マイクロ流体フォーマットにおけるアッセイ実装
感染症（例えば、ＡＩＤＳおよびマラリア）を監視し、診断するためのポイントオブケア計測装置プラットフォームに関係するカートリッジ内のマイクロ流体フォーマットのアッセイ実装。プラットフォームは、完全血球算定も行うことができる。計測装置プラットフォームは、カートリッジおよび光学系の一部を保持し、カートリッジの流路内で血液試料の蛍光および散乱光関連分析を実行することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年１２月２９日に出願した米国仮特許出願第６０／７５５，０１４号の利益を主張する。
本出願は、２００５年１２月２２日に出願した米国仮特許出願第６０／７５３，２９３号の利益を主張する、２００６年１２月２２日に出願した米国特許出願第１１／６１５，８８４号の一部継続出願である。
【０００２】
本出願は、２００４年５月１４日に出願した仮特許出願第６０／５７１，２３５号の利益を主張する、２００５年５月１２日に出願した米国特許出願第１０／９０８，４６０号の一部継続出願である。
【０００３】
本出願は、２００４年５月１４日に出願した仮特許出願第６０／５７１，２３５号の利益を主張する、２００５年５月１２日に出願した米国特許出願第１０／９０８，４６１号の一部継続出願である。
【０００４】
本出願は、２００４年９月２７日に出願した米国特許出願第１０／９５０，８９８号の一部継続出願である、２００５年１２月３０日に出願した米国特許出願第１１／３０６，５０８号の一部継続出願である。
【０００５】
本出願は、２００２年１１月２６日に出願した米国特許出願第１０／３０４，７７３号の一部継続出願である、２００４年９月９日に出願した米国特許出願第１０／９３８，２６５号の一部継続出願である。
【０００６】
本発明は、サイトメトリー、特に携帯型サイトメトリーに関するものである。より具体的には、本発明は、血液分析に関する。
【背景技術】
【０００７】
ＨＩＶおよびマラリアは、死亡率と疾病率のいくつかの主要原因のうちの２つであり、それぞれ、即座の診断と効果的な治療で予防可能である。これらの疾病は両方とも全世界の途方もない負担となっているが、これが発生しているのがサハラ砂漠以南のアフリカである。マラリア原虫血症の有病率は、ＨＩＶ感染とともに増大し、マラリアの発生率は、ＨＩＶ感染とともに増大し、ＨＩＶは、マラリア患者が重度のマラリアを発症する危険性を増大し、マラリア予防または治療はＨＩＶ重感染に対しては有効性が低い場合があることを示唆する証拠が挙げられている。ＨＩＶを監視する場合、注目するマーカーは、ＣＤ４＋リンパ球であり、ＣＤ４枯渇は、ＨＩＶ疾病の発病に直接リンクしているように見える。
【０００８】
全白血球数またはリンパ球数の変動は、ヒトのＣＤ４数に影響を及ぼす可能性があることに留意されたい。これは、変化の少ないＣＤ４パーセンテージについて話すのを好む人たちもいるからである。
【０００９】
完全血球算定（ＣＢＣ）を指令すると、ヘマトクリットおよびヘモグロビン（赤血球に関する情報が得られる）と白血球数を求めることができる。「分画」は、異なる種類の白血球を、また好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球のパーセンテージを示すことができる。ＨＩＶで注目するのは、リンパ球である。
【００１０】
Ｔ細胞数（ＣＤ３数）は、ＣＤ４数およびＣＤ８数を含むことができる。比ＣＤ４／ＣＤ８は、もはや頻繁には使用されないであろう。これらの測定に対し、高い数値が最良であるように見えるが、ウイルス量、絶対数のＣＤ４数、およびＣＤ４パーセンテージに注意を払うことによりある種の混同を避け、比ＣＤ４／ＣＤ８を無視することができる。
【００１１】
ＣＤ＋４（Ｔヘルパーともいう）リンパ球は、人体の免疫学的防御に関与している可能性がある。ＨＩＶ感染によりそれが喪失すると、免疫系が徐々に低下し、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連する症状に進行する可能性がある。治療ガイドラインでは、抗レトロウイルス薬物療法をいつ開始すべきかを決定すること、治療計画がどれだけよく働いているかを評価すること、および代替え投薬計画への切り換えが必要かどうかを決定するのを補助することのために定量的ＣＤ４＋リンパ球およびＨＩＶウイルス量検査を使用する必要がある場合がある。
【００１２】
開発途上国のＨＩＶ感染者が増加の一途を辿り、ヘルスケアサービスに過度の負担をかけ、圧倒し続ける。大半の開発途上国では、既存の検査方法があまりにも高価で複雑であるため、ＨＩＶ感染者のＣＤ４＋リンパ球数を監視する既存の施設は、限られているか、または存在していない。ＣＤ４＋リンパ球を監視するための単純で、安価で、半定量的なアプローチが利用可能であれば、以下の疾病および公衆衛生への影響が生じうる。ＣＤ４＋リンパ球レベルを検査し、監視するための簡素化された、低コストの、使いやすいデバイスを実現すると、ＣＤ４検査をふつうに、一貫して利用することが可能になり、これによりＨＩＶ治療の有効性が高まり、薬剤耐性が低減されるが、これは開発途上国世界においては非常に価値のあることと思われる。
【００１３】
マラリアによる感染の早期の正確な診断は、効果的な疾病管理には重要であり、また脳マラリアなどの合併症の進行と発症を防ぐのにも重要である。マラリアの２つの最も伝染力の強い普通種は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ）および三日熱マラリア原虫であり、したがって、安価で、使いやすいデバイスを介してこれら２つの種を同定できれば、開発途上国世界にとって大いに有益であろう。
【００１４】
２００５年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／７５３，２９３号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００５年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／７５５，０１４号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００５年５月１２日に出願された米国特許出願第１０／９０８，４６０号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００５年５月１２日に出願された米国特許出願第１０／９０８，４６１号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００５年１２月３０日に出願された米国特許出願第１１／３０６，５０８号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００４年９月２７日に出願された米国特許出願第１０／９５０，８９８号の一部継続出願は、参照により本明細書に組み込まれる。２００４年９月９日に出願された米国特許出願第１０／９３８，２６５号は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、１つのポイントオブケア（ＰＯＣ）マイクロ流体計測装置プラットフォームで免疫アッセイおよび血液学検査を行うことができる装置である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
診断、監視、および生命科学の用途向けのポイントオブケア（ＰＯＣ）計測装置の需要が増大している。ＰＯＣフローサイトメーターの重要な用途の１つは、投薬（ＡＲＴ）中のＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）患者および他の疾病を患っている患者を含む他の患者を監視することである。フローサイトメーターは、マイクロ流体フォーマットでこれらのアッセイを実施する。
【００１７】
本発明は、ポイントオブケア計測装置用にＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤＸＸアッセイ（ＨＩＶ感染患者に使用される）を実施するアプローチを実現する。このアッセイは、使い捨て型プラスチック製分析カードのマイクロ流体フォーマットで実装されうる。カードは、ＣＤＸＸアッセイを実行することができるだけでなく、さらに総白血球数／白血球分画の検査も実行できる。本発明は、単一のマイクロ流体カートリッジ上で組み合わせることができるそれぞれのモジュールとなっている２つの検査（ＣＤＸＸ検査または免疫アッセイ検査および血液学検査）を実施することができる。カートリッジは、積層構造であるか、または少なくとも部分的には、成形構造としてよい。カートリッジの材料としては、さまざまなタイプのプラスチックおよびガラス材料が考えられる。他の材料も、例えば、埋め込まれる電極などの特定の電気的コンポーネントに対する導電性材料などを適宜構造の中に使用できる。
【００１８】
マイクロ流体フォーマットのいくつかの利点として、試薬消費量が最小である（したがって、検査コストが低い）、両方の検査が同じカード上で実行されるため使いやすい、試料調製手順が簡素化されている（３０分間のインキュベーションがない）などが挙げられる。本発明は、マイクロ流体カートリッジ上にマイクロ流体フォーマットで異なるアッセイ機能を実装することを含むことができる。これらの機能は、混合、分離、濾過、洗浄、予備濃縮、溶解、選別などを含むことができる。
【００１９】
本発明は、白血球試料入力から得られた白血球を計数し、分類することができるＰＯＣ統合散乱および蛍光フローサイトメーターとしてよい。本発明のＰＯＣ計測装置は、ＣＤ４監視（ＣＤ４絶対数およびパーセントＣＤ４）に使用されうる。このサイトメーターは、ハンドヘルド型計測装置およびクレジットカードサイズの使い捨て型分析カートリッジで構成することができる。使い捨て型カートリッジは、オンボード試薬貯蔵容器（希釈液、溶解液、およびシース液）、全血試料捕捉毛細管、およびオンボード液流センサーを備えることができる。サイトメーターシステムは、カートリッジ上の自動化試料調製機能、赤色ＶＣＳＥＬ配列ベース電子セルフアライメント機能、超小型３流路ポンプシステム、ならびにカスタム開発電子回路およびグラフィカルユーザーインターフェイスを備えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図１は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）計測装置およびその動作のブロック図である。全血試料は、ブロック１１１で持ち込むことができる。全血の一部は、溶解ウェル１１２に通され、そこで主にブロック１１３で白血球を得るために赤血球を除去することができる。白血球の一部は、ブロック１１４で散乱ベースサイトメトリーに入り、その結果、ブロック１１５で白血球の個数と５分画が得られる。
【００２１】
ブロック１１３から、一部の白血球は、さらに、蛍光標識抗体でインキュベートするためにブロック１１６に入ることができる。これは、ブロック１１７で、ＣＤ４、ＣＤ、マラリア寄生体、結核（ＴＢ）などの指標および／または量に関する情報を得るためである。
【００２２】
さらにブロック１１１からは、全血一部が、散乱およびサイトメトリーブロック１１８に入り、ＲＢＣ数とヘマトクリットデータを取得することができる。ここでもまた、ブロック１１１から、全血はブロック１２０に入り、血液中のヘモグロビンの量に関する溶解および吸収ベースの情報得ることができる。図１のブロック内の項目は、マイクロ流体カートリッジまたはカード上で実装することができ、血液学分析器とみなすことができる。カートリッジの主な目標の１つは、赤血球数、白血球数、ヘモグロビン量、ヘマトクリットデータ、血小板数、および白血球の５分画を含むことができる完全血球算定パラメータを得ることである。ブロック１１５、１１９、および１２１では、完全血球算定を行うことができる。ブロック１１７は、蛍光で分析を行うことができる。２つの主要な操作は、通常のクレジットカードほどの小ささで、使い捨てのマイクロ流体カートリッジ上に実装され、実施されうる。
【００２３】
白血球を５群に分画した後、それらの群の１つまたは複数は、さらに、複数の小群に分画されうる。これらの群の１つであるリンパ球は、蛍光またはフルオロ標識またはマーカーで標識されうる。細胞は、カートリッジ上に用意されうる貯蔵容器からの抗原と抗体を有し、抗体は、特定の抗原に結合することができる。リンパ球の小群への分類は、臨床的な意義を持つことがある。小群への分類の結果、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤＸ、ＣＤＸＸ細胞の群が得られ、医者は病原体などに注目し、および／または推論し、患者のＨＩＶ、ＡＩＤＳ、マラリア、ＴＢなどを監視することができる。単球であっても、蛍光マーカーで標識されうる。抗体に標識を付けて、偽陽性率を小さくすることができる。
【００２４】
ＨＩＶおよびマラリアとの重感染は、死亡率の増大をもたらす可能性があるけれども、この重感染は、ＨＩＶ／結核重感染に比べればそれほど問題ではないことに留意するとよいが、それは、これら２つの疾病は通常、異なる年齢層を攻撃し、マラリアは若年層で最も一般的であり、結核は高年齢層で最も一般的であるからである。しかし、不安定なマラリア伝染の地域では、ＨＩＶは、マラリアが発生したときに大人が重度のマラリアを発症する一因となりうる。
【００２５】
また、ＨＩＶとマラリアとの間には高い相関もありうる。この相関から、マラリアそれ自体がＨＩＶの蔓延の主要原因であるということが示唆される。ウイルス量が高いほど、ＨＩＶ感染が増え、マラリアは、高ＨＩＶウイルス量をもたらす原因となりうる。この見かけの因果関係が、患者がＨＩＶ、マラリア、および／またはＴＢに罹っているかどうかをアッセイ検査で判定することができる理由になっているとしてよい。
【００２６】
マラリアは、最も一般的な感染症の１つであり、非常に大きな公衆衛生問題である考えられる。この疾病は、マラリア原虫の寄生原虫類により引き起こされるとみなされている。最も重度の疾病形態は、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫によって引き起こされうるが、他の関係する種（卵形マラリア原虫および四日熱マラリア原虫）もヒトに病気をうつす可能性がある。このヒト病原性マラリア原虫種群は、マラリア寄生体と呼ばれることが多い。
【００２７】
図２は、それぞれ縦軸と横軸にプロットされた小角度散乱対大角度散乱のデータに基づく白血球の５分画のグラフであり、結果として、白血球の５つの群１３１、１３２、１３３、１３４、および１３５のプロットが得られる。図３は、抗体１３８が到達して鍵と錠のように合わさる抗原１３７を有する、リンパ球などの白血球１３６を示している。それぞれの細胞は、最終的に、抗原が付着した全血に由来しうる。
【００２８】
図４ａは、プロットされたデータに対する直交する測定結果を含むリンパ球の３次元プロットである。データは、フルオロ強度（抗体により細胞がどれだけ標識されているかを示す）対ＦＡＬＳが図４ａのシートに平行な平面に置かれ、ＳＡＬＳに対する第３の座標がシートから外へ伸びる形で３Ｄプロットされている。図４ａは、２つのピークを持つ（１４１および１４２）透視図を示している。図４ｂは、図４ａのグラフの辺に向かう視線方向から見た例示的な細胞１４３を示している。図５ａのグラフは、第１のピークが、第１のピークの振幅が小さく見え、身体反応がよくないことを示している可能性のあることを除き図４ａのと同様である。図４ａのピーク１４１は、身体反応がよいことを示している可能性がある。ピーク１４１とピーク１４２との比から、被検者の健康のある種の情報が得られる。図５ｂは、ピーク１４１と１４２を明らかにするＳＡＬＳ対フルオロのプロットを示している。
【００２９】
さまざまなパラメータが、血液学分析に役立ちうる。４つの重要なパラメータ、赤血球（ＲＢＣ）数（細胞数／μＬ）、血小板（ＰＬＴ）数（細胞数／μＬ）、平均細胞体積（ＭＣＶ）、および赤血球分布幅（ＲＤＷ）は、血液試料に対する光学的アプローチで得られる。ＭＣＶは、事実上、ＲＢＣの平均サイズの測定結果であり、ＲＤＷは、ＲＢＣ間のサイズの変動である。ＲＢＣのサイズの変動が大きいほど、ＲＤＷも大きい。
【００３０】
ＲＢＣ数は、分析対象の血液の単位体積当たりのＲＢＣの実際の数である。Ｈｃｔは、ＲＢＣ×ＭＣＶであるヘマトクリットであり、結局、血液の酸素運搬能の尺度となりうる（つまり、分析対象の単位体積中の細胞のすべての全能力）。Ｈｃｔは、さらに、血液中でＲＢＣが占有する空間の量、または赤血球からなる全血の割合とみなすこともできる。ＭＣＨは、事実上それぞれのＲＢＣ中のヘモグロビンの量である「平均赤血球ヘモグロビン」である。ＭＣＨは、ピコグラムを単位とする、個々のＲＢＣ中のヘモグロビンの平均、またはおおよそ平均質量とみなすことができる。ＭＣＨ＝Ｈｂ÷ＲＢＣ。Ｈｂは、分析対象の試料の単位体積当たりのヘモグロビンの量である。ＭＣＨＣは、ＲＢＣのそれぞれにおける単位体積当たりのヘモグロビンの濃度とみなせる「平均赤血球ヘモグロビン濃度」である。ＭＣＨＣ＝Ｈｂ÷Ｈｃｔ。
【００３１】
いくつかの測定パラメータ群は、細胞流量（ＦＲ）、測定時間（Ｔ）、希釈係数（ＤＦ）、計数されたＲＢＣ数（ＮＲＢＣ）、計数された血小板数（ＮＰＬＴ）、ヘモグロビン量（Ｈｂ）、および実質的にそれぞれのｃｃｌｌｊの直径（ミクロン）（ｄｒｂｃｉ）を含むことができる。＜ｄｒｂｃｉ＞は、集合｛ｄｒｂｃｉ｝により表される、細胞の測定されたｃｃｌｌ直径の平均である。主要な計算パラメータのいくつかとして、ＲＢＣ＝ＮＲＢＣ÷（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ）、ＰＬＴ＝ＮＰＬＴ÷（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ）、ＭＣＶ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３＞、およびＲＤＷ＝ＳＤ｛［（π／６）ｄｒｂｃｉ３］｝÷ＭＣＶがあるが、ただし、ＳＤは、測定された量の標準偏差を表す。計算パラメータとしては、Ｈｃｔ＝ＲＢＣ×ＭＣＶ、ＭＣＨＣ＝Ｈｂ÷Ｈｃｔ、およびＭＣＨ＝ＭＣＨＣ×ＭＣＶがある。
【００３２】
モジュール１２１は、血液試料中のヘモグロビン（Ｈｂ）の量またはヘモグロビン濃度を決定するために使用されうる。モジュールは、ヘモグロビン吸収を使用してＨｂを決定することができる。血液中のヘモグロビンの量は、グラム／リットル単位で表すことができる。
【００３３】
白血球の繰り返し可能な３分画は、図６ａおよび６ｂに示されているように正しく示すことができる。図６ａは、それぞれ群１４５および１４６として示される、５μｍおよび６μｍのビーズの計数および分類のグラフを示している。このプロットは、ビーズのＰＡＬＳ対ＳＡＬＳの関係を示す。それぞれのビーズタイプに対する絶対数は、予測値の約５％の範囲内にあるように見える。図６ｂは、細胞の複数のグループ分けを示す散乱データから得られる白血球プロットの結果を示している。このプロットは、ポイントオブケアタイプの計測装置による細胞のＦＡＬＳ対ＳＡＬＳの関係を示すものである。白血球３つの群１４７、１４８、および１４９（それぞれリンパ球、Ｌ、単球、Ｍ、および顆粒球、Ｇ）は、図６ｂのプロットにおいて分画されうる。全ＷＢＣ数は、市販の血液学分析器を使用して同じ試料について実行された類似の測定結果の６％の範囲にあるように見えた。
【００３４】
赤色ＶＣＳＥＬ配列は、集束レーザースポットと粒子流経路との位置合わせを含むことができるフローサイトメトリーにおける最も重要な態様の１つに対する解決策をもたらしうる。典型的には、使い捨て型流体カートリッジなどの成型プラスチック部品における位置合わせは、そのような部品を使用することにはある種の正確さが関連するため難しい。標準の単一レーザーを直線配列のレーザーで置き換えることは、特定の細胞の実質的に正確な経路を決定し、セルフアライメントを可能にする一手段となる。
【００３５】
本発明のＰＯＣサイトメーターは、全血試料捕捉、試薬貯蔵、赤血球の連続的溶解、フローサイトメトリーに対する血球サイズコア内への白血球の３次元流体力学的／幾何学的集束、ならびに試料および廃棄物貯蔵室ためのマイクロ流体回路を備えることができる。これは、準備段階なしで１滴（１５μＬ）の血液から直接働き、試薬使用量を最小限にし、試料、試薬、廃棄物をカード上に保持することができる。
【００３６】
分析カートリッジ上のマイクロスケール流路内の液流は、本質的に層流としてよく、これにより、混和流体（例えば、全血と水）を隣同士で流し、分子および対流拡散を通じてのみ混合することができる。これにより、生物学的粒子（血液細胞など）を制御された時間の間に露出させることが可能であり、残っている白血球を検出し特徴付けられるように化学および浸透圧を介して赤血球（ＲＢＣ）の選択的溶解を能にすることができる。カートリッジ上のＲＢＣの選択的溶解に対するこのようなアプローチは、「オンザフライ溶解」（ＬＯＦ）と呼ばれ、ベンチトップサイトメーターで実行されるバッチ溶解とは異なり、同じ時間の間、溶解液に曝されるすべての細胞を利用することができる。
【００３７】
本発明の光散乱ベースのＰＯＣサイトメーターに加えて、ＰＯＣサイトメーターに役立つ他の２つの進行中の態様がありうる。光散乱ベースの計測装置上の２色光蛍光能力は、ＣＤ４／ＣＤ４５アッセイを実行するために使用されうる。ＰＯＣは、さらに、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤＸ、ＣＤＸＸ、および／または同様のアッセイを実効できる統合散乱／蛍光サイトメーターであってよい。使い捨て型カードまたはカートリッジでは、オンカードｍＡｂｓによる白血球のオンカード染色および赤血球溶解を使用することができる。本発明のＰＯＣ血液学分析器は、完全血球算定（ＣＢＣ）検査を実行するＣＬＩＡ放棄計測装置として設計することができる。
【００３８】
図７は、例示的な小型化された携帯型サイトメーターの斜視図である。このサイトメーターのあるバージョンは、本発明と連携して使用することができる。サイトメーターは、一般に１０で示されており、筐体１２および取り外し可能もしくは交換可能カートリッジ１４を備えることができる。例示的な筐体１２は、底部１６、カバー１８、および底部１６をカバー１８に取り付ける蝶番２０を備えることができる。底部１６は、光源２２ａおよび２２ｂ、関連する光学系、およびサイトメーターの動作に必要な電子回路を備えることができる。カバー１２は、手動式加圧要素、制御用マイクロ弁を備える圧力室、および関連する光学系を備える光検出器２４ａおよび２４ｂを備えることができる。
【００３９】
取り外し可能カートリッジ１４は、試料捕集装置口３２を介して試料流体を受け入れることができる。キャップ３８は、取り外し可能カートリッジ１４が使用されていない場合に試料捕集装置口３２を保護するために使用することができる。取り外し可能カートリッジ１４は、コア形成のため血液希釈、赤血球融解、および流体力学的絞り込みを実行することができる。取り外し可能カートリッジ１４は、一部がエッチングされた流路を持つ積層構造を使用することで製造されうる、流体回路により構成することができる。
【００４０】
取り外し可能構造またはカートリッジ１４は、カバー１８が開位置にあるときに筐体内に挿入できる。取り外し可能カートリッジ１４は、計測装置の異なる部分の間の位置合わせおよび結合を行いやすくする、位置決めピン２８ａおよび２８ｂを底部１６内に受け入れるための穴２６ａおよび２６ｂを備えることができる。取り外し可能カートリッジ１４は、さらに、透明なフロー流窓３０ａおよび３０ｂを備えることができ、これらは、光源２２ａおよび２２ｂと光検出器２４ａと２４ｂの配列に位置を揃えられている。カバーが閉位置に移動され、システムが加圧されると、カバー１８は、それぞれ圧力供給口３６ａ、３６ｂ、および３６ｃを介して取り外し可能カートリッジ１４内の受圧口３４ａ、３４ｂ、３４ｃに制御圧力を加えることができる。
【００４１】
検査を開始するために、カバー１８が持ち上げられ、新しいカートリッジ１４が入れられ、底部１６上で位置を合わせするようにできる。血液試料が試料捕集装置３２内に導入されうる。カバー１８は閉じられ、システムが手動加圧されうる。加圧は、手動以外であってもよい。加圧された後、計測装置は、白血球サイトメトリー測定および他の測定を実行することができる。取り外し可能カートリッジ１４は、コア形成のため血液希釈、赤血球溶解、および流体力学的絞り込みを実行することができる。光源２２ａおよび２２ｂ、光検出器２４ａおよび２４ｂ、ならびに関連する制御および処理電子回路は、光散乱蛍光信号に基づき白血球の分画および計数を実行することができる。筐体１２に蝶番付きの構造を使用する代わりに、スライド式カートリッジスロットまたは他の好適な構造を使用することが考えられる。
【００４２】
図８は、図７の例示的なサイトメーターの略図である。上述のように、底部１６は、光源２２ａおよび２２ｂ、関連する光学系、ならびにサイトメーターの動作に必要な制御および処理電子回路４０を備えることができる。底部１６は、さらに、サイトメーターに給電するための電池４２を備えることもできる。手動式加圧要素４４、制御用マイクロ弁を備える圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃ、ならびに関連する光学系を備える光検出器２４ａおよび２４ｂを備えるカバー１８が図に示されている。
【００４３】
取り外し可能カートリッジ１４は、試料捕集装置口３２を介して試料流体を受け入れることができる。カバー１８により加圧されると、取り外し可能カートリッジ１４は、本発明のデバイスにおいて血液希釈、赤血球溶解、およびコア形成のための流体力学的絞り込みを実行することができる。形成された後、図７のフロー流窓３０ａおよび３０ｂを通る、フロー流経路５０の下側にコアが送られうる。底部にある光源２２ａおよび２２ｂならびに関連する光学系は、フロー流窓３０ａおよび３０ｂを介してコア流に光を通し、光をコア流に到達させることができる。検出器２４ａおよび２４ｂ、ならびに関連する光学系は、それぞれ、さらにフロー流窓３０ａおよび３０ｂを介して、コアから散乱光および非散乱光を受け入れることができる。コントローラまたはプロセッサ４０は、検出器２４ａおよび２４ｂから出力信号を受け取り、コア流内に存在する選択された白血球を分画し、識別し、計数することができる。
【００４４】
取り外し可能カートリッジ１４は、流体のそれぞれの速度の制御を補助するための流体制御ブロック４８を備えることができる。例示的な実施例では、流体制御ブロック４８は、さまざまな流体の速度を感知するフローセンサーを備え、それらの速度をコントローラまたはプロセッサ４０に報告することができる。次いで、コントローラまたはプロセッサ４０は、圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃに関連付けられているマイクロ弁を調節して、サイトメーターを適切に動作させられる所望の圧力およびしたがって、所望の流体速度を得ることができる。
【００４５】
血液および他の生物学的廃棄物は、病気を拡大する可能性があるため、取り外し可能カートリッジ１４は、廃棄物貯蔵容器５２をフロー流窓３０ａおよび３０ｂの下流に備えるとよい。廃棄物貯蔵容器５２は、取り外し可能カートリッジ１４内のフロー流の流体を受け入れ、貯蔵することができる。試験が完了したら、取り外し可能カートリッジを取り外して、生物学的廃棄物と親和性のある容器内に処分することができる。
【００４６】
図９は、カバー１８がまだ押し下げられていない図８のサイトメーターを示すより詳細な略図である。図１０は、カバーが押し下げられている図８のサイトメーターを示すより詳細な略図である。手動式加圧要素４４、圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃ、および全体として６０で示されている制御用マイクロ弁を備えるカバー１８が示されている。光源および検出器は、これらの図に示されていない。
【００４７】
加圧される流体毎に１つずつ、３つの圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃがありうる。例示的な実施例において、圧力室４６ａは、血液試料貯蔵容器６２に圧力を加えることができる。圧力室４６ｂは、溶解液貯蔵容器６４に圧力を加え、圧力室４６ｃは、シース貯蔵容器６６に圧力を加えることができる。それぞれの圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃのサイズおよび形状は、所望の圧力特性を対応する流体に与えるように手直しすることができる。
【００４８】
圧力室４６ａは、第１の圧力室７０および第２の圧力室７２を含むことができる。第１の弁７４が、第１の圧力室７０と第２の圧力室７２との間に備えられ、これにより、第１の圧力室７０内の圧力を第２の圧力室７２へ制御しつつ逃すことができる。第２の圧力室７２と流体で連絡している、第２の弁７６は、第２の圧力室７２内の圧力を制御しつつ抜くことができる。それぞれの弁は、アドレッシングおよび制御を個別に行うことが可能な静電駆動式マイクロ弁の配列とすることができる。圧力室４６ｂおよび４６ｃは、溶解液貯蔵容器６４およびシース貯蔵容器６６にそれぞれ加えられる圧力を制御する類似の弁を備えることができる。それとは別に、それぞれの弁は、「実効」流量または漏出量が制御しつつ得られる制御可能なデューティサイクルでパルス変調される静電駆動式マイクロ弁の配列とすることができる。
【００４９】
取り外し可能カートリッジ１４は、カバー１８から制御を圧力を受けるための受圧口３４ａ、３４ｂ、および３４ｃを備えることができる。制御圧力は、図に示されているように、血液貯蔵容器６２、溶解液貯蔵容器６４、およびシース貯蔵容器６６に供給されうる。溶解液貯蔵容器６４およびシース貯蔵容器６６は、取り外し可能カートリッジ１４が使用のため出荷される前に充填されうるが、血液貯蔵容器６２は、試料捕集装置口３２から充填される。血液試料は、試料捕集装置口３２に供給され、血液試料は、毛管現象により、血液貯蔵容器６２内に吸い込まれうる。血液試料が血液貯蔵容器６２内に入った後、カバー１８を閉じて、システムを加圧することができる。
【００５０】
フローセンサーは、流体力学的絞り込みの前にそれぞれの流体と一致するように備えることができる。それぞれのフローセンサー８０、１００、および１０２は、対応する流体の速度を測定することができる。フローセンサーは、熱式流速計型フローセンサー、またはマイクロブリッジ型フローセンサーとしてよい。それぞれのフローセンサー８０、１００、および１０２からの出力信号は、コントローラまたはプロセッサ４０に供給されうる。コントローラまたはプロセッサ４０は、血液試料の速度が第１の所定の値よりも低くなった場合に第１の弁７４を開き、血液試料の速度が第２の所定の値よりも高くなった場合に第２の弁７６を開くことができる。弁８４、８６、９４、および９６は、同様の方法で溶解液およびシース液の速度を制御するように動作しうる。
【００５１】
動作中、システムを加圧するために、手動式加圧要素４４が押し下げられうる。圧力要素は、非手動機構と置き換えられうる。示されている実施例では、手動式加圧要素４４は、３つのプランジャを備え、それぞれのプランジャは第１の複数の圧力室のうちの対応する１つの圧力室内に受け入れられうる。プランジャは、第１の圧力室内に比較的高い非精密圧力を発生することができる。第１の弁７４、８４、および９４を開くことにより、二次室内に、低い制御圧力が発生し、二次室内に制御可能な漏れを生じうる。二次圧力室内に生じる圧力が大きすぎる場合、対応するベント弁７６、８６、および９６が開いて、圧力を逃すようにできる。
【００５２】
カバー１８を閉じたときに、ベント弁７６、８６、および９６を開いているままにして、ノーマルオープンの第１の弁７４、８４、および９４は、閉じることができる。所定の圧力Ｐが第１の圧力室内に生じたときに、ベント弁７６、８６、および９６を閉じ、第１の弁７４、８４、および９４を開き、二次圧力室に低い圧力Ｐ’を生じさせることができる。二次圧力室の制御圧力は、取り外し可能カートリッジ１４の流体回路に必要な圧力を供給し、血液、溶解液、およびシースに対する流体流を生じさせることができる。次いで、下流のフローセンサー８０、１００、および１０２により、流体流の速度が測定されうる。それぞれのフローセンサーは、対応する第１の弁および弁と弁の動作を制御し、それぞれの流体について所望の流量を一定にするためにコントローラまたはプロセッサ４０により使用される出力信号を供給することができる。
【００５３】
全体として１１０で示されている下流の弁も備えることができる。コントローラまたはプロセッサ４０は、システムが加圧されるまで下流弁１１０を閉じておくことができる。これにより、回路が加圧される前に血液、溶解液、およびシースが流体回路内に流れ込むのを防ぐことができる。本発明の他の例示低名実施例では、下流弁１１０は、カバーが閉じられたときに機械の作用により開くことができる。
【００５４】
図１１は、図９の流体力学的絞り込みブロック８８によるフロー流およびコアの形成を示す略図である。流体力学的絞り込みブロック８８は、流体駆動装置から制御された速度で血液、溶解液、およびシースを受け取ることができる。血液を溶解液と混合することで、赤血球を取り除くことができる。溶解溶液のｐＨは、赤血球に比べて低い場合がある。これは、赤血球溶解またはオンザフライ溶解と呼ばれることも多い。残っている白血球は、フロー流５０を発生するためにシース液により囲まれている、中心内腔１５０の下に供給されうる。フロー流５０は、シース液１５２により囲まれているコア流１６０を含むことができる。流路の寸法は、白血球１５４および１５６が一列縦隊で並ぶように、図に示されているとおりに縮小されうる。シース液の速度は、コア流１６０の約９倍としてよい。しかし、シース液およびコア流１６０の速度は、流路内に層流を維持できるよう十分遅いものとしてよい。
【００５５】
発光体２２ａおよび２２ｂならびに関連する光学系は、フロー流５０の片側に隣接して備えることができる。フロー流５０を介して発光体２２ａから光を、また蛍光発光粒子から光を受け取るために、フロー流５０の他方の側に光検出器２４ａおよび２４ｂならびに関連する光学系を備えることができる。光検出器２４ａおよび２４ｂからの出力信号は、コントローラまたはプロセッサ４０に供給され、そこで、コア流１６０内の選択された白血球を同定し、および／または計数するために分析される。
【００５６】
図１２は、図１１の散乱を介してコア流１６０の分析用の光源の配列２２ａおよび光検出器の配列２４ｂを示す略図である。光源は「＋」記号として表され、検出器はボックスで表される。示されている実施例では、光源の配列は、フロー流５０の片側に隣接して備えられ、光検出器の配列は、フロー流の対向側に隣接して備えられうる。光検出器はそれぞれ、複数の光源のうちの対応する１つの光源に位置を揃えることができる。光源の配列および光検出器の配列は、フロー流５０の軸２０２に関して少し回転された光源軸２００にそって整列されるように示されている。
【００５７】
光源の配列２２ａは、共通基板上に加工された垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などのレーザーの配列であるとしてよい。ＶＣＳＥＬは、垂直発光であるため、小型化された携帯型サイトメーターなどのコンパクトな計測装置のパッケージングに適している場合がある。このようなサイトメーターは、ヒトが身につけることができるものとしてよい。ＶＣＳＥＬは、従来の８５０ｎｍよりも短い波長で動作する、または特に、６７０ｎｍから７８０ｎｍまでの範囲の波長で動作する「赤色」ＶＣＳＥＬとしてよい。赤色ＶＣＳＥＬは、散乱測定に適している波長、電力、および偏波特性を有することができる。
【００５８】
いくつかのサイトメーターベンチモデルでは、波長６５０ｎｍの単一９ｍＷ端面放射型レーザーを使用することができる。ビームを１０×１００ミクロンの細長い形状に集束させ、コア流の位置ずれと幅のせいで生じる粒子位置の不確定性に対応することができる。対照的に、本発明の６７０ｎｍで動作する赤色ＶＣＳＥＬの出力は、典型的には、１０×１０ミクロンの放射体と１００ミクロンの間隔に対し約１ｍＷとしてよい。したがって、１０個の赤色ＶＣＳＥＬの直線配列からの光の全強度は、いくつかの従来技術のベンチモデルと本質的には同じであってよい。
【００５９】
流れの軸２０２に関してある角度で向き付けられているレーザーの直線配列することには、単一光源構成に勝る重要な利点が多数ありえる。例えば、レーザーの直線配列は、コア流内の粒子の経路の横方向アライメントを決定するために使用することができる。粒子流のアライメントの不確定性の発生源の１つは、コア流の幅であるとしてよく、これにより、粒子経路位置に統計変動が生じうる。これらの変動は検出器データの分析から判別され、コントローラまたはプロセッサ４０はこの変動を利用して、流体駆動装置の弁を調節し、試料流体および支持流体に加えられる相対圧力を変更し、フロー流内の選択された粒子のアライメントを変更することができる。
【００６０】
流体流５０内の細胞の横方向アライメントを決定するために、ＶＣＳＥＬの直線配列により生成される複数の焦点スポットに細胞を通すことができる。細胞は、対応するインライン基準検出器内の信号の低下を引き起こしうる。これらの信号の相対的強弱度は、粒子経路の中心および粒子幅の大きさを決定するためにコントローラまたはプロセッサ４０により使用されうる。
【００６１】
粒子経路および粒子サイズを決定するために、コア流の平面内で一連のガウススポット２１４（約１０００Ｗ／ｃｍ２の強度）にレーザー２２ａが集束されうる。スポット２１４は、白血球とほぼ同じサイズとしてよい（１０〜１２μｍ）。例示的なガウススポット２１４が、図１３に例示されている。検出器の配列２４ａとのその集束光学系の配列は、流体流５０の対向側に備えることができる。かなり大きなＦナンバーを有するレンズを使用することで、取り外し可能カートリッジのサイトメーターセクション用の数百ミクロンの作業空間を確保できる。
【００６２】
単一レーザー構成ではなくレーザーの直線配列２２ａを使用する場合の他の利点は、それぞれの細胞の速度を決定できるという点である。粒子速度は、光散乱信号から粒子サイズを推定する際の重要パラメータとすることができる。ある種のサイトメトリーでは、粒子速度は、ポンプ流量から外挿されうる。このアプローチの限界は、ポンプは非常に高精度なものであるべきである、サイトメーターフロー室の公差は厳格に制御されるべきである、漏れなどの流体障害は発生すべきでない、フローまたはコア形成を阻害する微泡などの障害物が入り込むべきではないという条件である。
【００６３】
それぞれの細胞の速度を決定するために、システムは、２つの隣接する、または連続的なスポットの間をそれぞれの細胞が通過するのに要する時間を測定することができる。例えば、図１２を参照すると、細胞は、検出器２０８を通過し、次いで、検出器２１０を通過することができる。細胞が検出器２０８から検出器２１０へ移動するのに要する時間を測定することにより、また検出器２０８から検出器２１０までの距離を知ることにより、コントローラまたはプロセッサ４０は、細胞の速度を計算することができる。これは、近似的な速度測定結果となるであろう。これは、飛行時間型測定と呼ばれることが多い。速度が判明した後、粒子が中心位置に来るスポットを通って移動する時間（数マイクロ秒）は、粒子の長さおよびサイズの尺度となりうる。
【００６４】
粒子速度は、さらに、流体駆動装置の制御を補助するために使用できるとも考えられる。本発明のサイズ、コスト、および複雑度を低減するために、図７の交換式カートリッジは、プラスチック積層または成形部品から製造することができる。このような製造技術により安価な部品が得られるが、典型的には、寸法が非対称で、断面の公差が大きく、寸法的正確さおよび反復性があまりよくない。このように公差が大きいほど、特にカートリッジからカートリッジまでの間の粒子速度に、変動を生じる可能性がある。このように大きな公差を補償しやすくするために、コントローラまたはプロセッサ４０では本明細書で説明されている飛行時間型測定を使用し、血液、溶解液、およびシース液に加えられる制御圧力を調節し、コア流内の粒子の速度が比較的一定するようにできる。
【００６５】
さらに、細胞サイズを評価するために、細胞経路にそって、さらに細胞経路を横切る形で、レーザー・ビームを集束させることができると考えられる。さらに、細胞を横切る複数のサンプルをテクスチャ特徴に関して分析し、形態学的特徴と他の細胞種類との相関を求めることができる。これにより細胞サイズに関する複数のパラメータが得られ、細胞種類を互いに分離させるのに役立ちうる。
【００６６】
単一レーザー源構成ではなくレーザーの直線配列２２ａを使用する場合の他の利点は、流路を横切る形で比較的一定した光照射を与えることができるという点である。これは、図１３に示されているように、隣接するＶＣＳＥＬ ２２ａからのガウスビーム２１４を重ね合わせることにより達成されうる。単一レーザーシステムでは、流路を横切る光照射は、その流路を横切るときに変化しうる。そのため、粒子が、流路の中心にない場合、その後の測定の精度は落ちる可能性がある。
【００６７】
上述の測定を実行するために、図１２のそれぞれの検出器２４ａは、単一のインライン検出器とすることができる。しかし、ＦＡＬＳおよびＳＡＬＳの散乱を測定するために、それぞれの検出器２４ａは、さらに、図１４に示されているように、インライン検出器の周りに配置された２つの環状検出器を備えることができる。この図を参照すると、ＶＣＳＥＬ ２１８は、光を上向き方向に送るように示されている。光はレンズに通され、レンズはコア流の平面内のガウススポットに光を集束させることができる。レンズ２２０は、マイクロレンズなどであってよく、ＶＣＳＥＬ ２１８と別であるか、または一体化されている。光はコア流を通過し、回折光学素子などの他のレンズ２２２により受け取られる。レンズ２２２は、光をインライン検出器２２６および環状検出器２２８および２３０に送ることができる。インライン検出器２２６は、コア流内で粒子により著しく散乱されない光を検出することができる。環状検出器２２８は、前方散乱（ＦＡＬＳ）光を検出することができ、環状検出器２３０は、小角度散乱（ＳＡＬＳ）光を検出することができる。
【００６８】
図１５は、光源および光検出器の３つの別々の配列を備えることができる例示的な他の実施例を示している。光源および光検出器のそれぞれの配列は、フロー流の中心流軸に関して少し回転された異なる光源軸にそって位置決めされうる。３つの配列を使用することにより、それぞれの配列に関連付けられている光学系は、特定の用途または機能に合わせて最適化されうる。小画散乱（ＳＡＬＳ）を検出するためには、コア流の平面上に十分に集束されているレーザー光が望ましい。前方散乱（ＦＡＬＳ）を検出するためには、コリメート光が望ましい。
【００６９】
図１５を参照すると、光源および光検出器の第１の配列が、３００で示されている。光源および光検出器は、第１の光源軸にそって直線配列として配置されうる。第１の光源軸は、フロー流の流れ軸に関して回転されうる。光源および光検出器は、図１２に関して上で説明されているものと類似のものであってよいが、例えば、フロー流内の細胞の横方向アライメント、粒子サイズ、粒子の速度を測定するために使用されうる。
【００７０】
上で示されているように、ユーザーは、取り外し可能カートリッジを取得し、血液試料を取り外し可能カートリッジの試料捕集装置口３２（図７を参照）に送ることができる。血液試料は、例えば、指に針を刺すことで集めることができる。ユーザーは、次いで、取り外し可能カートリッジを筐体内に挿入し、手動でシステムを加圧することができる。次いで、小型化された携帯型サイトメーターは、ユーザーが医療を求めるべきかどうかを示す読み取り値を与えることができる。この読み取り値は、視覚的読み取り値、可聴音、または他の好適なインジケータとすることができる。
【００７１】
指を針で刺すなどの方法で血液試料を取得する代わりに、カテーテル８０４（図２７）などをユーザーの静脈に挿入し、試料捕集装置口３２に取り付けることができる。これにより、システムは、読み取り値が必要な場合に血液試料をユーザーから自動的に捕集することができる。それとは別に、小型化された携帯型サイトメーターは、試料捕集装置口３２が好適な血液供給源に接続された状態でユーザー体内に埋め込むことができると考えられる。
【００７２】
図１６は、例示的な取り外し可能カートリッジのいくつかの特徴の略図である。例示的な取り外し可能カートリッジは、一般的に４００で示されており、本明細書で説明されている取り外し可能カートリッジ１４に類似のものとしてよい。取り外し可能カートリッジ４００は、例示されているにすぎず、本発明の実施例は、形態、機能、または構成に関係なく、多くのマイクロ流体カートリッジに適用されうることは理解されるであろう。例えば、本発明の実施例は、フローサイトメトリー、血液検査、免疫アッセイ、臨床化学、血液化学分析、尿検査、血液ガス分析、ウイルス分析、バクテリア分析、電解質測定などに適合された取り外し可能カートリッジに応用可能である。また、取り外し可能カートリッジ４００などの本発明の取り外し可能カートリッジは、例えば、ガラス、シリコン、１つまたは複数のポリマーを含む好適な材料もしくは材料系、または他の好適な材料もしくは材料系、または材料もしくは材料系の組み合わせから作ることができることも考えられる。
【００７３】
例示的な取り外し可能カートリッジ４００は、第１の測定流路４０２および第２の測定流路４０４を備えるが、必要に応じて使用する測定流路を加減することも可能である。例示的な実施例における第１の測定流路４０２は、赤血球測定流路であり、第２の測定流路４０４は、白血球測定流路である。全血試料は、血液受口４０６を介して取り外し可能カートリッジ４０２より受け取られ、毛管作用により、知られている量の血液が抗凝血剤コーティング血液試料貯蔵毛細管４０８内に引き込まれる。試料押し（Ｐ）圧力が、試料押し流体貯蔵容器に加えられる。圧力が加えられると、試料押し流体が強制的に、試料押し流体貯蔵容器から血液試料押し流路４１０内に送り込まれる。
【００７４】
例示的ないくつかの実施例では、弁４１２およびフローセンサー４１４を血液試料押し流路４１０と一列になるように備えることができる。弁４１２は、血液試料を流体回路に押し通すことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４１４は、血液試料押し流体の流量を測定することができ、したがって、抗凝血剤コーティング毛細管４０８を通る血液試料流量を測定することができる。フローセンサー４１４から得られる流量は、取り外し可能カートリッジ４００に供給される試料押し（Ｐ）圧力を制御しやすくするために使用されうる。
【００７５】
例示的な実施例では、全血試料は分割され、ブランチ４１６を介して赤血球測定流路４０２および白血球測定流路４０４に送られる。例示的な実施例では、弁４１８は、赤血球測定流路４０２内に入る血液試料流を制御するためにブランチと一列になるように備えられ、弁４２０は、白血球測定流路４０４内に入る血液試料流を制御するように備えられる。
【００７６】
赤血球測定流路４０２を特に参照すると、赤血球球状化試薬圧力（ＳＰ）が球状化試薬貯蔵容器に加えられることがわかる。圧力が加えられると、球状化試薬貯蔵容器内の球状化試薬が強制的に、球状化試薬流路４２４内に送られる。
【００７７】
例示的ないくつかの実施例では、弁４２６およびフローセンサー４２８は、さらに、球状化試薬流路４２４と一列になるように備えることができる。弁４２６は、球状化試薬を流体回路に押し込むことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４２８は、球状化試薬の流量を測定することができ、球状化試薬流路４２４を通る球状化試薬の流量を測定することができる。フローセンサー４２８から得られる流量は、圧力源／コントローラにより取り外し可能カートリッジ４００に供給される球状化圧力（ＳＰ）を制御しやすくするために使用されうる。
【００７８】
例示的な取り外し可能カートリッジ４００の通常の機能動作中に、形状化試薬が球状化試薬流量の交差領域４３０内に押し込まれ、血液試料が血液試料流量の交差領域４３０に押し込まれる。血液試料流量および球状化試薬流量は、圧力源／コントローラにより制御されうる。
【００７９】
交差領域４３０は、球状化試薬が血液試料の周囲を流れる動作が、両方の流体が交差領域４３０内を流れるときに生じるように構成されうる。場合によっては、球状化試薬流量は、血液試料流量より高くてもよく、これにより下流のオンザフライ球状化流路４３２内の流量特性を改善し、場合によっては、球状化試薬により完全に、また一様に囲まれている薄いリボン状の血液を形成しやすくすることができる。このようなリボン状の流れは、オンザフライ球状化流路４３２内を移動するときに球状化試薬が赤血球を一様に球状化するのを助けることができる。さらに、オンザフライ球状化流路４３２の長さは、球状化試薬および血液試料の流量と併せて、血液試料が適切な時間の間に球状化試薬に曝されるように設定できる。
【００８０】
シース液（ＳＨ）圧力をシース液貯蔵容器に加えることができる。圧力が加えられると、シース液が強制的に、シース液貯蔵容器からシース流路４３４内に送り込まれる。例示的ないくつかの実施例では、弁４３６およびフローセンサー４３８をシース流路４３４と一列になるように備えることができる。弁４３６は、シース液を流体回路に押し込むことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４３８は、シース液の流量を測定することができ、シース流路４３４を通るシース流量を測定することができる。フローセンサー４３８から得られる流量は、取り外し可能カートリッジ４００に供給されるシース圧力（ＳＨ）を制御しやすくするために使用されうる。
【００８１】
例示されている実施例では、シース液は、シース液流量の交差領域４４０に供給され、球状化された血液試料は、球状化された血液試料の流量の交差領域４４０に供給される。球状化された血液試料の流量およびシース流量は、圧力源／コントローラにより制御されうる。
【００８２】
交差領域４４０は、シース液が球状化された血液試料の周囲を流れる動作が、両方の流体が交差領域４４０内を流れるときに生じるように構成されうる。いくつかの場合において、シース流量は、球状化された血液試料の流量に比べて著しく高く、下流のフローサイトメトリー流路４４２内のコア形成を改善するのに役立ちうる。例えば、いくつかのフローサイトメトリー用途では、この交差領域４４０は、それぞれの赤血球を取り外し可能カートリッジ４００内の光学的窓領域４４４を通過するときに分析器により個別に光学的に問い合わせできるように一列縦隊のコア内に球状化された血液細胞を流体力学的に集束させ、配列するように構成されうる。いくつかの場合において、サイトメトリー流路４４２を通過する流体は、オンボード廃棄物貯蔵容器に向けられる。
【００８３】
次に、白血球測定流路４０４を参照すると、白血球溶血剤圧力（Ｌ）が溶血剤貯蔵容器に加えられうることがわかる。圧力が加えられると、溶解液貯蔵容器内の溶血剤が強制的に、溶血剤流路４５４内に送られる。
【００８４】
例示的ないくつかの実施例では、弁４５６およびフローセンサー４５８は、さらに、溶血剤流路４５４と一列になるように備えることができる。弁４５６は、溶血剤を流体回路に押し込むことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４５８は、溶血剤の流量を測定することができ、溶血剤流路４５４を通る溶血剤の流量を測定することができる。フローセンサー４５８から得られる流量は、圧力源／コントローラにより取り外し可能カートリッジ４００に供給される溶解圧力（Ｌ）を制御しやすくするために使用されうる。
【００８５】
例示的な取り外し可能カートリッジ４００の通常の機能動作中に、溶血剤が溶血剤流量の交差領域４６０内に供給され、血液試料が血液試料流量の交差領域４６０に供給される。血液試料流量および溶血剤流量は、圧力源／コントローラにより制御されうる。
【００８６】
交差領域４６０は、溶血剤が血液試料の周囲を流れる動作が、両方の流体が交差領域４６０内を流れるときに生じるように構成されうる。場合によっては、溶血剤流量は、血液試料流量より高くてもよく、これによりオンザフライ溶解流路４６２内の流量特性を改善し、場合によっては、溶血剤により完全に、また一様に囲まれている薄いリボン状の血液を形成しやすくすることができる。このようなリボン状の流れは、オンザフライ溶解流路４６２内を移動するときに溶血剤が赤血球を一様に溶解するのを助けることができる。さらに、オンザフライ溶解流路４６２の長さは、溶血剤および血液試料の流量と併せて、血液試料が適切な時間の間に溶血剤に曝されるように設定できる。
【００８７】
シース液（ＳＨ）圧力をシース液貯蔵容器に加えることができる。圧力が加えられると、シース液が強制的に、シース液貯蔵容器からシース流路４６４内に送り込まれる。例示的ないくつかの実施例では、弁４６６およびフローセンサー４６８をシース流路４６４と一列になるように備えることができる。弁４６６は、シース液を流体回路に押し込むことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４６８は、シース液の流量を測定することができ、シース流路４６４を通るシース流量を測定することができる。フローセンサー４６８から得られる流量は、取り外し可能カートリッジ４００に供給されるシース圧力（ＳＨ）を制御しやすくするために使用されうる。いくつかの場合において、シース流路４６４を通るシース流量は、シース流路４３４を通るシース流量と同じである。しかし、他の場合には、シース流路４６４を通るシース流量は、シース流路４３４を通るシース流量と異なる場合もある。
【００８８】
例示されている実施例では、シース液は、シース液流量の交差領域４７０に供給され、溶解された血液試料は、溶解された血液試料の流量の交差領域４７０に供給される。溶解された血液試料の流量およびシース流量は、圧力源／コントローラにより制御されうる。
【００８９】
交差領域４７０は、シース液が溶解された血液試料の周囲を流れる動作が、両方の流体が交差領域４７０内を流れるときに生じるように構成されうる。いくつかの場合において、シース流量は、溶解された血液試料の流量に比べて著しく高く、下流のフローサイトメトリー流路４７２内のコア形成を改善するのに役立ちうる。例えば、いくつかのフローサイトメトリー用途では、この交差領域４７０は、それぞれの白血球を取り外し可能カートリッジ４００内の光学的窓領域４７４を通過するときに分析器により個別に光学的に問い合わせできるように一列縦隊のコア内に溶解された血液試料を流体力学的に集束させ、配列するように構成されうる。いくつかの場合において、サイトメトリー流路４７２を通過する流体は、オンボード廃棄物貯蔵容器に供給される。
【００９０】
いくつかの場合において、吸収測定流路も備えることができる。例示的な実施例では、溶解された血液試料の一部が吸収流路４８０に送られる。弁４８２は、溶解された血液試料の一部を選択的に、吸収流路または領域４８４に移動できるように備えることができる。分析器は、吸収流路または領域４８４を照らすための光源だけでなく、吸収流路または領域４８４内の溶解された血液試料により吸収されない光を検出するための検出器をも備えることができる。次いで、分析器は、バルク吸収ベースのヘモグロビン測定を行える吸収レベルを決定することができる。いくつかの場合において、吸収流路４８４は、必要ならば、サイトメトリー流路４７２の下流に配置されうる。他の場合には、全血試料は、ブランチ４１６などから吸収流路へ、直接供給されうる。そのような場合、吸収流路は、吸収測定を実行するのに先立って赤血球を溶解するための機構を備えることができる。例示的な取り外し可能カートリッジ４００は、全血試料に対し完全血球算定（ＣＢＣ）分析を実行するように適合されているが、他の取り外し可能カートリッジ構成および分析タイプも、必要に応じて使用できることが考えられる。
図１７は、取り外し可能カートリッジを使用して血液試料を分析するための例示的なアプローチを示す概略流れ図である。例示的なアプローチでは、ステップ６００で血液試料が最初に取得される。次に、血液試料が、取り外し可能カートリッジ内の抗凝血剤コーティング毛細管に送られる。次いで、血液試料は、分割され、赤血球および血小板（ＲＢＣ／Ｐ）測定流路６０４ならびに白血球（ＷＢＣ）測定流路６０６に送られる。
【００９１】
ＲＢＣ／Ｐ測定流路６０４内で、赤血球は、６１２に示されているように最初に球状化され、次いで、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路６１４の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの光源６１６は、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路６１４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に光を当てる。いくつかの場合において、ＶＣＳＥＬデバイスの配列が備えられ、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路６１４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞と揃えられる（複数の）ＶＣＳＥＬのみが活性化される。ＶＣＳＥＬにより送られる入射光の一部が散乱され、検出器６１８は、その散乱された光を検出する。いくつかの場合において、検出器６１８は、前方角度散乱光（ＦＡＬＳ）、小角度散乱光（ＳＡＬＳ）、および大角度散乱光（ＬＡＬＳ）を検出することができる。
【００９２】
いくつかの場合において、レーザー（または他の）光源は、細長い線光源として、または２つの別々のスポット光源として、ＲＢＣ／Ｐサイトメーター流路６１４内に集束される。ＲＢＣおよびＲＢＣ／Ｐサイトメーター流路６１４内の血小板は、集束光に通される。高品質集光光学系を使用することで、細胞の鮮明な像および集光を、縦軸がＲＢＣ／Ｐサイトメーター流路６１４内の流れの方向に直交するように配置された１つ、２つ、またはそれ以上の平行なスリットを含む不透明スクリーン上に形成することができる。これらのスリット間の距離は、例えば、ＲＢＣ／Ｐサイトメーター流路６１４内で予想される平均細胞分離距離の程度としてよい。これらのスリットを含む不透明スクリーンは、１つまたは複数の検出器６１８の前に置くことができる。細胞の像が１つのスリットを通り越すときに、これはスリット上に入射する光を遮り、検出器６１８上の信号を弱め、幅が細胞直径に比例するパルス波形を発生する。２つの相隔てて並ぶスリットが備えられた場合、２つの波形は、細胞流速の計算を許すものとなりうる。この技術を使用することで、高信号対雑音比が得られ、これにより、イベントの計数と、複数の細胞イベントの同定が容易に行える。さらに、パルスの幅と振幅で、いくつかの細胞タイプの弁別が可能になる場合がある。
【００９３】
いくつかの場合において、細胞と光源の両方の像が、検出器６１８の前に置かれた二重スリット開口上に結像される。この二重スリット開口は、明確に定められた幾何学的開口をなし、細胞を計数するための高い信号対雑音比をもたらす。上述のように、これらのスリットからの信号は、細胞流速の正確な測定を可能にし、次いで、細胞直径の計算も可能にしうる。
【００９４】
いくつかの場合において、６２０に示されているように、この分析の際に、例えば、試料流量（ＦＲ）、測定時間（Ｔ）の長さ、および試料希釈係数（ＤＦ）を含む、多数のパラメータを測定することができる。（複数の）検出器の出力、および／または対応する散乱シグネチャを監視することにより、赤血球数（ＮＲＢ）、血小板数（ＮＰｌｔ）、それぞれの細胞の直径（ｄｒｂｃ）を測定することができる。
【００９５】
これらのパラメータから、また６８２に示されているように、例えば、赤血球数（ＲＢＣ＝ＮＲＢ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、血小板数（Ｐｌｔ＝ＮＰｌｔ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、平均細胞ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ＝＜ＣＨＣ＞）、平均細胞体積（ＭＣＶ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃ３＞）、平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃ３×ＣＨＣ＞）、相対分布幅（ＲＤＷ＝［（π／６）×ｄｒｂｃ３］／ＭＣＶの標準偏差）、ヘマトクリットパラメータ（Ｈｃｔ＝ＲＢＣ×ＭＣＶ）、および／またはヘモグロビン濃度（Ｈｂ＝ＭＣＨＣ×Ｈｃｔ）を含む、多数の赤血球分析パラメータが計算されうる。
【００９６】
例示的なＷＢＣ測定流路６０６内で、赤血球は、６３２に示されているように最初に溶解され、次いで、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＷＢＣサイトメトリー流路６３４の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの光源６３６は、個々の細胞がＷＢＣサイトメトリー流路６３４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に光を当てる。いくつかの場合において、ＶＣＳＥＬデバイスの配列が備えられ、個々の細胞がＷＢＣサイトメトリー流路６３４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞と揃えられる（複数の）ＶＣＳＥＬのみが活性化される。ＶＣＳＥＬにより送られる入射光の一部が散乱され、検出器６３８は、その散乱された光を検出する。いくつかの場合において、検出器６３８は、前方角度散乱光（ＦＡＬＳ）、小角度散乱光（ＳＡＬＳ）、および大角度散乱光（ＬＡＬＳ）を検出する。いくつかの場合において、６４０に示されているように、この分析の際に、例えば、軸上細胞体積、全ＷＢＣ数、およびＷＢＣ ５分画を含む、多数のパラメータを測定することができる。
【００９７】
図１８は、多数の赤血球パラメータを取得するための例示的なアプローチを示す流れ図である。例示的なアプローチでは、ステップ６６０で血液試料が取得される。次に、血液試料が所望の希釈係数（ＤＦ）となるように希釈され、６６４に示されているように球状化される。次いで、希釈され、球状化された血球は、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの光源６１６は、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に光を当てる。（複数の）ＶＣＳＥＬにより送られる入射光の一部が散乱され、検出器は、その散乱された光を検出するために使用される。いくつかの場合において、検出器は、それぞれの細胞について前方角度散乱光（ＦＡＬＳ）と小角度散乱光（ＳＡＬＳ）の両方を検出する。次いで、プロセッサなどが、それぞれの細胞に対する２つの独立の散乱パラメータ、つまり、ＳＡＬＳおよびＦＡＬＳを、
｛ＳＳＡＬＳｉ，ＳＦＡＬＳｉ｝→｛ｄｒｂｃｉ，ＣＨＣｉ｝
のように細胞直径パラメータおよび細胞ヘモグロビン濃度パラメータにマッピングすることができる。
【００９８】
６７０に示されているように、散乱ＳＳＡＬＳｉプラスＳＦＡＬＳｉの強度が所定の検出閾値以下の場合、制御はステップ６６８に戻される。しかし、散乱ＳＳＡＬＳｉプラスＳＦＡＬＳｉの強度が所定の検出閾値よりも大きい場合、制御はステップ６７２に渡される。ステップ６７２で、ＳＳＡＬＳｉとＳＦＡＬＳｉの合計が所定の血小板閾値よりも大きいかどうかを判定する。ＳＳＡＬＳｉとＳＦＡＬＳｉの合計が所定の血小板閾値以下である場合、粒子「ｉ」は血小板であると判定され、制御は、ステップ６７４に渡される。ステップ６７４で、計数された血小板の数（ＮＰｌｔ）を１だけ増やし、制御をステップ６６８に戻す。
【００９９】
ＳＳＡＬＳｉとＳＦＡＬＳｉの合計が所定の血小板閾値よりも大きい場合、その細胞は赤血球であり、制御は、ステップ６７６に渡される。ステップ６７６で、計数された赤血球数（ＮＲＢＣ）を１だけ増やし、制御をステップ６７８に戻す。ステップ６７８で、所定の測定時間に達したかどうかを判定する。所定の時間に達していない場合、制御はステップ６６８に戻される。
【０１００】
ステップ６７８で、測定時間に達した後、制御はステップ６８０に渡される。ステップ６８０で、例えば、試料流量（ＦＲ）、測定時間（Ｔ）の長さ、試料希釈係数（ＤＦ）、計数された赤血球数（ＮＲＢＣ）、計数された血小板数（ＮＰｌｔ）、それぞれの細胞の直径（ｄｒｂｃｉ）、およびそれぞれの細胞のヘモグロビン濃度（ＣＨＣｉ）を含む多数の測定パラメータを示す。これらのパラメータから、またステップ６８２に示されているように、例えば、赤血球数（ＲＢＣ＝ＮＲＢＣ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、血小板数（Ｐｌｔ＝ＮＰｌｔ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、平均細胞ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ＝＜ＣＨＣｉ＞）、平均細胞体積（ＭＣＶ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３＞）、平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３×ＣＨＣｉ＞）、相対分布幅（ＲＤＷ＝［（π／６）×ｄｒｂｃｉ３］／ＭＣＶの標準偏差）、ヘマトクリットパラメータ（Ｈｃｔ＝ＲＢＣ×ＭＣＶ）、および／またはヘモグロビン濃度（Ｈｂ＝ＭＣＨＣ×Ｈｃｔ）を含む、多数の赤血球分析パラメータが計算されうるが、ただし、表記＜Ｘｉ＞は、すべての細胞Ｘｉにわたる平均細胞パラメータを意味する。
【０１０１】
図１９は、血液試料を分析するための他の例示的なアプローチを示す概略流れ図である。この例示的なアプローチでは、ステップ７００で示されているように、血液試料が取得され、血液試料貯蔵容器に送られる。次に、血液試料が、取り外し可能カートリッジ内の抗凝血剤コーティング毛細管に送られ、希釈される。次いで、血液試料は、分割され、赤血球および血小板（ＲＢＣ／Ｐ）測定流路７０４ならびに白血球（ＷＢＣ）測定流路７４０に送られる。
【０１０２】
ＲＢＣ／Ｐ測定流路７０４内で、赤血球は、７０６に示されているように最初に球状化され、次いで、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路７０８の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの第１の光源７１０および関連する光学系は、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路７０８の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に集光ビームを送る。いくつかの場合において、ＶＣＳＥＬデバイスの配列が備えられ、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路７０８の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞と揃えられる（複数の）ＶＣＳＥＬのみが活性化される。
【０１０３】
個々の細胞／粒子が集束入射光ビームを通過するときに、光の一部がブロックされ、散乱されるか、または他の何らかの方法で遮られるが、検出器により検出されうる（図に示されていない）。２つまたはそれ以上の光源がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路７０８にそって相隔てて並ぶ異なるスポット上に集束されると、それぞれの細胞の前縁および／または後縁が検出されうる。細胞が１つの集束スポットから次の集束スポットまでの距離を横断するのに要する時間を測定することにより、流量、したがって細胞速度が決定されうる。細胞速度が決定されると、細胞が光ビームをブロックするか、散乱するか、または他の何らかの方法で遮る時間の長さが、細胞サイズおよび／または細胞体積に相関されうる。
【０１０４】
いくつかの実施例では、分析器に他の光源７１４および関連する光学系が備えられうる。光源７１４の関連する光学系は、光を平行にし、ＳＡＬＳおよびＦＡＬＳ散乱などの軸外し散乱を測定することができる。上記のように、ＳＡＬＳおよびＦＡＬＳ散乱は、計数された赤血球数（ＮＲＢＣ）７１６、計数された血小板数（ＮＰｌｔ）７２２、それぞれの細胞の直径（ｄｒｂｃｉ）、細胞体積７１８、およびそれぞれの細胞のヘモグロビン濃度７２０（ＣＨＣｉ）を測定するために使用されうる。これらのパラメータから、また上述のように、例えば、赤血球数（ＲＢＣ＝ＮＲＢＣ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、血小板数（Ｐｌｔ＝ＮＰｌｔ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、平均細胞ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ＝＜ＣＨＣｉ＞）、平均細胞体積（ＭＣＶ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３＞）、平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３×ＣＨＣｉ＞）、相対分布幅（ＲＤＷ＝［（π／６）×ｄｒｂｃｉ３］／ＭＣＶの標準偏差）、ヘマトクリットパラメータ（Ｈｃｔ＝ＲＢＣ×ＭＣＶ）、および／またはヘモグロビン濃度（Ｈｂ＝ＭＣＨＣ×Ｈｃｔ）を含む、多数の赤血球分析パラメータが計算されうるが、ただし、表記＜Ｘｉ＞は、すべての細胞Ｘｉにわたる平均細胞パラメータを意味する。
【０１０５】
例示的なＷＢＣ測定流路７４０では、赤血球が溶解され、７４２に示されているように、染料が適宜注入される。次いで、細胞は、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＷＢＣサイトメトリー流路７４４の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの光源７４６は、個々の細胞がＷＢＣサイトメトリー流路７４４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に光を当てる。いくつかの場合において、ＶＣＳＥＬデバイスの配列が備えられ、個々の細胞がＷＢＣサイトメトリー流路７４４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞と揃えられる（複数の）ＶＣＳＥＬのみが活性化される。
【０１０６】
個々の細胞／粒子が集束入射光ビームを通過するときに、光の一部がブロックされ、散乱されるか、または他の何らかの方法で遮られるが、検出器により見つけることができる（図に示されていない）。２つまたはそれ以上の光源がＷＢＣサイトメトリー流路７４４にそって相隔てて並ぶ異なるスポット上に集束されると、それぞれの細胞の前縁および／または後縁が検出されうる。細胞が１つの集束スポットから次の集束スポットまでの距離を横断するのに要する時間を測定することにより、流量、したがって細胞速度が決定されうる。細胞速度が決定されると、細胞が光ビームをブロックするか、散乱するか、または他の何らかの方法で遮る時間の長さが、細胞サイズおよび／または細胞体積に相関されうる。
【０１０７】
いくつかの実施例では、分析器に他の光源７５０および関連する光学系および／または偏光器が備えられうる。光源７５０の関連する光学系は、光を平行にし、７５４に示されているように、ＳＡＬＳ、ＦＡＬＳ、およびＬＡＬＳ散乱などの軸外し散乱を測定することができる。上記と同様に、ＳＡＬＳ、ＦＡＬＳ、およびＬＡＬＳ散乱は、例えば、計数された白血球数（ＮＷＢＣ）７５２を測定するとともに、７５６に示されているように、白血球の分画を行いやすくするためにも使用することができる。いくつかの場合において、１つまたは複数の偏光器を備え、これにより、光源から発せられる光を偏光することができ、また検出器で検出された偏光消光／回転のレベルを使用して、白血球の分画を実行しやすくすることができるが、これはすべての実施例において必要というわけではない。
【０１０８】
血液試料中のヘモグロビン（Ｈｂ）の量またはヘモグロビン濃度を決定するために、別のモジュールが使用可能である。モジュールは、ヘモグロビン吸収を使用してＨｂを決定することができる。血液中のヘモグロビンの量は、グラム／リットルまたは他の単位の組み合わせで表すことができる。例示的な一実施例では、ＷＢＣサイトメトリー流路７４４を出た細胞を、バルク吸収流路７６０に送ることができる。光源７６２は、吸収流路７６０内に存在する細胞上に光を当て、検出器７６４は、常在細胞により吸収されない光を検出することができる。そこで、吸収流路７６０を、常在細胞のバルク吸収レベルを測定するために使用できる。例えば、吸収レベルは、血液試料中のバルクまたは平均細胞ヘモグロビン濃度の尺度となりうる。ヘモグロビン流路は、出力値再ゼロ調整光学系およびオートフォーカスおよび／またはアライメントを備えることができる。光源７６２は、吸収ピークの中心に近い出力を有するＬＥＤであってよく、したがって場合によってはフィルタが不要になる。ヘモグロビンに関して評価される試料を受け入れ、保持するためのキュベットがあってもよい。
【０１０９】
図２０は、ＨＧＢカード７７０またはモジュールの一実施例を示している。乾燥溶解粉末の堆積／プリントがある場所を示す溶血剤堆積領域７７１があってもよい。ＨＧＢ測定精度を改善するために乾燥溶解粉末により血液溶解時に発生する気泡をなくす気泡トラップ配置を示す領域７７３内の一番最後のターンにちょっと動かされたコーナー７７２がありうる。
【０１１０】
図２１は、散乱光学サブシステム５０１および蛍光光学サブシステム５０２を示すサイトメーターカートリッジ５００を示している。光学サブシステム５０１は、それぞれの側面流路５３０上に窓または開口部３０ａを備え、光学サブシステム５０２は、窓または開口部３０ｂを備えることができる。それぞれのサブシステムにおいて、流路５３０のそれぞれの側面に窓または開口部があってよい。これらの開口部は、光学的挿入物またはレンズを備えることができる。このサイトメーターは、人体に身につける、人体に取り付ける、または人体に挿入するように実装されうる。
【０１１１】
図２２は、それぞれ光学サブシステム５０１および５０２を組み込むことができるシステム５０３および５０４を示している。システム５０３は、さらに、コア流１６０内の白血球などの粒子の散乱測定のためＶＣＳＥＬ配列２２ａおよび検出器配列２４ａを備えることもできる。このシステムは、リンパ球および好中球の計数および分類に使用されうる。セルフアライメントも、赤色ＶＣＳＥＬ配列ベースの光学サブシステムにより使用可能にできる。ここでは散乱システム５０３の例示的ないくつかの実施について説明する。
【０１１２】
システム５０４は、白血球および血中タンパク質の特定のサブクラスを同定し、計数するために使用される蛍光励起および検出機構であってよい。白血球のサブクラスの検出は、好適な抗体が利用可能であれば使用可能にすることができ、これらの抗体の多くは蛍光性共役形態で市販されている。図２３は、血液組成と、蛍光システム５０４による計数および同定を適用されうる細胞の略図を示している。赤血球は、本明細書で説明されているように溶解によりサイトメーターを使って見られる試料から取り除くことができる。血小板は、白血球をチェックするときにサイズの小ささがサイトメーターの結果に影響を及ぼさないときに保持されうる。例示的な一実施例では、図２３の構造に示されている、ＣＤ４陽性Ｔ細胞５０５は、ＨＩＶ感染の臨床経過を辿る際に非常に重要と思われる血液中の割合および計数を有する。図２４ａに示されているように、ＣＤ４に関連付けられるマーカーを有する抗体を血液試料中で混合し、その結果として抗体（ＡＢ）５０６の「Ｙ」に見える構造とＣＤ４細胞５０５に付着しているそのマーカー（Ｍ）５０７を得る。光源２２ｂは、マーカー５０７により吸収されうる光を放射することができる。応答として、マーカー５０７は、蛍光を発し、ＣＤ４細胞５０５を同定するために検出されうる特定の波長の光を放射することができる。
【０１１３】
炭疽病について血液をチェックすることは、本発明のサイトメーターを使用できる他の応用である。炭疽をもたらすバクテリア５０９に対する抗体を血液試料と混合することができる。抗体は、バクテリア５０９と結びつきうる。これらの抗体は、光が衝突したときに蛍光を発するマーカー５１０を備えることができる。抗体５０８の「Ｙ」構造は、図２４ｂに示されている。マーカー５１０は、ＣＤ４細胞５０５に対する抗体５０６のマーカー５０７の帯域幅と異なっていてもよい特定の帯域幅の光を放射する。したがって、炭疽病問題は、異なる波長、色、またはシグネチャを有する蛍光発光による同じ血液試料検査におけるＨＩＶ問題と別に識別されうる。同じ血液試料中で同じときに検出される異なる問題の個数は、２つよりもはるかに多いことがある。
【０１１４】
他の例示的な実施例では、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（タンパク質の一種）は、骨髄抑制化学療法を受けている癌患者体内の好中球を計数することについて考慮することができる。この両方を行っている間、白血球数を正確に監視している必要があると思われる（特に、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）療法期間の好中球、単球、および血小板の個数）。本発明のサイトメーターは、自宅にいる化学療法患者のそのようなパラメータを監視するために未熟練者によって使用されうる。
【０１１５】
小型化された携帯型サイトメーターは、さらに、生物戦争でも使用できる。これは、生物兵器の定量的検出および同定に使用されうる。この検出および同定は、蛍光測定により実装されうる抗体−抗原タイプの免疫アッセイに基づくことができる。生物学的作用物質が存在する可能性がないか、環境、水、および食品が監視されうる。これは、サイトメーターに適した試料捕集および準備を伴うことがある。サイトメーターの他の用途としては、ハイスループット分析（蛍光検出機能を使用する）およびＤＮＡとＲＮＡの配列決定、潜在的薬物に対する細胞の反応の研究、白血病とリンパ腫の免疫表現型検査および癌患者の余病の監視、および起こりにくい事象の母集団の高速分離を含む、細胞選別および細胞単離がある。いくつかの用途および使用は、分析段階において操作者介入または調節を必要とせず、熟練者が計測装置を操作する必要がなく、とりわけ、一体型光学系および内部血液試料処理機能を有する衛生的な使い捨てのプラスチックまたは他の材料ベースのマイクロ流体カートリッジ１４を使用する、コンパクトな高精度流体駆動システムを有する低電力低コストの単一の小型化された携帯型一体型散乱および多色蛍光サイトメトリー計測装置により達成することが可能である。
【０１１６】
図２２のシステム５０４は、流路５３０内を一列縦隊で流れる粒子５１２に光５１１を当てるように位置決めされたレーザー光源２２ｂを備えることができる。例示されている目的に関して、粒子５１２は、それぞれ図２４ａおよび２４ｂの構造５１３および５１４を含むことができる。光５１１は、例えば、それぞれ６５０から７００ナノメートルまたは３８０から４２０ナノメートルの帯域幅を取りうる、発光ダイオード（ＬＥＤ）などの赤色または青色レーザー光源から放射できる。適切な波長を有する他のタイプの光源も、光５１１に使用できる。光５１１が蛍光マーカー５０７および５１０に当たると、これらのマーカーは、蛍光を発し、光５１５および５１６をそれぞれ放射することができる。これらのマーカーは互いに異なるため、光５１５および光５１６は、異なる波長を取りうる。したがって、構造５１３および５１４は、放射光の波長により識別可能であるが、同じ試料、血液、または他のものにおいて互いに区別できる。光５１５および５１６は、異なる方向にそれぞれを向けることにより２つのビームを分離する２色性ビームスプリッタ５１７に進むことができる。ビーム５１６は、光５１６を検出して電気信号５２０に変換しプロセッサ４０に送る蛍光検出器５１８に進むことができる。ビーム５１５は、光５１５を検出して電気信号５２２に変換しプロセッサ４０に送る蛍光検出器５２１に進むことができる。ビーム５１６の経路内にある、帯域通過フィルタ５１９は、ビーム５１６内に存在するように管理されている光源２２ｂからの光５１１を除去することができる。帯域通過フィルタ５２３は、ビーム５１５に対するフィルタ５１０と同じ目的でビーム５１５に対し使用されうる。鏡５２４は、検出システム５０４のパッケージングを小型化できるように、または他の理由から、検出器５２１の配置の目的に関してビーム５１５の向きを変えるために使用されうる。鏡５２４は、その一方で、ビーム５１５および５１６とは異なる波長の光５２５を分割する他の２色性ビームスプリッタであってよい。さらに他の周波数の光を分割するためにカスケード状の構造、または他の構造でさらに多くのスプリッタを使用することも可能であろう。さらに、プロセッサ４０に進むのは、散乱検出システム５０３の検出器配列２４ａからの信号である。光源２２ａおよび２２ｂは、１つの光源で置き換えることができることに留意されたい。
【０１１７】
スプリッタ５１７は、さまざまな波長の光を分離するか、または特定の波長を選択するため他の機構で置き換えることもできる。これらは、さまざまな種類のノッチおよびステップ関数フィルタ、同調可能回折格子、薄膜誘電体スタック、ミラービームスプリッタ、光バンドギャップフィルタ、フォトニック結晶、同調可能帯域通過フィルタ、エタロンくし形および他の構造、構造的または他のフィルタリング機能を持つ導光器を有するウェハ、または吸収／フィルタリングについて特定のサイズおよびピッチの導波路およびミシン目を有するシリコンまたはガラスウェハなどを備えることができる。
【０１１８】
図２５は、蛍光光学サブシステム５０２の例示的な一実施例を示している。ビーム５１１は、光源２２ｂにより放射され、窓３０ｂを通してマイクロレンズ５２６により粒子５１２に集束されうる。光ビーム５１１は、平行である場合もない場合もある。粒子５１２は、蛍光を発し、窓３０ｂ、薄膜コーティングフィルタ５２７、およびマイクロレンズ５２８を通して光ビーム５１５、５１６を放射するマーカーを有することができる。フィルタ５２７は、光源２２ｂからの光５１１を除去することができる。フィルタ５２７は、レンズ５２８の下に配置された誘電体スタックであり、光源２２ｂｎの光５１１をブロックするノッチまたはステップ関数フィルタとすることができる。レンズ５２８は、マーカーから放射された蛍光をビーム５１５／５１６に集束し、ビームはスプリッタ５１７などのビームスプリッタへ進むことができる。ビーム５１５／５１６は、平行である場合もない場合もある。不透明層または吸収層５２９は、流路５３０のガラス、石英、またはプラスチック（積層されているか、または積層されていない）基板５３１上の窓３０ｂまたはレンズ５２８の周り、または前後に形成されうる。層５２９は、光源２２ｂから放射される光５１１が蛍光５１５／５１６とともに出るのをブロックすることができる。層またはブロッキングフィルタ５２９は、ブロックされることが望ましい波長帯に対し黒色であるか、または不透明である薄膜とすることができる。フィルタ５２９は、ノッチまたはステップ関数フィルタとすることも可能であろう。他のガラス、石英、またはプラスチック（積層されているか、または積層されていない）基板５３２は、粒子５１２に対するコア流用の流路５３０を形成することができる。基板５３１および５３２、窓３０ｂ、ならびにレンズ５２６および５２８は、蛍光発する可能性のある成分を含んでいてはならない。例示的な一実施例では、光源２２ｂからの光５１１の方向は、粒子５１２から放射された蛍光５１５／５１６の方向に関して約９０度としてよい。光源５１１と放射された蛍光５１５／５１６との間の角度により、事実上、蛍光５１５／５１６とともに出てくる光源からの光が低減されるか、または除去されうる。実施例における光源２２ｂからの光５１１の方向の角度は、縦寸法流路５３０の方向または粒子５１２のコア流の方向に関して約４５度とすることができる。しかし、いくつかの用途では、光５１１と光５１５／５１６の方向の間の角度は、０から１２０度までの範囲とすることができる。
【０１１９】
図２６は、図２２のサイトメーター構成の図を示しているが、ただし、レンズ５４１および５４２が配置されている。本明細書で述べられているように、窓および開口部３０ｂは、レンズ５４１および５４２に加えてマイクロレンズを備えている場合も備えていない場合もある。単一の光源バージョン（光源２２ａと２２ｂの代わりに）も、類似のレンズおよび／またはマイクロレンズ光学配置を取ることができる。
【０１２０】
図２７は、手首または手のひらの周りに着けられるように適合された散乱および蛍光検出および監視の両方を行う小型化された携帯型サイトメーターの例示的な実施例を示す斜視図である。このサイトメーター８００は、図７、２１、３１、３３、および／または３７に示されているものと類似しているものとしてよい。バンド８０２は、小型化された携帯型サイトメーター８００をユーザーの手首に固定することができる。
【０１２１】
本明細書で示されているように、ユーザーは、取り外し可能カートリッジを取得し、血液試料を取り外し可能カートリッジの試料捕集装置口３２（図７、２１、２２、および２６を参照）に送ることができる。血液試料は、例えば、指に針を刺すことで集めることができる。ユーザーは、次いで、取り外し可能カートリッジを筐体内に挿入し、手動でシステムを加圧することができる。次いで、小型化された携帯型サイトメーターは、ユーザーが医療を求めるべきかどうかを示す読み取り値を与えることができる。この読み取り値は、視覚的読み取り値、可聴音、または他の好適なインジケータとすることができる。
【０１２２】
指を針で刺すなどの方法で血液試料を取得する代わりに、カテーテル８０４などをユーザーの静脈に挿入し、試料捕集装置口３２に取り付けることができる。これにより、システムは、読み取り値が必要な場合に血液試料をユーザーから自動的に捕集することができる。それとは別に、小型化された携帯型サイトメーターは、試料捕集装置口３２が好適な血液供給源に接続された状態でユーザー体内に埋め込むことができると考えられる。
【０１２３】
図２８に示されている流路８６５は、約１００×２００ミクロンの断面積を持つことができる。粒子８６８のコア流８６７は、約１５〜２０ミクロンの幅としてよい。光８６６のスポットは、６７０ｎｍの赤色光に対し約２０×１８０ミクロンとすることができる。図２８に例示されているように、コアは、粒子位置８７１および８７２により示されているように並んで移動することができる。一列縦隊の白血球８６８のコア流８６７に当たる光８６６からの散乱光８６９は、検出要素８７４で１から３度の帯域（ＦＡＬＳ）を測定し、散乱光８６９の検出要素８８１により３〜１１度の帯域（ＳＡＬＳ）を測定する光検出器８７３によりプロットすることができる。検出器８７３は、さらに、大角度散乱（ＬＡＬＳ）も測定することができる。
【０１２４】
純粋な散乱では、これらのタイプの白血球を同定することができる。ＦＡＬＳ対ＳＡＬＳデータについては図２９ａ、ＦＡＬＳ対ＬＡＬＳデータについては図２９ｂに散乱のプロットが示されている。図６ａおよび６ｂは、本明細書では、いくつかの実験試行結果からのＦＡＬＳ対ＳＡＬＳのプロットを示している。図２は、細胞の５分画を示している。図２９ａと２９ｂのプロットにより、５種類の白血球を同定することができ、曲線８８６はリンパ球を表し、曲線８８７は好中球を表し、曲線８８８は好酸球を表し、曲線８８９は好塩基球を表し、曲線８８０は単球を表す。図２８の検出器８７３は、環状検出器とすることができる。しかし、代わりに、直線状検出器であってもよい。環状検出器は、高品質の検出を行うことができるが、直線状検出器は、比較的安価である。
【０１２５】
白血球の種類のほかに、それぞれの種類にさまざまな種がありうる。例えば、リンパ球には、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、または他の種がありうる。種を同定するのに散乱とは別のアプローチが必要である。例えば、ＣＤ４にはＹ字型抗体があり、その抗体上に青色蛍光標識またはマーカーを付けることができる。他の色の蛍光標識で印を付けられるＣＤ５に対する他の抗体もありうる。さまざまな色に対する標識の計数は、他の波長の光ビームでマーカーまたは標識を励起することにより行うことができる。蛍光を検出するために、光増倍管を使用できる。ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＸＸなどの数が計数されうる。後のイベントは、散乱では実行されない。しかし、散乱は、それでも必要であり、余分な付着していない抗体による誤計数をなくすために使用されうる。
【０１２６】
全血を採って、溶解し（つまり、赤血球を除去し）、白血球と抗体で終わらせることができる。白血球は、抗体複合体を有することがある。リンパ球が１００個あった場合、種同定および計数を目的として１００個の抗体が必要であろう。ＣＤ４およびＣＤ５のほかの他の種についても抗体がありうる。種を見逃さないために、いくつかの余分な標識抗体がありうる。余剰分の抗体がありうるが、光散乱が細胞の計数に使用できるので、細胞に付着している抗体のみが計数される。光散乱は、標識されている付着してない抗体を探し出すために使用されうる。
【０１２７】
細胞の寸法は、１２ミクロン程度であるが、抗体の寸法は、数百ナノメートルの範囲である。磁気標識の使用など、標識付けには他のアプローチもありうる。重要な点は、ある種の白血球のそれぞれの種、例えば、ＣＤ４、ＣＤ５、．．．について、それぞれの種に対し別の、異なる色を必要とする場合があるという点である。例えば、単一流路内の２０個のさまざまな種を同定するために２０の異なる色が必要になる。
【０１２８】
励起された蛍光標識のさまざまな色が、１つのビームとして放射されうる。これらの色は、それぞれ異なる色に調節された一連のスプリッタで大きな力、または強引な力で分離させることができる。単一光ビームにおけるさまざまな色の分離および検出のよりコンパクトなアプローチは、プリズムまたは回折格子で分離するというものである。例えば、波長は、４００、４３０、４５０、．．．、６７０ｎｍなどとしてよい。
【０１２９】
生物学的種は、白血球のようなものに対する適切な基準としてよい。観察される試料は、環境からとったものでよく、炭疽菌とすることが可能であろう。ＣＤ４は、炭疽菌で置き換えることができる。言い換えると、抗体を使用することができ、またＣＤ４に使用される抗体を置き換えることができるということである。１つのシステム内で複数の薬剤などのさまざまなもののそれぞれに対し抗体が必要になるであろう。
【０１３０】
ポリクローナル抗体の代わりに、モノクローナル抗体を使用することができる。図２４ａには、図２４ｂのＣＤ４に対する抗体とＣＤ８に対する抗体を持つリンパ球の図がある。ＣＤ４に対する抗体があるが、ＣＤ８に進み、その結果誤計数が生じうる。これは、ポリクローナル抗体で生じうる問題といえる。この問題は、それぞれがＣＤ４、ＣＤ８、または他の指定された種にのみ付着するように特徴付けられるため、モノクローナル抗体で解決できる。モノクローナル抗体が、比較的高品質であり、ポリクローナル抗体よりもよい精度をもたらすとしても、後者は著しく安価である。モノクローナル抗体は、典型的には、ＣＤ４、ＣＤ５、および類似のドメインに使用されうる。
【０１３１】
指摘されているように、細胞にはサブクラスがありうる。種は、化学兵器作用物質とすることができる。作用物質は、マラリア、ＴＢなどを含むことができ。マラリアは、血液中にあり、したがって、マラリアに対する抗体がありうる。生物学的種は血液中にあり、化学兵器作用物質に水中にあり、疾病は血液中にありうる。３種類の生物学的種は、標識を有する抗体で同定することができる。
【０１３２】
抗原は、例えば、ＣＤ４に付着されたアンテナ（図２４ａ）のように見える。ハンドヘルド型サイトメーターで生物学的種の同定および計数を行うことで、世界中のへんぴな土地でも予防的ケアを実施することができる。ハンドヘルド型サイトメーターは、試料準備および分析のため完全自動化されうる。すべてのサイトメーターではないとしてもほとんどのサイトメーターが、単に指に針を刺して得られただけの試料では機能しない。後者は、サイトメーターの非熟練ユーザー向けに達成可能である。試料は、１月に１回だけ必要になると考えられる。レーザー穿刺は、本発明のサイトメーターで使用することができるが、このようなアプローチは、通常の指に針を刺す方法に比べて高価である。さまざまな他のサイトメーターシステムでは、かなりの量の血液を実際に採血する必要がある可能性がある。
【０１３３】
図３０は、平行アプローチに対するシステム９５０の光学的レイアウトを示している。このアプローチは、２色性ビームスプリッタ９６３、帯域通過フィルタ９６４経路、および検出器９７２が蛍光検出脚内で使用されるものとして定義されうる。検出器９７２は、ＰＭＴまたは他の好適なタイプの検出器とすることができる。光源脚は、流路９６７を照射する２つの光源（９６５、９６６）波長（青色４８８ｎｍおよび赤色６３０ｎｍ）を含むことができる。しかし、代わりに、光源が１つだけであってもよい。前方角度光散乱（ＦＡＬＳ）検出脚は、両方の光源波長において散乱光９６９の測定を可能にする帯域通過フィルタを備える２素子光ダイオード検出器９６８を備えるように示されている。蛍光信号に対しプロットされたときのＦＡＬＳ検出器からの散乱信号により、システムは関連付けられている抗原を持たない標識抗体を同定するので、検出感度が改善される。この平行アプローチでは、単純な検出読み取りを行える。このアプローチの特性は、このアプローチの平行という性質からシステムサイズを増やす結果となりうる４つよりも多い色への拡大、および／またはシステムが拡大されたときの、多数のビームスプリッタ９６３／帯域通過フィルタ９６４を含みうる。
【０１３４】
検出蛍光流路の数を増やせるようにしながらシステムの複雑度を低減するには、直線状検出器配列９５８からなるマイクロスペクトロメーターを使用してすべての蛍光スペクトルを記録する。図３１は、蛍光信号の測定用のスペクトロメーターベースのアプローチに対するシステム９６０の光学的レイアウトを示している。システム９６０は、２つの光源９６５、９６６、またはただ１つの光源を備えることができる。わかりやすくするため、ポンプシステム、電子回路、およびソフトウェアインターフェイスは、この図には示されていない。このアプローチでは、波長、または異なる蛍光染色により放射されるさまざまな色に応じて光を分離するために分散素子として使用されるプリズム９７１（または回折格子）を備えることができる。次いで、分離された色は、光増倍管（ＰＭＴ）配列９５８の個々の検出素子に向けて集束されうる。要約すると、このアプローチにおける蛍光検出脚は、マイクロスペクトロメーターとみなすことができる。ＦＡＬＳ検出脚は、図３０に示されている平行アプローチのＦＡＬＳ検出器９６８に類似のものでよい。検出脚内のマイクロスペクトロメーターを使用することにより、図３０に示されているアプローチと同様の複数の平行蛍光流路を不要にできる。マイクロスペクトロメーターは、ＣＣＤ検出器配列を備えることができる。これらの検出器配列は、標識抗体により発生する蛍光信号を適切に感知するために十分な感度を必要とし、毎秒１００〜１０００個の速度で流れる細胞からの離散信号については特に十分な感度が必要である。マイクロサイトメーター９５０は、小さなシステムフットプリントにおいて４つを超える色に拡大することができる。最大色数は、現在利用可能なのが１×３２ＰＭＴ配列であるため３２としてよい。しかし、マイクロサイトメーター９５０の色数を増やすために、さらに大きなＰＭＴ配列も利用可能である。図３１のシステム９６０では、プリズム９７１、格子などを光分散素子として使用できる。
【０１３５】
図３１では、ＰＭＴ検出器配列９５８は、システム９６０全体の信号対雑音比に関係する特定の充填率を持つことができる。しかし、光源の出力は、適宜変更することができ、カスタム光学系は、さまざまなＰＭＴ配列のピッチに合わせて手直しすることができる。検査のため、選択されたＢＷ薬剤および模擬薬に対しモノクローナル抗体を利用できるかどうかをチェックすることができる。モノクローナル抗体が利用可能なものに対する検査のため、適切な不活性化された薬剤／模擬薬を選択できる。
【０１３６】
図３２の表は、サイトメーター９５０または９６０のＡＩＤＳ／マラリアバージョンに組み込むことができる有意なパラメータを明らかにしている。この図は、ＡＩＤＳ／マラリア用途に使用できる光学ベースのサイトメーター９５０、９６０を示す。３流路（１つは散乱用、２つは蛍光用）アプローチが使用可能である。システムは、全体的サイズを大きく変えることなく６つ以上の流路に容易に拡大できる。例えば、検出空間内で全部で散乱流路１つ、蛍光流路４つを、計測装置用とすることができる（ＡＩＤＳおよびマラリアは、異なる蛍光流路を必要とすると仮定する）。ただし、白血球数を分画する（少なくとも３分画）機能は、特定の感染症（ウイルスおよびバクテリア）を診断し、監視するための計測装置の重要な拡張機能であると理解できる。技術的には、このような拡張機能は、３つの散乱流路（図３２においてオプションの散乱流路として説明されている）と場合によっては２つのサイトメーター測定流路をカード上に必要とする場合がある。しかし、１つの測定流量で十分と思われる。そのため、技術的なオプションとして、ＡＤＩＳ／マラリアＰＯＣサイトメーターの実験室内評価にこれを加えることを検討してもよい。照明側では、少なくとも１つの赤色抗原が、適切な蛍光プローブとともにＡＩＤＳアッセイに必要になる場合があり、また赤色と青色の両方の光源が、マラリアアッセイに必要になる場合がある。同じ赤色光源を、散乱測定と蛍光測定の両方に使用することができる。カートリッジの複雑さに関して、ＡＩＤＳアッセイとマラリアアッセイは両方とも、同じ数のフローセンサーおよび試薬貯蔵容器を必要とすることがある。ＡＩＤＳアッセイでは、同じサイトメーター測定流路および同じレーザー光源が、散乱測定と蛍光測定の両方に使用されうる。
【０１３７】
光学的サブシステムの基準アプローチでは、ＡＩＤＳとマラリアの両方に対する必要な性能を実現するには、細胞散乱（例えば、ＷＢＣ数および分画の種類）および多色蛍光（例えば、ＣＤ４／ＣＤ４５／ＣＤＸＸ同定、計数、およびマラリア種病原体決定）の両用の測定を必要とすると仮定できる。光学的サブシステムは、赤色励起蛍光プローブ、および複数の光学的散乱および蛍光流路と１つの光源との一体化を組み込むことができる。
【０１３８】
図３３（図３０に類似している）は、基準アプローチとしてみなせる光学的レイアウトを備え、蛍光検出脚において２色性ビームスプリッタ９６３、帯域通過フィルタ９６４、および検出器９７２の平行流路を有するシステム９５０を示している。光源脚は、使い捨て型試料カートリッジ９５２内に埋め込まれている流路９６７を照射する赤色（９６６）および青色（９６５）の波長（例えば、６３０ｎｍおよび４８８ｎｍ）の２つのレーザーを有することができる。しかし、代わりに、レーザーが１つだけであってもよい。図に示されているように、１つまたは複数の光源９６６、９６５は、光源をサイトメーター流路９６７のコア流９７４内の細胞９７３の流れに自動的に揃えることを可能にする一軸微小平行移動ステージの形態の自動アライメント機能を組み込むことができる。ＶＣＳＥＬ配列が光源として使用される場合、光源をコア流９７４の細胞９７３に揃える自動電子セルフアライメントを実行することができる（細胞の流れに揃う適切なＶＣＳＥＬを選択することにより）。この電子セルフアライメント機能により、ＰＯＣサイトメーターがメンテナンスフリーになり、開発途上国の現場で使用できる堅牢さを有することができる。
【０１３９】
図３３は、さらに、ＡＩＤＳ／マラリア用途に使用できる光学ベースのＰＯＣサイトメーターに対するアプローチを示す。３流路（１つは散乱用、２つは蛍光用）アプローチがここに示されている。このアプローチは、全体的サイズを大きく変えることなく６つ以上の流路に拡大できる。図を簡単にするため、散乱検出脚は、この図に示されていない（しかし、図３０には示されている）。散乱光は、全ＷＢＣ数を測定するために、ＦＡＬＳチャネルと従来から呼ばれている小角度の少なくとも１つの範囲（約１から３度）において必要になるが、ＳＡＬＳ（約５から１０度）およびＬＡＬＳ（大角度散乱）などのより高い角度における追加の角度ビンは、さまざまな種類の５つの異なる白血球を分画するために、必要になる場合がある（図２９ａおよび２９ｂに示されているように）。システム９５０のシリコン光ダイオード検出器９６８（図３０）は、小さな角度で散乱された光には適している場合があるが、小型光増倍管（ＰＭＴ）は、９０度散乱およびすべての蛍光流路に対してより効果的であると思われる。さらに、ＦＡＬＳ（約１から３度）検出器からの散乱信号が蛍光信号に対しプロットされた場合、システムは抗原を持たない標識抗体を同定することができ、その結果、検出感度が改善される。このアプローチの結果として、大半の市販の大きなベンチトップサイトメーターで使用される実証済みのアプローチに基づく単純な検出結果読み出しが行える。ＡＩＤＳとマラリアの両方のアッセイに、４つの蛍光検出流路があれば十分であると思われる。
【０１４０】
ＨＩＶアッセイについては、実験室用使い捨て型カートリッジまたはカード９５２上でＣＤ４／ＣＤ４５抗体−抗原捕捉により白血球を標識することができる。フローサイトメトリー検査では、カード９５２は、全血の試料約１０μＬを処理し、ＣＤ４およびＣＤ４５（および／またはＣＤＸ、ＣＤＸＸ）により白血球を染色し、赤血球を溶解し、残りの細胞をオンカードサイトメーター流路内に集めてＰＯＣサイトメーター９５０によりプレゼンテーションおよびサイトメトリー分析を実行することができる。これは、ＡＩＤＳ（ＣＤ４）アッセイに使用されるクレジットカードサイズの使い捨て型カートリッジ９５２とすることができる。カード９５２は、図３３に示されているように、フローセンサー９７５、オンザフライ溶解ループ９７６、オンザフライ染色ループ９７７、流路９６７、血液貯蔵容器９７８、および試薬貯蔵容器９７９を備えることができる。
【０１４１】
使い捨て型カートリッジ９５２内には検査用の処理があってよい。全血試料は、指に針を刺すことで得られる。血液は、オンカード試料ループ内で貯蔵できる。抗体および再水和緩衝液を用意することができる。また、血液細胞の標識付け（つまり、抗体抗原結合）も行える。次いで、赤血球が、オンカード溶血剤による溶解に出会う。溶解された血液は、細胞９７３がオンカードシース試薬とともに流路９６７内のコア流９７４として一列縦隊で集束される場所に進むことができる。細胞９７３に関する情報が得られた後、血液はオンカード廃棄物室に進むことができる。
【０１４２】
同様に、２色マラリアアッセイでは、さらに、カートリッジ上に試料、抗体−抗原捕捉、試薬混合、および他のアッセイプロトコルを一体化すすることができる。このアプローチは、マラリアアッセイを含むことができる。マイクロ流体力学ベースのアッセイでは、図３６の表の特徴の比較により示されるように、高価な試薬の消費量を減らし、アッセイ手順を簡素化し、今日のベンチトップサイトメーターで使用される従来のアッセイと比べて全体的アッセイコストを低減することができる。
フローサイトメーター９５０または９６０は、ＡＩＤＳ監視／マラリア診断のため遠隔地で使用できる。サイトメーター９５０または９６０のような迅速で、配備可能であり、低コストである（計測装置およびアッセイのコスト）計測装置は、市販の大型のフローサイトメトリーシステムに匹敵するか、またはそれ超えるよい結果をもたらしうる。それに加えて、マラリアの場合、これは、感染種を同定することができる低コストで、使いやすいＰＯＣフローサイトメトリースクリーニングの必要性を満たすことができる。携帯型サイトメーター９５０または９６０は、開発途上国世界のへんぴな地域でそのようなスクリーニングを行う場合にいくつかの利点を有すると思われる。これらの利点としては、特定の治療を必要とする可能性のある患者の迅速で簡単な識別、関連死亡率および疾病率を有する重度のマラリアへの進行の低減、寄生体抵抗の予防、および多くの人々の良好な患者予後が挙げられる。
【０１４３】
ＣＤ４および類似の監視について市販の、いくぶん小型化されているサイトメーターと本発明のサイトメーターとを比較すると、後者が最も有利であることがわかる。サイトメータープラットフォーム９５０または９６０は、開発途上国世界のポイントオブケア環境におけるマラリア診断洋の第１の実用的なサイトメーターベースのプラットフォームとみなすことができる。サイトメーター９５０または９６０は、安価で、携帯性に優れ、非熟練者にも扱いやすく、必要なメンテナンスの少ない、感染症のＰＯＣ診断および監視の最新技術を推進することができる。
【０１４４】
サイトメーター９５０または９６０は、ＡＩＤＳおよびマラリアのアッセイに対するフル機能を備えることができる。しかし、最初に、プログラム実行時に組み立てられるすべての計測装置の機械的筐体および固定具に、一部のスロットが埋まっていないとしても、全ＡＩＤＳ／マラリア測定機能用に空間とスロットを割り当てておくことができる。
【０１４５】
蛍光ビーズ、全血、およびマラリア模擬薬は、目標試料として使用することができる。機械的筐体に加えて、ＰＯＣ計測装置９５０または９６０は、複数のサブシステムを備えることができる。サブシステムのいくつかは、流体駆動装置（ポンプ）サブシステム、光学的サブシステム、駆動および感知電子回路、ならびにソフトウェアおよびグラフィカルユーザーインターフェイスを備えることができる。ＣＤ４アッセイでは、より複雑なゲーティング法ともよく合うように見える、Ｐａｎ−ｌｅｕｃｏｇａｔｉｎｇなどの確立されているゲーティングアルゴリズムを使用する計画を立てることもできる。
【０１４６】
駆動感知電子回路、アルゴリズム、およびソフトウェアは、所定の入力試料の模擬薬およびＢＷ薬剤などの臨床または環境試料を検査するように構成されうる。分析カートリッジにより、試料調製を行い（市販の試薬の化学的性質をカスタマイズする）、生物学的試料中のＢＷ薬剤を検出することができる。カードまたはカートリッジは、試料入口および試薬オンカード貯蔵容器を備えることができる。さらに、カードまたはカートリッジ上に、廃棄物保管貯蔵容器、抗体が抗原と混合される場所、および生物学的薬剤のサイトメトリー分析が少なくとも一部は実行される場所を用意することもできる。
【０１４７】
ポンプ機能は、ＰＯＣ分析器計測装置に関して注意すべき因子である場合がある。いくつかの血液学分析器およびフローサイトメーター内のポンプシステムは、ステッパーモーターにより駆動される注射器ポンプにより発生する体積制御流量に基づくことができる。このようなシステムは、正確であるが、かさばり／電力を食い、ＰＯＣ計測装置で使用するのには適さないと思われる。ＰＯＣ血液学分析器の開発の一環として、図３４に示されているように、閉ループで動作する小型化された圧力駆動（体積駆動とは反対の）ポンプシステムが使用可能である。ポンプシステムは、それぞれ試料９０３およびシース液９０４を供給するためマイクロ弁９０８とともに高圧および低圧室９０１および９０２を備えることができる。試料９０３およびシース液９０４の流れの量は、フローセンサー９０５および９０６により決定されうる。流量指示は、制御ループ制御電子回路９０７に進むことができる。電子回路９０７は、フローセンサー９０５および９０６からの指示に基づき、信号をポンプシステムに送信し、流体９０３および９０４の流れをいくつかの所望のレベルに制御することができる。試料流体９０３およびシース液９０４は、ポンプで多岐管９０９内に送り込むことができる。多岐管９０９から、試料９０３およびシース９０４がサイトメーター９１０および流体チップ９１１上のその流路９６７内に入ることができる。
【０１４８】
本発明のサイトメーターでは、閉ループで動作する小型化された圧力駆動（体積駆動とは反対の）ポンプシステムが使用できる。このような多くの動作原理は、マイクロポンプを使用して生成される高圧空気源を伴うことができる。低い、正確に制御される圧力は、小型化された弁の配列を使用することによりこの高圧空気源から生み出すことができる。これらの弁は、それぞれの流路に対し所望の流量を確保するためにそれぞれの流路内に取り付けられたマイクロフローセンサーを備える閉ループ構成で使用されうる。いくつかのこのようなポンプが組み立てられ、特徴付けられ、うまく行くことが証明されている。図３５ａおよび３５ｂのグラフは、高精度の低および高流量がこの技術により得られることを示している。これらのグラフは、図３５ａのプロット９６１により示されている２〜３μＬ／分および図３５ｂのプロット９６２により示されている１５０〜２００μＬ／分の流量範囲においてこのポンプシステムの２つの流路の流量を高い精度（１％の精度）で制御することを示すデータを明らかにしている。さまざまな試薬および血液試料の流量の制御が高精度であるということは、血液細胞の数の測定も高精度であるということである。本発明のＰＯＣサイトメーターでは、ＡＩＤＳおよびマラリアのアッセイに必要ないくつかの小さな修正を追加の流路に加えただけで、この閉ループポンプ技術を使用することができる。
【０１４９】
さまざまなアッセイにおいて、カートリッジ９５２（カートリッジ）上のマイクロ流体力学ベースのアッセイには、図３６に示されているようにベンチトップサイトメーター（ベンチトップ）に勝る多数の利点を有すると考えられる。カートリッジは、全血試料を約１２μＬだけ必要とするが、ベンチトップでは、約１００μＬを必要とする。ベンチトップでは、４つの希釈ステップが使用され、カートリッジでは何も使用されない。モノクローナル抗体を無理なく取得する難しさを考えると、カートリッジでは０．６μＬだけ（最適化されていない）あればよいが、ベンチトップでは５μＬが必要である。カートリッジについては、インキュベーションステップの数と持続時間は、２つあり、１つは室温で２０秒間であり、もう１つも室温で２０秒間である。ベンチトップについては、インキュベーションステップは、４０℃で３０分間のものと、室温で５分間のものを含む。使用される溶解溶液の量は、カートリッジとベンチトップとでそれぞれ５００μＬと１．４ｍＬである。サイトメトリー測定時間は、カートリッジもベンチトップも約２〜３分である。
【０１５０】
サイトメーターでは、カートリッジ上に試薬貯蔵容器９７９があり、マイクロフローセンサー９７５が埋め込まれうる（図３０、３１、３３）。カード９５２では、ＣＤ４およびＣＤ４５抗体の貯蔵溶液（０℃〜４℃で貯蔵される）を使用することができる。乾燥されたＣＤ４およびＣＤ４５抗体をカード上のマイクロ流体流路内に直接プリントするプロセスがありうる。生物学的試薬のナノリットル体積分をプラスチック表面に堆積することができる。試薬が乾燥されマイクロ流路内に入れられた後、低温積層プロセスを使用してこれらの流路を封止することができる。次いで、試薬は、正しい細胞に標識する生物学的活性を保持するように緩衝液（これもカード上に貯蔵される）により再水和され、使用時にカード上で血液と混合されうる。制御カードは、基準として類似のカード内の非乾燥試薬を伴うことができる。マイクロ流路内の試薬を乾燥させ、乾燥した試薬を、正しい細胞を標識する生物学的活性を保持するように再水和するプロトコルがありうる。
【０１５１】
ポイントオブケア診断用途向けの一体化プラスチック製使い捨て型カード９５２を生産する系統だったアプローチがありうる。所定の用途に対する複数のマイクロ流体機能は、最も単純な形態（サブサーキットと呼ばれる）に還元することができる。例えば、カード内への１滴の試薬の適切なアライメントと捕捉は、カード内の初期サブサーキットであってよい。このカードにより、ユーザーは１滴の血液（指に針を刺して得られる）を採り、次いで（吸引を介して）少量（約１０から３０μＬ）の試料を指の圧力でカード内に引き込むことができる。マイクロ流体流路内で一定方向に空気および液体を通すことを許すマイクロ逆止弁がありうる。これらの弁を、カード内に組み込むことができる柔軟な空気袋と併用すると、エンドユーザーは測定された体積の試薬を容易に取得できる。サブサーキットは、動作可能なカード内に組み込むことができる。
【０１５２】
使い捨て型分析カートリッジ９５２に超低自己蛍光材料を使用することができる。環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）ベースのプラスチックは、４８８ｎｍでガラスと同程度の、またはそれよりもよい自己蛍光特性を持つことができ、また非常によい防湿層となりうる。この材料のガラス転移温度は、等級に応じて、約７０から１８０℃としてよい。ＣＯＣポリマーは、４８８ｎｍで非常に高い光透過率（＞９５パーセント）を持つことができる。
【０１５３】
４８８ｎｍにおけるガラス状自己蛍光特性を有する低コストプラスチックが識別され、使い捨て型分析カード９５２上に光学的窓および／またはレンズ（例えば、図３３のレンズ９９２）を形成するために使用されうる。特定のプラスチック群は、ＣＯＣ（Ｔｏｐａｓ（商標））および他のそのようなポリマーを含むことができる。それに加えて、これらの光学的窓は、さらに、石英、Ｐｙｒｅｘ（商標）、および他のガラスまたはガラス状材料で作ることができる。各種ＣＯＣは、非常に低いレベルの自己蛍光を持つことができるため、蛍光フローサイトメトリー用の使い捨て型マイクロ流体カードで使用するのに非常に適していると思われる。ＣＯＣプラスチックは、他のガラス材料と異なり、カード製造プロセスに容易に組み込める。これらのプラスチックの複屈折性は、ポリカーボネート、ポリスチレン、およびアクリルに比べて低くてもよい。ＣＯＣプラスチックは、非常によい耐薬品性を有するように思われ、また軽量であり、粉砕に強く、生体適合性もある。これらは、可視光線波長で約９２パーセントの透過率、約１．５３３の屈折率、および５６のアッベ数を持つことができる。これらのプラスチックは、さらに、良好な寸法安定性および高ガラス転移温度も持つことができる。
【０１５４】
フローサイトメトリー検査では、カード９５２は、全血の試料約１０μＬを処理し、ＣＤ４およびＣＤ４５抗体抗原捕捉により白血球を染色し、赤血球を溶解し、残りの細胞をオンカードサイトメーター流路内に集めてＰＯＣサイトメーター９５０によりプレゼンテーションおよびサイトメトリー分析を実行することができる。ＡＩＤＳ（ＣＤ４）アッセイおよびその操作手順に対するクレジットカードサイズの使い捨て型カートリッジ９５２が、それぞれ図３７および３８に示されている。カード９５２は、フローセンサー９７５、オンザフライ溶解ループ９７６、オンザフライ染色ループ９７７、流路９６７、血液貯蔵容器９７８、および試薬貯蔵容器９７９を備えることができる。
【０１５５】
図３８は、システム９５０、９６０の使い捨て型および／またはマイクロ流体カートリッジ９５２内における操作手順のプロセス図を示している。全血試料は、ブロック９８１で指に針を刺すことで得られる。血液は、ブロック９８２でオンカード試料ループ内に貯蔵できる。セクション９８４では、セクション９８５へのオンカード抗体（モノクローナルおよびポリクローナル）を供給することができる。また、ブロック９８２からの血液は、血液細胞の標識付け（つまり、抗体抗原結合）が行われるセクション９８５に進むことができる。セクション９８５から、血液は、赤血球がブロック９８７からのオンカード溶血剤による溶解に遭遇するセクション９８６に進むことができる。溶解された血液は、細胞９７３がブロック９８９からのオンカードシース試薬とともに流路９６７（図３３）内のコア流９７４として一列縦隊で集束されるセクション９８８に進むことができる。細胞は、計数され、分類されうる。細胞９７３に関するさまざまな情報項目が得られた後、血液はブロック９９１でオンカード廃棄物室に進むことができる。
【０１５６】
材料選択は、正しく機能するカードを得るためにカード９５２の加工プロセスでは重要なものと思われる。さまざまな可能な用途、化学的性質、および最適な性能となるように一体化できる他のコンポーネントを考えると、すべてのカード設計のニーズを満たす普遍的なプラスチックは存在しないように見える。むしろ、所望のカードの機能の仕様とバランスのとれるさまざまなプラスチックおよび接着剤がある。４８８ｎｍ（青色）および６３０ｎｍ（赤色）で好適な材料不透明性について、さまざまな候補プラスチックフィルムを評価することができる。それに加えて、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ社のＡｃｌａｒ（商標）フィルムなどの非常によい防湿層特性を持つプラスチックに注目するとよい。フィルムのバリア性は、液体が乾燥（Ｈ２Ｏ移動）してしまうのを防ぎ、さらにはｐＨドリフトを防ぐ（Ｏ２およびＣＯ２の移動を最小にする）うえで重要な役割を果たしうる。材料選択は、市販の使い捨て型カードが最大１年間周囲温度で安定し、開発途上国世界の辺境地で使用するのに好適であるという目標が与えられた場合に特に重要であると思われる。
【０１５７】
本明細書では、問題のいくつかは、他の方法または時制で述べられていけれども仮説的または予言的性質を有するものとすることができる。
本発明は、少なくとも１つの例示的な実施例に関して説明されているけれども、本明細書を読んだ後、多くの変更形態および修正形態が当業者に明らかなものとなるであろう。したがって、付属の請求項が従来技術に関して可能な限り広く、そのようなすべての変更形態および修正形態を含むものと解釈されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】ポイントオブケア計測装置のブロック図である。
【図２】白血球の５分画のグラフである。
【図３】抗原を有する白血球の図である。
【図４ａ】３次元透視図法で細胞のプロットを示した図である。
【図４ｂ】観察者が右側のプラットフォームのエッジをのぞき込んでいるときに見えるものを表した図である。
【図５ａ】左のピークが右のピークに相対的に弱いことを除き、図４ａのと似た細胞のプロットの図である。
【図５ｂ】この図での向きを変更したことを除き、図５ａのプロットと同様の図である。
【図６ａ】複数のサイズを有するビーズの計数および分類のグラフである。
【図６ｂ】３種類の白血球の分画のグラフである。
【図７】小型化された携帯型サイトメーターの斜視図である。
【図８】小型化されたサイトメーターの略図である。
【図９】カバーが押し下げられていない状態の小型化されたサイトメーターのより詳細な略図である。
【図１０】カバーが押し下げられている状態の小型化されたサイトメーターのより詳細な略図である。
【図１１】流体力学的絞り込みコンポーネントによるフロー流およびコアの形成を示す図である。
【図１２】コア流の分析用の光源と検出器の配列の図である。
【図１３】ガウス光点の図である。
【図１４】光散乱体に対する光源および検出器の配置の図である。
【図１５】流路に近接する光源および対応する検出器の３つのセットの図である。
【図１６】例示的なカートリッジのいくつかの特徴の略図である。
【図１７】血液試料を分析するための例示的なアプローチを示す概略流れ図である。
【図１８】多数の赤血球パラメータを取得するための例示的なアプローチを示す流れ図である。
【図１９】血液試料を分析するための他の例示的なアプローチを示す概略流れ図である。
【図２０】ヘモグロビン測定精度を改善するために溶血剤堆積領域および気泡トラップを有するカードを示す図である。
【図２１】散乱サブシステムおよび蛍光光学サブシステムを備えるサイトメーターカートリッジの図である。
【図２２】散乱および蛍光サブシステムの光学配置の略図である。
【図２３】血液の成分の図である。
【図２４ａ】細胞の蛍光同定のため細胞にマーカーを付着させた抗体を示す図である。
【図２４ｂ】細胞の蛍光同定のため細胞にマーカーを付着させた抗体を示す図である。
【図２５】流路の蛍光光学サブシステムの図である。
【図２６】レンズ装着蛍光光学サブシステムの略図である。
【図２７】手首に付けるために小型化されたサイトメーターを示す図である。
【図２８】光散乱検出器を備える流路の端面図である。
【図２９ａ】白血球の３分画を明らかにするＦＡＬＳデータとＳＡＬＳデータとの関係を示すプロットである。
【図２９ｂ】図２９ａの白血球に加えて、さらに２種類の白血球の分画を明らかにするＦＡＬＳデータとＬＡＬＳデータとの関係を示すプロットである。
【図３０】小型サイトメーターカートリッジに関連する２色性ビームスプリッタタイプの光学系の略図である。
【図３１】小型サイトメーターカートリッジに関連するプリズムビームディスクリミネータタイプの光学系の略図である。
【図３２】ＡＩＤＳおよびマラリアアッセイのさまざまなパラメータに対する構成要素を示す表である。
【図３３】図２５の関連する光学系を備えるより詳細な小型サイトメーターカートリッジの略図である。
【図３４】血液学分析器およびフローサイトメーターなどのポイントオブケア計測装置の閉ループポンプシステムを示す図である。
【図３５ａ】閉ループポンプシステムの流速精度を示すグラフである。
【図３５ｂ】閉ループポンプシステムの流速精度を示すグラフである。
【図３６】小型サイトメーターおよびベンチトップサイトメーターの比較結果を示す表である。
【図３７】ＡＩＤＳ（ＣＤ４）アッセイを行うための小型カートリッジレイアウトの図である。
【図３８】免疫アッセイおよび血液学検査の用途を有する小型カートリッジの操作手順を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年１２月２９日に出願した米国仮特許出願第６０／７５５，０１４号の利益を主張する。
本出願は、２００５年１２月２２日に出願した米国仮特許出願第６０／７５３，２９３号の利益を主張する、２００６年１２月２２日に出願した米国特許出願第１１／６１５，８８４号の一部継続出願である。
【０００２】
本出願は、２００４年５月１４日に出願した仮特許出願第６０／５７１，２３５号の利益を主張する、２００５年５月１２日に出願した米国特許出願第１０／９０８，４６０号の一部継続出願である。
【０００３】
本出願は、２００４年５月１４日に出願した仮特許出願第６０／５７１，２３５号の利益を主張する、２００５年５月１２日に出願した米国特許出願第１０／９０８，４６１号の一部継続出願である。
【０００４】
本出願は、２００４年９月２７日に出願した米国特許出願第１０／９５０，８９８号の一部継続出願である、２００５年１２月３０日に出願した米国特許出願第１１／３０６，５０８号の一部継続出願である。
【０００５】
本出願は、２００２年１１月２６日に出願した米国特許出願第１０／３０４，７７３号の一部継続出願である、２００４年９月９日に出願した米国特許出願第１０／９３８，２６５号の一部継続出願である。
【０００６】
本発明は、サイトメトリー、特に携帯型サイトメトリーに関するものである。より具体的には、本発明は、血液分析に関する。
【背景技術】
【０００７】
ＨＩＶおよびマラリアは、死亡率と疾病率のいくつかの主要原因のうちの２つであり、それぞれ、即座の診断と効果的な治療で予防可能である。これらの疾病は両方とも全世界の途方もない負担となっているが、これが発生しているのがサハラ砂漠以南のアフリカである。マラリア原虫血症の有病率は、ＨＩＶ感染とともに増大し、マラリアの発生率は、ＨＩＶ感染とともに増大し、ＨＩＶは、マラリア患者が重度のマラリアを発症する危険性を増大し、マラリア予防または治療はＨＩＶ重感染に対しては有効性が低い場合があることを示唆する証拠が挙げられている。ＨＩＶを監視する場合、注目するマーカーは、ＣＤ４＋リンパ球であり、ＣＤ４枯渇は、ＨＩＶ疾病の発病に直接リンクしているように見える。
【０００８】
全白血球数またはリンパ球数の変動は、ヒトのＣＤ４数に影響を及ぼす可能性があることに留意されたい。これは、変化の少ないＣＤ４パーセンテージについて話すのを好む人たちもいるからである。
【０００９】
完全血球算定（ＣＢＣ）を指令すると、ヘマトクリットおよびヘモグロビン（赤血球に関する情報が得られる）と白血球数を求めることができる。「分画」は、異なる種類の白血球を、また好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球のパーセンテージを示すことができる。ＨＩＶで注目するのは、リンパ球である。
【００１０】
Ｔ細胞数（ＣＤ３数）は、ＣＤ４数およびＣＤ８数を含むことができる。比ＣＤ４／ＣＤ８は、もはや頻繁には使用されないであろう。これらの測定に対し、高い数値が最良であるように見えるが、ウイルス量、絶対数のＣＤ４数、およびＣＤ４パーセンテージに注意を払うことによりある種の混同を避け、比ＣＤ４／ＣＤ８を無視することができる。
【００１１】
ＣＤ＋４（Ｔヘルパーともいう）リンパ球は、人体の免疫学的防御に関与している可能性がある。ＨＩＶ感染によりそれが喪失すると、免疫系が徐々に低下し、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）に関連する症状に進行する可能性がある。治療ガイドラインでは、抗レトロウイルス薬物療法をいつ開始すべきかを決定すること、治療計画がどれだけよく働いているかを評価すること、および代替え投薬計画への切り換えが必要かどうかを決定するのを補助することのために定量的ＣＤ４＋リンパ球およびＨＩＶウイルス量検査を使用する必要がある場合がある。
【００１２】
開発途上国のＨＩＶ感染者が増加の一途を辿り、ヘルスケアサービスに過度の負担をかけ、圧倒し続ける。大半の開発途上国では、既存の検査方法があまりにも高価で複雑であるため、ＨＩＶ感染者のＣＤ４＋リンパ球数を監視する既存の施設は、限られているか、または存在していない。ＣＤ４＋リンパ球を監視するための単純で、安価で、半定量的なアプローチが利用可能であれば、以下の疾病および公衆衛生への影響が生じうる。ＣＤ４＋リンパ球レベルを検査し、監視するための簡素化された、低コストの、使いやすいデバイスを実現すると、ＣＤ４検査をふつうに、一貫して利用することが可能になり、これによりＨＩＶ治療の有効性が高まり、薬剤耐性が低減されるが、これは開発途上国世界においては非常に価値のあることと思われる。
【００１３】
マラリアによる感染の早期の正確な診断は、効果的な疾病管理には重要であり、また脳マラリアなどの合併症の進行と発症を防ぐのにも重要である。マラリアの２つの最も伝染力の強い普通種は、熱帯熱マラリア原虫（Ｐ）および三日熱マラリア原虫であり、したがって、安価で、使いやすいデバイスを介してこれら２つの種を同定できれば、開発途上国世界にとって大いに有益であろう。
【００１４】
２００５年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／７５３，２９３号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００５年１２月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／７５５，０１４号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００５年５月１２日に出願された米国特許出願第１０／９０８，４６０号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００５年５月１２日に出願された米国特許出願第１０／９０８，４６１号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００５年１２月３０日に出願された米国特許出願第１１／３０６，５０８号は、参照により本明細書に組み込まれる。２００４年９月２７日に出願された米国特許出願第１０／９５０，８９８号の一部継続出願は、参照により本明細書に組み込まれる。２００４年９月９日に出願された米国特許出願第１０／９３８，２６５号は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、１つのポイントオブケア（ＰＯＣ）マイクロ流体計測装置プラットフォームで免疫アッセイおよび血液学検査を行うことができる装置である。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
診断、監視、および生命科学の用途向けのポイントオブケア（ＰＯＣ）計測装置の需要が増大している。ＰＯＣフローサイトメーターの重要な用途の１つは、投薬（ＡＲＴ）中のＡＩＤＳ（ＨＩＶ感染）患者および他の疾病を患っている患者を含む他の患者を監視することである。フローサイトメーターは、マイクロ流体フォーマットでこれらのアッセイを実施する。
【００１７】
本発明は、ポイントオブケア計測装置用にＣＤ４／ＣＤ８／ＣＤＸＸアッセイ（ＨＩＶ感染患者に使用される）を実施するアプローチを実現する。このアッセイは、使い捨て型プラスチック製分析カードのマイクロ流体フォーマットで実装されうる。カードは、ＣＤＸＸアッセイを実行することができるだけでなく、さらに総白血球数／白血球分画の検査も実行できる。本発明は、単一のマイクロ流体カートリッジ上で組み合わせることができるそれぞれのモジュールとなっている２つの検査（ＣＤＸＸ検査または免疫アッセイ検査および血液学検査）を実施することができる。カートリッジは、積層構造であるか、または少なくとも部分的には、成形構造としてよい。カートリッジの材料としては、さまざまなタイプのプラスチックおよびガラス材料が考えられる。他の材料も、例えば、埋め込まれる電極などの特定の電気的コンポーネントに対する導電性材料などを適宜構造の中に使用できる。
【００１８】
マイクロ流体フォーマットのいくつかの利点として、試薬消費量が最小である（したがって、検査コストが低い）、両方の検査が同じカード上で実行されるため使いやすい、試料調製手順が簡素化されている（３０分間のインキュベーションがない）などが挙げられる。本発明は、マイクロ流体カートリッジ上にマイクロ流体フォーマットで異なるアッセイ機能を実装することを含むことができる。これらの機能は、混合、分離、濾過、洗浄、予備濃縮、溶解、選別などを含むことができる。
【００１９】
本発明は、白血球試料入力から得られた白血球を計数し、分類することができるＰＯＣ統合散乱および蛍光フローサイトメーターとしてよい。本発明のＰＯＣ計測装置は、ＣＤ４監視（ＣＤ４絶対数およびパーセントＣＤ４）に使用されうる。このサイトメーターは、ハンドヘルド型計測装置およびクレジットカードサイズの使い捨て型分析カートリッジで構成することができる。使い捨て型カートリッジは、オンボード試薬貯蔵容器（希釈液、溶解液、およびシース液）、全血試料捕捉毛細管、およびオンボード液流センサーを備えることができる。サイトメーターシステムは、カートリッジ上の自動化試料調製機能、赤色ＶＣＳＥＬ配列ベース電子セルフアライメント機能、超小型３流路ポンプシステム、ならびにカスタム開発電子回路およびグラフィカルユーザーインターフェイスを備えることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
図１は、ポイントオブケア（ＰＯＣ）計測装置およびその動作のブロック図である。全血試料は、ブロック１１１で持ち込むことができる。全血の一部は、溶解ウェル１１２に通され、そこで主にブロック１１３で白血球を得るために赤血球を除去することができる。白血球の一部は、ブロック１１４で散乱ベースサイトメトリーに入り、その結果、ブロック１１５で白血球の個数と５分画が得られる。
【００２１】
ブロック１１３から、一部の白血球は、さらに、蛍光標識抗体でインキュベートするためにブロック１１６に入ることができる。これは、ブロック１１７で、ＣＤ４、ＣＤ、マラリア寄生体、結核（ＴＢ）などの指標および／または量に関する情報を得るためである。
【００２２】
さらにブロック１１１からは、全血一部が、散乱およびサイトメトリーブロック１１８に入り、ＲＢＣ数とヘマトクリットデータを取得することができる。ここでもまた、ブロック１１１から、全血はブロック１２０に入り、血液中のヘモグロビンの量に関する溶解および吸収ベースの情報得ることができる。図１のブロック内の項目は、マイクロ流体カートリッジまたはカード上で実装することができ、血液学分析器とみなすことができる。カートリッジの主な目標の１つは、赤血球数、白血球数、ヘモグロビン量、ヘマトクリットデータ、血小板数、および白血球の５分画を含むことができる完全血球算定パラメータを得ることである。ブロック１１５、１１９、および１２１では、完全血球算定を行うことができる。ブロック１１７は、蛍光で分析を行うことができる。２つの主要な操作は、通常のクレジットカードほどの小ささで、使い捨てのマイクロ流体カートリッジ上に実装され、実施されうる。
【００２３】
白血球を５群に分画した後、それらの群の１つまたは複数は、さらに、複数の小群に分画されうる。これらの群の１つであるリンパ球は、蛍光またはフルオロ標識またはマーカーで標識されうる。細胞は、カートリッジ上に用意されうる貯蔵容器からの抗原と抗体を有し、抗体は、特定の抗原に結合することができる。リンパ球の小群への分類は、臨床的な意義を持つことがある。小群への分類の結果、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤＸ、ＣＤＸＸ細胞の群が得られ、医者は病原体などに注目し、および／または推論し、患者のＨＩＶ、ＡＩＤＳ、マラリア、ＴＢなどを監視することができる。単球であっても、蛍光マーカーで標識されうる。抗体に標識を付けて、偽陽性率を小さくすることができる。
【００２４】
ＨＩＶおよびマラリアとの重感染は、死亡率の増大をもたらす可能性があるけれども、この重感染は、ＨＩＶ／結核重感染に比べればそれほど問題ではないことに留意するとよいが、それは、これら２つの疾病は通常、異なる年齢層を攻撃し、マラリアは若年層で最も一般的であり、結核は高年齢層で最も一般的であるからである。しかし、不安定なマラリア伝染の地域では、ＨＩＶは、マラリアが発生したときに大人が重度のマラリアを発症する一因となりうる。
【００２５】
また、ＨＩＶとマラリアとの間には高い相関もありうる。この相関から、マラリアそれ自体がＨＩＶの蔓延の主要原因であるということが示唆される。ウイルス量が高いほど、ＨＩＶ感染が増え、マラリアは、高ＨＩＶウイルス量をもたらす原因となりうる。この見かけの因果関係が、患者がＨＩＶ、マラリア、および／またはＴＢに罹っているかどうかをアッセイ検査で判定することができる理由になっているとしてよい。
【００２６】
マラリアは、最も一般的な感染症の１つであり、非常に大きな公衆衛生問題である考えられる。この疾病は、マラリア原虫の寄生原虫類により引き起こされるとみなされている。最も重度の疾病形態は、熱帯熱マラリア原虫および三日熱マラリア原虫によって引き起こされうるが、他の関係する種（卵形マラリア原虫および四日熱マラリア原虫）もヒトに病気をうつす可能性がある。このヒト病原性マラリア原虫種群は、マラリア寄生体と呼ばれることが多い。
【００２７】
図２は、それぞれ縦軸と横軸にプロットされた小角度散乱対大角度散乱のデータに基づく白血球の５分画のグラフであり、結果として、白血球の５つの群１３１、１３２、１３３、１３４、および１３５のプロットが得られる。図３は、抗体１３８が到達して鍵と錠のように合わさる抗原１３７を有する、リンパ球などの白血球１３６を示している。それぞれの細胞は、最終的に、抗原が付着した全血に由来しうる。
【００２８】
図４ａは、プロットされたデータに対する直交する測定結果を含むリンパ球の３次元プロットである。データは、フルオロ強度（抗体により細胞がどれだけ標識されているかを示す）対ＦＡＬＳが図４ａのシートに平行な平面に置かれ、ＳＡＬＳに対する第３の座標がシートから外へ伸びる形で３Ｄプロットされている。図４ａは、２つのピークを持つ（１４１および１４２）透視図を示している。図４ｂは、図４ａのグラフの辺に向かう視線方向から見た例示的な細胞１４３を示している。図５ａのグラフは、第１のピークが、第１のピークの振幅が小さく見え、身体反応がよくないことを示している可能性のあることを除き図４ａのと同様である。図４ａのピーク１４１は、身体反応がよいことを示している可能性がある。ピーク１４１とピーク１４２との比から、被検者の健康のある種の情報が得られる。図５ｂは、ピーク１４１と１４２を明らかにするＳＡＬＳ対フルオロのプロットを示している。
【００２９】
さまざまなパラメータが、血液学分析に役立ちうる。４つの重要なパラメータ、赤血球（ＲＢＣ）数（細胞数／μＬ）、血小板（ＰＬＴ）数（細胞数／μＬ）、平均細胞体積（ＭＣＶ）、および赤血球分布幅（ＲＤＷ）は、血液試料に対する光学的アプローチで得られる。ＭＣＶは、事実上、ＲＢＣの平均サイズの測定結果であり、ＲＤＷは、ＲＢＣ間のサイズの変動である。ＲＢＣのサイズの変動が大きいほど、ＲＤＷも大きい。
【００３０】
ＲＢＣ数は、分析対象の血液の単位体積当たりのＲＢＣの実際の数である。Ｈｃｔは、ＲＢＣ×ＭＣＶであるヘマトクリットであり、結局、血液の酸素運搬能の尺度となりうる（つまり、分析対象の単位体積中の細胞のすべての全能力）。Ｈｃｔは、さらに、血液中でＲＢＣが占有する空間の量、または赤血球からなる全血の割合とみなすこともできる。ＭＣＨは、事実上それぞれのＲＢＣ中のヘモグロビンの量である「平均赤血球ヘモグロビン」である。ＭＣＨは、ピコグラムを単位とする、個々のＲＢＣ中のヘモグロビンの平均、またはおおよそ平均質量とみなすことができる。ＭＣＨ＝Ｈｂ÷ＲＢＣ。Ｈｂは、分析対象の試料の単位体積当たりのヘモグロビンの量である。ＭＣＨＣは、ＲＢＣのそれぞれにおける単位体積当たりのヘモグロビンの濃度とみなせる「平均赤血球ヘモグロビン濃度」である。ＭＣＨＣ＝Ｈｂ÷Ｈｃｔ。
【００３１】
いくつかの測定パラメータ群は、細胞流量（ＦＲ）、測定時間（Ｔ）、希釈係数（ＤＦ）、計数されたＲＢＣ数（ＮＲＢＣ）、計数された血小板数（ＮＰＬＴ）、ヘモグロビン量（Ｈｂ）、および実質的にそれぞれのｃｃｌｌｊの直径（ミクロン）（ｄｒｂｃｉ）を含むことができる。＜ｄｒｂｃｉ＞は、集合｛ｄｒｂｃｉ｝により表される、細胞の測定されたｃｃｌｌ直径の平均である。主要な計算パラメータのいくつかとして、ＲＢＣ＝ＮＲＢＣ÷（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ）、ＰＬＴ＝ＮＰＬＴ÷（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ）、ＭＣＶ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３＞、およびＲＤＷ＝ＳＤ｛［（π／６）ｄｒｂｃｉ３］｝÷ＭＣＶがあるが、ただし、ＳＤは、測定された量の標準偏差を表す。計算パラメータとしては、Ｈｃｔ＝ＲＢＣ×ＭＣＶ、ＭＣＨＣ＝Ｈｂ÷Ｈｃｔ、およびＭＣＨ＝ＭＣＨＣ×ＭＣＶがある。
【００３２】
モジュール１２１は、血液試料中のヘモグロビン（Ｈｂ）の量またはヘモグロビン濃度を決定するために使用されうる。モジュールは、ヘモグロビン吸収を使用してＨｂを決定することができる。血液中のヘモグロビンの量は、グラム／リットル単位で表すことができる。
【００３３】
白血球の繰り返し可能な３分画は、図６ａおよび６ｂに示されているように正しく示すことができる。図６ａは、それぞれ群１４５および１４６として示される、５μｍおよび６μｍのビーズの計数および分類のグラフを示している。このプロットは、ビーズのＰＡＬＳ対ＳＡＬＳの関係を示す。それぞれのビーズタイプに対する絶対数は、予測値の約５％の範囲内にあるように見える。図６ｂは、細胞の複数のグループ分けを示す散乱データから得られる白血球プロットの結果を示している。このプロットは、ポイントオブケアタイプの計測装置による細胞のＦＡＬＳ対ＳＡＬＳの関係を示すものである。白血球３つの群１４７、１４８、および１４９（それぞれリンパ球、Ｌ、単球、Ｍ、および顆粒球、Ｇ）は、図６ｂのプロットにおいて分画されうる。全ＷＢＣ数は、市販の血液学分析器を使用して同じ試料について実行された類似の測定結果の６％の範囲にあるように見えた。
【００３４】
赤色ＶＣＳＥＬ配列は、集束レーザースポットと粒子流経路との位置合わせを含むことができるフローサイトメトリーにおける最も重要な態様の１つに対する解決策をもたらしうる。典型的には、使い捨て型流体カートリッジなどの成型プラスチック部品における位置合わせは、そのような部品を使用することにはある種の正確さが関連するため難しい。標準の単一レーザーを直線配列のレーザーで置き換えることは、特定の細胞の実質的に正確な経路を決定し、セルフアライメントを可能にする一手段となる。
【００３５】
本発明のＰＯＣサイトメーターは、全血試料捕捉、試薬貯蔵、赤血球の連続的溶解、フローサイトメトリーに対する血球サイズコア内への白血球の３次元流体力学的／幾何学的集束、ならびに試料および廃棄物貯蔵室ためのマイクロ流体回路を備えることができる。これは、準備段階なしで１滴（１５μＬ）の血液から直接働き、試薬使用量を最小限にし、試料、試薬、廃棄物をカード上に保持することができる。
【００３６】
分析カートリッジ上のマイクロスケール流路内の液流は、本質的に層流としてよく、これにより、混和流体（例えば、全血と水）を隣同士で流し、分子および対流拡散を通じてのみ混合することができる。これにより、生物学的粒子（血液細胞など）を制御された時間の間に露出させることが可能であり、残っている白血球を検出し特徴付けられるように化学および浸透圧を介して赤血球（ＲＢＣ）の選択的溶解を能にすることができる。カートリッジ上のＲＢＣの選択的溶解に対するこのようなアプローチは、「オンザフライ溶解」（ＬＯＦ）と呼ばれ、ベンチトップサイトメーターで実行されるバッチ溶解とは異なり、同じ時間の間、溶解液に曝されるすべての細胞を利用することができる。
【００３７】
本発明の光散乱ベースのＰＯＣサイトメーターに加えて、ＰＯＣサイトメーターに役立つ他の２つの進行中の態様がありうる。光散乱ベースの計測装置上の２色光蛍光能力は、ＣＤ４／ＣＤ４５アッセイを実行するために使用されうる。ＰＯＣは、さらに、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤＸ、ＣＤＸＸ、および／または同様のアッセイを実効できる統合散乱／蛍光サイトメーターであってよい。使い捨て型カードまたはカートリッジでは、オンカードｍＡｂｓによる白血球のオンカード染色および赤血球溶解を使用することができる。本発明のＰＯＣ血液学分析器は、完全血球算定（ＣＢＣ）検査を実行するＣＬＩＡ放棄計測装置として設計することができる。
【００３８】
図７は、例示的な小型化された携帯型サイトメーターの斜視図である。このサイトメーターのあるバージョンは、本発明と連携して使用することができる。サイトメーターは、一般に１０で示されており、筐体１２および取り外し可能もしくは交換可能カートリッジ１４を備えることができる。例示的な筐体１２は、底部１６、カバー１８、および底部１６をカバー１８に取り付ける蝶番２０を備えることができる。底部１６は、光源２２ａおよび２２ｂ、関連する光学系、およびサイトメーターの動作に必要な電子回路を備えることができる。カバー１２は、手動式加圧要素、制御用マイクロ弁を備える圧力室、および関連する光学系を備える光検出器２４ａおよび２４ｂを備えることができる。
【００３９】
取り外し可能カートリッジ１４は、試料捕集装置口３２を介して試料流体を受け入れることができる。キャップ３８は、取り外し可能カートリッジ１４が使用されていない場合に試料捕集装置口３２を保護するために使用することができる。取り外し可能カートリッジ１４は、コア形成のため血液希釈、赤血球融解、および流体力学的絞り込みを実行することができる。取り外し可能カートリッジ１４は、一部がエッチングされた流路を持つ積層構造を使用することで製造されうる、流体回路により構成することができる。
【００４０】
取り外し可能構造またはカートリッジ１４は、カバー１８が開位置にあるときに筐体内に挿入できる。取り外し可能カートリッジ１４は、計測装置の異なる部分の間の位置合わせおよび結合を行いやすくする、位置決めピン２８ａおよび２８ｂを底部１６内に受け入れるための穴２６ａおよび２６ｂを備えることができる。取り外し可能カートリッジ１４は、さらに、透明なフロー流窓３０ａおよび３０ｂを備えることができ、これらは、光源２２ａおよび２２ｂと光検出器２４ａと２４ｂの配列に位置を揃えられている。カバーが閉位置に移動され、システムが加圧されると、カバー１８は、それぞれ圧力供給口３６ａ、３６ｂ、および３６ｃを介して取り外し可能カートリッジ１４内の受圧口３４ａ、３４ｂ、３４ｃに制御圧力を加えることができる。
【００４１】
検査を開始するために、カバー１８が持ち上げられ、新しいカートリッジ１４が入れられ、底部１６上で位置を合わせするようにできる。血液試料が試料捕集装置３２内に導入されうる。カバー１８は閉じられ、システムが手動加圧されうる。加圧は、手動以外であってもよい。加圧された後、計測装置は、白血球サイトメトリー測定および他の測定を実行することができる。取り外し可能カートリッジ１４は、コア形成のため血液希釈、赤血球溶解、および流体力学的絞り込みを実行することができる。光源２２ａおよび２２ｂ、光検出器２４ａおよび２４ｂ、ならびに関連する制御および処理電子回路は、光散乱蛍光信号に基づき白血球の分画および計数を実行することができる。筐体１２に蝶番付きの構造を使用する代わりに、スライド式カートリッジスロットまたは他の好適な構造を使用することが考えられる。
【００４２】
図８は、図７の例示的なサイトメーターの略図である。上述のように、底部１６は、光源２２ａおよび２２ｂ、関連する光学系、ならびにサイトメーターの動作に必要な制御および処理電子回路４０を備えることができる。底部１６は、さらに、サイトメーターに給電するための電池４２を備えることもできる。手動式加圧要素４４、制御用マイクロ弁を備える圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃ、ならびに関連する光学系を備える光検出器２４ａおよび２４ｂを備えるカバー１８が図に示されている。
【００４３】
取り外し可能カートリッジ１４は、試料捕集装置口３２を介して試料流体を受け入れることができる。カバー１８により加圧されると、取り外し可能カートリッジ１４は、本発明のデバイスにおいて血液希釈、赤血球溶解、およびコア形成のための流体力学的絞り込みを実行することができる。形成された後、図７のフロー流窓３０ａおよび３０ｂを通る、フロー流経路５０の下側にコアが送られうる。底部にある光源２２ａおよび２２ｂならびに関連する光学系は、フロー流窓３０ａおよび３０ｂを介してコア流に光を通し、光をコア流に到達させることができる。検出器２４ａおよび２４ｂ、ならびに関連する光学系は、それぞれ、さらにフロー流窓３０ａおよび３０ｂを介して、コアから散乱光および非散乱光を受け入れることができる。コントローラまたはプロセッサ４０は、検出器２４ａおよび２４ｂから出力信号を受け取り、コア流内に存在する選択された白血球を分画し、識別し、計数することができる。
【００４４】
取り外し可能カートリッジ１４は、流体のそれぞれの速度の制御を補助するための流体制御ブロック４８を備えることができる。例示的な実施例では、流体制御ブロック４８は、さまざまな流体の速度を感知するフローセンサーを備え、それらの速度をコントローラまたはプロセッサ４０に報告することができる。次いで、コントローラまたはプロセッサ４０は、圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃに関連付けられているマイクロ弁を調節して、サイトメーターを適切に動作させられる所望の圧力およびしたがって、所望の流体速度を得ることができる。
【００４５】
血液および他の生物学的廃棄物は、病気を拡大する可能性があるため、取り外し可能カートリッジ１４は、廃棄物貯蔵容器５２をフロー流窓３０ａおよび３０ｂの下流に備えるとよい。廃棄物貯蔵容器５２は、取り外し可能カートリッジ１４内のフロー流の流体を受け入れ、貯蔵することができる。試験が完了したら、取り外し可能カートリッジを取り外して、生物学的廃棄物と親和性のある容器内に処分することができる。
【００４６】
図９は、カバー１８がまだ押し下げられていない図８のサイトメーターを示すより詳細な略図である。図１０は、カバーが押し下げられている図８のサイトメーターを示すより詳細な略図である。手動式加圧要素４４、圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃ、および全体として６０で示されている制御用マイクロ弁を備えるカバー１８が示されている。光源および検出器は、これらの図に示されていない。
【００４７】
加圧される流体毎に１つずつ、３つの圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃがありうる。例示的な実施例において、圧力室４６ａは、血液試料貯蔵容器６２に圧力を加えることができる。圧力室４６ｂは、溶解液貯蔵容器６４に圧力を加え、圧力室４６ｃは、シース貯蔵容器６６に圧力を加えることができる。それぞれの圧力室４６ａ、４６ｂ、および４６ｃのサイズおよび形状は、所望の圧力特性を対応する流体に与えるように手直しすることができる。
【００４８】
圧力室４６ａは、第１の圧力室７０および第２の圧力室７２を含むことができる。第１の弁７４が、第１の圧力室７０と第２の圧力室７２との間に備えられ、これにより、第１の圧力室７０内の圧力を第２の圧力室７２へ制御しつつ逃すことができる。第２の圧力室７２と流体で連絡している、第２の弁７６は、第２の圧力室７２内の圧力を制御しつつ抜くことができる。それぞれの弁は、アドレッシングおよび制御を個別に行うことが可能な静電駆動式マイクロ弁の配列とすることができる。圧力室４６ｂおよび４６ｃは、溶解液貯蔵容器６４およびシース貯蔵容器６６にそれぞれ加えられる圧力を制御する類似の弁を備えることができる。それとは別に、それぞれの弁は、「実効」流量または漏出量が制御しつつ得られる制御可能なデューティサイクルでパルス変調される静電駆動式マイクロ弁の配列とすることができる。
【００４９】
取り外し可能カートリッジ１４は、カバー１８から制御を圧力を受けるための受圧口３４ａ、３４ｂ、および３４ｃを備えることができる。制御圧力は、図に示されているように、血液貯蔵容器６２、溶解液貯蔵容器６４、およびシース貯蔵容器６６に供給されうる。溶解液貯蔵容器６４およびシース貯蔵容器６６は、取り外し可能カートリッジ１４が使用のため出荷される前に充填されうるが、血液貯蔵容器６２は、試料捕集装置口３２から充填される。血液試料は、試料捕集装置口３２に供給され、血液試料は、毛管現象により、血液貯蔵容器６２内に吸い込まれうる。血液試料が血液貯蔵容器６２内に入った後、カバー１８を閉じて、システムを加圧することができる。
【００５０】
フローセンサーは、流体力学的絞り込みの前にそれぞれの流体と一致するように備えることができる。それぞれのフローセンサー８０、１００、および１０２は、対応する流体の速度を測定することができる。フローセンサーは、熱式流速計型フローセンサー、またはマイクロブリッジ型フローセンサーとしてよい。それぞれのフローセンサー８０、１００、および１０２からの出力信号は、コントローラまたはプロセッサ４０に供給されうる。コントローラまたはプロセッサ４０は、血液試料の速度が第１の所定の値よりも低くなった場合に第１の弁７４を開き、血液試料の速度が第２の所定の値よりも高くなった場合に第２の弁７６を開くことができる。弁８４、８６、９４、および９６は、同様の方法で溶解液およびシース液の速度を制御するように動作しうる。
【００５１】
動作中、システムを加圧するために、手動式加圧要素４４が押し下げられうる。圧力要素は、非手動機構と置き換えられうる。示されている実施例では、手動式加圧要素４４は、３つのプランジャを備え、それぞれのプランジャは第１の複数の圧力室のうちの対応する１つの圧力室内に受け入れられうる。プランジャは、第１の圧力室内に比較的高い非精密圧力を発生することができる。第１の弁７４、８４、および９４を開くことにより、二次室内に、低い制御圧力が発生し、二次室内に制御可能な漏れを生じうる。二次圧力室内に生じる圧力が大きすぎる場合、対応するベント弁７６、８６、および９６が開いて、圧力を逃すようにできる。
【００５２】
カバー１８を閉じたときに、ベント弁７６、８６、および９６を開いているままにして、ノーマルオープンの第１の弁７４、８４、および９４は、閉じることができる。所定の圧力Ｐが第１の圧力室内に生じたときに、ベント弁７６、８６、および９６を閉じ、第１の弁７４、８４、および９４を開き、二次圧力室に低い圧力Ｐ’を生じさせることができる。二次圧力室の制御圧力は、取り外し可能カートリッジ１４の流体回路に必要な圧力を供給し、血液、溶解液、およびシースに対する流体流を生じさせることができる。次いで、下流のフローセンサー８０、１００、および１０２により、流体流の速度が測定されうる。それぞれのフローセンサーは、対応する第１の弁および弁と弁の動作を制御し、それぞれの流体について所望の流量を一定にするためにコントローラまたはプロセッサ４０により使用される出力信号を供給することができる。
【００５３】
全体として１１０で示されている下流の弁も備えることができる。コントローラまたはプロセッサ４０は、システムが加圧されるまで下流弁１１０を閉じておくことができる。これにより、回路が加圧される前に血液、溶解液、およびシースが流体回路内に流れ込むのを防ぐことができる。本発明の他の例示低名実施例では、下流弁１１０は、カバーが閉じられたときに機械の作用により開くことができる。
【００５４】
図１１は、図９の流体力学的絞り込みブロック８８によるフロー流およびコアの形成を示す略図である。流体力学的絞り込みブロック８８は、流体駆動装置から制御された速度で血液、溶解液、およびシースを受け取ることができる。血液を溶解液と混合することで、赤血球を取り除くことができる。溶解溶液のｐＨは、赤血球に比べて低い場合がある。これは、赤血球溶解またはオンザフライ溶解と呼ばれることも多い。残っている白血球は、フロー流５０を発生するためにシース液により囲まれている、中心内腔１５０の下に供給されうる。フロー流５０は、シース液１５２により囲まれているコア流１６０を含むことができる。流路の寸法は、白血球１５４および１５６が一列縦隊で並ぶように、図に示されているとおりに縮小されうる。シース液の速度は、コア流１６０の約９倍としてよい。しかし、シース液およびコア流１６０の速度は、流路内に層流を維持できるよう十分遅いものとしてよい。
【００５５】
発光体２２ａおよび２２ｂならびに関連する光学系は、フロー流５０の片側に隣接して備えることができる。フロー流５０を介して発光体２２ａから光を、また蛍光発光粒子から光を受け取るために、フロー流５０の他方の側に光検出器２４ａおよび２４ｂならびに関連する光学系を備えることができる。光検出器２４ａおよび２４ｂからの出力信号は、コントローラまたはプロセッサ４０に供給され、そこで、コア流１６０内の選択された白血球を同定し、および／または計数するために分析される。
【００５６】
図１２は、図１１の散乱を介してコア流１６０の分析用の光源の配列２２ａおよび光検出器の配列２４ｂを示す略図である。光源は「＋」記号として表され、検出器はボックスで表される。示されている実施例では、光源の配列は、フロー流５０の片側に隣接して備えられ、光検出器の配列は、フロー流の対向側に隣接して備えられうる。光検出器はそれぞれ、複数の光源のうちの対応する１つの光源に位置を揃えることができる。光源の配列および光検出器の配列は、フロー流５０の軸２０２に関して少し回転された光源軸２００にそって整列されるように示されている。
【００５７】
光源の配列２２ａは、共通基板上に加工された垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などのレーザーの配列であるとしてよい。ＶＣＳＥＬは、垂直発光であるため、小型化された携帯型サイトメーターなどのコンパクトな計測装置のパッケージングに適している場合がある。このようなサイトメーターは、ヒトが身につけることができるものとしてよい。ＶＣＳＥＬは、従来の８５０ｎｍよりも短い波長で動作する、または特に、６７０ｎｍから７８０ｎｍまでの範囲の波長で動作する「赤色」ＶＣＳＥＬとしてよい。赤色ＶＣＳＥＬは、散乱測定に適している波長、電力、および偏波特性を有することができる。
【００５８】
いくつかのサイトメーターベンチモデルでは、波長６５０ｎｍの単一９ｍＷ端面放射型レーザーを使用することができる。ビームを１０×１００ミクロンの細長い形状に集束させ、コア流の位置ずれと幅のせいで生じる粒子位置の不確定性に対応することができる。対照的に、本発明の６７０ｎｍで動作する赤色ＶＣＳＥＬの出力は、典型的には、１０×１０ミクロンの放射体と１００ミクロンの間隔に対し約１ｍＷとしてよい。したがって、１０個の赤色ＶＣＳＥＬの直線配列からの光の全強度は、いくつかの従来技術のベンチモデルと本質的には同じであってよい。
【００５９】
流れの軸２０２に関してある角度で向き付けられているレーザーの直線配列することには、単一光源構成に勝る重要な利点が多数ありえる。例えば、レーザーの直線配列は、コア流内の粒子の経路の横方向アライメントを決定するために使用することができる。粒子流のアライメントの不確定性の発生源の１つは、コア流の幅であるとしてよく、これにより、粒子経路位置に統計変動が生じうる。これらの変動は検出器データの分析から判別され、コントローラまたはプロセッサ４０はこの変動を利用して、流体駆動装置の弁を調節し、試料流体および支持流体に加えられる相対圧力を変更し、フロー流内の選択された粒子のアライメントを変更することができる。
【００６０】
流体流５０内の細胞の横方向アライメントを決定するために、ＶＣＳＥＬの直線配列により生成される複数の焦点スポットに細胞を通すことができる。細胞は、対応するインライン基準検出器内の信号の低下を引き起こしうる。これらの信号の相対的強弱度は、粒子経路の中心および粒子幅の大きさを決定するためにコントローラまたはプロセッサ４０により使用されうる。
【００６１】
粒子経路および粒子サイズを決定するために、コア流の平面内で一連のガウススポット２１４（約１０００Ｗ／ｃｍ２の強度）にレーザー２２ａが集束されうる。スポット２１４は、白血球とほぼ同じサイズとしてよい（１０〜１２μｍ）。例示的なガウススポット２１４が、図１３に例示されている。検出器の配列２４ａとのその集束光学系の配列は、流体流５０の対向側に備えることができる。かなり大きなＦナンバーを有するレンズを使用することで、取り外し可能カートリッジのサイトメーターセクション用の数百ミクロンの作業空間を確保できる。
【００６２】
単一レーザー構成ではなくレーザーの直線配列２２ａを使用する場合の他の利点は、それぞれの細胞の速度を決定できるという点である。粒子速度は、光散乱信号から粒子サイズを推定する際の重要パラメータとすることができる。ある種のサイトメトリーでは、粒子速度は、ポンプ流量から外挿されうる。このアプローチの限界は、ポンプは非常に高精度なものであるべきである、サイトメーターフロー室の公差は厳格に制御されるべきである、漏れなどの流体障害は発生すべきでない、フローまたはコア形成を阻害する微泡などの障害物が入り込むべきではないという条件である。
【００６３】
それぞれの細胞の速度を決定するために、システムは、２つの隣接する、または連続的なスポットの間をそれぞれの細胞が通過するのに要する時間を測定することができる。例えば、図１２を参照すると、細胞は、検出器２０８を通過し、次いで、検出器２１０を通過することができる。細胞が検出器２０８から検出器２１０へ移動するのに要する時間を測定することにより、また検出器２０８から検出器２１０までの距離を知ることにより、コントローラまたはプロセッサ４０は、細胞の速度を計算することができる。これは、近似的な速度測定結果となるであろう。これは、飛行時間型測定と呼ばれることが多い。速度が判明した後、粒子が中心位置に来るスポットを通って移動する時間（数マイクロ秒）は、粒子の長さおよびサイズの尺度となりうる。
【００６４】
粒子速度は、さらに、流体駆動装置の制御を補助するために使用できるとも考えられる。本発明のサイズ、コスト、および複雑度を低減するために、図７の交換式カートリッジは、プラスチック積層または成形部品から製造することができる。このような製造技術により安価な部品が得られるが、典型的には、寸法が非対称で、断面の公差が大きく、寸法的正確さおよび反復性があまりよくない。このように公差が大きいほど、特にカートリッジからカートリッジまでの間の粒子速度に、変動を生じる可能性がある。このように大きな公差を補償しやすくするために、コントローラまたはプロセッサ４０では本明細書で説明されている飛行時間型測定を使用し、血液、溶解液、およびシース液に加えられる制御圧力を調節し、コア流内の粒子の速度が比較的一定するようにできる。
【００６５】
さらに、細胞サイズを評価するために、細胞経路にそって、さらに細胞経路を横切る形で、レーザー・ビームを集束させることができると考えられる。さらに、細胞を横切る複数のサンプルをテクスチャ特徴に関して分析し、形態学的特徴と他の細胞種類との相関を求めることができる。これにより細胞サイズに関する複数のパラメータが得られ、細胞種類を互いに分離させるのに役立ちうる。
【００６６】
単一レーザー源構成ではなくレーザーの直線配列２２ａを使用する場合の他の利点は、流路を横切る形で比較的一定した光照射を与えることができるという点である。これは、図１３に示されているように、隣接するＶＣＳＥＬ ２２ａからのガウスビーム２１４を重ね合わせることにより達成されうる。単一レーザーシステムでは、流路を横切る光照射は、その流路を横切るときに変化しうる。そのため、粒子が、流路の中心にない場合、その後の測定の精度は落ちる可能性がある。
【００６７】
上述の測定を実行するために、図１２のそれぞれの検出器２４ａは、単一のインライン検出器とすることができる。しかし、ＦＡＬＳおよびＳＡＬＳの散乱を測定するために、それぞれの検出器２４ａは、さらに、図１４に示されているように、インライン検出器の周りに配置された２つの環状検出器を備えることができる。この図を参照すると、ＶＣＳＥＬ ２１８は、光を上向き方向に送るように示されている。光はレンズに通され、レンズはコア流の平面内のガウススポットに光を集束させることができる。レンズ２２０は、マイクロレンズなどであってよく、ＶＣＳＥＬ ２１８と別であるか、または一体化されている。光はコア流を通過し、回折光学素子などの他のレンズ２２２により受け取られる。レンズ２２２は、光をインライン検出器２２６および環状検出器２２８および２３０に送ることができる。インライン検出器２２６は、コア流内で粒子により著しく散乱されない光を検出することができる。環状検出器２２８は、前方散乱（ＦＡＬＳ）光を検出することができ、環状検出器２３０は、小角度散乱（ＳＡＬＳ）光を検出することができる。
【００６８】
図１５は、光源および光検出器の３つの別々の配列を備えることができる例示的な他の実施例を示している。光源および光検出器のそれぞれの配列は、フロー流の中心流軸に関して少し回転された異なる光源軸にそって位置決めされうる。３つの配列を使用することにより、それぞれの配列に関連付けられている光学系は、特定の用途または機能に合わせて最適化されうる。小画散乱（ＳＡＬＳ）を検出するためには、コア流の平面上に十分に集束されているレーザー光が望ましい。前方散乱（ＦＡＬＳ）を検出するためには、コリメート光が望ましい。
【００６９】
図１５を参照すると、光源および光検出器の第１の配列が、３００で示されている。光源および光検出器は、第１の光源軸にそって直線配列として配置されうる。第１の光源軸は、フロー流の流れ軸に関して回転されうる。光源および光検出器は、図１２に関して上で説明されているものと類似のものであってよいが、例えば、フロー流内の細胞の横方向アライメント、粒子サイズ、粒子の速度を測定するために使用されうる。
【００７０】
上で示されているように、ユーザーは、取り外し可能カートリッジを取得し、血液試料を取り外し可能カートリッジの試料捕集装置口３２（図７を参照）に送ることができる。血液試料は、例えば、指に針を刺すことで集めることができる。ユーザーは、次いで、取り外し可能カートリッジを筐体内に挿入し、手動でシステムを加圧することができる。次いで、小型化された携帯型サイトメーターは、ユーザーが医療を求めるべきかどうかを示す読み取り値を与えることができる。この読み取り値は、視覚的読み取り値、可聴音、または他の好適なインジケータとすることができる。
【００７１】
指を針で刺すなどの方法で血液試料を取得する代わりに、カテーテル８０４（図２７）などをユーザーの静脈に挿入し、試料捕集装置口３２に取り付けることができる。これにより、システムは、読み取り値が必要な場合に血液試料をユーザーから自動的に捕集することができる。それとは別に、小型化された携帯型サイトメーターは、試料捕集装置口３２が好適な血液供給源に接続された状態でユーザー体内に埋め込むことができると考えられる。
【００７２】
図１６は、例示的な取り外し可能カートリッジのいくつかの特徴の略図である。例示的な取り外し可能カートリッジは、一般的に４００で示されており、本明細書で説明されている取り外し可能カートリッジ１４に類似のものとしてよい。取り外し可能カートリッジ４００は、例示されているにすぎず、本発明の実施例は、形態、機能、または構成に関係なく、多くのマイクロ流体カートリッジに適用されうることは理解されるであろう。例えば、本発明の実施例は、フローサイトメトリー、血液検査、免疫アッセイ、臨床化学、血液化学分析、尿検査、血液ガス分析、ウイルス分析、バクテリア分析、電解質測定などに適合された取り外し可能カートリッジに応用可能である。また、取り外し可能カートリッジ４００などの本発明の取り外し可能カートリッジは、例えば、ガラス、シリコン、１つまたは複数のポリマーを含む好適な材料もしくは材料系、または他の好適な材料もしくは材料系、または材料もしくは材料系の組み合わせから作ることができることも考えられる。
【００７３】
例示的な取り外し可能カートリッジ４００は、第１の測定流路４０２および第２の測定流路４０４を備えるが、必要に応じて使用する測定流路を加減することも可能である。例示的な実施例における第１の測定流路４０２は、赤血球測定流路であり、第２の測定流路４０４は、白血球測定流路である。全血試料は、血液受口４０６を介して取り外し可能カートリッジ４０２より受け取られ、毛管作用により、知られている量の血液が抗凝血剤コーティング血液試料貯蔵毛細管４０８内に引き込まれる。試料押し（Ｐ）圧力が、試料押し流体貯蔵容器に加えられる。圧力が加えられると、試料押し流体が強制的に、試料押し流体貯蔵容器から血液試料押し流路４１０内に送り込まれる。
【００７４】
例示的ないくつかの実施例では、弁４１２およびフローセンサー４１４を血液試料押し流路４１０と一列になるように備えることができる。弁４１２は、血液試料を流体回路に押し通すことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４１４は、血液試料押し流体の流量を測定することができ、したがって、抗凝血剤コーティング毛細管４０８を通る血液試料流量を測定することができる。フローセンサー４１４から得られる流量は、取り外し可能カートリッジ４００に供給される試料押し（Ｐ）圧力を制御しやすくするために使用されうる。
【００７５】
例示的な実施例では、全血試料は分割され、ブランチ４１６を介して赤血球測定流路４０２および白血球測定流路４０４に送られる。例示的な実施例では、弁４１８は、赤血球測定流路４０２内に入る血液試料流を制御するためにブランチと一列になるように備えられ、弁４２０は、白血球測定流路４０４内に入る血液試料流を制御するように備えられる。
【００７６】
赤血球測定流路４０２を特に参照すると、赤血球球状化試薬圧力（ＳＰ）が球状化試薬貯蔵容器に加えられることがわかる。圧力が加えられると、球状化試薬貯蔵容器内の球状化試薬が強制的に、球状化試薬流路４２４内に送られる。
【００７７】
例示的ないくつかの実施例では、弁４２６およびフローセンサー４２８は、さらに、球状化試薬流路４２４と一列になるように備えることができる。弁４２６は、球状化試薬を流体回路に押し込むことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４２８は、球状化試薬の流量を測定することができ、球状化試薬流路４２４を通る球状化試薬の流量を測定することができる。フローセンサー４２８から得られる流量は、圧力源／コントローラにより取り外し可能カートリッジ４００に供給される球状化圧力（ＳＰ）を制御しやすくするために使用されうる。
【００７８】
例示的な取り外し可能カートリッジ４００の通常の機能動作中に、形状化試薬が球状化試薬流量の交差領域４３０内に押し込まれ、血液試料が血液試料流量の交差領域４３０に押し込まれる。血液試料流量および球状化試薬流量は、圧力源／コントローラにより制御されうる。
【００７９】
交差領域４３０は、球状化試薬が血液試料の周囲を流れる動作が、両方の流体が交差領域４３０内を流れるときに生じるように構成されうる。場合によっては、球状化試薬流量は、血液試料流量より高くてもよく、これにより下流のオンザフライ球状化流路４３２内の流量特性を改善し、場合によっては、球状化試薬により完全に、また一様に囲まれている薄いリボン状の血液を形成しやすくすることができる。このようなリボン状の流れは、オンザフライ球状化流路４３２内を移動するときに球状化試薬が赤血球を一様に球状化するのを助けることができる。さらに、オンザフライ球状化流路４３２の長さは、球状化試薬および血液試料の流量と併せて、血液試料が適切な時間の間に球状化試薬に曝されるように設定できる。
【００８０】
シース液（ＳＨ）圧力をシース液貯蔵容器に加えることができる。圧力が加えられると、シース液が強制的に、シース液貯蔵容器からシース流路４３４内に送り込まれる。例示的ないくつかの実施例では、弁４３６およびフローセンサー４３８をシース流路４３４と一列になるように備えることができる。弁４３６は、シース液を流体回路に押し込むことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４３８は、シース液の流量を測定することができ、シース流路４３４を通るシース流量を測定することができる。フローセンサー４３８から得られる流量は、取り外し可能カートリッジ４００に供給されるシース圧力（ＳＨ）を制御しやすくするために使用されうる。
【００８１】
例示されている実施例では、シース液は、シース液流量の交差領域４４０に供給され、球状化された血液試料は、球状化された血液試料の流量の交差領域４４０に供給される。球状化された血液試料の流量およびシース流量は、圧力源／コントローラにより制御されうる。
【００８２】
交差領域４４０は、シース液が球状化された血液試料の周囲を流れる動作が、両方の流体が交差領域４４０内を流れるときに生じるように構成されうる。いくつかの場合において、シース流量は、球状化された血液試料の流量に比べて著しく高く、下流のフローサイトメトリー流路４４２内のコア形成を改善するのに役立ちうる。例えば、いくつかのフローサイトメトリー用途では、この交差領域４４０は、それぞれの赤血球を取り外し可能カートリッジ４００内の光学的窓領域４４４を通過するときに分析器により個別に光学的に問い合わせできるように一列縦隊のコア内に球状化された血液細胞を流体力学的に集束させ、配列するように構成されうる。いくつかの場合において、サイトメトリー流路４４２を通過する流体は、オンボード廃棄物貯蔵容器に向けられる。
【００８３】
次に、白血球測定流路４０４を参照すると、白血球溶血剤圧力（Ｌ）が溶血剤貯蔵容器に加えられうることがわかる。圧力が加えられると、溶解液貯蔵容器内の溶血剤が強制的に、溶血剤流路４５４内に送られる。
【００８４】
例示的ないくつかの実施例では、弁４５６およびフローセンサー４５８は、さらに、溶血剤流路４５４と一列になるように備えることができる。弁４５６は、溶血剤を流体回路に押し込むことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４５８は、溶血剤の流量を測定することができ、溶血剤流路４５４を通る溶血剤の流量を測定することができる。フローセンサー４５８から得られる流量は、圧力源／コントローラにより取り外し可能カートリッジ４００に供給される溶解圧力（Ｌ）を制御しやすくするために使用されうる。
【００８５】
例示的な取り外し可能カートリッジ４００の通常の機能動作中に、溶血剤が溶血剤流量の交差領域４６０内に供給され、血液試料が血液試料流量の交差領域４６０に供給される。血液試料流量および溶血剤流量は、圧力源／コントローラにより制御されうる。
【００８６】
交差領域４６０は、溶血剤が血液試料の周囲を流れる動作が、両方の流体が交差領域４６０内を流れるときに生じるように構成されうる。場合によっては、溶血剤流量は、血液試料流量より高くてもよく、これによりオンザフライ溶解流路４６２内の流量特性を改善し、場合によっては、溶血剤により完全に、また一様に囲まれている薄いリボン状の血液を形成しやすくすることができる。このようなリボン状の流れは、オンザフライ溶解流路４６２内を移動するときに溶血剤が赤血球を一様に溶解するのを助けることができる。さらに、オンザフライ溶解流路４６２の長さは、溶血剤および血液試料の流量と併せて、血液試料が適切な時間の間に溶血剤に曝されるように設定できる。
【００８７】
シース液（ＳＨ）圧力をシース液貯蔵容器に加えることができる。圧力が加えられると、シース液が強制的に、シース液貯蔵容器からシース流路４６４内に送り込まれる。例示的ないくつかの実施例では、弁４６６およびフローセンサー４６８をシース流路４６４と一列になるように備えることができる。弁４６６は、シース液を流体回路に押し込むことが望ましい場合に、開くように制御できる。フローセンサー４６８は、シース液の流量を測定することができ、シース流路４６４を通るシース流量を測定することができる。フローセンサー４６８から得られる流量は、取り外し可能カートリッジ４００に供給されるシース圧力（ＳＨ）を制御しやすくするために使用されうる。いくつかの場合において、シース流路４６４を通るシース流量は、シース流路４３４を通るシース流量と同じである。しかし、他の場合には、シース流路４６４を通るシース流量は、シース流路４３４を通るシース流量と異なる場合もある。
【００８８】
例示されている実施例では、シース液は、シース液流量の交差領域４７０に供給され、溶解された血液試料は、溶解された血液試料の流量の交差領域４７０に供給される。溶解された血液試料の流量およびシース流量は、圧力源／コントローラにより制御されうる。
【００８９】
交差領域４７０は、シース液が溶解された血液試料の周囲を流れる動作が、両方の流体が交差領域４７０内を流れるときに生じるように構成されうる。いくつかの場合において、シース流量は、溶解された血液試料の流量に比べて著しく高く、下流のフローサイトメトリー流路４７２内のコア形成を改善するのに役立ちうる。例えば、いくつかのフローサイトメトリー用途では、この交差領域４７０は、それぞれの白血球を取り外し可能カートリッジ４００内の光学的窓領域４７４を通過するときに分析器により個別に光学的に問い合わせできるように一列縦隊のコア内に溶解された血液試料を流体力学的に集束させ、配列するように構成されうる。いくつかの場合において、サイトメトリー流路４７２を通過する流体は、オンボード廃棄物貯蔵容器に供給される。
【００９０】
いくつかの場合において、吸収測定流路も備えることができる。例示的な実施例では、溶解された血液試料の一部が吸収流路４８０に送られる。弁４８２は、溶解された血液試料の一部を選択的に、吸収流路または領域４８４に移動できるように備えることができる。分析器は、吸収流路または領域４８４を照らすための光源だけでなく、吸収流路または領域４８４内の溶解された血液試料により吸収されない光を検出するための検出器をも備えることができる。次いで、分析器は、バルク吸収ベースのヘモグロビン測定を行える吸収レベルを決定することができる。いくつかの場合において、吸収流路４８４は、必要ならば、サイトメトリー流路４７２の下流に配置されうる。他の場合には、全血試料は、ブランチ４１６などから吸収流路へ、直接供給されうる。そのような場合、吸収流路は、吸収測定を実行するのに先立って赤血球を溶解するための機構を備えることができる。例示的な取り外し可能カートリッジ４００は、全血試料に対し完全血球算定（ＣＢＣ）分析を実行するように適合されているが、他の取り外し可能カートリッジ構成および分析タイプも、必要に応じて使用できることが考えられる。
図１７は、取り外し可能カートリッジを使用して血液試料を分析するための例示的なアプローチを示す概略流れ図である。例示的なアプローチでは、ステップ６００で血液試料が最初に取得される。次に、血液試料が、取り外し可能カートリッジ内の抗凝血剤コーティング毛細管に送られる。次いで、血液試料は、分割され、赤血球および血小板（ＲＢＣ／Ｐ）測定流路６０４ならびに白血球（ＷＢＣ）測定流路６０６に送られる。
【００９１】
ＲＢＣ／Ｐ測定流路６０４内で、赤血球は、６１２に示されているように最初に球状化され、次いで、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路６１４の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの光源６１６は、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路６１４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に光を当てる。いくつかの場合において、ＶＣＳＥＬデバイスの配列が備えられ、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路６１４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞と揃えられる（複数の）ＶＣＳＥＬのみが活性化される。ＶＣＳＥＬにより送られる入射光の一部が散乱され、検出器６１８は、その散乱された光を検出する。いくつかの場合において、検出器６１８は、前方角度散乱光（ＦＡＬＳ）、小角度散乱光（ＳＡＬＳ）、および大角度散乱光（ＬＡＬＳ）を検出することができる。
【００９２】
いくつかの場合において、レーザー（または他の）光源は、細長い線光源として、または２つの別々のスポット光源として、ＲＢＣ／Ｐサイトメーター流路６１４内に集束される。ＲＢＣおよびＲＢＣ／Ｐサイトメーター流路６１４内の血小板は、集束光に通される。高品質集光光学系を使用することで、細胞の鮮明な像および集光を、縦軸がＲＢＣ／Ｐサイトメーター流路６１４内の流れの方向に直交するように配置された１つ、２つ、またはそれ以上の平行なスリットを含む不透明スクリーン上に形成することができる。これらのスリット間の距離は、例えば、ＲＢＣ／Ｐサイトメーター流路６１４内で予想される平均細胞分離距離の程度としてよい。これらのスリットを含む不透明スクリーンは、１つまたは複数の検出器６１８の前に置くことができる。細胞の像が１つのスリットを通り越すときに、これはスリット上に入射する光を遮り、検出器６１８上の信号を弱め、幅が細胞直径に比例するパルス波形を発生する。２つの相隔てて並ぶスリットが備えられた場合、２つの波形は、細胞流速の計算を許すものとなりうる。この技術を使用することで、高信号対雑音比が得られ、これにより、イベントの計数と、複数の細胞イベントの同定が容易に行える。さらに、パルスの幅と振幅で、いくつかの細胞タイプの弁別が可能になる場合がある。
【００９３】
いくつかの場合において、細胞と光源の両方の像が、検出器６１８の前に置かれた二重スリット開口上に結像される。この二重スリット開口は、明確に定められた幾何学的開口をなし、細胞を計数するための高い信号対雑音比をもたらす。上述のように、これらのスリットからの信号は、細胞流速の正確な測定を可能にし、次いで、細胞直径の計算も可能にしうる。
【００９４】
いくつかの場合において、６２０に示されているように、この分析の際に、例えば、試料流量（ＦＲ）、測定時間（Ｔ）の長さ、および試料希釈係数（ＤＦ）を含む、多数のパラメータを測定することができる。（複数の）検出器の出力、および／または対応する散乱シグネチャを監視することにより、赤血球数（ＮＲＢ）、血小板数（ＮＰｌｔ）、それぞれの細胞の直径（ｄｒｂｃ）を測定することができる。
【００９５】
これらのパラメータから、また６８２に示されているように、例えば、赤血球数（ＲＢＣ＝ＮＲＢ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、血小板数（Ｐｌｔ＝ＮＰｌｔ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、平均細胞ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ＝＜ＣＨＣ＞）、平均細胞体積（ＭＣＶ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃ３＞）、平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃ３×ＣＨＣ＞）、相対分布幅（ＲＤＷ＝［（π／６）×ｄｒｂｃ３］／ＭＣＶの標準偏差）、ヘマトクリットパラメータ（Ｈｃｔ＝ＲＢＣ×ＭＣＶ）、および／またはヘモグロビン濃度（Ｈｂ＝ＭＣＨＣ×Ｈｃｔ）を含む、多数の赤血球分析パラメータが計算されうる。
【００９６】
例示的なＷＢＣ測定流路６０６内で、赤血球は、６３２に示されているように最初に溶解され、次いで、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＷＢＣサイトメトリー流路６３４の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの光源６３６は、個々の細胞がＷＢＣサイトメトリー流路６３４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に光を当てる。いくつかの場合において、ＶＣＳＥＬデバイスの配列が備えられ、個々の細胞がＷＢＣサイトメトリー流路６３４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞と揃えられる（複数の）ＶＣＳＥＬのみが活性化される。ＶＣＳＥＬにより送られる入射光の一部が散乱され、検出器６３８は、その散乱された光を検出する。いくつかの場合において、検出器６３８は、前方角度散乱光（ＦＡＬＳ）、小角度散乱光（ＳＡＬＳ）、および大角度散乱光（ＬＡＬＳ）を検出する。いくつかの場合において、６４０に示されているように、この分析の際に、例えば、軸上細胞体積、全ＷＢＣ数、およびＷＢＣ ５分画を含む、多数のパラメータを測定することができる。
【００９７】
図１８は、多数の赤血球パラメータを取得するための例示的なアプローチを示す流れ図である。例示的なアプローチでは、ステップ６６０で血液試料が取得される。次に、血液試料が所望の希釈係数（ＤＦ）となるように希釈され、６６４に示されているように球状化される。次いで、希釈され、球状化された血球は、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの光源６１６は、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に光を当てる。（複数の）ＶＣＳＥＬにより送られる入射光の一部が散乱され、検出器は、その散乱された光を検出するために使用される。いくつかの場合において、検出器は、それぞれの細胞について前方角度散乱光（ＦＡＬＳ）と小角度散乱光（ＳＡＬＳ）の両方を検出する。次いで、プロセッサなどが、それぞれの細胞に対する２つの独立の散乱パラメータ、つまり、ＳＡＬＳおよびＦＡＬＳを、
｛ＳＳＡＬＳｉ，ＳＦＡＬＳｉ｝→｛ｄｒｂｃｉ，ＣＨＣｉ｝
のように細胞直径パラメータおよび細胞ヘモグロビン濃度パラメータにマッピングすることができる。
【００９８】
６７０に示されているように、散乱ＳＳＡＬＳｉプラスＳＦＡＬＳｉの強度が所定の検出閾値以下の場合、制御はステップ６６８に戻される。しかし、散乱ＳＳＡＬＳｉプラスＳＦＡＬＳｉの強度が所定の検出閾値よりも大きい場合、制御はステップ６７２に渡される。ステップ６７２で、ＳＳＡＬＳｉとＳＦＡＬＳｉの合計が所定の血小板閾値よりも大きいかどうかを判定する。ＳＳＡＬＳｉとＳＦＡＬＳｉの合計が所定の血小板閾値以下である場合、粒子「ｉ」は血小板であると判定され、制御は、ステップ６７４に渡される。ステップ６７４で、計数された血小板の数（ＮＰｌｔ）を１だけ増やし、制御をステップ６６８に戻す。
【００９９】
ＳＳＡＬＳｉとＳＦＡＬＳｉの合計が所定の血小板閾値よりも大きい場合、その細胞は赤血球であり、制御は、ステップ６７６に渡される。ステップ６７６で、計数された赤血球数（ＮＲＢＣ）を１だけ増やし、制御をステップ６７８に戻す。ステップ６７８で、所定の測定時間に達したかどうかを判定する。所定の時間に達していない場合、制御はステップ６６８に戻される。
【０１００】
ステップ６７８で、測定時間に達した後、制御はステップ６８０に渡される。ステップ６８０で、例えば、試料流量（ＦＲ）、測定時間（Ｔ）の長さ、試料希釈係数（ＤＦ）、計数された赤血球数（ＮＲＢＣ）、計数された血小板数（ＮＰｌｔ）、それぞれの細胞の直径（ｄｒｂｃｉ）、およびそれぞれの細胞のヘモグロビン濃度（ＣＨＣｉ）を含む多数の測定パラメータを示す。これらのパラメータから、またステップ６８２に示されているように、例えば、赤血球数（ＲＢＣ＝ＮＲＢＣ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、血小板数（Ｐｌｔ＝ＮＰｌｔ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、平均細胞ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ＝＜ＣＨＣｉ＞）、平均細胞体積（ＭＣＶ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３＞）、平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３×ＣＨＣｉ＞）、相対分布幅（ＲＤＷ＝［（π／６）×ｄｒｂｃｉ３］／ＭＣＶの標準偏差）、ヘマトクリットパラメータ（Ｈｃｔ＝ＲＢＣ×ＭＣＶ）、および／またはヘモグロビン濃度（Ｈｂ＝ＭＣＨＣ×Ｈｃｔ）を含む、多数の赤血球分析パラメータが計算されうるが、ただし、表記＜Ｘｉ＞は、すべての細胞Ｘｉにわたる平均細胞パラメータを意味する。
【０１０１】
図１９は、血液試料を分析するための他の例示的なアプローチを示す概略流れ図である。この例示的なアプローチでは、ステップ７００で示されているように、血液試料が取得され、血液試料貯蔵容器に送られる。次に、血液試料が、取り外し可能カートリッジ内の抗凝血剤コーティング毛細管に送られ、希釈される。次いで、血液試料は、分割され、赤血球および血小板（ＲＢＣ／Ｐ）測定流路７０４ならびに白血球（ＷＢＣ）測定流路７４０に送られる。
【０１０２】
ＲＢＣ／Ｐ測定流路７０４内で、赤血球は、７０６に示されているように最初に球状化され、次いで、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路７０８の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの第１の光源７１０および関連する光学系は、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路７０８の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に集光ビームを送る。いくつかの場合において、ＶＣＳＥＬデバイスの配列が備えられ、個々の細胞がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路７０８の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞と揃えられる（複数の）ＶＣＳＥＬのみが活性化される。
【０１０３】
個々の細胞／粒子が集束入射光ビームを通過するときに、光の一部がブロックされ、散乱されるか、または他の何らかの方法で遮られるが、検出器により検出されうる（図に示されていない）。２つまたはそれ以上の光源がＲＢＣ／Ｐサイトメトリー流路７０８にそって相隔てて並ぶ異なるスポット上に集束されると、それぞれの細胞の前縁および／または後縁が検出されうる。細胞が１つの集束スポットから次の集束スポットまでの距離を横断するのに要する時間を測定することにより、流量、したがって細胞速度が決定されうる。細胞速度が決定されると、細胞が光ビームをブロックするか、散乱するか、または他の何らかの方法で遮る時間の長さが、細胞サイズおよび／または細胞体積に相関されうる。
【０１０４】
いくつかの実施例では、分析器に他の光源７１４および関連する光学系が備えられうる。光源７１４の関連する光学系は、光を平行にし、ＳＡＬＳおよびＦＡＬＳ散乱などの軸外し散乱を測定することができる。上記のように、ＳＡＬＳおよびＦＡＬＳ散乱は、計数された赤血球数（ＮＲＢＣ）７１６、計数された血小板数（ＮＰｌｔ）７２２、それぞれの細胞の直径（ｄｒｂｃｉ）、細胞体積７１８、およびそれぞれの細胞のヘモグロビン濃度７２０（ＣＨＣｉ）を測定するために使用されうる。これらのパラメータから、また上述のように、例えば、赤血球数（ＲＢＣ＝ＮＲＢＣ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、血小板数（Ｐｌｔ＝ＮＰｌｔ／（ＤＦ×ＦＲ×Ｔ））、平均細胞ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ＝＜ＣＨＣｉ＞）、平均細胞体積（ＭＣＶ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３＞）、平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ＝（π／６）×＜ｄｒｂｃｉ３×ＣＨＣｉ＞）、相対分布幅（ＲＤＷ＝［（π／６）×ｄｒｂｃｉ３］／ＭＣＶの標準偏差）、ヘマトクリットパラメータ（Ｈｃｔ＝ＲＢＣ×ＭＣＶ）、および／またはヘモグロビン濃度（Ｈｂ＝ＭＣＨＣ×Ｈｃｔ）を含む、多数の赤血球分析パラメータが計算されうるが、ただし、表記＜Ｘｉ＞は、すべての細胞Ｘｉにわたる平均細胞パラメータを意味する。
【０１０５】
例示的なＷＢＣ測定流路７４０では、赤血球が溶解され、７４２に示されているように、染料が適宜注入される。次いで、細胞は、流体力学的に集束され、取り外し可能カートリッジ内のＷＢＣサイトメトリー流路７４４の下に一列縦隊で送られる。垂直キャビティ面発光レーザー（ＶＣＳＥＬ）などの光源７４６は、個々の細胞がＷＢＣサイトメトリー流路７４４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞に光を当てる。いくつかの場合において、ＶＣＳＥＬデバイスの配列が備えられ、個々の細胞がＷＢＣサイトメトリー流路７４４の分析領域を通り過ぎるときにそれらの細胞と揃えられる（複数の）ＶＣＳＥＬのみが活性化される。
【０１０６】
個々の細胞／粒子が集束入射光ビームを通過するときに、光の一部がブロックされ、散乱されるか、または他の何らかの方法で遮られるが、検出器により見つけることができる（図に示されていない）。２つまたはそれ以上の光源がＷＢＣサイトメトリー流路７４４にそって相隔てて並ぶ異なるスポット上に集束されると、それぞれの細胞の前縁および／または後縁が検出されうる。細胞が１つの集束スポットから次の集束スポットまでの距離を横断するのに要する時間を測定することにより、流量、したがって細胞速度が決定されうる。細胞速度が決定されると、細胞が光ビームをブロックするか、散乱するか、または他の何らかの方法で遮る時間の長さが、細胞サイズおよび／または細胞体積に相関されうる。
【０１０７】
いくつかの実施例では、分析器に他の光源７５０および関連する光学系および／または偏光器が備えられうる。光源７５０の関連する光学系は、光を平行にし、７５４に示されているように、ＳＡＬＳ、ＦＡＬＳ、およびＬＡＬＳ散乱などの軸外し散乱を測定することができる。上記と同様に、ＳＡＬＳ、ＦＡＬＳ、およびＬＡＬＳ散乱は、例えば、計数された白血球数（ＮＷＢＣ）７５２を測定するとともに、７５６に示されているように、白血球の分画を行いやすくするためにも使用することができる。いくつかの場合において、１つまたは複数の偏光器を備え、これにより、光源から発せられる光を偏光することができ、また検出器で検出された偏光消光／回転のレベルを使用して、白血球の分画を実行しやすくすることができるが、これはすべての実施例において必要というわけではない。
【０１０８】
血液試料中のヘモグロビン（Ｈｂ）の量またはヘモグロビン濃度を決定するために、別のモジュールが使用可能である。モジュールは、ヘモグロビン吸収を使用してＨｂを決定することができる。血液中のヘモグロビンの量は、グラム／リットルまたは他の単位の組み合わせで表すことができる。例示的な一実施例では、ＷＢＣサイトメトリー流路７４４を出た細胞を、バルク吸収流路７６０に送ることができる。光源７６２は、吸収流路７６０内に存在する細胞上に光を当て、検出器７６４は、常在細胞により吸収されない光を検出することができる。そこで、吸収流路７６０を、常在細胞のバルク吸収レベルを測定するために使用できる。例えば、吸収レベルは、血液試料中のバルクまたは平均細胞ヘモグロビン濃度の尺度となりうる。ヘモグロビン流路は、出力値再ゼロ調整光学系およびオートフォーカスおよび／またはアライメントを備えることができる。光源７６２は、吸収ピークの中心に近い出力を有するＬＥＤであってよく、したがって場合によってはフィルタが不要になる。ヘモグロビンに関して評価される試料を受け入れ、保持するためのキュベットがあってもよい。
【０１０９】
図２０は、ＨＧＢカード７７０またはモジュールの一実施例を示している。乾燥溶解粉末の堆積／プリントがある場所を示す溶血剤堆積領域７７１があってもよい。ＨＧＢ測定精度を改善するために乾燥溶解粉末により血液溶解時に発生する気泡をなくす気泡トラップ配置を示す領域７７３内の一番最後のターンにちょっと動かされたコーナー７７２がありうる。
【０１１０】
図２１は、散乱光学サブシステム５０１および蛍光光学サブシステム５０２を示すサイトメーターカートリッジ５００を示している。光学サブシステム５０１は、それぞれの側面流路５３０上に窓または開口部３０ａを備え、光学サブシステム５０２は、窓または開口部３０ｂを備えることができる。それぞれのサブシステムにおいて、流路５３０のそれぞれの側面に窓または開口部があってよい。これらの開口部は、光学的挿入物またはレンズを備えることができる。このサイトメーターは、人体に身につける、人体に取り付ける、または人体に挿入するように実装されうる。
【０１１１】
図２２は、それぞれ光学サブシステム５０１および５０２を組み込むことができるシステム５０３および５０４を示している。システム５０３は、さらに、コア流１６０内の白血球などの粒子の散乱測定のためＶＣＳＥＬ配列２２ａおよび検出器配列２４ａを備えることもできる。このシステムは、リンパ球および好中球の計数および分類に使用されうる。セルフアライメントも、赤色ＶＣＳＥＬ配列ベースの光学サブシステムにより使用可能にできる。ここでは散乱システム５０３の例示的ないくつかの実施について説明する。
【０１１２】
システム５０４は、白血球および血中タンパク質の特定のサブクラスを同定し、計数するために使用される蛍光励起および検出機構であってよい。白血球のサブクラスの検出は、好適な抗体が利用可能であれば使用可能にすることができ、これらの抗体の多くは蛍光性共役形態で市販されている。図２３は、血液組成と、蛍光システム５０４による計数および同定を適用されうる細胞の略図を示している。赤血球は、本明細書で説明されているように溶解によりサイトメーターを使って見られる試料から取り除くことができる。血小板は、白血球をチェックするときにサイズの小ささがサイトメーターの結果に影響を及ぼさないときに保持されうる。例示的な一実施例では、図２３の構造に示されている、ＣＤ４陽性Ｔ細胞５０５は、ＨＩＶ感染の臨床経過を辿る際に非常に重要と思われる血液中の割合および計数を有する。図２４ａに示されているように、ＣＤ４に関連付けられるマーカーを有する抗体を血液試料中で混合し、その結果として抗体（ＡＢ）５０６の「Ｙ」に見える構造とＣＤ４細胞５０５に付着しているそのマーカー（Ｍ）５０７を得る。光源２２ｂは、マーカー５０７により吸収されうる光を放射することができる。応答として、マーカー５０７は、蛍光を発し、ＣＤ４細胞５０５を同定するために検出されうる特定の波長の光を放射することができる。
【０１１３】
炭疽病について血液をチェックすることは、本発明のサイトメーターを使用できる他の応用である。炭疽をもたらすバクテリア５０９に対する抗体を血液試料と混合することができる。抗体は、バクテリア５０９と結びつきうる。これらの抗体は、光が衝突したときに蛍光を発するマーカー５１０を備えることができる。抗体５０８の「Ｙ」構造は、図２４ｂに示されている。マーカー５１０は、ＣＤ４細胞５０５に対する抗体５０６のマーカー５０７の帯域幅と異なっていてもよい特定の帯域幅の光を放射する。したがって、炭疽病問題は、異なる波長、色、またはシグネチャを有する蛍光発光による同じ血液試料検査におけるＨＩＶ問題と別に識別されうる。同じ血液試料中で同じときに検出される異なる問題の個数は、２つよりもはるかに多いことがある。
【０１１４】
他の例示的な実施例では、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（タンパク質の一種）は、骨髄抑制化学療法を受けている癌患者体内の好中球を計数することについて考慮することができる。この両方を行っている間、白血球数を正確に監視している必要があると思われる（特に、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）療法期間の好中球、単球、および血小板の個数）。本発明のサイトメーターは、自宅にいる化学療法患者のそのようなパラメータを監視するために未熟練者によって使用されうる。
【０１１５】
小型化された携帯型サイトメーターは、さらに、生物戦争でも使用できる。これは、生物兵器の定量的検出および同定に使用されうる。この検出および同定は、蛍光測定により実装されうる抗体−抗原タイプの免疫アッセイに基づくことができる。生物学的作用物質が存在する可能性がないか、環境、水、および食品が監視されうる。これは、サイトメーターに適した試料捕集および準備を伴うことがある。サイトメーターの他の用途としては、ハイスループット分析（蛍光検出機能を使用する）およびＤＮＡとＲＮＡの配列決定、潜在的薬物に対する細胞の反応の研究、白血病とリンパ腫の免疫表現型検査および癌患者の余病の監視、および起こりにくい事象の母集団の高速分離を含む、細胞選別および細胞単離がある。いくつかの用途および使用は、分析段階において操作者介入または調節を必要とせず、熟練者が計測装置を操作する必要がなく、とりわけ、一体型光学系および内部血液試料処理機能を有する衛生的な使い捨てのプラスチックまたは他の材料ベースのマイクロ流体カートリッジ１４を使用する、コンパクトな高精度流体駆動システムを有する低電力低コストの単一の小型化された携帯型一体型散乱および多色蛍光サイトメトリー計測装置により達成することが可能である。
【０１１６】
図２２のシステム５０４は、流路５３０内を一列縦隊で流れる粒子５１２に光５１１を当てるように位置決めされたレーザー光源２２ｂを備えることができる。例示されている目的に関して、粒子５１２は、それぞれ図２４ａおよび２４ｂの構造５１３および５１４を含むことができる。光５１１は、例えば、それぞれ６５０から７００ナノメートルまたは３８０から４２０ナノメートルの帯域幅を取りうる、発光ダイオード（ＬＥＤ）などの赤色または青色レーザー光源から放射できる。適切な波長を有する他のタイプの光源も、光５１１に使用できる。光５１１が蛍光マーカー５０７および５１０に当たると、これらのマーカーは、蛍光を発し、光５１５および５１６をそれぞれ放射することができる。これらのマーカーは互いに異なるため、光５１５および光５１６は、異なる波長を取りうる。したがって、構造５１３および５１４は、放射光の波長により識別可能であるが、同じ試料、血液、または他のものにおいて互いに区別できる。光５１５および５１６は、異なる方向にそれぞれを向けることにより２つのビームを分離する２色性ビームスプリッタ５１７に進むことができる。ビーム５１６は、光５１６を検出して電気信号５２０に変換しプロセッサ４０に送る蛍光検出器５１８に進むことができる。ビーム５１５は、光５１５を検出して電気信号５２２に変換しプロセッサ４０に送る蛍光検出器５２１に進むことができる。ビーム５１６の経路内にある、帯域通過フィルタ５１９は、ビーム５１６内に存在するように管理されている光源２２ｂからの光５１１を除去することができる。帯域通過フィルタ５２３は、ビーム５１５に対するフィルタ５１０と同じ目的でビーム５１５に対し使用されうる。鏡５２４は、検出システム５０４のパッケージングを小型化できるように、または他の理由から、検出器５２１の配置の目的に関してビーム５１５の向きを変えるために使用されうる。鏡５２４は、その一方で、ビーム５１５および５１６とは異なる波長の光５２５を分割する他の２色性ビームスプリッタであってよい。さらに他の周波数の光を分割するためにカスケード状の構造、または他の構造でさらに多くのスプリッタを使用することも可能であろう。さらに、プロセッサ４０に進むのは、散乱検出システム５０３の検出器配列２４ａからの信号である。光源２２ａおよび２２ｂは、１つの光源で置き換えることができることに留意されたい。
【０１１７】
スプリッタ５１７は、さまざまな波長の光を分離するか、または特定の波長を選択するため他の機構で置き換えることもできる。これらは、さまざまな種類のノッチおよびステップ関数フィルタ、同調可能回折格子、薄膜誘電体スタック、ミラービームスプリッタ、光バンドギャップフィルタ、フォトニック結晶、同調可能帯域通過フィルタ、エタロンくし形および他の構造、構造的または他のフィルタリング機能を持つ導光器を有するウェハ、または吸収／フィルタリングについて特定のサイズおよびピッチの導波路およびミシン目を有するシリコンまたはガラスウェハなどを備えることができる。
【０１１８】
図２５は、蛍光光学サブシステム５０２の例示的な一実施例を示している。ビーム５１１は、光源２２ｂにより放射され、窓３０ｂを通してマイクロレンズ５２６により粒子５１２に集束されうる。光ビーム５１１は、平行である場合もない場合もある。粒子５１２は、蛍光を発し、窓３０ｂ、薄膜コーティングフィルタ５２７、およびマイクロレンズ５２８を通して光ビーム５１５、５１６を放射するマーカーを有することができる。フィルタ５２７は、光源２２ｂからの光５１１を除去することができる。フィルタ５２７は、レンズ５２８の下に配置された誘電体スタックであり、光源２２ｂｎの光５１１をブロックするノッチまたはステップ関数フィルタとすることができる。レンズ５２８は、マーカーから放射された蛍光をビーム５１５／５１６に集束し、ビームはスプリッタ５１７などのビームスプリッタへ進むことができる。ビーム５１５／５１６は、平行である場合もない場合もある。不透明層または吸収層５２９は、流路５３０のガラス、石英、またはプラスチック（積層されているか、または積層されていない）基板５３１上の窓３０ｂまたはレンズ５２８の周り、または前後に形成されうる。層５２９は、光源２２ｂから放射される光５１１が蛍光５１５／５１６とともに出るのをブロックすることができる。層またはブロッキングフィルタ５２９は、ブロックされることが望ましい波長帯に対し黒色であるか、または不透明である薄膜とすることができる。フィルタ５２９は、ノッチまたはステップ関数フィルタとすることも可能であろう。他のガラス、石英、またはプラスチック（積層されているか、または積層されていない）基板５３２は、粒子５１２に対するコア流用の流路５３０を形成することができる。基板５３１および５３２、窓３０ｂ、ならびにレンズ５２６および５２８は、蛍光発する可能性のある成分を含んでいてはならない。例示的な一実施例では、光源２２ｂからの光５１１の方向は、粒子５１２から放射された蛍光５１５／５１６の方向に関して約９０度としてよい。光源５１１と放射された蛍光５１５／５１６との間の角度により、事実上、蛍光５１５／５１６とともに出てくる光源からの光が低減されるか、または除去されうる。実施例における光源２２ｂからの光５１１の方向の角度は、縦寸法流路５３０の方向または粒子５１２のコア流の方向に関して約４５度とすることができる。しかし、いくつかの用途では、光５１１と光５１５／５１６の方向の間の角度は、０から１２０度までの範囲とすることができる。
【０１１９】
図２６は、図２２のサイトメーター構成の図を示しているが、ただし、レンズ５４１および５４２が配置されている。本明細書で述べられているように、窓および開口部３０ｂは、レンズ５４１および５４２に加えてマイクロレンズを備えている場合も備えていない場合もある。単一の光源バージョン（光源２２ａと２２ｂの代わりに）も、類似のレンズおよび／またはマイクロレンズ光学配置を取ることができる。
【０１２０】
図２７は、手首または手のひらの周りに着けられるように適合された散乱および蛍光検出および監視の両方を行う小型化された携帯型サイトメーターの例示的な実施例を示す斜視図である。このサイトメーター８００は、図７、２１、３１、３３、および／または３７に示されているものと類似しているものとしてよい。バンド８０２は、小型化された携帯型サイトメーター８００をユーザーの手首に固定することができる。
【０１２１】
本明細書で示されているように、ユーザーは、取り外し可能カートリッジを取得し、血液試料を取り外し可能カートリッジの試料捕集装置口３２（図７、２１、２２、および２６を参照）に送ることができる。血液試料は、例えば、指に針を刺すことで集めることができる。ユーザーは、次いで、取り外し可能カートリッジを筐体内に挿入し、手動でシステムを加圧することができる。次いで、小型化された携帯型サイトメーターは、ユーザーが医療を求めるべきかどうかを示す読み取り値を与えることができる。この読み取り値は、視覚的読み取り値、可聴音、または他の好適なインジケータとすることができる。
【０１２２】
指を針で刺すなどの方法で血液試料を取得する代わりに、カテーテル８０４などをユーザーの静脈に挿入し、試料捕集装置口３２に取り付けることができる。これにより、システムは、読み取り値が必要な場合に血液試料をユーザーから自動的に捕集することができる。それとは別に、小型化された携帯型サイトメーターは、試料捕集装置口３２が好適な血液供給源に接続された状態でユーザー体内に埋め込むことができると考えられる。
【０１２３】
図２８に示されている流路８６５は、約１００×２００ミクロンの断面積を持つことができる。粒子８６８のコア流８６７は、約１５〜２０ミクロンの幅としてよい。光８６６のスポットは、６７０ｎｍの赤色光に対し約２０×１８０ミクロンとすることができる。図２８に例示されているように、コアは、粒子位置８７１および８７２により示されているように並んで移動することができる。一列縦隊の白血球８６８のコア流８６７に当たる光８６６からの散乱光８６９は、検出要素８７４で１から３度の帯域（ＦＡＬＳ）を測定し、散乱光８６９の検出要素８８１により３〜１１度の帯域（ＳＡＬＳ）を測定する光検出器８７３によりプロットすることができる。検出器８７３は、さらに、大角度散乱（ＬＡＬＳ）も測定することができる。
【０１２４】
純粋な散乱では、これらのタイプの白血球を同定することができる。ＦＡＬＳ対ＳＡＬＳデータについては図２９ａ、ＦＡＬＳ対ＬＡＬＳデータについては図２９ｂに散乱のプロットが示されている。図６ａおよび６ｂは、本明細書では、いくつかの実験試行結果からのＦＡＬＳ対ＳＡＬＳのプロットを示している。図２は、細胞の５分画を示している。図２９ａと２９ｂのプロットにより、５種類の白血球を同定することができ、曲線８８６はリンパ球を表し、曲線８８７は好中球を表し、曲線８８８は好酸球を表し、曲線８８９は好塩基球を表し、曲線８８０は単球を表す。図２８の検出器８７３は、環状検出器とすることができる。しかし、代わりに、直線状検出器であってもよい。環状検出器は、高品質の検出を行うことができるが、直線状検出器は、比較的安価である。
【０１２５】
白血球の種類のほかに、それぞれの種類にさまざまな種がありうる。例えば、リンパ球には、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、または他の種がありうる。種を同定するのに散乱とは別のアプローチが必要である。例えば、ＣＤ４にはＹ字型抗体があり、その抗体上に青色蛍光標識またはマーカーを付けることができる。他の色の蛍光標識で印を付けられるＣＤ５に対する他の抗体もありうる。さまざまな色に対する標識の計数は、他の波長の光ビームでマーカーまたは標識を励起することにより行うことができる。蛍光を検出するために、光増倍管を使用できる。ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＸＸなどの数が計数されうる。後のイベントは、散乱では実行されない。しかし、散乱は、それでも必要であり、余分な付着していない抗体による誤計数をなくすために使用されうる。
【０１２６】
全血を採って、溶解し（つまり、赤血球を除去し）、白血球と抗体で終わらせることができる。白血球は、抗体複合体を有することがある。リンパ球が１００個あった場合、種同定および計数を目的として１００個の抗体が必要であろう。ＣＤ４およびＣＤ５のほかの他の種についても抗体がありうる。種を見逃さないために、いくつかの余分な標識抗体がありうる。余剰分の抗体がありうるが、光散乱が細胞の計数に使用できるので、細胞に付着している抗体のみが計数される。光散乱は、標識されている付着してない抗体を探し出すために使用されうる。
【０１２７】
細胞の寸法は、１２ミクロン程度であるが、抗体の寸法は、数百ナノメートルの範囲である。磁気標識の使用など、標識付けには他のアプローチもありうる。重要な点は、ある種の白血球のそれぞれの種、例えば、ＣＤ４、ＣＤ５、．．．について、それぞれの種に対し別の、異なる色を必要とする場合があるという点である。例えば、単一流路内の２０個のさまざまな種を同定するために２０の異なる色が必要になる。
【０１２８】
励起された蛍光標識のさまざまな色が、１つのビームとして放射されうる。これらの色は、それぞれ異なる色に調節された一連のスプリッタで大きな力、または強引な力で分離させることができる。単一光ビームにおけるさまざまな色の分離および検出のよりコンパクトなアプローチは、プリズムまたは回折格子で分離するというものである。例えば、波長は、４００、４３０、４５０、．．．、６７０ｎｍなどとしてよい。
【０１２９】
生物学的種は、白血球のようなものに対する適切な基準としてよい。観察される試料は、環境からとったものでよく、炭疽菌とすることが可能であろう。ＣＤ４は、炭疽菌で置き換えることができる。言い換えると、抗体を使用することができ、またＣＤ４に使用される抗体を置き換えることができるということである。１つのシステム内で複数の薬剤などのさまざまなもののそれぞれに対し抗体が必要になるであろう。
【０１３０】
ポリクローナル抗体の代わりに、モノクローナル抗体を使用することができる。図２４ａには、図２４ｂのＣＤ４に対する抗体とＣＤ８に対する抗体を持つリンパ球の図がある。ＣＤ４に対する抗体があるが、ＣＤ８に進み、その結果誤計数が生じうる。これは、ポリクローナル抗体で生じうる問題といえる。この問題は、それぞれがＣＤ４、ＣＤ８、または他の指定された種にのみ付着するように特徴付けられるため、モノクローナル抗体で解決できる。モノクローナル抗体が、比較的高品質であり、ポリクローナル抗体よりもよい精度をもたらすとしても、後者は著しく安価である。モノクローナル抗体は、典型的には、ＣＤ４、ＣＤ５、および類似のドメインに使用されうる。
【０１３１】
指摘されているように、細胞にはサブクラスがありうる。種は、化学兵器作用物質とすることができる。作用物質は、マラリア、ＴＢなどを含むことができ。マラリアは、血液中にあり、したがって、マラリアに対する抗体がありうる。生物学的種は血液中にあり、化学兵器作用物質に水中にあり、疾病は血液中にありうる。３種類の生物学的種は、標識を有する抗体で同定することができる。
【０１３２】
抗原は、例えば、ＣＤ４に付着されたアンテナ（図２４ａ）のように見える。ハンドヘルド型サイトメーターで生物学的種の同定および計数を行うことで、世界中のへんぴな土地でも予防的ケアを実施することができる。ハンドヘルド型サイトメーターは、試料準備および分析のため完全自動化されうる。すべてのサイトメーターではないとしてもほとんどのサイトメーターが、単に指に針を刺して得られただけの試料では機能しない。後者は、サイトメーターの非熟練ユーザー向けに達成可能である。試料は、１月に１回だけ必要になると考えられる。レーザー穿刺は、本発明のサイトメーターで使用することができるが、このようなアプローチは、通常の指に針を刺す方法に比べて高価である。さまざまな他のサイトメーターシステムでは、かなりの量の血液を実際に採血する必要がある可能性がある。
【０１３３】
図３０は、平行アプローチに対するシステム９５０の光学的レイアウトを示している。このアプローチは、２色性ビームスプリッタ９６３、帯域通過フィルタ９６４経路、および検出器９７２が蛍光検出脚内で使用されるものとして定義されうる。検出器９７２は、ＰＭＴまたは他の好適なタイプの検出器とすることができる。光源脚は、流路９６７を照射する２つの光源（９６５、９６６）波長（青色４８８ｎｍおよび赤色６３０ｎｍ）を含むことができる。しかし、代わりに、光源が１つだけであってもよい。前方角度光散乱（ＦＡＬＳ）検出脚は、両方の光源波長において散乱光９６９の測定を可能にする帯域通過フィルタを備える２素子光ダイオード検出器９６８を備えるように示されている。蛍光信号に対しプロットされたときのＦＡＬＳ検出器からの散乱信号により、システムは関連付けられている抗原を持たない標識抗体を同定するので、検出感度が改善される。この平行アプローチでは、単純な検出読み取りを行える。このアプローチの特性は、このアプローチの平行という性質からシステムサイズを増やす結果となりうる４つよりも多い色への拡大、および／またはシステムが拡大されたときの、多数のビームスプリッタ９６３／帯域通過フィルタ９６４を含みうる。
【０１３４】
検出蛍光流路の数を増やせるようにしながらシステムの複雑度を低減するには、直線状検出器配列９５８からなるマイクロスペクトロメーターを使用してすべての蛍光スペクトルを記録する。図３１は、蛍光信号の測定用のスペクトロメーターベースのアプローチに対するシステム９６０の光学的レイアウトを示している。システム９６０は、２つの光源９６５、９６６、またはただ１つの光源を備えることができる。わかりやすくするため、ポンプシステム、電子回路、およびソフトウェアインターフェイスは、この図には示されていない。このアプローチでは、波長、または異なる蛍光染色により放射されるさまざまな色に応じて光を分離するために分散素子として使用されるプリズム９７１（または回折格子）を備えることができる。次いで、分離された色は、光増倍管（ＰＭＴ）配列９５８の個々の検出素子に向けて集束されうる。要約すると、このアプローチにおける蛍光検出脚は、マイクロスペクトロメーターとみなすことができる。ＦＡＬＳ検出脚は、図３０に示されている平行アプローチのＦＡＬＳ検出器９６８に類似のものでよい。検出脚内のマイクロスペクトロメーターを使用することにより、図３０に示されているアプローチと同様の複数の平行蛍光流路を不要にできる。マイクロスペクトロメーターは、ＣＣＤ検出器配列を備えることができる。これらの検出器配列は、標識抗体により発生する蛍光信号を適切に感知するために十分な感度を必要とし、毎秒１００〜１０００個の速度で流れる細胞からの離散信号については特に十分な感度が必要である。マイクロサイトメーター９５０は、小さなシステムフットプリントにおいて４つを超える色に拡大することができる。最大色数は、現在利用可能なのが１×３２ＰＭＴ配列であるため３２としてよい。しかし、マイクロサイトメーター９５０の色数を増やすために、さらに大きなＰＭＴ配列も利用可能である。図３１のシステム９６０では、プリズム９７１、格子などを光分散素子として使用できる。
【０１３５】
図３１では、ＰＭＴ検出器配列９５８は、システム９６０全体の信号対雑音比に関係する特定の充填率を持つことができる。しかし、光源の出力は、適宜変更することができ、カスタム光学系は、さまざまなＰＭＴ配列のピッチに合わせて手直しすることができる。検査のため、選択されたＢＷ薬剤および模擬薬に対しモノクローナル抗体を利用できるかどうかをチェックすることができる。モノクローナル抗体が利用可能なものに対する検査のため、適切な不活性化された薬剤／模擬薬を選択できる。
【０１３６】
図３２の表は、サイトメーター９５０または９６０のＡＩＤＳ／マラリアバージョンに組み込むことができる有意なパラメータを明らかにしている。この図は、ＡＩＤＳ／マラリア用途に使用できる光学ベースのサイトメーター９５０、９６０を示す。３流路（１つは散乱用、２つは蛍光用）アプローチが使用可能である。システムは、全体的サイズを大きく変えることなく６つ以上の流路に容易に拡大できる。例えば、検出空間内で全部で散乱流路１つ、蛍光流路４つを、計測装置用とすることができる（ＡＩＤＳおよびマラリアは、異なる蛍光流路を必要とすると仮定する）。ただし、白血球数を分画する（少なくとも３分画）機能は、特定の感染症（ウイルスおよびバクテリア）を診断し、監視するための計測装置の重要な拡張機能であると理解できる。技術的には、このような拡張機能は、３つの散乱流路（図３２においてオプションの散乱流路として説明されている）と場合によっては２つのサイトメーター測定流路をカード上に必要とする場合がある。しかし、１つの測定流量で十分と思われる。そのため、技術的なオプションとして、ＡＤＩＳ／マラリアＰＯＣサイトメーターの実験室内評価にこれを加えることを検討してもよい。照明側では、少なくとも１つの赤色抗原が、適切な蛍光プローブとともにＡＩＤＳアッセイに必要になる場合があり、また赤色と青色の両方の光源が、マラリアアッセイに必要になる場合がある。同じ赤色光源を、散乱測定と蛍光測定の両方に使用することができる。カートリッジの複雑さに関して、ＡＩＤＳアッセイとマラリアアッセイは両方とも、同じ数のフローセンサーおよび試薬貯蔵容器を必要とすることがある。ＡＩＤＳアッセイでは、同じサイトメーター測定流路および同じレーザー光源が、散乱測定と蛍光測定の両方に使用されうる。
【０１３７】
光学的サブシステムの基準アプローチでは、ＡＩＤＳとマラリアの両方に対する必要な性能を実現するには、細胞散乱（例えば、ＷＢＣ数および分画の種類）および多色蛍光（例えば、ＣＤ４／ＣＤ４５／ＣＤＸＸ同定、計数、およびマラリア種病原体決定）の両用の測定を必要とすると仮定できる。光学的サブシステムは、赤色励起蛍光プローブ、および複数の光学的散乱および蛍光流路と１つの光源との一体化を組み込むことができる。
【０１３８】
図３３（図３０に類似している）は、基準アプローチとしてみなせる光学的レイアウトを備え、蛍光検出脚において２色性ビームスプリッタ９６３、帯域通過フィルタ９６４、および検出器９７２の平行流路を有するシステム９５０を示している。光源脚は、使い捨て型試料カートリッジ９５２内に埋め込まれている流路９６７を照射する赤色（９６６）および青色（９６５）の波長（例えば、６３０ｎｍおよび４８８ｎｍ）の２つのレーザーを有することができる。しかし、代わりに、レーザーが１つだけであってもよい。図に示されているように、１つまたは複数の光源９６６、９６５は、光源をサイトメーター流路９６７のコア流９７４内の細胞９７３の流れに自動的に揃えることを可能にする一軸微小平行移動ステージの形態の自動アライメント機能を組み込むことができる。ＶＣＳＥＬ配列が光源として使用される場合、光源をコア流９７４の細胞９７３に揃える自動電子セルフアライメントを実行することができる（細胞の流れに揃う適切なＶＣＳＥＬを選択することにより）。この電子セルフアライメント機能により、ＰＯＣサイトメーターがメンテナンスフリーになり、開発途上国の現場で使用できる堅牢さを有することができる。
【０１３９】
図３３は、さらに、ＡＩＤＳ／マラリア用途に使用できる光学ベースのＰＯＣサイトメーターに対するアプローチを示す。３流路（１つは散乱用、２つは蛍光用）アプローチがここに示されている。このアプローチは、全体的サイズを大きく変えることなく６つ以上の流路に拡大できる。図を簡単にするため、散乱検出脚は、この図に示されていない（しかし、図３０には示されている）。散乱光は、全ＷＢＣ数を測定するために、ＦＡＬＳチャネルと従来から呼ばれている小角度の少なくとも１つの範囲（約１から３度）において必要になるが、ＳＡＬＳ（約５から１０度）およびＬＡＬＳ（大角度散乱）などのより高い角度における追加の角度ビンは、さまざまな種類の５つの異なる白血球を分画するために、必要になる場合がある（図２９ａおよび２９ｂに示されているように）。システム９５０のシリコン光ダイオード検出器９６８（図３０）は、小さな角度で散乱された光には適している場合があるが、小型光増倍管（ＰＭＴ）は、９０度散乱およびすべての蛍光流路に対してより効果的であると思われる。さらに、ＦＡＬＳ（約１から３度）検出器からの散乱信号が蛍光信号に対しプロットされた場合、システムは抗原を持たない標識抗体を同定することができ、その結果、検出感度が改善される。このアプローチの結果として、大半の市販の大きなベンチトップサイトメーターで使用される実証済みのアプローチに基づく単純な検出結果読み出しが行える。ＡＩＤＳとマラリアの両方のアッセイに、４つの蛍光検出流路があれば十分であると思われる。
【０１４０】
ＨＩＶアッセイについては、実験室用使い捨て型カートリッジまたはカード９５２上でＣＤ４／ＣＤ４５抗体−抗原捕捉により白血球を標識することができる。フローサイトメトリー検査では、カード９５２は、全血の試料約１０μＬを処理し、ＣＤ４およびＣＤ４５（および／またはＣＤＸ、ＣＤＸＸ）により白血球を染色し、赤血球を溶解し、残りの細胞をオンカードサイトメーター流路内に集めてＰＯＣサイトメーター９５０によりプレゼンテーションおよびサイトメトリー分析を実行することができる。これは、ＡＩＤＳ（ＣＤ４）アッセイに使用されるクレジットカードサイズの使い捨て型カートリッジ９５２とすることができる。カード９５２は、図３３に示されているように、フローセンサー９７５、オンザフライ溶解ループ９７６、オンザフライ染色ループ９７７、流路９６７、血液貯蔵容器９７８、および試薬貯蔵容器９７９を備えることができる。
【０１４１】
使い捨て型カートリッジ９５２内には検査用の処理があってよい。全血試料は、指に針を刺すことで得られる。血液は、オンカード試料ループ内で貯蔵できる。抗体および再水和緩衝液を用意することができる。また、血液細胞の標識付け（つまり、抗体抗原結合）も行える。次いで、赤血球が、オンカード溶血剤による溶解に出会う。溶解された血液は、細胞９７３がオンカードシース試薬とともに流路９６７内のコア流９７４として一列縦隊で集束される場所に進むことができる。細胞９７３に関する情報が得られた後、血液はオンカード廃棄物室に進むことができる。
【０１４２】
同様に、２色マラリアアッセイでは、さらに、カートリッジ上に試料、抗体−抗原捕捉、試薬混合、および他のアッセイプロトコルを一体化すすることができる。このアプローチは、マラリアアッセイを含むことができる。マイクロ流体力学ベースのアッセイでは、図３６の表の特徴の比較により示されるように、高価な試薬の消費量を減らし、アッセイ手順を簡素化し、今日のベンチトップサイトメーターで使用される従来のアッセイと比べて全体的アッセイコストを低減することができる。
フローサイトメーター９５０または９６０は、ＡＩＤＳ監視／マラリア診断のため遠隔地で使用できる。サイトメーター９５０または９６０のような迅速で、配備可能であり、低コストである（計測装置およびアッセイのコスト）計測装置は、市販の大型のフローサイトメトリーシステムに匹敵するか、またはそれ超えるよい結果をもたらしうる。それに加えて、マラリアの場合、これは、感染種を同定することができる低コストで、使いやすいＰＯＣフローサイトメトリースクリーニングの必要性を満たすことができる。携帯型サイトメーター９５０または９６０は、開発途上国世界のへんぴな地域でそのようなスクリーニングを行う場合にいくつかの利点を有すると思われる。これらの利点としては、特定の治療を必要とする可能性のある患者の迅速で簡単な識別、関連死亡率および疾病率を有する重度のマラリアへの進行の低減、寄生体抵抗の予防、および多くの人々の良好な患者予後が挙げられる。
【０１４３】
ＣＤ４および類似の監視について市販の、いくぶん小型化されているサイトメーターと本発明のサイトメーターとを比較すると、後者が最も有利であることがわかる。サイトメータープラットフォーム９５０または９６０は、開発途上国世界のポイントオブケア環境におけるマラリア診断洋の第１の実用的なサイトメーターベースのプラットフォームとみなすことができる。サイトメーター９５０または９６０は、安価で、携帯性に優れ、非熟練者にも扱いやすく、必要なメンテナンスの少ない、感染症のＰＯＣ診断および監視の最新技術を推進することができる。
【０１４４】
サイトメーター９５０または９６０は、ＡＩＤＳおよびマラリアのアッセイに対するフル機能を備えることができる。しかし、最初に、プログラム実行時に組み立てられるすべての計測装置の機械的筐体および固定具に、一部のスロットが埋まっていないとしても、全ＡＩＤＳ／マラリア測定機能用に空間とスロットを割り当てておくことができる。
【０１４５】
蛍光ビーズ、全血、およびマラリア模擬薬は、目標試料として使用することができる。機械的筐体に加えて、ＰＯＣ計測装置９５０または９６０は、複数のサブシステムを備えることができる。サブシステムのいくつかは、流体駆動装置（ポンプ）サブシステム、光学的サブシステム、駆動および感知電子回路、ならびにソフトウェアおよびグラフィカルユーザーインターフェイスを備えることができる。ＣＤ４アッセイでは、より複雑なゲーティング法ともよく合うように見える、Ｐａｎ−ｌｅｕｃｏｇａｔｉｎｇなどの確立されているゲーティングアルゴリズムを使用する計画を立てることもできる。
【０１４６】
駆動感知電子回路、アルゴリズム、およびソフトウェアは、所定の入力試料の模擬薬およびＢＷ薬剤などの臨床または環境試料を検査するように構成されうる。分析カートリッジにより、試料調製を行い（市販の試薬の化学的性質をカスタマイズする）、生物学的試料中のＢＷ薬剤を検出することができる。カードまたはカートリッジは、試料入口および試薬オンカード貯蔵容器を備えることができる。さらに、カードまたはカートリッジ上に、廃棄物保管貯蔵容器、抗体が抗原と混合される場所、および生物学的薬剤のサイトメトリー分析が少なくとも一部は実行される場所を用意することもできる。
【０１４７】
ポンプ機能は、ＰＯＣ分析器計測装置に関して注意すべき因子である場合がある。いくつかの血液学分析器およびフローサイトメーター内のポンプシステムは、ステッパーモーターにより駆動される注射器ポンプにより発生する体積制御流量に基づくことができる。このようなシステムは、正確であるが、かさばり／電力を食い、ＰＯＣ計測装置で使用するのには適さないと思われる。ＰＯＣ血液学分析器の開発の一環として、図３４に示されているように、閉ループで動作する小型化された圧力駆動（体積駆動とは反対の）ポンプシステムが使用可能である。ポンプシステムは、それぞれ試料９０３およびシース液９０４を供給するためマイクロ弁９０８とともに高圧および低圧室９０１および９０２を備えることができる。試料９０３およびシース液９０４の流れの量は、フローセンサー９０５および９０６により決定されうる。流量指示は、制御ループ制御電子回路９０７に進むことができる。電子回路９０７は、フローセンサー９０５および９０６からの指示に基づき、信号をポンプシステムに送信し、流体９０３および９０４の流れをいくつかの所望のレベルに制御することができる。試料流体９０３およびシース液９０４は、ポンプで多岐管９０９内に送り込むことができる。多岐管９０９から、試料９０３およびシース９０４がサイトメーター９１０および流体チップ９１１上のその流路９６７内に入ることができる。
【０１４８】
本発明のサイトメーターでは、閉ループで動作する小型化された圧力駆動（体積駆動とは反対の）ポンプシステムが使用できる。このような多くの動作原理は、マイクロポンプを使用して生成される高圧空気源を伴うことができる。低い、正確に制御される圧力は、小型化された弁の配列を使用することによりこの高圧空気源から生み出すことができる。これらの弁は、それぞれの流路に対し所望の流量を確保するためにそれぞれの流路内に取り付けられたマイクロフローセンサーを備える閉ループ構成で使用されうる。いくつかのこのようなポンプが組み立てられ、特徴付けられ、うまく行くことが証明されている。図３５ａおよび３５ｂのグラフは、高精度の低および高流量がこの技術により得られることを示している。これらのグラフは、図３５ａのプロット９６１により示されている２〜３μＬ／分および図３５ｂのプロット９６２により示されている１５０〜２００μＬ／分の流量範囲においてこのポンプシステムの２つの流路の流量を高い精度（１％の精度）で制御することを示すデータを明らかにしている。さまざまな試薬および血液試料の流量の制御が高精度であるということは、血液細胞の数の測定も高精度であるということである。本発明のＰＯＣサイトメーターでは、ＡＩＤＳおよびマラリアのアッセイに必要ないくつかの小さな修正を追加の流路に加えただけで、この閉ループポンプ技術を使用することができる。
【０１４９】
さまざまなアッセイにおいて、カートリッジ９５２（カートリッジ）上のマイクロ流体力学ベースのアッセイには、図３６に示されているようにベンチトップサイトメーター（ベンチトップ）に勝る多数の利点を有すると考えられる。カートリッジは、全血試料を約１２μＬだけ必要とするが、ベンチトップでは、約１００μＬを必要とする。ベンチトップでは、４つの希釈ステップが使用され、カートリッジでは何も使用されない。モノクローナル抗体を無理なく取得する難しさを考えると、カートリッジでは０．６μＬだけ（最適化されていない）あればよいが、ベンチトップでは５μＬが必要である。カートリッジについては、インキュベーションステップの数と持続時間は、２つあり、１つは室温で２０秒間であり、もう１つも室温で２０秒間である。ベンチトップについては、インキュベーションステップは、４０℃で３０分間のものと、室温で５分間のものを含む。使用される溶解溶液の量は、カートリッジとベンチトップとでそれぞれ５００μＬと１．４ｍＬである。サイトメトリー測定時間は、カートリッジもベンチトップも約２〜３分である。
【０１５０】
サイトメーターでは、カートリッジ上に試薬貯蔵容器９７９があり、マイクロフローセンサー９７５が埋め込まれうる（図３０、３１、３３）。カード９５２では、ＣＤ４およびＣＤ４５抗体の貯蔵溶液（０℃〜４℃で貯蔵される）を使用することができる。乾燥されたＣＤ４およびＣＤ４５抗体をカード上のマイクロ流体流路内に直接プリントするプロセスがありうる。生物学的試薬のナノリットル体積分をプラスチック表面に堆積することができる。試薬が乾燥されマイクロ流路内に入れられた後、低温積層プロセスを使用してこれらの流路を封止することができる。次いで、試薬は、正しい細胞に標識する生物学的活性を保持するように緩衝液（これもカード上に貯蔵される）により再水和され、使用時にカード上で血液と混合されうる。制御カードは、基準として類似のカード内の非乾燥試薬を伴うことができる。マイクロ流路内の試薬を乾燥させ、乾燥した試薬を、正しい細胞を標識する生物学的活性を保持するように再水和するプロトコルがありうる。
【０１５１】
ポイントオブケア診断用途向けの一体化プラスチック製使い捨て型カード９５２を生産する系統だったアプローチがありうる。所定の用途に対する複数のマイクロ流体機能は、最も単純な形態（サブサーキットと呼ばれる）に還元することができる。例えば、カード内への１滴の試薬の適切なアライメントと捕捉は、カード内の初期サブサーキットであってよい。このカードにより、ユーザーは１滴の血液（指に針を刺して得られる）を採り、次いで（吸引を介して）少量（約１０から３０μＬ）の試料を指の圧力でカード内に引き込むことができる。マイクロ流体流路内で一定方向に空気および液体を通すことを許すマイクロ逆止弁がありうる。これらの弁を、カード内に組み込むことができる柔軟な空気袋と併用すると、エンドユーザーは測定された体積の試薬を容易に取得できる。サブサーキットは、動作可能なカード内に組み込むことができる。
【０１５２】
使い捨て型分析カートリッジ９５２に超低自己蛍光材料を使用することができる。環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）ベースのプラスチックは、４８８ｎｍでガラスと同程度の、またはそれよりもよい自己蛍光特性を持つことができ、また非常によい防湿層となりうる。この材料のガラス転移温度は、等級に応じて、約７０から１８０℃としてよい。ＣＯＣポリマーは、４８８ｎｍで非常に高い光透過率（＞９５パーセント）を持つことができる。
【０１５３】
４８８ｎｍにおけるガラス状自己蛍光特性を有する低コストプラスチックが識別され、使い捨て型分析カード９５２上に光学的窓および／またはレンズ（例えば、図３３のレンズ９９２）を形成するために使用されうる。特定のプラスチック群は、ＣＯＣ（Ｔｏｐａｓ（商標））および他のそのようなポリマーを含むことができる。それに加えて、これらの光学的窓は、さらに、石英、Ｐｙｒｅｘ（商標）、および他のガラスまたはガラス状材料で作ることができる。各種ＣＯＣは、非常に低いレベルの自己蛍光を持つことができるため、蛍光フローサイトメトリー用の使い捨て型マイクロ流体カードで使用するのに非常に適していると思われる。ＣＯＣプラスチックは、他のガラス材料と異なり、カード製造プロセスに容易に組み込める。これらのプラスチックの複屈折性は、ポリカーボネート、ポリスチレン、およびアクリルに比べて低くてもよい。ＣＯＣプラスチックは、非常によい耐薬品性を有するように思われ、また軽量であり、粉砕に強く、生体適合性もある。これらは、可視光線波長で約９２パーセントの透過率、約１．５３３の屈折率、および５６のアッベ数を持つことができる。これらのプラスチックは、さらに、良好な寸法安定性および高ガラス転移温度も持つことができる。
【０１５４】
フローサイトメトリー検査では、カード９５２は、全血の試料約１０μＬを処理し、ＣＤ４およびＣＤ４５抗体抗原捕捉により白血球を染色し、赤血球を溶解し、残りの細胞をオンカードサイトメーター流路内に集めてＰＯＣサイトメーター９５０によりプレゼンテーションおよびサイトメトリー分析を実行することができる。ＡＩＤＳ（ＣＤ４）アッセイおよびその操作手順に対するクレジットカードサイズの使い捨て型カートリッジ９５２が、それぞれ図３７および３８に示されている。カード９５２は、フローセンサー９７５、オンザフライ溶解ループ９７６、オンザフライ染色ループ９７７、流路９６７、血液貯蔵容器９７８、および試薬貯蔵容器９７９を備えることができる。
【０１５５】
図３８は、システム９５０、９６０の使い捨て型および／またはマイクロ流体カートリッジ９５２内における操作手順のプロセス図を示している。全血試料は、ブロック９８１で指に針を刺すことで得られる。血液は、ブロック９８２でオンカード試料ループ内に貯蔵できる。セクション９８４では、セクション９８５へのオンカード抗体（モノクローナルおよびポリクローナル）を供給することができる。また、ブロック９８２からの血液は、血液細胞の標識付け（つまり、抗体抗原結合）が行われるセクション９８５に進むことができる。セクション９８５から、血液は、赤血球がブロック９８７からのオンカード溶血剤による溶解に遭遇するセクション９８６に進むことができる。溶解された血液は、細胞９７３がブロック９８９からのオンカードシース試薬とともに流路９６７（図３３）内のコア流９７４として一列縦隊で集束されるセクション９８８に進むことができる。細胞は、計数され、分類されうる。細胞９７３に関するさまざまな情報項目が得られた後、血液はブロック９９１でオンカード廃棄物室に進むことができる。
【０１５６】
材料選択は、正しく機能するカードを得るためにカード９５２の加工プロセスでは重要なものと思われる。さまざまな可能な用途、化学的性質、および最適な性能となるように一体化できる他のコンポーネントを考えると、すべてのカード設計のニーズを満たす普遍的なプラスチックは存在しないように見える。むしろ、所望のカードの機能の仕様とバランスのとれるさまざまなプラスチックおよび接着剤がある。４８８ｎｍ（青色）および６３０ｎｍ（赤色）で好適な材料不透明性について、さまざまな候補プラスチックフィルムを評価することができる。それに加えて、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ社のＡｃｌａｒ（商標）フィルムなどの非常によい防湿層特性を持つプラスチックに注目するとよい。フィルムのバリア性は、液体が乾燥（Ｈ２Ｏ移動）してしまうのを防ぎ、さらにはｐＨドリフトを防ぐ（Ｏ２およびＣＯ２の移動を最小にする）うえで重要な役割を果たしうる。材料選択は、市販の使い捨て型カードが最大１年間周囲温度で安定し、開発途上国世界の辺境地で使用するのに好適であるという目標が与えられた場合に特に重要であると思われる。
【０１５７】
本明細書では、問題のいくつかは、他の方法または時制で述べられていけれども仮説的または予言的性質を有するものとすることができる。
本発明は、少なくとも１つの例示的な実施例に関して説明されているけれども、本明細書を読んだ後、多くの変更形態および修正形態が当業者に明らかなものとなるであろう。したがって、付属の請求項が従来技術に関して可能な限り広く、そのようなすべての変更形態および修正形態を含むものと解釈されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】ポイントオブケア計測装置のブロック図である。
【図２】白血球の５分画のグラフである。
【図３】抗原を有する白血球の図である。
【図４ａ】３次元透視図法で細胞のプロットを示した図である。
【図４ｂ】観察者が右側のプラットフォームのエッジをのぞき込んでいるときに見えるものを表した図である。
【図５ａ】左のピークが右のピークに相対的に弱いことを除き、図４ａのと似た細胞のプロットの図である。
【図５ｂ】この図での向きを変更したことを除き、図５ａのプロットと同様の図である。
【図６ａ】複数のサイズを有するビーズの計数および分類のグラフである。
【図６ｂ】３種類の白血球の分画のグラフである。
【図７】小型化された携帯型サイトメーターの斜視図である。
【図８】小型化されたサイトメーターの略図である。
【図９】カバーが押し下げられていない状態の小型化されたサイトメーターのより詳細な略図である。
【図１０】カバーが押し下げられている状態の小型化されたサイトメーターのより詳細な略図である。
【図１１】流体力学的絞り込みコンポーネントによるフロー流およびコアの形成を示す図である。
【図１２】コア流の分析用の光源と検出器の配列の図である。
【図１３】ガウス光点の図である。
【図１４】光散乱体に対する光源および検出器の配置の図である。
【図１５】流路に近接する光源および対応する検出器の３つのセットの図である。
【図１６】例示的なカートリッジのいくつかの特徴の略図である。
【図１７】血液試料を分析するための例示的なアプローチを示す概略流れ図である。
【図１８】多数の赤血球パラメータを取得するための例示的なアプローチを示す流れ図である。
【図１９】血液試料を分析するための他の例示的なアプローチを示す概略流れ図である。
【図２０】ヘモグロビン測定精度を改善するために溶血剤堆積領域および気泡トラップを有するカードを示す図である。
【図２１】散乱サブシステムおよび蛍光光学サブシステムを備えるサイトメーターカートリッジの図である。
【図２２】散乱および蛍光サブシステムの光学配置の略図である。
【図２３】血液の成分の図である。
【図２４ａ】細胞の蛍光同定のため細胞にマーカーを付着させた抗体を示す図である。
【図２４ｂ】細胞の蛍光同定のため細胞にマーカーを付着させた抗体を示す図である。
【図２５】流路の蛍光光学サブシステムの図である。
【図２６】レンズ装着蛍光光学サブシステムの略図である。
【図２７】手首に付けるために小型化されたサイトメーターを示す図である。
【図２８】光散乱検出器を備える流路の端面図である。
【図２９ａ】白血球の３分画を明らかにするＦＡＬＳデータとＳＡＬＳデータとの関係を示すプロットである。
【図２９ｂ】図２９ａの白血球に加えて、さらに２種類の白血球の分画を明らかにするＦＡＬＳデータとＬＡＬＳデータとの関係を示すプロットである。
【図３０】小型サイトメーターカートリッジに関連する２色性ビームスプリッタタイプの光学系の略図である。
【図３１】小型サイトメーターカートリッジに関連するプリズムビームディスクリミネータタイプの光学系の略図である。
【図３２】ＡＩＤＳおよびマラリアアッセイのさまざまなパラメータに対する構成要素を示す表である。
【図３３】図２５の関連する光学系を備えるより詳細な小型サイトメーターカートリッジの略図である。
【図３４】血液学分析器およびフローサイトメーターなどのポイントオブケア計測装置の閉ループポンプシステムを示す図である。
【図３５ａ】閉ループポンプシステムの流速精度を示すグラフである。
【図３５ｂ】閉ループポンプシステムの流速精度を示すグラフである。
【図３６】小型サイトメーターおよびベンチトップサイトメーターの比較結果を示す表である。
【図３７】ＡＩＤＳ（ＣＤ４）アッセイを行うための小型カートリッジレイアウトの図である。
【図３８】免疫アッセイおよび血液学検査の用途を有する小型カートリッジの操作手順を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポイントオブケア分析器であって、
携帯型計測装置と、
計測装置内に挿入可能なマイクロ流体カートリッジとを備え、
ただし、
前記計測装置およびカートリッジは、
血液試料を運ぶための流路と、
免疫アッセイのため前記血液試料の成分に付いているマーカーを検出し、同定するための少なくとも１つの蛍光光学的流路と、
前記血液試料の成分の個数および／または特性を判定するための少なくとも１つの散乱光学的流路とを備え、
免疫アッセイで検出されるべき前記血液試料の前記成分は、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤＸ、ＣＤＸＸ、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、さまざまな他の病原体などからなる群の少なくとも１つとすることができるポイントオブケア分析器。
【請求項２】
前記散乱光学的流路は、大角度で前記試料の成分により散乱された光を検出するためのものである請求項１に記載の分析器。
【請求項３】
前記計測装置およびカートリッジは、さらに、
小角度で前記試料の成分により散乱される光を検出するための第２の散乱光学的流路と、
前方角度で前記試料の成分により散乱される光を検出するための第３の散乱光学的流路とを備える請求項２に記載の分析器。
【請求項４】
前記成分により散乱される光は、前記血液試料の成分の数および／または特性を判定するために使用される請求項３に記載の分析器。
【請求項５】
前記カートリッジは、さらに、
複数のフローセンサーと、
複数の試薬貯蔵容器とを備える請求項１に記載の分析器。
【請求項６】
カートリッジ上でマイクロ流体力学ベースのアッセイを行うための方法であって、
全血の試料をマイクロ流体カートリッジに供給するステップと、
分析器の携帯型計測装置内に配置されているカートリッジ上でマイクロ流体力学ベースのアッセイを実行するステップとを含む方法。
【請求項７】
前記マイクロ流体力学ベースのアッセイを実行するステップは、さらに、
全血試料を前記カートリッジの投入口に供給するステップと、
前記試料の少なくとも一部を溶解するステップと、
使用する前記カートリッジ内のモノクローナル抗体の供給を確定するステップと、
少なくとも１つのインキュベーションステップを実行するステップとを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料の量は、２５マイクロリットル未満である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロ流体力学ベースのアッセイを実行するステップは、さらに、１つ未満の希釈ステップを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体の前記供給は、２マイクロリットル未満である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記アッセイは、１ミリリットル未満の溶解溶液を使用する請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記アッセイは、３つ未満のインキュベーションステップを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
インキュベーションステップは、ほぼ室温において１分未満の時間の間、実行される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロ流体力学ベースのアッセイの持続時間は、５分未満である請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
ポイントオブケア分析器であって、
免疫アッセイモジュールと、
血液学モジュールを備え、
前記モジュールの少なくとも一部は、前記分析器の計測装置内に挿入可能なカートリッジに配置されるポイントオブケア分析器。
【請求項１６】
前記免疫アッセイモジュールは、第１のマイクロ流体回路を備え、
前記血液学モジュールは、第２のマイクロ流体回路を備え、
前記第１および第２のマイクロ流体回路は、前記カートリッジ内に配置される請求項１５に記載の分析器。
【請求項１７】
前記免疫アッセイモジュールは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤＸ、ＣＤＸＸ、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ＴＢ、さまざまな他の病原体、および／または類似物の存在を判定し、および／または推論するための流路および前記流路に近接する少なくとも１つの蛍光光学的流路を備え、
前記血液学モジュールは、少なくとも完全血球算定を行うための流路および前記流路に近接する少なくとも１つの散乱光学的流路を備える請求項１５に記載の分析器。
【請求項１８】
前記免疫アッセイモジュールおよび血液学モジュールは、同じ流路を備える請求項１７に記載の分析器。
【請求項１９】
前記病原体は、ＡＩＤＳ、マラリア、ＨＩＶ、ＴＢなどに影響を与えうる請求項１７に記載の分析器。
【請求項２０】
前記免疫アッセイモジュールは、リンパ球および単球に蛍光マーカーまたは蛍光標識を付けることができる請求項１５に記載の分析器。
【請求項２１】
前記血液学モジュールは、白血球を少なくとも３つのカテゴリに分画することができる請求項１７に記載の分析器。
【請求項２２】
前記カテゴリは、リンパ球、単球、好中球、好酸球、および好塩基球を含む請求項２１に記載の分析器。
【請求項２３】
前記血液学モジュールおよび免疫アッセイモジュールは、単一の共通光源を利用する請求項１７に記載の分析器。
【請求項２４】
前記マイクロ流体回路は、
流体力学的集束流路と、
廃棄物貯蔵容器と、
試薬貯蔵容器（シース、溶解、希釈）と、
抗体貯蔵容器とを備える請求項１６に記載の分析器。
【請求項２５】
血液分析の方法であって、
血液学検査を実行するステップと、
免疫アッセイを実行するステップとを含み、
前記検査およびアッセイは、単一のマイクロ流体カートリッジにより実行される血液分析の方法。
【請求項２６】
前記血液学検査は、
全血の試料を用意するステップと、
完全血球算定を実行するステップとを含み、
前記完全血球算定は、
前記試料の第１の部分を溶解し、その結果として白血球を得るステップと、
前記白血球の第１の部分を流体力学的に集束して流路内に押し通し、光を散乱させるステップと、
前記白血球により散乱された光に応じて前記白血球を複数の種類に分画するステップと、
前記試料の第２の部分を流体力学的に集束して流路内に通し、光を散乱させるステップと、
前記赤血球により散乱された光に応じて前記赤血球を計数するステップと、
前記赤血球により散乱された光からヘマトクリットデータを判定するステップと、
前記試料の第３の部分のヘモグロビン含有量を光吸収により判定するステップとを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫アッセイは、
前記白血球の第２の部分をインキュベートし、蛍光抗体で標識するステップと、
前記白血球に光を当てるステップと、
前記標識された白血球から放射される蛍光を検出するステップと、
前記白血球により散乱された光を検出するステップと、
ＣＤＸＸおよび／または病原体データを判定するステップとを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞の前記溶解、分画、流体力学的集束、標識付け、および計数は、前記単一のマイクロ流体カートリッジ上で実行可能である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記インキュベートおよびＣＤＸＸおよび／または病原体データの判定は、前記単一のマイクロ流体カートリッジ上で実行可能である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アッセイシステムであって、
カードと、
前記カード内に配置された免疫アッセイコンポーネントとを備えるアッセイ。
【請求項３１】
さらに、前記カード内に配置されている血液学検査コンポーネントを備える請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記カードは、プラスチックタイプおよび／またはガラススタイプの材料を含むマイクロ流体カートリッジである請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記カードは、積層構造である請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
前記カードは、成形構造を有する請求項３２に記載のシステム。
【請求項３５】
前記免疫アッセイコンポーネントは、ＡＩＤＳおよび／またはマラリアをそれぞれ示すＣＤＸＸおよび／または病原体アッセイを実行することができ、
前記血液学検査コンポーネントは、血球数測定を実行することができる請求項３１に記載のシステム。
【請求項３６】
前記カードは、免疫アッセイおよび血液学検査を目的とする、混合、分離、流体力学的集束、濾過、洗浄、予備濃縮、溶解、選別、インキュベート、標識付けなど用のマイクロ流体回路を備える請求項３１に記載のシステム。
【請求項１】
ポイントオブケア分析器であって、
携帯型計測装置と、
計測装置内に挿入可能なマイクロ流体カートリッジとを備え、
ただし、
前記計測装置およびカートリッジは、
血液試料を運ぶための流路と、
免疫アッセイのため前記血液試料の成分に付いているマーカーを検出し、同定するための少なくとも１つの蛍光光学的流路と、
前記血液試料の成分の個数および／または特性を判定するための少なくとも１つの散乱光学的流路とを備え、
免疫アッセイで検出されるべき前記血液試料の前記成分は、ＣＤ４、ＣＤ４５、ＣＤＸ、ＣＤＸＸ、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、さまざまな他の病原体などからなる群の少なくとも１つとすることができるポイントオブケア分析器。
【請求項２】
前記散乱光学的流路は、大角度で前記試料の成分により散乱された光を検出するためのものである請求項１に記載の分析器。
【請求項３】
前記計測装置およびカートリッジは、さらに、
小角度で前記試料の成分により散乱される光を検出するための第２の散乱光学的流路と、
前方角度で前記試料の成分により散乱される光を検出するための第３の散乱光学的流路とを備える請求項２に記載の分析器。
【請求項４】
前記成分により散乱される光は、前記血液試料の成分の数および／または特性を判定するために使用される請求項３に記載の分析器。
【請求項５】
前記カートリッジは、さらに、
複数のフローセンサーと、
複数の試薬貯蔵容器とを備える請求項１に記載の分析器。
【請求項６】
カートリッジ上でマイクロ流体力学ベースのアッセイを行うための方法であって、
全血の試料をマイクロ流体カートリッジに供給するステップと、
分析器の携帯型計測装置内に配置されているカートリッジ上でマイクロ流体力学ベースのアッセイを実行するステップとを含む方法。
【請求項７】
前記マイクロ流体力学ベースのアッセイを実行するステップは、さらに、
全血試料を前記カートリッジの投入口に供給するステップと、
前記試料の少なくとも一部を溶解するステップと、
使用する前記カートリッジ内のモノクローナル抗体の供給を確定するステップと、
少なくとも１つのインキュベーションステップを実行するステップとを含む請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料の量は、２５マイクロリットル未満である請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記マイクロ流体力学ベースのアッセイを実行するステップは、さらに、１つ未満の希釈ステップを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
モノクローナル抗体の前記供給は、２マイクロリットル未満である請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記アッセイは、１ミリリットル未満の溶解溶液を使用する請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記アッセイは、３つ未満のインキュベーションステップを含む請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
インキュベーションステップは、ほぼ室温において１分未満の時間の間、実行される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロ流体力学ベースのアッセイの持続時間は、５分未満である請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
ポイントオブケア分析器であって、
免疫アッセイモジュールと、
血液学モジュールを備え、
前記モジュールの少なくとも一部は、前記分析器の計測装置内に挿入可能なカートリッジに配置されるポイントオブケア分析器。
【請求項１６】
前記免疫アッセイモジュールは、第１のマイクロ流体回路を備え、
前記血液学モジュールは、第２のマイクロ流体回路を備え、
前記第１および第２のマイクロ流体回路は、前記カートリッジ内に配置される請求項１５に記載の分析器。
【請求項１７】
前記免疫アッセイモジュールは、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５、ＣＤＸ、ＣＤＸＸ、熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、ＴＢ、さまざまな他の病原体、および／または類似物の存在を判定し、および／または推論するための流路および前記流路に近接する少なくとも１つの蛍光光学的流路を備え、
前記血液学モジュールは、少なくとも完全血球算定を行うための流路および前記流路に近接する少なくとも１つの散乱光学的流路を備える請求項１５に記載の分析器。
【請求項１８】
前記免疫アッセイモジュールおよび血液学モジュールは、同じ流路を備える請求項１７に記載の分析器。
【請求項１９】
前記病原体は、ＡＩＤＳ、マラリア、ＨＩＶ、ＴＢなどに影響を与えうる請求項１７に記載の分析器。
【請求項２０】
前記免疫アッセイモジュールは、リンパ球および単球に蛍光マーカーまたは蛍光標識を付けることができる請求項１５に記載の分析器。
【請求項２１】
前記血液学モジュールは、白血球を少なくとも３つのカテゴリに分画することができる請求項１７に記載の分析器。
【請求項２２】
前記カテゴリは、リンパ球、単球、好中球、好酸球、および好塩基球を含む請求項２１に記載の分析器。
【請求項２３】
前記血液学モジュールおよび免疫アッセイモジュールは、単一の共通光源を利用する請求項１７に記載の分析器。
【請求項２４】
前記マイクロ流体回路は、
流体力学的集束流路と、
廃棄物貯蔵容器と、
試薬貯蔵容器（シース、溶解、希釈）と、
抗体貯蔵容器とを備える請求項１６に記載の分析器。
【請求項２５】
血液分析の方法であって、
血液学検査を実行するステップと、
免疫アッセイを実行するステップとを含み、
前記検査およびアッセイは、単一のマイクロ流体カートリッジにより実行される血液分析の方法。
【請求項２６】
前記血液学検査は、
全血の試料を用意するステップと、
完全血球算定を実行するステップとを含み、
前記完全血球算定は、
前記試料の第１の部分を溶解し、その結果として白血球を得るステップと、
前記白血球の第１の部分を流体力学的に集束して流路内に押し通し、光を散乱させるステップと、
前記白血球により散乱された光に応じて前記白血球を複数の種類に分画するステップと、
前記試料の第２の部分を流体力学的に集束して流路内に通し、光を散乱させるステップと、
前記赤血球により散乱された光に応じて前記赤血球を計数するステップと、
前記赤血球により散乱された光からヘマトクリットデータを判定するステップと、
前記試料の第３の部分のヘモグロビン含有量を光吸収により判定するステップとを含む請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫アッセイは、
前記白血球の第２の部分をインキュベートし、蛍光抗体で標識するステップと、
前記白血球に光を当てるステップと、
前記標識された白血球から放射される蛍光を検出するステップと、
前記白血球により散乱された光を検出するステップと、
ＣＤＸＸおよび／または病原体データを判定するステップとを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞の前記溶解、分画、流体力学的集束、標識付け、および計数は、前記単一のマイクロ流体カートリッジ上で実行可能である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記インキュベートおよびＣＤＸＸおよび／または病原体データの判定は、前記単一のマイクロ流体カートリッジ上で実行可能である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アッセイシステムであって、
カードと、
前記カード内に配置された免疫アッセイコンポーネントとを備えるアッセイ。
【請求項３１】
さらに、前記カード内に配置されている血液学検査コンポーネントを備える請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記カードは、プラスチックタイプおよび／またはガラススタイプの材料を含むマイクロ流体カートリッジである請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記カードは、積層構造である請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
前記カードは、成形構造を有する請求項３２に記載のシステム。
【請求項３５】
前記免疫アッセイコンポーネントは、ＡＩＤＳおよび／またはマラリアをそれぞれ示すＣＤＸＸおよび／または病原体アッセイを実行することができ、
前記血液学検査コンポーネントは、血球数測定を実行することができる請求項３１に記載のシステム。
【請求項３６】
前記カードは、免疫アッセイおよび血液学検査を目的とする、混合、分離、流体力学的集束、濾過、洗浄、予備濃縮、溶解、選別、インキュベート、標識付けなど用のマイクロ流体回路を備える請求項３１に記載のシステム。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５ａ】
【図３５ｂ】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図２】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図５ａ】
【図５ｂ】
【図６ａ】
【図６ｂ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４Ａ】
【図２４Ｂ】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９Ａ】
【図２９Ｂ】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５ａ】
【図３５ｂ】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【公表番号】特表２００９−５２２５５６（Ｐ２００９−５２２５５６Ａ）
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５４８８７５（Ｐ２００８−５４８８７５）
【出願日】平成１８年１２月２９日（２００６．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６２７５６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７６５４９
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５００５７５８２４）ハネウェル・インターナショナル・インコーポレーテッド (1,504)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年６月１１日（２００９．６．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月２９日（２００６．１２．２９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０６２７５６
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０７６５４９
【国際公開日】平成１９年７月５日（２００７．７．５）
【出願人】（５００５７５８２４）ハネウェル・インターナショナル・インコーポレーテッド (1,504)
【Ｆターム（参考）】
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