マイコプラズマのためのプライマーセット、アッセイキットおよびそれを用いる方法
【課題】 マイコプラズマを特異的に増幅または検出するための手段を提供する。
【解決手段】 本実施の形態によれば、マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備するプライマーセットが提供される。
【解決手段】 本実施の形態によれば、マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備するプライマーセットが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態はマイコプラズマのための増幅および／または検出手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ(Mycoplasma)は、真正細菌の一属であり、マイコプラズマ科（family ;Mycoplasmataceae）、マイコプラズマ属（genus； Mycoplasma）に分類される。現在、約100種類の種が知られている。一般の真正細菌に見られるペプチドグリカン細胞壁が無い。そのため細胞の形は不定形で可塑性があると伴に、ペニシリン系、セフェム系の薬剤は効果がない。自然条件では特定の真核生物に寄生する。大半のものが合成培地での増殖が困難であり、多くのケースで場合は複数の成長因子添加を必要とする。
【０００３】
細胞壁を持たないため細胞の形状に可塑性があり、0.22μm濾過滅菌用フィルターを通過することもこの微生物のユニークな特徴である。そのため、濾過滅菌を行っても細胞培養用培地からのマイコプラズマ除去が出来ず、コンタミネーションによるトラブルの原因となる。
【０００４】
一般的に、細菌や真菌のコンタミネーションでは汚染発生を培地の変色や培養細胞の変性によりコンタミネーション発見が容易である。これに対してマイコプラズマのコンタミネーションは、目視および光学顕微鏡レベルでは培地の変質を発見することが難しい。その上、マイコプラズマが培養細胞と共存することが多いためにコンタミネーションの発生を見逃しやすい。マイコプラズマのコンタミネーションによる影響としては、培地の栄養の消費による培養細胞の成長阻害、マイコプラズマの直接の作用による代謝経路への影響、並びに遺伝子発現への影響が確認されている。そのため、細胞を用いた実験結果を正しく評価するためには、マイコプラズマのコンタミネーションがないことを注意深く確認する必要がある。また、汚染経路の特定のためには、種を推定することも必要である。
【０００５】
マイコプラズマの多くは、ヒトを含む様々な脊椎動物に寄生する。この寄生は、関節症や肺炎などの病原性を示すことがよく知られている。例えば、ヒトにおいては、非定型肺炎を引き起こし、喀痰を伴わない刺激性の咳、頭痛、咽頭痛、倦怠感、発熱などの感冒様症状を呈する。また、牛ではマイコプラズマ科に属する微生物の感染により、肺炎、乳房炎、関節炎、流産などを引き起こす。特に、乳牛におけるマイコプラズマ性乳房炎は、伝染が強くかつ難治性である。これは酪農経営において大きな脅威である。マイコプラズマ性乳房炎が発症し臨床型乳房炎になると、これを治癒することは非常に困難である。従って、感染拡大による経済損失を最小限に抑える為に、症状を示していない潜在感染個体を含む全てのマイコプラズマ感染個体を迅速に特定し、適切な処置を施すことが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３５００９２号公報
【特許文献２】特開２００９−１３１１７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、マイコプラズマを特異的に増幅および／または検出するための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的は以下の実施形態により達成される。
【０００９】
（Ａ）マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、前記LAMP増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
ＦＩＰプライマーが、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号２９、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号１０４、配列番号１１２、配列番号１２０およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
ＢＩＰプライマーが、配列番号６、配列番号８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３０、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
Ｆ３プライマーが、配列番号９、配列番号２８、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１１１、配列番号１１９およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、
Ｂ３プライマーが、配列番号１０、配列番号２３、配列番号３１、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１１４、配列番号１２２およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーである
プライマーセット；
（Ｂ） マイコプラズマの検出および／または分類するためのアッセイキットであって、
前記（Ａ）に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットによる増幅により得られた増幅産物からマイコプラズマを特異的に検出するための核酸プローブであり、
（１）配列番号１２７および配列番号１２８；
（２）配列番号１３１、配列番号１３２および配列番号１３３；
（３）配列番号１３６および配列番号１３９；
（４）配列番号１３７および配列番号１３８；
（５）配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０；
（６）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２５および配列番号１２６；並びに
（７）前記（１）〜（６）に記載の配列の相補配列；
によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブ群から少なくとも１選択される核酸プローブを含むアッセイキット；および
（Ｃ） マイコプラズマに由来する核酸を特異的に増幅および／または分類する方法であって、前記（Ａ）に記載のプライマーセットを用いて試料について増幅することを特徴とする方法；
である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本態様に従うＬＡＭＰ法による増幅方法を説明するための模式図。
【図２】本態様に従うＬＡＭＰ法を用いて得られる増幅産物を説明するための模式図。
【図３】本態様に従う増幅産物の１例を示す模式図。
【図４】本態様に従う核酸プローブ固定化基体の模式図。
【図５】本態様に従う核酸プローブ固定化基体の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．プライマー
本発明の１態様に従うと、マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ及びＲＴ−ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが提供される。
【００１２】
「ＬＡＭＰ法」および「ＲＴ-ＬＡＭＰ法」は核酸の増幅法である。これらは、等温遺伝子増幅法とも称される。ＬＡＭＰ法によりＤＮＡを鋳型にして核酸を増幅する。ＲＴ-ＬＡＭＰ法は、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行うことによりＲＮＡを鋳型にして核酸を増幅する。
【００１３】
ＬＡＭＰ法は２種若しくは４領域または４種若しくは６領域のプライマーを用いる点がＰＣＲ法とは異なる。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、当該態様に従うプライマーを使用することにより、簡便なサンプルの前処理で微量なマイコプラズマ属に分類される微生物を検出することが可能である。
【００１４】
ここで、ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計と、増幅により得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。図１は、検出しようとする二本鎖ＤＮＡを示している。合計４種類のプライマー配列、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを設定する。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域（ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃ）を含んでいる。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含んでいる。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含んでいる。ここでＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域は、前記二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖ＤＮＡの５’→３’方向に向かいこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ領域は、その相補鎖の一本鎖ＤＮＡの５’→３’方向に向かいこの順で設定された領域である。このときＢ３とＢ３ｃ、Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１、Ｆ２ｃとＦ２、Ｆ３ｃとＦ３は互いに相補鎖である。
【００１５】
これらの領域から構成される４種類のプライマー、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については説明を省略するが、必要であれば、例えば特開２００２−１８６７８１号公報を参照すればよい。また、この４種のプライマーのほかにループプライマーを併せて用いてもよい。ループプライマーは、ＬＰｆプライマーおよび／またはＬＰｂプライマーであってよい。
【００１６】
なお、ＲＴ−ＬＡＭＰ法は前記ＬＡＭＰ法反応液に逆転写活性を持つ酵素を添加して、逆転写反応を行いながらＬＡＭＰ増幅法を行う方法である。使用するプライマーはＬＡＭＰ法と同一のプライマーを使用してよい。ここにおいて「ＬＡＭＰ法」と記載したとき、ＬＡＭＰ法およびＲＴ−ＬＡＭＰ法の両方法についての言及であると解されてよい。
【００１７】
本態様においては、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置されるようにプライマーを設計する。「ターゲット配列」とは、核酸プローブにハイブリダイゼーションさせるべき配列である。図１に示すように、ターゲット配列（例えば、図１ではＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃの何れか）が、領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／または領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかに対応する位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分のいずれの部位に位置するように設計されてよい。ここで、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれてよい。こうして設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＲＴ-ＬＡＭＰ増幅を行なう。それにより、図３に示すようなＬＡＭＰ増幅産物の一部が得られる。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃが増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置することとなる。
【００１８】
一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと互いに相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成する。このように増幅産物中に含まれるターゲット配列は、図３に示すような一本鎖の状態で存在する。従って、変性操作を行なうことなく、図示のように各ターゲット配列に対して相補的な核酸プローブ（例えば、ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰ、ＢＰｃの配列を有する核酸）との特異的ハイブリダイゼーションが可能である。増幅産物の検出は、このような核酸プローブを利用することにより行うことも可能である。ここで、「特異的ハイブリダイゼーション」とは、一塩基多型(Single Nucleotide PolymorpHisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検出することが可能であることを意味する。
【００１９】
上述したとおり、本態様のプライマーセットは、Ｆ１、Ｆ２、F３、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域を元に設計される。
【００２０】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットの例は、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
ＦＩＰプライマーが、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号２９、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号１０４、配列番号１１２、配列番号１２０およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
ＢＩＰプライマーが、配列番号６、配列番号８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３０、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
Ｆ３プライマーが、配列番号９、配列番号２８、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１１１、配列番号１１９およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、
Ｂ３プライマーが、配列番号１０、配列番号２３、配列番号３１、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１１４、配列番号１２２およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーである
プライマーセットであってよい。
【００２１】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットの更なる例は、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号９および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット、および／または
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号２９および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号３０および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号２８および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号３１および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット
であるプライマーセット
であってよい。
【００２２】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、更にループプライマーを含み、
前記ループプライマーがＬＰｆプライマーおよび／またはＬＰｂプライマーであり、
前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５および配列番号１２３並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８、配列番号２２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号１００、配列番号１０８、配列番号１１６および配列番号１２４並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセットであってよい。
【００２３】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットの例は、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６および配列番号８並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；
（３）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（４）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号２２およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（５）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２４および配列番号２５並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；
（６）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２４および配列番号２５並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（７）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２６および配列番号２７並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；または
（８）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２６および配列番号２７並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
であるプライマーセット
であってよい。
【００２４】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットの更なる例は、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号５６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号５７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号５５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号５８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号５９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号６０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号６４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号５３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号５６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号６７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号６８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（３）前記ＦＩＰプライマーが配列番号７２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号７３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号７１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号７４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号７５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号７６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（４）前記ＦＩＰプライマーが配列番号８０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号７９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号８２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号８３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号８４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（５）前記ＦＩＰプライマーが配列番号８８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号８７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号９０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号９１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号９２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（６）前記ＦＩＰプライマーが配列番号９６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号９７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号９５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号９８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号９９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１００および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（７）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１０４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１０５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１０３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１０７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１０８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（８）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１１２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１１３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１１１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１１４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１１５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１１６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；および／または
（９）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１２０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１２１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１１９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１２２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１２４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
であるプライマーセットであってよい。
【００２５】
プライマーセットの例において、マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む配列とは、上記何れかの配列番号に記載の配列またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入などの変異を有する配列をいう。プライマーの例において、少なくとも１つのプライマーの一部にマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲であればどのような変異を含んでもよい。特異的に増幅可能な範囲とは、分類学的にマイコプラズマと同定されるために必ずしも必要ではない範囲内で変異が存在する範囲である。
【００２６】
そのような変異を含む複数の配列を１つの増幅反応場において同時に存在させてもよい。その場合、上記何れかの配列番号に記載の配列またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドとして調製されてもよく、何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、ユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２７】
ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Ｇｒｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の3−ニトロピロール（Nitropyrrole）、5-ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl ；dP)、デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-D-リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl ；dK)が含まれる。
【００２８】
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。当該プライマーの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。
【００２９】
プライマーセットの例において、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プラマーおよびＢ３プライマーは、それぞれ１つの種類の配列からなってもよく、それぞれ複数種類の配列を含んでもよい。これらのプライマーセットにおいて更にＬＰｆプライマーおよび／またはＬＰｂプライマーを使用する場合には、ＬＰｆプライマーおよびＬＰｂプライマーは、それぞれ１つの種類の配列からなってもよく、それぞれ複数種類の配列を含んでもよい。
【００３０】
上記のような領域を使用したプライマーを用いて、マイコプラズマ由来の核酸を含有する検体試料に対してＬＡＭＰ法或いはＲＴ-ＬＡＭＰ法による増幅を行うと、図３で説明したように、ステム・アンド・ループ構造が形成され、一本鎖のループ構造内に含まれるマイコプラズマ由来のターゲット配列が得られる。
【００３１】
本態様は、上記のようなプライマーセットをマイコプラズマ由来の核酸を含む試料に対して適用すれば、マイコプラズマ標的配列に対応する核酸が特異的に増幅される。また、得られる増幅産物の存在を検出することにより、マイコプラズマ由来の核酸の存在を検出することが可能である。試料におけるマイコプラズマの検出は、検出対象である試料について、当該プライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより行うことが可能である。
【００３２】
マイコプラズマに由来する核酸を特異的に増幅する方法は、上記の何れかのプライマーセットを用いて試料について増幅することを特徴とする方法である。
【００３３】
増幅反応の条件は、それ自身公知の何れかの条件を利用すればよい。また、当該増幅反応を行った結果を基に当該試料はマイコプラズマ由来の核酸（「マイコプラズマ核酸」ともいう）が含まれていると判定すればよい。そのような判定により試料中のマイコプラズマ核酸の存在を検出および分類することが可能である。
【００３４】
例えば、上記増幅反応は、１反応場当たり、例えば、１チューブ当たり１プライマーセットで行ってもよく、あるいは１反応場（例えば、１チューブ）に各種遺伝子型に対応した複数のプライマーセットを用いて行ってもよい。複数のマイコプラズマ種を特定する必要がある場合は、後者の方法で行う方が効率的である。増幅反応場は、例えば、そこにおいて反応が可能な容器であってよく、例えば、チューブ、マイクロチューブ、ビーカー、マルチウェルプレートなどであってよいが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
また、ユニバーサルにマイコプラズマ核酸を増幅するためには、それぞれ複数の種類のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プラマーおよびＢ３プライマーを使用することがより好ましい。また、特定の種のマイコプラズマ核酸を増幅するためには、特定の種に特異的なヌクレオチドを有する配列を使用すればよい。より確実に包括的にウイルスを増幅するためには、少なくとも種に特異的な変異部位に関してユニバーサルヌクレオチドまたはミックス塩基となるようにプライマーを設計および使用することが好ましい。
【００３６】
また、変異部について塩基の種類の異なる複数の配列を１つの配列で表してもよい。その場合、問題となる変異部の塩基は複数の塩基を示す１塩基表示による記号を含ませればよい。それらの記号の示す塩基の意味は通常当該技術分野において一般的に使用される意味である。即ち、「ｒ」はグアニンまたはアデニン、「ｙ」はチミンまたはシトシン、「ｍ」はアデニンまたはシトシン、「ｋ」はグアニンまたはチミン、「ｓ」はグアニンまたはシトシン、「ｗ」はアデニンまたはチミン、「ｂ」はグアニンまたはシトシンまたはチミン、「ｄ」はアデニンまたはグアニンまたはチミン、「ｈ」はアデニンまたはシトシンまたはチミン、「ｖ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシン、「ｎ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミンである。
【００３７】
上記増幅反応は、これに限定するものではないが、例えば、以下に示すような組成のバッファー中で行ってよい：
ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応液組成
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣＬ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
16 U Bst DNA polymerase
0.625U AMV Reverse transcriptase。
【００３８】
このような組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んでもよい；
プライマー添加量
ＦＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３プライマー ５ｐｍｏＬ
Ｂ３プライマー ５ｐｍｏＬ。
【００３９】
ここで「試料」とは、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、オナガザル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、アザラシおよびネズミイルカなどの哺乳類、鳥類などの体液、組織、細胞、便、並びに水、湖水、川水、海水および土壌などの環境に存在する何れかの物質であってもよい。或いは、当該試料は、マイコプラズマ属に分類される微生物あるいはその遺伝子が含まれている可能性の疑われる物質であってよい。例えば、培養液のようなものでもよい。そのような物質をそれ自身公知の手段により、核酸の増幅に適した状態に前処理したものであってもよく、何れの前処理もなされなくてもよい。そのような前処理の例は、変性、濾過、核酸抽出、不純物除去などを含む。
【００４０】
上述のようなプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、特異的にマイコプラズマ核酸を増幅することが可能である。これを利用して、試料に含まれる核酸を当該プライマーまたはプライマーセットを用いるＲＴ-ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、試料に含まれるマイコプラズマ由来の核酸を特異的に検出することが可能である。
【００４１】
従来の方法では、特異性を配列検出の際の特異性は、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出している。この場合、ＰＣＲにより生成される産物は２本鎖であるため、核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させると、相補鎖が核酸プローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く、検出感度が悪い。そのような方法において、従来では、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するなどの方法も行われている。このような場合では、酵素の使用および磁気ビーズの使用などによって、ワーキングコストが高額となったり、操作が煩雑性になったりする。このような問題も本態様により解決することが可能である。
【００４２】
これまで、迅速診断法としては特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検出する方法などが知られていた。しかしながら、ＰＣＲを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をする可能性がある。また実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。本態様に従うプライマーセットを使用することにより、より簡便に、より正確に、より迅速に、より広い検出レンジで、特異的にマイコプラズマ由来の核酸を増幅することが可能である。
【００４３】
従来のヒトおよび動物の臨床診断現場や細胞を用いた研究、疫学研究、その他様々な分野では、マイコプラズマに特徴的な遺伝子配列の存在の検出と迅速な同定を行うことが可能な方法の開発が求められているが、このような要求も本態様によって満たされる。
【００４４】
２．核酸プローブ
本態様は更に、上述のプライマーにより増幅されたマイコプラズマに由来する核酸を検出および／または分類するための核酸プローブおよび核酸プローブセットを提供する。
【００４５】
当該核酸プローブは、マイコプラズマに由来する核酸を包括的に検出するための核酸プローブであってもよく、所望の種を特異的に検出するための核酸プローブであってもよい。そのような核酸プローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定されればよい。また、当該プライマーは好ましくは、約１０〜６０塩基長、約１２〜４０塩基長などであればよい。
【００４６】
例えば、好ましい核酸プローブの例は、図１に示すようなステム・アンド・ループ構造のプライマー領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかの位置に対応するように選択されてよい。
【００４７】
前記プライマーセットによる増幅により得られた増幅産物からマイコプラズマを特異的に検出するための核酸プローブの例は、
（１）配列番号１２７および配列番号１２８；
（２）配列番号１３１、配列番号１３２および配列番号１３３；
（３）配列番号１３６および配列番号１３９；
（４）配列番号１３７および配列番号１３８；
（５）配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０；
（６）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２５および配列番号１２６；並びに
（７）前記（１）〜（６）に記載の配列の相補配列；
によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブ群から少なくとも１選択される核酸プローブを含む。
【００４８】
マイコプラズマの特定の種を検出および／または分類するための核酸プローブの例は、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブ群から少なくとも１種類選択される配列を含む核酸プローブを含む。
【００４９】
核酸プローブまたは核酸プローブセットの例において、マイコプラズマ由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含んでもよい。特異的に検出可能な範囲とは、分類学的にマイコプラズマと同定されるために必ずしも必要ではない範囲内で変異が存在する範囲である。例えば、上述した核酸プローブは、何れも上記の配列番号により示される配列の任意の位置の塩基が1つまたは数個置換あるいは欠失あるいは塩基を挿入された配列からなってもよい。核酸プローブは、検出しようとするマイコプラズマの株および／または種の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化させ、上記の配列番号により示される配列の任意の位置の塩基が1つまたは数個置換あるいは欠失あるいは塩基を挿入された配列からなってもよい。このような変異を含む複数の配列を１つの反応場において同時に存在させてもよい。その場合、上記何れかの配列番号に記載の配列またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドとして調製されてもよく、何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、ユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００５０】
ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Ｇｒｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の3−ニトロピロール（Nitropyrrole）、5-ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl ；dP)、デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-D-リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl ；dK)が含まれる。
【００５１】
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。当該プライマーの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。
【００５２】
何れの核酸プローブおよび核酸プローブセットも、上述したマイコプラズマに由来する増幅産物を所望に応じて検出するために使用されてよい。当該核酸プローブは、固相基体表面に固定化されたものであってもよく、液相において使用されてもよい。
【００５３】
固相基体において使用される場合、典型的にはＤＮＡチップを構成する核酸プローブとして用いられてよく、他のマイクロアレイを構成する核酸プローブとして用いられてもよい。当該増幅産物を検出するための核酸プローブは、検出する微生物株または種の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化させてもよい。
【００５４】
上述した何れの核酸プローブも、１つの反応場において１種類で使用しても、複数種類で使用してもよい。また、固相基体表面に固定化して使用する場合には、当該基体における１信号を得るための１領域に１種類で使用しても複数種類で使用してもよい。複数種類で使用される場合、２種類、２種類以上、またはそれぞれの配列を含む全ての核酸プローブが一緒に使用されてもよい。また、これらの配列を構成する何れかの１以上の塩基がミックス塩基に設計されてもよい。ここで、「ミックス塩基」とは、ミックス塩基としたい所望の箇所の塩基を「アデニン」、「チミン」、「シトシン」および「グアニン」に設計した核酸プローブを２以上または全て混合して使用する核酸プローブセットをいう。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。ミックス塩基は、１つの反応場において１つの位置の塩基についてのミックス塩基として使用されても、複数の位置の塩基について全て対応するようなミックス塩基として使用されてもよい。
【００５５】
また、核酸プローブの構造は、特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸および／またはその他の人工核酸鎖を用いることが可能である。また、これら何れかの核酸のキメラ核酸でもよい。
【００５６】
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイズを検出するための手段は、これらに特に限定されるものではないが、濁度、可視光、蛍光、化学発光、電気化学発光、化学蛍光、蛍光エネルギー転移法、ＥＳＲなどの光学的な手法や、電流、電圧、周波数、伝導度、抵抗などの電気的な性質を利用してよい。
【００５７】
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイズを検出するための手段として核酸プローブ固相化チップを使用することが可能である。核酸プローブ固相化チップは、上述の核酸プローブを固相である基体に固定化した装置である。これは、一般的にマイクロアレイまたはＤＮＡチップとも称される。
【００５８】
核酸プローブ固定化チップの非限定的な１例を模式図として図４に示す。核酸プローブ固定化チップ１は、基体２に固定化領域３を具備する。核酸プローブ４は該固定化領域３に固定化される。このような核酸プローブ固定化チップ１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体２に配置される固定化領域３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このような核酸プローブ固定化チップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。1つの固定化領域３には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００５９】
核酸プローブ固定化チップの更なる非限定的な１例を図５に示す。図５の核酸プローブ固定化チップ１１は、基体１２に固定化領域としての電極１３を具備する。核酸プローブ１４は電極１３に固定化される。電極１３は、パット１５に接続される。電極１３からの電気的情報はパット１５を介して取得される。このような核酸プローブ固定化チップ１１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１２に配置される電極１３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例の核酸プローブ固定化チップ１１は、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００６０】
核酸プローブを固相に固定化する場合は、上述した核酸プローブの末端にアミノ基、チオール基およびビオチンなどの官能基を導入してもよい。更に、官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入してもよい。ここで用いられるスペーサーの種類は特に限定されないが、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いてよい。また、核酸プローブの一部の塩基がユニバーサルなヌクレオチドに置換されてもよい。本態様に使用可能なユニバーサルなヌクレオチドの例は、deoxyinosine(dI)や、Gren Research社の3-Nitropyrrole、5-Nitroindole、deoxyribofuranosyl (dP)、deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl(dK)などを含む。
【００６１】
本態様で用いる核酸プローブを固定化するための表面は、特に限定されるものではないが、樹脂ビーズ、磁気ビーズ、金属微粒子、マイクロタイタープート、ガラス基板、シリコン基板、樹脂製基板、電極基板などを用いてよい。
【００６２】
本態様で使用する基体の材料は、特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いてよい。
【００６３】
例えば、電気的な性質を利用する場合、電極を基体に配置することが好ましい。電極は特に限定されるものではないが、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物であってよい。更に、酸化珪素等の半導体化合物や、ＣＣＤ、ＦＥＴ、ＣＭＯＳなど各種半導体デバイスを用いてもよい。
【００６４】
抽出方法は特に限定される物ではなく、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、（社製）等を利用することも可能である。次に、抽出した核酸成分を鋳型にＲＴ-ＬＡＭＰ増幅を行った後、遺伝子検出用電極とでハイブリダイゼーション反応を行う。反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡ、界面活性剤などを添加することが可能である。ここに抽出および増幅した核酸成分を添加の上、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応に供与する。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は１０℃〜９０℃の範囲で、また反応時間は1分以上1晩程度行う。ハイブリダイゼーション反応後の洗浄には、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００６５】
抽出および増幅したサンプル核酸は、あらかじめＦＩＴＣやＣｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなどの蛍光色素やビオチン、ハプテン、オキシダーゼやポスファターゼ等の酵素や、フェロセンやキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識するか、あるいは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出してよい。
【００６６】
電気化学的に活性な核酸結合物質を用いた検出を行う場合は、以下のような手順で検出を行う。基体を洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する核酸結合物質を作用させ、電気化学的な測定を行ってよい。ここで用いられる核酸結合物質は特に限定される物ではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いてよい。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。核酸結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用する。この際、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。電極を核酸結合物質と反応させた後、電気化学的な測定を行う。電気化学的な測定は、３電極タイプ、即ち、参照電極、対極、作用極、あるいは２電極タイプ、即ち、対極、作用極で行う。測定では、核酸結合物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、核酸結合物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加してよい。測定には、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出する。遺伝子検出用電極を用いた遺伝子検出装置は、遺伝子抽出部、遺伝子反応部、核酸結合物質反応部、電気化学測定部、洗浄部等から構成される。
【００６７】
３．アッセイキット
１つの態様に従うと、マイコプラズマの検出および／または分類するためのアッセイキットが提供されてもよい。更なる態様に従うと、マイコプラズマの遺伝子型分類および／または種分類を行うアッセイキットが提供されてもよい。
【００６８】
そのようなアッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットと核酸プローブまたは核酸プローブセットとを含めばよい。当該アッセイキットは、当該プライマーまたはプライマーセットおよび核酸プローブまたは核酸プローブセットに加えて、ＬＡＭＰ増幅および／またはＲＴ-ＬＡＭＰ増幅に必要なバッファーを含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要なバッファー、並びにそこにおいて当該増幅および／またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。また、アッセイキットに含まれる核酸プローブは上述したような基体に固定化されて提供されてもよく、当該アッセイキットが、固相化のための基体を更に含んで提供されてもよい。
【００６９】
増幅産物と核酸プローブとの反応は、上述の何れかの核酸プローブを用いてハイブリダイズが可能なそれ自身公知の何れかの条件で行ってよい。
【００７０】
ＬＡＭＰ産物には特徴的な複雑な高次構造が存在する。そのような公示構造は、ハイブリダイゼーション反応時において核酸プローブが結合した基体と物理的な障害を起こすことが知られている。そのような障害は、ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼす（たとえば、特開２００５−９５０４３を参照されたい）。そのような悪影響を受けないようにするために、核酸プローブは、従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にマイコプラズマ属に分類される微生物由来のターゲット配列が位置するようにプライマーを設計している。
【００７１】
本態様によれば、簡便、安価、高速にマイコプラズマ属に分類される微生物の検出および属レベルまたは種レベルで遺伝子型を分類する方法が提供される。
【００７２】
４．マイコプラズマの検出および／または分類方法
更なる態様に従うと、マイコプラズマを検出および／または分類する方法が提供される。当該検出方法は、上記したプライマー、核酸プローブおよび増幅方法を利用することにより、マイコプラズマに分類される微生物の検出および属レベルまたは種レベルで遺伝子型分類を行う方法である。
【００７３】
例えば、試料に含まれる核酸を上述の何れかのプライマーセットを用いてＲＴ-ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ増幅する工程と、前記増幅により生じた増幅産物と上述の何れかの核酸プローブとを反応することと、前記反応の結果から試料に存在するマイコプラズマを検出および／または分類することを具備する方法であってよい。
【００７４】
また例えば、上述の何れかのプライマーセットを用いて、試料についてＲＴ-ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ増幅反応を行うことと、当該増幅反応により生じた増幅産物と、上述の何れかの核酸プローブとを反応し、それにより生じるハイブリダイズの有無を検出することにより試料におけるマイコプラズマの存在の有無を判定する、および／または試料におけるマイコプラズマを分類することを具備する方法であってもよい。
【００７５】
また例えば、マイコプラズマに分類される微生物の感染や存在を検出する方法は、
上述の態様に従うプライマーから任意に選択された少なくとも１種類のプライマーセットを用いて試料について増幅反応させることと、
前記増幅反応により生じた増幅産物の有無に基づいて、前記試料中についてマイコプラズマが存在するか否かを判定することと
を特徴とする方法であってもよい。
【００７６】
検出に使用される試料はその状態や含まれる成分に応じて、それ自身公知の手段で前処理されてもよい。そのような前処理は例えば、ホモジネート、核酸の抽出および／または精製などであってよい。
【００７７】
増幅反応は、ＬＡＭＰ増幅またはＲＴ−ＬＡＭＰ増幅であってよい。増幅は、上述の何れかのプライマーを用いて増幅対象の核酸を増幅可能なそれ自身公知の何れの条件で行ってよい。増幅産物の有無の判定は、増幅産物による白濁を検出することにより行ってもよく、増幅産物と上述の何れかの核酸プライマーとの間で生じるハイブリダイゼーションを検出することにより行ってもよい。
【００７８】
増幅産物と核酸プローブとの反応は、上述の何れかの核酸プローブを用いてハイブリダイズが可能なそれ自身公知の何れかの条件で行ってよい。
【００７９】
本態様によれば、簡便、安価、高速にマイコプラズマ属に分類される微生物の検知および属レベルまたは種レベルで遺伝子型を分類する方法が提供される。
【００８０】
また、上述したとおり、これまで、迅速診断法としてはウイルスＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを作成した上、前記ＤＮＡ配列中の特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検知する方法（ＲＴ-ＰＣＲ法）などが知られている。しかしながら、PCRを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またPCR法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の1塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。特異性を配列検知の際の特異性を挙げる方法としては、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検知する手法が挙げられるが、ＰＣＲにて生成される産物が２本鎖であるため、核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させる場合に、相補鎖が核酸プローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検知感度が悪いのが問題である。本態様に従うと、このようなＰＣＲ法による問題も解決することが可能である。
【００８１】
また、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった従来の方法もあるが、これらの方法は、いずれも、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価格化、操作における煩雑性が問題である。このような問題も本態様により解決することが可能である。
【００８２】
［例］
以下に、本態様による核酸検出方法について例を用いて具体的に説明する。
【００８３】
マイコプラズマ（Mycoplasma）属を構成する微生物種では、微生物ゲノム解析の結果１６ｓ−ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡをコードする遺伝子配列の一部領域が、微生物種毎にユニークな配列を保持しながらも高度に保存されていることを見出した。そこで、先ず、マイコプラズマ属の代表列としてマイコプラズマ属の６種、即ち、M.argininim、M.orale、M.hyorhinis、M.bovis、M.fermentans、M.pulmonisを選択した。これらの種はウシ、ヒト、ウマ血清への混入が知られるとともに、各種培養細胞で感染報告のある種である。これらを検出対象とし、前記遺伝子領域について検出するために最適なプライマー／プローブ設計遺伝子配列を設計した。これらの配列を基に後述する種々の実験を行った。それにより好ましいプライマーセットと核酸プローブを選定した。選定されたプライマーセットと核酸プローブは、最終的に目的とする核酸を検出する際に、検出信号量および検出特異性について好ましい特性を有していることを確認した。
【００８４】
更に、マイコプラズマ属の他の種、即ち、M. bovirhinis、M. bovigenitalium、M. arginini、M alkalescens、M. californicum、M. canadense、M. haemofelis 、Candidatus Mycoplasma haemominutum およびM. felisについても、前記プライマー／プローブ設計遺伝子配列に対応する遺伝子配列領域の配列を基にプライマーおよび核酸プローブを設計した。得られたプライマーおよび核酸プローブについて、それぞれの核酸検出特性を確認した。それらは望ましい検出特性を有していることが確認された。詳細を以下に記す。
【００８５】
［例１］
プライマーセットの選択
マイコプラズマ属から６種、即ち、M.argininiｍ、M.orale、M.hyorhinis、M.bovis、M.fermentans、M.pulmonisを選択した。これらの種の代表配列（即ちAccession No.；AF125581、AY796060、AF258792、U02968、M24289およびAF125582）について、16ｓ−ｒRNA領域のアライメントを作成した。アライメント上で、保存性が高い領域に対して栄研化学の推奨するＬＡＭＰ法プライマー設計方法を参考に、以下のようにプライマーを設計した。即ち、マイコプラズマ属に共通な領域と種判別可能な領域とを選択し、ＬＡＭＰ増幅で生じる２つのループにそれぞれ割り当てられるよう、Ｆ１、Ｆ２、Ｂ１、Ｂ２を配置した。前記６種のうち、M.pulmonisゲノムＤＮＡの一部をクローニングしたプラスミド（103copies/reaction）を鋳型にしてＬＡＭＰ増幅を行った。増幅は、以下に記す組成のＬＡＭＰ反応液組成を用いて６３℃９０分でＲｅａｌｏｏｐ−３０（モリテックス社製）を用いて行った。使用したプライマーは、表１−１および表１−２に示すＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーである。
【表１−１】
【００８６】
【表１−２】
【００８７】
これらを用いて増幅を行った場合の濁度立上がり時間を表２に示す。
【表２】
【００８８】
この結果から、使用した１０種のプライマーセットから濁度の立上りが見られたものはＭｐＣＳ−１およびＭｐＳ−１の２種類であった（表２）。この２種類のうち、増幅速度の速いプライマーセットであるＭｐＳ−１を選択した。このプライマーを使用し、更にループプライマーとM.pulmonis以外の5種に対応する更なるプライマーを追加して後述するようにＬＡＭＰ増幅を行った。使用したプライマーの組み合わせは表３に記載する。
【表３】
【００８９】
追加するプライマーの量は、変異割合に応じて、トータルプライマー量に対して割り付けた。
【００９０】
＜LAMP反応液組成（１×）＞
FIPプライマー 40 pmol
BIPプライマー 40 pmol
F3プライマー 5 pmol
B3プライマー 5 pmol
(Lfc/Lb 20 pmol)
2×Reaction Mixture 12.5μＬ
8 U/μl Bst DNA polymerase 1μＬ
鋳型 1μL
蒸留水 Up to 25μＬ。
【００９１】
＜反応混合物（反応時濃度）＞
Tris-HCl (pH8.8) 20 mM
KCL 10 mM
MgSO4 8 mM
(NH4)SO4 10 mM
Tween-20 0.1 %
Betaine 0.8 M
dNTPs 各1.4 mMずつ。
【００９２】
ループプライマーの選択
上記で候補となったプライマーセットに対し、定法に従ってループプライマーを設計して合成した。上述の反応組成に２０ｐｍｏｌのループプライマーを追加して上述と同様にＬＡＭＰ増幅を行った。鋳型は添加前に９５℃で５分間処理したものを使用した。ループプライマーは表１に記載の配列に記載するものを使用した。増幅結果をプライマーの組合せと共に表４に示す。
【表４】
【００９３】
表４の結果から、以降の実験に使用する各プライマーセットのためのループプライマーを選択した。
【００９４】
［例２］
マイコプラズマの上記増幅用プライマーの設定部位には種に特異的な変異が存在する。そのようなそれぞれの種に特有の配列、即ち、変異に対応したプライマーを作成した。これを用いて、変異割合に応じた割付を行った。更に、トータルプライマー量を数段階変化させた。その結果から、マイコプラズマ属の上気６種に由来する核酸を効率よく増幅できる条件を設定した。具体的には、上記6微生物種のゲノムDNAを準備し、各ゲノムDNAを鋳型としてトータルプライマー量および酵素量の至適条件を探った。その結果、トータルプライマー量２倍、酵素量２倍の組成において、６種のゲノムについて、１０３copies/reaction相当のゲノムを使用すれば、全ての種を20分台で増幅できることが確認できた。この条件を以下の試験では使用した。
【００９５】
なお、上記のプライマーセットを使用した場合のマイコプラズマ属の近縁種であるAcholeplasma laidrawiiについて増幅交差反応性を調べた。106copies/reaction以上で交差増幅することが示された。そこで、後述するようにDNAチップにAcholeplasma laidrawii判別核酸プローブの設置の可能性を検討した。
【００９６】
以上の検討から好ましいと選定されたプライマーセットを表５に示す。
【表５】
【００９７】
［例３］
核酸プローブの配列設計
前記プライマーセットにより増幅されたＬＡＭＰ増幅産物を検出するためのプローブを設計した。まず、複数の候補配列を設計した。これらの候補配列は、ＬＡＭＰ増幅産物と核酸プローブとがハイブリダイズしたときに、ＬＡＭＰ増幅産物の１本鎖核酸領域においてそれらがハイブリダイズするように設計した。候補配列は、３’末端チオール修飾を持つ合成核酸として準備された。
【００９８】
マイコプラズマの増幅産物は、種によって異なる配列がＦループに、属共通の配列がＢループに位置するように設計されている。そこで、増幅産物であるループ・アンド・ステム構造のＦループにM.pulmonisおよび近縁種A.laidrawiiを判別するための核酸プローブが含まれ、Bループに属を共通して検出するための核酸プローブが含まれるように核酸プローブの配列を設計した。核酸プローブのための候補配列を表６に記す。
【表６】
【００９９】
［例４］
核酸プローブの選定
Mycoplasma pulmonis検体を用いた場合のプローブ選定例を以下に示す。
【０１００】
例３に記載した核酸プローブの候補配列を用いて、図６に示すような核酸プローブ固定化チップ（これは「核酸プローブ固定化電極」とも称す）を作製した。基板１０に配置された金電極に対して、それぞれの核酸プローブ候補配列からなる合成核酸（３’末端がチオール修飾されている）をその配列の種類毎にスポットした。それにより核酸プローブが配列毎に１つの電極に対して固定化された。また、更なる電極に対して、ネガティブコントロールプローブをスポットした。その後、その基板を超純水で洗浄し、風乾し、電流検出型の核酸プローブ固定化チップを作製した。作製した核酸チップを２×ＳＳＣの塩を添加した例２で得られたＬＡＭＰ増幅産物に浸漬した。これを３５℃で６０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。ＬＡＭＰ増幅産物は、標準株配列を持つプラスミドを鋳型に増幅したものを用いた。更に、この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した。その後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。Mycoplasma pulmonis検体を用いた場合の電流測定の結果例を表６に示す（表６を参照されたい）。
【０１０１】
電極に固定化した核酸プローブは、領域中に存在する変異をあらかじめ考慮して複数用意した。３０ｎＡ以上の増加量を示す最適な核酸プローブ、２０−３０ｎＡの増加量を示す良好な核酸プローブが得られた。以上の結果から、マイコプラズマ属及び、Mycoplasma pulmonis検出用核酸チップに搭載するためのプローブ配列が選択された。
【０１０２】
更に、上記で選定された最適な核酸プローブとゲノム上の同一位置に設計したプローブ配列を上記と同様に使用して、Mycoplasma pulmonis以外の5種のマイコプラズマ属の微生物およびA.laidrawii由来のＬＡＭＰ増幅産物について反応を行った。その結果、それらの試料についても、何れのプローブ配列からも、核酸プローブと試料核酸検がフルマッチである場合において、３０ｎＡ以上の電流増加量が得られた（表７−１および表７−２）。
【表７−１】
【０１０３】
【表７−２】
【０１０４】
［例５］
他のMycoplasma属の微生物についても上述の例１〜６において選択したプライマー／プローブ設計遺伝子配列に対応する遺伝子領域を特定した。使用した微生物は、M. bovirhinis、M. bovigenitalium、M. arginini、M alkalescens、M. californicum、M. canadense、M. haemofelis 、Candidatus Mycoplasma haemominutum 、M. felisであり、それぞれの代表配列は次の通りである；Accession No.；NR_025986、AY121109、GQ409971、NR_025984、NR_029166、EU925158、AY529632、AY529634、NR029174。これらのプライマー／プローブ設計遺伝子配列を基にそれぞれの微生物種に対応したプライマーと核酸プローブを設計し合成した。それらのプライマーおよび核酸プローブを表８−１、表８−２、表８−３、表８−４および表８−５に示す。
【表８−１】
【０１０５】
【表８−２】
【０１０６】
【表８−３】
【０１０７】
【表８−４】
【０１０８】
【表８−５】
【０１０９】
上述した代表的なマイコプラズマ属の6種およびこれらを含めた上記マイコプラズマ属に対する検出特性を確認した。その結果、構築されたプライマーおよび核酸プローブにより、マイコプラズマ属に分類される微生物種を特異的かつ十分な信号量で検出できることが確認できた。表９−１、表９−２、表９−３および表９−４に各プライマーおよび種判別用の核酸プローブを用いた際の検出結果を示す。
【表９−１】
【０１１０】
【表９−２】
【０１１１】
【表９−３】
【０１１２】
【表９−４】
【０１１３】
［例６］
＜非特異増幅の起きないプライマーセットの選択＞
表１０−１および表１０−２に示す配列番号１〜配列番号２７のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用意した。
【表１０−１】
【０１１４】
【表１０−２】
【０１１５】
これらのプライマーをプライマーセットとして使用してＬＡＭＰ増幅を行った。Mycoplasma pulmonisの一部をクローニングしたプラスミド(１０３copies/reaction)を鋳型にした場合の濁度の立ち上がり時間と、何れの鋳型も含まない場合の非特異増幅濁度の立ち上がり時間を測定した。その結果と用いたプライマーセットの構成を表１１−１および表１１−２に示す。
【表１１−１】
【０１１６】
【表１１−２】
【０１１７】
その結果、プライマーセット１０４−１以外は、非特異的増幅濁度の立ち上がり時間よりも特異的増幅濁度の立ち上がり時間の方が短く、良好なプライマーセットであった。プライマーセット１０２−１、１０２−２および１０３−１は、非特異増幅濁度の立ち上がりがなくより良好なプライマーセットであることが示唆された。更に、プライマーセット１０２−２は、Mycoplasma pulmonisを鋳型とした場合の濁度の立ち上がり時間が３０分以内であり、且つプライマーセット１０２−２は鋳型を含まない場合の非特異増幅濁度の立ち上がりは見られなかった。従って、これらのプライマーセットの中ではプライマーセット１０２−２が最も良好であることが示唆された。
【０１１８】
以上のように、マイコプラズマ属を特異的に増幅することが可能なプライマー、並びにマイコプラズマを特異的に検出できる核酸プローブおよび種判別を良好に行うことが可能な核酸プローブが提供された。これらのプライマーは望ましい増幅特性、即ち、増幅特異性および良好な増幅効率を有していた。また、これらの核酸プローブは、望ましい検出特性、即ち、検出信号量および検出特異性を有していた。
【符号の説明】
【０１１９】
１．核酸プローブ固定化チップ ２．基体 ３．固定化領域 ４．核酸プローブ １１．核酸プローブ固定化チップ １２．基体 １３．電極（即ち、固定化領域） １４．核酸プローブ １５．パット
【技術分野】
【０００１】
本発明の実施形態はマイコプラズマのための増幅および／または検出手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイコプラズマ(Mycoplasma)は、真正細菌の一属であり、マイコプラズマ科（family ;Mycoplasmataceae）、マイコプラズマ属（genus； Mycoplasma）に分類される。現在、約100種類の種が知られている。一般の真正細菌に見られるペプチドグリカン細胞壁が無い。そのため細胞の形は不定形で可塑性があると伴に、ペニシリン系、セフェム系の薬剤は効果がない。自然条件では特定の真核生物に寄生する。大半のものが合成培地での増殖が困難であり、多くのケースで場合は複数の成長因子添加を必要とする。
【０００３】
細胞壁を持たないため細胞の形状に可塑性があり、0.22μm濾過滅菌用フィルターを通過することもこの微生物のユニークな特徴である。そのため、濾過滅菌を行っても細胞培養用培地からのマイコプラズマ除去が出来ず、コンタミネーションによるトラブルの原因となる。
【０００４】
一般的に、細菌や真菌のコンタミネーションでは汚染発生を培地の変色や培養細胞の変性によりコンタミネーション発見が容易である。これに対してマイコプラズマのコンタミネーションは、目視および光学顕微鏡レベルでは培地の変質を発見することが難しい。その上、マイコプラズマが培養細胞と共存することが多いためにコンタミネーションの発生を見逃しやすい。マイコプラズマのコンタミネーションによる影響としては、培地の栄養の消費による培養細胞の成長阻害、マイコプラズマの直接の作用による代謝経路への影響、並びに遺伝子発現への影響が確認されている。そのため、細胞を用いた実験結果を正しく評価するためには、マイコプラズマのコンタミネーションがないことを注意深く確認する必要がある。また、汚染経路の特定のためには、種を推定することも必要である。
【０００５】
マイコプラズマの多くは、ヒトを含む様々な脊椎動物に寄生する。この寄生は、関節症や肺炎などの病原性を示すことがよく知られている。例えば、ヒトにおいては、非定型肺炎を引き起こし、喀痰を伴わない刺激性の咳、頭痛、咽頭痛、倦怠感、発熱などの感冒様症状を呈する。また、牛ではマイコプラズマ科に属する微生物の感染により、肺炎、乳房炎、関節炎、流産などを引き起こす。特に、乳牛におけるマイコプラズマ性乳房炎は、伝染が強くかつ難治性である。これは酪農経営において大きな脅威である。マイコプラズマ性乳房炎が発症し臨床型乳房炎になると、これを治癒することは非常に困難である。従って、感染拡大による経済損失を最小限に抑える為に、症状を示していない潜在感染個体を含む全てのマイコプラズマ感染個体を迅速に特定し、適切な処置を施すことが重要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００４−３５００９２号公報
【特許文献２】特開２００９−１３１１７４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、マイコプラズマを特異的に増幅および／または検出するための手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記目的は以下の実施形態により達成される。
【０００９】
（Ａ）マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのLAMP増幅用核酸プライマーセットであって、前記LAMP増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
ＦＩＰプライマーが、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号２９、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号１０４、配列番号１１２、配列番号１２０およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
ＢＩＰプライマーが、配列番号６、配列番号８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３０、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
Ｆ３プライマーが、配列番号９、配列番号２８、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１１１、配列番号１１９およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、
Ｂ３プライマーが、配列番号１０、配列番号２３、配列番号３１、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１１４、配列番号１２２およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーである
プライマーセット；
（Ｂ） マイコプラズマの検出および／または分類するためのアッセイキットであって、
前記（Ａ）に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットによる増幅により得られた増幅産物からマイコプラズマを特異的に検出するための核酸プローブであり、
（１）配列番号１２７および配列番号１２８；
（２）配列番号１３１、配列番号１３２および配列番号１３３；
（３）配列番号１３６および配列番号１３９；
（４）配列番号１３７および配列番号１３８；
（５）配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０；
（６）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２５および配列番号１２６；並びに
（７）前記（１）〜（６）に記載の配列の相補配列；
によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブ群から少なくとも１選択される核酸プローブを含むアッセイキット；および
（Ｃ） マイコプラズマに由来する核酸を特異的に増幅および／または分類する方法であって、前記（Ａ）に記載のプライマーセットを用いて試料について増幅することを特徴とする方法；
である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本態様に従うＬＡＭＰ法による増幅方法を説明するための模式図。
【図２】本態様に従うＬＡＭＰ法を用いて得られる増幅産物を説明するための模式図。
【図３】本態様に従う増幅産物の１例を示す模式図。
【図４】本態様に従う核酸プローブ固定化基体の模式図。
【図５】本態様に従う核酸プローブ固定化基体の模式図。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１．プライマー
本発明の１態様に従うと、マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ及びＲＴ−ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットが提供される。
【００１２】
「ＬＡＭＰ法」および「ＲＴ-ＬＡＭＰ法」は核酸の増幅法である。これらは、等温遺伝子増幅法とも称される。ＬＡＭＰ法によりＤＮＡを鋳型にして核酸を増幅する。ＲＴ-ＬＡＭＰ法は、逆転写反応とＬＡＭＰ反応を同時に行うことによりＲＮＡを鋳型にして核酸を増幅する。
【００１３】
ＬＡＭＰ法は２種若しくは４領域または４種若しくは６領域のプライマーを用いる点がＰＣＲ法とは異なる。ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲを用いた方法に比べ増幅効率が優れていると共に、サンプル中の不純物の影響も受けにくい。そのため、当該態様に従うプライマーを使用することにより、簡便なサンプルの前処理で微量なマイコプラズマ属に分類される微生物を検出することが可能である。
【００１４】
ここで、ＬＡＭＰ法におけるプライマー設計と、増幅により得られる増幅産物について、図１および図２を参照して説明する。図１は、検出しようとする二本鎖ＤＮＡを示している。合計４種類のプライマー配列、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを設定する。ＦＩＰプライマーおよびＢＩＰプライマーは、各々二つの領域（ＦＩＰはＦ１ｃとＦ２、ＢＩＰはＢ２とＢ１ｃ）を含んでいる。Ｆ３プライマーはＦ３領域を含んでいる。Ｂ３プライマーはＢ３領域を含んでいる。ここでＦ３、Ｆ２、Ｆ１、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃ領域は、前記二本鎖ＤＮＡのうちの一本鎖ＤＮＡの５’→３’方向に向かいこの順で設定された領域である。またＢ３、Ｂ２、Ｂ１、Ｆ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃ領域は、その相補鎖の一本鎖ＤＮＡの５’→３’方向に向かいこの順で設定された領域である。このときＢ３とＢ３ｃ、Ｂ２とＢ２ｃ、Ｂ１とＢ１ｃ、Ｆ１ｃとＦ１、Ｆ２ｃとＦ２、Ｆ３ｃとＦ３は互いに相補鎖である。
【００１５】
これらの領域から構成される４種類のプライマー、即ち、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーを用いてＬＡＭＰ増幅を行なうと、図１の二本鎖ＤＮＡの夫々の鎖から、図２に示すようなダンベル型のステム・アンド・ループ構造の増幅産物が得られる。その増幅機構については説明を省略するが、必要であれば、例えば特開２００２−１８６７８１号公報を参照すればよい。また、この４種のプライマーのほかにループプライマーを併せて用いてもよい。ループプライマーは、ＬＰｆプライマーおよび／またはＬＰｂプライマーであってよい。
【００１６】
なお、ＲＴ−ＬＡＭＰ法は前記ＬＡＭＰ法反応液に逆転写活性を持つ酵素を添加して、逆転写反応を行いながらＬＡＭＰ増幅法を行う方法である。使用するプライマーはＬＡＭＰ法と同一のプライマーを使用してよい。ここにおいて「ＬＡＭＰ法」と記載したとき、ＬＡＭＰ法およびＲＴ−ＬＡＭＰ法の両方法についての言及であると解されてよい。
【００１７】
本態様においては、一本鎖のループ部分にターゲット配列が位置されるようにプライマーを設計する。「ターゲット配列」とは、核酸プローブにハイブリダイゼーションさせるべき配列である。図１に示すように、ターゲット配列（例えば、図１ではＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃの何れか）が、領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／または領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかに対応する位置するように、６つのプライマー領域を設定する。ターゲット配列は、上記それぞれの領域間に形成される一本鎖のループ部分のいずれの部位に位置するように設計されてよい。ここで、プライマー領域Ｆ１とＦ２との間のループ部分には、Ｆ２領域自体も含まれてよい。こうして設定された６つのプライマー領域に基づいて４種類のプライマーを作製し、これらプライマーを用いてＲＴ-ＬＡＭＰ増幅を行なう。それにより、図３に示すようなＬＡＭＰ増幅産物の一部が得られる。このＬＡＭＰ増幅産物中においては、ターゲット配列ＦＰｃ、ＦＰ、ＢＰ、ＢＰｃが増幅産物のダンベル構造における一本鎖ループの中に位置することとなる。
【００１８】
一方、プライマー領域Ｆ１ｃとＦ１、およびＢ１ｃとＢ１は、もともと互いに相補的な配列を有しているので、相互に自己ハイブリダイゼーションを生じて二本鎖を形成する。このように増幅産物中に含まれるターゲット配列は、図３に示すような一本鎖の状態で存在する。従って、変性操作を行なうことなく、図示のように各ターゲット配列に対して相補的な核酸プローブ（例えば、ＦＰ、ＦＰｃ、ＢＰ、ＢＰｃの配列を有する核酸）との特異的ハイブリダイゼーションが可能である。増幅産物の検出は、このような核酸プローブを利用することにより行うことも可能である。ここで、「特異的ハイブリダイゼーション」とは、一塩基多型(Single Nucleotide PolymorpHisms:SNPs)または変異が存在する場合、その僅かの違いも検出することが可能であることを意味する。
【００１９】
上述したとおり、本態様のプライマーセットは、Ｆ１、Ｆ２、F３、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃおよびＢ３ｃ領域を元に設計される。
【００２０】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットの例は、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
ＦＩＰプライマーが、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号２９、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号１０４、配列番号１１２、配列番号１２０およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
ＢＩＰプライマーが、配列番号６、配列番号８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３０、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
Ｆ３プライマーが、配列番号９、配列番号２８、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１１１、配列番号１１９およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、
Ｂ３プライマーが、配列番号１０、配列番号２３、配列番号３１、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１１４、配列番号１２２およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーである
プライマーセットであってよい。
【００２１】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットの更なる例は、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号９および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット、および／または
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号２９および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号３０および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号２８および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号３１および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット
であるプライマーセット
であってよい。
【００２２】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットは、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、更にループプライマーを含み、
前記ループプライマーがＬＰｆプライマーおよび／またはＬＰｂプライマーであり、
前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５および配列番号１２３並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８、配列番号２２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号１００、配列番号１０８、配列番号１１６および配列番号１２４並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセットであってよい。
【００２３】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットの例は、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６および配列番号８並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；
（３）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（４）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号２２およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（５）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２４および配列番号２５並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；
（６）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２４および配列番号２５並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（７）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２６および配列番号２７並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；または
（８）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２６および配列番号２７並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
であるプライマーセット
であってよい。
【００２４】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットの更なる例は、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号５６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号５７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号５５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号５８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号５９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号６０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号６４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号５３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号５６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号６７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号６８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（３）前記ＦＩＰプライマーが配列番号７２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号７３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号７１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号７４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号７５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号７６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（４）前記ＦＩＰプライマーが配列番号８０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号７９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号８２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号８３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号８４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（５）前記ＦＩＰプライマーが配列番号８８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号８７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号９０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号９１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号９２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（６）前記ＦＩＰプライマーが配列番号９６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号９７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号９５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号９８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号９９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１００および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（７）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１０４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１０５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１０３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１０７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１０８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（８）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１１２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１１３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１１１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１１４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１１５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１１６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；および／または
（９）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１２０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１２１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１１９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１２２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１２４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
であるプライマーセットであってよい。
【００２５】
プライマーセットの例において、マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む配列とは、上記何れかの配列番号に記載の配列またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドにおいて、何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失および／または挿入などの変異を有する配列をいう。プライマーの例において、少なくとも１つのプライマーの一部にマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲であればどのような変異を含んでもよい。特異的に増幅可能な範囲とは、分類学的にマイコプラズマと同定されるために必ずしも必要ではない範囲内で変異が存在する範囲である。
【００２６】
そのような変異を含む複数の配列を１つの増幅反応場において同時に存在させてもよい。その場合、上記何れかの配列番号に記載の配列またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドとして調製されてもよく、何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、ユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００２７】
ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Ｇｒｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の3−ニトロピロール（Nitropyrrole）、5-ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl ；dP)、デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-D-リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl ；dK)が含まれる。
【００２８】
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。当該プライマーの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。
【００２９】
プライマーセットの例において、ＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プラマーおよびＢ３プライマーは、それぞれ１つの種類の配列からなってもよく、それぞれ複数種類の配列を含んでもよい。これらのプライマーセットにおいて更にＬＰｆプライマーおよび／またはＬＰｂプライマーを使用する場合には、ＬＰｆプライマーおよびＬＰｂプライマーは、それぞれ１つの種類の配列からなってもよく、それぞれ複数種類の配列を含んでもよい。
【００３０】
上記のような領域を使用したプライマーを用いて、マイコプラズマ由来の核酸を含有する検体試料に対してＬＡＭＰ法或いはＲＴ-ＬＡＭＰ法による増幅を行うと、図３で説明したように、ステム・アンド・ループ構造が形成され、一本鎖のループ構造内に含まれるマイコプラズマ由来のターゲット配列が得られる。
【００３１】
本態様は、上記のようなプライマーセットをマイコプラズマ由来の核酸を含む試料に対して適用すれば、マイコプラズマ標的配列に対応する核酸が特異的に増幅される。また、得られる増幅産物の存在を検出することにより、マイコプラズマ由来の核酸の存在を検出することが可能である。試料におけるマイコプラズマの検出は、検出対象である試料について、当該プライマーセットを用いて増幅反応を行うことにより行うことが可能である。
【００３２】
マイコプラズマに由来する核酸を特異的に増幅する方法は、上記の何れかのプライマーセットを用いて試料について増幅することを特徴とする方法である。
【００３３】
増幅反応の条件は、それ自身公知の何れかの条件を利用すればよい。また、当該増幅反応を行った結果を基に当該試料はマイコプラズマ由来の核酸（「マイコプラズマ核酸」ともいう）が含まれていると判定すればよい。そのような判定により試料中のマイコプラズマ核酸の存在を検出および分類することが可能である。
【００３４】
例えば、上記増幅反応は、１反応場当たり、例えば、１チューブ当たり１プライマーセットで行ってもよく、あるいは１反応場（例えば、１チューブ）に各種遺伝子型に対応した複数のプライマーセットを用いて行ってもよい。複数のマイコプラズマ種を特定する必要がある場合は、後者の方法で行う方が効率的である。増幅反応場は、例えば、そこにおいて反応が可能な容器であってよく、例えば、チューブ、マイクロチューブ、ビーカー、マルチウェルプレートなどであってよいが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
また、ユニバーサルにマイコプラズマ核酸を増幅するためには、それぞれ複数の種類のＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プラマーおよびＢ３プライマーを使用することがより好ましい。また、特定の種のマイコプラズマ核酸を増幅するためには、特定の種に特異的なヌクレオチドを有する配列を使用すればよい。より確実に包括的にウイルスを増幅するためには、少なくとも種に特異的な変異部位に関してユニバーサルヌクレオチドまたはミックス塩基となるようにプライマーを設計および使用することが好ましい。
【００３６】
また、変異部について塩基の種類の異なる複数の配列を１つの配列で表してもよい。その場合、問題となる変異部の塩基は複数の塩基を示す１塩基表示による記号を含ませればよい。それらの記号の示す塩基の意味は通常当該技術分野において一般的に使用される意味である。即ち、「ｒ」はグアニンまたはアデニン、「ｙ」はチミンまたはシトシン、「ｍ」はアデニンまたはシトシン、「ｋ」はグアニンまたはチミン、「ｓ」はグアニンまたはシトシン、「ｗ」はアデニンまたはチミン、「ｂ」はグアニンまたはシトシンまたはチミン、「ｄ」はアデニンまたはグアニンまたはチミン、「ｈ」はアデニンまたはシトシンまたはチミン、「ｖ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシン、「ｎ」はアデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミンである。
【００３７】
上記増幅反応は、これに限定するものではないが、例えば、以下に示すような組成のバッファー中で行ってよい：
ＲＴ−ＬＡＭＰ法の反応液組成
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．８）
１０ｍＭ ＫＣＬ
８ｍＭ ＭｇＳＯ４
１０ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４
０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
０．８Ｍ Ｂｅｔａｉｎｅ
１．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ
16 U Bst DNA polymerase
0.625U AMV Reverse transcriptase。
【００３８】
このような組成の反応液で、総量２５μＬで反応を行う際には、下記の濃度でそれぞれのプライマーを持ち込んでもよい；
プライマー添加量
ＦＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
ＢＩＰプライマー ４０ｐｍｏＬ
Ｆ３プライマー ５ｐｍｏＬ
Ｂ３プライマー ５ｐｍｏＬ。
【００３９】
ここで「試料」とは、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、フェレット、オナガザル、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、アザラシおよびネズミイルカなどの哺乳類、鳥類などの体液、組織、細胞、便、並びに水、湖水、川水、海水および土壌などの環境に存在する何れかの物質であってもよい。或いは、当該試料は、マイコプラズマ属に分類される微生物あるいはその遺伝子が含まれている可能性の疑われる物質であってよい。例えば、培養液のようなものでもよい。そのような物質をそれ自身公知の手段により、核酸の増幅に適した状態に前処理したものであってもよく、何れの前処理もなされなくてもよい。そのような前処理の例は、変性、濾過、核酸抽出、不純物除去などを含む。
【００４０】
上述のようなプライマーセットを用いて核酸の増幅を行うことにより、簡便、安価、高速に、特異的にマイコプラズマ核酸を増幅することが可能である。これを利用して、試料に含まれる核酸を当該プライマーまたはプライマーセットを用いるＲＴ-ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ増幅反応に供し、増幅反応の結果生じた増幅産物の有無を判定することにより、試料に含まれるマイコプラズマ由来の核酸を特異的に検出することが可能である。
【００４１】
従来の方法では、特異性を配列検出の際の特異性は、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検出している。この場合、ＰＣＲにより生成される産物は２本鎖であるため、核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させると、相補鎖が核酸プローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く、検出感度が悪い。そのような方法において、従来では、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するなどの方法も行われている。このような場合では、酵素の使用および磁気ビーズの使用などによって、ワーキングコストが高額となったり、操作が煩雑性になったりする。このような問題も本態様により解決することが可能である。
【００４２】
これまで、迅速診断法としては特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検出する方法などが知られていた。しかしながら、ＰＣＲを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またＰＣＲ法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をする可能性がある。また実際に、プライマーの末端の１塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。本態様に従うプライマーセットを使用することにより、より簡便に、より正確に、より迅速に、より広い検出レンジで、特異的にマイコプラズマ由来の核酸を増幅することが可能である。
【００４３】
従来のヒトおよび動物の臨床診断現場や細胞を用いた研究、疫学研究、その他様々な分野では、マイコプラズマに特徴的な遺伝子配列の存在の検出と迅速な同定を行うことが可能な方法の開発が求められているが、このような要求も本態様によって満たされる。
【００４４】
２．核酸プローブ
本態様は更に、上述のプライマーにより増幅されたマイコプラズマに由来する核酸を検出および／または分類するための核酸プローブおよび核酸プローブセットを提供する。
【００４５】
当該核酸プローブは、マイコプラズマに由来する核酸を包括的に検出するための核酸プローブであってもよく、所望の種を特異的に検出するための核酸プローブであってもよい。そのような核酸プローブは、例えば、上述のプライマーにより増幅されたステム・アンド・ループ構造を有するポリヌクレオチドの一本鎖のループ部分の領域に対して結合するように設定されればよい。また、当該プライマーは好ましくは、約１０〜６０塩基長、約１２〜４０塩基長などであればよい。
【００４６】
例えば、好ましい核酸プローブの例は、図１に示すようなステム・アンド・ループ構造のプライマー領域Ｆ１とＦ２との間(この領域はＦ２領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｆ２ｃとＦ１ｃとの間(この領域はＦ２ｃ領域を含んでもよい)、プライマー領域Ｂ１とＢ２との間(この領域はＢ２領域を含んでもよい)、および／またはプライマー領域Ｂ２ｃとＢ１ｃとの間(この領域はＢ２ｃ領域を含んでもよい)の何れかの位置に対応するように選択されてよい。
【００４７】
前記プライマーセットによる増幅により得られた増幅産物からマイコプラズマを特異的に検出するための核酸プローブの例は、
（１）配列番号１２７および配列番号１２８；
（２）配列番号１３１、配列番号１３２および配列番号１３３；
（３）配列番号１３６および配列番号１３９；
（４）配列番号１３７および配列番号１３８；
（５）配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０；
（６）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２５および配列番号１２６；並びに
（７）前記（１）〜（６）に記載の配列の相補配列；
によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブ群から少なくとも１選択される核酸プローブを含む。
【００４８】
マイコプラズマの特定の種を検出および／または分類するための核酸プローブの例は、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドを含む核酸プローブ群から少なくとも１種類選択される配列を含む核酸プローブを含む。
【００４９】
核酸プローブまたは核酸プローブセットの例において、マイコプラズマ由来の核酸を特異的に検出可能な範囲で変異を含んでもよい。特異的に検出可能な範囲とは、分類学的にマイコプラズマと同定されるために必ずしも必要ではない範囲内で変異が存在する範囲である。例えば、上述した核酸プローブは、何れも上記の配列番号により示される配列の任意の位置の塩基が1つまたは数個置換あるいは欠失あるいは塩基を挿入された配列からなってもよい。核酸プローブは、検出しようとするマイコプラズマの株および／または種の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化させ、上記の配列番号により示される配列の任意の位置の塩基が1つまたは数個置換あるいは欠失あるいは塩基を挿入された配列からなってもよい。このような変異を含む複数の配列を１つの反応場において同時に存在させてもよい。その場合、上記何れかの配列番号に記載の配列またはその相補配列により示されるポリヌクレオチドの何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、混合ヌクレオチドとして調製されてもよく、何れかの位置の１〜５個、好ましくは１〜数個のヌクレオチドが、ユニバーサルなヌクレオチドであってもよい。
【００５０】
ユニバーサルなヌクレオチドの例は、これらに限定するものではないが、デオキシイノシン（deoxyinosine；dI)や、Ｇｒｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社の3−ニトロピロール（Nitropyrrole）、5-ニトロインドール（Nitroindole）、デオキシリボルラノシル（deoxyribofuranosyl ；dP)、デオキシ-5'-ジメトキシトリチル-D-リボフラノシル（deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl ；dK)が含まれる。
【００５１】
またここで、プライマーの各配列間またはその末端側には、１〜１００ヌクレオチド、好ましくは２〜３０ヌクレオチド程度の配列（例えば、スペーサーとして使用される配列）が含まれていてもよい。当該プライマーの長さは３０〜２００ヌクレオチド程度であってよく、好ましくは３５〜１００ヌクレオチド、更に好ましくは４３〜６０ヌクレオチドであってよい。
【００５２】
何れの核酸プローブおよび核酸プローブセットも、上述したマイコプラズマに由来する増幅産物を所望に応じて検出するために使用されてよい。当該核酸プローブは、固相基体表面に固定化されたものであってもよく、液相において使用されてもよい。
【００５３】
固相基体において使用される場合、典型的にはＤＮＡチップを構成する核酸プローブとして用いられてよく、他のマイクロアレイを構成する核酸プローブとして用いられてもよい。当該増幅産物を検出するための核酸プローブは、検出する微生物株または種の保持する遺伝的多型や変異などに応じて変化させてもよい。
【００５４】
上述した何れの核酸プローブも、１つの反応場において１種類で使用しても、複数種類で使用してもよい。また、固相基体表面に固定化して使用する場合には、当該基体における１信号を得るための１領域に１種類で使用しても複数種類で使用してもよい。複数種類で使用される場合、２種類、２種類以上、またはそれぞれの配列を含む全ての核酸プローブが一緒に使用されてもよい。また、これらの配列を構成する何れかの１以上の塩基がミックス塩基に設計されてもよい。ここで、「ミックス塩基」とは、ミックス塩基としたい所望の箇所の塩基を「アデニン」、「チミン」、「シトシン」および「グアニン」に設計した核酸プローブを２以上または全て混合して使用する核酸プローブセットをいう。また、複数種類の塩基に対して対合可能な修飾塩基で置換するように設計されてもよい。ミックス塩基は、１つの反応場において１つの位置の塩基についてのミックス塩基として使用されても、複数の位置の塩基について全て対応するようなミックス塩基として使用されてもよい。
【００５５】
また、核酸プローブの構造は、特に限定されるものではなく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、メチルホスホネート骨格の核酸および／またはその他の人工核酸鎖を用いることが可能である。また、これら何れかの核酸のキメラ核酸でもよい。
【００５６】
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイズを検出するための手段は、これらに特に限定されるものではないが、濁度、可視光、蛍光、化学発光、電気化学発光、化学蛍光、蛍光エネルギー転移法、ＥＳＲなどの光学的な手法や、電流、電圧、周波数、伝導度、抵抗などの電気的な性質を利用してよい。
【００５７】
核酸プローブと増幅産物とのハイブリダイズを検出するための手段として核酸プローブ固相化チップを使用することが可能である。核酸プローブ固相化チップは、上述の核酸プローブを固相である基体に固定化した装置である。これは、一般的にマイクロアレイまたはＤＮＡチップとも称される。
【００５８】
核酸プローブ固定化チップの非限定的な１例を模式図として図４に示す。核酸プローブ固定化チップ１は、基体２に固定化領域３を具備する。核酸プローブ４は該固定化領域３に固定化される。このような核酸プローブ固定化チップ１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体２に配置される固定化領域３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。このような核酸プローブ固定化チップは、蛍光を用いた検出方法のために好適に用いられてよい。1つの固定化領域３には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００５９】
核酸プローブ固定化チップの更なる非限定的な１例を図５に示す。図５の核酸プローブ固定化チップ１１は、基体１２に固定化領域としての電極１３を具備する。核酸プローブ１４は電極１３に固定化される。電極１３は、パット１５に接続される。電極１３からの電気的情報はパット１５を介して取得される。このような核酸プローブ固定化チップ１１は、当該分野で周知の方法によって製造することができる。基体１２に配置される電極１３の数及びその配置は、当業者が必要に応じて適宜設計変更することが可能である。さらに、本例の核酸プローブ固定化チップ１１は、必要に応じて、参照電極及び対極を具備してもよい。1つの固定化領域には、独立した１つの信号として得ることが必要な情報を得るために必要な１種類または１種類以上の核酸プローブまたは核酸プローブセットが固定化される。
【００６０】
核酸プローブを固相に固定化する場合は、上述した核酸プローブの末端にアミノ基、チオール基およびビオチンなどの官能基を導入してもよい。更に、官能基とヌクレオチドの間にスペーサーを導入してもよい。ここで用いられるスペーサーの種類は特に限定されないが、例えばアルカン骨格、エチレングリコール骨格などを用いてよい。また、核酸プローブの一部の塩基がユニバーサルなヌクレオチドに置換されてもよい。本態様に使用可能なユニバーサルなヌクレオチドの例は、deoxyinosine(dI)や、Gren Research社の3-Nitropyrrole、5-Nitroindole、deoxyribofuranosyl (dP)、deoxy-5'-dimethoxytrityl-D-ribofuranosyl(dK)などを含む。
【００６１】
本態様で用いる核酸プローブを固定化するための表面は、特に限定されるものではないが、樹脂ビーズ、磁気ビーズ、金属微粒子、マイクロタイタープート、ガラス基板、シリコン基板、樹脂製基板、電極基板などを用いてよい。
【００６２】
本態様で使用する基体の材料は、特に限定されるものではない。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素、等の無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いてよい。
【００６３】
例えば、電気的な性質を利用する場合、電極を基体に配置することが好ましい。電極は特に限定されるものではないが、例えば、金、金の合金、銀、プラチナ、水銀、ニッケル、パラジウム、シリコン、ゲルマニウム、ガリウム、タングステン等の金属単体及びそれらの合金、あるいはグラファイト、グラシーカーボン等の炭素等、またはこれらの酸化物、化合物であってよい。更に、酸化珪素等の半導体化合物や、ＣＣＤ、ＦＥＴ、ＣＭＯＳなど各種半導体デバイスを用いてもよい。
【００６４】
抽出方法は特に限定される物ではなく、フェノール−クロロホルム法等の液−液抽出法や担体を用いる固液抽出法を用いることができる。また、市販の核酸抽出方法ＱＩＡａｍｐ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、（社製）等を利用することも可能である。次に、抽出した核酸成分を鋳型にＲＴ-ＬＡＭＰ増幅を行った後、遺伝子検出用電極とでハイブリダイゼーション反応を行う。反応溶液は、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液中で行う。この溶液中にはハイブリダイゼーション促進剤である硫酸デキストランや、サケ精子ＤＮＡ、牛胸腺ＤＮＡ、ＥＤＴＡ、界面活性剤などを添加することが可能である。ここに抽出および増幅した核酸成分を添加の上、核酸プローブとのハイブリダイゼーション反応に供与する。反応中は、撹拌、あるいは振とうなどの操作で反応速度を高めることもできる。反応温度は１０℃〜９０℃の範囲で、また反応時間は1分以上1晩程度行う。ハイブリダイゼーション反応後の洗浄には、イオン強度０．０１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。
【００６５】
抽出および増幅したサンプル核酸は、あらかじめＦＩＴＣやＣｙ３、Ｃｙ５、ローダミンなどの蛍光色素やビオチン、ハプテン、オキシダーゼやポスファターゼ等の酵素や、フェロセンやキノン類等の電気化学的に活性な物質で標識するか、あるいは前述した物質で標識したセカンドプローブを用いることで検出してよい。
【００６６】
電気化学的に活性な核酸結合物質を用いた検出を行う場合は、以下のような手順で検出を行う。基体を洗浄後、電極表面に形成した二本鎖部分に選択的に結合する核酸結合物質を作用させ、電気化学的な測定を行ってよい。ここで用いられる核酸結合物質は特に限定される物ではないが、例えば、ヘキスト３３２５８、アクリジンオレンジ、キナクリン、ドウノマイシン、メタロインターカレーター、ビスアクリジン等のビスインターカレーター、トリスインターカレーター、ポリインターカレーター等を用いてよい。更に、これらのインターカレーターを電気化学的に活性な金属錯体、例えば、フェロセン、ビオロゲン等で修飾しておくことも可能である。核酸結合物質の濃度は、その種類によって異なるが、一般的には１ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌの範囲で使用する。この際、イオン強度０．００１〜５の範囲で、ｐＨ５〜１０の範囲の緩衝液を用いる。電極を核酸結合物質と反応させた後、電気化学的な測定を行う。電気化学的な測定は、３電極タイプ、即ち、参照電極、対極、作用極、あるいは２電極タイプ、即ち、対極、作用極で行う。測定では、核酸結合物質が電気化学的に反応する電位以上の電位を印加し、核酸結合物質に由来する反応電流値を測定する。この際、電位は定速で掃引するか、あるいはパルスで印加するか、あるいは、定電位を印加してよい。測定には、ポテンショスタット、デジタルマルチメーター、ファンクションジェネレーター等の装置を用いて電流、電圧を制御する。得られた電流値を基に、検量線から標的遺伝子の濃度を算出する。遺伝子検出用電極を用いた遺伝子検出装置は、遺伝子抽出部、遺伝子反応部、核酸結合物質反応部、電気化学測定部、洗浄部等から構成される。
【００６７】
３．アッセイキット
１つの態様に従うと、マイコプラズマの検出および／または分類するためのアッセイキットが提供されてもよい。更なる態様に従うと、マイコプラズマの遺伝子型分類および／または種分類を行うアッセイキットが提供されてもよい。
【００６８】
そのようなアッセイキットは、上述のプライマーまたはプライマーセットと核酸プローブまたは核酸プローブセットとを含めばよい。当該アッセイキットは、当該プライマーまたはプライマーセットおよび核酸プローブまたは核酸プローブセットに加えて、ＬＡＭＰ増幅および／またはＲＴ-ＬＡＭＰ増幅に必要なバッファーを含んでもよく、ハイブリダイゼーションに必要なバッファー、並びにそこにおいて当該増幅および／またはハイブリダイゼーションを行うための容器を具備してもよい。また、アッセイキットに含まれる核酸プローブは上述したような基体に固定化されて提供されてもよく、当該アッセイキットが、固相化のための基体を更に含んで提供されてもよい。
【００６９】
増幅産物と核酸プローブとの反応は、上述の何れかの核酸プローブを用いてハイブリダイズが可能なそれ自身公知の何れかの条件で行ってよい。
【００７０】
ＬＡＭＰ産物には特徴的な複雑な高次構造が存在する。そのような公示構造は、ハイブリダイゼーション反応時において核酸プローブが結合した基体と物理的な障害を起こすことが知られている。そのような障害は、ハイブリダイゼーション効率に悪影響を及ぼす（たとえば、特開２００５−９５０４３を参照されたい）。そのような悪影響を受けないようにするために、核酸プローブは、従来のターゲット配列の位置とは異なり、一本鎖のループ部分にマイコプラズマ属に分類される微生物由来のターゲット配列が位置するようにプライマーを設計している。
【００７１】
本態様によれば、簡便、安価、高速にマイコプラズマ属に分類される微生物の検出および属レベルまたは種レベルで遺伝子型を分類する方法が提供される。
【００７２】
４．マイコプラズマの検出および／または分類方法
更なる態様に従うと、マイコプラズマを検出および／または分類する方法が提供される。当該検出方法は、上記したプライマー、核酸プローブおよび増幅方法を利用することにより、マイコプラズマに分類される微生物の検出および属レベルまたは種レベルで遺伝子型分類を行う方法である。
【００７３】
例えば、試料に含まれる核酸を上述の何れかのプライマーセットを用いてＲＴ-ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ増幅する工程と、前記増幅により生じた増幅産物と上述の何れかの核酸プローブとを反応することと、前記反応の結果から試料に存在するマイコプラズマを検出および／または分類することを具備する方法であってよい。
【００７４】
また例えば、上述の何れかのプライマーセットを用いて、試料についてＲＴ-ＬＡＭＰまたはＬＡＭＰ増幅反応を行うことと、当該増幅反応により生じた増幅産物と、上述の何れかの核酸プローブとを反応し、それにより生じるハイブリダイズの有無を検出することにより試料におけるマイコプラズマの存在の有無を判定する、および／または試料におけるマイコプラズマを分類することを具備する方法であってもよい。
【００７５】
また例えば、マイコプラズマに分類される微生物の感染や存在を検出する方法は、
上述の態様に従うプライマーから任意に選択された少なくとも１種類のプライマーセットを用いて試料について増幅反応させることと、
前記増幅反応により生じた増幅産物の有無に基づいて、前記試料中についてマイコプラズマが存在するか否かを判定することと
を特徴とする方法であってもよい。
【００７６】
検出に使用される試料はその状態や含まれる成分に応じて、それ自身公知の手段で前処理されてもよい。そのような前処理は例えば、ホモジネート、核酸の抽出および／または精製などであってよい。
【００７７】
増幅反応は、ＬＡＭＰ増幅またはＲＴ−ＬＡＭＰ増幅であってよい。増幅は、上述の何れかのプライマーを用いて増幅対象の核酸を増幅可能なそれ自身公知の何れの条件で行ってよい。増幅産物の有無の判定は、増幅産物による白濁を検出することにより行ってもよく、増幅産物と上述の何れかの核酸プライマーとの間で生じるハイブリダイゼーションを検出することにより行ってもよい。
【００７８】
増幅産物と核酸プローブとの反応は、上述の何れかの核酸プローブを用いてハイブリダイズが可能なそれ自身公知の何れかの条件で行ってよい。
【００７９】
本態様によれば、簡便、安価、高速にマイコプラズマ属に分類される微生物の検知および属レベルまたは種レベルで遺伝子型を分類する方法が提供される。
【００８０】
また、上述したとおり、これまで、迅速診断法としてはウイルスＲＮＡから逆転写酵素によりＤＮＡを作成した上、前記ＤＮＡ配列中の特徴的な配列を含む領域をポリメラーゼチェインリアクション（PCR）で増幅し、電気泳動法により検知する方法（ＲＴ-ＰＣＲ法）などが知られている。しかしながら、PCRを利用する方法は、サーマルサイクラーのような複雑な温度制御装置が必要なことや簡便性に課題があるなどの不利点がある。またPCR法では、万が一誤って相補鎖合成が行われてしまった場合にはその生成物が鋳型となり増幅してしまい、誤った判定をしてしまう可能性がある。実際に、プライマーの末端の1塩基相違のみでは特異的な増幅を制御することは困難である。特異性を配列検知の際の特異性を挙げる方法としては、一般的にＰＣＲ法で増幅した目的遺伝子産物をＤＮＡチップにより検知する手法が挙げられるが、ＰＣＲにて生成される産物が２本鎖であるため、核酸プローブとハイブリダイゼーション反応させる場合に、相補鎖が核酸プローブに対するコンペティターとなりハイブリ効率が低く検知感度が悪いのが問題である。本態様に従うと、このようなＰＣＲ法による問題も解決することが可能である。
【００８１】
また、ターゲットを１本鎖にするために、相補鎖を分解する、または分離するといった従来の方法もあるが、これらの方法は、いずれも、酵素の使用、磁気ビーズの使用などによる高価格化、操作における煩雑性が問題である。このような問題も本態様により解決することが可能である。
【００８２】
［例］
以下に、本態様による核酸検出方法について例を用いて具体的に説明する。
【００８３】
マイコプラズマ（Mycoplasma）属を構成する微生物種では、微生物ゲノム解析の結果１６ｓ−ｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡをコードする遺伝子配列の一部領域が、微生物種毎にユニークな配列を保持しながらも高度に保存されていることを見出した。そこで、先ず、マイコプラズマ属の代表列としてマイコプラズマ属の６種、即ち、M.argininim、M.orale、M.hyorhinis、M.bovis、M.fermentans、M.pulmonisを選択した。これらの種はウシ、ヒト、ウマ血清への混入が知られるとともに、各種培養細胞で感染報告のある種である。これらを検出対象とし、前記遺伝子領域について検出するために最適なプライマー／プローブ設計遺伝子配列を設計した。これらの配列を基に後述する種々の実験を行った。それにより好ましいプライマーセットと核酸プローブを選定した。選定されたプライマーセットと核酸プローブは、最終的に目的とする核酸を検出する際に、検出信号量および検出特異性について好ましい特性を有していることを確認した。
【００８４】
更に、マイコプラズマ属の他の種、即ち、M. bovirhinis、M. bovigenitalium、M. arginini、M alkalescens、M. californicum、M. canadense、M. haemofelis 、Candidatus Mycoplasma haemominutum およびM. felisについても、前記プライマー／プローブ設計遺伝子配列に対応する遺伝子配列領域の配列を基にプライマーおよび核酸プローブを設計した。得られたプライマーおよび核酸プローブについて、それぞれの核酸検出特性を確認した。それらは望ましい検出特性を有していることが確認された。詳細を以下に記す。
【００８５】
［例１］
プライマーセットの選択
マイコプラズマ属から６種、即ち、M.argininiｍ、M.orale、M.hyorhinis、M.bovis、M.fermentans、M.pulmonisを選択した。これらの種の代表配列（即ちAccession No.；AF125581、AY796060、AF258792、U02968、M24289およびAF125582）について、16ｓ−ｒRNA領域のアライメントを作成した。アライメント上で、保存性が高い領域に対して栄研化学の推奨するＬＡＭＰ法プライマー設計方法を参考に、以下のようにプライマーを設計した。即ち、マイコプラズマ属に共通な領域と種判別可能な領域とを選択し、ＬＡＭＰ増幅で生じる２つのループにそれぞれ割り当てられるよう、Ｆ１、Ｆ２、Ｂ１、Ｂ２を配置した。前記６種のうち、M.pulmonisゲノムＤＮＡの一部をクローニングしたプラスミド（103copies/reaction）を鋳型にしてＬＡＭＰ増幅を行った。増幅は、以下に記す組成のＬＡＭＰ反応液組成を用いて６３℃９０分でＲｅａｌｏｏｐ−３０（モリテックス社製）を用いて行った。使用したプライマーは、表１−１および表１−２に示すＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーである。
【表１−１】
【００８６】
【表１−２】
【００８７】
これらを用いて増幅を行った場合の濁度立上がり時間を表２に示す。
【表２】
【００８８】
この結果から、使用した１０種のプライマーセットから濁度の立上りが見られたものはＭｐＣＳ−１およびＭｐＳ−１の２種類であった（表２）。この２種類のうち、増幅速度の速いプライマーセットであるＭｐＳ−１を選択した。このプライマーを使用し、更にループプライマーとM.pulmonis以外の5種に対応する更なるプライマーを追加して後述するようにＬＡＭＰ増幅を行った。使用したプライマーの組み合わせは表３に記載する。
【表３】
【００８９】
追加するプライマーの量は、変異割合に応じて、トータルプライマー量に対して割り付けた。
【００９０】
＜LAMP反応液組成（１×）＞
FIPプライマー 40 pmol
BIPプライマー 40 pmol
F3プライマー 5 pmol
B3プライマー 5 pmol
(Lfc/Lb 20 pmol)
2×Reaction Mixture 12.5μＬ
8 U/μl Bst DNA polymerase 1μＬ
鋳型 1μL
蒸留水 Up to 25μＬ。
【００９１】
＜反応混合物（反応時濃度）＞
Tris-HCl (pH8.8) 20 mM
KCL 10 mM
MgSO4 8 mM
(NH4)SO4 10 mM
Tween-20 0.1 %
Betaine 0.8 M
dNTPs 各1.4 mMずつ。
【００９２】
ループプライマーの選択
上記で候補となったプライマーセットに対し、定法に従ってループプライマーを設計して合成した。上述の反応組成に２０ｐｍｏｌのループプライマーを追加して上述と同様にＬＡＭＰ増幅を行った。鋳型は添加前に９５℃で５分間処理したものを使用した。ループプライマーは表１に記載の配列に記載するものを使用した。増幅結果をプライマーの組合せと共に表４に示す。
【表４】
【００９３】
表４の結果から、以降の実験に使用する各プライマーセットのためのループプライマーを選択した。
【００９４】
［例２］
マイコプラズマの上記増幅用プライマーの設定部位には種に特異的な変異が存在する。そのようなそれぞれの種に特有の配列、即ち、変異に対応したプライマーを作成した。これを用いて、変異割合に応じた割付を行った。更に、トータルプライマー量を数段階変化させた。その結果から、マイコプラズマ属の上気６種に由来する核酸を効率よく増幅できる条件を設定した。具体的には、上記6微生物種のゲノムDNAを準備し、各ゲノムDNAを鋳型としてトータルプライマー量および酵素量の至適条件を探った。その結果、トータルプライマー量２倍、酵素量２倍の組成において、６種のゲノムについて、１０３copies/reaction相当のゲノムを使用すれば、全ての種を20分台で増幅できることが確認できた。この条件を以下の試験では使用した。
【００９５】
なお、上記のプライマーセットを使用した場合のマイコプラズマ属の近縁種であるAcholeplasma laidrawiiについて増幅交差反応性を調べた。106copies/reaction以上で交差増幅することが示された。そこで、後述するようにDNAチップにAcholeplasma laidrawii判別核酸プローブの設置の可能性を検討した。
【００９６】
以上の検討から好ましいと選定されたプライマーセットを表５に示す。
【表５】
【００９７】
［例３］
核酸プローブの配列設計
前記プライマーセットにより増幅されたＬＡＭＰ増幅産物を検出するためのプローブを設計した。まず、複数の候補配列を設計した。これらの候補配列は、ＬＡＭＰ増幅産物と核酸プローブとがハイブリダイズしたときに、ＬＡＭＰ増幅産物の１本鎖核酸領域においてそれらがハイブリダイズするように設計した。候補配列は、３’末端チオール修飾を持つ合成核酸として準備された。
【００９８】
マイコプラズマの増幅産物は、種によって異なる配列がＦループに、属共通の配列がＢループに位置するように設計されている。そこで、増幅産物であるループ・アンド・ステム構造のＦループにM.pulmonisおよび近縁種A.laidrawiiを判別するための核酸プローブが含まれ、Bループに属を共通して検出するための核酸プローブが含まれるように核酸プローブの配列を設計した。核酸プローブのための候補配列を表６に記す。
【表６】
【００９９】
［例４］
核酸プローブの選定
Mycoplasma pulmonis検体を用いた場合のプローブ選定例を以下に示す。
【０１００】
例３に記載した核酸プローブの候補配列を用いて、図６に示すような核酸プローブ固定化チップ（これは「核酸プローブ固定化電極」とも称す）を作製した。基板１０に配置された金電極に対して、それぞれの核酸プローブ候補配列からなる合成核酸（３’末端がチオール修飾されている）をその配列の種類毎にスポットした。それにより核酸プローブが配列毎に１つの電極に対して固定化された。また、更なる電極に対して、ネガティブコントロールプローブをスポットした。その後、その基板を超純水で洗浄し、風乾し、電流検出型の核酸プローブ固定化チップを作製した。作製した核酸チップを２×ＳＳＣの塩を添加した例２で得られたＬＡＭＰ増幅産物に浸漬した。これを３５℃で６０分間静置することによってハイブリダイゼーション反応を行った。ＬＡＭＰ増幅産物は、標準株配列を持つプラスミドを鋳型に増幅したものを用いた。更に、この電極を挿入剤であるヘキスト３３２５８溶液を５０μＭ含むリン酸緩衝液中に１５分間浸漬した。その後、ヘキスト３３２５８分子の酸化電流応答を測定した。Mycoplasma pulmonis検体を用いた場合の電流測定の結果例を表６に示す（表６を参照されたい）。
【０１０１】
電極に固定化した核酸プローブは、領域中に存在する変異をあらかじめ考慮して複数用意した。３０ｎＡ以上の増加量を示す最適な核酸プローブ、２０−３０ｎＡの増加量を示す良好な核酸プローブが得られた。以上の結果から、マイコプラズマ属及び、Mycoplasma pulmonis検出用核酸チップに搭載するためのプローブ配列が選択された。
【０１０２】
更に、上記で選定された最適な核酸プローブとゲノム上の同一位置に設計したプローブ配列を上記と同様に使用して、Mycoplasma pulmonis以外の5種のマイコプラズマ属の微生物およびA.laidrawii由来のＬＡＭＰ増幅産物について反応を行った。その結果、それらの試料についても、何れのプローブ配列からも、核酸プローブと試料核酸検がフルマッチである場合において、３０ｎＡ以上の電流増加量が得られた（表７−１および表７−２）。
【表７−１】
【０１０３】
【表７−２】
【０１０４】
［例５］
他のMycoplasma属の微生物についても上述の例１〜６において選択したプライマー／プローブ設計遺伝子配列に対応する遺伝子領域を特定した。使用した微生物は、M. bovirhinis、M. bovigenitalium、M. arginini、M alkalescens、M. californicum、M. canadense、M. haemofelis 、Candidatus Mycoplasma haemominutum 、M. felisであり、それぞれの代表配列は次の通りである；Accession No.；NR_025986、AY121109、GQ409971、NR_025984、NR_029166、EU925158、AY529632、AY529634、NR029174。これらのプライマー／プローブ設計遺伝子配列を基にそれぞれの微生物種に対応したプライマーと核酸プローブを設計し合成した。それらのプライマーおよび核酸プローブを表８−１、表８−２、表８−３、表８−４および表８−５に示す。
【表８−１】
【０１０５】
【表８−２】
【０１０６】
【表８−３】
【０１０７】
【表８−４】
【０１０８】
【表８−５】
【０１０９】
上述した代表的なマイコプラズマ属の6種およびこれらを含めた上記マイコプラズマ属に対する検出特性を確認した。その結果、構築されたプライマーおよび核酸プローブにより、マイコプラズマ属に分類される微生物種を特異的かつ十分な信号量で検出できることが確認できた。表９−１、表９−２、表９−３および表９−４に各プライマーおよび種判別用の核酸プローブを用いた際の検出結果を示す。
【表９−１】
【０１１０】
【表９−２】
【０１１１】
【表９−３】
【０１１２】
【表９−４】
【０１１３】
［例６］
＜非特異増幅の起きないプライマーセットの選択＞
表１０−１および表１０−２に示す配列番号１〜配列番号２７のオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用意した。
【表１０−１】
【０１１４】
【表１０−２】
【０１１５】
これらのプライマーをプライマーセットとして使用してＬＡＭＰ増幅を行った。Mycoplasma pulmonisの一部をクローニングしたプラスミド(１０３copies/reaction)を鋳型にした場合の濁度の立ち上がり時間と、何れの鋳型も含まない場合の非特異増幅濁度の立ち上がり時間を測定した。その結果と用いたプライマーセットの構成を表１１−１および表１１−２に示す。
【表１１−１】
【０１１６】
【表１１−２】
【０１１７】
その結果、プライマーセット１０４−１以外は、非特異的増幅濁度の立ち上がり時間よりも特異的増幅濁度の立ち上がり時間の方が短く、良好なプライマーセットであった。プライマーセット１０２−１、１０２−２および１０３−１は、非特異増幅濁度の立ち上がりがなくより良好なプライマーセットであることが示唆された。更に、プライマーセット１０２−２は、Mycoplasma pulmonisを鋳型とした場合の濁度の立ち上がり時間が３０分以内であり、且つプライマーセット１０２−２は鋳型を含まない場合の非特異増幅濁度の立ち上がりは見られなかった。従って、これらのプライマーセットの中ではプライマーセット１０２−２が最も良好であることが示唆された。
【０１１８】
以上のように、マイコプラズマ属を特異的に増幅することが可能なプライマー、並びにマイコプラズマを特異的に検出できる核酸プローブおよび種判別を良好に行うことが可能な核酸プローブが提供された。これらのプライマーは望ましい増幅特性、即ち、増幅特異性および良好な増幅効率を有していた。また、これらの核酸プローブは、望ましい検出特性、即ち、検出信号量および検出特異性を有していた。
【符号の説明】
【０１１９】
１．核酸プローブ固定化チップ ２．基体 ３．固定化領域 ４．核酸プローブ １１．核酸プローブ固定化チップ １２．基体 １３．電極（即ち、固定化領域） １４．核酸プローブ １５．パット
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
ＦＩＰプライマーが、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号２９、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号１０４、配列番号１１２、配列番号１２０およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
ＢＩＰプライマーが、配列番号６、配列番号８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３０、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
Ｆ３プライマーが、配列番号９、配列番号２８、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１１１、配列番号１１９およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、
Ｂ３プライマーが、配列番号１０、配列番号２３、配列番号３１、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１１４、配列番号１２２およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーである
プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットであって、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号９および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット、および／または
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号２９および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号３０および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号２８および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号３１および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット
であるプライマーセット。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマーセットであって、更に、ループプライマーを含み、
前記ループプライマーはＬＰｆプライマーおよび／またはＬＰｂプライマーを含み、
前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５および配列番号１２３並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８、配列番号２２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号１００、配列番号１０８、配列番号１１６および配列番号１２４並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット。
【請求項４】
請求項３に記載のプライマーセットであって、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６および配列番号８並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；
（３）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（４）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号２２およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（５）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２４および配列番号２５並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；
（６）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２４および配列番号２５並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（７）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２６および配列番号２７並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；または
（８）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２６および配列番号２７並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
であるプライマーセット。
【請求項５】
請求項３に記載のプライマーセットであって、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号５６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号５７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号５５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号５８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号５９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号６０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号６４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号５３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号５６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号６７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号６８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（３）前記ＦＩＰプライマーが配列番号７２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号７３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号７１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号７４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号７５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号７６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（４）前記ＦＩＰプライマーが配列番号８０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号７９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号８２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号８３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号８４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（５）前記ＦＩＰプライマーが配列番号８８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号８７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号９０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号９１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号９２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（６）前記ＦＩＰプライマーが配列番号９６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号９７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号９５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号９８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号９９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１００および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（７）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１０４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１０５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１０３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１０７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１０８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（８）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１１２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１１３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１１１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１１４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１１５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１１６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；および／または
（９）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１２０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１２１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１１９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１２２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１２４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
であるプライマーセット。
【請求項６】
マイコプラズマの検出および／または分類するためのアッセイキットであって、
請求項１〜５の何れか１項に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットによる増幅により得られた増幅産物からマイコプラズマを特異的に検出するための核酸プローブであり、
（１）配列番号１２７および配列番号１２８；
（２）配列番号１３１、配列番号１３２および配列番号１３３；
（３）配列番号１３６および配列番号１３９；
（４）配列番号１３７および配列番号１３８；
（５）配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０；
（６）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２５および配列番号１２６；並びに
（７）前記（１）〜（６）に記載の配列の相補配列；
によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブ群から少なくとも１選択される核酸プローブを含むアッセイキット。
【請求項７】
マイコプラズマの検出および／または分類するためのアッセイキットであって、
請求項１〜５の何れか１項に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットによる増幅により得られた増幅産物からマイコプラズマの所望の種を検出するための核酸プローブであり、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブ群から少なくとも１種類選択される配列を含む核酸プローブと、
を含むアッセイキット。
【請求項８】
マイコプラズマに由来する核酸を特異的に増幅する方法であって、請求項１〜５の何れか１項に記載プライマーセットを用いて試料について増幅することを特徴とする方法。
【請求項９】
マイコプラズマを検出する方法であって、
請求項１〜５の何れか１項に記載のプライマーセットを用いて試料について増幅反応させることと、
前記増幅反応により生じた増幅産物の有無に基づいて、前記試料中についてマイコプラズマが存在するか否かを判定することと
を特徴とする方法。
【請求項１０】
マイコプラズマを検出および／または分類する方法であって、
請求項１〜５の何れか１項に記載のプライマーセットを用いて試料について増幅反応させることと、
前記増幅により生じた反応産物と、
（１）配列番号１２７および配列番号１２８；
（２）配列番号１３１、配列番号１３２および配列番号１３３；
（３）配列番号１３６および配列番号１３９；
（４）配列番号１３７および配列番号１３８；
（５）配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０；
（６）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２５および配列番号１２６；並びに
（７）前記（１）〜（６）に記載の配列の相補配列；
によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブ群から少なくとも１種類選択される核酸プローブ群とを反応させることと、
前記反応の結果から、試料に存在するマイコプラズマを検出および／または分類することと
を特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記核酸プローブ群が基体に固定されていることを特徴とする方法。
【請求項１】
マイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅するためのＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットであって、前記ＬＡＭＰ増幅用核酸プライマーセットはＦＩＰプライマー、ＢＩＰプライマー、Ｆ３プライマーおよびＢ３プライマーを具備し、
ＦＩＰプライマーが、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号２９、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６、配列番号１０４、配列番号１１２、配列番号１２０およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦＩＰプライマーであり、
ＢＩＰプライマーが、配列番号６、配列番号８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３０、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、配列番号８１、配列番号８９、配列番号９７、配列番号１０５、配列番号１１３、配列番号１２１およびそれらの相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＢＩＰプライマーであり、
Ｆ３プライマーが、配列番号９、配列番号２８、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３、配列番号１１１、配列番号１１９およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーであり、
Ｂ３プライマーが、配列番号１０、配列番号２３、配列番号３１、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８、配列番号１０６、配列番号１１４、配列番号１２２およびその相補配列、並びにマイコプラズマ由来の核酸を特異的に増幅可能な範囲で変異を含む前記何れかの配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＦ３プライマーである
プライマーセット。
【請求項２】
請求項１に記載のプライマーセットであって、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号９および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット、および／または
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号２９および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号３０および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号２８および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号３１および／またはその相補配列で示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット
であるプライマーセット。
【請求項３】
請求項１に記載のプライマーセットであって、更に、ループプライマーを含み、
前記ループプライマーはＬＰｆプライマーおよび／またはＬＰｂプライマーを含み、
前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号４９、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１、配列番号９９、配列番号１０７、配列番号１１５および配列番号１２３並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８、配列番号２２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号１００、配列番号１０８、配列番号１１６および配列番号１２４並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドを含む少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット。
【請求項４】
請求項３に記載のプライマーセットであって、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６および配列番号８並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；
（３）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（４）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号２２およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（５）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２４および配列番号２５並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；
（６）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２４および配列番号２５並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
（７）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２６および配列番号２７並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含むプライマーセット；または
（８）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１、配列番号３、配列番号４および配列番号５並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦＩＰプライマーを含み、前記ＢＩＰプライマーが配列番号２６および配列番号２７並びにその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢＩＰプライマーを含み、前記Ｆ３プライマーが配列番号９およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＦ３プライマーを含み、前記Ｂ３プライマーが配列番号２３およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＢ３プライマーを含み、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６および配列番号１７並びに相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｆプライマーを含み、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１８およびその相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる群より少なくとも１選択されるポリヌクレオチドである少なくとも１種類のＬＰｂプライマーを含むプライマーセット；
であるプライマーセット。
【請求項５】
請求項３に記載のプライマーセットであって、
（１）前記ＦＩＰプライマーが配列番号５６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号５７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号５５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号５８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号５９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号６０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（２）前記ＦＩＰプライマーが配列番号６４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号６５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号５３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号５６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号６７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号６８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（３）前記ＦＩＰプライマーが配列番号７２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号７３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号７１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号７４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号７５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号７６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（４）前記ＦＩＰプライマーが配列番号８０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号７９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号８２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号８３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号８４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（５）前記ＦＩＰプライマーが配列番号８８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号８９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号８７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号９０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号９１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号９２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（６）前記ＦＩＰプライマーが配列番号９６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号９７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号９５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号９８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号９９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１００および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（７）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１０４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１０５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１０３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１０６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１０７および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１０８および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
（８）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１１２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１１３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１１１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１１４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１１５および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１１６および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；および／または
（９）前記ＦＩＰプライマーが配列番号１２０および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＢＩＰプライマーが配列番号１２１および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｆ３プライマーが配列番号１１９および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記Ｂ３プライマーが配列番号１２２および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｆプライマーが配列番号１２３および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであり、前記ＬＰｂプライマーが配列番号１２４および／または相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドであるプライマーセット；
であるプライマーセット。
【請求項６】
マイコプラズマの検出および／または分類するためのアッセイキットであって、
請求項１〜５の何れか１項に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットによる増幅により得られた増幅産物からマイコプラズマを特異的に検出するための核酸プローブであり、
（１）配列番号１２７および配列番号１２８；
（２）配列番号１３１、配列番号１３２および配列番号１３３；
（３）配列番号１３６および配列番号１３９；
（４）配列番号１３７および配列番号１３８；
（５）配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０；
（６）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２５および配列番号１２６；並びに
（７）前記（１）〜（６）に記載の配列の相補配列；
によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブ群から少なくとも１選択される核酸プローブを含むアッセイキット。
【請求項７】
マイコプラズマの検出および／または分類するためのアッセイキットであって、
請求項１〜５の何れか１項に記載のプライマーセットと、
前記プライマーセットによる増幅により得られた増幅産物からマイコプラズマの所望の種を検出するための核酸プローブであり、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０、並びにそれらの相補配列によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブ群から少なくとも１種類選択される配列を含む核酸プローブと、
を含むアッセイキット。
【請求項８】
マイコプラズマに由来する核酸を特異的に増幅する方法であって、請求項１〜５の何れか１項に記載プライマーセットを用いて試料について増幅することを特徴とする方法。
【請求項９】
マイコプラズマを検出する方法であって、
請求項１〜５の何れか１項に記載のプライマーセットを用いて試料について増幅反応させることと、
前記増幅反応により生じた増幅産物の有無に基づいて、前記試料中についてマイコプラズマが存在するか否かを判定することと
を特徴とする方法。
【請求項１０】
マイコプラズマを検出および／または分類する方法であって、
請求項１〜５の何れか１項に記載のプライマーセットを用いて試料について増幅反応させることと、
前記増幅により生じた反応産物と、
（１）配列番号１２７および配列番号１２８；
（２）配列番号１３１、配列番号１３２および配列番号１３３；
（３）配列番号１３６および配列番号１３９；
（４）配列番号１３７および配列番号１３８；
（５）配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９および配列番号１５０；
（６）配列番号６１、配列番号６２、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７７、配列番号７８、配列番号８５、配列番号８６、配列番号９３、配列番号９４、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２５および配列番号１２６；並びに
（７）前記（１）〜（６）に記載の配列の相補配列；
によりそれぞれ示されるポリヌクレオチドからなる核酸プローブ群から少なくとも１種類選択される核酸プローブ群とを反応させることと、
前記反応の結果から、試料に存在するマイコプラズマを検出および／または分類することと
を特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記核酸プローブ群が基体に固定されていることを特徴とする方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１２−６０９２５（Ｐ２０１２−６０９２５Ａ）
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２０７２５２（Ｐ２０１０−２０７２５２）
【出願日】平成２２年９月１５日（２０１０．９．１５）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月２９日（２０１２．３．２９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年９月１５日（２０１０．９．１５）
【出願人】（０００００３０７８）株式会社東芝 (54,554)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]