ボルデテラの検出アッセイ
ＩＳ４８１およびＩＳ１００１ゲノム挿入配列の存在を検出することによりそれぞれ百日咳菌およびパラ百日咳菌を検出するための方法および組成物が開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，病原体の検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の本発明の背景に関する記載は，単に読者の本発明に関する理解を促進するために提供するものであり，本発明に対する従来技術を記述または構成すると認めるものではない。
【０００３】
百日咳は，伝染性の強い呼吸系の疾病である。百日咳の症状としては，激しい咳および続く吸入フープ，時には嘔吐のエピソードがある。極端な場合には，これらの症状は低酸素症，永久脳障害，さらには死亡につながる。大部分の症例（８０−９８％）は，小さいグラム陰性の細菌である百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）により引き起こされるが，少ないが無視できない数の症例（２−２０％）はパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）により引き起こされる（Ｍａｔｔｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１８：３２６−３８２，２００５）。パラ百日咳菌により引き起こされる百日咳の症状は，典型的には百日咳菌により引き起こされるものより軽いが，臨床兆候のみに基づく鑑別診断は困難である。まれに，Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａまたはＢ．ｈｏｌｍｅｓｉｉの感染により引き起こされる百日咳様の症状がある。
【０００４】
百日咳をその初期に診断することは，兆候および症状が他の一般的呼吸器疾患，例えば，風邪，インフルエンザ，または気管支炎と似ているため，困難である。伝統的には，百日咳を決定的に診断するために細菌の培養が用いられてきた。患者の鼻および／または喉から粘液を採取し，培養のために医学実験室に送る。陽性の結果は決定診断であると見なされるが，ボルデテラ属の培養には，診断が得られるまで典型的には５から７日間を要する。また，ボルデテラ属の細菌の培養は，細菌の難しい性質のため偽陰性の結果を生じやすい。
【０００５】
抗体アッセイ，例えばＥＬＩＳＡも，特徴的な細菌抗原を検出することによりボルデテラ種を診断するために用いられている。最も一般的には，ボルデテラ感染を示すために，百日咳毒素蛋白質の検出が用いられている。これらの抗体に基づくアッセイは良好な感度および特異度を有するが，これらは典型的には，非侵襲的に採取した粘膜サンプルではなく患者血液のサンプルを必要とし，さらに，感染が初期および／または回復期であることを必要とする。したがって，これらのアッセイは，疾病経過の適切な時に患者サンプルを取得しないと，偽陰性の結果を生じやすい。
【０００６】
ボルデテラ感染を検出する別の方法としては，直接蛍光抗体（ＤＦＡ）試験および種々のＰＣＲ系の方法がある。ＤＦＡ試験は，非侵襲的に取得した粘膜サンプルを用いてボルデテラを検出することができるという利点を有するが，感度があまり高くない。ＰＣＲ系のアッセイは広く用いられるようになってきている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】（Ｍａｔｔｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１８：３２６−３８２，２００５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は，生物学的サンプルにおいて百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の存在または非存在を判定するための組成物および方法を提供する。本発明は，単独で，または臨床症状または他の指標と組み合わせて，百日咳について個体を診断するために用いることができる。詳細には，本発明は，サンプル中で細菌の核酸の存在を検出することにより，百日咳を引き起こすことが知られている病原性細菌（ボルデテラ種）の検出を可能とする。検出の方法論は，細菌のゲノム中において細菌感染の有用な指標である特定の標的配列を発見したことに基づく。
【０００９】
したがって，１つの観点においては，本発明は，生物学的サンプルにおいて，
（ａ）配列番号２またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ４８１標的核酸，および
（ｂ）配列番号８またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ１００１標的核酸
の存在または非存在を検出することにより，百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の存在または非存在を判定する方法を提供し，ここで，前記ＩＳ４８１標的核酸の存在は百日咳菌の存在を示し，前記ＩＳ１００１標的核酸の存在はパラ百日咳菌の存在を示す。
【００１０】
ある態様においては，ＩＳ４８１標的核酸およびＩＳ１００１標的核酸の一方または両方を増幅する（例えばＰＣＲにより）。
【００１１】
別の態様においては，本発明の方法は下記の工程を含む：
（ａ）ＩＳ４８１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適した第１のプライマー対を用意し，およびＩＳ１００１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適した第２のプライマー対を用意し，
（ｂ）ＩＳ４８１標的核酸がサンプル中に存在する場合には第１の反応生成物が生成し，ＩＳ１００１標的核酸がサンプル中に存在する場合には第２の反応生成物が生成するのに適した条件下で，工程（ａ）のプライマー対を含むマルチプレックスプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号２またはその相補体のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有する第１の反応生成物の存在または非存在を検出することにより，百日咳菌の存在または非存在を判定し，および／または，配列番号８またはその相補体のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有する第２の反応生成物の存在または非存在を検出することにより，パラ百日咳菌の存在または非存在を判定する。
【００１２】
別の観点においては，本発明はまた，配列番号２またはその相補体の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ４８１標的核酸の存在または非存在を検出することにより，生物学的サンプル中において百日咳菌の存在または非存在を判定する方法を提供する。
【００１３】
１つの態様においては，百日咳菌を検出する方法は以下の工程を含む：
（ａ）ＩＳ４８１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ４８１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合には反応生成物が生成するのに適した条件下で工程（ａ）のプライマー対を含むプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有する反応生成物の存在または非存在を検出することにより，百日咳菌の存在または非存在を判定する。
【００１４】
別の観点においては，本発明はまた，配列番号８またはその相補体の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ１００１標的核酸の存在または非存在を検出することにより，生物学的サンプル中においてパラ百日咳菌の存在または非存在を判定する方法を提供する。
【００１５】
１つの態様においては，パラ百日咳菌を検出する方法は，以下の工程を含む：
（ａ）ＩＳ１００１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ１００１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合には反応生成物が生成するのに適した条件下で工程（ａ）のプライマー対を含むプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号８のヌクレオチド配列またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有する反応生成物の存在または非存在を検出することにより，パラ百日咳菌の存在を判定する。
【００１６】
本発明のすべての観点の好ましい態様においては，ＩＳ４８１反応生成物は，配列番号２またはその相補体と少なくとも９５％（例えば，少なくとも９９％または１００％）同一である少なくとも２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，１００，１２５，または１４０個の連続する核酸を含む。。別の好ましい態様においては，ＩＳ４８１反応生成物は，配列番号３またはその相補体の少なくとも１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，または８５個の連続する核酸と少なくとも９５％（例えば少なくとも９９％または１００％）同一である。別の好ましい態様においては，ＩＳ４８１反応生成物は，約１７５，１５０，１２５，１００，または７５未満の核酸の長さである。
【００１７】
別の好ましい態様においては，ＩＳ４８１プライマー（すなわち，ＩＳ４８１またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー）の少なくとも１つは，配列番号４または５の配列またはその相補体を有する核酸を含む。１つの態様においては，ＩＳ４８１標的核酸は，オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される。オリゴヌクレオチドプローブは，好ましくは配列番号６または２７の配列またはその相補体を有し，検出可能なように標識されている。別の好ましい態様においては，検出可能な標識は蛍光標識である。
【００１８】
本発明のすべての観点の好ましい態様においては，ＩＳ１００１反応生成物は，配列番号８またはその相補体と少なくとも９５％（例えば，少なくとも９９％または１００％）同一である，少なくとも２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，１００，１２５，１４０，１６０，または１８０個の連続する核酸を含む。別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１反応生成物は，配列番号９またはその相補体の少なくとも１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０または７０個の連続する核酸と少なくとも９５％（例えば少なくとも９９％または１００％）同一である。別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１標的核酸は，約１７５，１５０，１２５，１００，または７５未満の核酸の長さである。
【００１９】
別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１プライマー（すなわち，ＩＳ１００１またはそのフラグメントを増幅するのに適当なプライマー）の少なくとも１つは，配列番号１０または１１の配列またはその相補体を有する核酸を含む。１つの態様においては，ＩＳ１００１反応生成物は，オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する。オリゴヌクレオチドプローブは，好ましくは配列番号１２の配列またはその相補体を有し，検出可能なように標識されている。別の好ましい態様においては，検出可能な標識は蛍光標識である。
【００２０】
上述のいずれかの方法の別の好ましい態様においては，本発明の方法はさらにリアルタイムＰＣＲを含む。別の態様においては，プライマーの少なくとも１つはスコーピオンプライマーである。好適なＩＳ４８１スコーピオンプライマーとしては，例えば，配列番号１３または２８の配列またはその相補体を有する核酸プライマーが挙げられる。好適なＩＳ１００１スコーピオンプライマーとしては，例えば，配列番号１４の配列またはその相補体を有する核酸プライマーが挙げられる。
【００２１】
別の観点においては，本発明は，ＩＳ４８１標的核酸をコードする単離された核酸を提供する。ＩＳ４８１標的核酸は，配列番号２またはその相補体の少なくとも２０（例えば，少なくとも２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，１００，１２５または１４０）個の連続するヌクレオチドと実質的に同一であり，１０００ヌクレオチド未満（例えば，７５０，５００，２５０，２００，１７５，１５０，１２５，１００，または７５ヌクレオチド未満）の長さである。１つの態様においては，ＩＳ４８１標的核酸は配列番号３の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
別の観点においては，本発明は，ＩＳ１００１標的核酸をコードする単離された核酸を提供する。ＩＳ１００１標的核酸は，配列番号８またはその相補体の少なくとも２０（例えば，少なくとも２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，１００，１２５，１５０，または１７５）個の連続するヌクレオチドと実質的に同一であり，１０００ヌクレオチド未満（例えば，７５０，５００，２５０，２００，１７５，１５０，１２５，１００，または７５ヌクレオチド未満）の長さである。１つの態様においては，ＩＳ１００１標的核酸は，配列番号９の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
別の観点においては，本発明は，ＩＳ４８１標的核酸またはＩＳ１００１標的核酸を増幅，および／または検出するのに適したオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する。本発明のＩＳ４８１プライマーおよびプローブは，１０−５０（例えば，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２５，３０，３５，４０，または４５）ヌクレオチドの長さであり，配列番号２の対応するヌクレオチド配列と実質的に同一（好ましくは１００％同一）である。本発明のＩＳ１００１プライマーおよびプローブは，１０−５０（例えば，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２５，３０，３５，４０，または４５）ヌクレオチドの長さであり，配列番号８の対応するヌクレオチド配列と実質的に同一（好ましくは１００％同一）である。好ましい態様においては，ＩＳ４８１プライマーおよびプローブは配列番号４−６または２７のヌクレオチド配列を有する。別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１プライマーおよびプローブは配列番号１０−１２のヌクレオチド配列を有する。
【００２４】
別の観点においては，本発明は，ＩＳ４８１標的核酸およびＩＳ１００１標的核酸を増幅および検出するためのスコーピオンプライマーを提供し，ここで，スコーピオンプライマーは，それぞれ個々にオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの要件を満たすオリゴヌクレオチドプローブ配列およびオリゴヌクレオチドプライマー配列を含む。好ましい態様においては，ＩＳ４８１スコーピオンプライマーは，配列番号１３のヌクレオチド配列を有する。別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１スコーピオンプライマーは配列番号１４のヌクレオチド配列を有する。
【００２５】
別の観点においては，本発明は，
（ａ）配列番号２の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズする第１のプライマー対，および配列番号２の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズしうる第１のプローブ，および
（ｂ）配列番号８の配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズする第２のプライマー，および配列番号８の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズしうる第２のプローブ，
を含むキットを提供する。
【００２６】
好ましい態様においては，第１のプライマー対および／または第１のプローブは，配列番号３の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。第１のプライマー対の好ましいメンバーは配列番号４−５の配列またはその相補体を有しており，好ましい第１のプローブは配列番号６または２７の配列またはその相補体を有する。
【００２７】
別の好ましい態様においては，第２のプライマー対および／または第２のプローブは，配列番号９の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。第２のプライマー対の好ましいメンバーは，配列番号１０−１１の配列またはその相補体を有しており，好ましい第２のプローブは配列番号１２の配列を有する。
【００２８】
好ましくは，プローブはさらに検出可能な標識（例えば蛍光標識）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２８２２０（配列番号１）で提供される百日咳菌ＩＳ４８１挿入配列のヌクレオチド配列である。
【図２】図２は，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６６８５８（配列番号７）で提供されるパラ百日咳菌ＩＳ１００１挿入配列のヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は，百日咳に最も一般的に関連する病原体である百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を同定するのに適した方法，組成物，およびキットを提供する。本発明は，個体から得た生物学的サンプル中で，百日咳菌の挿入配列ＩＳ４８１および／またはパラ百日咳菌の挿入配列ＩＳ１００１をリアルタイムＰＣＲで検出することに基づく。これらの挿入配列は比較的高いゲノムコピー数を有するため，ＰＣＲ系の診断アッセイに用いるのに有益である。百日咳菌ゲノムは，典型的には約１００−２００コピーのＩＳ４８１配列を含む。そして，パラ百日咳菌ゲノムは，典型的には約２０コピーのＩＳ１００１配列を含む。
【００３１】
本明細書において用いる場合，特に記載しないかぎり，単数形“ａ，”“ａｎ，”および“ｔｈｅ”には，複数形の参照が含まれる。すなわち，例えば，“ａｎ”オリゴヌクレオチドには複数のオリゴヌクレオチド分子が含まれ，“ａ”核酸は１またはそれ以上の核酸を表す。
【００３２】
本明細書において用いる場合，“約”とは，プラスマイナス１０％を意味する。
【００３３】
本明細書において用いる場合，“増幅”または“増幅する”との用語は，標的核酸をコピーし，このことにより，選択された核酸配列のコピー数を増加させる方法を含む。増幅は指数関数的であっても直線的であってもよい。標的核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。このようにして増幅された配列は，“アンプリコン”または“増幅産物”を形成する。下記に記載される例示的方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増幅に関するものであるが，核酸を増幅するための多くの他の方法が当該技術分野において知られている（例えば，等温法，ローリングサイクル法等）。当業者は，これらの他の方法をＰＣＲ法の代わりに，または一緒に用いることができることを理解するであろう。例えば，Ｓａｉｋｉ，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ”，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０，ｐｐ１３−２０；Ｗｈａｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１ Ｊｕｎ １；２９（１１）：Ｅ５４−Ｅ５４；Ｈａｆｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００１ Ａｐｒ；３０（４）：８５２−６，８５８，８６０；Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００１ Ａｐｒ；３０（４）：８５２−６，８５８，８６０を参照。
【００３４】
本明細書においてポリヌクレオチド（すなわち，ヌクレオチド，例えばオリゴヌクレオチドまたは標的核酸の配列）に関して用いる場合，“相補体”，“相補的な”または“相補性”との用語は，標準的なワトソンクリック塩基対形成規則を表す。一方の配列の５’末端が他方の３’末端と塩基対形成するような核酸配列の相補体は，“アンチパラレル関係”である。例えば，配列“５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’”は配列“３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’”と相補的である。天然の核酸中には一般に見いだされないある種の塩基も本明細書に記載される核酸に含まれ，これらには，例えば，イノシン，７−デアザグアニン，ロック核酸（ＬＮＡ），およびペプチド核酸（ＰＮＡ）がある。相補性は完全である必要はない。安定なデュープレックスは，ミスマッチした塩基対，縮重，またはマッチしていない塩基を含んでいてもよい。核酸技術の当業者は，例えば，オリゴヌクレオチドの長さ，オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列，イオン強度およびミスマッチした塩基対の出現率等の多くの変数を考慮して，デュープレックスの安定性を経験的に判定することができる。相補的配列は，ＤＮＡ配列またはその相補配列に相補的なＲＮＡの配列であってもよく，ｃＤＮＡであってもよい。本明細書において用いる場合，“実質的に相補的な”との用語は，２つの配列が特異的にハイブリダイズする（下記に定義される）ことを意味する。当業者は，実質的に相補的な配列は，その長さの全体にわたってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。
【００３５】
本明細書において，検出可能な標識からのシグナルを検出してサンプル中の標的核酸の存在を示す文脈において用いる場合，“検出する”との用語は，１００％の感度および／または１００％の特異度を与える方法である必要はない。よく知られるように，“感度”とは，その人が標的核酸配列を有している場合に試験が陽性である確率である“特異度”とは，その人が標的核酸配列を有していない場合に試験が陰性である確率である。少なくとも５０％の感度が好ましいが，少なくとも６０％，少なくとも７０％，少なくとも８０％，少なくとも９０％および少なくとも９９％の感度は明らかにより好ましい。少なくとも５０％の特異度が好ましいが，少なくとも６０％，少なくとも７０％，少なくとも８０％，少なくとも９０％および少なくとも９９％の感度は明らかにより好ましい。検出は，偽陽性および偽陰性についてのアッセイを包含する。偽陰性率は，１％，５％，１０％，１５％，２０％またはそれより高く，偽陽性率は１％，５％，１０％，１５％，２０％またはそれより高くてもよい。
【００３６】
遺伝子フラグメントの文脈において“フラグメント”とは，少なくとも約２０ヌクレオチド，少なくとも約２５ヌクレオチド，少なくとも約３０ヌクレオチド，少なくとも約４０ヌクレオチド，少なくとも約５０ヌクレオチド，または少なくとも１００ヌクレオチドの，ヌクレオチド残基の配列を表す。フラグメントは，典型的には約４００ヌクレオチド未満，約３００ヌクレオチド未満，約２５０ヌクレオチド未満，約２００ヌクレオチド未満，または１５０ヌクレオチド未満である。ある態様においては，フラグメントを種々のハイブリダイゼーション法またはマイクロアレイ法において用いて，特定の病原体を同定することができる。
【００３７】
核酸（例えばオリゴヌクレオチド）に関して，“単離された”とは，天然にそれが生ずるゲノムの実質的な部分から分離されている核酸を意味する。例えば，合成的に（例えば，連続的な塩基の縮合）製造された核酸は単離されたものと考えられる。同様に，組換え的に発現された，プライマー伸張反応（例えばＰＣＲ）により製造された，または他の方法によりゲノムから切り出された核酸も，単離されたものと考えられる。
【００３８】
本明細書において用いる場合，“マルチプレックスプライマー伸張反応”との用語は，同じ反応容器中で２またはそれ以上の標的核酸の相補的コピーを同時に生成することができるプライマー伸張反応を表す。各反応生成物は，別々のプライマー対を用いてプライミングされる。マルチプレックス反応はさらに，異なる検出可能成分で検出可能なように標識された，各産物に特異的なプローブを含んでいてもよい。好ましい態様においては，マルチプレックスプライマー伸張反応は，同じ反応容器中の２またはそれ以上の産物が増幅されるマルチプレックスＰＣＲである。
【００３９】
本明細書において用いる場合，“オリゴヌクレオチド”との用語は，デオキシリボヌクレオチド，リボヌクレオチドまたはこれらの任意の組み合わせから構成される短いポリマーを表す。オリゴヌクレオチドは，一般に，約１０，１１，１２，１３，１４または１５から約１５０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり，より好ましくは約１０，１１，１２，１３，１４，または１５から約７０ｎｔ，最も好ましくは約１８から約２６ｎｔの長さである。ヌクレオチドの一文字コードは，ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，セクション２４２２，表１に記載されるとおりである。この点に関して，ヌクレオチドの表記において，“Ｒ”はプリン，例えばグアニンまたはアデニンを意味し，“Ｙ”はピリミジン，例えばシトシンまたはチミジン（ＲＮＡの場合にはウラシル）を意味する。“Ｍ”はアデニンまたはシトシンを意味する。オリゴヌクレオチドは，プライマーとして，またはプローブとして用いることができる。
【００４０】
標的核酸を特異的に増幅する（すなわち，特定の標的核酸配列を増幅する），または特異的に検出する（すなわち，特定の標的核酸配列を検出する）ためにプライマーまたはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは，一般に，標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。
【００４１】
“病原体”とは，哺乳動物（例えばヒト）において百日咳または関連する状態を引き起こしうる任意の微生物を意味する。特定の病原体としては，例えば，百日咳菌およびパラ百日咳菌が挙げられる。
【００４２】
本明細書において用いる場合，増幅用の“プライマー”とは，標的ヌクレオチド配列に相補的であり，ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの存在下でプライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加を導くオリゴヌクレオチドである。最適な発現および増幅のためには，プライマーの３’ヌクレオチドは一般に，対応するヌクレオチド位置において標的配列と同一であるべきである。本明細書において用いる場合，“プライマー”との用語は，合成することができるすべての形のプライマーを含み，例えば，ペプチド核酸プライマー，ロック核酸プライマー，ホスホロチオエート修飾プライマー，標識したプライマー等が含まれる。本明細書において用いる場合，“フォワードプライマー”とは，ｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖に相補的なプライマーである。“リバースプライマー”とは，ｄｓＤＮＡのセンス鎖に相補的なプライマーである。“プライマー対”とは，それぞれ同じ標的核酸に特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを表す。
【００４３】
プライマーは，典型的には約１０から約１００ヌクレオチドの長さであり，好ましくは約１０から約６０ヌクレオチドの長さであり，最も好ましくは約１３から約２５ヌクレオチドの長さ（例えば，１３，１５，１７，１９，２１，または２３ヌクレオチド長）である。最適なハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応増幅のための標準的な長さはない。特定のプライマー用途のための最適な長さは，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（１９８９））に記載されるようにして容易に決定することができる。
【００４４】
標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチド（例えば，プローブまたはプライマー）は，適当な条件下で標的核酸と“ハイブリダイズ”する。本明細書において用いる場合，“ハイブリダイゼーション”または“ハイブリダイズする”とは，所定のハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドの一本鎖が塩基対形成により相補鎖とアニーリングするプロセスを表す。
【００４５】
“プライマー伸張反応”とは，オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸にハイブリダイズし，個々の相補的ヌクレオチドがポリメラーゼにより３’付加されることにより標的核酸の相補的コピーが生成される合成反応を意味する。好ましい態様においては，プライマー伸張反応はＰＣＲである。
【００４６】
本明細書において用いる場合，“サンプル”または“生物学的サンプル”との用語は，患者（例えばヒト患者）から得た臨床サンプルを表す。好ましい態様においては，サンプルは，被験者から採取した組織，体液，または微生物から得る。サンプルの起源としては，限定されないが，粘液，痰（処理済みまたは未処理），気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ），気管支洗浄液（ＢＷ），血液（例えば，全血，血漿，および血清），体液，脳脊髄液（ＣＳＦ），尿，血漿，血清，または組織（例えば，生検サンプル）が挙げられる。好ましいサンプル起源には，鼻咽頭スワブおよび／または咽頭スワブが含まれる。
【００４７】
本明細書において用いる場合，“スコーピオンプライマー”とは，蛍光団／消光剤の対をもつヘアピン構造を含む５’伸張プローブテールを有する３’プライマーを含むオリゴヌクレオチドを表す。任意に，スコーピオンプライマーはさらに，プローブ成分をプライマー成分から離す増幅ブロッカー（例えば，ヘキサエチレングリコール（“ＨＥＧ”）を含んでいてもよい。本明細書に詳細に記載されるように，Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマーはスコーピオンプライマーの一例である。
【００４８】
本明細書において用いる場合，“Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）検出システム”との用語は，リアルタイムＰＣＲの方法を表す。この方法は，ポリメラーゼブロッキング基によりプローブ要素に共有結合したＰＣＲプライマー要素を含む二官能性分子（本明細書において“Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）”と称する）を利用する。さらに，各Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）分子は，消光剤と相互作用してバックグラウンド蛍光を減少させる蛍光団を含む。
【００４９】
“特異的ハイブリダイゼーション”とは，核酸配列が高度の相補性を共有することを示す。許容されるアニーリング条件では，特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成され，続く洗浄段階の後にもハイブリダイズしたままである。核酸配列のアニーリングについての許容される条件は，当業者が日常的に決定することができ，例えば，約６×ＳＳＣの存在下で６５℃で生ずる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは，部分的には，洗浄工程を行う温度により表すことができる。そのような温度は，典型的には，所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱溶融点（Ｔｍ）より約５℃から２０℃低いように選択される。Ｔｍは５０％の標的配列が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨにおける）である。Ｔｍを計算するための等式および核酸ハイブリダイゼーションの条件は当該技術分野において知られている。
【００５０】
本明細書において用いる場合，オリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドと核酸とをアライメントさせたときにオリゴヌクレオチドが核酸の一部と少なくとも５０％の配列同一性を有する場合，核酸に“特異的”である。核酸に特異的なオリゴヌクレオチドは，適切なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で，目的とする標的にハイブリダイズすることができるが，目的としない核酸には実質的にハイブリダイズしないものである。より高いレベルの配列同一性が好ましく，例えば，少なくとも７５％，少なくとも８０％，少なくとも８５％，少なくとも９０％，少なくとも９５％，より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性が好ましい。配列同一性は，当該技術分野においてよく知られるアルゴリズムを利用する市販のコンピュータプログラムをデフォルトの設定で用いることにより決定することができる。本明細書において用いる場合，“高い配列同一性”を有する配列は，アライメントしたヌクレオチド位置の少なくとも約５０％，好ましくはアライメントしたヌクレオチド位置の少なくとも約６０％，より好ましくはアライメントしたヌクレオチド位置の少なくとも約７５％において同一のヌクレオチドを有する。
【００５１】
本明細書において用いる場合，核酸に関して“実質的に同一”との用語は，参照核酸配列と少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，または９９％の配列同一性を有するものである。比較する長さは，好ましくは核酸の全長であるが，一般に，少なくとも２０ヌクレオチド，３０ヌクレオチド，４０ヌクレオチド，５０ヌクレオチド，７５ヌクレオチド，１００ヌクレオチド，１２５ヌクレオチド，またはそれ以上である。
【００５２】
オリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマー対に関して“増幅するのに適した”とは，標的核酸に特異的にハイブリダイズし，標的核酸の相補的コピーが合成されるプライマー伸張反応の開始部位を与えることができるプライマーを意味する。
【００５３】
本明細書において用いる場合，“標的核酸”または“標的配列”との用語は，増幅し検出すべき目的とするヌクレオチドのセグメントを含む配列を表す。増幅反応の間に生成した標的配列のコピーは，増幅産物，アンプリマーまたはアンプリコンと称される。標的核酸は，染色体のセグメント，遺伝子間配列を含むかまたは含まない完全な遺伝子，遺伝子間配列を含むかまたは含まない遺伝子のセグメントまたは一部，またはプローブまたはプライマーを設計する核酸の配列から構成されることができる。標的核酸は，野生型配列，変異，欠失または重複，タンデムリピート領域，目的とする遺伝子，目的とする遺伝子の領域またはその任意の上流または下流の領域を含んでいてもよい。標的核酸は，特定の遺伝子の代替配列またはアレルであってもよい。標的核酸は，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，またはＲＮＡに由来するものでありうる。本明細書において用いる場合，標的核酸は，細胞から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく，これらからコピーまたは増幅された核酸であってもよく，抽出され亜硫酸水素反応によりさらに変換された核酸を含んでいてもよい。
【００５４】
本明細書において用いる場合，“ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ検出システム”とは，リアルタイムＰＣＲの方法を表す。この方法においては，増幅された核酸セグメントにハイブリダイズするＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲ反応混合物中に含める。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは，プローブのいずれかの末端に，ドナーの蛍光が消光剤により取り込まれるよう十分に近接して，ドナーおよび消光剤蛍光団を含む。しかし，プローブが増幅されたセグメントとハイブリダイズすると，Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性がプローブを切断し，このことによりドナー蛍光団が蛍光を放出できるようになり，これを検出することができる。
【００５５】
生物学的サンプルの収集および調製
本発明の方法および組成物を用いて，個体から採取した生物学的サンプル中の病原体核酸を検出することにより，百日咳を引き起こす病原体を検出することができる。病原体検出用のサンプルには，適当な培地で成長してコロニーを形成した，単離された細菌の培養物も含まれ，ここで培養物は個体から採取した生物学的サンプルから調製したものである。
【００５６】
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は，当該技術分野においてよく知られる任意の方法にしたがってサンプルから単離することができる。必要な場合には，遠心分離等によりサンプルを収集または濃縮することができる。サンプルの細胞は，例えば，酵素，熱，界面活性剤，超音波処理，またはこれらの組み合わせによる処理により溶解することができる。溶解処理は，病原体に由来するＤＮＡがサンプル中に存在する場合には，ポリメラーゼ連鎖反応を用いてこれを検出するのに十分な量のＤＮＡを得るために実施する。
【００５７】
ＤＮＡの単離にはＤＮＡ抽出の種々の方法が適している。好適な方法としてはフェノール・クロロホルム抽出が挙げられる。Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅ １６．５４（１９８９）を参照。多くの市販のキット，例えば，限定されないが，ＱＩＡａｍｐ（商標）ミニブラッドキット，Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｇｅｎｆｉｎｄ（商標），Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ（登録商標），またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌｓ（登録商標）を用いるフェノール・クロロホルム抽出によっても適切なＤＮＡを得ることができる。
【００５８】
標的核酸およびプライマー
本発明の種々の態様においては，本明細書に記載される方法においてオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを用いて，病原体の標的配列を増幅し検出する。ある態様においては，標的核酸には，百日咳菌のＩＳ４８１挿入配列（およびそのフラグメント）およびパラ百日咳菌のＩＳ１００１挿入配列（およびそのフラグメント）が含まれる。さらに，プライマーを用いて，１またはそれ以上の対照核酸配列を増幅することもできる。本明細書に記載される標的核酸は，単一で，またはそれぞれの標的について個々の標識を用いるマルチプレックスのフォーマットで，検出することができる。
【００５９】
当業者は，本明細書の開示に鑑みて，標的配列を増幅するのに適したプライマーを設計および製造することができる。本発明において用いる増幅プライマーの長さは，いくつかの因子，例えば，ヌクレオチド配列の種類，およびこれらの核酸がハイブリダイズする温度またはインビトロ核酸増幅の間に用いられる温度によって異なる。特定の配列の増幅プライマーの好ましい長さを決定する際に考慮すべき点は当業者によく知られている。
【００６０】
核酸分子を増幅するプライマーは，例えば，ＯＬＩＧＯ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）等のコンピュータプログラムを用いて設計することができる。増幅プライマーとして用いるべきオリゴヌクレオチドを設計する際に重要な点としては，限定されないが，増幅産物のサイズが検出（例えば，電気泳動またはリアルタイムＰＣＲによる）を容易にするのに適当であること，プライマーの対のメンバーが同様の溶融温度を有すること，および各プライマーの長さ（すなわち，プライマーは，配列特異的にアニーリングして合成を開始するのに十分に長くなければならないが，オリゴヌクレオチド合成の間の忠実度が低下するほど長くてはならない）が挙げられる。典型的には，オリゴヌクレオチドプライマーは，１５から３５ヌクレオチドの長さである。
【００６１】
ハイブリダイゼーションプローブとして用いるべきオリゴヌクレオチドの設計は，プライマーの設計と同様にして行うことができる。オリゴヌクレオチドプライマーと同様に，オリゴヌクレオチドプローブは通常は類似した溶融温度を有し，各プローブの長さは，配列特異的ハイブリダイゼーションが生ずるのに十分なものでなければならないが，合成の間に忠実度が低下するほど長くてはならない。オリゴヌクレオチドプローブは一般に１５から６０ヌクレオチドの長さである。
【００６２】
ある態様においては，１またはそれ以上のヌクレオチド位置において縮重を有するプライマーの混合物を用意する。縮重プライマーは，標的配列中に変動性が存在する場合に，すなわち配列情報が不明瞭である場合に，ＰＣＲにおいて用いられる。典型的には，縮重プライマーは，約４未満，約３未満，好ましくは約２未満，最も好ましくは，約１未満のヌクレオチド位置において変動性を示す。
【００６３】
好適な態様においては，ＰＣＲは，二官能性プライマー／プローブ組み合わせ（例えばＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマー）を用いて実施する。本発明において用いる場合，スコーピオンプライマーは，蛍光団／消光剤の対を有するヘアピン構造を含む５’側に延長されたプローブテールを有する３’プライマーを含む。ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）が含まれているため，ＰＣＲの間，ポリメラーゼは，プローブテールへと伸張することができないよう妨害されている。第１ラウンドの増幅の間，３’標的特異的プライマーは標的にアニーリングし，５’プローブ用の新たに合成された標的領域を有する，新たに合成された鎖中に，Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）が取り込まれるように伸張される。次のラウンドの変性およびアニーリングの間に，スコーピオンプライマーのヘアピンループのプローブ領域は標的にハイブリダイズし，したがって，蛍光団と消光剤とが分離され，測定可能なシグナルが生成する。そのようなプローブは，Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：８０４−８０７（１９９９）に記載されている。
【００６４】
核酸の増幅
核酸サンプルまたは単離された核酸は，当業者に知られる種々の方法により増幅することができる。好ましくは，ＰＣＲを用いて目的とする核酸を増幅する。簡単には，ＰＣＲにおいては，マーカー配列の反対側の相補鎖の領域に相補的な２つのプライマー配列を用意する。過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸を，ＤＮＡポリメラーゼ，例えば，Ｔａｑポリメラーゼとともに反応混合物に加える。上述のようにテンプレートの配列が改変されている場合には，増幅混合物は，好ましくはＵＮＧヌクレアーゼを含まない。
【００６５】
標的配列がサンプル中に存在すると，プライマーは配列に結合し，ポリメラーゼによりヌクレオチドが付加されることによりプライマーは標的配列に沿って伸張する。反応混合物の温度を上昇または低下させることにより，伸張したプライマーはマーカーから解離して反応生成物を形成し，過剰のプライマーはマーカーおよび反応生成物に結合し，このプロセスが繰り返されて，増幅産物が生成する。サイクルのパラメータは，伸張すべき増幅産物の長さに基づいて様々でありうる。オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを利用して，内部陽性増幅対照（ＩＰＣ）をサンプル中に含めることができる。ＩＰＣを用いて，変換プロセスおよびそれに続く増幅との両方をモニターすることができる。
【００６６】
好適な態様においては，リアルタイムＰＣＲは，ＰＣＲ増幅産物の蓄積を検出することができる任意の適当な装置を用いて行う。最も一般的には，装置は１またはそれ以上の蛍光標識からの蛍光を検出することができる。例えば，装置（例えば，ＡＢＩ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ７５００（登録商標）配列検出器）におけるリアルタイム検出は，各ＰＣＲサイクルの間に蛍光をモニターし，レポーターシグナルの測定値またはＲｎ値を計算する。閾値サイクルまたはＣｔ値は，蛍光が閾値と交叉するときのサイクルである。閾値は，配列検出システムのソフトウエアにより，または手動で決定する。
【００６７】
増幅した標的核酸の検出
核酸の増幅は，例えば，ゲル電気泳動，カラムクロマトグラフィー，プローブを用いるハイブリダイゼーション，配列決定，溶融曲線分析，または“リアルタイム”検出等の，当該技術分野においてよく知られる多くの方法のいずれかを用いて検出することができる。好ましい方法においては，目的とする２またはそれ以上のフラグメントからの配列を同じ反応容器で増幅する（すなわち，“マルチプレックスＰＣＲ”）。検出は，反応の終点を測定することにより，または“リアルタイム”で行うことができる。リアルタイム検出用には，プライマーおよび／またはプローブは，検出可能なように標識して，例えばプライマーが取り込まれたとき，またはプローブがハイブリダイズしたとき，および，反応の間の蛍光の変化をモニターしうる装置中で増幅されたときに，異なる蛍光が得られるようにすることができる。核酸増幅のリアルタイム検出方法はよく知られており，例えば，ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム，Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマーシステム，および二本鎖核酸用のインターカレート色素の使用が挙げられる。
【００６８】
終点検出においては，アンプリコン（単数または複数）は，まずアンプリコンをサイズ分離し，次にサイズ分離したアンプリコンを検出することにより，検出することができる。異なるサイズのアンプリコンの分離は，例えば，ゲル電気泳動，カラムクロマトグラフィー，またはキャピラリー電気泳動により行うことができる。これらのおよび他の分離法は当該技術分野においてよく知られている。一例においては，サイズが１０塩基対またはそれ以上異なる約１０から約１５０塩基対のアンプリコンは，例えば，４％から５％のアガロースゲル（約１５０から約３００塩基対のアンプリコンについては２％から３％のアガロースゲル），または６％から１０％のポリアクリルアミドゲルで分離することができる。分離した核酸は，次に臭化エチジウム等の色素で染色し，得られた染色されたバンド（単数または複数）のサイズを標準ＤＮＡラダーと比較することができる。
【００６９】
ある態様においては，増幅された核酸は，特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションにより検出する。増幅した標的配列の一部に相補的なプローブオリゴヌクレオチドを用いて，増幅したフラグメントを検出することができる。ハイブリダイゼーションは，リアルタイムで検出してもよく，非リアルタイムで検出してもよい。増幅した核酸は，標的配列のそれぞれについて同時に検出してもよく（すなわち，同じ反応容器中で），または別々に検出してもよい（すなわち，別々の反応容器中で）。好ましい態様においては，増幅されたＤＮＡは，２またはそれ以上の区別しうるように標識された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出する。プローブの一方は第１の標的配列にハイブリダイズし，他方は第２の標的配列にハイブリダイズする。配列が改変された核酸については，標的は上鎖または下鎖から独立して選択することができる。すなわち，検出されるべきすべての標的は，上鎖，下鎖，または上鎖と下鎖標的の組み合わせを含むことができる。
【００７０】
プローブは，当該技術分野において知られる方法により，検出可能なように標識することができる。有用な標識としては，例えば，蛍光色素（例えば，Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），ＦＩＴＣ，ローダミン，ランタニド蛍光体，テキサスレッド，ＦＡＭ，ＪＯＥ，Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（登録商標），Ｑｕａｓａｒ ６７０（登録商標）），放射性同位体（例えば，32Ｐ，35Ｓ，3Ｈ，14Ｃ，125Ｉ，131Ｉ），高電子密度試薬（例えば金），酵素（例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ，ルシフェラーゼ，アルカリホスファターゼ），比色標識（例えば金コロイド），磁気標識（例えば，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）），ビオチン，ジゴキシゲニン，または抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよび蛋白質が挙げられる。他の標識としては，それぞれ対応するレセプターまたはオリゴヌクレオチド相補体と複合体を形成しうるリガンドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は，検出すべき核酸中に直接取り込ませてもよく，または検出すべき核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えばオリゴヌクレオチド）または抗体に結合させてもよい。
【００７１】
リアルタイムＰＣＲの１つの一般的方法では，蛍光プローブ，例えば，ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ，分子ビーコン，およびスコーピオンを使用する。リアルタイムＰＣＲは，最終的な増幅された産物の量を検出する他の形の定量的ＰＣＲより高い特異度，感度および再現性をもって，テンプレートの最初の量を定量する。リアルタイムＰＣＲは，アンプリコンのサイズを検出しない。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）技術において用いられるプローブは，蛍光クエンチングの原理に基づいており，ドナー蛍光団とクエンチング成分とを含む。
【００７２】
好ましい態様においては，検出可能な標識は蛍光団である。本明細書において用いる場合，“蛍光団”との用語は，特定の波長（励起周波数）の光を吸収し，次により長い波長（放射周波数）の光を放出する分子を表す。本明細書において用いる場合，“ドナー蛍光団”との用語は，消光剤成分と近接している場合に，放出エネルギーを消光剤に供与ないし移動させる蛍光団を意味する。消光剤成分にエネルギーを供与した結果，ドナー蛍光団それ自体は，近接して配置された消光剤成分が存在しない場合よりも少ない特定の放出周波数の光を放出する。
【００７３】
本明細書において用いる場合，“消光剤成分”との用語は，ドナー蛍光団の近傍に位置して，ドナーにより生成された放出エネルギーを取り込み，エネルギーを熱またはドナーの放出波長より長い波長の光として消散させる分子を意味する。後者の場合，消光剤はアクセプター蛍光団であると考えられる。消光成分は，近接（すなわち衝突）クエンチングにより，またはフォスターないし蛍光共鳴エネルギー移動（“ＦＲＥＴ”）により作用する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブにおいては一般にＦＲＥＴによる消光が用いられ，分子ビーコンおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）タイプのプローブにおいては近接消光が用いられる。
【００７４】
好適な蛍光成分としては，当該技術分野において知られる下記の蛍光団が挙げられる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，アクリジンおよび誘導体（アクリジン，アクリジンイソチオシアネート），Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ），５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ），４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ），Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド，アントラニルアミド，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ，ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ，ブリリアントイエロー，クマリンおよび誘導体（クマリン，７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０），７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）），Ｃｙ２（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），Ｃｙ３．５（登録商標），Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ５．５（登録商標），シアノシン，４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ），５’，５"−ジブロモピロガロール−スルホネフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ），７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソシアナトフェニル）−４−メチルクマリン，ジエチレントリアミン四酢酸，４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸，４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ，塩化ダンシル），４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ），４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ），Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．），エオシンおよび誘導体（エオシン，エオシンイソチオシアネート），エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ，エリスロシンイソチオシアネート），エチジウム，フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ），２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ），フルオレセイン，フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ），ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ），ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ），テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）），フルオレスカミン，ＩＲ１４４，ＩＲ１４４６，マラカイトグリーンイソチオシアネート，４−メチルウンベリフェロン，オルトクレゾールフタレイン，ニトロチロシン，パラローザニリン，フェノールレッド，Ｂ−フィコエリスリン，Ｒ−フィコエリスリン，ｏ−フタルジアルデヒド，Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標），ヨウ化プロピジウム，ピレンおよび誘導体（ピレン，酪酸ピレン，酪酸スクシンイミジル１−ピレン），ＱＳＹ（登録商標）７，ＱＳＹ（登録商標）９，ＱＳＹ（登録商標）２１，ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ），リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ），ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ），６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ），リサミンローダミンＢ塩化スルホニル，ローダミン（Ｒｈｏｄ），ローダミンＢ，ローダミン１２３，ローダミングリーン，ローダミンＸイソチオシアネート，スルホローダミンＢ，スルホローダミン１０１，スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）），Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ），テトラメチルローダミン，テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ），リボフラビン，ロゾール酸，テルビウムキレート誘導体。
【００７５】
他の蛍光ヌクレオチド類似体を用いてもよい。例えば，Ｊａｍｅｓｏｎ，２７８ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６３−３９０（１９９７）；Ｚｈｕ，２２ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４１８−３４２２（１９９４）を参照。米国特許５，６５２，０９９および６，２６８，１３２もまた，酵素的または化学的合成のいずれかにより核酸，例えば，ＤＮＡおよび／またはＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド中に取り込ませて蛍光オリゴヌクレオチドを作製するためのヌクレオシド類似体を記載する。米国特許５，１３５，７１７は，蛍光標識として用いるためのフタロシアニンおよびテトラベンズトリアザポルフィリン試薬を記載する。
【００７６】
適当な消光剤は，特定の蛍光団の蛍光スペクトルに基づいて選択する。有用な消光剤としては，例えば，ｔｈｅ Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）消光剤であるＢＨＱ−１，ＢＨＱ−２，およびＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），およびＡＴＴＯシリーズの消光剤（ＡＴＴＯ５４０Ｑ，ＡＴＴＯ５８０Ｑ，およびＡＴＴＯ６１２Ｑ；Ａｔｔｏ−ＴｅｃＧｍｂＨ）が挙げられる。
【００７７】
検出可能な標識は，核酸中に取り込ませるか，会合させるか，またはコンジュゲートさせることができる。標識は，種々の長さのスペーサーアームにより結合させて，立体傷害または他の有用なまたは望ましい特性に与える影響を低減させることができる。例えば，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，９ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ １４５−１５６（１９９５）を参照。検出可能な標識は，共有結合または非共有結合手段により，例えば，クレノーポリメラーゼを用いるランダム−プライマー標識による転写，またはニックトランスレーション，または増幅，または当該技術分野において知られる同等の方法により，核酸中に取り込ませることができる。例えば，ヌクレオチド塩基を検出可能な成分，例えば蛍光色素とコンジュゲートさせ，次これを核酸合成または増幅の間に核酸中に取り込ませる。
【００７８】
スコーピオンプライマーを用いると，配列特異的プライミングおよびＰＣＲ産物の検出を単一の分子を用いて行うことができる。スコーピオンプライマーは，ハイブリダイズしていない状態ではステム・ループ構造を保持している。蛍光団は，５’末端に結合しており，３’末端に結合している成分によりクエンチされているが，好適な態様ではこの配置は逆でもよい。ステムおよび／またはループの３’部分はまた，プライマーの伸張産物に相補的な配列を含む。この配列は，特異的プライマーの５’末端に増幅可能でないモノマーを介して連結されている。プライマー成分の伸張後，特異的プローブ配列は伸張されたアンプリコン中のその相補体に結合することができ，このためヘアピンループが開く。このことにより蛍光の消光が妨害され，シグナルが観察される。特異的標的は，リバースプライマーおよびスコーピオンプライマーのプライマー部分により増幅され，伸張産物が生ずる。スコーピオンプライマーのプローブ要素が伸張産物に結合することにより，蛍光団が消光剤から離れ，蛍光シグナルが生成する。
【００７９】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｈｅｉｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ６：９８６−９９４，１９９６）は，Ｔａｑポリメラーゼの蛍光発生性５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して，ｃＤＮＡサンプル中の標的配列の量を測定する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは，通常は５’塩基またはその近傍に位置するドナー蛍光団，および典型的には３’塩基またはその近傍に位置するクエンチング成分を含むオリゴヌクレオチドである。消光剤成分は，ＴＡＭＲＡ等の色素であってもよく，非蛍光分子，例えば，４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）であってもよい。Ｔｙａｇｉ，ｅｔ ａｌ．，１６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４９−５３（１９９８）を参照。照射されると，励起された蛍光ドナーは，蛍光を発生するのではなく，ＦＲＥＴによりエネルギーを近傍のクエンチング成分に移動させる。すなわち，ドナーと消光剤とが近接することにより，ドナー蛍光の放出が妨害されるが，プローブは無傷のままである。
【００８０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは，ＰＣＲ産物の内部領域にアニーリングするよう設計される。ポリメラーゼ（例えばリバーストランスクリプターゼ）がＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが結合したテンプレートを複製すると，その５’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが切断される。このことにより，消光剤（ＦＲＥＴなし）の活性が消失し，ドナー蛍光団は蛍光を放出し始め，これは各サイクルでプローブの切断速度と比例して増加する。ＰＣＲ産物の蓄積は，レポーター色素の増加をモニターすることにより検出する（プライマーは標識されていないことに注意）。消光剤がアクセプター蛍光団である場合には，ＰＣＲ産物の蓄積は，アクセプター蛍光団の蛍光の減少をモニターすることにより検出することができる。
【００８１】
百日咳菌の検出
患者における百日咳菌の存在は，生物学的サンプル中のＩＳ４８１挿入配列をコードする核酸またはその診断用フラグメントの存在を検出することにより判定することができる。百日咳菌ＩＳ４８１のヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２８２２０で与えられ，図１（配列番号１）に示される。
【００８２】
好ましい態様においては，標的核酸は，ＩＳ４８１のヌクレオチド５５３−６９３またはそのフラグメントに対応し，以下に配列番号２として示される。
1 gcgccctggc caccgggtca cgggcaaccg acgcgatacc gttgaggggg ccggctggga
61 cttcgtcttc gtggccatcg atgaccacgc ccgcgtggcc ttcaccgaca tcccccccga
121 cgagcgcttc cccagcgccg t
配列番号２
【００８３】
全長標的核酸配列，またはその任意の一部は，任意の適当なプライマーおよびプローブを用いて増幅し，検出することができる。１つの特に有用な標的核酸配列は，ＩＳ４８１のヌクレオチド５８０−６６５（配列番号３）を含み，これは，配列番号２のヌクレオチド２８−１１３に対応する。有用なプライマーとしては，例えば，ＩＳ４８１のヌクレオチド５８０−５９７（配列番号４）および６４８−６６５（配列番号５）（上述の標的核酸中で下線で示される）またはその相補体に向けられたものが挙げられる。有用なプローブは，増幅されたＩＳ４８１配列の任意の有用な領域，例えば，ＩＳ４８１のヌクレオチド６２３−６４２（配列番号６）およびヌクレオチド６０４−６２８（配列番号２７）（それぞれ配列番号２のヌクレオチド７１−９０および５２−７６）またはその相補体に向けられたものである。
【００８４】
配列番号６のプローブを用いるＢＬＡＳＴ検索は，百日咳菌およびＢ．ｈｏｌｍｅｓｉｉのＩＳ４８１標的核酸配列との完全なマッチを示した。さらに，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのゲノム中に１８／２０ヌクレオチドのマッチが，およびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ，ｇｒｉｓｅａおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ，ｏｒｙｚａｅのゲノム中に１７／２０ヌクレオチドのマッチがある。下記に示されるように，Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ，Ｍ．ｇｒｉｓｅａ，およびＸ．ｏｒｙｚａｅについては，配列番号４−５のプライマーとの有意な配列同一性はない。したがって，これらの種は，配列番号４−５の増幅プライマーを用いた場合には有意な偽陽性の原因ではないはずである。配列番号６のプローブの交叉反応性は，このレベルの非相同性でのハイブリダイゼーションを阻害するのに十分な高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることにより，低減または排除することができる。
【００８５】
配列番号４−５のプライマー配列を用いるＢＬＡＳＴ検索は，百日咳菌およびＢ．ｈｏｌｍｅｓｉｉのＩＳ４８１標的核酸配列との完全なホモロジーを示した。Ｂ．ｈｏｌｍｅｓｉｉによるヒトの感染はまれであるが，本明細書に記載されるプライマーおよびプローブにより検出することができる。また，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｖｉｕｍ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ，およびＲｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓのゲノム中の配列との１５−１７ヌクレオチドのマッチが見いだされた。しかし，これらの細菌および真菌は，ヒトに感染することは知られておらず，したがって偽陽性の診断結果の有意な原因ではないはずである。
【００８６】
パラ百日咳菌の検出
患者におけるパラ百日咳菌の存在は，生物学的サンプル中のＩＳ１００１挿入配列をコードする核酸，またはその診断用フラグメントの存在を検出することにより，判定することができる。パラ百日咳菌ＩＳ１００１のヌクレオチド配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６６８５８で与えられ，図２（配列番号７）に示される。
【００８７】
好ましい態様においては，標的核酸はＩＳ１００１のヌクレオチド６８０−８５９またはそのフラグメントに対応し，下記に配列番号８として示す。
1 caattgccgc ctggggccgc ccaacgcatc aaggccgttg ccatcgacat gaccaccgcc
61 tacgagttGG AGATCCAGGC CCacagccca caggcggaga tcgtctatga cttgttccat
121 gtcgtggcca agtatggacg agaggtcatt gatcgggtgc gcgtggatca ggccaatcaa
配列番号８
【００８８】
全標的核酸配列，またはその任意の一部は，任意の適切なプライマーおよびプローブを用いて増幅および検出することができる。１つの特に有用な標的核酸配列は，ＩＳ４８１のヌクレオチド７３０−８０２（配列番号９）を含み，これは配列番号８のヌクレオチド５１−１２３に対応する。有用なプライマーとしては，例えば，ＩＳ１００１のヌクレオチド７３０−７４７（配列番号１０）および７７７−８０２（配列番号１１）（上述の標的核酸中で下線で示す）またはその相補体に向けられたものが挙げられる。１つの有用なプローブは，ＩＳ１００１のヌクレオチド７４８−７６１（配列番号１２）（上述の標的核酸中で大文字で示す）またはその相補体に向けられたものである。
【００８９】
配列番号１０−１１のプライマーを用いるＢＬＡＳＴ検索は，パラ百日咳菌のＩＳ１００１標的核酸配列との完全なマッチを示した。さらに，配列番号１０のプライマーは，Ａｃａｎｔｈｏｓｔｉｇｍａ ｐｅｒｐｕｓｉｌｌｕｍ，Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ，Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ，およびＳａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒのゲノム中に１６ヌクレオチドおよび１７ヌクレオチドのマッチを示した。配列番号１１のプライマーは関連するいずれの種とも，短く有意ではないマッチしか示さなかった。
【実施例】
【００９０】
実施例１：サンプルの収集およびＤＮＡ抽出．
合計で３０６個の鼻咽頭スワブサンプルを用意し，アッセイのバリデーション目的で試験した。３０６個のサンプルのうち，２９０個は患者から取得した実際の臨床標本であった。残りの１６サンプルは“人為”（すなわち，陽性対照）パラ百日咳菌標本であった。人為標本は，病原体陰性の鼻咽頭スワブマトリクスを培養したパラ百日咳菌生物でスパイクすることにより調製した。
【００９１】
患者から鼻咽頭スワブを採取し，ただちにチャコールを含むエイムス（Ａｉｍｅｓ）培地または液体バイアル運搬培地（ＭｉｃｒｏＴｅｓｔ（商標）Ｍ４培地；Ｒｅｍｅｌ，Ｉｎｃ．）に入れ，運搬用に−２０℃で凍結し，アッセイまで−２０℃で保存した。
【００９２】
下記に記載されるボルデテラ種アッセイ用には，鼻咽頭スワブサンプルからＤＮＡを抽出した。簡単には，サンプルを融解し，２００μｌの各サンプルを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注した。陽性対照ＤＮＡ（上述を参照）を含むかまたはＤＮＡなし（陰性対照）の２００μｌの希釈液を含む別のチューブを用意し，患者サンプルと同時に処理した。次に５μｌの内部対照ＤＮＡ（下記参照）を各サンプルに加えた。ＱＩＡａｍｐ（商標）ミニブラッドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造元の指針にしたがってＤＮＡを抽出した。
【００９３】
内部対照（ＩＣ）ＤＮＡは，アッセイされた生物のいずれにも存在しないランダム配列のＤＮＡフラグメントから構成される。５’リン酸を有する２つのオリゴヌクレオチド（ｐＩＣＦ５’ＰおよびｐＩＣＲ５’ｐ）をアニーリングさせ，生成物をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００９４】
(pIC F 5'P): 5' リン酸-aaTTCGCCCT TTGTTTCGAC CTAGCTTGCC AGTTCGCAGAA TTTGTTGCTC GTCAGTCGTC GGCGGTTTTA agggcg (配列番号 15)
(pIC R 5'P): 5' リン酸-aattcgccct TAAAACCGCC GACGACTGAC GAGCAACAAA TTCTGCGAAC TGGCAAGCTA GGTCGAAACA AAGGGCG (配列番号 16)
【００９５】
ＩＣアンプリコンは，ｐＵＣ１９配列にアニーリングする以下のプライマーにより生成した。
フォワードプライマー (PUC-For): 5' GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTA (配列番号 17)
リバースプライマー (PUC-Rev): 5' CACTTTATGC TTCCGGCTCG TA (配列番号 18)
IC アンプリコンの配列:
1 GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCgccctta aaaccgccga
61 cgactgacga gcaacaaatt ctgcgaactg gcaagctagg tcgaaacaaa gggcggattc
121 GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGGCGTAATC
181 ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG
241 AGCCGGAAGC ATAAAGTG (配列番号 19)
【００９６】
下線を付した配列は，ｐＵＣ１９のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）の一部である。小文字の配列は，２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることにより生成した。ＩＣアンプリコンは，ｐＵＣ１９配列にアニーリングする下記のプライマーにより生成した。
【００９７】
すべてのアッセイについて，陽性および陰性対照を用意し，患者サンプルと同時にアッセイした。陽性対照ＤＮＡは，単一分子中にそれぞれ百日咳菌およびパラ百日咳菌のＩＳ４８１およびＩＳ１００１標的領域を含む６２５ｂｐのＤＮＡフラグメントから構成される。陰性対照アッセイはＤＮＡを含まないものである。
【００９８】
陽性対照テンプレートを構築するためには，ＩＳ４８１およびＩＳ１００１の標的領域を増幅するようプライマーを設計し，これらをｐＵＣ１９プラスミドにタンデムにクローニングした。ＩＳ４８１フォワードプライマーはＥｃｏＲＩ制限部位を加えるように設計し（ＩＳ４８１ ＥｃｏＲＩ Ｆ），ＩＳ４８１リバースプライマーはＢａｍＨＩ制限部位を加えるように設計した（ＩＳ４８１ ＢａｍＨＩ Ｒ）。次にこれらのプライマーを用いて，百日咳菌のＩＳ４８１から２３７ｂｐのアンプリコンを生成した。
IS481 EcoRI F: 5' agcagtgaat tcggtggtgc gctacgagca (配列番号 20)
IS481 BamHI R: 5' atatgcggat ccgccactgc gtccttgagga (配列番号 21)
【００９９】
ＩＳ１００１フォワードプライマーはＢａｍＨＩ制限部位を加えるように設計し（ＩＳ１００１ ＢａｍＨＩ Ｆ），ＩＳ１００１リバースプライマーはＰｓｔＩ制限部位を加えるように設計した（ＩＳ１００１ ＰｓｔＩ Ｒ）。
IS1001 BamHI F: 5' atatgcggat ccataccgtc aagacgctgg aca (配列番号 22)
IS1001 PstI R: 5' tagcaactgc agcgatcaat gacctctcgt ccata (配列番号 23)
【０１００】
これらのプライマーを用いて，パラ百日咳菌のＩＳ１００１から３５８ｂｐのアンプリコンを生成した。
【０１０１】
次に，アンプリコンを精製し，予めＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＵＣ１９プラスミドにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて同時にライゲーションした。ライゲーションしたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉをトランスフォームし，次にアンピリシンを含むＬＢ寒天上で選択成長させた。単一コロニーを選択し，ＤＮＡを調製した。このＤＮＡを，ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲによるスクリーニングにおいてテンプレートＤＮＡとして，ＩＳ４８１フォワードプライマーおよびＩＳ１００１リバースプライマーとともに用いた。陽性のＳＹＢＲグリーンＰＣＲ結果を示したプラスミドを次に配列決定して，タンデムに配置されたＩＳ４８１およびＩＳ１００１標的（５９５ｂｐ），およびＢａｍＨＩ制限部位（６ｂｐ）を含む６０１ｂｐの挿入物の存在を確認した。
【０１０２】
陽性対照のアンプリコンは，タンデムの６０１ｂｐＩＳ４８１／ＩＳ１００１挿入物をテンプレートとして含むプラスミドをＩＳ４８１ ＥｃｏＲＩ ＦおよびＩＳ１００１ ＰｓｔＩ Ｒプライマーとともに用いる増幅により生成した。付加された制限部位を含めて，陽性対照アンプリコンの合計サイズは６２５ｂｐであり，以下のヌクレオチド配列を含む：
1 agcagtgaat tcggtggtgc gctacgagca tcaggccccc ggcgatctgc tgcacatcga
61 catcaagaag ctgggacgta tccagcgccc tggccaccgg gtcacgggca accgacgcga
121 taccgttgag ggggccggct gggacttcgt cttcgtggcc atcgatgacc acgcccgcgt
181 ggccttcacc gacatccccc ccgacgagcg cttccccagc gccgtccagt tcctcaagga
241 cgcagtggcg gatccatacc gtcaagacgc tggacaaggc tcggctgcgt gcgtcggtgc
301 gcgaaccgga ttggtccaag atcgagtatt tggcgatgga cgagtttgcc ctgcacaaag
361 ggcatcgcta cgcgacagtg gtggtcgatc cgatcggcag gcaggtgctg tggattggcc
421 caggacgctc acgcgagacg gcccgggcgt tcttcgaaca attgccgcct ggggccgccc
481 aacgcatcaa ggccgttgcc atcgacatga ccaccgccta cgagttggag atccaggccc
541 acagcccaca ggcggagatc gtctatgact tgttccatgt cgtggccaag tatggacgag
601 aggtcattga tcgctgcagt tgcta (配列番号 24)
【０１０３】
実施例２：ボルデテラ種のマルチプレックスＰＣＲ検出
最終ＰＣＲ試薬溶液は，以下を含んでいた：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），ＭｇＣｌ2，ＫＣｌ，ＥＤＴＡ，ＤＴＴ，Ｔｗｅｅｎ２０，（ＮＨ4）2ＳＯ4，グリセロール，ｄＮＴＰｓ（ｄＴ，ｄＡ，ｄＧ，およびｄＣ），およびＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（商標）。
【０１０４】
１０ＸＰＣＲプライマー溶液は，百日咳菌，パラ百日咳菌，および内部対照についてのスコーピオンプライマーおよびリバースプライマーを含むよう調製した。１０ＸＰＣＲプライマー溶液中，百日咳菌のスコーピオンおよびリバースプライマーは２μＭの最終濃度であり，パラ百日咳菌のスコーピオンおよびリバースプライマーは１．５μＭの最終濃度であり，ＩＣのスコーピオンおよびリバースプライマーは１μＭの最終濃度であった。２つの異なる百日咳菌スコーピオンプライマーを個別に試験した。プライマー対は次のとおりである：
百日咳菌(IS481):
[Q]-GCGTGGTCATCGATGGCCACcacgct-[F]-tttttt-heg-ccgacgcgataccgttga(配列番号 13) および
[Q]-agcGGCCACGAAGACGAAGTCCCAGCCGct-[F]-heg-ccgacgcgataccgttga(配列番号 28); および
リバースプライマー: ggatgtcggtgaaggcca (配列番号 25)
パラ百日咳菌 (IS1001):
[Q]-accGGGCCTGGATCTCCcggt-[F]-heg-gaccaccgcctacgagtt(配列番号 14), および
リバースプライマー: gacatggaacaagtcatagacgatct (配列番号 26)
内部標準:
[Q]-TGCGAACTGGCAAGCT-[F]-heg-attcgccctttgtttcgaccta (配列番号 15), および
リバースプライマー: CCGACGACTGACGAGCAA (配列番号 16)
【０１０５】
上述の各スコーピオンプライマーについて，Ｑ＝消光剤，Ｆ＝蛍光団，および“ｈｅｇ”＝ヘキサエチレングリコールである。プローブ配列は大文字で示される。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
ＰＣＲ反応溶液は，実施するサンプルアッセイあたり，１２．５μｌのＰＣＲ試薬溶液，２．５μｌの１０ＸＰＣＲプライマー溶液，および５μｌの無ヌクレアーゼ水を混合することにより作製した。
【０１０８】
マルチプレックスＰＣＲ検出アッセイは９６ウエルプレートで実施した。各アッセイは，２０μｌのＰＣＲ反応溶液および５μｌの抽出した核酸（すなわち，患者サンプル，陽性対照，または陰性対照）を含むものであった。プレートを密封し，２０００ｘｇで２分間遠心分離し，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）７５００リアルタイムＰＣＲ検出システムで測定した。ＰＣＲ反応は以下のように行った：
段階１（１サイクル）：１０分間，９５℃
段階２（４５サイクル）：工程１：９５℃，１５秒間
工程２：６０℃，３５秒間（工程２の間のデータ収集）
【０１０９】
データを収集し，患者サンプルを１またはそれ以上の病原種の存在について分析した。１またはそれ以上の病原種のいずれかについて陽性の結果を有する患者サンプルは，これらの種について陽性であると評点した。すべての病原体種について陰性の結果を有する患者サンプルは，内部対照標的核酸が検出され，陽性対照サンプルアッセイが百日咳菌およびパラ百日咳菌標的核酸の両方について陽性である場合に，陰性と評点した。
【０１１０】
実施例３：マルチプレックスＰＣＲアッセイの結果の確認
上述のマルチプレックスアッセイの結果を，他の検出アッセイと比較した。すべてのサンプルのアリコートは，マルチプレックスアッセイの結果の確認のために２回目のアッセイを行った。百日咳菌は，ＩＳ４８１挿入配列中の異なる標的核酸ならびに別個の内部対照を検出するＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイ（Ｐｒｏｄｅｓｓｅ，Ｉｎｃ．）において評価した。パラ百日咳菌は，上述のスコーピオンおよびリバースプライマーのプライマーおよびプローブ領域と同一のプライマーおよびプローブを用いて，ＩＳ１００１挿入配列についてＴａｑｍａｎ（登録商標）スタイルのアッセイを用いて評価した。
【０１１１】
３０６個のサンプルをそれぞれ，マルチプレックスアッセイにおいて百日咳菌およびパラ百日咳菌について同時にアッセイした。さらに３０６個のサンプルは，ＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイを用いて１回，およびパラ百日咳菌Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイを用いて１回アッセイした。百日咳菌アッセイ（マルチプレックスおよびＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓ）については，３７．０以下のＣｔ値を陽性として評点した。パラ百日咳菌アッセイ（マルチプレックスおよびＴａｑｍａｎ（登録商標））については，３６．５以下のＣｔ値を陽性として評点した。３つのサンプルについてのマルチプレックスアッセイは最初の反復で失敗し，２つのサンプルは繰り返し試験で失敗した。これはおそらく，臨床標本中の阻害物質が内部対照の失敗を引き起こしたためであろう。このため，下記に示される反復＃１と＃２の間では，合計が３０３から３０４に変わっている。さらに，百日咳菌についてのまたはパラ百日咳菌についての２つの試験の間で不一致であったすべてのサンプルは，マルチプレックス試験および比較試験の両方を用いて繰り返した。反復＃２からの結果には，反復試験後のサンプル結果が含まれる。各アッセイの結果は以下のとおりである。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
マルチプレックスアッセイの百日咳菌成分は，ＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイと９５．９％の陽性一致および９６．４％の陰性一致を示した。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
マルチプレックスアッセイの百日咳菌成分はＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイと９６．２％の陽性一致および９９．６％の陰性一致を示した。
【０１１６】
【表４】
【０１１７】
【表５】
【０１１８】
マルチプレックスアッセイのパラ百日咳菌成分は，Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイと９７．８％の陽性一致および１００％の陰性一致を示した。
【０１１９】
実施例４：ボルデテラマルチプレックスアッセイの交叉反応性
交叉反応性アッセイのためには，対照の鼻スワブ標本を試験生物の１つ（各生物についてｎ＝５）でスパイクし，上述した方法にしたがってＤＮＡを抽出した。ただし，Ｓ．ａｕｒｅｕｓについては，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ陽性であることが知られている臨床鼻スワブ標本を用いた（すなわち，Ｓ．ａｕｒｅｕｓサンプルは人為ではなく真性物である）。各サンプルについてボルデテラマルチプレックスアッセイを行った。それぞれの場合について，百日咳菌の交叉反応性については３７．０以下のＣｔ値を陽性の結果とし，パラ百日咳菌の交叉反応性については３６．５以下のＣｔ値を陽性の結果とした。
【０１２０】
下記の種について交叉反応性は測定されなかった：
Bacillus cereus
Chlamydophila pneumoniae
Haemophilus influenzae
Klebsiella pneumoniae
Legionella pneumophila
Mycoplasma pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Moraxella catarrhalis
インフルエンザ A
インフルエンザ B
RSV B
ヒトランダム対照ＤＮＡ
【０１２１】
また，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを，５つの独立した人為鼻スワブサンプルを用いて交叉反応性について試験した。５つのサンプルのそれぞれは二重に試験した。試験したサンプルのうち２つは両方の複製物について百日咳菌についてやや陽性であった（それぞれのＣｔ値は３６．６５および３６．４６）。陽性サンプルのそれぞれは，ＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイにおいて百日咳菌について陽性であった。Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを含むリストされた生物のいずれについても，パラ百日咳菌との交叉反応性は認められなかった。入り交じった陽性結果にもかかわらず，ＢＬＡＳＴ検索は，百日咳菌とパラ百日咳菌とＨ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅについてのマルチプレックスＰＣＲプライマーの間には相同性がないことを示した。
【０１２２】
特に明記しないかぎり，本明細書で用いられるすべての技術および科学用語は，本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味をもつ。
【０１２３】
本明細書に例示的に記載される本発明は，本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数または複数），制限（単数または複数）を適宜除いて実施することができる。したがって，例えば“・・・を含む”，“・・・を含有する”，“・・・が含まれる”等の用語は広範に，制限なしに理解すべきである。さらに，本明細書で用いられる用語および表現は，記述のための用語として使用するものであって制限を与えるものではなく，それらの用語および表現の使用に際しては，表示および記述する特徴の同等物またはその一部のいずれをも除外する意図はなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で種々の改変が可能であることが認識される。
【０１２４】
すなわち，好ましい態様および選択可能な特徴によって本発明を具体的に開示してきたが，当業者は，本明細書に開示する本発明の改変，改善，および変更をなすことができ，それらの改変，改善，および変更は本発明の範囲内に含まれるとみなされる。本明細書に記載される物質，方法，および実施例は好ましい態様の代表的なものであり，例証であって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１２５】
本発明について広範かつ一般的に記載した。包括的な開示に含まれる，より狭義の種および亜群もそれぞれ本発明の一部を為す。属（genus）から任意の対象を除去する条件付きまたは消極的制限を有する本発明の一般的な記述は，その除外された要素が具体的に本明細書に記載されているか否かに拘わらず，これに含まれる。
【０１２６】
さらに，本発明の特徴または観点がマーカッシュ群で記載されている場合，当業者に認識されるように，本発明はマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群に関しても記載されている。
【０１２７】
本明細書に記載する全ての文献，特許出願，特許，および参照は，そのそれぞれが個々に参照により組み込まれたのと同程度に，その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる。不一致が生じる場合，定義を含む本明細書が優先する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は，病原体の検出の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の本発明の背景に関する記載は，単に読者の本発明に関する理解を促進するために提供するものであり，本発明に対する従来技術を記述または構成すると認めるものではない。
【０００３】
百日咳は，伝染性の強い呼吸系の疾病である。百日咳の症状としては，激しい咳および続く吸入フープ，時には嘔吐のエピソードがある。極端な場合には，これらの症状は低酸素症，永久脳障害，さらには死亡につながる。大部分の症例（８０−９８％）は，小さいグラム陰性の細菌である百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）により引き起こされるが，少ないが無視できない数の症例（２−２０％）はパラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）により引き起こされる（Ｍａｔｔｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１８：３２６−３８２，２００５）。パラ百日咳菌により引き起こされる百日咳の症状は，典型的には百日咳菌により引き起こされるものより軽いが，臨床兆候のみに基づく鑑別診断は困難である。まれに，Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａまたはＢ．ｈｏｌｍｅｓｉｉの感染により引き起こされる百日咳様の症状がある。
【０００４】
百日咳をその初期に診断することは，兆候および症状が他の一般的呼吸器疾患，例えば，風邪，インフルエンザ，または気管支炎と似ているため，困難である。伝統的には，百日咳を決定的に診断するために細菌の培養が用いられてきた。患者の鼻および／または喉から粘液を採取し，培養のために医学実験室に送る。陽性の結果は決定診断であると見なされるが，ボルデテラ属の培養には，診断が得られるまで典型的には５から７日間を要する。また，ボルデテラ属の細菌の培養は，細菌の難しい性質のため偽陰性の結果を生じやすい。
【０００５】
抗体アッセイ，例えばＥＬＩＳＡも，特徴的な細菌抗原を検出することによりボルデテラ種を診断するために用いられている。最も一般的には，ボルデテラ感染を示すために，百日咳毒素蛋白質の検出が用いられている。これらの抗体に基づくアッセイは良好な感度および特異度を有するが，これらは典型的には，非侵襲的に採取した粘膜サンプルではなく患者血液のサンプルを必要とし，さらに，感染が初期および／または回復期であることを必要とする。したがって，これらのアッセイは，疾病経過の適切な時に患者サンプルを取得しないと，偽陰性の結果を生じやすい。
【０００６】
ボルデテラ感染を検出する別の方法としては，直接蛍光抗体（ＤＦＡ）試験および種々のＰＣＲ系の方法がある。ＤＦＡ試験は，非侵襲的に取得した粘膜サンプルを用いてボルデテラを検出することができるという利点を有するが，感度があまり高くない。ＰＣＲ系のアッセイは広く用いられるようになってきている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】（Ｍａｔｔｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１８：３２６−３８２，２００５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は，生物学的サンプルにおいて百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の存在または非存在を判定するための組成物および方法を提供する。本発明は，単独で，または臨床症状または他の指標と組み合わせて，百日咳について個体を診断するために用いることができる。詳細には，本発明は，サンプル中で細菌の核酸の存在を検出することにより，百日咳を引き起こすことが知られている病原性細菌（ボルデテラ種）の検出を可能とする。検出の方法論は，細菌のゲノム中において細菌感染の有用な指標である特定の標的配列を発見したことに基づく。
【０００９】
したがって，１つの観点においては，本発明は，生物学的サンプルにおいて，
（ａ）配列番号２またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ４８１標的核酸，および
（ｂ）配列番号８またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ１００１標的核酸
の存在または非存在を検出することにより，百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の存在または非存在を判定する方法を提供し，ここで，前記ＩＳ４８１標的核酸の存在は百日咳菌の存在を示し，前記ＩＳ１００１標的核酸の存在はパラ百日咳菌の存在を示す。
【００１０】
ある態様においては，ＩＳ４８１標的核酸およびＩＳ１００１標的核酸の一方または両方を増幅する（例えばＰＣＲにより）。
【００１１】
別の態様においては，本発明の方法は下記の工程を含む：
（ａ）ＩＳ４８１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適した第１のプライマー対を用意し，およびＩＳ１００１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適した第２のプライマー対を用意し，
（ｂ）ＩＳ４８１標的核酸がサンプル中に存在する場合には第１の反応生成物が生成し，ＩＳ１００１標的核酸がサンプル中に存在する場合には第２の反応生成物が生成するのに適した条件下で，工程（ａ）のプライマー対を含むマルチプレックスプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号２またはその相補体のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有する第１の反応生成物の存在または非存在を検出することにより，百日咳菌の存在または非存在を判定し，および／または，配列番号８またはその相補体のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有する第２の反応生成物の存在または非存在を検出することにより，パラ百日咳菌の存在または非存在を判定する。
【００１２】
別の観点においては，本発明はまた，配列番号２またはその相補体の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ４８１標的核酸の存在または非存在を検出することにより，生物学的サンプル中において百日咳菌の存在または非存在を判定する方法を提供する。
【００１３】
１つの態様においては，百日咳菌を検出する方法は以下の工程を含む：
（ａ）ＩＳ４８１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ４８１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合には反応生成物が生成するのに適した条件下で工程（ａ）のプライマー対を含むプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有する反応生成物の存在または非存在を検出することにより，百日咳菌の存在または非存在を判定する。
【００１４】
別の観点においては，本発明はまた，配列番号８またはその相補体の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ１００１標的核酸の存在または非存在を検出することにより，生物学的サンプル中においてパラ百日咳菌の存在または非存在を判定する方法を提供する。
【００１５】
１つの態様においては，パラ百日咳菌を検出する方法は，以下の工程を含む：
（ａ）ＩＳ１００１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ１００１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合には反応生成物が生成するのに適した条件下で工程（ａ）のプライマー対を含むプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号８のヌクレオチド配列またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有する反応生成物の存在または非存在を検出することにより，パラ百日咳菌の存在を判定する。
【００１６】
本発明のすべての観点の好ましい態様においては，ＩＳ４８１反応生成物は，配列番号２またはその相補体と少なくとも９５％（例えば，少なくとも９９％または１００％）同一である少なくとも２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，１００，１２５，または１４０個の連続する核酸を含む。。別の好ましい態様においては，ＩＳ４８１反応生成物は，配列番号３またはその相補体の少なくとも１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，または８５個の連続する核酸と少なくとも９５％（例えば少なくとも９９％または１００％）同一である。別の好ましい態様においては，ＩＳ４８１反応生成物は，約１７５，１５０，１２５，１００，または７５未満の核酸の長さである。
【００１７】
別の好ましい態様においては，ＩＳ４８１プライマー（すなわち，ＩＳ４８１またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー）の少なくとも１つは，配列番号４または５の配列またはその相補体を有する核酸を含む。１つの態様においては，ＩＳ４８１標的核酸は，オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出される。オリゴヌクレオチドプローブは，好ましくは配列番号６または２７の配列またはその相補体を有し，検出可能なように標識されている。別の好ましい態様においては，検出可能な標識は蛍光標識である。
【００１８】
本発明のすべての観点の好ましい態様においては，ＩＳ１００１反応生成物は，配列番号８またはその相補体と少なくとも９５％（例えば，少なくとも９９％または１００％）同一である，少なくとも２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，１００，１２５，１４０，１６０，または１８０個の連続する核酸を含む。別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１反応生成物は，配列番号９またはその相補体の少なくとも１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０または７０個の連続する核酸と少なくとも９５％（例えば少なくとも９９％または１００％）同一である。別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１標的核酸は，約１７５，１５０，１２５，１００，または７５未満の核酸の長さである。
【００１９】
別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１プライマー（すなわち，ＩＳ１００１またはそのフラグメントを増幅するのに適当なプライマー）の少なくとも１つは，配列番号１０または１１の配列またはその相補体を有する核酸を含む。１つの態様においては，ＩＳ１００１反応生成物は，オリゴヌクレオチドプローブを用いて検出する。オリゴヌクレオチドプローブは，好ましくは配列番号１２の配列またはその相補体を有し，検出可能なように標識されている。別の好ましい態様においては，検出可能な標識は蛍光標識である。
【００２０】
上述のいずれかの方法の別の好ましい態様においては，本発明の方法はさらにリアルタイムＰＣＲを含む。別の態様においては，プライマーの少なくとも１つはスコーピオンプライマーである。好適なＩＳ４８１スコーピオンプライマーとしては，例えば，配列番号１３または２８の配列またはその相補体を有する核酸プライマーが挙げられる。好適なＩＳ１００１スコーピオンプライマーとしては，例えば，配列番号１４の配列またはその相補体を有する核酸プライマーが挙げられる。
【００２１】
別の観点においては，本発明は，ＩＳ４８１標的核酸をコードする単離された核酸を提供する。ＩＳ４８１標的核酸は，配列番号２またはその相補体の少なくとも２０（例えば，少なくとも２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，１００，１２５または１４０）個の連続するヌクレオチドと実質的に同一であり，１０００ヌクレオチド未満（例えば，７５０，５００，２５０，２００，１７５，１５０，１２５，１００，または７５ヌクレオチド未満）の長さである。１つの態様においては，ＩＳ４８１標的核酸は配列番号３の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
別の観点においては，本発明は，ＩＳ１００１標的核酸をコードする単離された核酸を提供する。ＩＳ１００１標的核酸は，配列番号８またはその相補体の少なくとも２０（例えば，少なくとも２５，３０，３５，４０，４５，５０，７５，１００，１２５，１５０，または１７５）個の連続するヌクレオチドと実質的に同一であり，１０００ヌクレオチド未満（例えば，７５０，５００，２５０，２００，１７５，１５０，１２５，１００，または７５ヌクレオチド未満）の長さである。１つの態様においては，ＩＳ１００１標的核酸は，配列番号９の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと実質的に同一のヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
別の観点においては，本発明は，ＩＳ４８１標的核酸またはＩＳ１００１標的核酸を増幅，および／または検出するのに適したオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する。本発明のＩＳ４８１プライマーおよびプローブは，１０−５０（例えば，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２５，３０，３５，４０，または４５）ヌクレオチドの長さであり，配列番号２の対応するヌクレオチド配列と実質的に同一（好ましくは１００％同一）である。本発明のＩＳ１００１プライマーおよびプローブは，１０−５０（例えば，１２，１４，１６，１８，２０，２２，２５，３０，３５，４０，または４５）ヌクレオチドの長さであり，配列番号８の対応するヌクレオチド配列と実質的に同一（好ましくは１００％同一）である。好ましい態様においては，ＩＳ４８１プライマーおよびプローブは配列番号４−６または２７のヌクレオチド配列を有する。別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１プライマーおよびプローブは配列番号１０−１２のヌクレオチド配列を有する。
【００２４】
別の観点においては，本発明は，ＩＳ４８１標的核酸およびＩＳ１００１標的核酸を増幅および検出するためのスコーピオンプライマーを提供し，ここで，スコーピオンプライマーは，それぞれ個々にオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブの要件を満たすオリゴヌクレオチドプローブ配列およびオリゴヌクレオチドプライマー配列を含む。好ましい態様においては，ＩＳ４８１スコーピオンプライマーは，配列番号１３のヌクレオチド配列を有する。別の好ましい態様においては，ＩＳ１００１スコーピオンプライマーは配列番号１４のヌクレオチド配列を有する。
【００２５】
別の観点においては，本発明は，
（ａ）配列番号２の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズする第１のプライマー対，および配列番号２の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズしうる第１のプローブ，および
（ｂ）配列番号８の配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズする第２のプライマー，および配列番号８の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズしうる第２のプローブ，
を含むキットを提供する。
【００２６】
好ましい態様においては，第１のプライマー対および／または第１のプローブは，配列番号３の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。第１のプライマー対の好ましいメンバーは配列番号４−５の配列またはその相補体を有しており，好ましい第１のプローブは配列番号６または２７の配列またはその相補体を有する。
【００２７】
別の好ましい態様においては，第２のプライマー対および／または第２のプローブは，配列番号９の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。第２のプライマー対の好ましいメンバーは，配列番号１０−１１の配列またはその相補体を有しており，好ましい第２のプローブは配列番号１２の配列を有する。
【００２８】
好ましくは，プローブはさらに検出可能な標識（例えば蛍光標識）を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ２８２２０（配列番号１）で提供される百日咳菌ＩＳ４８１挿入配列のヌクレオチド配列である。
【図２】図２は，ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６６８５８（配列番号７）で提供されるパラ百日咳菌ＩＳ１００１挿入配列のヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は，百日咳に最も一般的に関連する病原体である百日咳菌および／またはパラ百日咳菌を同定するのに適した方法，組成物，およびキットを提供する。本発明は，個体から得た生物学的サンプル中で，百日咳菌の挿入配列ＩＳ４８１および／またはパラ百日咳菌の挿入配列ＩＳ１００１をリアルタイムＰＣＲで検出することに基づく。これらの挿入配列は比較的高いゲノムコピー数を有するため，ＰＣＲ系の診断アッセイに用いるのに有益である。百日咳菌ゲノムは，典型的には約１００−２００コピーのＩＳ４８１配列を含む。そして，パラ百日咳菌ゲノムは，典型的には約２０コピーのＩＳ１００１配列を含む。
【００３１】
本明細書において用いる場合，特に記載しないかぎり，単数形“ａ，”“ａｎ，”および“ｔｈｅ”には，複数形の参照が含まれる。すなわち，例えば，“ａｎ”オリゴヌクレオチドには複数のオリゴヌクレオチド分子が含まれ，“ａ”核酸は１またはそれ以上の核酸を表す。
【００３２】
本明細書において用いる場合，“約”とは，プラスマイナス１０％を意味する。
【００３３】
本明細書において用いる場合，“増幅”または“増幅する”との用語は，標的核酸をコピーし，このことにより，選択された核酸配列のコピー数を増加させる方法を含む。増幅は指数関数的であっても直線的であってもよい。標的核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。このようにして増幅された配列は，“アンプリコン”または“増幅産物”を形成する。下記に記載される例示的方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いる増幅に関するものであるが，核酸を増幅するための多くの他の方法が当該技術分野において知られている（例えば，等温法，ローリングサイクル法等）。当業者は，これらの他の方法をＰＣＲ法の代わりに，または一緒に用いることができることを理解するであろう。例えば，Ｓａｉｋｉ，“Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ”，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０，ｐｐ１３−２０；Ｗｈａｒａｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００１ Ｊｕｎ １；２９（１１）：Ｅ５４−Ｅ５４；Ｈａｆｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００１ Ａｐｒ；３０（４）：８５２−６，８５８，８６０；Ｚｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２００１ Ａｐｒ；３０（４）：８５２−６，８５８，８６０を参照。
【００３４】
本明細書においてポリヌクレオチド（すなわち，ヌクレオチド，例えばオリゴヌクレオチドまたは標的核酸の配列）に関して用いる場合，“相補体”，“相補的な”または“相補性”との用語は，標準的なワトソンクリック塩基対形成規則を表す。一方の配列の５’末端が他方の３’末端と塩基対形成するような核酸配列の相補体は，“アンチパラレル関係”である。例えば，配列“５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’”は配列“３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’”と相補的である。天然の核酸中には一般に見いだされないある種の塩基も本明細書に記載される核酸に含まれ，これらには，例えば，イノシン，７−デアザグアニン，ロック核酸（ＬＮＡ），およびペプチド核酸（ＰＮＡ）がある。相補性は完全である必要はない。安定なデュープレックスは，ミスマッチした塩基対，縮重，またはマッチしていない塩基を含んでいてもよい。核酸技術の当業者は，例えば，オリゴヌクレオチドの長さ，オリゴヌクレオチドの塩基組成および配列，イオン強度およびミスマッチした塩基対の出現率等の多くの変数を考慮して，デュープレックスの安定性を経験的に判定することができる。相補的配列は，ＤＮＡ配列またはその相補配列に相補的なＲＮＡの配列であってもよく，ｃＤＮＡであってもよい。本明細書において用いる場合，“実質的に相補的な”との用語は，２つの配列が特異的にハイブリダイズする（下記に定義される）ことを意味する。当業者は，実質的に相補的な配列は，その長さの全体にわたってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。
【００３５】
本明細書において，検出可能な標識からのシグナルを検出してサンプル中の標的核酸の存在を示す文脈において用いる場合，“検出する”との用語は，１００％の感度および／または１００％の特異度を与える方法である必要はない。よく知られるように，“感度”とは，その人が標的核酸配列を有している場合に試験が陽性である確率である“特異度”とは，その人が標的核酸配列を有していない場合に試験が陰性である確率である。少なくとも５０％の感度が好ましいが，少なくとも６０％，少なくとも７０％，少なくとも８０％，少なくとも９０％および少なくとも９９％の感度は明らかにより好ましい。少なくとも５０％の特異度が好ましいが，少なくとも６０％，少なくとも７０％，少なくとも８０％，少なくとも９０％および少なくとも９９％の感度は明らかにより好ましい。検出は，偽陽性および偽陰性についてのアッセイを包含する。偽陰性率は，１％，５％，１０％，１５％，２０％またはそれより高く，偽陽性率は１％，５％，１０％，１５％，２０％またはそれより高くてもよい。
【００３６】
遺伝子フラグメントの文脈において“フラグメント”とは，少なくとも約２０ヌクレオチド，少なくとも約２５ヌクレオチド，少なくとも約３０ヌクレオチド，少なくとも約４０ヌクレオチド，少なくとも約５０ヌクレオチド，または少なくとも１００ヌクレオチドの，ヌクレオチド残基の配列を表す。フラグメントは，典型的には約４００ヌクレオチド未満，約３００ヌクレオチド未満，約２５０ヌクレオチド未満，約２００ヌクレオチド未満，または１５０ヌクレオチド未満である。ある態様においては，フラグメントを種々のハイブリダイゼーション法またはマイクロアレイ法において用いて，特定の病原体を同定することができる。
【００３７】
核酸（例えばオリゴヌクレオチド）に関して，“単離された”とは，天然にそれが生ずるゲノムの実質的な部分から分離されている核酸を意味する。例えば，合成的に（例えば，連続的な塩基の縮合）製造された核酸は単離されたものと考えられる。同様に，組換え的に発現された，プライマー伸張反応（例えばＰＣＲ）により製造された，または他の方法によりゲノムから切り出された核酸も，単離されたものと考えられる。
【００３８】
本明細書において用いる場合，“マルチプレックスプライマー伸張反応”との用語は，同じ反応容器中で２またはそれ以上の標的核酸の相補的コピーを同時に生成することができるプライマー伸張反応を表す。各反応生成物は，別々のプライマー対を用いてプライミングされる。マルチプレックス反応はさらに，異なる検出可能成分で検出可能なように標識された，各産物に特異的なプローブを含んでいてもよい。好ましい態様においては，マルチプレックスプライマー伸張反応は，同じ反応容器中の２またはそれ以上の産物が増幅されるマルチプレックスＰＣＲである。
【００３９】
本明細書において用いる場合，“オリゴヌクレオチド”との用語は，デオキシリボヌクレオチド，リボヌクレオチドまたはこれらの任意の組み合わせから構成される短いポリマーを表す。オリゴヌクレオチドは，一般に，約１０，１１，１２，１３，１４または１５から約１５０ヌクレオチド（ｎｔ）の長さであり，より好ましくは約１０，１１，１２，１３，１４，または１５から約７０ｎｔ，最も好ましくは約１８から約２６ｎｔの長さである。ヌクレオチドの一文字コードは，ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｏｆｆｉｃｅ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐａｔｅｎｔ Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，セクション２４２２，表１に記載されるとおりである。この点に関して，ヌクレオチドの表記において，“Ｒ”はプリン，例えばグアニンまたはアデニンを意味し，“Ｙ”はピリミジン，例えばシトシンまたはチミジン（ＲＮＡの場合にはウラシル）を意味する。“Ｍ”はアデニンまたはシトシンを意味する。オリゴヌクレオチドは，プライマーとして，またはプローブとして用いることができる。
【００４０】
標的核酸を特異的に増幅する（すなわち，特定の標的核酸配列を増幅する），または特異的に検出する（すなわち，特定の標的核酸配列を検出する）ためにプライマーまたはプローブとして用いられるオリゴヌクレオチドは，一般に，標的核酸に特異的にハイブリダイズすることができる。
【００４１】
“病原体”とは，哺乳動物（例えばヒト）において百日咳または関連する状態を引き起こしうる任意の微生物を意味する。特定の病原体としては，例えば，百日咳菌およびパラ百日咳菌が挙げられる。
【００４２】
本明細書において用いる場合，増幅用の“プライマー”とは，標的ヌクレオチド配列に相補的であり，ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの存在下でプライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加を導くオリゴヌクレオチドである。最適な発現および増幅のためには，プライマーの３’ヌクレオチドは一般に，対応するヌクレオチド位置において標的配列と同一であるべきである。本明細書において用いる場合，“プライマー”との用語は，合成することができるすべての形のプライマーを含み，例えば，ペプチド核酸プライマー，ロック核酸プライマー，ホスホロチオエート修飾プライマー，標識したプライマー等が含まれる。本明細書において用いる場合，“フォワードプライマー”とは，ｄｓＤＮＡのアンチセンス鎖に相補的なプライマーである。“リバースプライマー”とは，ｄｓＤＮＡのセンス鎖に相補的なプライマーである。“プライマー対”とは，それぞれ同じ標的核酸に特異的なフォワードプライマーとリバースプライマーとの組み合わせを表す。
【００４３】
プライマーは，典型的には約１０から約１００ヌクレオチドの長さであり，好ましくは約１０から約６０ヌクレオチドの長さであり，最も好ましくは約１３から約２５ヌクレオチドの長さ（例えば，１３，１５，１７，１９，２１，または２３ヌクレオチド長）である。最適なハイブリダイゼーションまたはポリメラーゼ連鎖反応増幅のための標準的な長さはない。特定のプライマー用途のための最適な長さは，Ｈ．Ｅｒｌｉｃｈ（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，（１９８９））に記載されるようにして容易に決定することができる。
【００４４】
標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチド（例えば，プローブまたはプライマー）は，適当な条件下で標的核酸と“ハイブリダイズ”する。本明細書において用いる場合，“ハイブリダイゼーション”または“ハイブリダイズする”とは，所定のハイブリダイゼーション条件下でオリゴヌクレオチドの一本鎖が塩基対形成により相補鎖とアニーリングするプロセスを表す。
【００４５】
“プライマー伸張反応”とは，オリゴヌクレオチドプライマーが標的核酸にハイブリダイズし，個々の相補的ヌクレオチドがポリメラーゼにより３’付加されることにより標的核酸の相補的コピーが生成される合成反応を意味する。好ましい態様においては，プライマー伸張反応はＰＣＲである。
【００４６】
本明細書において用いる場合，“サンプル”または“生物学的サンプル”との用語は，患者（例えばヒト患者）から得た臨床サンプルを表す。好ましい態様においては，サンプルは，被験者から採取した組織，体液，または微生物から得る。サンプルの起源としては，限定されないが，粘液，痰（処理済みまたは未処理），気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ），気管支洗浄液（ＢＷ），血液（例えば，全血，血漿，および血清），体液，脳脊髄液（ＣＳＦ），尿，血漿，血清，または組織（例えば，生検サンプル）が挙げられる。好ましいサンプル起源には，鼻咽頭スワブおよび／または咽頭スワブが含まれる。
【００４７】
本明細書において用いる場合，“スコーピオンプライマー”とは，蛍光団／消光剤の対をもつヘアピン構造を含む５’伸張プローブテールを有する３’プライマーを含むオリゴヌクレオチドを表す。任意に，スコーピオンプライマーはさらに，プローブ成分をプライマー成分から離す増幅ブロッカー（例えば，ヘキサエチレングリコール（“ＨＥＧ”）を含んでいてもよい。本明細書に詳細に記載されるように，Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマーはスコーピオンプライマーの一例である。
【００４８】
本明細書において用いる場合，“Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）検出システム”との用語は，リアルタイムＰＣＲの方法を表す。この方法は，ポリメラーゼブロッキング基によりプローブ要素に共有結合したＰＣＲプライマー要素を含む二官能性分子（本明細書において“Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）”と称する）を利用する。さらに，各Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）分子は，消光剤と相互作用してバックグラウンド蛍光を減少させる蛍光団を含む。
【００４９】
“特異的ハイブリダイゼーション”とは，核酸配列が高度の相補性を共有することを示す。許容されるアニーリング条件では，特異的ハイブリダイゼーション複合体が形成され，続く洗浄段階の後にもハイブリダイズしたままである。核酸配列のアニーリングについての許容される条件は，当業者が日常的に決定することができ，例えば，約６×ＳＳＣの存在下で６５℃で生ずる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは，部分的には，洗浄工程を行う温度により表すことができる。そのような温度は，典型的には，所定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱溶融点（Ｔｍ）より約５℃から２０℃低いように選択される。Ｔｍは５０％の標的配列が完全にマッチしたプローブとハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨにおける）である。Ｔｍを計算するための等式および核酸ハイブリダイゼーションの条件は当該技術分野において知られている。
【００５０】
本明細書において用いる場合，オリゴヌクレオチドは，オリゴヌクレオチドと核酸とをアライメントさせたときにオリゴヌクレオチドが核酸の一部と少なくとも５０％の配列同一性を有する場合，核酸に“特異的”である。核酸に特異的なオリゴヌクレオチドは，適切なハイブリダイゼーションまたは洗浄条件下で，目的とする標的にハイブリダイズすることができるが，目的としない核酸には実質的にハイブリダイズしないものである。より高いレベルの配列同一性が好ましく，例えば，少なくとも７５％，少なくとも８０％，少なくとも８５％，少なくとも９０％，少なくとも９５％，より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性が好ましい。配列同一性は，当該技術分野においてよく知られるアルゴリズムを利用する市販のコンピュータプログラムをデフォルトの設定で用いることにより決定することができる。本明細書において用いる場合，“高い配列同一性”を有する配列は，アライメントしたヌクレオチド位置の少なくとも約５０％，好ましくはアライメントしたヌクレオチド位置の少なくとも約６０％，より好ましくはアライメントしたヌクレオチド位置の少なくとも約７５％において同一のヌクレオチドを有する。
【００５１】
本明細書において用いる場合，核酸に関して“実質的に同一”との用語は，参照核酸配列と少なくとも８０％，８５％，９０％，９５％，または９９％の配列同一性を有するものである。比較する長さは，好ましくは核酸の全長であるが，一般に，少なくとも２０ヌクレオチド，３０ヌクレオチド，４０ヌクレオチド，５０ヌクレオチド，７５ヌクレオチド，１００ヌクレオチド，１２５ヌクレオチド，またはそれ以上である。
【００５２】
オリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマー対に関して“増幅するのに適した”とは，標的核酸に特異的にハイブリダイズし，標的核酸の相補的コピーが合成されるプライマー伸張反応の開始部位を与えることができるプライマーを意味する。
【００５３】
本明細書において用いる場合，“標的核酸”または“標的配列”との用語は，増幅し検出すべき目的とするヌクレオチドのセグメントを含む配列を表す。増幅反応の間に生成した標的配列のコピーは，増幅産物，アンプリマーまたはアンプリコンと称される。標的核酸は，染色体のセグメント，遺伝子間配列を含むかまたは含まない完全な遺伝子，遺伝子間配列を含むかまたは含まない遺伝子のセグメントまたは一部，またはプローブまたはプライマーを設計する核酸の配列から構成されることができる。標的核酸は，野生型配列，変異，欠失または重複，タンデムリピート領域，目的とする遺伝子，目的とする遺伝子の領域またはその任意の上流または下流の領域を含んでいてもよい。標的核酸は，特定の遺伝子の代替配列またはアレルであってもよい。標的核酸は，ゲノムＤＮＡ，ｃＤＮＡ，またはＲＮＡに由来するものでありうる。本明細書において用いる場合，標的核酸は，細胞から抽出されたＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく，これらからコピーまたは増幅された核酸であってもよく，抽出され亜硫酸水素反応によりさらに変換された核酸を含んでいてもよい。
【００５４】
本明細書において用いる場合，“ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ検出システム”とは，リアルタイムＰＣＲの方法を表す。この方法においては，増幅された核酸セグメントにハイブリダイズするＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲ反応混合物中に含める。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは，プローブのいずれかの末端に，ドナーの蛍光が消光剤により取り込まれるよう十分に近接して，ドナーおよび消光剤蛍光団を含む。しかし，プローブが増幅されたセグメントとハイブリダイズすると，Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性がプローブを切断し，このことによりドナー蛍光団が蛍光を放出できるようになり，これを検出することができる。
【００５５】
生物学的サンプルの収集および調製
本発明の方法および組成物を用いて，個体から採取した生物学的サンプル中の病原体核酸を検出することにより，百日咳を引き起こす病原体を検出することができる。病原体検出用のサンプルには，適当な培地で成長してコロニーを形成した，単離された細菌の培養物も含まれ，ここで培養物は個体から採取した生物学的サンプルから調製したものである。
【００５６】
核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）は，当該技術分野においてよく知られる任意の方法にしたがってサンプルから単離することができる。必要な場合には，遠心分離等によりサンプルを収集または濃縮することができる。サンプルの細胞は，例えば，酵素，熱，界面活性剤，超音波処理，またはこれらの組み合わせによる処理により溶解することができる。溶解処理は，病原体に由来するＤＮＡがサンプル中に存在する場合には，ポリメラーゼ連鎖反応を用いてこれを検出するのに十分な量のＤＮＡを得るために実施する。
【００５７】
ＤＮＡの単離にはＤＮＡ抽出の種々の方法が適している。好適な方法としてはフェノール・クロロホルム抽出が挙げられる。Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅ １６．５４（１９８９）を参照。多くの市販のキット，例えば，限定されないが，ＱＩＡａｍｐ（商標）ミニブラッドキット，Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｇｅｎｆｉｎｄ（商標），Ｒｏｃｈｅ Ｃｏｂａｓ（登録商標），Ｒｏｃｈｅ ＭａｇＮＡ Ｐｕｒｅ（登録商標），またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｐｈａｓｅ Ｌｏｃｋ Ｇｅｌｓ（登録商標）を用いるフェノール・クロロホルム抽出によっても適切なＤＮＡを得ることができる。
【００５８】
標的核酸およびプライマー
本発明の種々の態様においては，本明細書に記載される方法においてオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを用いて，病原体の標的配列を増幅し検出する。ある態様においては，標的核酸には，百日咳菌のＩＳ４８１挿入配列（およびそのフラグメント）およびパラ百日咳菌のＩＳ１００１挿入配列（およびそのフラグメント）が含まれる。さらに，プライマーを用いて，１またはそれ以上の対照核酸配列を増幅することもできる。本明細書に記載される標的核酸は，単一で，またはそれぞれの標的について個々の標識を用いるマルチプレックスのフォーマットで，検出することができる。
【００５９】
当業者は，本明細書の開示に鑑みて，標的配列を増幅するのに適したプライマーを設計および製造することができる。本発明において用いる増幅プライマーの長さは，いくつかの因子，例えば，ヌクレオチド配列の種類，およびこれらの核酸がハイブリダイズする温度またはインビトロ核酸増幅の間に用いられる温度によって異なる。特定の配列の増幅プライマーの好ましい長さを決定する際に考慮すべき点は当業者によく知られている。
【００６０】
核酸分子を増幅するプライマーは，例えば，ＯＬＩＧＯ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＩｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ）等のコンピュータプログラムを用いて設計することができる。増幅プライマーとして用いるべきオリゴヌクレオチドを設計する際に重要な点としては，限定されないが，増幅産物のサイズが検出（例えば，電気泳動またはリアルタイムＰＣＲによる）を容易にするのに適当であること，プライマーの対のメンバーが同様の溶融温度を有すること，および各プライマーの長さ（すなわち，プライマーは，配列特異的にアニーリングして合成を開始するのに十分に長くなければならないが，オリゴヌクレオチド合成の間の忠実度が低下するほど長くてはならない）が挙げられる。典型的には，オリゴヌクレオチドプライマーは，１５から３５ヌクレオチドの長さである。
【００６１】
ハイブリダイゼーションプローブとして用いるべきオリゴヌクレオチドの設計は，プライマーの設計と同様にして行うことができる。オリゴヌクレオチドプライマーと同様に，オリゴヌクレオチドプローブは通常は類似した溶融温度を有し，各プローブの長さは，配列特異的ハイブリダイゼーションが生ずるのに十分なものでなければならないが，合成の間に忠実度が低下するほど長くてはならない。オリゴヌクレオチドプローブは一般に１５から６０ヌクレオチドの長さである。
【００６２】
ある態様においては，１またはそれ以上のヌクレオチド位置において縮重を有するプライマーの混合物を用意する。縮重プライマーは，標的配列中に変動性が存在する場合に，すなわち配列情報が不明瞭である場合に，ＰＣＲにおいて用いられる。典型的には，縮重プライマーは，約４未満，約３未満，好ましくは約２未満，最も好ましくは，約１未満のヌクレオチド位置において変動性を示す。
【００６３】
好適な態様においては，ＰＣＲは，二官能性プライマー／プローブ組み合わせ（例えばＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマー）を用いて実施する。本発明において用いる場合，スコーピオンプライマーは，蛍光団／消光剤の対を有するヘアピン構造を含む５’側に延長されたプローブテールを有する３’プライマーを含む。ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）が含まれているため，ＰＣＲの間，ポリメラーゼは，プローブテールへと伸張することができないよう妨害されている。第１ラウンドの増幅の間，３’標的特異的プライマーは標的にアニーリングし，５’プローブ用の新たに合成された標的領域を有する，新たに合成された鎖中に，Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）が取り込まれるように伸張される。次のラウンドの変性およびアニーリングの間に，スコーピオンプライマーのヘアピンループのプローブ領域は標的にハイブリダイズし，したがって，蛍光団と消光剤とが分離され，測定可能なシグナルが生成する。そのようなプローブは，Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：８０４−８０７（１９９９）に記載されている。
【００６４】
核酸の増幅
核酸サンプルまたは単離された核酸は，当業者に知られる種々の方法により増幅することができる。好ましくは，ＰＣＲを用いて目的とする核酸を増幅する。簡単には，ＰＣＲにおいては，マーカー配列の反対側の相補鎖の領域に相補的な２つのプライマー配列を用意する。過剰のデオキシヌクレオチド三リン酸を，ＤＮＡポリメラーゼ，例えば，Ｔａｑポリメラーゼとともに反応混合物に加える。上述のようにテンプレートの配列が改変されている場合には，増幅混合物は，好ましくはＵＮＧヌクレアーゼを含まない。
【００６５】
標的配列がサンプル中に存在すると，プライマーは配列に結合し，ポリメラーゼによりヌクレオチドが付加されることによりプライマーは標的配列に沿って伸張する。反応混合物の温度を上昇または低下させることにより，伸張したプライマーはマーカーから解離して反応生成物を形成し，過剰のプライマーはマーカーおよび反応生成物に結合し，このプロセスが繰り返されて，増幅産物が生成する。サイクルのパラメータは，伸張すべき増幅産物の長さに基づいて様々でありうる。オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブを利用して，内部陽性増幅対照（ＩＰＣ）をサンプル中に含めることができる。ＩＰＣを用いて，変換プロセスおよびそれに続く増幅との両方をモニターすることができる。
【００６６】
好適な態様においては，リアルタイムＰＣＲは，ＰＣＲ増幅産物の蓄積を検出することができる任意の適当な装置を用いて行う。最も一般的には，装置は１またはそれ以上の蛍光標識からの蛍光を検出することができる。例えば，装置（例えば，ＡＢＩ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ７５００（登録商標）配列検出器）におけるリアルタイム検出は，各ＰＣＲサイクルの間に蛍光をモニターし，レポーターシグナルの測定値またはＲｎ値を計算する。閾値サイクルまたはＣｔ値は，蛍光が閾値と交叉するときのサイクルである。閾値は，配列検出システムのソフトウエアにより，または手動で決定する。
【００６７】
増幅した標的核酸の検出
核酸の増幅は，例えば，ゲル電気泳動，カラムクロマトグラフィー，プローブを用いるハイブリダイゼーション，配列決定，溶融曲線分析，または“リアルタイム”検出等の，当該技術分野においてよく知られる多くの方法のいずれかを用いて検出することができる。好ましい方法においては，目的とする２またはそれ以上のフラグメントからの配列を同じ反応容器で増幅する（すなわち，“マルチプレックスＰＣＲ”）。検出は，反応の終点を測定することにより，または“リアルタイム”で行うことができる。リアルタイム検出用には，プライマーおよび／またはプローブは，検出可能なように標識して，例えばプライマーが取り込まれたとき，またはプローブがハイブリダイズしたとき，および，反応の間の蛍光の変化をモニターしうる装置中で増幅されたときに，異なる蛍光が得られるようにすることができる。核酸増幅のリアルタイム検出方法はよく知られており，例えば，ＴａｑＭａｎ（登録商標）システム，Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）プライマーシステム，および二本鎖核酸用のインターカレート色素の使用が挙げられる。
【００６８】
終点検出においては，アンプリコン（単数または複数）は，まずアンプリコンをサイズ分離し，次にサイズ分離したアンプリコンを検出することにより，検出することができる。異なるサイズのアンプリコンの分離は，例えば，ゲル電気泳動，カラムクロマトグラフィー，またはキャピラリー電気泳動により行うことができる。これらのおよび他の分離法は当該技術分野においてよく知られている。一例においては，サイズが１０塩基対またはそれ以上異なる約１０から約１５０塩基対のアンプリコンは，例えば，４％から５％のアガロースゲル（約１５０から約３００塩基対のアンプリコンについては２％から３％のアガロースゲル），または６％から１０％のポリアクリルアミドゲルで分離することができる。分離した核酸は，次に臭化エチジウム等の色素で染色し，得られた染色されたバンド（単数または複数）のサイズを標準ＤＮＡラダーと比較することができる。
【００６９】
ある態様においては，増幅された核酸は，特異的プローブを用いるハイブリダイゼーションにより検出する。増幅した標的配列の一部に相補的なプローブオリゴヌクレオチドを用いて，増幅したフラグメントを検出することができる。ハイブリダイゼーションは，リアルタイムで検出してもよく，非リアルタイムで検出してもよい。増幅した核酸は，標的配列のそれぞれについて同時に検出してもよく（すなわち，同じ反応容器中で），または別々に検出してもよい（すなわち，別々の反応容器中で）。好ましい態様においては，増幅されたＤＮＡは，２またはそれ以上の区別しうるように標識された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いて同時に検出する。プローブの一方は第１の標的配列にハイブリダイズし，他方は第２の標的配列にハイブリダイズする。配列が改変された核酸については，標的は上鎖または下鎖から独立して選択することができる。すなわち，検出されるべきすべての標的は，上鎖，下鎖，または上鎖と下鎖標的の組み合わせを含むことができる。
【００７０】
プローブは，当該技術分野において知られる方法により，検出可能なように標識することができる。有用な標識としては，例えば，蛍光色素（例えば，Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），ＦＩＴＣ，ローダミン，ランタニド蛍光体，テキサスレッド，ＦＡＭ，ＪＯＥ，Ｃａｌ Ｆｌｕｏｒ Ｒｅｄ ６１０（登録商標），Ｑｕａｓａｒ ６７０（登録商標）），放射性同位体（例えば，32Ｐ，35Ｓ，3Ｈ，14Ｃ，125Ｉ，131Ｉ），高電子密度試薬（例えば金），酵素（例えば，西洋ワサビペルオキシダーゼ，ベータ−ガラクトシダーゼ，ルシフェラーゼ，アルカリホスファターゼ），比色標識（例えば金コロイド），磁気標識（例えば，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）），ビオチン，ジゴキシゲニン，または抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なハプテンおよび蛋白質が挙げられる。他の標識としては，それぞれ対応するレセプターまたはオリゴヌクレオチド相補体と複合体を形成しうるリガンドまたはオリゴヌクレオチドが挙げられる。標識は，検出すべき核酸中に直接取り込ませてもよく，または検出すべき核酸にハイブリダイズまたは結合するプローブ（例えばオリゴヌクレオチド）または抗体に結合させてもよい。
【００７１】
リアルタイムＰＣＲの１つの一般的方法では，蛍光プローブ，例えば，ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ，分子ビーコン，およびスコーピオンを使用する。リアルタイムＰＣＲは，最終的な増幅された産物の量を検出する他の形の定量的ＰＣＲより高い特異度，感度および再現性をもって，テンプレートの最初の量を定量する。リアルタイムＰＣＲは，アンプリコンのサイズを検出しない。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（商標）およびＴａｑＭａｎ（登録商標）技術において用いられるプローブは，蛍光クエンチングの原理に基づいており，ドナー蛍光団とクエンチング成分とを含む。
【００７２】
好ましい態様においては，検出可能な標識は蛍光団である。本明細書において用いる場合，“蛍光団”との用語は，特定の波長（励起周波数）の光を吸収し，次により長い波長（放射周波数）の光を放出する分子を表す。本明細書において用いる場合，“ドナー蛍光団”との用語は，消光剤成分と近接している場合に，放出エネルギーを消光剤に供与ないし移動させる蛍光団を意味する。消光剤成分にエネルギーを供与した結果，ドナー蛍光団それ自体は，近接して配置された消光剤成分が存在しない場合よりも少ない特定の放出周波数の光を放出する。
【００７３】
本明細書において用いる場合，“消光剤成分”との用語は，ドナー蛍光団の近傍に位置して，ドナーにより生成された放出エネルギーを取り込み，エネルギーを熱またはドナーの放出波長より長い波長の光として消散させる分子を意味する。後者の場合，消光剤はアクセプター蛍光団であると考えられる。消光成分は，近接（すなわち衝突）クエンチングにより，またはフォスターないし蛍光共鳴エネルギー移動（“ＦＲＥＴ”）により作用する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブにおいては一般にＦＲＥＴによる消光が用いられ，分子ビーコンおよびＳｃｏｒｐｉｏｎ（商標）タイプのプローブにおいては近接消光が用いられる。
【００７４】
好適な蛍光成分としては，当該技術分野において知られる下記の蛍光団が挙げられる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，アクリジンおよび誘導体（アクリジン，アクリジンイソチオシアネート），Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ），５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ），４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ ＶＳ），Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド，アントラニルアミド，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ−６Ｇ，ＢＯＰＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０，ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ，ブリリアントイエロー，クマリンおよび誘導体（クマリン，７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ，クマリン１２０），７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマリン１５１）），Ｃｙ２（登録商標），Ｃｙ３（登録商標），Ｃｙ３．５（登録商標），Ｃｙ５（登録商標），Ｃｙ５．５（登録商標），シアノシン，４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ），５’，５"−ジブロモピロガロール−スルホネフタレイン（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ Ｒｅｄ），７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソシアナトフェニル）−４−メチルクマリン，ジエチレントリアミン四酢酸，４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸，４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸，塩化５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニル（ＤＮＳ，塩化ダンシル），４−（４’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ），４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ），Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．），エオシンおよび誘導体（エオシン，エオシンイソチオシアネート），エリスロシンおよび誘導体（エリスロシンＢ，エリスロシンイソチオシアネート），エチジウム，フルオレセインおよび誘導体（５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ），５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ），２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ），フルオレセイン，フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ），ヘキサクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＨＥＸ），ＱＦＩＴＣ（ＸＲＩＴＣ），テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）），フルオレスカミン，ＩＲ１４４，ＩＲ１４４６，マラカイトグリーンイソチオシアネート，４−メチルウンベリフェロン，オルトクレゾールフタレイン，ニトロチロシン，パラローザニリン，フェノールレッド，Ｂ−フィコエリスリン，Ｒ−フィコエリスリン，ｏ−フタルジアルデヒド，Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標），ヨウ化プロピジウム，ピレンおよび誘導体（ピレン，酪酸ピレン，酪酸スクシンイミジル１−ピレン），ＱＳＹ（登録商標）７，ＱＳＹ（登録商標）９，ＱＳＹ（登録商標）２１，ＱＳＹ（登録商標）３５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ），リアクティブレッド４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（登録商標）ブリリアントレッド３Ｂ−Ａ），ローダミンおよび誘導体（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ），６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ），リサミンローダミンＢ塩化スルホニル，ローダミン（Ｒｈｏｄ），ローダミンＢ，ローダミン１２３，ローダミングリーン，ローダミンＸイソチオシアネート，スルホローダミンＢ，スルホローダミン１０１，スルホローダミン１０１の塩化スルホニル誘導体（テキサスレッド）），Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ），テトラメチルローダミン，テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ），リボフラビン，ロゾール酸，テルビウムキレート誘導体。
【００７５】
他の蛍光ヌクレオチド類似体を用いてもよい。例えば，Ｊａｍｅｓｏｎ，２７８ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３６３−３９０（１９９７）；Ｚｈｕ，２２ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４１８−３４２２（１９９４）を参照。米国特許５，６５２，０９９および６，２６８，１３２もまた，酵素的または化学的合成のいずれかにより核酸，例えば，ＤＮＡおよび／またはＲＮＡまたはオリゴヌクレオチド中に取り込ませて蛍光オリゴヌクレオチドを作製するためのヌクレオシド類似体を記載する。米国特許５，１３５，７１７は，蛍光標識として用いるためのフタロシアニンおよびテトラベンズトリアザポルフィリン試薬を記載する。
【００７６】
適当な消光剤は，特定の蛍光団の蛍光スペクトルに基づいて選択する。有用な消光剤としては，例えば，ｔｈｅ Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ（商標）消光剤であるＢＨＱ−１，ＢＨＱ−２，およびＢＨＱ−３（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），およびＡＴＴＯシリーズの消光剤（ＡＴＴＯ５４０Ｑ，ＡＴＴＯ５８０Ｑ，およびＡＴＴＯ６１２Ｑ；Ａｔｔｏ−ＴｅｃＧｍｂＨ）が挙げられる。
【００７７】
検出可能な標識は，核酸中に取り込ませるか，会合させるか，またはコンジュゲートさせることができる。標識は，種々の長さのスペーサーアームにより結合させて，立体傷害または他の有用なまたは望ましい特性に与える影響を低減させることができる。例えば，Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，９ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ １４５−１５６（１９９５）を参照。検出可能な標識は，共有結合または非共有結合手段により，例えば，クレノーポリメラーゼを用いるランダム−プライマー標識による転写，またはニックトランスレーション，または増幅，または当該技術分野において知られる同等の方法により，核酸中に取り込ませることができる。例えば，ヌクレオチド塩基を検出可能な成分，例えば蛍光色素とコンジュゲートさせ，次これを核酸合成または増幅の間に核酸中に取り込ませる。
【００７８】
スコーピオンプライマーを用いると，配列特異的プライミングおよびＰＣＲ産物の検出を単一の分子を用いて行うことができる。スコーピオンプライマーは，ハイブリダイズしていない状態ではステム・ループ構造を保持している。蛍光団は，５’末端に結合しており，３’末端に結合している成分によりクエンチされているが，好適な態様ではこの配置は逆でもよい。ステムおよび／またはループの３’部分はまた，プライマーの伸張産物に相補的な配列を含む。この配列は，特異的プライマーの５’末端に増幅可能でないモノマーを介して連結されている。プライマー成分の伸張後，特異的プローブ配列は伸張されたアンプリコン中のその相補体に結合することができ，このためヘアピンループが開く。このことにより蛍光の消光が妨害され，シグナルが観察される。特異的標的は，リバースプライマーおよびスコーピオンプライマーのプライマー部分により増幅され，伸張産物が生ずる。スコーピオンプライマーのプローブ要素が伸張産物に結合することにより，蛍光団が消光剤から離れ，蛍光シグナルが生成する。
【００７９】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ｈｅｉｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ６：９８６−９９４，１９９６）は，Ｔａｑポリメラーゼの蛍光発生性５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して，ｃＤＮＡサンプル中の標的配列の量を測定する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは，通常は５’塩基またはその近傍に位置するドナー蛍光団，および典型的には３’塩基またはその近傍に位置するクエンチング成分を含むオリゴヌクレオチドである。消光剤成分は，ＴＡＭＲＡ等の色素であってもよく，非蛍光分子，例えば，４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）であってもよい。Ｔｙａｇｉ，ｅｔ ａｌ．，１６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４９−５３（１９９８）を参照。照射されると，励起された蛍光ドナーは，蛍光を発生するのではなく，ＦＲＥＴによりエネルギーを近傍のクエンチング成分に移動させる。すなわち，ドナーと消光剤とが近接することにより，ドナー蛍光の放出が妨害されるが，プローブは無傷のままである。
【００８０】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは，ＰＣＲ産物の内部領域にアニーリングするよう設計される。ポリメラーゼ（例えばリバーストランスクリプターゼ）がＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが結合したテンプレートを複製すると，その５’エキソヌクレアーゼ活性によりプローブが切断される。このことにより，消光剤（ＦＲＥＴなし）の活性が消失し，ドナー蛍光団は蛍光を放出し始め，これは各サイクルでプローブの切断速度と比例して増加する。ＰＣＲ産物の蓄積は，レポーター色素の増加をモニターすることにより検出する（プライマーは標識されていないことに注意）。消光剤がアクセプター蛍光団である場合には，ＰＣＲ産物の蓄積は，アクセプター蛍光団の蛍光の減少をモニターすることにより検出することができる。
【００８１】
百日咳菌の検出
患者における百日咳菌の存在は，生物学的サンプル中のＩＳ４８１挿入配列をコードする核酸またはその診断用フラグメントの存在を検出することにより判定することができる。百日咳菌ＩＳ４８１のヌクレオチド配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号Ｍ２８２２０で与えられ，図１（配列番号１）に示される。
【００８２】
好ましい態様においては，標的核酸は，ＩＳ４８１のヌクレオチド５５３−６９３またはそのフラグメントに対応し，以下に配列番号２として示される。
1 gcgccctggc caccgggtca cgggcaaccg acgcgatacc gttgaggggg ccggctggga
61 cttcgtcttc gtggccatcg atgaccacgc ccgcgtggcc ttcaccgaca tcccccccga
121 cgagcgcttc cccagcgccg t
配列番号２
【００８３】
全長標的核酸配列，またはその任意の一部は，任意の適当なプライマーおよびプローブを用いて増幅し，検出することができる。１つの特に有用な標的核酸配列は，ＩＳ４８１のヌクレオチド５８０−６６５（配列番号３）を含み，これは，配列番号２のヌクレオチド２８−１１３に対応する。有用なプライマーとしては，例えば，ＩＳ４８１のヌクレオチド５８０−５９７（配列番号４）および６４８−６６５（配列番号５）（上述の標的核酸中で下線で示される）またはその相補体に向けられたものが挙げられる。有用なプローブは，増幅されたＩＳ４８１配列の任意の有用な領域，例えば，ＩＳ４８１のヌクレオチド６２３−６４２（配列番号６）およびヌクレオチド６０４−６２８（配列番号２７）（それぞれ配列番号２のヌクレオチド７１−９０および５２−７６）またはその相補体に向けられたものである。
【００８４】
配列番号６のプローブを用いるＢＬＡＳＴ検索は，百日咳菌およびＢ．ｈｏｌｍｅｓｉｉのＩＳ４８１標的核酸配列との完全なマッチを示した。さらに，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのゲノム中に１８／２０ヌクレオチドのマッチが，およびＭａｇｎａｐｏｒｔｈｅ，ｇｒｉｓｅａおよびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ，ｏｒｙｚａｅのゲノム中に１７／２０ヌクレオチドのマッチがある。下記に示されるように，Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ，Ｍ．ｇｒｉｓｅａ，およびＸ．ｏｒｙｚａｅについては，配列番号４−５のプライマーとの有意な配列同一性はない。したがって，これらの種は，配列番号４−５の増幅プライマーを用いた場合には有意な偽陽性の原因ではないはずである。配列番号６のプローブの交叉反応性は，このレベルの非相同性でのハイブリダイゼーションを阻害するのに十分な高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を用いることにより，低減または排除することができる。
【００８５】
配列番号４−５のプライマー配列を用いるＢＬＡＳＴ検索は，百日咳菌およびＢ．ｈｏｌｍｅｓｉｉのＩＳ４８１標的核酸配列との完全なホモロジーを示した。Ｂ．ｈｏｌｍｅｓｉｉによるヒトの感染はまれであるが，本明細書に記載されるプライマーおよびプローブにより検出することができる。また，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ａｖｉｕｍ，Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔｕｓ，Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ，およびＲｕｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌａｎｏｐｈｉｌｕｓのゲノム中の配列との１５−１７ヌクレオチドのマッチが見いだされた。しかし，これらの細菌および真菌は，ヒトに感染することは知られておらず，したがって偽陽性の診断結果の有意な原因ではないはずである。
【００８６】
パラ百日咳菌の検出
患者におけるパラ百日咳菌の存在は，生物学的サンプル中のＩＳ１００１挿入配列をコードする核酸，またはその診断用フラグメントの存在を検出することにより，判定することができる。パラ百日咳菌ＩＳ１００１のヌクレオチド配列は，Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｘ６６８５８で与えられ，図２（配列番号７）に示される。
【００８７】
好ましい態様においては，標的核酸はＩＳ１００１のヌクレオチド６８０−８５９またはそのフラグメントに対応し，下記に配列番号８として示す。
1 caattgccgc ctggggccgc ccaacgcatc aaggccgttg ccatcgacat gaccaccgcc
61 tacgagttGG AGATCCAGGC CCacagccca caggcggaga tcgtctatga cttgttccat
121 gtcgtggcca agtatggacg agaggtcatt gatcgggtgc gcgtggatca ggccaatcaa
配列番号８
【００８８】
全標的核酸配列，またはその任意の一部は，任意の適切なプライマーおよびプローブを用いて増幅および検出することができる。１つの特に有用な標的核酸配列は，ＩＳ４８１のヌクレオチド７３０−８０２（配列番号９）を含み，これは配列番号８のヌクレオチド５１−１２３に対応する。有用なプライマーとしては，例えば，ＩＳ１００１のヌクレオチド７３０−７４７（配列番号１０）および７７７−８０２（配列番号１１）（上述の標的核酸中で下線で示す）またはその相補体に向けられたものが挙げられる。１つの有用なプローブは，ＩＳ１００１のヌクレオチド７４８−７６１（配列番号１２）（上述の標的核酸中で大文字で示す）またはその相補体に向けられたものである。
【００８９】
配列番号１０−１１のプライマーを用いるＢＬＡＳＴ検索は，パラ百日咳菌のＩＳ１００１標的核酸配列との完全なマッチを示した。さらに，配列番号１０のプライマーは，Ａｃａｎｔｈｏｓｔｉｇｍａ ｐｅｒｐｕｓｉｌｌｕｍ，Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ，Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ，およびＳａｌｉｎｉｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒのゲノム中に１６ヌクレオチドおよび１７ヌクレオチドのマッチを示した。配列番号１１のプライマーは関連するいずれの種とも，短く有意ではないマッチしか示さなかった。
【実施例】
【００９０】
実施例１：サンプルの収集およびＤＮＡ抽出．
合計で３０６個の鼻咽頭スワブサンプルを用意し，アッセイのバリデーション目的で試験した。３０６個のサンプルのうち，２９０個は患者から取得した実際の臨床標本であった。残りの１６サンプルは“人為”（すなわち，陽性対照）パラ百日咳菌標本であった。人為標本は，病原体陰性の鼻咽頭スワブマトリクスを培養したパラ百日咳菌生物でスパイクすることにより調製した。
【００９１】
患者から鼻咽頭スワブを採取し，ただちにチャコールを含むエイムス（Ａｉｍｅｓ）培地または液体バイアル運搬培地（ＭｉｃｒｏＴｅｓｔ（商標）Ｍ４培地；Ｒｅｍｅｌ，Ｉｎｃ．）に入れ，運搬用に−２０℃で凍結し，アッセイまで−２０℃で保存した。
【００９２】
下記に記載されるボルデテラ種アッセイ用には，鼻咽頭スワブサンプルからＤＮＡを抽出した。簡単には，サンプルを融解し，２００μｌの各サンプルを１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに分注した。陽性対照ＤＮＡ（上述を参照）を含むかまたはＤＮＡなし（陰性対照）の２００μｌの希釈液を含む別のチューブを用意し，患者サンプルと同時に処理した。次に５μｌの内部対照ＤＮＡ（下記参照）を各サンプルに加えた。ＱＩＡａｍｐ（商標）ミニブラッドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造元の指針にしたがってＤＮＡを抽出した。
【００９３】
内部対照（ＩＣ）ＤＮＡは，アッセイされた生物のいずれにも存在しないランダム配列のＤＮＡフラグメントから構成される。５’リン酸を有する２つのオリゴヌクレオチド（ｐＩＣＦ５’ＰおよびｐＩＣＲ５’ｐ）をアニーリングさせ，生成物をｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。
【００９４】
(pIC F 5'P): 5' リン酸-aaTTCGCCCT TTGTTTCGAC CTAGCTTGCC AGTTCGCAGAA TTTGTTGCTC GTCAGTCGTC GGCGGTTTTA agggcg (配列番号 15)
(pIC R 5'P): 5' リン酸-aattcgccct TAAAACCGCC GACGACTGAC GAGCAACAAA TTCTGCGAAC TGGCAAGCTA GGTCGAAACA AAGGGCG (配列番号 16)
【００９５】
ＩＣアンプリコンは，ｐＵＣ１９配列にアニーリングする以下のプライマーにより生成した。
フォワードプライマー (PUC-For): 5' GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTA (配列番号 17)
リバースプライマー (PUC-Rev): 5' CACTTTATGC TTCCGGCTCG TA (配列番号 18)
IC アンプリコンの配列:
1 GTTTTCCCAG TCACGACGTT GTAAAACGAC GGCCAGTGAA TTCgccctta aaaccgccga
61 cgactgacga gcaacaaatt ctgcgaactg gcaagctagg tcgaaacaaa gggcggattc
121 GAGCTCGGTA CCCGGGGATC CTCTAGAGTC GACCTGCAGG CATGCAAGCT TGGCGTAATC
181 ATGGTCATAG CTGTTTCCTG TGTGAAATTG TTATCCGCTC ACAATTCCAC ACAACATACG
241 AGCCGGAAGC ATAAAGTG (配列番号 19)
【００９６】
下線を付した配列は，ｐＵＣ１９のマルチクローニング部位（ＭＣＳ）の一部である。小文字の配列は，２つの相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングさせることにより生成した。ＩＣアンプリコンは，ｐＵＣ１９配列にアニーリングする下記のプライマーにより生成した。
【００９７】
すべてのアッセイについて，陽性および陰性対照を用意し，患者サンプルと同時にアッセイした。陽性対照ＤＮＡは，単一分子中にそれぞれ百日咳菌およびパラ百日咳菌のＩＳ４８１およびＩＳ１００１標的領域を含む６２５ｂｐのＤＮＡフラグメントから構成される。陰性対照アッセイはＤＮＡを含まないものである。
【００９８】
陽性対照テンプレートを構築するためには，ＩＳ４８１およびＩＳ１００１の標的領域を増幅するようプライマーを設計し，これらをｐＵＣ１９プラスミドにタンデムにクローニングした。ＩＳ４８１フォワードプライマーはＥｃｏＲＩ制限部位を加えるように設計し（ＩＳ４８１ ＥｃｏＲＩ Ｆ），ＩＳ４８１リバースプライマーはＢａｍＨＩ制限部位を加えるように設計した（ＩＳ４８１ ＢａｍＨＩ Ｒ）。次にこれらのプライマーを用いて，百日咳菌のＩＳ４８１から２３７ｂｐのアンプリコンを生成した。
IS481 EcoRI F: 5' agcagtgaat tcggtggtgc gctacgagca (配列番号 20)
IS481 BamHI R: 5' atatgcggat ccgccactgc gtccttgagga (配列番号 21)
【００９９】
ＩＳ１００１フォワードプライマーはＢａｍＨＩ制限部位を加えるように設計し（ＩＳ１００１ ＢａｍＨＩ Ｆ），ＩＳ１００１リバースプライマーはＰｓｔＩ制限部位を加えるように設計した（ＩＳ１００１ ＰｓｔＩ Ｒ）。
IS1001 BamHI F: 5' atatgcggat ccataccgtc aagacgctgg aca (配列番号 22)
IS1001 PstI R: 5' tagcaactgc agcgatcaat gacctctcgt ccata (配列番号 23)
【０１００】
これらのプライマーを用いて，パラ百日咳菌のＩＳ１００１から３５８ｂｐのアンプリコンを生成した。
【０１０１】
次に，アンプリコンを精製し，予めＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで消化したｐＵＣ１９プラスミドにＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて同時にライゲーションした。ライゲーションしたプラスミドでＥ．ｃｏｌｉをトランスフォームし，次にアンピリシンを含むＬＢ寒天上で選択成長させた。単一コロニーを選択し，ＤＮＡを調製した。このＤＮＡを，ＳＹＢＲグリーンリアルタイムＰＣＲによるスクリーニングにおいてテンプレートＤＮＡとして，ＩＳ４８１フォワードプライマーおよびＩＳ１００１リバースプライマーとともに用いた。陽性のＳＹＢＲグリーンＰＣＲ結果を示したプラスミドを次に配列決定して，タンデムに配置されたＩＳ４８１およびＩＳ１００１標的（５９５ｂｐ），およびＢａｍＨＩ制限部位（６ｂｐ）を含む６０１ｂｐの挿入物の存在を確認した。
【０１０２】
陽性対照のアンプリコンは，タンデムの６０１ｂｐＩＳ４８１／ＩＳ１００１挿入物をテンプレートとして含むプラスミドをＩＳ４８１ ＥｃｏＲＩ ＦおよびＩＳ１００１ ＰｓｔＩ Ｒプライマーとともに用いる増幅により生成した。付加された制限部位を含めて，陽性対照アンプリコンの合計サイズは６２５ｂｐであり，以下のヌクレオチド配列を含む：
1 agcagtgaat tcggtggtgc gctacgagca tcaggccccc ggcgatctgc tgcacatcga
61 catcaagaag ctgggacgta tccagcgccc tggccaccgg gtcacgggca accgacgcga
121 taccgttgag ggggccggct gggacttcgt cttcgtggcc atcgatgacc acgcccgcgt
181 ggccttcacc gacatccccc ccgacgagcg cttccccagc gccgtccagt tcctcaagga
241 cgcagtggcg gatccatacc gtcaagacgc tggacaaggc tcggctgcgt gcgtcggtgc
301 gcgaaccgga ttggtccaag atcgagtatt tggcgatgga cgagtttgcc ctgcacaaag
361 ggcatcgcta cgcgacagtg gtggtcgatc cgatcggcag gcaggtgctg tggattggcc
421 caggacgctc acgcgagacg gcccgggcgt tcttcgaaca attgccgcct ggggccgccc
481 aacgcatcaa ggccgttgcc atcgacatga ccaccgccta cgagttggag atccaggccc
541 acagcccaca ggcggagatc gtctatgact tgttccatgt cgtggccaag tatggacgag
601 aggtcattga tcgctgcagt tgcta (配列番号 24)
【０１０３】
実施例２：ボルデテラ種のマルチプレックスＰＣＲ検出
最終ＰＣＲ試薬溶液は，以下を含んでいた：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０），ＭｇＣｌ2，ＫＣｌ，ＥＤＴＡ，ＤＴＴ，Ｔｗｅｅｎ２０，（ＮＨ4）2ＳＯ4，グリセロール，ｄＮＴＰｓ（ｄＴ，ｄＡ，ｄＧ，およびｄＣ），およびＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ（商標）。
【０１０４】
１０ＸＰＣＲプライマー溶液は，百日咳菌，パラ百日咳菌，および内部対照についてのスコーピオンプライマーおよびリバースプライマーを含むよう調製した。１０ＸＰＣＲプライマー溶液中，百日咳菌のスコーピオンおよびリバースプライマーは２μＭの最終濃度であり，パラ百日咳菌のスコーピオンおよびリバースプライマーは１．５μＭの最終濃度であり，ＩＣのスコーピオンおよびリバースプライマーは１μＭの最終濃度であった。２つの異なる百日咳菌スコーピオンプライマーを個別に試験した。プライマー対は次のとおりである：
百日咳菌(IS481):
[Q]-GCGTGGTCATCGATGGCCACcacgct-[F]-tttttt-heg-ccgacgcgataccgttga(配列番号 13) および
[Q]-agcGGCCACGAAGACGAAGTCCCAGCCGct-[F]-heg-ccgacgcgataccgttga(配列番号 28); および
リバースプライマー: ggatgtcggtgaaggcca (配列番号 25)
パラ百日咳菌 (IS1001):
[Q]-accGGGCCTGGATCTCCcggt-[F]-heg-gaccaccgcctacgagtt(配列番号 14), および
リバースプライマー: gacatggaacaagtcatagacgatct (配列番号 26)
内部標準:
[Q]-TGCGAACTGGCAAGCT-[F]-heg-attcgccctttgtttcgaccta (配列番号 15), および
リバースプライマー: CCGACGACTGACGAGCAA (配列番号 16)
【０１０５】
上述の各スコーピオンプライマーについて，Ｑ＝消光剤，Ｆ＝蛍光団，および“ｈｅｇ”＝ヘキサエチレングリコールである。プローブ配列は大文字で示される。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】
ＰＣＲ反応溶液は，実施するサンプルアッセイあたり，１２．５μｌのＰＣＲ試薬溶液，２．５μｌの１０ＸＰＣＲプライマー溶液，および５μｌの無ヌクレアーゼ水を混合することにより作製した。
【０１０８】
マルチプレックスＰＣＲ検出アッセイは９６ウエルプレートで実施した。各アッセイは，２０μｌのＰＣＲ反応溶液および５μｌの抽出した核酸（すなわち，患者サンプル，陽性対照，または陰性対照）を含むものであった。プレートを密封し，２０００ｘｇで２分間遠心分離し，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ）７５００リアルタイムＰＣＲ検出システムで測定した。ＰＣＲ反応は以下のように行った：
段階１（１サイクル）：１０分間，９５℃
段階２（４５サイクル）：工程１：９５℃，１５秒間
工程２：６０℃，３５秒間（工程２の間のデータ収集）
【０１０９】
データを収集し，患者サンプルを１またはそれ以上の病原種の存在について分析した。１またはそれ以上の病原種のいずれかについて陽性の結果を有する患者サンプルは，これらの種について陽性であると評点した。すべての病原体種について陰性の結果を有する患者サンプルは，内部対照標的核酸が検出され，陽性対照サンプルアッセイが百日咳菌およびパラ百日咳菌標的核酸の両方について陽性である場合に，陰性と評点した。
【０１１０】
実施例３：マルチプレックスＰＣＲアッセイの結果の確認
上述のマルチプレックスアッセイの結果を，他の検出アッセイと比較した。すべてのサンプルのアリコートは，マルチプレックスアッセイの結果の確認のために２回目のアッセイを行った。百日咳菌は，ＩＳ４８１挿入配列中の異なる標的核酸ならびに別個の内部対照を検出するＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイ（Ｐｒｏｄｅｓｓｅ，Ｉｎｃ．）において評価した。パラ百日咳菌は，上述のスコーピオンおよびリバースプライマーのプライマーおよびプローブ領域と同一のプライマーおよびプローブを用いて，ＩＳ１００１挿入配列についてＴａｑｍａｎ（登録商標）スタイルのアッセイを用いて評価した。
【０１１１】
３０６個のサンプルをそれぞれ，マルチプレックスアッセイにおいて百日咳菌およびパラ百日咳菌について同時にアッセイした。さらに３０６個のサンプルは，ＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイを用いて１回，およびパラ百日咳菌Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイを用いて１回アッセイした。百日咳菌アッセイ（マルチプレックスおよびＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓ）については，３７．０以下のＣｔ値を陽性として評点した。パラ百日咳菌アッセイ（マルチプレックスおよびＴａｑｍａｎ（登録商標））については，３６．５以下のＣｔ値を陽性として評点した。３つのサンプルについてのマルチプレックスアッセイは最初の反復で失敗し，２つのサンプルは繰り返し試験で失敗した。これはおそらく，臨床標本中の阻害物質が内部対照の失敗を引き起こしたためであろう。このため，下記に示される反復＃１と＃２の間では，合計が３０３から３０４に変わっている。さらに，百日咳菌についてのまたはパラ百日咳菌についての２つの試験の間で不一致であったすべてのサンプルは，マルチプレックス試験および比較試験の両方を用いて繰り返した。反復＃２からの結果には，反復試験後のサンプル結果が含まれる。各アッセイの結果は以下のとおりである。
【０１１２】
【表２】
【０１１３】
マルチプレックスアッセイの百日咳菌成分は，ＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイと９５．９％の陽性一致および９６．４％の陰性一致を示した。
【０１１４】
【表３】
【０１１５】
マルチプレックスアッセイの百日咳菌成分はＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイと９６．２％の陽性一致および９９．６％の陰性一致を示した。
【０１１６】
【表４】
【０１１７】
【表５】
【０１１８】
マルチプレックスアッセイのパラ百日咳菌成分は，Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイと９７．８％の陽性一致および１００％の陰性一致を示した。
【０１１９】
実施例４：ボルデテラマルチプレックスアッセイの交叉反応性
交叉反応性アッセイのためには，対照の鼻スワブ標本を試験生物の１つ（各生物についてｎ＝５）でスパイクし，上述した方法にしたがってＤＮＡを抽出した。ただし，Ｓ．ａｕｒｅｕｓについては，Ｓ．ａｕｒｅｕｓ陽性であることが知られている臨床鼻スワブ標本を用いた（すなわち，Ｓ．ａｕｒｅｕｓサンプルは人為ではなく真性物である）。各サンプルについてボルデテラマルチプレックスアッセイを行った。それぞれの場合について，百日咳菌の交叉反応性については３７．０以下のＣｔ値を陽性の結果とし，パラ百日咳菌の交叉反応性については３６．５以下のＣｔ値を陽性の結果とした。
【０１２０】
下記の種について交叉反応性は測定されなかった：
Bacillus cereus
Chlamydophila pneumoniae
Haemophilus influenzae
Klebsiella pneumoniae
Legionella pneumophila
Mycoplasma pneumoniae
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Moraxella catarrhalis
インフルエンザ A
インフルエンザ B
RSV B
ヒトランダム対照ＤＮＡ
【０１２１】
また，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｐａｒａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを，５つの独立した人為鼻スワブサンプルを用いて交叉反応性について試験した。５つのサンプルのそれぞれは二重に試験した。試験したサンプルのうち２つは両方の複製物について百日咳菌についてやや陽性であった（それぞれのＣｔ値は３６．６５および３６．４６）。陽性サンプルのそれぞれは，ＰｒｏＰｅｒｔｕｓｓｉｓアッセイにおいて百日咳菌について陽性であった。Ｈ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅを含むリストされた生物のいずれについても，パラ百日咳菌との交叉反応性は認められなかった。入り交じった陽性結果にもかかわらず，ＢＬＡＳＴ検索は，百日咳菌とパラ百日咳菌とＨ．ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅについてのマルチプレックスＰＣＲプライマーの間には相同性がないことを示した。
【０１２２】
特に明記しないかぎり，本明細書で用いられるすべての技術および科学用語は，本発明が属する分野の当業者が一般に理解するものと同じ意味をもつ。
【０１２３】
本明細書に例示的に記載される本発明は，本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数または複数），制限（単数または複数）を適宜除いて実施することができる。したがって，例えば“・・・を含む”，“・・・を含有する”，“・・・が含まれる”等の用語は広範に，制限なしに理解すべきである。さらに，本明細書で用いられる用語および表現は，記述のための用語として使用するものであって制限を与えるものではなく，それらの用語および表現の使用に際しては，表示および記述する特徴の同等物またはその一部のいずれをも除外する意図はなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲内で種々の改変が可能であることが認識される。
【０１２４】
すなわち，好ましい態様および選択可能な特徴によって本発明を具体的に開示してきたが，当業者は，本明細書に開示する本発明の改変，改善，および変更をなすことができ，それらの改変，改善，および変更は本発明の範囲内に含まれるとみなされる。本明細書に記載される物質，方法，および実施例は好ましい態様の代表的なものであり，例証であって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【０１２５】
本発明について広範かつ一般的に記載した。包括的な開示に含まれる，より狭義の種および亜群もそれぞれ本発明の一部を為す。属（genus）から任意の対象を除去する条件付きまたは消極的制限を有する本発明の一般的な記述は，その除外された要素が具体的に本明細書に記載されているか否かに拘わらず，これに含まれる。
【０１２６】
さらに，本発明の特徴または観点がマーカッシュ群で記載されている場合，当業者に認識されるように，本発明はマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群に関しても記載されている。
【０１２７】
本明細書に記載する全ての文献，特許出願，特許，および参照は，そのそれぞれが個々に参照により組み込まれたのと同程度に，その全体が参照により明確に本明細書に組み込まれる。不一致が生じる場合，定義を含む本明細書が優先する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中における百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の存在または非存在を同定する方法であって，
（ａ）配列番号２またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含むＩＳ４８１標的核酸，および
（ｂ）配列番号８またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含むＩＳ１００１標的核酸
の存在または非存在を検出することを含み，
ここで，前記ＩＳ４８１標的核酸の存在は百日咳菌の存在を示し，および前記ＩＳ１００１標的核酸の存在はパラ百日咳菌の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記方法は，前記ＩＳ４８１標的核酸または前記ＩＳ１００１標的核酸の少なくとも１つを増幅することを含む，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＳ４８１標的核酸は，配列番号２と少なくとも９５％同一である少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む，請求項１−２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＳ１００１標的核酸は，配列番号８と少なくとも９５％同一である少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む，請求項１−２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記方法は，
（ａ）ＩＳ４８１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適した第１のプライマー対を用意し，およびＩＳ１００１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適した第２のプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ４８１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合には第１の反応生成物が生じ，および前記サンプル中にＩＳ１００１標的核酸が存在する場合には第２の反応生成物が生ずるのに適した条件下で，工程（ａ）のプライマー対を含むマルチプレックスプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４ヌクレオチドを有する第１の反応生成物の存在または非存在を検出することにより百日咳菌の存在または非存在を判定し，および／または，配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４ヌクレオチドを有する第２の反応生成物の存在または非存在を検出することによりパラ百日咳菌の存在または非存在を判定する，
の各工程を含む，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第１の反応生成物は，配列番号３の配列またはその相補体からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む，請求項５記載の方法。
【請求項７】
第１のプライマー対の少なくとも１つのメンバーは，配列番号４または５の配列またはその相補体を含む，請求項６記載の方法。
【請求項８】
第１のプライマー対の少なくとも１つのプライマーは，配列番号１３または２８の配列またはその相補体を含む，請求項６記載の方法。
【請求項９】
第１の反応生成物は，配列番号６または２７の配列またはその相補体を含むプローブを用いて検出される，請求項６記載の方法。
【請求項１０】
プローブはさらに蛍光標識を含む，請求項９記載の方法。
【請求項１１】
第２の反応生成物は，配列番号９の配列またはその相補体からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む，請求項５記載の方法。
【請求項１２】
第２のプライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号１０または１１の配列またはその相補体を含む，請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
第２のプライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号１４の配列またはその相補体を含む，請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
第２の反応生成物は配列番号１２の配列またはその相補体を含むプローブを用いて検出される，請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
プローブはさらに蛍光標識を含む，請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
生物学的サンプル中における百日咳菌の存在または非存在を検出する方法であって，配列番号２の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含むＩＳ４８１標的核酸の存在または非存在を検出することを含む方法。
【請求項１７】
前記ＩＳ４８１標的核酸は，配列番号２の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む，請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は，
（ａ）ＩＳ４８１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ４８１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合に反応生成物が生ずるのに適した条件下で，工程（ａ）のプライマー対を含むプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４ヌクレオチドを含む反応生成物の存在または非存在を検出することにより，百日咳菌の存在または非存在を判定する，
ことを含む，請求項１６−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
反応生成物は配列番号３の配列またはその相補体からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む，請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
プライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号４または５の配列またはその相補体を含む，請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
プライマー対の少なくとも１つのプライマーは，配列番号１３または２８の配列またはその相補体を含む，請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
反応生成物は配列番号６または２７の配列またはその相補体を含むプローブを用いて検出される，請求項１８−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
プローブはさらに蛍光標識を含む，請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記方法はリアルタイムＰＣＲを含む，請求項１６−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
生物学的サンプルにおけるパラ百日咳菌の存在または非存在を検出する方法であって，配列番号８の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ１００１標的核酸の存在または非存在を検出することを含む方法。
【請求項２６】
前記ＩＳ１００１標的核酸は，配列番号８の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む，請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記方法は，
（ａ）ＩＳ１００１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ１００１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合に反応生成物が生ずるのに適した条件下で，工程（ａ）のプライマー対を含むプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４ヌクレオチドを含む反応生成物の存在または非存在を検出することにより，パラ百日咳菌の存在を判定する，
ことを含む，請求項２５−２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
反応生成物は配列番号９の配列またはその相補体からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む，請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
プライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号１０または１１の配列またはその相補体を含む，請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
プライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号１４の配列またはその相補体を含む，請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
反応生成物は配列番号１２の配列またはその相補体を含むプローブを用いて同定される，請求項２７−３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
プローブはさらに蛍光標識を含む，請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記方法はリアルタイムＰＣＲを含む，請求項２５−３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
配列番号２またはその相補体の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み，前記核酸は２００ヌクレオチド未満の長さである，単離された核酸。
【請求項３５】
前記核酸は配列番号２またはその相補体の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３４記載の核酸。
【請求項３６】
前記核酸は配列番号２またはその相補体の少なくとも４０個の連続するヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３４−３５のいずれかに記載の核酸。
【請求項３７】
前記核酸は配列番号３と同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３４−３６のいずれかに記載の核酸。
【請求項３８】
前記核酸は配列番号３と同一のヌクレオチド配列からなる，請求項３７記載の核酸。
【請求項３９】
配列番号８またはその相補体の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み，および前記核酸は２００ヌクレオチド未満の長さである，単離された核酸。
【請求項４０】
前記核酸は配列番号８またはその相補体の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３９記載の核酸。
【請求項４１】
前記核酸は配列番号８またはの少なくとも４０個の連続するヌクレオチドその相補体と同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３９−４０のいずれかに記載の核酸。
【請求項４２】
前記核酸は配列番号９と同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３９−４１のいずれかに記載の核酸。
【請求項４３】
前記核酸は配列番号９と同一のヌクレオチド配列からなる，請求項４２記載の核酸。
【請求項４４】
（ａ）配列番号２の配列を有する核酸またはその相補体に特異的にハイブリダイズする第１のプライマー対，および配列番号２の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズしうる第１のプローブ；および
（ｂ）配列番号８の配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズする第２のプライマー対，および配列番号８の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズしうる第２のプローブ，
を含むキット。
【請求項４５】
第１のプライマー対は配列番号３の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる，請求項４４記載のキット。
【請求項４６】
第１のプローブは配列番号３の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる，請求項４４−４５のいずれかに記載のキット。
【請求項４７】
第１のプライマー対の少なくとも１つのメンバーは配列番号４または５，またはその相補体の配列を含む，請求項４４−４６のいずれかに記載のキット。
【請求項４８】
第１のプローブは配列番号６または２７またはその相補体の配列を含む，請求項４４−４７のいずれかに記載のキット。
【請求項４９】
第２のプライマー対は配列番号９の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる，請求項４４−４８のいずれかに記載のキット。
【請求項５０】
第２のプローブは配列番号９の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる，請求項４４−４９のいずれかに記載のキット。
【請求項５１】
第２のプライマー対の少なくとも１つのメンバーは配列番号１０または１１，またはその相補体の配列を含む，請求項４４−４６および４８−５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５２】
第２のプローブは配列番号１２またはその相補体の配列を含む，請求項４４−４８および５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５３】
第１のプライマー対の少なくとも１つのメンバーはスコーピオンプライマーである，請求項４４−５２のいずれかに記載のキット。
【請求項５４】
スコーピオンプライマーは配列番号１３または２８，またはその相補体の配列を有する，請求項５３記載のキット。
【請求項５５】
第２のプライマー対の少なくとも１つのメンバーはスコーピオンプライマーである，請求項４４−５４のいずれかに記載のキット。
【請求項５６】
スコーピオンプライマーは配列番号１４またはその相補体の配列を有する，請求項５５記載のキット。
【請求項５７】
第１のプローブおよび第２のプローブはさらに検出可能な標識を含む，請求項４４−５６のいずれかに記載のキット。
【請求項１】
生物学的サンプル中における百日咳菌および／またはパラ百日咳菌の存在または非存在を同定する方法であって，
（ａ）配列番号２またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含むＩＳ４８１標的核酸，および
（ｂ）配列番号８またはその相補体と少なくとも９５％同一である少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含むＩＳ１００１標的核酸
の存在または非存在を検出することを含み，
ここで，前記ＩＳ４８１標的核酸の存在は百日咳菌の存在を示し，および前記ＩＳ１００１標的核酸の存在はパラ百日咳菌の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記方法は，前記ＩＳ４８１標的核酸または前記ＩＳ１００１標的核酸の少なくとも１つを増幅することを含む，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ＩＳ４８１標的核酸は，配列番号２と少なくとも９５％同一である少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む，請求項１−２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＳ１００１標的核酸は，配列番号８と少なくとも９５％同一である少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む，請求項１−２のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記方法は，
（ａ）ＩＳ４８１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適した第１のプライマー対を用意し，およびＩＳ１００１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適した第２のプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ４８１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合には第１の反応生成物が生じ，および前記サンプル中にＩＳ１００１標的核酸が存在する場合には第２の反応生成物が生ずるのに適した条件下で，工程（ａ）のプライマー対を含むマルチプレックスプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４ヌクレオチドを有する第１の反応生成物の存在または非存在を検出することにより百日咳菌の存在または非存在を判定し，および／または，配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４ヌクレオチドを有する第２の反応生成物の存在または非存在を検出することによりパラ百日咳菌の存在または非存在を判定する，
の各工程を含む，請求項１−４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第１の反応生成物は，配列番号３の配列またはその相補体からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む，請求項５記載の方法。
【請求項７】
第１のプライマー対の少なくとも１つのメンバーは，配列番号４または５の配列またはその相補体を含む，請求項６記載の方法。
【請求項８】
第１のプライマー対の少なくとも１つのプライマーは，配列番号１３または２８の配列またはその相補体を含む，請求項６記載の方法。
【請求項９】
第１の反応生成物は，配列番号６または２７の配列またはその相補体を含むプローブを用いて検出される，請求項６記載の方法。
【請求項１０】
プローブはさらに蛍光標識を含む，請求項９記載の方法。
【請求項１１】
第２の反応生成物は，配列番号９の配列またはその相補体からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む，請求項５記載の方法。
【請求項１２】
第２のプライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号１０または１１の配列またはその相補体を含む，請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
第２のプライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号１４の配列またはその相補体を含む，請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
第２の反応生成物は配列番号１２の配列またはその相補体を含むプローブを用いて検出される，請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
プローブはさらに蛍光標識を含む，請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
生物学的サンプル中における百日咳菌の存在または非存在を検出する方法であって，配列番号２の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含むＩＳ４８１標的核酸の存在または非存在を検出することを含む方法。
【請求項１７】
前記ＩＳ４８１標的核酸は，配列番号２の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む，請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は，
（ａ）ＩＳ４８１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ４８１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合に反応生成物が生ずるのに適した条件下で，工程（ａ）のプライマー対を含むプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号２のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４ヌクレオチドを含む反応生成物の存在または非存在を検出することにより，百日咳菌の存在または非存在を判定する，
ことを含む，請求項１６−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
反応生成物は配列番号３の配列またはその相補体からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む，請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
プライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号４または５の配列またはその相補体を含む，請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
プライマー対の少なくとも１つのプライマーは，配列番号１３または２８の配列またはその相補体を含む，請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
反応生成物は配列番号６または２７の配列またはその相補体を含むプローブを用いて検出される，請求項１８−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
プローブはさらに蛍光標識を含む，請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記方法はリアルタイムＰＣＲを含む，請求項１６−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
生物学的サンプルにおけるパラ百日咳菌の存在または非存在を検出する方法であって，配列番号８の少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを有するＩＳ１００１標的核酸の存在または非存在を検出することを含む方法。
【請求項２６】
前記ＩＳ１００１標的核酸は，配列番号８の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを含む，請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記方法は，
（ａ）ＩＳ１００１標的核酸またはそのフラグメントを増幅するのに適したプライマー対を用意し；
（ｂ）ＩＳ１００１標的核酸が前記サンプル中に存在する場合に反応生成物が生ずるのに適した条件下で，工程（ａ）のプライマー対を含むプライマー伸張反応を実施し；そして
（ｃ）配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一である少なくとも１４ヌクレオチドを含む反応生成物の存在または非存在を検出することにより，パラ百日咳菌の存在を判定する，
ことを含む，請求項２５−２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
反応生成物は配列番号９の配列またはその相補体からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む，請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
プライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号１０または１１の配列またはその相補体を含む，請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
プライマー対の少なくとも１つのプライマーは配列番号１４の配列またはその相補体を含む，請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
反応生成物は配列番号１２の配列またはその相補体を含むプローブを用いて同定される，請求項２７−３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
プローブはさらに蛍光標識を含む，請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記方法はリアルタイムＰＣＲを含む，請求項２５−３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
配列番号２またはその相補体の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み，前記核酸は２００ヌクレオチド未満の長さである，単離された核酸。
【請求項３５】
前記核酸は配列番号２またはその相補体の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３４記載の核酸。
【請求項３６】
前記核酸は配列番号２またはその相補体の少なくとも４０個の連続するヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３４−３５のいずれかに記載の核酸。
【請求項３７】
前記核酸は配列番号３と同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３４−３６のいずれかに記載の核酸。
【請求項３８】
前記核酸は配列番号３と同一のヌクレオチド配列からなる，請求項３７記載の核酸。
【請求項３９】
配列番号８またはその相補体の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含み，および前記核酸は２００ヌクレオチド未満の長さである，単離された核酸。
【請求項４０】
前記核酸は配列番号８またはその相補体の少なくとも２０個の連続するヌクレオチドと同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３９記載の核酸。
【請求項４１】
前記核酸は配列番号８またはの少なくとも４０個の連続するヌクレオチドその相補体と同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３９−４０のいずれかに記載の核酸。
【請求項４２】
前記核酸は配列番号９と同一のヌクレオチド配列を含む，請求項３９−４１のいずれかに記載の核酸。
【請求項４３】
前記核酸は配列番号９と同一のヌクレオチド配列からなる，請求項４２記載の核酸。
【請求項４４】
（ａ）配列番号２の配列を有する核酸またはその相補体に特異的にハイブリダイズする第１のプライマー対，および配列番号２の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズしうる第１のプローブ；および
（ｂ）配列番号８の配列またはその相補体に特異的にハイブリダイズする第２のプライマー対，および配列番号８の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズしうる第２のプローブ，
を含むキット。
【請求項４５】
第１のプライマー対は配列番号３の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる，請求項４４記載のキット。
【請求項４６】
第１のプローブは配列番号３の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる，請求項４４−４５のいずれかに記載のキット。
【請求項４７】
第１のプライマー対の少なくとも１つのメンバーは配列番号４または５，またはその相補体の配列を含む，請求項４４−４６のいずれかに記載のキット。
【請求項４８】
第１のプローブは配列番号６または２７またはその相補体の配列を含む，請求項４４−４７のいずれかに記載のキット。
【請求項４９】
第２のプライマー対は配列番号９の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる，請求項４４−４８のいずれかに記載のキット。
【請求項５０】
第２のプローブは配列番号９の配列またはその相補体を有する核酸に特異的にハイブリダイズすることができる，請求項４４−４９のいずれかに記載のキット。
【請求項５１】
第２のプライマー対の少なくとも１つのメンバーは配列番号１０または１１，またはその相補体の配列を含む，請求項４４−４６および４８−５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５２】
第２のプローブは配列番号１２またはその相補体の配列を含む，請求項４４−４８および５０のいずれかに記載のキット。
【請求項５３】
第１のプライマー対の少なくとも１つのメンバーはスコーピオンプライマーである，請求項４４−５２のいずれかに記載のキット。
【請求項５４】
スコーピオンプライマーは配列番号１３または２８，またはその相補体の配列を有する，請求項５３記載のキット。
【請求項５５】
第２のプライマー対の少なくとも１つのメンバーはスコーピオンプライマーである，請求項４４−５４のいずれかに記載のキット。
【請求項５６】
スコーピオンプライマーは配列番号１４またはその相補体の配列を有する，請求項５５記載のキット。
【請求項５７】
第１のプローブおよび第２のプローブはさらに検出可能な標識を含む，請求項４４−５６のいずれかに記載のキット。
【図１】
【図２】
【図２】
【公表番号】特表２０１１−５０００８５（Ｐ２０１１−５０００８５Ａ）
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３１１１７（Ｐ２０１０−５３１１１７）
【出願日】平成２０年１０月７日（２００８．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９０８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５５２３９
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０５０６３０５０）クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド (20)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１月６日（２０１１．１．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月７日（２００８．１０．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７９０８１
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０５５２３９
【国際公開日】平成２１年４月３０日（２００９．４．３０）
【出願人】（５０５０６３０５０）クエスト ダイアグノスティックス インヴェストメンツ インコーポレイテッド (20)
【Ｆターム（参考）】
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