（図２では塩基配列ＰＮ２によってコードされている）は最初に同定されたペリオスチンアイソフォームタンパク質で、もともとは骨芽細胞特異的因子−２（ＯＳＦ−２）と名付けられたもので、エクソン１７を欠損している。アイソフォーム３はさらに最近ペリオスチン様因子（ＰＬＦ）と名付けられたもので、エクソン１７を含んでいるがエクソン２１は含んでいない（図２では塩基配列ＰＮ３によってコードされている）。アイソフォーム４は現時点で公開されている最も短いペリオスチンアイソフォームで、エクソン２０と２１を含んでいる（図２では塩基配列ＰＮ４によってコードされている）。
【００１７】
本発明は、本願においてＰＡＮＣ（すべて大文字で特定されるタンパク質）と称する、新規であり、５番目のペリオスチンアイソフォームを包含する。ＰＡＮＣは、膵臓再生過程で最も一般的に発現するペリオスチンアイソフォームである。ＰＡＮＣはアイソフォーム４と同様のサイズだが、ダイレクトシーケンスで確認されたように、エクソン１７と２１を欠損している。図１は、ＰＡＮＣ（配列番号１、図１）と上述した４つのネズミペリオスチンアイソフォーム間で異なる部位の塩基配列のアラインメントを示している。よって、本発明は、前記単離されたｐａｎｃ核酸及びＰＡＮＣタンパク質だけでなく、前記ｐａｎｃの核酸配列（小文字全部によって特定されるＤＮＡ）及び前記ＰＡＮＣタンパク質の両方を包含している。
【００１８】
図３は、ヒト組換えペリオスチンタンパク質のアミノ酸配列を示す。図５Ａは、図１Ｂで図示されたネズミのペリオスチンタンパク質アイソフォームをコードする塩基配列（配列番号３）を示す。図５Ｂは、図１Ｂで図示されたネズミのペリオスチンタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列（配列番号２）を示しており、該アイソフォームは図５Ａに示された配列にコードされている。
【００１９】
１型糖尿病では前記免疫系が前記膵臓を攻撃するので、投与の一形態として前記ペリオスチン分子は免疫抑制剤と組み合わせて投与してもよい。
【００２０】
定義
本願文脈における“症状又は疾患を治療”という用語は、予防、進行の阻止、もしくは、症状又は疾患の進行遅延を意味する。
本願文脈における“再生”という用語は、細胞数の増加（増殖）、及び幹細胞の新細胞への分化の両方を包含する。膵臓組織の再生は、新しい膵細胞の増殖、星細胞増殖の誘導、及び／又は管状複合体形成を含む。
【００２１】
ペリオスチン核酸分子
本発明のペリオスチン核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はＲＮＡであってよく、また二重鎖でも一重鎖でもよい（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか）。これらの分子の区別もまた本発明の範囲内と考えられ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、あるいは１またはそれ以上の制限酵素処理によって作り出すことができる。リボ核酸（ＲＮＡ）分子はインビトロ転写反応によって作ることができる。前記核酸配列が、通常生理的条件下で長さとは無関係に可溶性のポリペプチドをコードしているとより好ましい。
【００２２】
本発明に係る核酸分子は、天然の配列、又は天然配列とは異なるが遺伝コードの縮重により同じポリペプチドをコードする配列を含むことができる。さらに、これらの核酸分子はコード配列に限定されることはなく、例えば、コード配列の上流又は下流にある非コード配列の一部分又は全部を含むことができる。
【００２３】
本発明に係る核酸分子は合成（例えば、ホスホラミダイトに基づいた合成法）、又は、哺乳類細胞のような生体細胞から得ることができる。前記核酸はヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、又はネコの核酸でもよい。また、前記種類の核酸間で組み合わせた、又は修飾したヌクレオチドも含まれる。
【００２４】
さらに、本発明に係る単離した核酸分子は、天然には見出されない部分を包含する。それ故、本発明は組換え核酸分子（例えば、ペリオスチンをコードする核酸分子部分がベクター（例えば、プラスミド又はウィルスベクター）、あるいは異種細胞のゲノム（又は同種細胞のゲノムだが本来の染色体上の位置ではない部位）に挿入されたもの）を包含する。
【００２５】
ペリオスチンファミリー遺伝子又はタンパク質は、それぞれペリオスチン関連遺伝子又はタンパク質との相同性に基づいて同定される。例えば、前記同定は配列同一性に基づくことができる。本発明は、単離された核酸分子が（ａ）前記ｐａｎｃの塩基配列（図２）、及び（ｂ）ｐａｎｃの少なくとも３０（例えば、少なくとも５０、１００、１５０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７００、９００、１１００、１４００、１７００、２０００、２２００、２２５０、２３００、又は２３１０）ヌクレオチドを含む核酸分子（図２）に対して少なくとも５０％（あるいは、５５％、６５％、７５％、８５％、又は９８％）同一であることを特徴とする。
【００２６】
２つの配列間の同一性の割合は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌの数学的アルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３−５８７７（１９９３））を用いて決定することができる。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムに取り入れられている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０））。ペリオスチンをコードする核酸と相同な塩基配列を得るためのＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、スコア＝１００、ワード長＝１２で、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行われる。ペリオスチンペプチドと相同なアミノ酸配列を得るためのＢＬＡＳＴタンパク質検索は、スコア＝５０、ワード長＝３で、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて行われる。比較するためのギャップアラインメントを得るには、文献（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２（１９９７））に記載されたようにギャップＢＬＡＳＴが用いられる。ＢＬＡＳＴとギャップＢＬＡＳＴプログラムを併用する場合には、それぞれのプログラムでの規定値（パラメーター）が用いられる（例えば、ＸＢＬＡＳＴとＮＢＬＡＳＴ）。
【００２７】
また、ハイブリダイゼーションも２つの核酸配列間の相同性検定に用いることができる。ペリオスチンをコードする核酸配列又はその一部分は、標準的なハイブリダイゼーション法においてハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ペリオスチンプローブが試料（例えば、哺乳類細胞）由来のＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズすることは、該試料中にペリオスチンＤＮＡ又はＲＮＡが存在することを示している。ハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知であり、分子生物学のカレントプロトコールでもみることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６（１９９１））。穏やかなハイブリダイゼーション条件とは、２倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で３０℃にてハイブリダイゼーションを行った後、０．１％ＳＤＳを含む１倍濃度のＳＳＣ中で５０℃にて洗浄する条件と同等と定義されている。非常に厳しい条件とは、６倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で４５℃にてハイブリダイゼーションを行った後、０．１％ＳＤＳを含む０．２倍濃度のＳＳＣ中で６５℃にて洗浄する条件と同等と定義されている。
【００２８】
また、本発明は（ａ）コード配列及び／又はその相補鎖（すなわち、“アンチセンス”配列）に関わる前記ペリオスチンのいずれかを含むベクター、（ｂ）コード配列に関わる前記ペリオスチンのいずれかを含む発現ベクターで、該ペリオスチンは転写／翻訳調節要素のいずれかに制御されるように連結している発現ベクター、（ｃ）ペリオスチンポリペプチドの他に、レポーター、マーカー、又はペリオスチンと融合したシングルペプチドといったペリオスチンとは無縁の配列をコードしている発現ベクター、及び（ｄ）前記発現ベクター、を含み、それ故本発明に係る前記核酸分子を発現する遺伝子改変宿主細胞（以下参照）、を包含する。
【００２９】
組換え核酸分子は、ペリオスチン又は異種シグナル配列を有するペリオスチンを含むことができる。前記ペリオスチン全長ポリペプチド又はその断片は、上述したような異種シグナル配列又はさらなるポリペプチドと融合させてもよい。同様に、本発明に係る前記核酸分子は、成熟型ペリオスチン又は分泌促進のための外来性ポリペプチドを含む形のペリオスチンをコードすることができる。
【００３０】
上述及び後述する転写／翻訳調節要素は、誘導性及び非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、及び当業者が知る遺伝子発現を駆動もしくは調節する他要素を含むがこれに制限されるものではない。そのような調節要素は、サイトメガロウィルスｈＣＭＶの前初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウィルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｔシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ファージＡの主要オペレーター及びプロモーター、ｆｄコートタンパクの制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、及び、酵母のα−接合因子のプロモーターを含むがこれに限定されるものではない。
【００３１】
同様に、前記核酸は、例えばマーカー又はレポーターとして機能する配列のように、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成することができる。マーカー及びレポーター遺伝子の例には、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジハイドロフォレートレドクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフォトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼをコードしている）、及び、キサンチングアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が含まれる。本発明の実施に伴う多くの標準的方法と同様に、熟練した当業者は、例えばマーカー又はレポーターの機能に役立つ付加的配列のような、さらなる有用な試薬（手立て）に気づくであろう。一般に、前記ハイブリットポリペプチドは最初の部分と２番目の部分を含むと考えられ、前記最初の部分はペリオスチンポリペプチドであり、前記２番目の部分は例えば上述したレポーターあるいは免疫グロブリンの定常領域又は免疫グロブリンの定常領域の一部（例えば、ＩｇＧ２ａ重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）である。他のハイブリッドは精製を促進するために抗原性タグ又はＨｉｓタグを含むことができる。
【００３２】
本発明に用いてもよい前記発現システムは、本発明に係る前記核酸分子を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質変換されたバクテリア（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌））のような微生物、本発明に係る前記核酸分子を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス又はピチア属）、本発明に係る前記核酸分子を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）に感染した昆虫細胞システム、ペリオスチン塩基配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）又はタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ））に感染あるいは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞システム、あるいは、前記哺乳類細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳類ウィルスに由来するプロモーター（例えば、前記アデノウィルス後期プロモーター及びワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを内包する哺乳類細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞）を含むがこれに限定されるものではない。また、哺乳類から一次的又は二次的に得られ、プラスミドベクターを導入あるいはウィルスベクターに感染した宿主細胞も同様に有用である。
【００３３】
本発明に係るベクターを遺伝子導入又は形質導入された細胞は、例えば、当該分野で周知の方法によって、ペリオスチンポリペプチド又はその抗原断片のインビトロでの大規模又は小規模生産に用いることができる。基本的に、そのような方法は、前記ポリペプチド又は抗原断片の生産を最大にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び前記細胞又は前記培養液からそれ（前記ポリペプチド又は抗原断片）を単離する工程を含んでいる。
【００３４】
ペリオスチンタンパク質／ポリペプチド
本発明の、及び本発明で用いられるペリオスチンタンパク質／ポリペプチドは、シグナルペプチドを有するものと有しないものの両方を包含する。それらはまた、組換え型及びアイソフォームも包含する。
【００３５】
前記ペリオスチン分子のアミノ酸配列は、前記ペリオスチン分子の野生型配列と同一であり得る。実質的に前記野生型ペリオスチン配列と同一なポリペプチドもまた包含される。タンパク質に適用する場合、“実質的に同一”という語句は、規定のギャップウェイトを用いてＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどでアラインさせた際に、典型的には少なくとも約７０パーセントの配列同一性、あるいは少なくとも約８０、８５、９０、９５パーセント以上の配列同一性を示す２配列を意味してよい。また、前記ポリペプチドのいずれも、欠失、付加、または置換のような変異を含むことができる。必要なのは、前記変異型ペリオスチン分子が、前記野生型ペリオスチン分子が有する野生型ペリオスチン特異的抗体への結合能力の少なくとも５％（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれ以上）の能力を有していることだけである。
【００３６】
アミノ酸配列では、同一でないアミノ酸残基はアミノ酸の同類置換によって異なっていてもよい。“同類置換”という語句は、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に代える際に、両アミノ酸が共通した特性を有するグループのメンバーである場合をいう。それぞれのアミノ酸間の共通特性を規定する実用的な方法は、相同生物において相当するタンパク質間で標準化したアミノ酸置換率を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ． ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。そのような分析によれば、アミノ酸グループは、グループ内のアミノ酸は互いに優先的に置換し合うのでタンパク質の全体構造に与える影響が最も似通う、と規定されてよい（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ． ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このように定義されるアミノ酸グループセットの一例としては、（ｉ）Ｇｌｕ（グルタミン酸）及びＡｓｐ（アスパラギン酸）、Ｌｙｓ（リジン）、Ａｒｇ（アルギニン）、及びＨｉｓ（ヒスチジン）からなる電荷を帯びたグループ、（ｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる正電荷を帯びたグループ、（ｉｉｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる負電荷を帯びたグループ、（ｉｖ）Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｔｙｒ（チロシン）、及びＴｒｐ（トリプトファン）からなる芳香族グループ、（ｖ）ＨｉｓおよびＴｒｐからなる窒素環グループ、（ｖｉ）Ｖａｌ（バリン）、Ｌｅｕ（ロイシン）及びＩｌｅ（イソロイシン）からなる大きな脂肪族非極性グループ、（ｖｉｉ）Ｍｅｔ（メチオニン）及びＣｙｓ（システイン）よりなる微極性グループ、（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（スレオニン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ｇｌｙ（グリシン）、Ａｌａ（アラニン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｇｌｎ（グルタミン）、及びＰｒｏ（プロリン）からなる小残基グループ、（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、及びＣｙｓからなる脂肪族グループ、及び（ｘ）Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる小ヒドロキシルグループ、が含まれる。
【００３７】
前記ポリペプチドは自然物（例えば、血液、血清、血漿、又は膵臓、肺、胎盤といった組織や細胞、又は結腸組織、あるいはペリオスチンポリペプチドを自然に産生するすべての癌性もしくは正常細胞）から精製することができる。前記ペリオスチン分子はヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、又はネコのペリオスチン分子であってよい。また、便利なことに、小ペプチド（１００アミノ酸長未満）は通常の化学的手法によって合成することができる。加えて、ポリペプチド及びペプチドはともに、適切なポリペプチド又はペプチドをコードする塩基配列を用いた標準的なインビトロ組換えＤＮＡ技術及びインビボ遺伝子組換え技術によって産生することができる。関連するコード配列及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの作製には、当業者に周知の方法を用いることができる。例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールドスプリングハーバー研究所、Ｎ．Ｙ．（１９８９））、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載された技術を参照するとよい。
【００３８】
組換えペリオスチンは本発明に係る方法に用いることができる。本発明に有益な組換えペリオスチンの例を図３に示す。
【００３９】
また、本発明に係るタンパク質及びポリペプチドは、上述した核酸分子のいずれからも従来技術を用いて産生することができる。
【００４０】
本発明に係るポリペプチドは全長ペリオスチン断片を含み、そのような断片は膵臓組織を再生することができる。そのようなペリオスチン断片は、ペリオスチンタンパク質の少なくとも１５（又は３０、５０、１００、あるいは１５０）の連続したアミノ酸配列を含んでよい。前記ポリペプチド断片は、他の部分がない状態でも生物学的にアクティブとなるペリオスチン部分を含み得る。従来技術において周知であるように、比較的少数のアミノ酸はしばしば（タンパク質の）活性を破壊することなく、タンパク質の一端から除去することができる。
【００４１】
前記ポリペプチド又はポリペプチド断片は、２つ目のタンパク質又はポリペプチドと遺伝的に融合したような、より大きなタンパク質の一部であってもよい。あるいは、前記ポリペプチド又はポリペプチド断片は、例えば架橋剤を用いることで、２つ目のタンパク質に結合していてもよい。
【００４２】
ペリオスチン又はその一部のポリペプチドは、ポリマーとの共有結合によって化学的に修飾することができる。例えば、ペリオスチンの循環半減期を伸ばすためにこのような修飾を行ってもよい。ポリマー及びそれらをペプチドに結合する方法は、米国特許４，７６６，１０６、４，１７９，３３７、４，４９５，２８５、及び４，６０９，５４６に示されている。ポリマーの例としては、ポリオキシエチレン化ポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。ＰＥＧは室温で水に可溶性で、Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒの一般式を有しており、式中Ｒは水素もしくはアルキル基又はアルカノール基のような保護基であり得る。前記保護基は１〜８の炭素を有してよく、メチル基であってもよい。前記記号ｎは正の整数で、一般には１〜１，０００、あるいは２〜５００である。前記ＰＥＧは一般には平均分子量が１０００〜４０，０００であり、２０００〜２０，０００又は３，０００〜１２，０００であってもよい。ＰＥＧは少なくとも１つのヒドロキシ基を有してよく、末端にヒドロキシ基を有していてもよい。
【００４３】
製剤処方と投与経路
ペリオスチンタンパク質又はその断片を含む医薬組成物は、膵機能不全の治療に用いてもよい。別の形態では、医薬組成物は本発明に則ったペリオスチン塩基配列を含んでもよい。
【００４４】
本発明に係る組成物は、経口、口腔、経鼻、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下投与）、局所、又は直腸投与に適した１以上の薬学的に許容し得る担体を用いた通常の方法で、あるいは吸入投与に適した形で処方してよい。前記組成物は膵臓内、血液循環系内、又は腹腔内に直接注射してもよい。前記投与は、前記組成物を含むゲル又はマトリクスの外科的挿入でも可能である。
【００４５】
液剤を用いる場合には、前記ポリペプチド又は核酸は異なる濃度に処方してよく、あるいは異なる剤を用いてもよい。例えば、これらの剤は油、ポリマー、ビタミン、炭化水素、アミノ酸、塩、バッファー、アルブミン、界面活性剤、又は増量剤を含んでよい。炭化水素には、糖、もしくはモノ−、ジ−、又はポリサッカライド等の糖アルコール、あるいは水溶性グルカンが含まれる。前記サッカライド又はグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファ及びベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルスターチ、及びカルボキシメチルセルロース、もしくはそれらの混合物を含むことができる。スクロースはその一例である。糖アルコールは１つのＯＨ基を有するＣ４からＣ８の炭化水素と定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、及びアラビトールを包含する。マンニトールはその一例である。上述したこれらの糖又は糖アルコールは、単独でも、組み合わせて用いてもよい。前記糖又は糖アルコールが水系調整において可溶性である限り、使用量に定まった制限はない。前記糖又は糖アルコール濃度は一般に１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％であり、２．０〜６．０ｗ／ｖ％でもよい。アミノ酸は左旋性カミチン、アルギニン、及びベタインを含むが、他のアミノ酸を加えてもよい。ポリマーは、平均分子量２，０００〜３，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）又は平均分子量３，０００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。バッファーは前記液中のｐＨ変動を最小にするために、使用するのであれば、凍結乾燥前又は再構成後にもっぱら前記組成物において使用される。生理学的バッファーならおよそどのバッファーを使用してよいが、クエン酸、リン酸、コハク酸、及びグルタミン酸バッファー、もしくはそれらの混合物が一般的である。前記濃度は０．０１から０．３モル濃度でよい。また、前記処方には界面活性剤を加えることもできる。
【００４６】
前記液状医薬組成物を調整した後は、分解を防止し無菌状態を保つために、前記液状組成物を凍結乾燥してもよい。液状組成物を凍結乾燥する方法は当業者に周知である。前記組成物は使用直前に滅菌した希釈剤（例えば、リンガー液、蒸留水、又は滅菌した生理的食塩水）で再構成するとよく、該希釈剤はさらなる成分を含んでいてもよい。再構成後はすぐに前記組成物を当業者に周知の方法で被験者に投与するのが好ましい。
【００４７】
本願における“薬学的に許容される賦形剤”とは、概して安全で毒性がなく、生物学的もしくは他の意味においても不都合でない医薬組成物の調整に有用な賦形剤を意味しており、ヒトへの薬学的用途と同様に獣医学的用途にも許容される賦形剤を包含している。本願明細書及び特許請求の範囲で用いているように、“薬学的に許容される賦形剤”には１及び１以上の前記賦形剤が含まれる。
【実施例】
【００４８】
外科的手法
すべての外科的手法において、該外科処置の４５分から１時間前に、マウスに０．０５ｍｇ／ｋｇの希釈したブプレノルフィン（０．０３ｍｇ／ｍｌ）を皮下注射した。マウスは、麻酔箱中でイソフルラン濃度を徐々に５％に上げることで麻酔状態にした。前記麻酔薬はＯｈｉｏ Ｆｏｒａｎｅ気化器（誘導箱）及びイソフルラン吸入器（マスク）によって送達した。一旦麻酔されると、前記マウスにはイソフルラン１．５％の顔マスクを装着した。前記外科手術部位は体毛を剃り、エンデュア石鹸で清浄し、滅菌水ですすいだ後、クロラヘクスセプティック液で外科的処置を施した。麻酔中に前記動物の目が乾燥するのを防ぐために、ＢＮＰ眼軟膏剤を前記動物の目に塗った。外科手術に先立って、１ｍｌの生理的食塩水を皮下注射した。外科手術中、前記マウスは（必要に応じて増減したが）イソフルラン１．５％中に維持した。前記外科手術が完了すると、前記マウスを約１分間酸素中に置き、その後動き始めるとすぐにケージに戻した。
【００４９】
膵臓組織を摘出するために、腹腔への到達は正中切開により行った。まず、１０番の外科用メスの刃を用いて、腹の中央の皮膚を１〜１．５ｃｍ切開した。鉗子を用いて前記皮膚を前記腹壁から丁寧に剥がし、前記腹部の正中線をあらわにした。ラット用歯鉗子を用いて前記正中線を持ち上げ、ハサミで体壁を１ｃｍ未満に微小切開した。脾臓に接した膵臓の葉があった場合には、前記切開部にて鉗子を用いて前記葉を持ち上げた。前記脾臓葉の全てと胃及び十二指腸に接した膵臓葉の末端部を、鉗子と綿棒を用いた穏やかな掻爬によって除去し、主だった静脈と動脈が損傷していないことを確認した。過剰な出血が認められた場合には、止血を促すために前記出血部位を数分間クランプした。除去した後には、前記膵臓のごく一部（〜３０％）だけが前記十二指腸に沿って残っていた。外科的に摘出した前記膵臓は全膵臓の約７０％であり、このことは予備実験において摘出及び残存した前記組織部分の重さを測定することで確認した。前記体壁は、外科手術用縫合絹糸（ジョンソン＆ジョンソン社製）で不連続に２〜３回縫合することで閉じた。前記皮膚は、外科用ステープル（フィッシャー社製）で２〜３回止めることで閉じた。前記外科手術が完了すると、前記マウスを約１分間酸素中に置き、その後動き始めるとすぐにケージに戻した。血糖値は、グルコース増加に対する血糖の値を調べることで一日おきに解析した。さらに、マウスには外科手術後の最初の１週間、０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを毎日皮下注射した。
【００５０】
試験例１ 組換えペリオスチンを用いた膵臓再生
ペリオスチンが膵臓再生において果たす役割を明らかにするために、組換えペリオスチンタンパク質を前記膵臓に注射した。組換えペリオスチンタンパク質（バイオベンダー社より購入、ＲＤ１７２０４５１００）は生理的食塩水を用いて１０ｎｇ／μｌの濃度に溶解及び希釈した。前記組換えペリオスチンタンパク質（図３に示した６７１アミノ酸配列）はＣ末端が欠損したヒトのペリオスチンタンパク質であり、前記４種類の既知アイソフォームすべてに共通した配列を代表している。１０μｌ(１００ｎｇ又は５μｇ／ｋｇ)を直接膵臓内へ注射した。直接注射は、上述した通り前記膵臓を正中切開で露出し、ハミルトン注射器を用いて１０μｌの組換えペリオスチン液を前記膵臓内へ直接注射することで行った。溶媒投与動物には、生理的食塩水で希釈した上記と同量の溶媒を注射した。前記膵臓へ注射後、膵切除術後に行われるように前記体壁を縫合によって閉じ、前記皮膚は創傷クリップで閉じた。術後１週間はマウスを毎日観察し、０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを毎日皮下投与した。前記外科手術後に、分裂細胞を継続的に標識するために、ＢｒｄＵ（シグマ社製）を濃度０．８ｍｇ／ｍｌとなるように飲料水中に投与した。
【００５１】
前記注射から２４時間後、生理的食塩水を注射したコントロールと比べて、ペリオスチンは広域に及ぶ細胞増殖を誘導した。組織学によって、前記増殖は島、管、及び腺房細胞以外の部位で起きており、ビメンチン発現細胞に局在していることが示された。再生過程では、ペリオスチンは、サイトケラチン７及びＥｃａｄ陽性管状複合体の周囲にある膵臓再生端に局在する。これらの複合体は、Ｋｉ６７の免疫染色によって示されるように、膵臓における細胞増殖の源である。定常状態の膵臓におけるペリオスチンｍＲＮＡに比べて、ペリオスチンｍＲＮＡは膵切除後３日で１０倍近く増加する。これは、胎生期の発生における増加がわずか３倍であることの比ではない。
【００５２】
ペリオスチン注射から３日後、ビメンチン発現細胞の数は大幅に増加した。この増加は管状複合体のある領域に局在しており、前記膵臓の他の領域では通常レベルのビメンチンを発現していた。しかし、ペリオスチン注射から３日後にはビメンチン発現細胞はもう増殖してなく、サイトケラチン７を発現する管状複合体では増殖していた。前記管状複合体は管、島、及び腺房細胞と同様にＥ−カドヘリンを発現していたが、Ｋｉ６７の免疫染色の増加で示されるように増殖が亢進していた。また、前記管状複合体は、膵臓前駆細胞のマーカーであるＰｄｘ−１及びＮｇｎ３も発現していた。Ｎｇｎ３細胞は管状複合体の外側にも認められたが、近傍には認められなかった。管状複合体を構成する遠位部には、Ｎｇｎ３陽性細胞は存在しなかった。
【００５３】
ペリオスチン注射から１週間後、前記実質細胞は、生理的食塩水を注射した膵臓と比べると、Ｅ−カドヘリン陰性細胞の蓄積で示されるように増加していた。前記ペリオスチンを注射した膵臓ではごくわずかの管状複合体しか残存していなかったが、前記生理的食塩水を注射したコントロールと比べて増殖は広域に及んでいた。しかし、この時点では、増殖は管状複合体に限らず、Ｅ−カドヘリン発現細胞でも起きていた。増殖はアミラーゼを発現している腺房細胞でも認められたが、その周囲の実質では認められなかった。前記周囲の実質はＢｒｄＵの蓄積を呈しており、その幅は１０μｍ〜３００μｍと大きさが異なっていた。前記実質の蓄積のうちで最大のものはＥ−カドヘリン陽性管状複合体をいくらか含んでいたが、ペリオスチン注射から３日後よりは多くなかった。マウスの体重辺り５００μｇより多い投与量（５００μｇ／ｋｇ体重）では、膵臓、特にアミラーゼを分泌する外分泌細胞において、細胞死が増加する結果となった。
【００５４】
試験例２ 腹腔内注射による膵臓再生
ペリオスチンを侵襲性の低い方法で投与しても膵臓再生が誘導されるのかどうかを確認するために、前記組換えタンパク質（バイオベンダー社製、ＲＤ１７２０４５１００）を、前記膵臓内への直接注射法とは対照的に、体重辺り５０μｇ（５０μｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射によって注入した。ペリオスチン注射から１週間後、生理的食塩水を注射したコントロールに比べて、島細胞によるＢｒｄＵ取り込みの増加が認められた。さらに、（ペリオスチン注射した）島内部では、Ｋｉ６７の染色で示される細胞増殖が生理的食塩水を注射したコントロールに比べて亢進していた。ペリオスチン又は生理的食塩水を注射したＭＩＰ−ＧＨＰマウスのＦＡＣＳ解析によって、（ペリオスチン注射した該マウスでは）インスリンを分泌しているβ細胞数が約２倍増加していることが観察された（ｎ＝３）。ペリオスチンを注射したマウスと生理的食塩水を注射した同腹子コントロールを比較することで、膵臓β細胞の数が２倍以上増加することが明らかとなった。
【００５５】
試験例３ 組換えペリオスチンを用いた、ＳＴＺ誘発性糖尿病における膵臓再生
ストレプトゾソシン（ＳＴＺ）は哺乳類の膵臓β細胞を選択的に標的とし破壊する。それは、１型糖尿病の動物モデル作製に用いることができる。マウスに糖尿病を誘発するために、Ｃｒａｖｅｎ（Ｃｒａｖｅｎ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１））が記載したＣ５７ＢＬ／６Ｊの遺伝的背景において、前記マウスがＧｒｏｓｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１，２２２７−３２（２００２））が記載した糖尿病の症状を呈するまで、１００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを一日おきに腹腔内注射した。その最初のＳＴＺ注射（０日目）以降、血糖値を毎日計り、前記マウスの糖尿病状態を判断した。別のプロトコールでは、血糖値を一日おきに解析しながらマウスに一日あたり５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを５日間注射することで糖尿病を誘発した。糖尿病マウスには、該マウスの健康と寿命を改善する必要に応じてインスリンを投与した。
【００５６】
ペリオスチンがＳＴＺ誘発性糖尿病を予防できるかどうかを判断するために、ＳＴＺ投与に続いて組換えペリオスチン（バイオベンダー社製、ＲＤ１７２０４５１００）をマウスに注射した。ＳＴＺ投与マウスには、前述したＳＴＺ注射に続いて、体重あたり１０ｍｇ／ｋｇから９０ｍｇ／ｋｇまでのさまざまな濃度の組換えペリオスチンを腹腔内注射（ＩＰ）した。血糖値は一日おきに解析した。もしペリオスチン投与マウスが正常血糖レベルを維持し、ペリオスチン非投与の同腹マウスが糖尿病になれば、ペリオスチンはＳＴＺ誘発性糖尿病を予防すると判断することにした。ＳＴＺとペリオスチンを共投与した場合には、１５匹のうち１１匹の動物が正常血糖レベルを維持した（図４）。また、この実験によって、マウスに腹腔内投与するペリオスチンの至適用量は３０〜７０ｍｇ／ｋｇ体重であることが示唆された。マウスに腹腔内投与するペリオスチンの好ましい用量は、４０〜６０ｍｇ／ｋｇ体重と考えられる。
【００５７】
試験例４ ＰＡＮＣペリオスチンアイソフォームをコードするＤＮＡの単離
膵臓組織は液体窒素中で急速冷凍し、氷冷した乳鉢と乳棒を用いて直ちに粉砕した。前記細粉化膵臓組織は解凍前に１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン社製、製品番号１５５９６−０１８）と混合した。そして、前記製造元の使用説明書に従い、前記膵臓組織由来ＲＮＡを抽出した。
【００５８】
ＲＮＡ試料は前記ＲＮＡ ＰＣＲ コアキット（アプライドバイオシステムズ社製、製品番号Ｎ８０８−０１４３）を用いて前記製造元の使用説明書に従って逆転写した。前記キットに含まれるオリゴｄ（Ｔ）ｓ及びランダムヘキサマーの両プライマーを用いて、前記ｃＤＮＡ合成のための逆転写（ＲＴ）反応を開始した。
【００５９】
上述の方法に従い作製したｃＤＮＡから前記ペリオスチンＣ末端を増幅する前記ＰＣＲ反応には、下記の試薬が含まれる：ｃＤＮＡ ５μｌ、５０ｎＭ フォワードプライマー ＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡ（配列番号４）、５０ｎｍ リバースプライマー ＡＡＣＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴ（配列番号５）、５００ｎｍ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μｌ １０倍濃度反応バッファー、及び０．２５μｌ ＴＡＱポリメラーゼ（インビトロジェン社製、製品番号１０３４２−０２０）。前記反応液は５０μｌになるように希釈した。前記ＰＣＲ反応の運転条件は次の通りである：２５サイクル（９５℃で６０秒、６０℃で６０秒、及び７２℃で６０秒）。その後、前記反応液は２％アガロースゲル上で展開し、４６２ｂｐの位置に検出される明瞭なバンドを清潔な外科用メスを用いて前記ゲルから切り出した。前記ＤＮＡ断片は、前記ＱＩＡｑｕｉｃｋ ゲル抽出キット（キアゲン社製、製品番号２８７０６）を用いて前記製造元の使用説明書に従い、前記ゲルから抽出した。抽出後、前記ＤＮＡ断片は上述したフォワード及びリバースプライマーを用いて独立した反応系でシークエンスした。さらに具体的には、Ｓｔｅｍｃｏｒｅ研究所（ＯＨＲＩ、オタワ、ＯＮ）にてアプライドバイオシステムズ社の３７３０ ＤＮＡアナライザーを使用して１０ｎｇのＰＣＲ鋳型をシークエンスするのに、２μＭのプライマーを用いた。
【００６０】
試験例５ 注射したペリオスチンの安全性
ペリオスチンが安全に投与できるのかどうか確認するために、０、２、４、又は１０μｇ／ｋｇ体重の前記組換えペリオスチン（バイオベンダー社製、ＲＤ１７２０４５１００）を、８週齢のマウスに週に一度、６週間に渡って腹腔内投与した。１３週までに、視覚的に認識できる腫瘍は検出されなかった。各マウスの血糖値は週一回の頻度でモニターした。各グループごとのマウスの平均血糖値（６匹／グループ、ｍＭ／Ｌで表記）を下記表１に示す。標準偏差は０．３１〜２．０６ｍＭ／Ｌの範囲であった。
【００６１】
【表１】
【００６２】
試験例６ 星細胞はペリオスチンを発現し、膵臓再生を仲介する
星細胞が膵臓再生過程におけるペリオスチン供給細胞であるのかどうかを判断するために、前記成人の膵臓から、ペリオスチン発現細胞を高純度に含む細胞集団を精製した。前記精製されたペリオスチン発現細胞集団は、（１）前記再生途中の膵臓では、ペリオスチンはビメンチン及び幹細胞抗原−１（Ｓｃａ１／Ｌｙ６Ａ）共発現細胞において発現されるという観察、及び（２）標準的な蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）プロトコールを用いた前記膵臓残余からのＳｃａ１発現生細胞の単離（蛍光色素を結合したＳｃａ−１特異的抗体（ｅバイオサイエンス社製、１７−５９８１）を使用）、により回収した。標準的ＦＡＣＳプロトコールは、（ＣＤ３１及び）Ｓｃａ１も発現する内皮細胞を除去するために、ＣＤ３１−細胞の同定に用いた（蛍光色素を結合したＣＤ３１特異的抗体（ｅバイオサイエンス社製、１２−０１１２）を使用）。
【００６３】
前記ＦＡＣＳで精製したＳｃａ１＋／ＣＤ３１−細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中で培養し増殖させた。培養系では、前記Ｓｃａ１＋／ＣＤ３１−細胞は膵臓星細胞の形態及びマーカー（ビメンチン＋、平滑筋アクチン＋、デスミン＋、ネスチン＋、ＧＦＡＰ＋、サイトケラチン−７−、Ｅ−カドヘリン−、アミラーゼ−、及びインスリン−）を示した。ペリオスチン−ＬａｃＺヘテロ接合アリルの発現は、Ｓｃａ１＋細胞に限定するフルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）染色及びフローサイトメトリーによって確認した。さらに、標準的な定量的ＰＣＲプロトコールによって、前記培養下のＳｃａ１＋／ＣＤ３１−細胞がペリオスチンｍＲＮＡを発現していることが確認された。これらの結果は、前記膵星細胞は、膵臓再生過程における前記ペリオスチンの細胞性供給源であることを示している。
【００６４】
試験例７ 間葉系星細胞は膵臓再生を誘導する
レンチウィルス−ＧＦＰを感染させたＳｃａ１＋星細胞は、受容マウスの膵臓に直接注入した（１×１０４細胞／マウス）。野生型星細胞は、前記受容マウスの膵臓に浸入し、管状複合体形成及びＮｇｎ３前駆細胞とＰｄｘ１発現膵島細胞の産生を誘導することが観察された。標準的プロトコールに従った抗ＧＦＰ抗体（インビトロジェン社製、Ａ２１３１１）染色によって、注入後２週間で、ドナー細胞が内分泌組織中に分散していることが明らかとなった。ＧＦＰ発現ドナー細胞を含む部位は、Ｎｇｎ３を発現する管状複合体も含んでいた。サイトケラチン−７、Ｐｄｘ−１のいずれもＧＦＰと共局在しなかったので、管状複合体はドナー細胞を含んでいなかった。
【００６５】
図６は、膵星細胞を移植した前記膵臓の組織学を示している。図６Ａ及び６Ｃはそれぞれ、注入から３日後及び１週間後のＧＦＰ発現野生型ドナー細胞の浸入を示している。図６Ａは図６Ｂにおいて矢印で示された部位の拡大図である。図６Ａの縮尺バーは５００μｍだが、図６Ｂの縮尺バーは１ｍｍである。図６Ｄ−Ｆは、野生型細胞を注入された膵臓が下記の様相を呈したことを示している：（Ｄ）Ｅ−カドヘリン及びＮｇｎ３を発現する管状複合体の形成、（Ｅ）サイトケラチン−７導管構造の周囲にＧＦＰ発現細胞があること、及び（Ｆ）ＧＦＰ発現細胞がＰｄｘ１を発現していないこと。
【００６６】
試験例８ ペリオスチンによって誘導される膵臓再生及びインスリン発現
ＳＴＺ投与した糖尿病マウスにおいてペリオスチンが膵臓再生を誘導するかどうかを判断するために、上述したプロトコールに従い、ＳＴＺを毎日、５日間注射した。１週間後、上述したプロトコールに従い、組換えペリオスチンを前記マウスの膵臓に直接注射した（５ｍｇ／ｋｇ体重）。前記ペリオスチン注射から１週間後、導管細胞内部でのインスリン発現とともに、管状複合体の形成及びＮｇｎ３を発現する前駆細胞の産生が認められた。前記ペリオスチン注射から４週間後には、標準的な組織学的手法によっても、導管内及び導管周囲の細胞塊でインスリン発現が確認された。前記細胞塊はインスリン及びグルカゴンがともに陽性で且つＮｇｎ３をまだ発現している細胞を含んでおり、前記細胞塊が未成熟な膵島であることを示唆している。
【００６７】
図７Ａ−Ｇは、（Ａ）ペリオスチン注射から１週間後に、Ｎｇｎ３＋細胞が注射跡近辺に認められること、（Ｂ）インスリンの発現がサイトケラチン−７＋管状複合体構造内に観察されること、（Ｃ）生理的食塩水の注射ではインスリンの発現は検出されないこと、（Ｄ及びＥ）注射から４週間後には、インスリンの発現が導管構造の内部及び周辺に観察されること、（Ｆ）前記インスリン＋細胞塊はグルカゴン発現細胞を含むこと、（Ｇ）前記インスリン＋細胞塊はＮｇｎ３発現細胞を含むこと、を図示している。
【００６８】
本発明の実施例を完全に理解させるために、先の記述では、説明を目的として多くの詳細を記載した。しかしながら、本発明の実施にあたりこれらの具体的詳細は必要ないことは、当業者の目には明らかであろう。上述した本発明の実施例は単なる例の開示に過ぎない。当業者によって、本書に添付した特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、本願の個々の実施例に変更、修飾、及び変形を加えることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓組織再生のためのペリオスチンの使用全般に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓は、インスリン、グルカゴン、及びソマトスタチンといったいくつかの重要なホルモンと同様に消化酵素を産生する。前記ホルモン産生細胞はランゲルハンス島内でグループ化されており、該島は膵臓の約１〜２％を占めている。健常な膵臓では、インスリンは血糖値の上昇に応答してランゲルハンス島内のβ細胞において産生される。膵臓組織の損失に起因する、又は膵臓組織の損失を引き起こす疾患は数多く存在する。これらの疾患には糖尿病（１型及び２型の両方）及び膵外分泌機能不全が含まれている。
【０００３】
１型糖尿病（インスリン依存型糖尿病）は、体の免疫系がβ細胞を攻撃し、該細胞を破壊もしくは該細胞に十分なダメージを与える結果、インスリンがほとんど又は全く産生されなくなる自己免疫性疾患である。インスリン補充療法、極端な食事制限、及び血糖値の注意深いモニタリングによって糖尿病に伴う合併症を制限することができるが、膵臓を移植又は再生することが好ましい。
【０００４】
２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）はメタボリック病であり、最初はインスリン抵抗性を特徴としていたが、最終的には膵臓の細胞がインスリン要求量に見合ったインスリン量を産生できないことを特徴としている。
【０００５】
膵外分泌機能不全（ＥＰＩ）は、膵臓が産生する消化酵素が欠損しているために食物を適切に消化できない病気である。ＥＰＩは、濾胞性線維症及びシュバッハマン・ダイアモンド症候群を煩っている患者で認められる。それは、消化酵素を産生する膵細胞の進行性消失によって引き起こされる。ヒトでは、慢性膵炎はＥＰＩの最大の発症要因である。消化酵素の欠損は、栄養分の消化不良及び吸収不良をもたらす。
【０００６】
当該技術分野では、膵臓組織を再生するための方法及び薬剤開発の必要性がある。
前記（ランゲルハンス）島の外科的移植はまだ有効性が証明されていないが、膵細胞には再生能力があることが知られている。ＨＩＰ、ＩＮＧＡＰ、ＧＬＰ−１、Ｅｘｅｎｄｉｎ−４のような膵臓再生促進因子が研究されている（例えば、ＷＯ ２００６／０９６５６５、ＵＳ６,１１４,３０７、及びＵＳ ＲＥ３９２９９）。
【０００７】
ペリオスチンは約９０ｋＤａの分泌性タンパク質で、骨組織中の骨膜において優先的に発現している。（Ｔａｋｅｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９４，２７１−２７８（１９３３）；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１４，１２３９−１２４９（１９９９））。ペリオスチンは、Ｎ末端の分泌シグナルペプチド、システィン残基に富んだドメイン、４つの内部相同性リピート配列、及びＣ末端の親水性ドメインから構成されている。各リピートドメイン内では、２つの領域が高度に保存されている。ペリオスチンは種々の癌において同定されており、ペリオスチンの発現は癌の指標及び治療上の標的として提案されている（Ｋａｎｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１２２，１７０７−１７１８（２００８））。また、ペリオスチンは膵星細胞（ＰＳＣｓ）によっても分泌され、ストレス下で膵臓腫瘍細胞の増殖を支援する一方でＰＳＣの線維形成能も持続させることが示されている（Ｅｒｋａｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１３２，１４４７−１４６４（２００７））。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
最初の形態として、本発明はペリオスチンの投与によって膵臓組織を再生する方法を提供する。前記再生された組織はβ細胞を含むことができる。本発明に係る方法は、１型糖尿病、２型糖尿病、及びＥＰＩのような膵臓組織の欠損によって引き起こされる、又は膵臓組織の欠損を引き起こす疾患の治療に用いることができる。
【０００９】
別の形態では、前記投与はペリオスチンタンパク質をコードする塩基配列であってもよい。
【００１０】
さらなる形態として、本発明はペリオスチンタンパク質をコードする塩基配列を提供する。前記配列は、ｐａｎｃ遺伝子の配列（図１）、ｐａｎｃ配列に相同な塩基配列、又はｐａｎｃの相補鎖にハイブリダイズする塩基配列である。
【００１１】
本添付の図面と併せ、以下の本発明の具体的な実施形態の記載を参照することにより、本発明のその他の態様及び特徴は当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
次に、添付した図を参照して、例として本発明の実施形態を説明する。
【図１】図１Ａ−Ｃは、５つの異なる塩基配列にコードされるペリオスチンタンパク質の模式図を示す。図１Ｄは、図１Ａ−Ｃに示したペリオスチンタンパク質アイソフォームの可変部位をコードする、５つのペリオスチン塩基配列のアラインメントを示す。
【図２】図２は、図１Ｄの別の表記である。
【図３】図３は、ヒトペリオスチン組換えタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図４】図４Ａ−Ｂは、対マウスの一方にストレプトゾソシン及びペリオスチンを、もう一方にはペリオスチンのみを投与した、１５の実験結果の総括である。図４Ａにおいて、ひし形は、ペリオスチン投与マウスでは正常血糖値だがペリオスチン非投与マウスではＳＴＺ誘発性糖尿病となったマウス対を示す。図４Ａにおいて、三角は、ペリオスチン投与及び非投与の両方においてＳＴＺ誘発性糖尿病となったマウス対を示す。図４Ｂは、４０〜６０μｇ／ｋｇ体重のペリオスチンを投与した図４Ａのマウス対の血糖値（ｍｍｏｌ／Ｌ）を示す。
【図５】図５Ａは、図１Ｂで図示されたペリオスチンタンパク質アイソフォームをコードする塩基配列を示す。図５Ｂは、図１Ｂで図示され、且つ図５Ａにコードされるペリオスチンタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、移植された膵星細胞と膵臓の組織学的データを示す。図６Ａ及び６Ｃは、注入から３日後及び１週間後のＧＦＰ発現野生型ドナー細胞の浸入を示している。図６Ａは、図６Ｂにおいて矢印で示された部位の拡大図である。図６Ｄ−Ｆは、間葉系細胞を注入された膵臓は以下の様相を呈することを示している：（Ｄ）Ｅ−カドヘリン及びＮｇｎ３を発現する管状複合体の形成、（Ｅ）サイトケラチン−７陽性管構造の周囲のＧＦＰ発現細胞、及び（Ｆ）Ｐｄｘ１は発現していないＧＦＰ発現細胞。
【図７】図７は、直接注射されたペリオスチンが膵臓再生及びインスリン発現に与える影響を図示したものである。７Ａ−Ｇは、（Ａ）ペリオスチン注射から１週間後にＮｇｎ３＋細胞が注射跡近辺に認められること、（Ｂ）インスリンの発現がサイトケラチン−７＋管状複合体構造内に観察されること、（Ｃ）生理的食塩水の注射ではインスリンの発現は検出されないこと、（Ｄ及びＥ）注射から４週間後には、インスリンの発現が導管構造の内部及び周辺に観察されること、（Ｆ）前記インスリン＋細胞塊はグルカゴン発現細胞を含むこと、（Ｇ）前記インスリン＋細胞塊はＮｇｎ３発現細胞を含むこと、を図示している。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、概してペリオスチンを用いた膵臓組織の再生方法を提供する。特定の実施例においては、本発明はペリオスチンを用いたランゲルハンス島の種々の膵細胞の再生方法を提供する。さらなる実施例では、本発明はペリオスチンを用いたランゲルハンス島β細胞の再生方法を提供する。別の実施形態では、本発明は新規アイソフォームをコードする核酸も含めて、ペリオスチンの新規アイソフォームを包含する。
【００１４】
ペリオスチンにはさまざまなアイソフォームが存在する。本発明で使用するにあたって、“アイソフォーム”とは“機能的に類似し、類似しているが同一ではないアミノ酸配列を有し、且つ、異なる遺伝子もしくは同じ遺伝子に由来するが異なるエクソンが除去されたＲＮＡ転写物にコードされる２以上のタンパク質のうちのいずれか”と定義する（Ｍｅｒｒｉａｍ−Ｗｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ＯｎＬｉｎｅ）。
【００１５】
図１に示したように、ペリオスチンをコードする塩基配列は保存されたＥＭＩドメイン（〜７５アミノ酸からなるシステインに富んだ小モジュールで、ＥＭＩＬＩＮファミリータンパク質中に見出されたことから名づけられた）と４つのファシクリンリピート配列からなる。前記カルボキシル末端は多くのエクソンを含んでいる。これらのエクソンがどのようにスプライスアウトされるかによって、ペリオスチンアイソフォームの多様性がもたらされる。
【００１６】
図１及び２は、ネズミ科の既知のペリオスチンアイソフォーム４種類をコードする４種類の塩基配列を図示している。これらの配列はマウスより単離された核酸から決定されたが、他の哺乳類種も類似したペリオスチン遺伝子を有していると信じられている。アイソフォーム１は最も長い既知のペリオスチンアイソフォームで、２３個全てのエクソンを含んでいる（図２では塩基配列ＰＮ１によってコードされている）。アイソフォーム２（図２では塩基配列ＰＮ２によってコードされている）は最初に同定されたペリオスチンアイソフォームタンパク質で、もともとは骨芽細胞特異的因子−２（ＯＳＦ−２）と名付けられたもので、エクソン１７を欠損している。アイソフォーム３はさらに最近ペリオスチン様因子（ＰＬＦ）と名付けられたもので、エクソン１７を含んでいるがエクソン２１は含んでいない（図２では塩基配列ＰＮ３によってコードされている）。アイソフォーム４は現時点で公開されている最も短いペリオスチンアイソフォームで、エクソン２０と２１を含んでいる（図２では塩基配列ＰＮ４によってコードされている）。
【００１７】
本発明は、本願においてＰＡＮＣ（すべて大文字で特定されるタンパク質）と称する、新規であり、５番目のペリオスチンアイソフォームを包含する。ＰＡＮＣは、膵臓再生過程で最も一般的に発現するペリオスチンアイソフォームである。ＰＡＮＣはアイソフォーム４と同様のサイズだが、ダイレクトシーケンスで確認されたように、エクソン１７と２１を欠損している。図１は、ＰＡＮＣ（配列番号１、図１）と上述した４つのネズミペリオスチンアイソフォーム間で異なる部位の塩基配列のアラインメントを示している。よって、本発明は、前記単離されたｐａｎｃ核酸及びＰＡＮＣタンパク質だけでなく、前記ｐａｎｃの核酸配列（小文字全部によって特定されるＤＮＡ）及び前記ＰＡＮＣタンパク質の両方を包含している。
【００１８】
図３は、ヒト組換えペリオスチンタンパク質のアミノ酸配列を示す。図５Ａは、図１Ｂで図示されたネズミのペリオスチンタンパク質アイソフォームをコードする塩基配列（配列番号３）を示す。図５Ｂは、図１Ｂで図示されたネズミのペリオスチンタンパク質アイソフォームのアミノ酸配列（配列番号２）を示しており、該アイソフォームは図５Ａに示された配列にコードされている。
【００１９】
１型糖尿病では前記免疫系が前記膵臓を攻撃するので、投与の一形態として前記ペリオスチン分子は免疫抑制剤と組み合わせて投与してもよい。
【００２０】
定義
本願文脈における“症状又は疾患を治療”という用語は、予防、進行の阻止、もしくは、症状又は疾患の進行遅延を意味する。
本願文脈における“再生”という用語は、細胞数の増加（増殖）、及び幹細胞の新細胞への分化の両方を包含する。膵臓組織の再生は、新しい膵細胞の増殖、星細胞増殖の誘導、及び／又は管状複合体形成を含む。
【００２１】
ペリオスチン核酸分子
本発明のペリオスチン核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はＲＮＡであってよく、また二重鎖でも一重鎖でもよい（すなわち、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれか）。これらの分子の区別もまた本発明の範囲内と考えられ、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、あるいは１またはそれ以上の制限酵素処理によって作り出すことができる。リボ核酸（ＲＮＡ）分子はインビトロ転写反応によって作ることができる。前記核酸配列が、通常生理的条件下で長さとは無関係に可溶性のポリペプチドをコードしているとより好ましい。
【００２２】
本発明に係る核酸分子は、天然の配列、又は天然配列とは異なるが遺伝コードの縮重により同じポリペプチドをコードする配列を含むことができる。さらに、これらの核酸分子はコード配列に限定されることはなく、例えば、コード配列の上流又は下流にある非コード配列の一部分又は全部を含むことができる。
【００２３】
本発明に係る核酸分子は合成（例えば、ホスホラミダイトに基づいた合成法）、又は、哺乳類細胞のような生体細胞から得ることができる。前記核酸はヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、又はネコの核酸でもよい。また、前記種類の核酸間で組み合わせた、又は修飾したヌクレオチドも含まれる。
【００２４】
さらに、本発明に係る単離した核酸分子は、天然には見出されない部分を包含する。それ故、本発明は組換え核酸分子（例えば、ペリオスチンをコードする核酸分子部分がベクター（例えば、プラスミド又はウィルスベクター）、あるいは異種細胞のゲノム（又は同種細胞のゲノムだが本来の染色体上の位置ではない部位）に挿入されたもの）を包含する。
【００２５】
ペリオスチンファミリー遺伝子又はタンパク質は、それぞれペリオスチン関連遺伝子又はタンパク質との相同性に基づいて同定される。例えば、前記同定は配列同一性に基づくことができる。本発明は、単離された核酸分子が（ａ）前記ｐａｎｃの塩基配列（図２）、及び（ｂ）ｐａｎｃの少なくとも３０（例えば、少なくとも５０、１００、１５０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、７００、９００、１１００、１４００、１７００、２０００、２２００、２２５０、２３００、又は２３１０）ヌクレオチドを含む核酸分子（図２）に対して少なくとも５０％（あるいは、５５％、６５％、７５％、８５％、又は９８％）同一であることを特徴とする。
【００２６】
２つの配列間の同一性の割合は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌの数学的アルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３−５８７７（１９９３））を用いて決定することができる。そのようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰプログラムに取り入れられている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０））。ペリオスチンをコードする核酸と相同な塩基配列を得るためのＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、スコア＝１００、ワード長＝１２で、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行われる。ペリオスチンペプチドと相同なアミノ酸配列を得るためのＢＬＡＳＴタンパク質検索は、スコア＝５０、ワード長＝３で、ＢＬＡＳＴＰプログラムを用いて行われる。比較するためのギャップアラインメントを得るには、文献（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，３３８９−３４０２（１９９７））に記載されたようにギャップＢＬＡＳＴが用いられる。ＢＬＡＳＴとギャップＢＬＡＳＴプログラムを併用する場合には、それぞれのプログラムでの規定値（パラメーター）が用いられる（例えば、ＸＢＬＡＳＴとＮＢＬＡＳＴ）。
【００２７】
また、ハイブリダイゼーションも２つの核酸配列間の相同性検定に用いることができる。ペリオスチンをコードする核酸配列又はその一部分は、標準的なハイブリダイゼーション法においてハイブリダイゼーションプローブとして用いることができる。ペリオスチンプローブが試料（例えば、哺乳類細胞）由来のＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズすることは、該試料中にペリオスチンＤＮＡ又はＲＮＡが存在することを示している。ハイブリダイゼーションの条件は当業者に周知であり、分子生物学のカレントプロトコールでもみることができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，６．３．１−６．３．６（１９９１））。穏やかなハイブリダイゼーション条件とは、２倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で３０℃にてハイブリダイゼーションを行った後、０．１％ＳＤＳを含む１倍濃度のＳＳＣ中で５０℃にて洗浄する条件と同等と定義されている。非常に厳しい条件とは、６倍濃度の塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で４５℃にてハイブリダイゼーションを行った後、０．１％ＳＤＳを含む０．２倍濃度のＳＳＣ中で６５℃にて洗浄する条件と同等と定義されている。
【００２８】
また、本発明は（ａ）コード配列及び／又はその相補鎖（すなわち、“アンチセンス”配列）に関わる前記ペリオスチンのいずれかを含むベクター、（ｂ）コード配列に関わる前記ペリオスチンのいずれかを含む発現ベクターで、該ペリオスチンは転写／翻訳調節要素のいずれかに制御されるように連結している発現ベクター、（ｃ）ペリオスチンポリペプチドの他に、レポーター、マーカー、又はペリオスチンと融合したシングルペプチドといったペリオスチンとは無縁の配列をコードしている発現ベクター、及び（ｄ）前記発現ベクター、を含み、それ故本発明に係る前記核酸分子を発現する遺伝子改変宿主細胞（以下参照）、を包含する。
【００２９】
組換え核酸分子は、ペリオスチン又は異種シグナル配列を有するペリオスチンを含むことができる。前記ペリオスチン全長ポリペプチド又はその断片は、上述したような異種シグナル配列又はさらなるポリペプチドと融合させてもよい。同様に、本発明に係る前記核酸分子は、成熟型ペリオスチン又は分泌促進のための外来性ポリペプチドを含む形のペリオスチンをコードすることができる。
【００３０】
上述及び後述する転写／翻訳調節要素は、誘導性及び非誘導性プロモーター、エンハンサー、オペレーター、及び当業者が知る遺伝子発現を駆動もしくは調節する他要素を含むがこれに制限されるものではない。そのような調節要素は、サイトメガロウィルスｈＣＭＶの前初期遺伝子、ＳＶ４０アデノウィルスの初期又は後期プロモーター、ｌａｃシステム、ｔｒｔシステム、ＴＡＣシステム、ＴＲＣシステム、ファージＡの主要オペレーター及びプロモーター、ｆｄコートタンパクの制御領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、及び、酵母のα−接合因子のプロモーターを含むがこれに限定されるものではない。
【００３１】
同様に、前記核酸は、例えばマーカー又はレポーターとして機能する配列のように、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成することができる。マーカー及びレポーター遺伝子の例には、β−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスフォトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジハイドロフォレートレドクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスフォトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼをコードしている）、及び、キサンチングアニンホスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）が含まれる。本発明の実施に伴う多くの標準的方法と同様に、熟練した当業者は、例えばマーカー又はレポーターの機能に役立つ付加的配列のような、さらなる有用な試薬（手立て）に気づくであろう。一般に、前記ハイブリットポリペプチドは最初の部分と２番目の部分を含むと考えられ、前記最初の部分はペリオスチンポリペプチドであり、前記２番目の部分は例えば上述したレポーターあるいは免疫グロブリンの定常領域又は免疫グロブリンの定常領域の一部（例えば、ＩｇＧ２ａ重鎖のＣＨ２及びＣＨ３ドメイン）である。他のハイブリッドは精製を促進するために抗原性タグ又はＨｉｓタグを含むことができる。
【００３２】
本発明に用いてもよい前記発現システムは、本発明に係る前記核酸分子を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質変換されたバクテリア（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（枯草菌））のような微生物、本発明に係る前記核酸分子を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス又はピチア属）、本発明に係る前記核酸分子を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィルス）に感染した昆虫細胞システム、ペリオスチン塩基配列を含む組換えウィルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）又はタバコモザイクウィルス（ＴＭＶ））に感染あるいは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞システム、あるいは、前記哺乳類細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）又は哺乳類ウィルスに由来するプロモーター（例えば、前記アデノウィルス後期プロモーター及びワクシニアウィルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現コンストラクトを内包する哺乳類細胞システム（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞）を含むがこれに限定されるものではない。また、哺乳類から一次的又は二次的に得られ、プラスミドベクターを導入あるいはウィルスベクターに感染した宿主細胞も同様に有用である。
【００３３】
本発明に係るベクターを遺伝子導入又は形質導入された細胞は、例えば、当該分野で周知の方法によって、ペリオスチンポリペプチド又はその抗原断片のインビトロでの大規模又は小規模生産に用いることができる。基本的に、そのような方法は、前記ポリペプチド又は抗原断片の生産を最大にする条件下で前記細胞を培養する工程、及び前記細胞又は前記培養液からそれ（前記ポリペプチド又は抗原断片）を単離する工程を含んでいる。
【００３４】
ペリオスチンタンパク質／ポリペプチド
本発明の、及び本発明で用いられるペリオスチンタンパク質／ポリペプチドは、シグナルペプチドを有するものと有しないものの両方を包含する。それらはまた、組換え型及びアイソフォームも包含する。
【００３５】
前記ペリオスチン分子のアミノ酸配列は、前記ペリオスチン分子の野生型配列と同一であり得る。実質的に前記野生型ペリオスチン配列と同一なポリペプチドもまた包含される。タンパク質に適用する場合、“実質的に同一”という語句は、規定のギャップウェイトを用いてＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムなどでアラインさせた際に、典型的には少なくとも約７０パーセントの配列同一性、あるいは少なくとも約８０、８５、９０、９５パーセント以上の配列同一性を示す２配列を意味してよい。また、前記ポリペプチドのいずれも、欠失、付加、または置換のような変異を含むことができる。必要なのは、前記変異型ペリオスチン分子が、前記野生型ペリオスチン分子が有する野生型ペリオスチン特異的抗体への結合能力の少なくとも５％（例えば、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、１００％又はそれ以上）の能力を有していることだけである。
【００３６】
アミノ酸配列では、同一でないアミノ酸残基はアミノ酸の同類置換によって異なっていてもよい。“同類置換”という語句は、１つのアミノ酸を別のアミノ酸に代える際に、両アミノ酸が共通した特性を有するグループのメンバーである場合をいう。それぞれのアミノ酸間の共通特性を規定する実用的な方法は、相同生物において相当するタンパク質間で標準化したアミノ酸置換率を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ． ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。そのような分析によれば、アミノ酸グループは、グループ内のアミノ酸は互いに優先的に置換し合うのでタンパク質の全体構造に与える影響が最も似通う、と規定されてよい（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ． ａｎｄ Ｒ．Ｈ．Ｓｃｈｉｒｍｅｒ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。このように定義されるアミノ酸グループセットの一例としては、（ｉ）Ｇｌｕ（グルタミン酸）及びＡｓｐ（アスパラギン酸）、Ｌｙｓ（リジン）、Ａｒｇ（アルギニン）、及びＨｉｓ（ヒスチジン）からなる電荷を帯びたグループ、（ｉｉ）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、及びＨｉｓからなる正電荷を帯びたグループ、（ｉｉｉ）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる負電荷を帯びたグループ、（ｉｖ）Ｐｈｅ（フェニルアラニン）、Ｔｙｒ（チロシン）、及びＴｒｐ（トリプトファン）からなる芳香族グループ、（ｖ）ＨｉｓおよびＴｒｐからなる窒素環グループ、（ｖｉ）Ｖａｌ（バリン）、Ｌｅｕ（ロイシン）及びＩｌｅ（イソロイシン）からなる大きな脂肪族非極性グループ、（ｖｉｉ）Ｍｅｔ（メチオニン）及びＣｙｓ（システイン）よりなる微極性グループ、（ｖｉｉｉ）Ｓｅｒ（セリン）、Ｔｈｒ（スレオニン）、Ａｓｐ（アスパラギン酸）、Ａｓｎ（アスパラギン）、Ｇｌｙ（グリシン）、Ａｌａ（アラニン）、Ｇｌｕ（グルタミン酸）、Ｇｌｎ（グルタミン）、及びＰｒｏ（プロリン）からなる小残基グループ、（ｉｘ）Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、及びＣｙｓからなる脂肪族グループ、及び（ｘ）Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる小ヒドロキシルグループ、が含まれる。
【００３７】
前記ポリペプチドは自然物（例えば、血液、血清、血漿、又は膵臓、肺、胎盤といった組織や細胞、又は結腸組織、あるいはペリオスチンポリペプチドを自然に産生するすべての癌性もしくは正常細胞）から精製することができる。前記ペリオスチン分子はヒト、非ヒト霊長類（例えば、サル）、マウス、ラット、モルモット、ウシ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、又はネコのペリオスチン分子であってよい。また、便利なことに、小ペプチド（１００アミノ酸長未満）は通常の化学的手法によって合成することができる。加えて、ポリペプチド及びペプチドはともに、適切なポリペプチド又はペプチドをコードする塩基配列を用いた標準的なインビトロ組換えＤＮＡ技術及びインビボ遺伝子組換え技術によって産生することができる。関連するコード配列及び適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターの作製には、当業者に周知の方法を用いることができる。例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールドスプリングハーバー研究所、Ｎ．Ｙ．（１９８９））、及び、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載された技術を参照するとよい。
【００３８】
組換えペリオスチンは本発明に係る方法に用いることができる。本発明に有益な組換えペリオスチンの例を図３に示す。
【００３９】
また、本発明に係るタンパク質及びポリペプチドは、上述した核酸分子のいずれからも従来技術を用いて産生することができる。
【００４０】
本発明に係るポリペプチドは全長ペリオスチン断片を含み、そのような断片は膵臓組織を再生することができる。そのようなペリオスチン断片は、ペリオスチンタンパク質の少なくとも１５（又は３０、５０、１００、あるいは１５０）の連続したアミノ酸配列を含んでよい。前記ポリペプチド断片は、他の部分がない状態でも生物学的にアクティブとなるペリオスチン部分を含み得る。従来技術において周知であるように、比較的少数のアミノ酸はしばしば（タンパク質の）活性を破壊することなく、タンパク質の一端から除去することができる。
【００４１】
前記ポリペプチド又はポリペプチド断片は、２つ目のタンパク質又はポリペプチドと遺伝的に融合したような、より大きなタンパク質の一部であってもよい。あるいは、前記ポリペプチド又はポリペプチド断片は、例えば架橋剤を用いることで、２つ目のタンパク質に結合していてもよい。
【００４２】
ペリオスチン又はその一部のポリペプチドは、ポリマーとの共有結合によって化学的に修飾することができる。例えば、ペリオスチンの循環半減期を伸ばすためにこのような修飾を行ってもよい。ポリマー及びそれらをペプチドに結合する方法は、米国特許４，７６６，１０６、４，１７９，３３７、４，４９５，２８５、及び４，６０９，５４６に示されている。ポリマーの例としては、ポリオキシエチレン化ポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）がある。ＰＥＧは室温で水に可溶性で、Ｒ（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎＯ−Ｒの一般式を有しており、式中Ｒは水素もしくはアルキル基又はアルカノール基のような保護基であり得る。前記保護基は１〜８の炭素を有してよく、メチル基であってもよい。前記記号ｎは正の整数で、一般には１〜１，０００、あるいは２〜５００である。前記ＰＥＧは一般には平均分子量が１０００〜４０，０００であり、２０００〜２０，０００又は３，０００〜１２，０００であってもよい。ＰＥＧは少なくとも１つのヒドロキシ基を有してよく、末端にヒドロキシ基を有していてもよい。
【００４３】
製剤処方と投与経路
ペリオスチンタンパク質又はその断片を含む医薬組成物は、膵機能不全の治療に用いてもよい。別の形態では、医薬組成物は本発明に則ったペリオスチン塩基配列を含んでもよい。
【００４４】
本発明に係る組成物は、経口、口腔、経鼻、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、又は皮下投与）、局所、又は直腸投与に適した１以上の薬学的に許容し得る担体を用いた通常の方法で、あるいは吸入投与に適した形で処方してよい。前記組成物は膵臓内、血液循環系内、又は腹腔内に直接注射してもよい。前記投与は、前記組成物を含むゲル又はマトリクスの外科的挿入でも可能である。
【００４５】
液剤を用いる場合には、前記ポリペプチド又は核酸は異なる濃度に処方してよく、あるいは異なる剤を用いてもよい。例えば、これらの剤は油、ポリマー、ビタミン、炭化水素、アミノ酸、塩、バッファー、アルブミン、界面活性剤、又は増量剤を含んでよい。炭化水素には、糖、もしくはモノ−、ジ−、又はポリサッカライド等の糖アルコール、あるいは水溶性グルカンが含まれる。前記サッカライド又はグルカンは、フルクトース、デキストロース、ラクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、スクロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、アルファ及びベータシクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルスターチ、及びカルボキシメチルセルロース、もしくはそれらの混合物を含むことができる。スクロースはその一例である。糖アルコールは１つのＯＨ基を有するＣ４からＣ８の炭化水素と定義され、ガラクチトール、イノシトール、マンニトール、キシリトール、ソルビトール、グリセロール、及びアラビトールを包含する。マンニトールはその一例である。上述したこれらの糖又は糖アルコールは、単独でも、組み合わせて用いてもよい。前記糖又は糖アルコールが水系調整において可溶性である限り、使用量に定まった制限はない。前記糖又は糖アルコール濃度は一般に１．０ｗ／ｖ％〜７．０ｗ／ｖ％であり、２．０〜６．０ｗ／ｖ％でもよい。アミノ酸は左旋性カミチン、アルギニン、及びベタインを含むが、他のアミノ酸を加えてもよい。ポリマーは、平均分子量２，０００〜３，０００のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）又は平均分子量３，０００〜５，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を包含する。バッファーは前記液中のｐＨ変動を最小にするために、使用するのであれば、凍結乾燥前又は再構成後にもっぱら前記組成物において使用される。生理学的バッファーならおよそどのバッファーを使用してよいが、クエン酸、リン酸、コハク酸、及びグルタミン酸バッファー、もしくはそれらの混合物が一般的である。前記濃度は０．０１から０．３モル濃度でよい。また、前記処方には界面活性剤を加えることもできる。
【００４６】
前記液状医薬組成物を調整した後は、分解を防止し無菌状態を保つために、前記液状組成物を凍結乾燥してもよい。液状組成物を凍結乾燥する方法は当業者に周知である。前記組成物は使用直前に滅菌した希釈剤（例えば、リンガー液、蒸留水、又は滅菌した生理的食塩水）で再構成するとよく、該希釈剤はさらなる成分を含んでいてもよい。再構成後はすぐに前記組成物を当業者に周知の方法で被験者に投与するのが好ましい。
【００４７】
本願における“薬学的に許容される賦形剤”とは、概して安全で毒性がなく、生物学的もしくは他の意味においても不都合でない医薬組成物の調整に有用な賦形剤を意味しており、ヒトへの薬学的用途と同様に獣医学的用途にも許容される賦形剤を包含している。本願明細書及び特許請求の範囲で用いているように、“薬学的に許容される賦形剤”には１及び１以上の前記賦形剤が含まれる。
【実施例】
【００４８】
外科的手法
すべての外科的手法において、該外科処置の４５分から１時間前に、マウスに０．０５ｍｇ／ｋｇの希釈したブプレノルフィン（０．０３ｍｇ／ｍｌ）を皮下注射した。マウスは、麻酔箱中でイソフルラン濃度を徐々に５％に上げることで麻酔状態にした。前記麻酔薬はＯｈｉｏ Ｆｏｒａｎｅ気化器（誘導箱）及びイソフルラン吸入器（マスク）によって送達した。一旦麻酔されると、前記マウスにはイソフルラン１．５％の顔マスクを装着した。前記外科手術部位は体毛を剃り、エンデュア石鹸で清浄し、滅菌水ですすいだ後、クロラヘクスセプティック液で外科的処置を施した。麻酔中に前記動物の目が乾燥するのを防ぐために、ＢＮＰ眼軟膏剤を前記動物の目に塗った。外科手術に先立って、１ｍｌの生理的食塩水を皮下注射した。外科手術中、前記マウスは（必要に応じて増減したが）イソフルラン１．５％中に維持した。前記外科手術が完了すると、前記マウスを約１分間酸素中に置き、その後動き始めるとすぐにケージに戻した。
【００４９】
膵臓組織を摘出するために、腹腔への到達は正中切開により行った。まず、１０番の外科用メスの刃を用いて、腹の中央の皮膚を１〜１．５ｃｍ切開した。鉗子を用いて前記皮膚を前記腹壁から丁寧に剥がし、前記腹部の正中線をあらわにした。ラット用歯鉗子を用いて前記正中線を持ち上げ、ハサミで体壁を１ｃｍ未満に微小切開した。脾臓に接した膵臓の葉があった場合には、前記切開部にて鉗子を用いて前記葉を持ち上げた。前記脾臓葉の全てと胃及び十二指腸に接した膵臓葉の末端部を、鉗子と綿棒を用いた穏やかな掻爬によって除去し、主だった静脈と動脈が損傷していないことを確認した。過剰な出血が認められた場合には、止血を促すために前記出血部位を数分間クランプした。除去した後には、前記膵臓のごく一部（〜３０％）だけが前記十二指腸に沿って残っていた。外科的に摘出した前記膵臓は全膵臓の約７０％であり、このことは予備実験において摘出及び残存した前記組織部分の重さを測定することで確認した。前記体壁は、外科手術用縫合絹糸（ジョンソン＆ジョンソン社製）で不連続に２〜３回縫合することで閉じた。前記皮膚は、外科用ステープル（フィッシャー社製）で２〜３回止めることで閉じた。前記外科手術が完了すると、前記マウスを約１分間酸素中に置き、その後動き始めるとすぐにケージに戻した。血糖値は、グルコース増加に対する血糖の値を調べることで一日おきに解析した。さらに、マウスには外科手術後の最初の１週間、０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを毎日皮下注射した。
【００５０】
試験例１ 組換えペリオスチンを用いた膵臓再生
ペリオスチンが膵臓再生において果たす役割を明らかにするために、組換えペリオスチンタンパク質を前記膵臓に注射した。組換えペリオスチンタンパク質（バイオベンダー社より購入、ＲＤ１７２０４５１００）は生理的食塩水を用いて１０ｎｇ／μｌの濃度に溶解及び希釈した。前記組換えペリオスチンタンパク質（図３に示した６７１アミノ酸配列）はＣ末端が欠損したヒトのペリオスチンタンパク質であり、前記４種類の既知アイソフォームすべてに共通した配列を代表している。１０μｌ(１００ｎｇ又は５μｇ／ｋｇ)を直接膵臓内へ注射した。直接注射は、上述した通り前記膵臓を正中切開で露出し、ハミルトン注射器を用いて１０μｌの組換えペリオスチン液を前記膵臓内へ直接注射することで行った。溶媒投与動物には、生理的食塩水で希釈した上記と同量の溶媒を注射した。前記膵臓へ注射後、膵切除術後に行われるように前記体壁を縫合によって閉じ、前記皮膚は創傷クリップで閉じた。術後１週間はマウスを毎日観察し、０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを毎日皮下投与した。前記外科手術後に、分裂細胞を継続的に標識するために、ＢｒｄＵ（シグマ社製）を濃度０．８ｍｇ／ｍｌとなるように飲料水中に投与した。
【００５１】
前記注射から２４時間後、生理的食塩水を注射したコントロールと比べて、ペリオスチンは広域に及ぶ細胞増殖を誘導した。組織学によって、前記増殖は島、管、及び腺房細胞以外の部位で起きており、ビメンチン発現細胞に局在していることが示された。再生過程では、ペリオスチンは、サイトケラチン７及びＥｃａｄ陽性管状複合体の周囲にある膵臓再生端に局在する。これらの複合体は、Ｋｉ６７の免疫染色によって示されるように、膵臓における細胞増殖の源である。定常状態の膵臓におけるペリオスチンｍＲＮＡに比べて、ペリオスチンｍＲＮＡは膵切除後３日で１０倍近く増加する。これは、胎生期の発生における増加がわずか３倍であることの比ではない。
【００５２】
ペリオスチン注射から３日後、ビメンチン発現細胞の数は大幅に増加した。この増加は管状複合体のある領域に局在しており、前記膵臓の他の領域では通常レベルのビメンチンを発現していた。しかし、ペリオスチン注射から３日後にはビメンチン発現細胞はもう増殖してなく、サイトケラチン７を発現する管状複合体では増殖していた。前記管状複合体は管、島、及び腺房細胞と同様にＥ−カドヘリンを発現していたが、Ｋｉ６７の免疫染色の増加で示されるように増殖が亢進していた。また、前記管状複合体は、膵臓前駆細胞のマーカーであるＰｄｘ−１及びＮｇｎ３も発現していた。Ｎｇｎ３細胞は管状複合体の外側にも認められたが、近傍には認められなかった。管状複合体を構成する遠位部には、Ｎｇｎ３陽性細胞は存在しなかった。
【００５３】
ペリオスチン注射から１週間後、前記実質細胞は、生理的食塩水を注射した膵臓と比べると、Ｅ−カドヘリン陰性細胞の蓄積で示されるように増加していた。前記ペリオスチンを注射した膵臓ではごくわずかの管状複合体しか残存していなかったが、前記生理的食塩水を注射したコントロールと比べて増殖は広域に及んでいた。しかし、この時点では、増殖は管状複合体に限らず、Ｅ−カドヘリン発現細胞でも起きていた。増殖はアミラーゼを発現している腺房細胞でも認められたが、その周囲の実質では認められなかった。前記周囲の実質はＢｒｄＵの蓄積を呈しており、その幅は１０μｍ〜３００μｍと大きさが異なっていた。前記実質の蓄積のうちで最大のものはＥ−カドヘリン陽性管状複合体をいくらか含んでいたが、ペリオスチン注射から３日後よりは多くなかった。マウスの体重辺り５００μｇより多い投与量（５００μｇ／ｋｇ体重）では、膵臓、特にアミラーゼを分泌する外分泌細胞において、細胞死が増加する結果となった。
【００５４】
試験例２ 腹腔内注射による膵臓再生
ペリオスチンを侵襲性の低い方法で投与しても膵臓再生が誘導されるのかどうかを確認するために、前記組換えタンパク質（バイオベンダー社製、ＲＤ１７２０４５１００）を、前記膵臓内への直接注射法とは対照的に、体重辺り５０μｇ（５０μｇ／ｋｇ体重）を腹腔内注射によって注入した。ペリオスチン注射から１週間後、生理的食塩水を注射したコントロールに比べて、島細胞によるＢｒｄＵ取り込みの増加が認められた。さらに、（ペリオスチン注射した）島内部では、Ｋｉ６７の染色で示される細胞増殖が生理的食塩水を注射したコントロールに比べて亢進していた。ペリオスチン又は生理的食塩水を注射したＭＩＰ−ＧＨＰマウスのＦＡＣＳ解析によって、（ペリオスチン注射した該マウスでは）インスリンを分泌しているβ細胞数が約２倍増加していることが観察された（ｎ＝３）。ペリオスチンを注射したマウスと生理的食塩水を注射した同腹子コントロールを比較することで、膵臓β細胞の数が２倍以上増加することが明らかとなった。
【００５５】
試験例３ 組換えペリオスチンを用いた、ＳＴＺ誘発性糖尿病における膵臓再生
ストレプトゾソシン（ＳＴＺ）は哺乳類の膵臓β細胞を選択的に標的とし破壊する。それは、１型糖尿病の動物モデル作製に用いることができる。マウスに糖尿病を誘発するために、Ｃｒａｖｅｎ（Ｃｒａｖｅｎ，Ｐ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２００１））が記載したＣ５７ＢＬ／６Ｊの遺伝的背景において、前記マウスがＧｒｏｓｓ（Ｇｒｏｓｓ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５１，２２２７−３２（２００２））が記載した糖尿病の症状を呈するまで、１００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを一日おきに腹腔内注射した。その最初のＳＴＺ注射（０日目）以降、血糖値を毎日計り、前記マウスの糖尿病状態を判断した。別のプロトコールでは、血糖値を一日おきに解析しながらマウスに一日あたり５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを５日間注射することで糖尿病を誘発した。糖尿病マウスには、該マウスの健康と寿命を改善する必要に応じてインスリンを投与した。
【００５６】
ペリオスチンがＳＴＺ誘発性糖尿病を予防できるかどうかを判断するために、ＳＴＺ投与に続いて組換えペリオスチン（バイオベンダー社製、ＲＤ１７２０４５１００）をマウスに注射した。ＳＴＺ投与マウスには、前述したＳＴＺ注射に続いて、体重あたり１０ｍｇ／ｋｇから９０ｍｇ／ｋｇまでのさまざまな濃度の組換えペリオスチンを腹腔内注射（ＩＰ）した。血糖値は一日おきに解析した。もしペリオスチン投与マウスが正常血糖レベルを維持し、ペリオスチン非投与の同腹マウスが糖尿病になれば、ペリオスチンはＳＴＺ誘発性糖尿病を予防すると判断することにした。ＳＴＺとペリオスチンを共投与した場合には、１５匹のうち１１匹の動物が正常血糖レベルを維持した（図４）。また、この実験によって、マウスに腹腔内投与するペリオスチンの至適用量は３０〜７０ｍｇ／ｋｇ体重であることが示唆された。マウスに腹腔内投与するペリオスチンの好ましい用量は、４０〜６０ｍｇ／ｋｇ体重と考えられる。
【００５７】
試験例４ ＰＡＮＣペリオスチンアイソフォームをコードするＤＮＡの単離
膵臓組織は液体窒素中で急速冷凍し、氷冷した乳鉢と乳棒を用いて直ちに粉砕した。前記細粉化膵臓組織は解凍前に１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ試薬（インビトロジェン社製、製品番号１５５９６−０１８）と混合した。そして、前記製造元の使用説明書に従い、前記膵臓組織由来ＲＮＡを抽出した。
【００５８】
ＲＮＡ試料は前記ＲＮＡ ＰＣＲ コアキット（アプライドバイオシステムズ社製、製品番号Ｎ８０８−０１４３）を用いて前記製造元の使用説明書に従って逆転写した。前記キットに含まれるオリゴｄ（Ｔ）ｓ及びランダムヘキサマーの両プライマーを用いて、前記ｃＤＮＡ合成のための逆転写（ＲＴ）反応を開始した。
【００５９】
上述の方法に従い作製したｃＤＮＡから前記ペリオスチンＣ末端を増幅する前記ＰＣＲ反応には、下記の試薬が含まれる：ｃＤＮＡ ５μｌ、５０ｎＭ フォワードプライマー ＡＡＡＣＴＣＣＴＣＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡ（配列番号４）、５０ｎｍ リバースプライマー ＡＡＣＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣＧＴＣＴ（配列番号５）、５００ｎｍ ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５μｌ １０倍濃度反応バッファー、及び０．２５μｌ ＴＡＱポリメラーゼ（インビトロジェン社製、製品番号１０３４２−０２０）。前記反応液は５０μｌになるように希釈した。前記ＰＣＲ反応の運転条件は次の通りである：２５サイクル（９５℃で６０秒、６０℃で６０秒、及び７２℃で６０秒）。その後、前記反応液は２％アガロースゲル上で展開し、４６２ｂｐの位置に検出される明瞭なバンドを清潔な外科用メスを用いて前記ゲルから切り出した。前記ＤＮＡ断片は、前記ＱＩＡｑｕｉｃｋ ゲル抽出キット（キアゲン社製、製品番号２８７０６）を用いて前記製造元の使用説明書に従い、前記ゲルから抽出した。抽出後、前記ＤＮＡ断片は上述したフォワード及びリバースプライマーを用いて独立した反応系でシークエンスした。さらに具体的には、Ｓｔｅｍｃｏｒｅ研究所（ＯＨＲＩ、オタワ、ＯＮ）にてアプライドバイオシステムズ社の３７３０ ＤＮＡアナライザーを使用して１０ｎｇのＰＣＲ鋳型をシークエンスするのに、２μＭのプライマーを用いた。
【００６０】
試験例５ 注射したペリオスチンの安全性
ペリオスチンが安全に投与できるのかどうか確認するために、０、２、４、又は１０μｇ／ｋｇ体重の前記組換えペリオスチン（バイオベンダー社製、ＲＤ１７２０４５１００）を、８週齢のマウスに週に一度、６週間に渡って腹腔内投与した。１３週までに、視覚的に認識できる腫瘍は検出されなかった。各マウスの血糖値は週一回の頻度でモニターした。各グループごとのマウスの平均血糖値（６匹／グループ、ｍＭ／Ｌで表記）を下記表１に示す。標準偏差は０．３１〜２．０６ｍＭ／Ｌの範囲であった。
【００６１】
【表１】
【００６２】
試験例６ 星細胞はペリオスチンを発現し、膵臓再生を仲介する
星細胞が膵臓再生過程におけるペリオスチン供給細胞であるのかどうかを判断するために、前記成人の膵臓から、ペリオスチン発現細胞を高純度に含む細胞集団を精製した。前記精製されたペリオスチン発現細胞集団は、（１）前記再生途中の膵臓では、ペリオスチンはビメンチン及び幹細胞抗原−１（Ｓｃａ１／Ｌｙ６Ａ）共発現細胞において発現されるという観察、及び（２）標準的な蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）プロトコールを用いた前記膵臓残余からのＳｃａ１発現生細胞の単離（蛍光色素を結合したＳｃａ−１特異的抗体（ｅバイオサイエンス社製、１７−５９８１）を使用）、により回収した。標準的ＦＡＣＳプロトコールは、（ＣＤ３１及び）Ｓｃａ１も発現する内皮細胞を除去するために、ＣＤ３１−細胞の同定に用いた（蛍光色素を結合したＣＤ３１特異的抗体（ｅバイオサイエンス社製、１２−０１１２）を使用）。
【００６３】
前記ＦＡＣＳで精製したＳｃａ１＋／ＣＤ３１−細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ培地中で培養し増殖させた。培養系では、前記Ｓｃａ１＋／ＣＤ３１−細胞は膵臓星細胞の形態及びマーカー（ビメンチン＋、平滑筋アクチン＋、デスミン＋、ネスチン＋、ＧＦＡＰ＋、サイトケラチン−７−、Ｅ−カドヘリン−、アミラーゼ−、及びインスリン−）を示した。ペリオスチン−ＬａｃＺヘテロ接合アリルの発現は、Ｓｃａ１＋細胞に限定するフルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）染色及びフローサイトメトリーによって確認した。さらに、標準的な定量的ＰＣＲプロトコールによって、前記培養下のＳｃａ１＋／ＣＤ３１−細胞がペリオスチンｍＲＮＡを発現していることが確認された。これらの結果は、前記膵星細胞は、膵臓再生過程における前記ペリオスチンの細胞性供給源であることを示している。
【００６４】
試験例７ 間葉系星細胞は膵臓再生を誘導する
レンチウィルス−ＧＦＰを感染させたＳｃａ１＋星細胞は、受容マウスの膵臓に直接注入した（１×１０４細胞／マウス）。野生型星細胞は、前記受容マウスの膵臓に浸入し、管状複合体形成及びＮｇｎ３前駆細胞とＰｄｘ１発現膵島細胞の産生を誘導することが観察された。標準的プロトコールに従った抗ＧＦＰ抗体（インビトロジェン社製、Ａ２１３１１）染色によって、注入後２週間で、ドナー細胞が内分泌組織中に分散していることが明らかとなった。ＧＦＰ発現ドナー細胞を含む部位は、Ｎｇｎ３を発現する管状複合体も含んでいた。サイトケラチン−７、Ｐｄｘ−１のいずれもＧＦＰと共局在しなかったので、管状複合体はドナー細胞を含んでいなかった。
【００６５】
図６は、膵星細胞を移植した前記膵臓の組織学を示している。図６Ａ及び６Ｃはそれぞれ、注入から３日後及び１週間後のＧＦＰ発現野生型ドナー細胞の浸入を示している。図６Ａは図６Ｂにおいて矢印で示された部位の拡大図である。図６Ａの縮尺バーは５００μｍだが、図６Ｂの縮尺バーは１ｍｍである。図６Ｄ−Ｆは、野生型細胞を注入された膵臓が下記の様相を呈したことを示している：（Ｄ）Ｅ−カドヘリン及びＮｇｎ３を発現する管状複合体の形成、（Ｅ）サイトケラチン−７導管構造の周囲にＧＦＰ発現細胞があること、及び（Ｆ）ＧＦＰ発現細胞がＰｄｘ１を発現していないこと。
【００６６】
試験例８ ペリオスチンによって誘導される膵臓再生及びインスリン発現
ＳＴＺ投与した糖尿病マウスにおいてペリオスチンが膵臓再生を誘導するかどうかを判断するために、上述したプロトコールに従い、ＳＴＺを毎日、５日間注射した。１週間後、上述したプロトコールに従い、組換えペリオスチンを前記マウスの膵臓に直接注射した（５ｍｇ／ｋｇ体重）。前記ペリオスチン注射から１週間後、導管細胞内部でのインスリン発現とともに、管状複合体の形成及びＮｇｎ３を発現する前駆細胞の産生が認められた。前記ペリオスチン注射から４週間後には、標準的な組織学的手法によっても、導管内及び導管周囲の細胞塊でインスリン発現が確認された。前記細胞塊はインスリン及びグルカゴンがともに陽性で且つＮｇｎ３をまだ発現している細胞を含んでおり、前記細胞塊が未成熟な膵島であることを示唆している。
【００６７】
図７Ａ−Ｇは、（Ａ）ペリオスチン注射から１週間後に、Ｎｇｎ３＋細胞が注射跡近辺に認められること、（Ｂ）インスリンの発現がサイトケラチン−７＋管状複合体構造内に観察されること、（Ｃ）生理的食塩水の注射ではインスリンの発現は検出されないこと、（Ｄ及びＥ）注射から４週間後には、インスリンの発現が導管構造の内部及び周辺に観察されること、（Ｆ）前記インスリン＋細胞塊はグルカゴン発現細胞を含むこと、（Ｇ）前記インスリン＋細胞塊はＮｇｎ３発現細胞を含むこと、を図示している。
【００６８】
本発明の実施例を完全に理解させるために、先の記述では、説明を目的として多くの詳細を記載した。しかしながら、本発明の実施にあたりこれらの具体的詳細は必要ないことは、当業者の目には明らかであろう。上述した本発明の実施例は単なる例の開示に過ぎない。当業者によって、本書に添付した特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、本願の個々の実施例に変更、修飾、及び変形を加えることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペリオスチンを含むことを特徴とする、膵臓組織を再生するための組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記ペリオスチンが図３によって与えられるアミノ酸配列を有する、又はｐａｎｃの塩基配列を有するヌクレオチドにコードされる組換えペリオスチンである組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物において、前記再生した膵臓組織がβ細胞を含む組成物。
【請求項４】
インスリン依存性糖尿病の治療を目的とした、請求項１−３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
注射投与用に処方された、請求項１−４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物において、前記注射が腹腔内、血液循環系内、又は前記膵臓組織内への直接注射である組成物。
【請求項７】
請求項１−４のいずれかに記載の組成物において、前記ペリオスチンを含む外科的挿入用ゲル又はマトリックス用として処方された組成物。
【請求項８】
請求項１−４のいずれかに記載の組成物において、前記再生した膵臓組織がインスリンを分泌する組成物。
【請求項９】
ペリオスチンタンパク質をコードする塩基配列を含む、膵臓組織を再生するための組成物。
【請求項１０】
下記の配列を含むことを特徴とする、ペリオスチンタンパク質をコードする塩基配列：
ｐａｎｃ、
ｐａｎｃに相同的な塩基配列、又は
ｐａｎｃに相補的な塩基配列にハイブリダイズする塩基配列。
【請求項１１】
請求項１０に記載の塩基配列を含むことを特徴とする、膵臓組織を再生するための組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のペプチドを含む、膵臓組織を再生するための組成物。
【請求項１４】
下記を含むことを特徴とする組換えベクター：
ｐａｎｃ、
ｐａｎｃに相同的な塩基配列、又は
ｐａｎｃに相補的な塩基配列にハイブリダイズする塩基配列。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
ペリオスチン、請求項１０に記載の塩基配列、又は請求項１２に記載のペプチドを含む、糖尿病又は膵外分泌機能不全の治療又は予防のための組成物。
【請求項１７】
ペリオスチン、請求項１０に記載の塩基配列、又は請求項１２に記載のペプチドを含む、糖尿病又は膵外分泌機能不全の治療又は予防のための薬剤製品。
【請求項１】
ペリオスチンを含むことを特徴とする、膵臓組織を再生するための組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記ペリオスチンが図３によって与えられるアミノ酸配列を有する、又はｐａｎｃの塩基配列を有するヌクレオチドにコードされる組換えペリオスチンである組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の組成物において、前記再生した膵臓組織がβ細胞を含む組成物。
【請求項４】
インスリン依存性糖尿病の治療を目的とした、請求項１−３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
注射投与用に処方された、請求項１−４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
請求項５に記載の組成物において、前記注射が腹腔内、血液循環系内、又は前記膵臓組織内への直接注射である組成物。
【請求項７】
請求項１−４のいずれかに記載の組成物において、前記ペリオスチンを含む外科的挿入用ゲル又はマトリックス用として処方された組成物。
【請求項８】
請求項１−４のいずれかに記載の組成物において、前記再生した膵臓組織がインスリンを分泌する組成物。
【請求項９】
ペリオスチンタンパク質をコードする塩基配列を含む、膵臓組織を再生するための組成物。
【請求項１０】
下記の配列を含むことを特徴とする、ペリオスチンタンパク質をコードする塩基配列：
ｐａｎｃ、
ｐａｎｃに相同的な塩基配列、又は
ｐａｎｃに相補的な塩基配列にハイブリダイズする塩基配列。
【請求項１１】
請求項１０に記載の塩基配列を含むことを特徴とする、膵臓組織を再生するための組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の塩基配列にコードされるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のペプチドを含む、膵臓組織を再生するための組成物。
【請求項１４】
下記を含むことを特徴とする組換えベクター：
ｐａｎｃ、
ｐａｎｃに相同的な塩基配列、又は
ｐａｎｃに相補的な塩基配列にハイブリダイズする塩基配列。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
ペリオスチン、請求項１０に記載の塩基配列、又は請求項１２に記載のペプチドを含む、糖尿病又は膵外分泌機能不全の治療又は予防のための組成物。
【請求項１７】
ペリオスチン、請求項１０に記載の塩基配列、又は請求項１２に記載のペプチドを含む、糖尿病又は膵外分泌機能不全の治療又は予防のための薬剤製品。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図３】
【図４】
【図５−Ａ】
【図５−Ｂ】
【図６】
【図７】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−３】
【図３】
【図４】
【図５−Ａ】
【図５−Ｂ】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１２−５０１９７６（Ｐ２０１２−５０１９７６Ａ）
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５２５３８０（Ｐ２０１１−５２５３８０）
【出願日】平成２１年９月８日（２００９．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１２２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５５５５
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５０５０５０５５５）オタワ ホスピタル リサーチ インスティテュート (11)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１月２６日（２０１２．１．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月８日（２００９．９．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１２２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０２５５５５
【国際公開日】平成２２年３月１１日（２０１０．３．１１）
【出願人】（５０５０５０５５５）オタワ ホスピタル リサーチ インスティテュート (11)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]