マイクロ流体チップ、マイクロ流体チップセット及び核酸分析キット
【課題】複数種類の遺伝子が所定量発現したか否かの判定が、高感度、高精度で簡単にできるマイクロ流体チップ、マイクロ流体チップセット及び核酸分析キットを提供すること。
【解決手段】試薬３０，３１，３２は、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸と、標的核酸及び内部標準核酸に共通のプライマーと、標的核酸及び内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、標的核酸の増幅産物に結合した場合と内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含んでいる。ウェル１６毎に、ウェル１６に含まれるプライマー及び蛍光プローブが異なる。内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液をウェル１６に導入した場合に、ウェル１６に導入される反応液に含まれる標的核酸の量と同じである。
【解決手段】試薬３０，３１，３２は、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸と、標的核酸及び内部標準核酸に共通のプライマーと、標的核酸及び内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、標的核酸の増幅産物に結合した場合と内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含んでいる。ウェル１６毎に、ウェル１６に含まれるプライマー及び蛍光プローブが異なる。内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液をウェル１６に導入した場合に、ウェル１６に導入される反応液に含まれる標的核酸の量と同じである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体チップ、マイクロ流体チップセット及び核酸分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多数の遺伝子の発現を一度に解析するために、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）が注目されている。ＤＮＡチップを用いた核酸検出・定量法は、ＤＮＡの相補性に基づくハイブリダイゼーション反応を利用した核酸検出・定量法である。ＤＮＡチップは、平面基板上に多種類のＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）が固定されているのが特徴で、具体的な使用方法としては、研究又は検査対象の細胞に含まれる発現遺伝子を蛍光色素で標識し、平面基板上のＤＮＡ断片と結合させ、その箇所を専用の装置で蛍光輝度を測定することにより、サンプル中の遺伝子発現量を定量する方法が挙げられる。
【０００３】
しかしながら、非特許文献１に記載されているように、ＤＮＡチップには、いくつかの課題がある。
【０００４】
第１に、感度についての課題が挙げられる。ＤＮＡチップの検出能力（感度）は低発現の遺伝子に対して十分ではない。
【０００５】
第２に、精度についての課題が挙げられる。ＤＮＡチップで低発現の遺伝子を検出するためには、検体量を十分に確保する必要がある。検体量が少なくて反応に十分でない場合には、その遺伝子に対しＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；Polymerase Chain Reaction）やＩＶＴ（in-vitro transcription）などの増幅反応を行って、検体中の核酸量を増やす必要がある。ＰＣＲは、標的核酸及び試薬を混合したものをＰＣＲ用のチューブ（反応容器）に入れ、サーマルサイクラーという温度制御装置で、例えば５５℃、７２℃、９４℃の３段階の温度変化を数分の周期で繰り返し反応させるもので、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の作用により温度サイクル１回あたり、標的核酸だけを約２倍に増幅することができる。この増幅処理は、検体に含まれる遺伝子量の比が変わってしまうため、定量精度が低下するという問題が指摘されている。
【０００６】
また、標的核酸とよく似た配列を有する核酸がプローブに間違って結合すること（クロスハイブリダイゼーション）によっても精度が低下する。さらに、プローブの配列によって、特定の遺伝子の結合がバイアスされる可能性が指摘されている。同様に、標的核酸を蛍光標識することも精度に影響することが考えられる。
【０００７】
第３に、再現性についての課題が挙げられる。ＤＮＡチップはプラットホーム（ＤＮＡチップ製品）が異なると、結果が異なる。様々な要因があるが、プローブの長さや配列が異なることが最大の原因と考えられている。
【０００８】
臨床検査において用いられる、遺伝子発現を高精度、高感度に解析する手法として、リアルタイムＰＣＲの絶対定量法や競合ＰＣＲ法がある。これらの手法で定量を行い、その結果に基づいて注意深くキャリブレーションを行えば、ＤＮＡチップの感度及び精度の問題の一部を改善することができる。しかし、リアルタイムＰＣＲの絶対定量法は、少なくとも５点のデータから検量線を作成する必要があり、競合ＰＣＲ法も、複数の検量線を作成する必要がある。この作業は煩雑で、非常に手間と時間がかかる。さらに、キャリブレーション自体も煩雑な作業であった。そのため、これらの手法を多種類の遺伝子に適用することは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sorin Draghici et.al.、"Reliability and reproducibility issues in DNA microarray measurement"、TRENDS in Genetics Vol.22 No.2 February 2006、P101-109
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、複数種類の遺伝子が所定量発現したか否かの判定が、高感度、高精度で簡単にできるマイクロ流体チップ、マイクロ流体チップセット及び核酸分析キットを提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（１）本発明に係るマイクロ流体チップは、
検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用するマイクロ流体チップであって、
複数の反応容器を含み、
前記反応容器は、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、前記標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸と、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、前記標的核酸の増幅産物に結合した場合と前記内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれる前記プライマー及び前記蛍光プローブの種類は互いに異なり、
前記内部標準核酸の量は、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を前記反応容器に導入した場合に、前記反応容器に導入される前記反応液に含まれる前記標的核酸の量である参照量と同じである。
【００１２】
本発明によれば、反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なるため、複数種類の遺伝子の発現を簡単に精度良く判定できるマイクロ流体チップを実現できる。
【００１３】
また、本発明によれば、内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を反応容器に導入した場合に、反応容器に導入される反応液に含まれる標的核酸の量である参照量と同じであるため、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できるマイクロ流体チップを実現できる。
【００１４】
（２）このマイクロ流体チップは、
前記参照量は、前記参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量の少なくとも一方であってもよい。
【００１５】
これにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体の少なくとも一方における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００１６】
（３）このマイクロ流体チップは、
前記参照量が、前記参照検体を、前記健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器と、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器と、
を含んでいてもよい。
【００１７】
これにより、１つのマイクロ流体チップで、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００１８】
（４）このマイクロ流体チップは、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器と、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器と、
を含んでいてもよい。
【００１９】
これにより、１つのマイクロ流体チップで、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００２０】
（５）本発明に係るマイクロ流体チップセットは、
前記複数の反応容器の少なくとも一部として、前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器を含む、上述のマイクロ流体チップと、
前記複数の反応容器の少なくとも一部として、前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器を含む、上述のマイクロ流体チップと、
を含む。
【００２１】
本発明によれば、判定の基準となる参照量を用途に応じて容易に選択できるマイクロ流体チップセットを実現できる。
【００２２】
（６）本発明に係る核酸分析キットは、
検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用する核酸分析キットであって、
マイクロ流体チップと、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、前記標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸を含む液体である内部標準試薬と、
を含み、
前記マイクロ流体チップは、複数の反応容器を含み、
前記反応容器は、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、前記標的核酸の増幅産物に結合した場合と前記内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれる前記プライマー及び前記蛍光プローブの種類は互いに異なり、
前記内部標準核酸のモル濃度は、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる前記標的核酸のモル濃度である参照モル濃度と同じである。
【００２３】
本発明によれば、反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なるため、複数種類の遺伝子の発現を簡単に精度良く判定できる核酸分析キットを実現できる。
【００２４】
また、本発明によれば、内部標準核酸のモル濃度は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じであるため、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【００２５】
（７）この核酸分析キットは、
前記参照モル濃度は、前記参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度の少なくとも一方であってもよい。
【００２６】
これにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体の少なくとも一方における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００２７】
（８）この核酸分析キットは、
前記内部標準試薬として、
前記参照モル濃度が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である前記内部標準核酸を含む第１の内部標準試薬と、
前記参照モル濃度が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である前記内部標準核酸を含む第２の内部標準試薬と、
を含んでいてもよい。
【００２８】
これにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００の基板１０を模式的に示す平面図。
【図２】図１のＡ−Ａ線の断面を模式的に表した図。
【図３】第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を模式的に示す平面図。
【図４】図３のＢ−Ｂ線の断面を模式的に表した図。
【図５】マイクロ流体チップ１００のウェル１６近傍の断面を拡大して示す模式図。
【図６】図６（Ａ）は、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａを模式的に示す平面図、図６（Ｂ）は、第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂを模式的に示す平面図。
【図７】図７（Ａ）〜図７（Ｃ）は、変形例に係るマイクロ流体チップ１０１，１０１ａ，１０１ｂを模式的に示す平面図。
【図８】マイクロ流体チップ１００のリザーバー１５に被検液８０を導入した状態で、慣性力を印加した様子を模式的に示す図。
【図９】ローラー９０によって、マイクロ流体チップ１００のウェル１６を密閉する様子を模式的に示した図。
【図１０】第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット２００を模式的に示す平面図。
【図１１】第５実施形態に係る核酸分析キット３００を模式的に示す図。
【図１２】第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａを模式的に示す図。
【図１３】図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）は、変形例に係る核酸分析キット３０１及び３０１ａを模式的に示す図
【図１４】標的核酸及び内部標準核酸の配列例。
【図１５】図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応するプライマーの配列例。
【図１６】図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応する蛍光プローブの配列例。
【図１７】標的核酸及び内部標準核酸の他の配列例。
【図１８】図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応するプライマーの配列例。
【図１９】図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応する蛍光プローブの配列例。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００３１】
１．マイクロ流体チップ
１−１．第１実施形態に係るマイクロ流体チップの構成
第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００は、測定対象となる検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用するマイクロ流体チップであって、複数の反応容器を含む。以下に説明する例では、マイクロ流体チップ１００は、基板１０とカバー２０とを有し、基板１０に反応容器となる複数のウェル１６が設けられている。
【００３２】
なお、以下の説明において、「平面視において」、「平面的に見て」及び「平面的に見た」という場合は、基板１０の第１面１１に直交する方向から見た場合のことを指すものとする。
【００３３】
１−１−１．基板
図１は、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００の基板１０を模式的に示す平面図である。図２は、図１のＡ−Ａ線の断面を模式的に表した図である。
【００３４】
基板１０は、マイクロ流体チップ１００の基体となる板状の部材である。基板１０は、図２に示すように、互いに表裏の関係を有する第１面１１及び第２面１２を有する。基板１０の形状は、板状であり、基板１０の第１面１１のウェル領域１４の高さ及びウェル領域１４を囲む基板の面の高さが、ウェル開口１６の開口面の高さと一致すれば特に限定されない。基板１０の厚み（第１面１１及び第２面１２の間の距離）も特に限定されないが、取り扱いの容易さや、破損しにくさの点で、０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下であることが好ましい。基板１０の平面的に見た外形形状については、特に限定されず、矩形、円形などとすることができる。本実施形態では、基板１０の平面的に見た形状が長方形である例を示す。
【００３５】
基板１０の材質としては、特に限定されず、無機材料（例えば単結晶シリコン、パイレックス（登録商標）ガラス）、及び有機材料（例えばポリカーボネート、ポリプロピレン等の樹脂）を挙げることができ、これらの複合材料であってもよい。マイクロ流体チップ１００を、蛍光測定を伴う用途に使用する場合には、基板１０は、自発蛍光の小さい材質で形成されることが望ましい。このような自発蛍光の小さい材質としては、例えば、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられる。なお、基板１０はＰＣＲにおける加熱に耐えられる材質であることが好ましい。
【００３６】
さらに、基板１０の材質には、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、若しくは、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ又はＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ又はＣｒの炭化物などの黒色物質等を配合することができる。基板１０の材質に、このような黒色物質が配合されることにより、樹脂等の有する自発蛍光をさらに抑制することができる。また、後述するウェル１６等をマイクロ流体チップ１００の外部から観察するような用途（例えば、リアルタイムＰＣＲなど）にマイクロ流体チップ１００を用いる場合には、必要に応じて、基板１０の材質を透明なものとすることができる。またなお、基板１０の材質は、核酸やタンパク質の吸着が少なく、ポリメラーゼ等の酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。
【００３７】
基板１０が無機材料で形成される場合には、フォトリソグラフィー法を用いたドライエッチングなどを行って、成形、加工することができる。また、基板１０が樹脂を主成分として形成される場合には、鋳型成形、射出成形又はホットエンボス加工などの方法によって、成形、加工することができる。
【００３８】
１−１−２．リザーバー領域及びウェル領域
図１に示すように、基板１０には、平面視において、リザーバー領域１３及びウェル領域１４が設けられる。リザーバー領域１３及びウェル領域１４は、互いに隣り合って設けられる。リザーバー領域１３及びウェル領域１４は、隣接して設けられてもよい。また、リザーバー領域１３及びウェル領域１４は、複数設けられてもよい。リザーバー領域１３及びウェル領域１４は、平面視において、後述するカバー２０の固着領域２１の内側に設けられる。基板１０におけるリザーバー領域１３及びウェル領域１４の設けられる位置は、基板１０に遠心力等の慣性力が印加された際に、リザーバー領域１３からウェル領域１４に向かう方向に当該慣性力が作用することができる限り特に限定されない。リザーバー領域１３及びウェル領域１４の平面的に見た形状は、特に限定されず、矩形、円形等とすることができる。
【００３９】
１−１−３．カバー
図３は、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を模式的に示す平面図である。図４は、図３のＢ−Ｂ線の断面を模式的に表した図である。
【００４０】
なお、以下の説明において、「敷設」とは、基板１０の第１面１１にカバー２０が敷かれた状態のことを指し、「固着」とは、基板１０の第１面１１に敷設されて固定されている状態を指す。すなわち、「敷設」との文言は、カバー２０と基板１０の第１面１１とが、固着（固定）されている場合と固着されていない場合とを含む意味で用いている。したがって、カバー２０が敷設され、固着領域２１を有する状態とは、基板１０とカバー２０との間に間隙を形成することが容易な部分と、基板１０とカバー２０とが分離しにくい部分とがある状態であり、後者の基板１０とカバー２０とが分離しにくい部分を、固着された固着領域２１と表現するものとする。
【００４１】
カバー２０は、基板１０の第１面１１側に敷設される。カバー２０は、フィルム又はシート状の形状を有する。カバー２０の厚みは、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｍ以上５ｍｍ以下とすることができる。カバー２０の平面的に見た外形形状は、基板１０の平面的に見た外形形状と一致していてもいなくてもよい。図３の例では、カバー２０の平面的に見た外形形状は、基板１０の平面的に見た外形形状と一致している。カバー２０は、静的な状態では基板１０に接しているが、マイクロ流体チップ１００に遠心力などの慣性力が印加された場合には、基板１０とカバー２０との間に間隙が形成される程度の可撓性ないしは弾性を有する。また、カバー２０は、基板１０に接した状態で、基板１０に設けられるウェル１６（後述する）の開口１６ａを塞ぎ、ウェル１６を独立した空間（反応容器）とすることができる。カバー２０は、基板１０に押しつけられる場合などに、ウェル１６の開口１６ａ付近において撓みにくくウェル１６の容積に大きな変化を生じない程度の弾性を有することが好ましい。このようなカバー２０の弾性の程度は、カバー２０の厚み、ウェル１６の開口１６ａの大きさ、及び基板１０に当接される際の押圧などを考慮して、材質を選ぶことにより適宜設計されることができる。
【００４２】
カバー２０の材質としては、遠心力等の慣性力によって撓むことができる程度の弾性を有するものが挙げられ、例えば、有機材料（ポリカーボネート、ポリプロピレン等の樹脂及び各種のゴム）や、有機材料と無機材料の複合材料を挙げることができる。マイクロ流体チップ１００を、蛍光測定を伴う用途に使用する場合には、カバー２０は、自発蛍光の小さい材質で形成されることが望ましい。このような自発蛍光の小さい材質としては、例えば、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられる。カバー２０の材質は、核酸やタンパク質の吸着が少なく、ポリメラーゼ等の酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。またなお、カバー２０はＰＣＲにおける加熱に耐えられる材質であることが好ましい。
【００４３】
また、カバー２０の材質には、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、若しくは、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ又はＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ又はＣｒの炭化物などの黒色物質を配合することができる。カバー２０の材質に、このような黒色物質が配合されることにより、樹脂等の有する自発蛍光をさらに抑制することができる。さらに、後述するウェル１６をマイクロ流体チップ１００の外部から観察するような用途にマイクロ流体チップ１００を用いる場合には、必要に応じて、カバー２０の材質を透明なものとすることができる。カバー２０は、例えば、フィルム成形、シート成形、射出成形、プレス成形などの方法によって、成形、加工することができる。
【００４４】
カバー２０は、一方の表面２０ａが基板１０に向かうように敷設される。すなわち、表面２０ａが基板１０の第１面１１に面するように設けられる。カバー２０の表面２０ａは、接着性を有してもよい。表面２０ａが接着性を有する場合には、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加されるときに、表面２０ａと第１面１１とが剥離できる程度の接着力とすることが好ましい。ただし、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力を印加し終えた後はこの限りではなく、表面２０ａと第１面１１とが離れにくいように接着（固着）する程度の接着力を有してもよい。
【００４５】
カバー２０の表面２０ａは、接着力を有さなくてもよい。このような場合には、第１面１１に表面２０ａを固着させるために、接着剤を利用することや、熱融着を行うことができる。また、表面２０ａは、カバー２０を基板１０に対して加圧しない状態では接着力を発揮せずに、加圧により接着力を発揮する性質を有してもよい。このような表面２０ａとしては、多孔質となっているものを例示することができる。このような方法であれば、加圧させるだけなので、固着させる際に熱が発生することがなく、マイクロ流体チップ１００の温度の上昇を抑制することができ、液体等に与える熱の影響を抑制することができる。このような表面２０ａを有するカバー２０の具体例としては、商品名：LightCycler 480 Sealing Foil・型名：04 729 757 001・ロシュ・ダイアグノスティクス社製、商品名：ポリオレフィン マイクロプレートシーリングテープ・型名：9793・３Ｍ社製、商品名：アンプリフィケーションテープ96・型名：232702・Nunc社製などを例示することができる。
【００４６】
さらに、表面２０ａは、潜在的な接着力を有してもよい。すなわち、表面２０ａは、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加される前までは接着力を有さず、慣性力が印加された後の所望の時点で、エネルギー線（例えば、紫外線、電子線など）を照射することによって接着力を発揮できるものであってもよい。
【００４７】
また、表面２０ａと基板１０の第１面１１とを固着させる方法としては、超音波溶着法を利用してもよい。例えば、固着させたい領域の形状に対応する形状の治具をカバー２０の基板１０に対して固着させたい部分に押しつけて超音波振動させ、カバー２０と基板１０とを溶着（固着）させてもよい。このようにすれば、基板１０とカバー２０とを超音波照射によって溶着（固着）させるため、試料に対する加熱を抑えることができ、試料に与えるダメージを少なくすることができる。例えば、ウェル１６に含まれる試薬の活性を低下させることも抑制できる。さらに、固着領域２１を超音波溶着法によって形成した場合は、溶着による基板１０とカバー２０との接合力は、例えば加圧による方法などと比較して比較的強いため、ウェル領域１４からの液体の漏れをより確実に防止することができる。
【００４８】
カバー２０は、基板１０と固着された固着領域２１を有する。固着領域２１は、平面視において、基板１０のリザーバー領域１３及びウェル領域１４を囲むように配置される。すなわち、平面的に見て、固着領域２１の内側に、リザーバー領域１３及びウェル領域１４が配置される。固着領域２１は、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加されても、敷設されたカバー２０と基板１０とが剥離しにくい領域である。敷設されているカバー２０の固着領域２１以外の領域は、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加されると、表面２０ａと第１面１１とが剥離することができる。固着領域２１では、カバー２０の表面２０ａの性質に合わせて、例えば、カバー２０と基板１０とが溶着されてもよく、粘着剤、接着剤等で接着されてもよい。
【００４９】
固着領域２１の機能の一つとしては、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加されてカバー２０と基板１０との間に間隙が形成されるときに、当該間隙を内部に形成する袋（ポケット）状の構造を形成させることが挙げられる。これにより、基板１０とカバー２０との間で、リザーバー領域１３及びウェル領域１４を基板１０の第１面１１側で連通させるとともに、液体を両領域の間で流通させることができる。
【００５０】
既に述べたが、慣性力は、リザーバー領域１３側からウェル領域１４側へ向かうようにマイクロ流体チップ１００に印加される。そのため、固着領域２１は、少なくともウェル領域１４を囲む位置では連続して設けられる。したがって、カバー２０と基板１０との間の間隙に液体が導入された際に、慣性力により、液体が固着領域２１の外側に、ウェル領域１４側から漏れ出さないようになっている。また、固着領域２１は、平面視において、基板１０のリザーバー領域１３及びウェル領域１４の両者を取り囲んで環状に連続していることができる。このようにすれば、カバー２０と基板１０との間の間隙に液体が導入された際に、液体が固着領域２１の外側に漏れ出さないようにすることができる。なお、固着領域２１は、リザーバー領域１３側においては、連続していない部分を有することができる。このような部分を有する場合には、当該連続していない部分を、カバー２０と基板１０との間の間隙に内圧が生じた場合の通気孔として機能させることができる。さらに、固着領域２１が平面視において、基板１０のリザーバー領域１３及びウェル領域１４を取り囲んで環状に連続している場合には、カバー２０に、リザーバー領域１３側の適宜な位置に図示せぬ孔を設けることにより、当該孔を、カバー２０と基板１０との間の間隙に内圧が生じた場合の通気孔として機能させることができる。なお、通気孔は、リザーバー１５及びウェル１６に導入される液体の漏れが生じない位置及び大きさで設けることが好ましい。
【００５１】
固着領域２１を形成するには、例えば、基板１０の第１面１１に、接着剤を固着領域２１の形状に塗布して、カバー２０を敷設することによって、固着領域２１を形成することができる。また、例えば、カバー２０の表面２０ａがカバー２０を基板１０に対して加圧しない状態では接着力を発揮せずに、加圧により接着力を発揮する性質を有する場合には、固着領域２１の形状に対応する治具等を用意して、当該治具によって、カバー２０を基板１０に対して加圧力を印加して、固着領域２１を形成することができる。また、例えば、固着領域２１の形状に対応する形状の治具を用いた超音波溶着によって、固着領域２１を形成することもできる。
【００５２】
１−１−４．リザーバー
基板１０のリザーバー領域１３には、第１面１１に開口を有するリザーバー１５が形成される。リザーバー１５は、リザーバー領域１３内に複数形成されてもよい。リザーバー１５の平面的に見た形状は、円形、矩形等とすることができる。リザーバー１５は、第１面１１側及び第２面１２側の双方向に被検液（測定対象となる検体を含む液体）を流通させることができる貫通孔として形成されていてもよい。この場合、被検液を第２面１２側からリザーバー１５へ導入することができる。
【００５３】
１−１−５．ウェル
基板１０のウェル領域１４には、基板１０の第１面１１側に開口１６ａを有するウェル１６が形成される（図１ないし図４参照）。図５は、マイクロ流体チップ１００のウェル１６近傍の断面を拡大して示す模式図である。
【００５４】
ウェル１６は、ウェル領域１４に複数形成されている。ウェル１６は、基板１０の第１面１１側に開口１６ａを有した容器状の形状を有する。ウェル１６は、内部に被検液を保持することができる。また、ウェル１６内において、被検液の反応を行うことができる。すなわち、ウェル１６は、反応容器としての機能を果たす。
【００５５】
ウェル１６の形状は、容器状であれば、特に限定されず、多様な形態を採ることができる。例えば、ウェル１６の形状は、円柱、角柱、円錐台及び角錐台、これらが傾いたような形状、並びにこれらを組み合わせた形状のいずれでもよい。本実施形態ではウェル１６の形状として、図１ないし図５に示すような円柱状（平面視において円形であって、断面視において矩形である形状）の形状を有する場合について説明する。
【００５６】
ウェル１６の開口１６ａは、カバー２０によって塞がれることができる。これにより、ウェル１６は、独立した密閉容器となることができる。このようにウェル１６を独立して密閉することにより、他のウェル１６の内容物との混合やコンタミネーションを抑制することができる。ウェル１６は、カバー２０がウェル１６の開口１６ａの周囲に敷設されて固着されると、独立した密閉容器となることができる。
【００５７】
ウェル１６内には、予め、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用するための試薬が配置されている。配置される試薬の状態は、固体あるいは液体であることが好ましい。図５に示す例では、マイクロ流体チップ１００に設けられた複数のウェル１６のうち、ウェル１６０には試薬３０、ウェル１６１には試薬３１、ウェル１６２には試薬３２が配置されている。
【００５８】
試薬３０，３１，３２として、乾燥等に対して安定性の高いものを用いる場合には、ウェル１６内で乾燥されてもよく、図５に示すように、例えば、ウェル１６の内壁面に塗布されて乾燥された状態で配置されてもよい。このように試薬３０，３１，３２をウェル１６の内壁面に塗布する方法としては、例えば、インクジェット方式の印刷に用いられる液体噴射ヘッド等により、試薬３０，３１，３２を塗布する方法が挙げられる。
【００５９】
ウェル１６内において試薬３０，３１，３２が配置される位置は、特に限定されないが、開口１６ａから遠い位置であるほど、試薬３０，３１，３２が、導入された液体とともにウェル１６の外に流出する可能性が小さくなる点でより好ましい。
【００６０】
ウェル１６（反応容器）に含まれる試薬３０，３１，３２は、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸と、標的核酸及び内部標準核酸に共通のプライマーと、標的核酸及び内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、標的核酸の増幅産物に結合した場合と内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含んでいる。
【００６１】
また、ウェル１６（反応容器）のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なっている。例えば、図５に示されている試薬３０及び試薬３１が互いに異なる場合、これらの試薬を含むウェル１６０及びウェル１６１が、それぞれ第１の反応容器及び第２の反応容器に対応する。なお、この説明は、他の任意の２つのウェル（反応容器）についても成立する。これにより、１つのマイクロ流体チップ１００で複数種類の遺伝子の発現を判定できる。
【００６２】
また、ウェル１６（反応容器）ごとにプライマー及び蛍光プローブの種類が異なる場合には、ウェル１６（反応容器）ごとに異なる遺伝子が増幅されるので、例えばクロスコンタミネーションのような、他の遺伝子の影響を抑制することができる。
【００６３】
さらに、マイクロ流体チップ１００が、同じ種類のプライマー及び蛍光プローブを含む複数のウェル１６（反応容器）を含む場合、当該複数のウェル１６（反応容器）に含まれる内部標準核酸の量が互いに異なってもよい。これにより、１種類の遺伝子について、１つのマイクロ流体チップ１００で多条件の遺伝子発現状態との比較が簡単にできる。
【００６４】
また、試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を反応容器１６に導入した場合に、反応容器１６に導入される反応液に含まれる標的核酸の量である参照量と同じである。例えば、内部標準核酸のコピー数が、参照検体の反応液を反応容器１６に導入した場合に、反応容器１６に導入される標的核酸のコピー数と同じであってもよい。また例えば、内部標準核酸の反応容器１６の体積当たりのモル濃度が、参照検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じであってもよい。参照検体の反応液は、例えば、参照検体に含まれるｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを含む液体であってもよい。
【００６５】
ここで「同じ」の範囲は、完全同一のみならず、要求される判定精度を満たせる程度の誤差を含んだ範囲内であればよい。例えば、反応容器内１６の内部標準核酸の量で決まる１本の検量線で定量可能な範囲内としてもよい。
【００６６】
参照検体は、遺伝子が所定量発現したか否かの判定の目的に応じて選択される検体であり、例えば、遺伝子が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である。参照検体を基準としたときの標的核酸の測定値は、参照すべき状態からの差異を直接的に表現しているため、参照量との差異を絶対量として知ることができるという特徴がある。また、このため、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた結果と比較しやすいという特徴がある。
【００６７】
このような参照検体としては、例えば、健康な個体から採取した検体を代表する検体及び病気の個体から採取した検体を代表する検体の少なくとも一方であってもよい。健康な個体から採取した検体を代表する検体は、健康な１つの個体から採取した検体であってもよいし、健康な複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。同様に、病気の個体から採取した検体を代表する検体は、病気の１つの個体から採取した検体であってもよいし、病気の複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。なお、上述の「個体」は、ヒトであっても、ヒト以外の動物や植物であってもよい。
【００６８】
このような参照検体を選択して、試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量を設定すること、すなわち、参照量を、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量の少なくとも一方と同じにすることにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体の少なくとも一方における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００６９】
このように、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００によれば、反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なるため、複数種類の遺伝子が所定量発現したか否かの判定が簡単にできるマイクロ流体チップを実現できる。
【００７０】
また、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００によれば、内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を反応容器に導入した場合に、反応容器に導入される標的核酸の量と同じであるため、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できるマイクロ流体チップを実現できる。
【００７１】
ＰＣＲの原理においては、２つのプライマーＤＮＡ（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を用いて目的の核酸を増幅する。そのため第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００にＰＣＲの原理を適用することで、１種類のプローブＤＮＡを使用するＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）に比べて特異性が高く、測定の信頼性が高いものとなる。また、ＰＣＲによる核酸増幅を行うので、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）では不可能だった低発現の遺伝子についても定量することができる。
【００７２】
また、遺伝子の発現量を定量する方法として、共通のプライマーで増幅できる既知量の内部標準核酸を添加し、共増幅する競合ＰＣＲ法がある。競合ＰＣＲ法は、標的核酸に由来する増幅産物量と、内部標準核酸に由来する増幅産物量とを比較することにより、標的核酸を定量する方法である。
【００７３】
競合ＰＣＲ法の原理を用いると、標的核酸と内部標準核酸とは、蛍光プローブによる蛍光反応以外は同じ性質とみなせるので、両核酸の増幅速度は等しいとみなせる。したがって、標的核酸と内部標準核酸を１つの反応容器で共増幅させた場合の増幅産物の比率は、増幅前の両者の比率を反映する。そのため、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を使って競合ＰＣＲ法の原理を用いると、既知量の内部標準核酸を用いることにより、定量可能な範囲（標的核酸の量と内部標準核酸の量が近い範囲；１本の検量線で定量できる範囲）においては定量精度が高く、複数の検量線を引くなどの煩雑な作業を要することなく絶対定量も可能になる。これにより、低コストで、遺伝子の発現量を絶対定量することができる。
【００７４】
また、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を用いた反応は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）のような固体表面での反応ではなく、ウェル１６内での均質な液体の中の反応であるため、反応の効率と精度が高いものとなる。さらに、１つのウェル１６内では１種類の増幅反応が行われるため、クロスハイブリダイゼーションによる定量精度の低下が起こらない。
【００７５】
１−２．第２実施形態に係るマイクロ流体チップの構成
図６（Ａ）は、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａを模式的に示す平面図である。また、マイクロ流体チップ１００ａのウェル１６近傍の断面を拡大した様子は、図５と同様である。第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａは、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と比べて、ウェル１６（反応容器）内に配置されている試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量の基準となる参照検体が異なる。したがって、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と同様の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００７６】
第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａは、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）と、参照量が、参照検体を、病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）と、を含んでいる。
【００７７】
図６（Ａ）に示す例では、マイクロ流体チップ１００ａの基板１０には、平面視において、健康領域４１と病気領域４２とが設けられている。健康領域４１に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）であり、病気領域４２に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）である。
【００７８】
病気が進行し、遺伝子の発現量が健康な場合の発現量から変化したときには、発現量は正常な状態とは大きく異なるため、発現量が健康な状態及び病気の状態のいずれの状態に近いかについて、競合ＰＣＲ法の原理を用いて判定する場合の判定精度が低下する可能性がある。そのため、病気の状態で現れる遺伝子の発現状態を調べたデータベースに基づいて、内部標準核酸の量を新たに病気の状態を代表する値に設定することにより、判定精度を保つことができる。
【００７９】
なお、発現量が健康な状態及び病気の状態のいずれの状態に近いかについての判定精度を高める観点からは、参照検体となる各状態の検体を代表する検体は、１つの個体から採取した検体よりも、複数の検体から採取した個体から統計的手法により導出された仮想的な検体とすることが好ましい。
【００８０】
このように、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａによれば、参照量が、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）と、参照量が、参照検体を、病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）と、を含んでいることにより、１つのマイクロ流体チップで、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００８１】
１−３．第３実施形態に係るマイクロ流体チップの構成
図６（Ｂ）は、第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂを模式的に示す平面図である。また、マイクロ流体チップ１００ａのウェル１６近傍の断面を拡大した様子は、図５と同様である。第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂは、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と比べて、ウェル１６（反応容器）内に配置されている試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量の基準となる参照検体が異なる。したがって、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と同様の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００８２】
第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂは、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）と、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）と、を含んでいる。
【００８３】
図６（Ｂ）に示す例では、マイクロ流体チップ１００ａの基板１０には、平面視において、第１進行状態領域５１と第２進行状態領域５２とが設けられている。第１進行状態領域５１に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）であり、第２進行状態領域５２に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）である。
【００８４】
病気の進行やタイプによって、遺伝子に様々な発現状態が予測される場合には、内部標準核酸の量を複数設定しておくことにより、標的核酸の定量精度を保つことができる。
【００８５】
なお、複数存在する病気の進行状態のうち、任意に選択した２つの進行状態が、それぞれ病気の第１進行状態、病気の第２進行状態に対応する。また、病気の第１進行状態の検体を代表する検体は、病気の第１進行状態の１つの個体から採取した検体であってもよいし、病気の第１進行状態の複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。同様に、病気の第２進行状態の検体を代表する検体は、病気の第２進行状態の１つの個体から採取した検体であってもよいし、病気の第２進行状態の複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。なお、発現量が病気のいずれの進行状態に近いかについての判定精度を高める観点からは、各状態の検体を代表する検体は、１つの個体から採取した検体よりも、複数の検体から採取した個体から統計的手法により導出された仮想的な検体とすることが好ましい。
【００８６】
このように、第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂによれば、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１の反応容器）と、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２の反応容器）と、を含んでいることにより、１つのマイクロ流体チップで、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００８７】
１−４．変形例
上述した第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａ及び第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂにおいては、ウェル１６（反応容器）ごとに、ウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量の少なくとも一方が異なっている例について説明したが、ウェル１６（反応容器）が、複数のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群を構成し、反応容器群のうち、第１の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）と第２の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量の少なくとも一方が互いに異なっていてもよい。換言すれば、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量が同一であってもよい。
【００８８】
図７（Ａ）〜図７（Ｃ）は、変形例に係るマイクロ流体チップ１０１，１０１ａ，１０１ｂを模式的に示す平面図である。図７（Ａ）に示すマイクロ流体チップ１０１は、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００の変形例、図７（Ｂ）に示すマイクロ流体チップ１０１ｂは、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａの変形例、図７（Ｃ）に示すマイクロ流体チップ１０１ｂは、第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂの変形例である。
【００８９】
図７（Ａ）に示す例では、ウェル１６（反応容器）が、それぞれ１０個のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群６１，６２，６３，６４及び６５を構成している。例えば、図７（Ａ）に示されている反応容器群６１に属するウェル１６（反応容器）と反応容器群６２に属するウェル１６（反応容器）とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量の少なくとも一方が互いに異なる場合、反応容器群６１及び反応容器群６２が、それぞれ第１の反応容器群及び第２の反応容器群に対応する。なお、この説明は、他の任意の２つの反応容器群についても成立する。
【００９０】
図７（Ａ）に示す例では、反応容器群６１，６２，６３，６４及び６５ごとに、反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている。換言すれば、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量は、同一となっている。
【００９１】
図７（Ｂ）に示す例では、ウェル１６（反応容器）が、それぞれ５個のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群６１１，６１２，６１３，６１４，６１５，６２１，６２２，６２３，６２４及び６２５を構成している。このうち、反応容器群６１１，６１２，６１３，６１４及び６１５は、健康領域４１に配置され、反応容器群６２１，６２２，６２３，６２４及び６２５は、病気領域４２に配置されている。すなわち、反応容器群６１１，６１２，６１３，６１４及び６１５に属するウェル１６（反応容器）と反応容器群６２１，６２２，６２３，６２４及び６２５に属するウェル１６（反応容器）とに含まれる内部標準核酸の量は、互いに異なっている。また、図７（Ｂ）に示す例では、反応容器群６１１，６１２，６１３，６１４及び６１５ごとに反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっており、さらに、反応容器群６２１，６２２，６２３，６２４及び６２５ごとに反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている。図７（Ｂ）に示す例においても、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量は、同一となっている。
【００９２】
図７（Ｃ）に示す例では、ウェル１６（反応容器）が、それぞれ５個のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群６３１，６３２，６３３，６３４，６３５，６４１，６４２，６４３，６４４及び６４５を構成している。このうち、反応容器群６３１，６３２，６３３，６３４及び６３５は、第１進行状態領域５１に配置され、反応容器群６４１，６４２，６４３，６４４及び６４５は、第２進行状態領域５２に配置されている。すなわち、反応容器群６３１，６３２，６３３，６３４及び６３５に属するウェル１６（反応容器）と反応容器群６４１，６４２，６４３，６４４及び６４５に属するウェル１６（反応容器）とに含まれる内部標準核酸の量は、互いに異なっている。また、図７（Ｃ）に示す例では、反応容器群６３１，６３２，６３３，６３４及び６３５ごとに反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっており、さらに、反応容器群６４１，６４２，６４３，６４４及び６４５ごとに反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている。図７（Ｃ）に示す例においても、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量は、同一となっている。
【００９３】
このように、反応容器群ごとに、同一条件のウェル１６（反応容器）を複数含むことにより、ウェル１６（反応容器）ごとの誤差が判定結果に反映されにくくなり、判定の信頼性が向上する。また、誤って１つのウェル１６（反応容器）に気泡や異物が混入した場合にも、同一の反応容器群に属する他のウェル１６（反応容器）の結果を用いて判定を行うことができる。
【００９４】
また、反応容器群ごとに、ウェル１６に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量の少なくとも一方が異なっていることにより、１つのマイクロ流体チップで、複数種類の遺伝子、又は複数条件を対象として、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かをさらに高感度、高精度に判定できるマイクロ流体チップを実現できる。
【００９５】
１−５．被検液の充填方法
次に、被検液をウェル１６（反応容器）に充填する方法について、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を例にとり説明する。なお、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａ及び第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂ、並びに変形例に係るマイクロ流体チップ１０１，１０１ａ及び１０１ｂについても、同様の方法により被検液をウェル１６（反応容器）に充填することができる。
【００９６】
以下の例では、カバー２０の表面２０ａが、カバー２０を基板１０に対して加圧しない状態では接着力を発揮せずに、加圧により接着力を発揮する性質を有しているものとする。また、以下の例では、カバー２０の固着領域２１は、平面視において、基板１０のリザーバー領域１３及びウェル領域１４の両者を取り囲んで環状に連続しているものとする。また、以下の例では、カバー２０は、透明な材質で形成されているものとする。なお、この例では、ウェル１６の形状は円柱形であって、底面の直径がおよそ１ｍｍ、深さがおよそ０．５ｍｍであるものを例示する。さらに、この例では、基板１０及びカバー２０の平面的に見た外形形状は、長方形であって、長辺が約７．５ｃｍ、短辺が約２．５ｃｍであるものを例示する。
【００９７】
まず、標的核酸を含む被検液８０を調製する。被検液８０において、測定対象となる標的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液等の生体試料から抽出されたＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ等が挙げられる。より具体的には、例えば、前述した生体試料に含まれる細胞から抽出されたｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡが挙げられる。被検液８０の量は、ウェル１６の全体の容積に応じて適宜決定されるが、例えば複数のウェル１６の総容積と同じか又は前記総容積より多いことが好ましく、複数のウェル１６により確実に被検液８０を充填できる点で、複数のウェル１６の総容積より多いことがより好ましい。
【００９８】
次に、マイクロ流体チップ１００のリザーバー１５に被検液８０を導入する。例えば、カバー２０を装着する前に被検液８０を導入してもよいし、カバー２０のリザーバー１５に対応する領域に孔を形成したマイクロ流体チップ１００にあっては、カバー２０が装着された後に、該孔から被検液８０を導入してもよい。さらに、リザーバー１５に対応する領域の少なくとも一部についてカバー２０を剥離して被検液８０を導入してもよい。なお、この時点では、マイクロ流体チップ１００のウェル１６内には、被検液８０は導入されていない。
【００９９】
次に、マイクロ流体チップ１００に、リザーバー領域１３側からウェル領域１４側に向かう慣性力を作用させる。図８は、マイクロ流体チップ１００のリザーバー１５に被検液８０を導入した状態で、慣性力を印加した様子を模式的に示す図である。
【０１００】
本実施形態では、慣性力は遠心機によって発生される。遠心機の回転軸Ｒは、マイクロ流体チップ１００のリザーバー領域１３から見て、ウェル領域１４と反対側に配置される。遠心機を運転して、マイクロ流体チップ１００に慣性力（遠心力）が発生すると、図８に示すように、リザーバー１５の中の被検液８０が、回転軸Ｒから遠ざかる方向、すなわちウェル領域１４に向かう方向に加速度Ｇ（図中矢印）を受ける。そして加速度を受けている状態では、基板１０とカバー２０との間に間隙が生じ、被検液８０は、ウェル領域１４に向かって該間隙内を移送される。なお、このときの間隙の大きさ（厚み）は、特に制限はないが、図８では、間隙の大きさが非常に小さい例を示している。そして、基板１０のウェル領域１４に形成されたウェル１６の開口１６ａから、慣性力でウェル１６内の空気と入れ替わることによって被検液８０がウェル１６に導入される。ウェル１６に導入された被検液８０は、ウェル１６内に予め配置された試薬３０等と混合される。
【０１０１】
なお、図８に示す例では、遠心機の回転軸Ｒに対して、垂直な方向に沿ってマイクロ流体チップ１００の平面（例えば基板１０の第１面１１）が配置されて回転されている様子を示しているが、マイクロ流体チップ１００の遠心機の回転軸Ｒに対する配置は、容器２００の内部の被検液８０が、遠心力によって、リザーバー１５からウェル１６へ向かうことができる範囲で任意である。このような配置は、リザーバー１５の形状や、基板１０のウェル１６の配置などによって、適宜に設定することができる。
【０１０２】
次に、遠心機を停止し、慣性力の印加を止める。この状態では、被検液８０がウェル１６内に充填されている。また、例えば、被検液８０の体積が、ウェル１６の合計の容積よりも大きい場合などには、被検液８０は、ウェル１６内、並びに、基板１０及びカバー２０の間の間隙に存在している。いずれの場合であっても、カバー２０の外側から、ローラー、スキージ、ブレード等の治具によって、カバー２０を基板１０に押さえつけることによって、カバー２０をマイクロ流体チップ１００に密着させてウェル１６を密閉することができ、ウェル１６内に被検液８０を封入することができる。すなわち、被検液８０が基板１０及びカバー２０の間の間隙に存在していない状態では、カバー２０を基板１０に押さえつけることによって、ウェル１６が密閉され、被検液８０が基板１０及びカバー２０の間の間隙に存在している状態では、余分の被検液８０をリザーバー領域１３側に押し戻しつつ、ウェル１６が密閉されることができる。これにより、基板１０とカバー２０とが接する面は、すべて接着されることができる。また、標的核酸が所定量発現したか否かの判定結果に影響を及ぼさない程度の容量精度で、ウェル１６内に被検液８０を封入することができる。
【０１０３】
図９は、ローラー９０によって、マイクロ流体チップ１００のウェル１６を密閉する様子を模式的に示した図である。図９に示す例では、カバー２０の表面を、マイクロ流体チップ１００を基準とした相対的な位置においてリザーバー１５から遠い側から近い側へ（図９における白抜き矢印方向へ）と移動するローラー９０によって、基板１０及びカバー２０の間の間隙に存在する過剰の被検液８０をリザーバー１５から容器２００に戻しつつ、ウェル１６を密閉する様子を示している。
【０１０４】
このようにして、マイクロ流体チップ１００のウェル１６内に、正確な容量の被検液８０を導入することができる。マイクロ流体チップ１００に複数のウェル１６が形成されている場合も同様であり、該複数のウェル１６は、上記操作の結果、それぞれ独立した密閉空間となり、所望の量の被検液８０を精密に分注することができる。これにより、ピペットでは困難な微小量の被検液８０であっても、正確かつ簡単にウェル１６に分注することができる。これにより、分注作業に費やす時間とコストを抑制することができる。
【０１０５】
なお、ウェル１６に被検液８０を導入した後に標的核酸を分析する方法については、「４．核酸の分析方法」の項で説明する。
【０１０６】
２．第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット
図１０は、第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット２００を模式的に示す平面図である。第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット２００は、マイクロ流体チップ１００ｃとマイクロ流体チップ１００ｄを含んでいる。マイクロ流体チップ１００ｃ及びマイクロ流体チップ１００ｄのウェル１６近傍の断面を拡大した様子は、ともに図５と同様である。マイクロ流体チップ１００ｃ及びマイクロ流体チップ１００ｄは、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と比べて、ウェル１６（反応容器）内に配置されている試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量の基準となる参照検体が異なる。したがって、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と同様の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【０１０７】
マイクロ流体チップ１００ｃは、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）を含むマイクロ流体チップである。図１０に示すように、マイクロ流体チップ１００ｃの基板１０には、平面視において、第１進行状態領域５１が設けられている。第１進行状態領域５１に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）である。
【０１０８】
マイクロ流体チップ１００ｄは、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）を含むマイクロ流体チップである。図１０に示すように、マイクロ流体チップ１００ｄの基板１０には、平面視において、第２進行状態領域５２が設けられている。第２進行状態領域５２に配置されているウェル１６は、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）である。
【０１０９】
このように、第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット２００は、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）を含むマイクロ流体チップ１００ｃと、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）を含むマイクロ流体チップ１００ｄと、を含むことにより、判定の基準となる参照量を容易に選択できるマイクロ流体チップセットを実現できる。
【０１１０】
なお、マイクロ流体チップ１００ｃ及びマイクロ流体チップ１００ｄにおいても、「１−４．被検液の充填方法」の項で説明した方法により被検液を充填することができる。したがって、ピペットでは困難な微小量の被検液であっても、正確かつ簡単にウェル１６に分注することができる。
【０１１１】
また、ウェル１６に被検液を導入した後に標的核酸を分析する方法については、「４．核酸の分析方法」の項で説明する。
【０１１２】
３．核酸分析キット
３−１．第５実施形態に係る核酸分析キット
図１１は、第５実施形態に係る核酸分析キット３００を模式的に示す図である。第５実施形態に係る核酸分析キット３００は、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用する核酸分析キットであって、マイクロ流体チップ１００ｅと、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸を含む液体である内部標準試薬１１０と、を含む。図１１に示す例では、内部標準試薬１１０は、蓋付き容器１５０に収容されている液体である。また、マイクロ流体チップ１００ｅは、複数のウェル１６（反応容器）を含んでいる。
【０１１３】
図１１には、マイクロ流体チップ１００ｅを模式的に示す平面図が表されている。また、マイクロ流体チップ１００ｅのウェル１６近傍の断面を拡大した様子は、図５と同様であり、再び参照して説明する。マイクロ流体チップ１００ｅは、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と比べて、ウェル１６（反応容器）内に配置されている試薬３０，３１，３２が異なる。したがって、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と同様の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【０１１４】
マイクロ流体チップ１００ｅのウェル１６に配置されている試薬３０，３１，３２は、標的核酸及び内部標準核酸に共通のプライマーと、標的核酸及び内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、標的核酸の増幅産物に結合した場合と内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含んでいる。
【０１１５】
また、ウェル１６（反応容器）のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なっている。例えば、図５に示されている試薬３０及び試薬３１が互いに異なる場合、これらの試薬を含むウェル１６０及びウェル１６１が、それぞれ第１の反応容器及び第２の反応容器に対応する。なお、この説明は、他の任意の２つのウェルについても成立する。これにより、１つのマイクロ流体チップ１００ｅで複数種類の遺伝子の発現を判定できる。
【０１１６】
また、ウェル１６（反応容器）ごとにプライマー及び蛍光プローブの種類が異なる場合には、ウェル１６（反応容器）ごとに異なる遺伝子が増幅されるので、例えばクロスコンタミネーションのような、他の遺伝子の影響を抑制することができる。
【０１１７】
また、内部標準試薬１１０に含まれる内部標準核酸のモル濃度は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる標的核酸のモル濃度である参照モル濃度と同じである。
【０１１８】
ここで「同じ」の範囲は、完全同一のみならず、要求される判定精度を満たせる程度の誤差を含んだ範囲内であればよい。また、ユーザー自身がマニュアル等の指示に従って、予め定められた割合で内部標準試薬１１０を希釈したり、予め定められた割合で内部標準試薬１１０と被検液とを混合したりすることにより、内部標準試薬１１０がウェル１６（反応容器）に導入された時点で、内部標準核酸のモル濃度が参照モル濃度と同じになるように調整されてもよい。これにより、参照モル濃度が容易に選択できるようになる。また、参照モル濃度の選択自由度が大きくなる。
【０１１９】
参照検体は、遺伝子が所定量発現したか否かの判定の目的に応じて選択される検体であり、例えば、遺伝子が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である。参照検体を基準としたときの標的核酸の測定値は、参照すべき状態からの差異を直接的に表現しているため、参照モル濃度との差異を絶対量として知ることができるという特徴がある。また、このため、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた結果と比較しやすいという特徴がある。
【０１２０】
このような参照検体としては、例えば、健康な個体から採取した検体を代表する検体及び病気の個体から採取した検体を代表する検体の少なくとも一方であってもよい。健康な個体から採取した検体を代表する検体は、健康な１つの個体から採取した検体であってもよいし、健康な複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。同様に、病気の個体から採取した検体を代表する検体は、病気の１つの個体から採取した検体であってもよいし、病気の複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。なお、上述の「個体」は、ヒトであっても、ヒト以外の動物や植物であってもよい。
【０１２１】
このような参照検体を選択して、内部標準核酸のモル濃度を設定すること、すなわち、参照モル濃度を、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度の少なくとも一方と同じにすることにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体の少なくとも一方における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【０１２２】
第５実施形態に係る核酸分析キット３００は、被検液と内部標準試薬１１０とを混合した混合液を調整した後に、当該混合液をウェル１６（反応容器）に導入することにより、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用されることができる。
【０１２３】
このように、第５実施形態に係る核酸分析キット３００によれば、反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なるため、複数種類の遺伝子の発現を簡単に精度良く判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１２４】
また、第５実施形態に係る核酸分析キット３００によれば、内部標準核酸のモル濃度は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じであるため、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１２５】
なお、マイクロ流体チップ１００ｅにおいても、被検液と内部標準試薬１１０とを混合した混合液を調整した後に、当該混合液をリザーバー１５に導入し、「１−４．被検液の充填方法」の項で説明した方法により当該混合液をウェル１６（反応容器）に充填することができる。したがって、ピペットでは困難な微小量の当該混合液であっても、正確かつ簡単にウェル１６に分注することができる。
【０１２６】
なお、ウェル１６に被検液と内部標準試薬１１０とを混合した混合液を導入した後に標的核酸を分析する方法については、「４．核酸の分析方法」の項で説明する。
【０１２７】
３−２．第６実施形態に係る核酸分析キット
図１２は、第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａを模式的に示す図である。第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａは、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用する核酸分析キットであって、マイクロ流体チップ１００ｅと、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸を含む液体である内部標準試薬として、第１の内部標準試薬１１１及び第２の内部標準試薬１１２とを含む。図１２に示す例では、第１の内部標準試薬１１１及び第２の内部標準試薬１１２は、それぞれ蓋付き容器１５１及び蓋付き容器１５２に収容されている液体である。
【０１２８】
第１の内部標準試薬１１１は、参照モル濃度が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である内部標準核酸を含んでいる。すなわち、第１の内部標準試薬１１１に含まれる内部標準核酸のモル濃度は、病気の第２進行状態の個体を代表する検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じである。
【０１２９】
第２の内部標準試薬１１２は、参照モル濃度が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である内部標準核酸を含んでいる。すなわち、第２の内部標準試薬１１２に含まれる内部標準核酸のモル濃度は、病気の第２進行状態の個体を代表する検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じである。
【０１３０】
ここで「同じ」の範囲は、完全同一のみならず、要求される判定精度を満たせる程度の誤差を含んだ範囲内であればよい。また、ユーザー自身がマニュアル等の指示に従って、予め定められた割合で第１の内部標準試薬１１１又は第２の内部標準試薬１１２を希釈したり、予め定められた割合で被検液と第１の内部標準試薬１１１又は第２の内部標準試薬１１２とを混合したりすることにより、第１の内部標準試薬１１１又は第２の内部標準試薬１１２がウェル１６（反応容器）に導入された時点で、内部標準核酸のモル濃度が参照モル濃度と同じになるように調整されてもよい。これにより、参照モル濃度が容易に選択できるようになる。また、参照モル濃度の選択自由度が大きくなる。
【０１３１】
第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａは、第１の内部標準試薬１１１又は第２の内部標準試薬１１２と被検液とを混合した混合液を調整した後に、当該混合液をウェル１６（反応容器）に導入することにより、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用されることができる。
【０１３２】
このように、第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａは、参照モル濃度が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である内部標準核酸を含む第１の内部標準試薬１１１と、参照モル濃度が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である内部標準核酸を含む第２の内部標準試薬１１２と、を含むことにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１３３】
なお、１つのマイクロ流体チップ１００ｅにおいて、第１の内部標準試薬１１１を用いるウェル１６（反応容器）と第２の内部標準試薬１１２を用いるウェル１６（反応容器）とを使い分けてもよい。これにより、１つのマイクロ流体チップ１００ｅを用いて、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１３４】
３−３．変形例に係る核酸分析キット
上述した第５実施形態に係る核酸分析キット３００及び第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａにおいては、ウェル１６（反応容器）ごとに、ウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている例について説明したが、ウェル１６（反応容器）が、複数のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群を構成し、反応容器群のうち、第１の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）と第２の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が互いに異なっていてもよい。換言すれば、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量が同一であってもよい。
【０１３５】
図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）は、変形例に係る核酸分析キット３０１及び３０１ａを模式的に示す図である。図１３（Ａ）に示す核酸分析キット３０１は、第５実施形態に係る核酸分析キット３００の変形例、図１３（Ｂ）に示す核酸分析キット３０１ａは、第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａの変形例である。
【０１３６】
図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）に示す例では、ウェル１６（反応容器）が、それぞれ１０個のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群６１，６２，６３，６４及び６５を構成している。例えば、図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）に示されている反応容器群６１に属するウェル１６（反応容器）と反応容器群６２に属するウェル１６（反応容器）とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が互いに異なる場合、反応容器群６１及び反応容器群６２が、それぞれ第１の反応容器群及び第２の反応容器群に対応する。なお、この説明は、他の任意の２つの反応容器群についても成立する。
【０１３７】
図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）に示す例では、反応容器群６１，６２，６３，６４及び６５ごとに、反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている。換言すれば、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は、同一となっている。
【０１３８】
このように、反応容器群ごとに、同一条件のウェル１６（反応容器）を複数含むことにより、ウェル１６（反応容器）ごとの誤差が判定結果に反映されにくくなり、判定の信頼性が向上する。また、誤って１つのウェル１６（反応容器）に気泡や異物が混入した場合にも、同一の反応容器群に属する他のウェル１６（反応容器）の結果を用いて判定を行うことができる。
【０１３９】
また、反応容器群ごとに、ウェル１６に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっていることにより、１つのマイクロ流体チップで、複数種類の遺伝子を対象として、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かをさらに高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１４０】
４．核酸の分析方法
次に、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を用いた核酸の分析方法の一例について説明する。以下では、ウェル１６（反応容器）内に被検液が導入された後の工程について説明する。なお、上述した他の実施形態に係るマイクロ流体チップ、マイクロ流体チップセット及び核酸分析キットを用いた場合にも、同様の方法により核酸を分析することができる。
【０１４１】
以下に説明する核酸の分析方法では、検体に含まれるｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを含む被検液を調整する工程と、複数のウェル１６（反応容器）内で核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）を行う工程と、各々のウェル１６（反応容器）内において、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、各々のウェル１６（反応容器）内で測定された蛍光強度及び各々のウェル１６（反応容器）内に配置された（又は導入された）内部標準核酸の量に基づいて、被検液に含まれる標的核酸の量を推定することにより検体に含まれるｍＲＮＡの量を推定する工程と、を含む。
【０１４２】
第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００のウェル１６（反応容器）内には、試薬３０，３１，３２として、既知量の内部標準核酸、プライマー及び蛍光プローブが配置されている。よって、ウェル１６（反応容器）内で核酸増幅反応を行う工程では、ウェル１６（反応容器）内に予め配置された内部標準核酸と、ウェル１６（反応容器）に導入された被検液に含まれる標的核酸とがともにウェル１６（反応容器）内で増幅される。
【０１４３】
核酸増幅反応では、例えば、標的核酸及び内部標準核酸の両方に蛍光プローブが結合することができ、さらに、蛍光プローブがどちらか一方と結合した際に蛍光の消光が発生するようにしておくことができる。この状態にて、各々のウェル１６（反応容器）から生じる蛍光強度を測定する。次いで、各々のウェル１６（反応容器）について測定された蛍光強度及び各々のウェル１６（反応容器）内に配置された内部標準核酸の量に基づいて、被検液に含まれる標的核酸の量を推定することができる。そして、推定された標的核酸の量に基づいて、検体に含まれるｍＲＮＡの量を推定することができる。
【０１４４】
各々のウェル１６（反応容器）について測定された蛍光強度と、後述する式（１）を用いて標的核酸の量を推定するために、予めポジティブコントロール及びネガティブコントロールのデータを用意する。
【０１４５】
まず、ポジティブコントロールとして、標的核酸ＴＧＴのみを含むウェルを用意する。このウェルにおいては、核酸増幅反応において得られるすべての増幅産物が標的核酸ＴＧＴを増幅したものであり、この場合の蛍光変化量をＦｔとする。この標的核酸ＴＧＴは、予め用意したものを用いることもできる。
【０１４６】
１つのマイクロ流体チップで複数種類の核酸について分析する場合には、標的核酸の種類ごとにポジティブコントロール用のウェルを用意する。なお、内部標準核酸の量によって、標的核酸の量を変える必要はない。
【０１４７】
次に、ネガティブコントロールとして、内部標準核酸ＣＰＴのみを含むウェルを用意する。このウェルにおいては、すべての増幅産物が内部標準核酸ＣＰＴを増幅したものであり、この場合の蛍光変化量をＦｃとする。
【０１４８】
なお、上述の「標的核酸ＴＧＴのみを含むウェル」及び「内部標準核酸ＣＰＴのみを含むウェル」は、実際に核酸の分析に用いるマイクロ流体チップの一部のウェルであってもよいし、同種である他のマイクロ流体チップのウェルであってもよい。
【０１４９】
ウェル内に標的核酸ＴＧＴ及び内部標準核酸ＣＰＴの両方が存在する場合には、両方の増幅産物ができるため、そのときの蛍光変化量Ｆを以下の式（１）で表すことができる。
【０１５０】
Ｆ＝Ｆｔ・Ｘ／（Ｘ＋Ｃ）＋Ｆｃ・Ｃ／（Ｘ＋Ｃ）
＝〔Ｃ・（Ｆｃ−Ｆｔ）／（Ｘ＋Ｃ）〕＋Ｆｔ ・・・・・（１）
【０１５１】
上記式（１）における蛍光変化量Ｆは、蛍光プローブが発する蛍光強度そのものでもよいし、あるいは、（ｉ）核酸増幅反応の前に測定された蛍光強度と、核酸増幅反応の後に測定された蛍光強度との比（蛍光変化量）、または、（ｉｉ）核酸増幅後に増幅産物及び蛍光プローブが解離する温度まで加熱した状態（核酸増幅反応後において蛍光プローブが増幅された核酸から解離している第１の状態）で測定された蛍光強度と、蛍光プローブが結合している温度（核酸増幅反応後において蛍光プローブが増幅された核酸の一部に結合している第２の状態）で測定された蛍光強度との比（蛍光変化量）であってもよい。
【０１５２】
上記式（１）において、Ｃはウェル１６（反応容器）における内部標準核酸ＣＰＴの量（ウェル１６（反応容器）内のコピー数）、Ｘはウェル１６（反応容器）における標的核酸ＴＧＴの量（ウェル１６（反応容器）内のコピー数）である。
【０１５３】
したがって、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの蛍光輝度から求めたＦｔとＦｃ、及び内部標準核酸の量Ｃを上記式（１）に代入すると、蛍光変化量Ｆから標的核酸の量Ｘを求めることができる。なお、蛍光強度の測定から標的核酸の量（又は検体に含まれるｍＲＮＡの量）を推定するまでの工程を、蛍光検出装置と、これによる蛍光検出結果に基づいて標的核酸の量（又は検体に含まれるｍＲＮＡの量）を推定する演算を行うプログラムとを組み合わせて行うこともできる。
【０１５４】
蛍光プローブは、ＰＣＲによって増幅された標的核酸の一部に結合し、標的核酸と内部標準核酸とを識別して蛍光変化を示すものであればよく、例えば、Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ（登録商標）、Ｈｙｂ ｐｒｏｂｅ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）等を用いることができる。Ｑ−Ｐｒｏｂｅは、標識した蛍光色素にグアニン塩基が近づくと、発する蛍光が減少するという「蛍光消光現象」を利用して目的の遺伝子を検出するプローブである。
【０１５５】
Ｑ−Ｐｒｏｂｅは蛍光標識されたシトシンを末端に有し、目的遺伝子に特異的に結合するような配列に設計されており、Ｑ−Ｐｒｏｂｅが目的遺伝子と結合すると、グアニンの影響を受けて蛍光が減少する。この現象を利用して内部標準核酸と標的核酸とを区別するためには、内部標準核酸が、Ｑ−Ｐｒｏｂｅの蛍光標識末端塩基に対応する塩基としてグアニンを有する場合には、標的核酸は、Ｑ−Ｐｒｏｂｅの蛍光標識末端塩基に対応する塩基がグアニン以外の塩基であることが必要である。これにより、Ｑ−Ｐｒｏｂｅが標的核酸及び内部標準核酸をともに共増幅した際、内部標準核酸とＱ−Ｐｒｏｂｅとがハイブリダイズすると、標識蛍光色素の蛍光発光が減少（消光）する一方、標的核酸とＱ−Ｐｒｏｂｅとがハイブリダイズすると、標識蛍光色素の蛍光発光は減少しない。なお、上記の説明については標的核酸と内部標準核酸とを入れ替えても成立する。従って、Ｑ−Ｐｒｏｂｅが標的核酸又は内部標準核酸のどちらと結合した際に蛍光の消光が発生するかを選択することができる。
【０１５６】
このように、上述した核酸の分析方法により、マイクロ流体チップ１００の複数のウェル１６（反応容器）を用いて、１つの検体から多種類の遺伝子についての遺伝子発現量や、複数の発現状態と比較した遺伝子発現量を分析できる。
【０１５７】
また、ウェル１６（反応容器）内での反応が液体中で行われること、及び、核酸増幅反応により増幅した後に発現量を分析することにより、ＤＮＡチップと比べて高い再現性が得られる。
【０１５８】
さらに、核酸増幅反応と蛍光強度の測定結果を演算することで遺伝子の発現量を分析できるため、簡単な装置で分析が実現できる。
【０１５９】
５．実施例
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【０１６０】
本実施例では、蛍光プローブとしてＱ−Ｐｒｏｂｅ（Kurata et al., Nucleic acids Research, 2001, vol.29, No.6 e34）を用いた場合を例にとり、マイクロ流体チップ１００を用いて競合ＰＣＲ法により検体に含まれるｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを標的核酸として定量する方法について説明する。
【０１６１】
Ｑ-Ｐｒｏｂｅは、結合した核酸に含まれるグアニンと相互作用して著しく蛍光が消光する。よって、標的核酸及び内部標準核酸の両方にＱ-Ｐｒｏｂｅが結合できるようにし、さらに、Ｑ-Ｐｒｏｂｅがどちらか一方と結合した際に蛍光の消光が発生するようにしておくことにより、既知の内部標準核酸の量に対する標的核酸の相対量を推定することができる。
【０１６２】
標的核酸及び内部標準核酸はＪ−Ｂｉｏ２１（株）から購入した。本実施例においては、標的核酸として、ヒトβアクチン遺伝子及びヒトアルブミン遺伝子を用いた。また、バッファーとして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ：８．３）と、ＫＣｌ：５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２：１．５ｍＭの混合液を使用した。
【０１６３】
図１４は、標的核酸及び内部標準核酸の配列例である。図１４に示す例では、標的核酸はヒトβアクチン遺伝子である。また、図１４に示す配列例は、標的核酸及び内部標準核酸のセンス鎖を表している。また、図１５は、図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応するプライマーの配列例、図１６は、図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応する蛍光プローブの配列例である。
【０１６４】
図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸の配列の下線を引いた部分相補的な関係となるアンチセンス鎖の部分に、図１６に示される蛍光プローブ（Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）が結合する。標的核酸と内部標準核酸とを比較すると、図１４に示されるように、蛍光プローブの結合部分（下線部分）の直後が、標的核酸は「ｃｃ」、内部標準核酸は「ａａ」となっている点で相違し、他の配列は同一である。したがって、Ｑ-Ｐｒｏｂｅは標的核酸と結合した際に、蛍光プローブの結合部分（下線部分）の直後のシトシン（ｃ）と相補的な関係となるアンチセンス鎖のグアニンと反応するため、蛍光が消光する。
【０１６５】
本実施例においては、マイクロ流体チップ１００のウェル１６（反応容器）内に、図１４に示される配列を有する内部標準核酸、図１５に示される配列を有するプライマー及び図１６に示される配列を有する蛍光プローブ（Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）を、ウェル１６（反応容器）内に試薬として配置した。Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（Ｊ−Ｂｉｏ２１（株）から購入）は、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて蛍光標識したものを使用した。
【０１６６】
図１７は、標的核酸及び内部標準核酸の他の配列例である。図１７に示す例では、標的核酸はヒトアルブミン遺伝子である。また、図１７に示す配列例は、標的核酸及び内部標準核酸のセンス鎖を表している。また、図１８は、図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応するプライマーの配列例、図１９は、図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応する蛍光プローブの配列例である。
【０１６７】
図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸の配列の下線を引いた部分に、図１９に示される蛍光プローブ（Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）が結合する。標的核酸と内部標準核酸とを比較すると、図１７に示されるように、蛍光プローブの結合部分（下線部分）の直前が、標的核酸は「ｇｇ」、内部標準核酸は「ａａ」となっている点で相違し、他の配列は同一である。したがって、Ｑ-Ｐｒｏｂｅは標的核酸と結合した際に、蛍光プローブの結合部分（下線部分）の直前のグアニン（ｇ）と反応するため、蛍光が消光する。
【０１６８】
本実施例においては、マイクロ流体チップ１００のウェル１６（反応容器）内に、図１７に示される配列を有する内部標準核酸、図１８に示される配列を有するプライマー及び図１９に示される配列を有する蛍光プローブ（Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）を、ウェル１６（反応容器）内に試薬として配置した。Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（Ｊ−Ｂｉｏ２１（株）から購入）は、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて蛍光標識したものを使用した。
【０１６９】
上述した方法と同様の方法により、マイクロ流体チップ１００のウェル１６を２つの反応容器群に分け、それぞれ２つの遺伝子ヒトβアクチン遺伝子及びヒトアルブミン遺伝子に対応するように反応容器群ごとに異なるプライマー及び蛍光プローブを配置した。また、内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体（検体１とする）の反応液をウェル１６（反応容器）に導入した場合に、ウェル１６（反応容器）に導入される標的核酸の量である参照量に調整して各々のウェル１６に配置した。参照検体中の各遺伝子の発現量は、予めリアルタイムＰＣＲ法により測定して求めたものであり、表１に示される。
【０１７０】
続いて、サンプル（検体２）から抽出した標的核酸を含む被検液をＰＣＲ反応に適するように調製し、ウェル１６（反応容器）に充填し、サーマルサイクラー（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社））でＰＣＲを行った。蛍光測定は、室温で増幅反応の前後に測定し、その比を蛍光変化量として算出した。
【０１７１】
表１は、上述した条件においてヒトβアクチン遺伝子及びヒトアルブミン遺伝子について競合ＰＣＲ法により定量した結果である。記号は前述の式（１）に対応して示している。参照検体（検体１）の定量ＲＴ−ＰＣＲの測定結果より、参照量を、βアクチン遺伝子については５０００ｃｏｐｙ／μｌ、アルブミン遺伝子については１００ｃｏｐｙ／μｌに設定した。
【０１７２】
【表１】
【０１７３】
表１の結果から、サンプル（検体２）中の標的核酸の量は、２種類とも適切に定量できていることが分かる。
【０１７４】
内部標準核酸の量を、サンプルの種類によらず一定にすると、サンプル中の標的核酸の量が内部標準核酸の量と著しく異なる場合（目安として１０分の１以下又は１０倍以上）には、十分な定量精度が確保できない。通常、遺伝子の種類によって発現量は大きく異なるため、全ての遺伝子を一定濃度の内部標準核酸との競合ＰＣＲ法で定量することは困難である。表１の結果から、参照量を予め設定したことで、発現量が１００倍以上異なる２種類の遺伝子の両方について、１つのマイクロ流体チップ１００を用いて精度良く定量ができたことが分かる。
【０１７５】
このように、本実施例によれば、標的核酸の発現量を事前に予想して内部標準核酸の量を設定することにより、期待された範囲内の発現量であれば、標的核酸の発現量を精度よく定量することができる。また、発現量が大きく異なる複数の遺伝子について、１つのマイクロ流体チップで定量することができる。
【０１７６】
６．本発明の適用例
本発明によれば、例えば、病院などで診断対象者（患者）から検体を採取し、遺伝子の発現状態を分析できる。例えば、内部標準核酸の量を健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量とすれば、診断対象者の遺伝子の発現状態が健康な状態の発現状態と比較してどれだけ差異があるかを容易に判定することができる。また例えば、内部標準核酸の量を特定の病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量とすれば、診断対象者の遺伝子の発現状態が特定の病気の状態の発現状態と比較してどれだけ差異があるかを容易に判定することができる。これにより、遺伝子発現量に基づいた病気の診断が可能になる。なお、病気であるか否かの判定基準は、統計データなどに基づいて、医学的に決定される。
【０１７７】
また、上述の方法によれば、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールを予め用意しておくことにより、遺伝子発現量の定量も可能になる。病気の程度によって、１通りの参照量では定量できないほどに遺伝子発現量が変化する場合には、１つのマイクロ流体チップに内部標準核酸の量が異なるウェル（反応容器）を設けたり、内部標準核酸の量が異なる複数のマイクロ流体チップを用いたりすることにより、遺伝子発現量の定量が可能になる。
【０１７８】
健康な状態の発現状態と比較して、定量できないほどに遺伝子発現量が変化している場合であっても、病気か否かの最初のスクリーニングとして使用することが可能である。この場合、必要に応じてオーバーレンジとなった遺伝子について、内部標準核酸の量を変えて再検査することにより、より精度の高い診断が可能となる。
【０１７９】
なお、上述した実施形態及び変形例は一例であって、これらに限定されるわけではない。例えば各実施形態及び各変形例は、複数を適宜組み合わせることが可能である。
【０１８０】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１８１】
１０ 基板、１１ 第１面、１２ 第２面、１３ リザーバー領域、１４ ウェル領域、１５ リザーバー、１６ ウェル、１６ａ 開口、２０ カバー、２０ａ 表面、２１ 固着領域、３０，３１，３２ 試薬、４１ 健康領域、４２ 病気領域、５１ 第１進行状態領域、５２ 第２進行状態領域、６１，６２，６３，６４，６５ 反応容器群、８０ 被検液、９０ ローラー、１００，１００ａ，１００ｂ，１００ｃ，１００ｄ，１００ｅ，１００ｆ，１０１，１０１ａ，１０１ｂ マイクロ流体チップ、１１０ 内部標準試薬、１１１ 第１の内部標準試薬、１１２ 第２の内部標準試薬、１５０，１５１，１５２ 蓋付き容器、１６０，１６１，１６２ ウェル、２００ マイクロ流体チップセット、３００，３００ａ，３０１，３０１ａ 核酸分析キット、６１１，６１２，６１３，６１４，６１５，６２１，６２２，６２３，６２４，６２５，６３１，６３２，６３３，６３４，６３５，６４１，６４２，６４３，６４４，６４５ 反応容器群、Ｒ 回転軸
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロ流体チップ、マイクロ流体チップセット及び核酸分析キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多数の遺伝子の発現を一度に解析するために、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）が注目されている。ＤＮＡチップを用いた核酸検出・定量法は、ＤＮＡの相補性に基づくハイブリダイゼーション反応を利用した核酸検出・定量法である。ＤＮＡチップは、平面基板上に多種類のＤＮＡ断片（プローブＤＮＡ）が固定されているのが特徴で、具体的な使用方法としては、研究又は検査対象の細胞に含まれる発現遺伝子を蛍光色素で標識し、平面基板上のＤＮＡ断片と結合させ、その箇所を専用の装置で蛍光輝度を測定することにより、サンプル中の遺伝子発現量を定量する方法が挙げられる。
【０００３】
しかしながら、非特許文献１に記載されているように、ＤＮＡチップには、いくつかの課題がある。
【０００４】
第１に、感度についての課題が挙げられる。ＤＮＡチップの検出能力（感度）は低発現の遺伝子に対して十分ではない。
【０００５】
第２に、精度についての課題が挙げられる。ＤＮＡチップで低発現の遺伝子を検出するためには、検体量を十分に確保する必要がある。検体量が少なくて反応に十分でない場合には、その遺伝子に対しＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；Polymerase Chain Reaction）やＩＶＴ（in-vitro transcription）などの増幅反応を行って、検体中の核酸量を増やす必要がある。ＰＣＲは、標的核酸及び試薬を混合したものをＰＣＲ用のチューブ（反応容器）に入れ、サーマルサイクラーという温度制御装置で、例えば５５℃、７２℃、９４℃の３段階の温度変化を数分の周期で繰り返し反応させるもので、酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）の作用により温度サイクル１回あたり、標的核酸だけを約２倍に増幅することができる。この増幅処理は、検体に含まれる遺伝子量の比が変わってしまうため、定量精度が低下するという問題が指摘されている。
【０００６】
また、標的核酸とよく似た配列を有する核酸がプローブに間違って結合すること（クロスハイブリダイゼーション）によっても精度が低下する。さらに、プローブの配列によって、特定の遺伝子の結合がバイアスされる可能性が指摘されている。同様に、標的核酸を蛍光標識することも精度に影響することが考えられる。
【０００７】
第３に、再現性についての課題が挙げられる。ＤＮＡチップはプラットホーム（ＤＮＡチップ製品）が異なると、結果が異なる。様々な要因があるが、プローブの長さや配列が異なることが最大の原因と考えられている。
【０００８】
臨床検査において用いられる、遺伝子発現を高精度、高感度に解析する手法として、リアルタイムＰＣＲの絶対定量法や競合ＰＣＲ法がある。これらの手法で定量を行い、その結果に基づいて注意深くキャリブレーションを行えば、ＤＮＡチップの感度及び精度の問題の一部を改善することができる。しかし、リアルタイムＰＣＲの絶対定量法は、少なくとも５点のデータから検量線を作成する必要があり、競合ＰＣＲ法も、複数の検量線を作成する必要がある。この作業は煩雑で、非常に手間と時間がかかる。さらに、キャリブレーション自体も煩雑な作業であった。そのため、これらの手法を多種類の遺伝子に適用することは困難であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sorin Draghici et.al.、"Reliability and reproducibility issues in DNA microarray measurement"、TRENDS in Genetics Vol.22 No.2 February 2006、P101-109
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、以上のような問題点に鑑みてなされたものであり、本発明のいくつかの態様によれば、複数種類の遺伝子が所定量発現したか否かの判定が、高感度、高精度で簡単にできるマイクロ流体チップ、マイクロ流体チップセット及び核酸分析キットを提供することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
（１）本発明に係るマイクロ流体チップは、
検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用するマイクロ流体チップであって、
複数の反応容器を含み、
前記反応容器は、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、前記標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸と、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、前記標的核酸の増幅産物に結合した場合と前記内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれる前記プライマー及び前記蛍光プローブの種類は互いに異なり、
前記内部標準核酸の量は、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を前記反応容器に導入した場合に、前記反応容器に導入される前記反応液に含まれる前記標的核酸の量である参照量と同じである。
【００１２】
本発明によれば、反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なるため、複数種類の遺伝子の発現を簡単に精度良く判定できるマイクロ流体チップを実現できる。
【００１３】
また、本発明によれば、内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を反応容器に導入した場合に、反応容器に導入される反応液に含まれる標的核酸の量である参照量と同じであるため、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できるマイクロ流体チップを実現できる。
【００１４】
（２）このマイクロ流体チップは、
前記参照量は、前記参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量の少なくとも一方であってもよい。
【００１５】
これにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体の少なくとも一方における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００１６】
（３）このマイクロ流体チップは、
前記参照量が、前記参照検体を、前記健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器と、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器と、
を含んでいてもよい。
【００１７】
これにより、１つのマイクロ流体チップで、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００１８】
（４）このマイクロ流体チップは、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器と、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器と、
を含んでいてもよい。
【００１９】
これにより、１つのマイクロ流体チップで、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００２０】
（５）本発明に係るマイクロ流体チップセットは、
前記複数の反応容器の少なくとも一部として、前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器を含む、上述のマイクロ流体チップと、
前記複数の反応容器の少なくとも一部として、前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器を含む、上述のマイクロ流体チップと、
を含む。
【００２１】
本発明によれば、判定の基準となる参照量を用途に応じて容易に選択できるマイクロ流体チップセットを実現できる。
【００２２】
（６）本発明に係る核酸分析キットは、
検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用する核酸分析キットであって、
マイクロ流体チップと、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、前記標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸を含む液体である内部標準試薬と、
を含み、
前記マイクロ流体チップは、複数の反応容器を含み、
前記反応容器は、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、前記標的核酸の増幅産物に結合した場合と前記内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれる前記プライマー及び前記蛍光プローブの種類は互いに異なり、
前記内部標準核酸のモル濃度は、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる前記標的核酸のモル濃度である参照モル濃度と同じである。
【００２３】
本発明によれば、反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なるため、複数種類の遺伝子の発現を簡単に精度良く判定できる核酸分析キットを実現できる。
【００２４】
また、本発明によれば、内部標準核酸のモル濃度は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じであるため、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【００２５】
（７）この核酸分析キットは、
前記参照モル濃度は、前記参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度の少なくとも一方であってもよい。
【００２６】
これにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体の少なくとも一方における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００２７】
（８）この核酸分析キットは、
前記内部標準試薬として、
前記参照モル濃度が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である前記内部標準核酸を含む第１の内部標準試薬と、
前記参照モル濃度が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である前記内部標準核酸を含む第２の内部標準試薬と、
を含んでいてもよい。
【００２８】
これにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００の基板１０を模式的に示す平面図。
【図２】図１のＡ−Ａ線の断面を模式的に表した図。
【図３】第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を模式的に示す平面図。
【図４】図３のＢ−Ｂ線の断面を模式的に表した図。
【図５】マイクロ流体チップ１００のウェル１６近傍の断面を拡大して示す模式図。
【図６】図６（Ａ）は、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａを模式的に示す平面図、図６（Ｂ）は、第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂを模式的に示す平面図。
【図７】図７（Ａ）〜図７（Ｃ）は、変形例に係るマイクロ流体チップ１０１，１０１ａ，１０１ｂを模式的に示す平面図。
【図８】マイクロ流体チップ１００のリザーバー１５に被検液８０を導入した状態で、慣性力を印加した様子を模式的に示す図。
【図９】ローラー９０によって、マイクロ流体チップ１００のウェル１６を密閉する様子を模式的に示した図。
【図１０】第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット２００を模式的に示す平面図。
【図１１】第５実施形態に係る核酸分析キット３００を模式的に示す図。
【図１２】第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａを模式的に示す図。
【図１３】図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）は、変形例に係る核酸分析キット３０１及び３０１ａを模式的に示す図
【図１４】標的核酸及び内部標準核酸の配列例。
【図１５】図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応するプライマーの配列例。
【図１６】図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応する蛍光プローブの配列例。
【図１７】標的核酸及び内部標準核酸の他の配列例。
【図１８】図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応するプライマーの配列例。
【図１９】図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応する蛍光プローブの配列例。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
以下、本発明の好適な実施形態について図面を用いて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施の形態は、特許請求の範囲に記載された本発明の内容を不当に限定するものではない。また以下で説明される構成の全てが本発明の必須構成要件であるとは限らない。
【００３１】
１．マイクロ流体チップ
１−１．第１実施形態に係るマイクロ流体チップの構成
第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００は、測定対象となる検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用するマイクロ流体チップであって、複数の反応容器を含む。以下に説明する例では、マイクロ流体チップ１００は、基板１０とカバー２０とを有し、基板１０に反応容器となる複数のウェル１６が設けられている。
【００３２】
なお、以下の説明において、「平面視において」、「平面的に見て」及び「平面的に見た」という場合は、基板１０の第１面１１に直交する方向から見た場合のことを指すものとする。
【００３３】
１−１−１．基板
図１は、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００の基板１０を模式的に示す平面図である。図２は、図１のＡ−Ａ線の断面を模式的に表した図である。
【００３４】
基板１０は、マイクロ流体チップ１００の基体となる板状の部材である。基板１０は、図２に示すように、互いに表裏の関係を有する第１面１１及び第２面１２を有する。基板１０の形状は、板状であり、基板１０の第１面１１のウェル領域１４の高さ及びウェル領域１４を囲む基板の面の高さが、ウェル開口１６の開口面の高さと一致すれば特に限定されない。基板１０の厚み（第１面１１及び第２面１２の間の距離）も特に限定されないが、取り扱いの容易さや、破損しにくさの点で、０．５ｍｍ以上５ｍｍ以下であることが好ましい。基板１０の平面的に見た外形形状については、特に限定されず、矩形、円形などとすることができる。本実施形態では、基板１０の平面的に見た形状が長方形である例を示す。
【００３５】
基板１０の材質としては、特に限定されず、無機材料（例えば単結晶シリコン、パイレックス（登録商標）ガラス）、及び有機材料（例えばポリカーボネート、ポリプロピレン等の樹脂）を挙げることができ、これらの複合材料であってもよい。マイクロ流体チップ１００を、蛍光測定を伴う用途に使用する場合には、基板１０は、自発蛍光の小さい材質で形成されることが望ましい。このような自発蛍光の小さい材質としては、例えば、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられる。なお、基板１０はＰＣＲにおける加熱に耐えられる材質であることが好ましい。
【００３６】
さらに、基板１０の材質には、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、若しくは、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ又はＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ又はＣｒの炭化物などの黒色物質等を配合することができる。基板１０の材質に、このような黒色物質が配合されることにより、樹脂等の有する自発蛍光をさらに抑制することができる。また、後述するウェル１６等をマイクロ流体チップ１００の外部から観察するような用途（例えば、リアルタイムＰＣＲなど）にマイクロ流体チップ１００を用いる場合には、必要に応じて、基板１０の材質を透明なものとすることができる。またなお、基板１０の材質は、核酸やタンパク質の吸着が少なく、ポリメラーゼ等の酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。
【００３７】
基板１０が無機材料で形成される場合には、フォトリソグラフィー法を用いたドライエッチングなどを行って、成形、加工することができる。また、基板１０が樹脂を主成分として形成される場合には、鋳型成形、射出成形又はホットエンボス加工などの方法によって、成形、加工することができる。
【００３８】
１−１−２．リザーバー領域及びウェル領域
図１に示すように、基板１０には、平面視において、リザーバー領域１３及びウェル領域１４が設けられる。リザーバー領域１３及びウェル領域１４は、互いに隣り合って設けられる。リザーバー領域１３及びウェル領域１４は、隣接して設けられてもよい。また、リザーバー領域１３及びウェル領域１４は、複数設けられてもよい。リザーバー領域１３及びウェル領域１４は、平面視において、後述するカバー２０の固着領域２１の内側に設けられる。基板１０におけるリザーバー領域１３及びウェル領域１４の設けられる位置は、基板１０に遠心力等の慣性力が印加された際に、リザーバー領域１３からウェル領域１４に向かう方向に当該慣性力が作用することができる限り特に限定されない。リザーバー領域１３及びウェル領域１４の平面的に見た形状は、特に限定されず、矩形、円形等とすることができる。
【００３９】
１−１−３．カバー
図３は、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を模式的に示す平面図である。図４は、図３のＢ−Ｂ線の断面を模式的に表した図である。
【００４０】
なお、以下の説明において、「敷設」とは、基板１０の第１面１１にカバー２０が敷かれた状態のことを指し、「固着」とは、基板１０の第１面１１に敷設されて固定されている状態を指す。すなわち、「敷設」との文言は、カバー２０と基板１０の第１面１１とが、固着（固定）されている場合と固着されていない場合とを含む意味で用いている。したがって、カバー２０が敷設され、固着領域２１を有する状態とは、基板１０とカバー２０との間に間隙を形成することが容易な部分と、基板１０とカバー２０とが分離しにくい部分とがある状態であり、後者の基板１０とカバー２０とが分離しにくい部分を、固着された固着領域２１と表現するものとする。
【００４１】
カバー２０は、基板１０の第１面１１側に敷設される。カバー２０は、フィルム又はシート状の形状を有する。カバー２０の厚みは、特に限定されないが、例えば、０．０１ｍｍ以上５ｍｍ以下とすることができる。カバー２０の平面的に見た外形形状は、基板１０の平面的に見た外形形状と一致していてもいなくてもよい。図３の例では、カバー２０の平面的に見た外形形状は、基板１０の平面的に見た外形形状と一致している。カバー２０は、静的な状態では基板１０に接しているが、マイクロ流体チップ１００に遠心力などの慣性力が印加された場合には、基板１０とカバー２０との間に間隙が形成される程度の可撓性ないしは弾性を有する。また、カバー２０は、基板１０に接した状態で、基板１０に設けられるウェル１６（後述する）の開口１６ａを塞ぎ、ウェル１６を独立した空間（反応容器）とすることができる。カバー２０は、基板１０に押しつけられる場合などに、ウェル１６の開口１６ａ付近において撓みにくくウェル１６の容積に大きな変化を生じない程度の弾性を有することが好ましい。このようなカバー２０の弾性の程度は、カバー２０の厚み、ウェル１６の開口１６ａの大きさ、及び基板１０に当接される際の押圧などを考慮して、材質を選ぶことにより適宜設計されることができる。
【００４２】
カバー２０の材質としては、遠心力等の慣性力によって撓むことができる程度の弾性を有するものが挙げられ、例えば、有機材料（ポリカーボネート、ポリプロピレン等の樹脂及び各種のゴム）や、有機材料と無機材料の複合材料を挙げることができる。マイクロ流体チップ１００を、蛍光測定を伴う用途に使用する場合には、カバー２０は、自発蛍光の小さい材質で形成されることが望ましい。このような自発蛍光の小さい材質としては、例えば、ポリカーボネート、ポリプロピレン等が挙げられる。カバー２０の材質は、核酸やタンパク質の吸着が少なく、ポリメラーゼ等の酵素反応を阻害しない材質であることが好ましい。またなお、カバー２０はＰＣＲにおける加熱に耐えられる材質であることが好ましい。
【００４３】
また、カバー２０の材質には、カーボンブラック、グラファイト、チタンブラック、アニリンブラック、若しくは、Ｒｕ、Ｍｎ、Ｎｉ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ又はＣｕの酸化物、Ｓｉ、Ｔｉ、Ｔａ、Ｚｒ又はＣｒの炭化物などの黒色物質を配合することができる。カバー２０の材質に、このような黒色物質が配合されることにより、樹脂等の有する自発蛍光をさらに抑制することができる。さらに、後述するウェル１６をマイクロ流体チップ１００の外部から観察するような用途にマイクロ流体チップ１００を用いる場合には、必要に応じて、カバー２０の材質を透明なものとすることができる。カバー２０は、例えば、フィルム成形、シート成形、射出成形、プレス成形などの方法によって、成形、加工することができる。
【００４４】
カバー２０は、一方の表面２０ａが基板１０に向かうように敷設される。すなわち、表面２０ａが基板１０の第１面１１に面するように設けられる。カバー２０の表面２０ａは、接着性を有してもよい。表面２０ａが接着性を有する場合には、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加されるときに、表面２０ａと第１面１１とが剥離できる程度の接着力とすることが好ましい。ただし、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力を印加し終えた後はこの限りではなく、表面２０ａと第１面１１とが離れにくいように接着（固着）する程度の接着力を有してもよい。
【００４５】
カバー２０の表面２０ａは、接着力を有さなくてもよい。このような場合には、第１面１１に表面２０ａを固着させるために、接着剤を利用することや、熱融着を行うことができる。また、表面２０ａは、カバー２０を基板１０に対して加圧しない状態では接着力を発揮せずに、加圧により接着力を発揮する性質を有してもよい。このような表面２０ａとしては、多孔質となっているものを例示することができる。このような方法であれば、加圧させるだけなので、固着させる際に熱が発生することがなく、マイクロ流体チップ１００の温度の上昇を抑制することができ、液体等に与える熱の影響を抑制することができる。このような表面２０ａを有するカバー２０の具体例としては、商品名：LightCycler 480 Sealing Foil・型名：04 729 757 001・ロシュ・ダイアグノスティクス社製、商品名：ポリオレフィン マイクロプレートシーリングテープ・型名：9793・３Ｍ社製、商品名：アンプリフィケーションテープ96・型名：232702・Nunc社製などを例示することができる。
【００４６】
さらに、表面２０ａは、潜在的な接着力を有してもよい。すなわち、表面２０ａは、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加される前までは接着力を有さず、慣性力が印加された後の所望の時点で、エネルギー線（例えば、紫外線、電子線など）を照射することによって接着力を発揮できるものであってもよい。
【００４７】
また、表面２０ａと基板１０の第１面１１とを固着させる方法としては、超音波溶着法を利用してもよい。例えば、固着させたい領域の形状に対応する形状の治具をカバー２０の基板１０に対して固着させたい部分に押しつけて超音波振動させ、カバー２０と基板１０とを溶着（固着）させてもよい。このようにすれば、基板１０とカバー２０とを超音波照射によって溶着（固着）させるため、試料に対する加熱を抑えることができ、試料に与えるダメージを少なくすることができる。例えば、ウェル１６に含まれる試薬の活性を低下させることも抑制できる。さらに、固着領域２１を超音波溶着法によって形成した場合は、溶着による基板１０とカバー２０との接合力は、例えば加圧による方法などと比較して比較的強いため、ウェル領域１４からの液体の漏れをより確実に防止することができる。
【００４８】
カバー２０は、基板１０と固着された固着領域２１を有する。固着領域２１は、平面視において、基板１０のリザーバー領域１３及びウェル領域１４を囲むように配置される。すなわち、平面的に見て、固着領域２１の内側に、リザーバー領域１３及びウェル領域１４が配置される。固着領域２１は、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加されても、敷設されたカバー２０と基板１０とが剥離しにくい領域である。敷設されているカバー２０の固着領域２１以外の領域は、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加されると、表面２０ａと第１面１１とが剥離することができる。固着領域２１では、カバー２０の表面２０ａの性質に合わせて、例えば、カバー２０と基板１０とが溶着されてもよく、粘着剤、接着剤等で接着されてもよい。
【００４９】
固着領域２１の機能の一つとしては、マイクロ流体チップ１００に遠心力等の慣性力が印加されてカバー２０と基板１０との間に間隙が形成されるときに、当該間隙を内部に形成する袋（ポケット）状の構造を形成させることが挙げられる。これにより、基板１０とカバー２０との間で、リザーバー領域１３及びウェル領域１４を基板１０の第１面１１側で連通させるとともに、液体を両領域の間で流通させることができる。
【００５０】
既に述べたが、慣性力は、リザーバー領域１３側からウェル領域１４側へ向かうようにマイクロ流体チップ１００に印加される。そのため、固着領域２１は、少なくともウェル領域１４を囲む位置では連続して設けられる。したがって、カバー２０と基板１０との間の間隙に液体が導入された際に、慣性力により、液体が固着領域２１の外側に、ウェル領域１４側から漏れ出さないようになっている。また、固着領域２１は、平面視において、基板１０のリザーバー領域１３及びウェル領域１４の両者を取り囲んで環状に連続していることができる。このようにすれば、カバー２０と基板１０との間の間隙に液体が導入された際に、液体が固着領域２１の外側に漏れ出さないようにすることができる。なお、固着領域２１は、リザーバー領域１３側においては、連続していない部分を有することができる。このような部分を有する場合には、当該連続していない部分を、カバー２０と基板１０との間の間隙に内圧が生じた場合の通気孔として機能させることができる。さらに、固着領域２１が平面視において、基板１０のリザーバー領域１３及びウェル領域１４を取り囲んで環状に連続している場合には、カバー２０に、リザーバー領域１３側の適宜な位置に図示せぬ孔を設けることにより、当該孔を、カバー２０と基板１０との間の間隙に内圧が生じた場合の通気孔として機能させることができる。なお、通気孔は、リザーバー１５及びウェル１６に導入される液体の漏れが生じない位置及び大きさで設けることが好ましい。
【００５１】
固着領域２１を形成するには、例えば、基板１０の第１面１１に、接着剤を固着領域２１の形状に塗布して、カバー２０を敷設することによって、固着領域２１を形成することができる。また、例えば、カバー２０の表面２０ａがカバー２０を基板１０に対して加圧しない状態では接着力を発揮せずに、加圧により接着力を発揮する性質を有する場合には、固着領域２１の形状に対応する治具等を用意して、当該治具によって、カバー２０を基板１０に対して加圧力を印加して、固着領域２１を形成することができる。また、例えば、固着領域２１の形状に対応する形状の治具を用いた超音波溶着によって、固着領域２１を形成することもできる。
【００５２】
１−１−４．リザーバー
基板１０のリザーバー領域１３には、第１面１１に開口を有するリザーバー１５が形成される。リザーバー１５は、リザーバー領域１３内に複数形成されてもよい。リザーバー１５の平面的に見た形状は、円形、矩形等とすることができる。リザーバー１５は、第１面１１側及び第２面１２側の双方向に被検液（測定対象となる検体を含む液体）を流通させることができる貫通孔として形成されていてもよい。この場合、被検液を第２面１２側からリザーバー１５へ導入することができる。
【００５３】
１−１−５．ウェル
基板１０のウェル領域１４には、基板１０の第１面１１側に開口１６ａを有するウェル１６が形成される（図１ないし図４参照）。図５は、マイクロ流体チップ１００のウェル１６近傍の断面を拡大して示す模式図である。
【００５４】
ウェル１６は、ウェル領域１４に複数形成されている。ウェル１６は、基板１０の第１面１１側に開口１６ａを有した容器状の形状を有する。ウェル１６は、内部に被検液を保持することができる。また、ウェル１６内において、被検液の反応を行うことができる。すなわち、ウェル１６は、反応容器としての機能を果たす。
【００５５】
ウェル１６の形状は、容器状であれば、特に限定されず、多様な形態を採ることができる。例えば、ウェル１６の形状は、円柱、角柱、円錐台及び角錐台、これらが傾いたような形状、並びにこれらを組み合わせた形状のいずれでもよい。本実施形態ではウェル１６の形状として、図１ないし図５に示すような円柱状（平面視において円形であって、断面視において矩形である形状）の形状を有する場合について説明する。
【００５６】
ウェル１６の開口１６ａは、カバー２０によって塞がれることができる。これにより、ウェル１６は、独立した密閉容器となることができる。このようにウェル１６を独立して密閉することにより、他のウェル１６の内容物との混合やコンタミネーションを抑制することができる。ウェル１６は、カバー２０がウェル１６の開口１６ａの周囲に敷設されて固着されると、独立した密閉容器となることができる。
【００５７】
ウェル１６内には、予め、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用するための試薬が配置されている。配置される試薬の状態は、固体あるいは液体であることが好ましい。図５に示す例では、マイクロ流体チップ１００に設けられた複数のウェル１６のうち、ウェル１６０には試薬３０、ウェル１６１には試薬３１、ウェル１６２には試薬３２が配置されている。
【００５８】
試薬３０，３１，３２として、乾燥等に対して安定性の高いものを用いる場合には、ウェル１６内で乾燥されてもよく、図５に示すように、例えば、ウェル１６の内壁面に塗布されて乾燥された状態で配置されてもよい。このように試薬３０，３１，３２をウェル１６の内壁面に塗布する方法としては、例えば、インクジェット方式の印刷に用いられる液体噴射ヘッド等により、試薬３０，３１，３２を塗布する方法が挙げられる。
【００５９】
ウェル１６内において試薬３０，３１，３２が配置される位置は、特に限定されないが、開口１６ａから遠い位置であるほど、試薬３０，３１，３２が、導入された液体とともにウェル１６の外に流出する可能性が小さくなる点でより好ましい。
【００６０】
ウェル１６（反応容器）に含まれる試薬３０，３１，３２は、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸と、標的核酸及び内部標準核酸に共通のプライマーと、標的核酸及び内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、標的核酸の増幅産物に結合した場合と内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含んでいる。
【００６１】
また、ウェル１６（反応容器）のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なっている。例えば、図５に示されている試薬３０及び試薬３１が互いに異なる場合、これらの試薬を含むウェル１６０及びウェル１６１が、それぞれ第１の反応容器及び第２の反応容器に対応する。なお、この説明は、他の任意の２つのウェル（反応容器）についても成立する。これにより、１つのマイクロ流体チップ１００で複数種類の遺伝子の発現を判定できる。
【００６２】
また、ウェル１６（反応容器）ごとにプライマー及び蛍光プローブの種類が異なる場合には、ウェル１６（反応容器）ごとに異なる遺伝子が増幅されるので、例えばクロスコンタミネーションのような、他の遺伝子の影響を抑制することができる。
【００６３】
さらに、マイクロ流体チップ１００が、同じ種類のプライマー及び蛍光プローブを含む複数のウェル１６（反応容器）を含む場合、当該複数のウェル１６（反応容器）に含まれる内部標準核酸の量が互いに異なってもよい。これにより、１種類の遺伝子について、１つのマイクロ流体チップ１００で多条件の遺伝子発現状態との比較が簡単にできる。
【００６４】
また、試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を反応容器１６に導入した場合に、反応容器１６に導入される反応液に含まれる標的核酸の量である参照量と同じである。例えば、内部標準核酸のコピー数が、参照検体の反応液を反応容器１６に導入した場合に、反応容器１６に導入される標的核酸のコピー数と同じであってもよい。また例えば、内部標準核酸の反応容器１６の体積当たりのモル濃度が、参照検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じであってもよい。参照検体の反応液は、例えば、参照検体に含まれるｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを含む液体であってもよい。
【００６５】
ここで「同じ」の範囲は、完全同一のみならず、要求される判定精度を満たせる程度の誤差を含んだ範囲内であればよい。例えば、反応容器内１６の内部標準核酸の量で決まる１本の検量線で定量可能な範囲内としてもよい。
【００６６】
参照検体は、遺伝子が所定量発現したか否かの判定の目的に応じて選択される検体であり、例えば、遺伝子が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である。参照検体を基準としたときの標的核酸の測定値は、参照すべき状態からの差異を直接的に表現しているため、参照量との差異を絶対量として知ることができるという特徴がある。また、このため、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた結果と比較しやすいという特徴がある。
【００６７】
このような参照検体としては、例えば、健康な個体から採取した検体を代表する検体及び病気の個体から採取した検体を代表する検体の少なくとも一方であってもよい。健康な個体から採取した検体を代表する検体は、健康な１つの個体から採取した検体であってもよいし、健康な複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。同様に、病気の個体から採取した検体を代表する検体は、病気の１つの個体から採取した検体であってもよいし、病気の複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。なお、上述の「個体」は、ヒトであっても、ヒト以外の動物や植物であってもよい。
【００６８】
このような参照検体を選択して、試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量を設定すること、すなわち、参照量を、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量の少なくとも一方と同じにすることにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体の少なくとも一方における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００６９】
このように、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００によれば、反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なるため、複数種類の遺伝子が所定量発現したか否かの判定が簡単にできるマイクロ流体チップを実現できる。
【００７０】
また、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００によれば、内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を反応容器に導入した場合に、反応容器に導入される標的核酸の量と同じであるため、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できるマイクロ流体チップを実現できる。
【００７１】
ＰＣＲの原理においては、２つのプライマーＤＮＡ（フォワードプライマー及びリバースプライマー）を用いて目的の核酸を増幅する。そのため第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００にＰＣＲの原理を適用することで、１種類のプローブＤＮＡを使用するＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）に比べて特異性が高く、測定の信頼性が高いものとなる。また、ＰＣＲによる核酸増幅を行うので、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）では不可能だった低発現の遺伝子についても定量することができる。
【００７２】
また、遺伝子の発現量を定量する方法として、共通のプライマーで増幅できる既知量の内部標準核酸を添加し、共増幅する競合ＰＣＲ法がある。競合ＰＣＲ法は、標的核酸に由来する増幅産物量と、内部標準核酸に由来する増幅産物量とを比較することにより、標的核酸を定量する方法である。
【００７３】
競合ＰＣＲ法の原理を用いると、標的核酸と内部標準核酸とは、蛍光プローブによる蛍光反応以外は同じ性質とみなせるので、両核酸の増幅速度は等しいとみなせる。したがって、標的核酸と内部標準核酸を１つの反応容器で共増幅させた場合の増幅産物の比率は、増幅前の両者の比率を反映する。そのため、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を使って競合ＰＣＲ法の原理を用いると、既知量の内部標準核酸を用いることにより、定量可能な範囲（標的核酸の量と内部標準核酸の量が近い範囲；１本の検量線で定量できる範囲）においては定量精度が高く、複数の検量線を引くなどの煩雑な作業を要することなく絶対定量も可能になる。これにより、低コストで、遺伝子の発現量を絶対定量することができる。
【００７４】
また、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を用いた反応は、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）のような固体表面での反応ではなく、ウェル１６内での均質な液体の中の反応であるため、反応の効率と精度が高いものとなる。さらに、１つのウェル１６内では１種類の増幅反応が行われるため、クロスハイブリダイゼーションによる定量精度の低下が起こらない。
【００７５】
１−２．第２実施形態に係るマイクロ流体チップの構成
図６（Ａ）は、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａを模式的に示す平面図である。また、マイクロ流体チップ１００ａのウェル１６近傍の断面を拡大した様子は、図５と同様である。第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａは、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と比べて、ウェル１６（反応容器）内に配置されている試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量の基準となる参照検体が異なる。したがって、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と同様の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００７６】
第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａは、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）と、参照量が、参照検体を、病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）と、を含んでいる。
【００７７】
図６（Ａ）に示す例では、マイクロ流体チップ１００ａの基板１０には、平面視において、健康領域４１と病気領域４２とが設けられている。健康領域４１に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）であり、病気領域４２に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）である。
【００７８】
病気が進行し、遺伝子の発現量が健康な場合の発現量から変化したときには、発現量は正常な状態とは大きく異なるため、発現量が健康な状態及び病気の状態のいずれの状態に近いかについて、競合ＰＣＲ法の原理を用いて判定する場合の判定精度が低下する可能性がある。そのため、病気の状態で現れる遺伝子の発現状態を調べたデータベースに基づいて、内部標準核酸の量を新たに病気の状態を代表する値に設定することにより、判定精度を保つことができる。
【００７９】
なお、発現量が健康な状態及び病気の状態のいずれの状態に近いかについての判定精度を高める観点からは、参照検体となる各状態の検体を代表する検体は、１つの個体から採取した検体よりも、複数の検体から採取した個体から統計的手法により導出された仮想的な検体とすることが好ましい。
【００８０】
このように、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａによれば、参照量が、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）と、参照量が、参照検体を、病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）と、を含んでいることにより、１つのマイクロ流体チップで、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００８１】
１−３．第３実施形態に係るマイクロ流体チップの構成
図６（Ｂ）は、第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂを模式的に示す平面図である。また、マイクロ流体チップ１００ａのウェル１６近傍の断面を拡大した様子は、図５と同様である。第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂは、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と比べて、ウェル１６（反応容器）内に配置されている試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量の基準となる参照検体が異なる。したがって、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と同様の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【００８２】
第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂは、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）と、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）と、を含んでいる。
【００８３】
図６（Ｂ）に示す例では、マイクロ流体チップ１００ａの基板１０には、平面視において、第１進行状態領域５１と第２進行状態領域５２とが設けられている。第１進行状態領域５１に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）であり、第２進行状態領域５２に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）である。
【００８４】
病気の進行やタイプによって、遺伝子に様々な発現状態が予測される場合には、内部標準核酸の量を複数設定しておくことにより、標的核酸の定量精度を保つことができる。
【００８５】
なお、複数存在する病気の進行状態のうち、任意に選択した２つの進行状態が、それぞれ病気の第１進行状態、病気の第２進行状態に対応する。また、病気の第１進行状態の検体を代表する検体は、病気の第１進行状態の１つの個体から採取した検体であってもよいし、病気の第１進行状態の複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。同様に、病気の第２進行状態の検体を代表する検体は、病気の第２進行状態の１つの個体から採取した検体であってもよいし、病気の第２進行状態の複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。なお、発現量が病気のいずれの進行状態に近いかについての判定精度を高める観点からは、各状態の検体を代表する検体は、１つの個体から採取した検体よりも、複数の検体から採取した個体から統計的手法により導出された仮想的な検体とすることが好ましい。
【００８６】
このように、第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂによれば、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１の反応容器）と、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２の反応容器）と、を含んでいることにより、１つのマイクロ流体チップで、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【００８７】
１−４．変形例
上述した第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａ及び第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂにおいては、ウェル１６（反応容器）ごとに、ウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量の少なくとも一方が異なっている例について説明したが、ウェル１６（反応容器）が、複数のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群を構成し、反応容器群のうち、第１の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）と第２の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量の少なくとも一方が互いに異なっていてもよい。換言すれば、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量が同一であってもよい。
【００８８】
図７（Ａ）〜図７（Ｃ）は、変形例に係るマイクロ流体チップ１０１，１０１ａ，１０１ｂを模式的に示す平面図である。図７（Ａ）に示すマイクロ流体チップ１０１は、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００の変形例、図７（Ｂ）に示すマイクロ流体チップ１０１ｂは、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａの変形例、図７（Ｃ）に示すマイクロ流体チップ１０１ｂは、第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂの変形例である。
【００８９】
図７（Ａ）に示す例では、ウェル１６（反応容器）が、それぞれ１０個のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群６１，６２，６３，６４及び６５を構成している。例えば、図７（Ａ）に示されている反応容器群６１に属するウェル１６（反応容器）と反応容器群６２に属するウェル１６（反応容器）とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量の少なくとも一方が互いに異なる場合、反応容器群６１及び反応容器群６２が、それぞれ第１の反応容器群及び第２の反応容器群に対応する。なお、この説明は、他の任意の２つの反応容器群についても成立する。
【００９０】
図７（Ａ）に示す例では、反応容器群６１，６２，６３，６４及び６５ごとに、反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている。換言すれば、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量は、同一となっている。
【００９１】
図７（Ｂ）に示す例では、ウェル１６（反応容器）が、それぞれ５個のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群６１１，６１２，６１３，６１４，６１５，６２１，６２２，６２３，６２４及び６２５を構成している。このうち、反応容器群６１１，６１２，６１３，６１４及び６１５は、健康領域４１に配置され、反応容器群６２１，６２２，６２３，６２４及び６２５は、病気領域４２に配置されている。すなわち、反応容器群６１１，６１２，６１３，６１４及び６１５に属するウェル１６（反応容器）と反応容器群６２１，６２２，６２３，６２４及び６２５に属するウェル１６（反応容器）とに含まれる内部標準核酸の量は、互いに異なっている。また、図７（Ｂ）に示す例では、反応容器群６１１，６１２，６１３，６１４及び６１５ごとに反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっており、さらに、反応容器群６２１，６２２，６２３，６２４及び６２５ごとに反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている。図７（Ｂ）に示す例においても、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量は、同一となっている。
【００９２】
図７（Ｃ）に示す例では、ウェル１６（反応容器）が、それぞれ５個のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群６３１，６３２，６３３，６３４，６３５，６４１，６４２，６４３，６４４及び６４５を構成している。このうち、反応容器群６３１，６３２，６３３，６３４及び６３５は、第１進行状態領域５１に配置され、反応容器群６４１，６４２，６４３，６４４及び６４５は、第２進行状態領域５２に配置されている。すなわち、反応容器群６３１，６３２，６３３，６３４及び６３５に属するウェル１６（反応容器）と反応容器群６４１，６４２，６４３，６４４及び６４５に属するウェル１６（反応容器）とに含まれる内部標準核酸の量は、互いに異なっている。また、図７（Ｃ）に示す例では、反応容器群６３１，６３２，６３３，６３４及び６３５ごとに反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっており、さらに、反応容器群６４１，６４２，６４３，６４４及び６４５ごとに反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている。図７（Ｃ）に示す例においても、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量は、同一となっている。
【００９３】
このように、反応容器群ごとに、同一条件のウェル１６（反応容器）を複数含むことにより、ウェル１６（反応容器）ごとの誤差が判定結果に反映されにくくなり、判定の信頼性が向上する。また、誤って１つのウェル１６（反応容器）に気泡や異物が混入した場合にも、同一の反応容器群に属する他のウェル１６（反応容器）の結果を用いて判定を行うことができる。
【００９４】
また、反応容器群ごとに、ウェル１６に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量の少なくとも一方が異なっていることにより、１つのマイクロ流体チップで、複数種類の遺伝子、又は複数条件を対象として、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かをさらに高感度、高精度に判定できるマイクロ流体チップを実現できる。
【００９５】
１−５．被検液の充填方法
次に、被検液をウェル１６（反応容器）に充填する方法について、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を例にとり説明する。なお、第２実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ａ及び第３実施形態に係るマイクロ流体チップ１００ｂ、並びに変形例に係るマイクロ流体チップ１０１，１０１ａ及び１０１ｂについても、同様の方法により被検液をウェル１６（反応容器）に充填することができる。
【００９６】
以下の例では、カバー２０の表面２０ａが、カバー２０を基板１０に対して加圧しない状態では接着力を発揮せずに、加圧により接着力を発揮する性質を有しているものとする。また、以下の例では、カバー２０の固着領域２１は、平面視において、基板１０のリザーバー領域１３及びウェル領域１４の両者を取り囲んで環状に連続しているものとする。また、以下の例では、カバー２０は、透明な材質で形成されているものとする。なお、この例では、ウェル１６の形状は円柱形であって、底面の直径がおよそ１ｍｍ、深さがおよそ０．５ｍｍであるものを例示する。さらに、この例では、基板１０及びカバー２０の平面的に見た外形形状は、長方形であって、長辺が約７．５ｃｍ、短辺が約２．５ｃｍであるものを例示する。
【００９７】
まず、標的核酸を含む被検液８０を調製する。被検液８０において、測定対象となる標的核酸としては、例えば、血液、尿、唾液、髄液等の生体試料から抽出されたＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡ等が挙げられる。より具体的には、例えば、前述した生体試料に含まれる細胞から抽出されたｍＲＮＡから逆転写したｃＤＮＡが挙げられる。被検液８０の量は、ウェル１６の全体の容積に応じて適宜決定されるが、例えば複数のウェル１６の総容積と同じか又は前記総容積より多いことが好ましく、複数のウェル１６により確実に被検液８０を充填できる点で、複数のウェル１６の総容積より多いことがより好ましい。
【００９８】
次に、マイクロ流体チップ１００のリザーバー１５に被検液８０を導入する。例えば、カバー２０を装着する前に被検液８０を導入してもよいし、カバー２０のリザーバー１５に対応する領域に孔を形成したマイクロ流体チップ１００にあっては、カバー２０が装着された後に、該孔から被検液８０を導入してもよい。さらに、リザーバー１５に対応する領域の少なくとも一部についてカバー２０を剥離して被検液８０を導入してもよい。なお、この時点では、マイクロ流体チップ１００のウェル１６内には、被検液８０は導入されていない。
【００９９】
次に、マイクロ流体チップ１００に、リザーバー領域１３側からウェル領域１４側に向かう慣性力を作用させる。図８は、マイクロ流体チップ１００のリザーバー１５に被検液８０を導入した状態で、慣性力を印加した様子を模式的に示す図である。
【０１００】
本実施形態では、慣性力は遠心機によって発生される。遠心機の回転軸Ｒは、マイクロ流体チップ１００のリザーバー領域１３から見て、ウェル領域１４と反対側に配置される。遠心機を運転して、マイクロ流体チップ１００に慣性力（遠心力）が発生すると、図８に示すように、リザーバー１５の中の被検液８０が、回転軸Ｒから遠ざかる方向、すなわちウェル領域１４に向かう方向に加速度Ｇ（図中矢印）を受ける。そして加速度を受けている状態では、基板１０とカバー２０との間に間隙が生じ、被検液８０は、ウェル領域１４に向かって該間隙内を移送される。なお、このときの間隙の大きさ（厚み）は、特に制限はないが、図８では、間隙の大きさが非常に小さい例を示している。そして、基板１０のウェル領域１４に形成されたウェル１６の開口１６ａから、慣性力でウェル１６内の空気と入れ替わることによって被検液８０がウェル１６に導入される。ウェル１６に導入された被検液８０は、ウェル１６内に予め配置された試薬３０等と混合される。
【０１０１】
なお、図８に示す例では、遠心機の回転軸Ｒに対して、垂直な方向に沿ってマイクロ流体チップ１００の平面（例えば基板１０の第１面１１）が配置されて回転されている様子を示しているが、マイクロ流体チップ１００の遠心機の回転軸Ｒに対する配置は、容器２００の内部の被検液８０が、遠心力によって、リザーバー１５からウェル１６へ向かうことができる範囲で任意である。このような配置は、リザーバー１５の形状や、基板１０のウェル１６の配置などによって、適宜に設定することができる。
【０１０２】
次に、遠心機を停止し、慣性力の印加を止める。この状態では、被検液８０がウェル１６内に充填されている。また、例えば、被検液８０の体積が、ウェル１６の合計の容積よりも大きい場合などには、被検液８０は、ウェル１６内、並びに、基板１０及びカバー２０の間の間隙に存在している。いずれの場合であっても、カバー２０の外側から、ローラー、スキージ、ブレード等の治具によって、カバー２０を基板１０に押さえつけることによって、カバー２０をマイクロ流体チップ１００に密着させてウェル１６を密閉することができ、ウェル１６内に被検液８０を封入することができる。すなわち、被検液８０が基板１０及びカバー２０の間の間隙に存在していない状態では、カバー２０を基板１０に押さえつけることによって、ウェル１６が密閉され、被検液８０が基板１０及びカバー２０の間の間隙に存在している状態では、余分の被検液８０をリザーバー領域１３側に押し戻しつつ、ウェル１６が密閉されることができる。これにより、基板１０とカバー２０とが接する面は、すべて接着されることができる。また、標的核酸が所定量発現したか否かの判定結果に影響を及ぼさない程度の容量精度で、ウェル１６内に被検液８０を封入することができる。
【０１０３】
図９は、ローラー９０によって、マイクロ流体チップ１００のウェル１６を密閉する様子を模式的に示した図である。図９に示す例では、カバー２０の表面を、マイクロ流体チップ１００を基準とした相対的な位置においてリザーバー１５から遠い側から近い側へ（図９における白抜き矢印方向へ）と移動するローラー９０によって、基板１０及びカバー２０の間の間隙に存在する過剰の被検液８０をリザーバー１５から容器２００に戻しつつ、ウェル１６を密閉する様子を示している。
【０１０４】
このようにして、マイクロ流体チップ１００のウェル１６内に、正確な容量の被検液８０を導入することができる。マイクロ流体チップ１００に複数のウェル１６が形成されている場合も同様であり、該複数のウェル１６は、上記操作の結果、それぞれ独立した密閉空間となり、所望の量の被検液８０を精密に分注することができる。これにより、ピペットでは困難な微小量の被検液８０であっても、正確かつ簡単にウェル１６に分注することができる。これにより、分注作業に費やす時間とコストを抑制することができる。
【０１０５】
なお、ウェル１６に被検液８０を導入した後に標的核酸を分析する方法については、「４．核酸の分析方法」の項で説明する。
【０１０６】
２．第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット
図１０は、第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット２００を模式的に示す平面図である。第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット２００は、マイクロ流体チップ１００ｃとマイクロ流体チップ１００ｄを含んでいる。マイクロ流体チップ１００ｃ及びマイクロ流体チップ１００ｄのウェル１６近傍の断面を拡大した様子は、ともに図５と同様である。マイクロ流体チップ１００ｃ及びマイクロ流体チップ１００ｄは、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と比べて、ウェル１６（反応容器）内に配置されている試薬３０，３１，３２に含まれる内部標準核酸の量の基準となる参照検体が異なる。したがって、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と同様の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【０１０７】
マイクロ流体チップ１００ｃは、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）を含むマイクロ流体チップである。図１０に示すように、マイクロ流体チップ１００ｃの基板１０には、平面視において、第１進行状態領域５１が設けられている。第１進行状態領域５１に配置されているウェル１６は、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）である。
【０１０８】
マイクロ流体チップ１００ｄは、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）を含むマイクロ流体チップである。図１０に示すように、マイクロ流体チップ１００ｄの基板１０には、平面視において、第２進行状態領域５２が設けられている。第２進行状態領域５２に配置されているウェル１６は、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）である。
【０１０９】
このように、第４実施形態に係るマイクロ流体チップセット２００は、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第１条件の反応容器）を含むマイクロ流体チップ１００ｃと、複数の反応容器の少なくとも一部として、参照量が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量であるウェル１６（第２条件の反応容器）を含むマイクロ流体チップ１００ｄと、を含むことにより、判定の基準となる参照量を容易に選択できるマイクロ流体チップセットを実現できる。
【０１１０】
なお、マイクロ流体チップ１００ｃ及びマイクロ流体チップ１００ｄにおいても、「１−４．被検液の充填方法」の項で説明した方法により被検液を充填することができる。したがって、ピペットでは困難な微小量の被検液であっても、正確かつ簡単にウェル１６に分注することができる。
【０１１１】
また、ウェル１６に被検液を導入した後に標的核酸を分析する方法については、「４．核酸の分析方法」の項で説明する。
【０１１２】
３．核酸分析キット
３−１．第５実施形態に係る核酸分析キット
図１１は、第５実施形態に係る核酸分析キット３００を模式的に示す図である。第５実施形態に係る核酸分析キット３００は、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用する核酸分析キットであって、マイクロ流体チップ１００ｅと、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸を含む液体である内部標準試薬１１０と、を含む。図１１に示す例では、内部標準試薬１１０は、蓋付き容器１５０に収容されている液体である。また、マイクロ流体チップ１００ｅは、複数のウェル１６（反応容器）を含んでいる。
【０１１３】
図１１には、マイクロ流体チップ１００ｅを模式的に示す平面図が表されている。また、マイクロ流体チップ１００ｅのウェル１６近傍の断面を拡大した様子は、図５と同様であり、再び参照して説明する。マイクロ流体チップ１００ｅは、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と比べて、ウェル１６（反応容器）内に配置されている試薬３０，３１，３２が異なる。したがって、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００と同様の構成には同一の符号を付し、詳細な説明を省略する。
【０１１４】
マイクロ流体チップ１００ｅのウェル１６に配置されている試薬３０，３１，３２は、標的核酸及び内部標準核酸に共通のプライマーと、標的核酸及び内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、標的核酸の増幅産物に結合した場合と内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、を含んでいる。
【０１１５】
また、ウェル１６（反応容器）のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なっている。例えば、図５に示されている試薬３０及び試薬３１が互いに異なる場合、これらの試薬を含むウェル１６０及びウェル１６１が、それぞれ第１の反応容器及び第２の反応容器に対応する。なお、この説明は、他の任意の２つのウェルについても成立する。これにより、１つのマイクロ流体チップ１００ｅで複数種類の遺伝子の発現を判定できる。
【０１１６】
また、ウェル１６（反応容器）ごとにプライマー及び蛍光プローブの種類が異なる場合には、ウェル１６（反応容器）ごとに異なる遺伝子が増幅されるので、例えばクロスコンタミネーションのような、他の遺伝子の影響を抑制することができる。
【０１１７】
また、内部標準試薬１１０に含まれる内部標準核酸のモル濃度は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる標的核酸のモル濃度である参照モル濃度と同じである。
【０１１８】
ここで「同じ」の範囲は、完全同一のみならず、要求される判定精度を満たせる程度の誤差を含んだ範囲内であればよい。また、ユーザー自身がマニュアル等の指示に従って、予め定められた割合で内部標準試薬１１０を希釈したり、予め定められた割合で内部標準試薬１１０と被検液とを混合したりすることにより、内部標準試薬１１０がウェル１６（反応容器）に導入された時点で、内部標準核酸のモル濃度が参照モル濃度と同じになるように調整されてもよい。これにより、参照モル濃度が容易に選択できるようになる。また、参照モル濃度の選択自由度が大きくなる。
【０１１９】
参照検体は、遺伝子が所定量発現したか否かの判定の目的に応じて選択される検体であり、例えば、遺伝子が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である。参照検体を基準としたときの標的核酸の測定値は、参照すべき状態からの差異を直接的に表現しているため、参照モル濃度との差異を絶対量として知ることができるという特徴がある。また、このため、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）を用いた結果と比較しやすいという特徴がある。
【０１２０】
このような参照検体としては、例えば、健康な個体から採取した検体を代表する検体及び病気の個体から採取した検体を代表する検体の少なくとも一方であってもよい。健康な個体から採取した検体を代表する検体は、健康な１つの個体から採取した検体であってもよいし、健康な複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。同様に、病気の個体から採取した検体を代表する検体は、病気の１つの個体から採取した検体であってもよいし、病気の複数の個体から採取した検体から統計的手法により導出された仮想的な検体であってもよい。なお、上述の「個体」は、ヒトであっても、ヒト以外の動物や植物であってもよい。
【０１２１】
このような参照検体を選択して、内部標準核酸のモル濃度を設定すること、すなわち、参照モル濃度を、参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度の少なくとも一方と同じにすることにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、健康な個体から採取した検体及び病気の個体から採取した検体の少なくとも一方における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる。
【０１２２】
第５実施形態に係る核酸分析キット３００は、被検液と内部標準試薬１１０とを混合した混合液を調整した後に、当該混合液をウェル１６（反応容器）に導入することにより、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用されることができる。
【０１２３】
このように、第５実施形態に係る核酸分析キット３００によれば、反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は互いに異なるため、複数種類の遺伝子の発現を簡単に精度良く判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１２４】
また、第５実施形態に係る核酸分析キット３００によれば、内部標準核酸のモル濃度は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じであるため、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１２５】
なお、マイクロ流体チップ１００ｅにおいても、被検液と内部標準試薬１１０とを混合した混合液を調整した後に、当該混合液をリザーバー１５に導入し、「１−４．被検液の充填方法」の項で説明した方法により当該混合液をウェル１６（反応容器）に充填することができる。したがって、ピペットでは困難な微小量の当該混合液であっても、正確かつ簡単にウェル１６に分注することができる。
【０１２６】
なお、ウェル１６に被検液と内部標準試薬１１０とを混合した混合液を導入した後に標的核酸を分析する方法については、「４．核酸の分析方法」の項で説明する。
【０１２７】
３−２．第６実施形態に係る核酸分析キット
図１２は、第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａを模式的に示す図である。第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａは、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用する核酸分析キットであって、マイクロ流体チップ１００ｅと、標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸を含む液体である内部標準試薬として、第１の内部標準試薬１１１及び第２の内部標準試薬１１２とを含む。図１２に示す例では、第１の内部標準試薬１１１及び第２の内部標準試薬１１２は、それぞれ蓋付き容器１５１及び蓋付き容器１５２に収容されている液体である。
【０１２８】
第１の内部標準試薬１１１は、参照モル濃度が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である内部標準核酸を含んでいる。すなわち、第１の内部標準試薬１１１に含まれる内部標準核酸のモル濃度は、病気の第２進行状態の個体を代表する検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じである。
【０１２９】
第２の内部標準試薬１１２は、参照モル濃度が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である内部標準核酸を含んでいる。すなわち、第２の内部標準試薬１１２に含まれる内部標準核酸のモル濃度は、病気の第２進行状態の個体を代表する検体に含まれる標的核酸のモル濃度と同じである。
【０１３０】
ここで「同じ」の範囲は、完全同一のみならず、要求される判定精度を満たせる程度の誤差を含んだ範囲内であればよい。また、ユーザー自身がマニュアル等の指示に従って、予め定められた割合で第１の内部標準試薬１１１又は第２の内部標準試薬１１２を希釈したり、予め定められた割合で被検液と第１の内部標準試薬１１１又は第２の内部標準試薬１１２とを混合したりすることにより、第１の内部標準試薬１１１又は第２の内部標準試薬１１２がウェル１６（反応容器）に導入された時点で、内部標準核酸のモル濃度が参照モル濃度と同じになるように調整されてもよい。これにより、参照モル濃度が容易に選択できるようになる。また、参照モル濃度の選択自由度が大きくなる。
【０１３１】
第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａは、第１の内部標準試薬１１１又は第２の内部標準試薬１１２と被検液とを混合した混合液を調整した後に、当該混合液をウェル１６（反応容器）に導入することにより、検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用されることができる。
【０１３２】
このように、第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａは、参照モル濃度が、参照検体を、病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である内部標準核酸を含む第１の内部標準試薬１１１と、参照モル濃度が、参照検体を、病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である内部標準核酸を含む第２の内部標準試薬１１２と、を含むことにより、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１３３】
なお、１つのマイクロ流体チップ１００ｅにおいて、第１の内部標準試薬１１１を用いるウェル１６（反応容器）と第２の内部標準試薬１１２を用いるウェル１６（反応容器）とを使い分けてもよい。これにより、１つのマイクロ流体チップ１００ｅを用いて、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、病気の第１進行状態の個体から採取した検体及び病気の第２進行状態の個体から採取した検体における標的核酸の発現量と同程度か否かを高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１３４】
３−３．変形例に係る核酸分析キット
上述した第５実施形態に係る核酸分析キット３００及び第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａにおいては、ウェル１６（反応容器）ごとに、ウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている例について説明したが、ウェル１６（反応容器）が、複数のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群を構成し、反応容器群のうち、第１の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）と第２の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が互いに異なっていてもよい。換言すれば、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類、並びに、内部標準核酸の量が同一であってもよい。
【０１３５】
図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）は、変形例に係る核酸分析キット３０１及び３０１ａを模式的に示す図である。図１３（Ａ）に示す核酸分析キット３０１は、第５実施形態に係る核酸分析キット３００の変形例、図１３（Ｂ）に示す核酸分析キット３０１ａは、第６実施形態に係る核酸分析キット３００ａの変形例である。
【０１３６】
図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）に示す例では、ウェル１６（反応容器）が、それぞれ１０個のウェル１６（反応容器）を含む反応容器群６１，６２，６３，６４及び６５を構成している。例えば、図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）に示されている反応容器群６１に属するウェル１６（反応容器）と反応容器群６２に属するウェル１６（反応容器）とに含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が互いに異なる場合、反応容器群６１及び反応容器群６２が、それぞれ第１の反応容器群及び第２の反応容器群に対応する。なお、この説明は、他の任意の２つの反応容器群についても成立する。
【０１３７】
図１３（Ａ）及び図１３（Ｂ）に示す例では、反応容器群６１，６２，６３，６４及び６５ごとに、反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっている。換言すれば、同一の反応容器群に属するウェル１６（反応容器）に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類は、同一となっている。
【０１３８】
このように、反応容器群ごとに、同一条件のウェル１６（反応容器）を複数含むことにより、ウェル１６（反応容器）ごとの誤差が判定結果に反映されにくくなり、判定の信頼性が向上する。また、誤って１つのウェル１６（反応容器）に気泡や異物が混入した場合にも、同一の反応容器群に属する他のウェル１６（反応容器）の結果を用いて判定を行うことができる。
【０１３９】
また、反応容器群ごとに、ウェル１６に含まれるプライマー及び蛍光プローブの種類が異なっていることにより、１つのマイクロ流体チップで、複数種類の遺伝子を対象として、測定対象となる検体における標的核酸の発現量が、基準となる参照検体における標的核酸の発現量と同程度か否かをさらに高感度、高精度に判定できる核酸分析キットを実現できる。
【０１４０】
４．核酸の分析方法
次に、第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００を用いた核酸の分析方法の一例について説明する。以下では、ウェル１６（反応容器）内に被検液が導入された後の工程について説明する。なお、上述した他の実施形態に係るマイクロ流体チップ、マイクロ流体チップセット及び核酸分析キットを用いた場合にも、同様の方法により核酸を分析することができる。
【０１４１】
以下に説明する核酸の分析方法では、検体に含まれるｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを含む被検液を調整する工程と、複数のウェル１６（反応容器）内で核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ）を行う工程と、各々のウェル１６（反応容器）内において、増幅された核酸の一部に結合した蛍光プローブが発する蛍光強度を測定する工程と、各々のウェル１６（反応容器）内で測定された蛍光強度及び各々のウェル１６（反応容器）内に配置された（又は導入された）内部標準核酸の量に基づいて、被検液に含まれる標的核酸の量を推定することにより検体に含まれるｍＲＮＡの量を推定する工程と、を含む。
【０１４２】
第１実施形態に係るマイクロ流体チップ１００のウェル１６（反応容器）内には、試薬３０，３１，３２として、既知量の内部標準核酸、プライマー及び蛍光プローブが配置されている。よって、ウェル１６（反応容器）内で核酸増幅反応を行う工程では、ウェル１６（反応容器）内に予め配置された内部標準核酸と、ウェル１６（反応容器）に導入された被検液に含まれる標的核酸とがともにウェル１６（反応容器）内で増幅される。
【０１４３】
核酸増幅反応では、例えば、標的核酸及び内部標準核酸の両方に蛍光プローブが結合することができ、さらに、蛍光プローブがどちらか一方と結合した際に蛍光の消光が発生するようにしておくことができる。この状態にて、各々のウェル１６（反応容器）から生じる蛍光強度を測定する。次いで、各々のウェル１６（反応容器）について測定された蛍光強度及び各々のウェル１６（反応容器）内に配置された内部標準核酸の量に基づいて、被検液に含まれる標的核酸の量を推定することができる。そして、推定された標的核酸の量に基づいて、検体に含まれるｍＲＮＡの量を推定することができる。
【０１４４】
各々のウェル１６（反応容器）について測定された蛍光強度と、後述する式（１）を用いて標的核酸の量を推定するために、予めポジティブコントロール及びネガティブコントロールのデータを用意する。
【０１４５】
まず、ポジティブコントロールとして、標的核酸ＴＧＴのみを含むウェルを用意する。このウェルにおいては、核酸増幅反応において得られるすべての増幅産物が標的核酸ＴＧＴを増幅したものであり、この場合の蛍光変化量をＦｔとする。この標的核酸ＴＧＴは、予め用意したものを用いることもできる。
【０１４６】
１つのマイクロ流体チップで複数種類の核酸について分析する場合には、標的核酸の種類ごとにポジティブコントロール用のウェルを用意する。なお、内部標準核酸の量によって、標的核酸の量を変える必要はない。
【０１４７】
次に、ネガティブコントロールとして、内部標準核酸ＣＰＴのみを含むウェルを用意する。このウェルにおいては、すべての増幅産物が内部標準核酸ＣＰＴを増幅したものであり、この場合の蛍光変化量をＦｃとする。
【０１４８】
なお、上述の「標的核酸ＴＧＴのみを含むウェル」及び「内部標準核酸ＣＰＴのみを含むウェル」は、実際に核酸の分析に用いるマイクロ流体チップの一部のウェルであってもよいし、同種である他のマイクロ流体チップのウェルであってもよい。
【０１４９】
ウェル内に標的核酸ＴＧＴ及び内部標準核酸ＣＰＴの両方が存在する場合には、両方の増幅産物ができるため、そのときの蛍光変化量Ｆを以下の式（１）で表すことができる。
【０１５０】
Ｆ＝Ｆｔ・Ｘ／（Ｘ＋Ｃ）＋Ｆｃ・Ｃ／（Ｘ＋Ｃ）
＝〔Ｃ・（Ｆｃ−Ｆｔ）／（Ｘ＋Ｃ）〕＋Ｆｔ ・・・・・（１）
【０１５１】
上記式（１）における蛍光変化量Ｆは、蛍光プローブが発する蛍光強度そのものでもよいし、あるいは、（ｉ）核酸増幅反応の前に測定された蛍光強度と、核酸増幅反応の後に測定された蛍光強度との比（蛍光変化量）、または、（ｉｉ）核酸増幅後に増幅産物及び蛍光プローブが解離する温度まで加熱した状態（核酸増幅反応後において蛍光プローブが増幅された核酸から解離している第１の状態）で測定された蛍光強度と、蛍光プローブが結合している温度（核酸増幅反応後において蛍光プローブが増幅された核酸の一部に結合している第２の状態）で測定された蛍光強度との比（蛍光変化量）であってもよい。
【０１５２】
上記式（１）において、Ｃはウェル１６（反応容器）における内部標準核酸ＣＰＴの量（ウェル１６（反応容器）内のコピー数）、Ｘはウェル１６（反応容器）における標的核酸ＴＧＴの量（ウェル１６（反応容器）内のコピー数）である。
【０１５３】
したがって、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの蛍光輝度から求めたＦｔとＦｃ、及び内部標準核酸の量Ｃを上記式（１）に代入すると、蛍光変化量Ｆから標的核酸の量Ｘを求めることができる。なお、蛍光強度の測定から標的核酸の量（又は検体に含まれるｍＲＮＡの量）を推定するまでの工程を、蛍光検出装置と、これによる蛍光検出結果に基づいて標的核酸の量（又は検体に含まれるｍＲＮＡの量）を推定する演算を行うプログラムとを組み合わせて行うこともできる。
【０１５４】
蛍光プローブは、ＰＣＲによって増幅された標的核酸の一部に結合し、標的核酸と内部標準核酸とを識別して蛍光変化を示すものであればよく、例えば、Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ（登録商標）、Ｈｙｂ ｐｒｏｂｅ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（登録商標）等を用いることができる。Ｑ−Ｐｒｏｂｅは、標識した蛍光色素にグアニン塩基が近づくと、発する蛍光が減少するという「蛍光消光現象」を利用して目的の遺伝子を検出するプローブである。
【０１５５】
Ｑ−Ｐｒｏｂｅは蛍光標識されたシトシンを末端に有し、目的遺伝子に特異的に結合するような配列に設計されており、Ｑ−Ｐｒｏｂｅが目的遺伝子と結合すると、グアニンの影響を受けて蛍光が減少する。この現象を利用して内部標準核酸と標的核酸とを区別するためには、内部標準核酸が、Ｑ−Ｐｒｏｂｅの蛍光標識末端塩基に対応する塩基としてグアニンを有する場合には、標的核酸は、Ｑ−Ｐｒｏｂｅの蛍光標識末端塩基に対応する塩基がグアニン以外の塩基であることが必要である。これにより、Ｑ−Ｐｒｏｂｅが標的核酸及び内部標準核酸をともに共増幅した際、内部標準核酸とＱ−Ｐｒｏｂｅとがハイブリダイズすると、標識蛍光色素の蛍光発光が減少（消光）する一方、標的核酸とＱ−Ｐｒｏｂｅとがハイブリダイズすると、標識蛍光色素の蛍光発光は減少しない。なお、上記の説明については標的核酸と内部標準核酸とを入れ替えても成立する。従って、Ｑ−Ｐｒｏｂｅが標的核酸又は内部標準核酸のどちらと結合した際に蛍光の消光が発生するかを選択することができる。
【０１５６】
このように、上述した核酸の分析方法により、マイクロ流体チップ１００の複数のウェル１６（反応容器）を用いて、１つの検体から多種類の遺伝子についての遺伝子発現量や、複数の発現状態と比較した遺伝子発現量を分析できる。
【０１５７】
また、ウェル１６（反応容器）内での反応が液体中で行われること、及び、核酸増幅反応により増幅した後に発現量を分析することにより、ＤＮＡチップと比べて高い再現性が得られる。
【０１５８】
さらに、核酸増幅反応と蛍光強度の測定結果を演算することで遺伝子の発現量を分析できるため、簡単な装置で分析が実現できる。
【０１５９】
５．実施例
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されない。
【０１６０】
本実施例では、蛍光プローブとしてＱ−Ｐｒｏｂｅ（Kurata et al., Nucleic acids Research, 2001, vol.29, No.6 e34）を用いた場合を例にとり、マイクロ流体チップ１００を用いて競合ＰＣＲ法により検体に含まれるｍＲＮＡを逆転写したｃＤＮＡを標的核酸として定量する方法について説明する。
【０１６１】
Ｑ-Ｐｒｏｂｅは、結合した核酸に含まれるグアニンと相互作用して著しく蛍光が消光する。よって、標的核酸及び内部標準核酸の両方にＱ-Ｐｒｏｂｅが結合できるようにし、さらに、Ｑ-Ｐｒｏｂｅがどちらか一方と結合した際に蛍光の消光が発生するようにしておくことにより、既知の内部標準核酸の量に対する標的核酸の相対量を推定することができる。
【０１６２】
標的核酸及び内部標準核酸はＪ−Ｂｉｏ２１（株）から購入した。本実施例においては、標的核酸として、ヒトβアクチン遺伝子及びヒトアルブミン遺伝子を用いた。また、バッファーとして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ：８．３）と、ＫＣｌ：５０ｍＭ、ＭｇＣｌ２：１．５ｍＭの混合液を使用した。
【０１６３】
図１４は、標的核酸及び内部標準核酸の配列例である。図１４に示す例では、標的核酸はヒトβアクチン遺伝子である。また、図１４に示す配列例は、標的核酸及び内部標準核酸のセンス鎖を表している。また、図１５は、図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応するプライマーの配列例、図１６は、図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応する蛍光プローブの配列例である。
【０１６４】
図１４に示される標的核酸及び内部標準核酸の配列の下線を引いた部分相補的な関係となるアンチセンス鎖の部分に、図１６に示される蛍光プローブ（Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）が結合する。標的核酸と内部標準核酸とを比較すると、図１４に示されるように、蛍光プローブの結合部分（下線部分）の直後が、標的核酸は「ｃｃ」、内部標準核酸は「ａａ」となっている点で相違し、他の配列は同一である。したがって、Ｑ-Ｐｒｏｂｅは標的核酸と結合した際に、蛍光プローブの結合部分（下線部分）の直後のシトシン（ｃ）と相補的な関係となるアンチセンス鎖のグアニンと反応するため、蛍光が消光する。
【０１６５】
本実施例においては、マイクロ流体チップ１００のウェル１６（反応容器）内に、図１４に示される配列を有する内部標準核酸、図１５に示される配列を有するプライマー及び図１６に示される配列を有する蛍光プローブ（Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）を、ウェル１６（反応容器）内に試薬として配置した。Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（Ｊ−Ｂｉｏ２１（株）から購入）は、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて蛍光標識したものを使用した。
【０１６６】
図１７は、標的核酸及び内部標準核酸の他の配列例である。図１７に示す例では、標的核酸はヒトアルブミン遺伝子である。また、図１７に示す配列例は、標的核酸及び内部標準核酸のセンス鎖を表している。また、図１８は、図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応するプライマーの配列例、図１９は、図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸に対応する蛍光プローブの配列例である。
【０１６７】
図１７に示される標的核酸及び内部標準核酸の配列の下線を引いた部分に、図１９に示される蛍光プローブ（Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）が結合する。標的核酸と内部標準核酸とを比較すると、図１７に示されるように、蛍光プローブの結合部分（下線部分）の直前が、標的核酸は「ｇｇ」、内部標準核酸は「ａａ」となっている点で相違し、他の配列は同一である。したがって、Ｑ-Ｐｒｏｂｅは標的核酸と結合した際に、蛍光プローブの結合部分（下線部分）の直前のグアニン（ｇ）と反応するため、蛍光が消光する。
【０１６８】
本実施例においては、マイクロ流体チップ１００のウェル１６（反応容器）内に、図１７に示される配列を有する内部標準核酸、図１８に示される配列を有するプライマー及び図１９に示される配列を有する蛍光プローブ（Ｑ−Ｐｒｏｂｅ）を、ウェル１６（反応容器）内に試薬として配置した。Ｑ−Ｐｒｏｂｅ（Ｊ−Ｂｉｏ２１（株）から購入）は、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ社製）を用いて蛍光標識したものを使用した。
【０１６９】
上述した方法と同様の方法により、マイクロ流体チップ１００のウェル１６を２つの反応容器群に分け、それぞれ２つの遺伝子ヒトβアクチン遺伝子及びヒトアルブミン遺伝子に対応するように反応容器群ごとに異なるプライマー及び蛍光プローブを配置した。また、内部標準核酸の量は、標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体（検体１とする）の反応液をウェル１６（反応容器）に導入した場合に、ウェル１６（反応容器）に導入される標的核酸の量である参照量に調整して各々のウェル１６に配置した。参照検体中の各遺伝子の発現量は、予めリアルタイムＰＣＲ法により測定して求めたものであり、表１に示される。
【０１７０】
続いて、サンプル（検体２）から抽出した標的核酸を含む被検液をＰＣＲ反応に適するように調製し、ウェル１６（反応容器）に充填し、サーマルサイクラー（Ｍａｓｔｅｒ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社））でＰＣＲを行った。蛍光測定は、室温で増幅反応の前後に測定し、その比を蛍光変化量として算出した。
【０１７１】
表１は、上述した条件においてヒトβアクチン遺伝子及びヒトアルブミン遺伝子について競合ＰＣＲ法により定量した結果である。記号は前述の式（１）に対応して示している。参照検体（検体１）の定量ＲＴ−ＰＣＲの測定結果より、参照量を、βアクチン遺伝子については５０００ｃｏｐｙ／μｌ、アルブミン遺伝子については１００ｃｏｐｙ／μｌに設定した。
【０１７２】
【表１】
【０１７３】
表１の結果から、サンプル（検体２）中の標的核酸の量は、２種類とも適切に定量できていることが分かる。
【０１７４】
内部標準核酸の量を、サンプルの種類によらず一定にすると、サンプル中の標的核酸の量が内部標準核酸の量と著しく異なる場合（目安として１０分の１以下又は１０倍以上）には、十分な定量精度が確保できない。通常、遺伝子の種類によって発現量は大きく異なるため、全ての遺伝子を一定濃度の内部標準核酸との競合ＰＣＲ法で定量することは困難である。表１の結果から、参照量を予め設定したことで、発現量が１００倍以上異なる２種類の遺伝子の両方について、１つのマイクロ流体チップ１００を用いて精度良く定量ができたことが分かる。
【０１７５】
このように、本実施例によれば、標的核酸の発現量を事前に予想して内部標準核酸の量を設定することにより、期待された範囲内の発現量であれば、標的核酸の発現量を精度よく定量することができる。また、発現量が大きく異なる複数の遺伝子について、１つのマイクロ流体チップで定量することができる。
【０１７６】
６．本発明の適用例
本発明によれば、例えば、病院などで診断対象者（患者）から検体を採取し、遺伝子の発現状態を分析できる。例えば、内部標準核酸の量を健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量とすれば、診断対象者の遺伝子の発現状態が健康な状態の発現状態と比較してどれだけ差異があるかを容易に判定することができる。また例えば、内部標準核酸の量を特定の病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量とすれば、診断対象者の遺伝子の発現状態が特定の病気の状態の発現状態と比較してどれだけ差異があるかを容易に判定することができる。これにより、遺伝子発現量に基づいた病気の診断が可能になる。なお、病気であるか否かの判定基準は、統計データなどに基づいて、医学的に決定される。
【０１７７】
また、上述の方法によれば、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールを予め用意しておくことにより、遺伝子発現量の定量も可能になる。病気の程度によって、１通りの参照量では定量できないほどに遺伝子発現量が変化する場合には、１つのマイクロ流体チップに内部標準核酸の量が異なるウェル（反応容器）を設けたり、内部標準核酸の量が異なる複数のマイクロ流体チップを用いたりすることにより、遺伝子発現量の定量が可能になる。
【０１７８】
健康な状態の発現状態と比較して、定量できないほどに遺伝子発現量が変化している場合であっても、病気か否かの最初のスクリーニングとして使用することが可能である。この場合、必要に応じてオーバーレンジとなった遺伝子について、内部標準核酸の量を変えて再検査することにより、より精度の高い診断が可能となる。
【０１７９】
なお、上述した実施形態及び変形例は一例であって、これらに限定されるわけではない。例えば各実施形態及び各変形例は、複数を適宜組み合わせることが可能である。
【０１８０】
本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、さらに種々の変形が可能である。例えば、本発明は、実施形態で説明した構成と実質的に同一の構成（例えば、機能、方法及び結果が同一の構成、あるいは目的及び効果が同一の構成）を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成の本質的でない部分を置き換えた構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成と同一の作用効果を奏する構成又は同一の目的を達成することができる構成を含む。また、本発明は、実施形態で説明した構成に公知技術を付加した構成を含む。
【符号の説明】
【０１８１】
１０ 基板、１１ 第１面、１２ 第２面、１３ リザーバー領域、１４ ウェル領域、１５ リザーバー、１６ ウェル、１６ａ 開口、２０ カバー、２０ａ 表面、２１ 固着領域、３０，３１，３２ 試薬、４１ 健康領域、４２ 病気領域、５１ 第１進行状態領域、５２ 第２進行状態領域、６１，６２，６３，６４，６５ 反応容器群、８０ 被検液、９０ ローラー、１００，１００ａ，１００ｂ，１００ｃ，１００ｄ，１００ｅ，１００ｆ，１０１，１０１ａ，１０１ｂ マイクロ流体チップ、１１０ 内部標準試薬、１１１ 第１の内部標準試薬、１１２ 第２の内部標準試薬、１５０，１５１，１５２ 蓋付き容器、１６０，１６１，１６２ ウェル、２００ マイクロ流体チップセット、３００，３００ａ，３０１，３０１ａ 核酸分析キット、６１１，６１２，６１３，６１４，６１５，６２１，６２２，６２３，６２４，６２５，６３１，６３２，６３３，６３４，６３５，６４１，６４２，６４３，６４４，６４５ 反応容器群、Ｒ 回転軸
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用するマイクロ流体チップであって、
複数の反応容器を含み、
前記反応容器は、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、前記標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸と、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、前記標的核酸の増幅産物に結合した場合と前記内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれる前記プライマー及び前記蛍光プローブの種類は互いに異なり、
前記内部標準核酸の量は、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を前記反応容器に導入した場合に、前記反応容器に導入される前記反応液に含まれる前記標的核酸の量である参照量と同じである、マイクロ流体チップ。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記参照量は、前記参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量の少なくとも一方である、マイクロ流体チップ。
【請求項３】
請求項１に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記参照量が、前記参照検体を、前記健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器と、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器と、
を含む、マイクロ流体チップ。
【請求項４】
請求項１に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器と、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器と、
を含む、マイクロ流体チップ。
【請求項５】
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器を含む、請求項１に記載のマイクロ流体チップと、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器を含む、請求項１に記載のマイクロ流体チップと、
を含む、マイクロ流体チップセット。
【請求項６】
検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用する核酸分析キットであって、
マイクロ流体チップと、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、前記標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸を含む液体である内部標準試薬と、
を含み、
前記マイクロ流体チップは、複数の反応容器を含み、
前記反応容器は、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、前記標的核酸の増幅産物に結合した場合と前記内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれる前記プライマー及び前記蛍光プローブの種類は互いに異なり、
前記内部標準核酸のモル濃度は、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる前記標的核酸のモル濃度である参照モル濃度と同じである、核酸分析キット。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分析キットにおいて、
前記参照モル濃度は、前記参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度の少なくとも一方である、核酸分析キット。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分析キットにおいて、
前記内部標準試薬として、
前記参照モル濃度が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である前記内部標準核酸を含む第１の内部標準試薬と、
前記参照モル濃度が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である前記内部標準核酸を含む第２の内部標準試薬と、
を含む、核酸分析キット。
【請求項１】
検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用するマイクロ流体チップであって、
複数の反応容器を含み、
前記反応容器は、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、前記標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸と、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、前記標的核酸の増幅産物に結合した場合と前記内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれる前記プライマー及び前記蛍光プローブの種類は互いに異なり、
前記内部標準核酸の量は、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体の反応液を前記反応容器に導入した場合に、前記反応容器に導入される前記反応液に含まれる前記標的核酸の量である参照量と同じである、マイクロ流体チップ。
【請求項２】
請求項１に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記参照量は、前記参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量の少なくとも一方である、マイクロ流体チップ。
【請求項３】
請求項１に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記参照量が、前記参照検体を、前記健康な個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器と、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器と、
を含む、マイクロ流体チップ。
【請求項４】
請求項１に記載のマイクロ流体チップにおいて、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器と、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器と、
を含む、マイクロ流体チップ。
【請求項５】
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第１条件の反応容器を含む、請求項１に記載のマイクロ流体チップと、
前記参照量が、前記参照検体を、前記病気の第２進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表する量である第２条件の反応容器を含む、請求項１に記載のマイクロ流体チップと、
を含む、マイクロ流体チップセット。
【請求項６】
検体に含まれる標的核酸の増幅、及び、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定に使用する核酸分析キットであって、
マイクロ流体チップと、
前記標的核酸と共通のプライマーで増幅可能な核酸であって、前記標的核酸とは異なる配列を有する核酸である、既知量の内部標準核酸を含む液体である内部標準試薬と、
を含み、
前記マイクロ流体チップは、複数の反応容器を含み、
前記反応容器は、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸に共通のプライマーと、
前記標的核酸及び前記内部標準核酸の増幅産物の一部に結合し、前記標的核酸の増幅産物に結合した場合と前記内部標準核酸の増幅産物に結合した場合とで異なる蛍光変化を示す蛍光プローブと、
を含み、
前記反応容器のうち、第１の反応容器と第２の反応容器とに含まれる前記プライマー及び前記蛍光プローブの種類は互いに異なり、
前記内部標準核酸のモル濃度は、前記標的核酸が所定量発現したか否かの判定の基準となる検体である参照検体に含まれる前記標的核酸のモル濃度である参照モル濃度と同じである、核酸分析キット。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸分析キットにおいて、
前記参照モル濃度は、前記参照検体を、健康な個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度及び病気の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度の少なくとも一方である、核酸分析キット。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分析キットにおいて、
前記内部標準試薬として、
前記参照モル濃度が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である前記内部標準核酸を含む第１の内部標準試薬と、
前記参照モル濃度が、前記参照検体を、前記病気の第１進行状態の個体から採取した検体とした場合を代表するモル濃度である前記内部標準核酸を含む第２の内部標準試薬と、
を含む、核酸分析キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【公開番号】特開２０１１−２３９７４２（Ｐ２０１１−２３９７４２Ａ）
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１１６０８１（Ｐ２０１０−１１６０８１）
【出願日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１２月１日（２０１１．１２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【出願人】（０００００２３６９）セイコーエプソン株式会社 (51,324)
【Ｆターム（参考）】
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