マクサ抽出物が有する破骨細胞形成抑制作用
【課題】本発明は、食品素材として利用されているマクサ（紅藻類テングサ目テングサ科）の抽出物を有効成分として、骨代謝を改善する剤または組成物を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明によりマクサの抽出物を有効成分とする骨代謝改善剤および組成物が提供される。さらにはこれらからなる破骨細胞形成抑制剤、飲食用組成物、医薬用組成物、ペットフードが提供される。
【解決手段】本発明によりマクサの抽出物を有効成分とする骨代謝改善剤および組成物が提供される。さらにはこれらからなる破骨細胞形成抑制剤、飲食用組成物、医薬用組成物、ペットフードが提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマクサ抽出物が有する破骨細胞形成抑制作用に関する。本発明における破骨細胞形成抑制作用とは、骨粗鬆症の予防、骨粗鬆症の進行・進展の防止、及び／又は骨粗鬆症患者における骨の状態の改善のため、更には骨の健康状態を維持するために、ヒト若しくはヒト以外の動物に与えられる医薬品（動物用治療薬も含む）用、飲食品用、及び飼料用またはペットフードの組成物を意味する。
【背景技術】
【０００２】
骨は骨吸収と骨形成を繰り返しており、骨形成に関与する細胞が骨芽細胞であり、骨吸収に関与する細胞が破骨細胞である。骨の成長、維持および修復は、これらの細胞の形成と吸収の速度バランスに依存しており、そのバランスが崩れることにより、骨吸収が骨形成を上回り、骨粗鬆症などの骨密度が減少する骨疾患がもたらされる。よって骨吸収が骨形成を上回らないことが骨密度の維持や増強に重要である。
【０００３】
骨粗鬆症は代謝疾患、内分泌障害、加齢等により骨吸収と骨形成のバランスが崩れたために骨量が減少し、骨の粗鬆化をきたす疾病である。症状は厳しい腰背痛と骨の粗鬆化に起因する骨折を呈し、老人の場合これを契機に寝たきりとなり、生活の質を低下させ、死亡に至ることもある。抗骨粗鬆症剤としては、腰背痛の緩和作用、骨吸収抑制作用、骨形成促進作用を有する薬剤が考えられ、カルシウム製剤、女性ホルモン製剤、活性型ビタミンＤ３製剤、ビタミンＫ２製剤、ビスフォスフォネート製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、カルシトニン製剤、イソフラボン系薬剤、蛋白同化ホルモン製剤などが使用されているが、臨床上、薬効や副作用の点において十分に満足できる製剤は未だなく、効果が高く副作用の少ない抗骨粗鬆症剤が望まれている。また、骨粗鬆症を予防する食品としては、大豆イソフラボン、ビタミンＫ２高産生納豆菌などが使用されている。また、カゼインフォスフォペプチドをはじめとして、骨の材料として必要なカルシウムの腸管吸収促進作用を持つ物質が知られている。しかし、これらのカルシウム吸収促進作用を有する物質は、消化管から体内へのカルシウム吸収を促進するものであり、骨へのカルシウム沈着を促進するものではない。そのため、骨代謝の改善や骨強化に十分な効果を得られない場合がある。従って骨に対して直接働きかける食品成分が望まれている。
【０００４】
マクサは、学名をＧｅｌｉｄｉｕｍ ｅｌｅｇａｎｓ Ｋｕｔｚｉｎｇと称し、紅藻類テングサ目テングサ科に分類され、古くから「ところてん」の食品原料としても利用されている。またマクサに関して、ＢＭＰ２産生増強作用、骨ＡＬＰ活性上昇作用といった骨芽細胞分化促進作用を示す記述は見られるが、破骨細胞形成抑制作用を示した記述は見られない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マクサは「ところてん」の食品原料としても利用されているテングサ科の海藻の一種である。また、マクサに関して破骨細胞形成抑制作用を示した学術的な記述は見られない。本発明は、食品原料として利用されているマクサが、骨代謝を改善する剤または組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、マクサ抽出物が骨代謝改善に有用である破骨細胞形成抑制作用を有することを見出し、それを基に本発明を完成するに至った。
【０００７】
マクサが上記効果を有していることは全く知られていなかった。
【０００８】
即ち本発明が提供するのは以下の通りである。
【０００９】
［１］マクサ抽出物を有効成分とする骨代謝改善剤。
【００１０】
［２］マクサ抽出物を含有する組成物を有効成分とする骨代謝改善剤。
【００１１】
［３］［１］または［２］に記載の骨代謝改善剤からなる破骨細胞分化抑制剤。
【００１２】
［４］［１］〜［３］に記載の骨代謝改善剤を含有する飲食用組成物。
【００１３】
［５］［１］〜［３］に記載の骨代謝改善剤を含有する医薬用組成物。
【００１４】
［６］骨疾患の改善または予防を目的とした［１］〜［５］に記載の剤または組成物。
【００１５】
［７］骨疾患が骨粗鬆症である［６］に記載の剤または組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の骨代謝改善剤、またはこれを含有する組成物は、破骨細胞の分化抑制をすることから、骨吸収の抑制が期待できる。従って、骨粗鬆症をはじめとする骨吸収を伴う骨疾患の治療、改善および予防に有用である。さらに、食品原料として利用されている材料から本発明の剤または組成物を製造することが可能であるので、安全性や付加価値、廃棄物の有効利用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書の骨代謝改善剤は、マクサ抽出物を含有する骨代謝改善効果を有する剤および組成物である。上記の化合物の含有量は限定されないが、骨代謝改善効果を発揮できる範囲で含まれていれば良い。
【００１８】
マクサは、古くから「ところてん」の食品原料としても利用されている海藻である。本発明で用いたマクサ抽出物は、上述のマクサからメタノールで抽出することによって得られるが、その他有機溶媒や水、緩衝液など、マクサから成分を抽出できる方法であれば限定されない。
【００１９】
本発明の骨代謝改善剤、またはこれを含有する各種組成物は、マクサ抽出物を含む材料であれば、そのまま用いることができるが、好ましくは、より摂取に適した形の組成物や、含有量の高い組成物、もしくは精製物とした上で有効成分として用いるほうが好ましい。また、前述の方法により得られたマクサ抽出物や粗精製物もしくは精製物は、所望により任意の食品もしくは医薬品で用いられる製剤化処理を行うこともできる。その場合の製剤化処理は限定されないが、例えば食用油脂や乳化剤などの助剤を用いた乳化処理、粉末化、造粒などが挙げられる。そのようにして得られた製剤は、吸収性や、摂取の容易さ、取り扱いの容易さの観点から有利である。
【００２０】
本発明でいう骨代謝改善作用とは、生体内で骨吸収を抑制する作用のことをいう。骨吸収の抑制は、骨粗鬆症をはじめとする骨量の減少を伴う疾患の予防に有用である。本明細書で提供する剤および組成物は、破骨細胞の分化を抑制し、骨吸収の抑制を介して生体内の骨代謝を改善することができる。この骨代謝改善作用は骨粗鬆症などの骨量が減少する疾患の予防や改善に有用である。
【００２１】
骨代謝改善作用は、評価物質を直接動物に投与して評価する方法もあるが、培養細胞を用いて骨吸収を抑制する作用に関連する破骨細胞形成抑制活性や培養破骨細胞による骨吸収抑制活性を評価する方法がある。破骨細胞形成抑制活性は、骨髄細胞、脾臓細胞、マクロファージなどの細胞を用いて評価することもできる。これら細胞を用いた評価では、破骨細胞を分化させる作用を有するＲＡＮＫＬやＭ−ＣＳＦを添加した培地を用いて破骨細胞の分化抑制を評価する方法や、骨芽細胞と共培養してプロスタグランジンＥ２、副腎皮質ホルモン、インターロイキン−１、活性型ビタミンＤ３や、リポポリサッカライドなどの破骨細胞分化刺激試薬を添加した培地を用いて破骨細胞の分化抑制を評価する方法が挙げられる。これらの培養法において、破骨細胞形成抑制の評価は、破骨細胞に特異的に発現する酒石酸耐性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現により評価することができる。具体的にはＴＲＡＰにより発色する基質を用いた染色法による破骨細胞数のカウント法、もしくはＴＲＡＰにより発色する基質を用いた比色法などが挙げられる。これらのうち少なくとも１種の測定において、サンプルの活性が一般に溶媒対照と比較し、低い値を示す場合、そのサンプルを「破骨細胞分化抑制活性あり」と評価する。
【００２２】
本発明の飲食用組成物は、上記の骨代謝改善剤を含有する組成物であり、これらを一般的な食品に混合したものである。また、公知の食品として適当な担体や助剤などを使用してカプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態にしたものでもよい。ここに言う飲食用とは、例えば、一般食品、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品、ペットフードなどである。ここにいう一般食品とは、飲料、乳製品、発酵乳、乳酸菌飲料、加工乳、コーヒー飲料、ジュース、アイスクリーム、飴、ビスケット、ウェハース、ゼリー、スープ、麺類、を含むがそれに限定されるものではない。好ましくは飲料、乳製品、加工乳、発酵乳、乳酸菌飲料、ウェハース、ゼリーを含む。
【００２３】
本発明の医薬用組成物は、上記の骨代謝改善剤を含有する組成物であり、上記剤そのものであってもよいし、所望により医薬的に許容される担体を含有する組成物であってもよい。その用途は限定されず、例えば一般用医薬品（ＯＴＣ）など容易に入手可能な医薬品又は医薬部外品などが挙げられる。医薬用組成物の形態は限定されず、例えば、丸薬剤、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル錠剤、トローチ剤、シロップ剤、ドライシロップ剤などである。好ましくはカプセル剤、液剤、エリクシル、錠剤、カシェ、座薬などとするほうが良い。また医薬的に許容される担体とは、経口、経腸、経皮、および皮下投与のために好適である任意の材料であり、例えば水、ゼラチン、アラビアガム、ラクトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイド性二酸化ケイ素、などが挙げられる。
【００２４】
本発明は、骨粗鬆症をはじめとする骨疾患に対して骨密度を改善する効果のある物質を含有させても良い。骨密度改善効果のある物質としては、今まで公知の物質を用いることができるが、例えば、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ラクトスクロースなどのオリゴ糖類、ビタミンＫ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、葉酸などのビタミン類、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、などのミネラル類、ダイジン、グリシチン、ゲニスチン、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインなどの大豆イソフラボン、大豆胚軸抽出物、カゼインホスホペプチドなどのペプチド類、またはザクロ等の抽出物、グルコサミン、コンドロイチン、およびコラーゲンを単独又はそれらを組み合わせることが好ましい。またその形態は限定されず、飲食用組成物、医薬用組成物を含む。これらの含有量は限定されないが、骨疾患に対して効果が発揮できる範囲で含まれていれば良い。
【００２５】
本発明の組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物に投与することにより、骨粗鬆症をはじめとする骨疾患を処置、改善または予防することができる。具体的には、閉経、加齢、不動化、ステロイド剤の使用、および免疫抑制剤の使用による骨粗鬆症の他、慢性関節リウマチ、歯槽膿漏、歯根膜炎、変形関節炎などが挙げられる。
【実施例】
以下に本発明をより詳細に説明する為に実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００２６】
破骨細胞形成抑制試験
マウス由来の骨髄細胞と骨芽細胞株化細胞の共存培養法を用いた。破骨細胞形成抑制活性は破骨細胞（多核、ＴＲＡＰ陽性）の形成した数をカウントして評価した。
マウス（雄性、５〜７週齢）の脛骨、大腿骨から採取した骨髄細胞２．０×１０５／ウェルと、マウス由来ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞様細胞株１．０×１０４／ウェルを１０−８Ｍの１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３〔以下、１，２５（ＯＨ）２ＶＤ３とする〕と１０−６ＭプロスタグランジンＥ２〔以下、ＰＧＥ２とする〕の混合液と培養液で混合させ分注した。培養液は１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ）であった。これを９６穴プレートに１００μｌ／ウェルになるように分注した。
【００２７】
サンプルは三重県尾鷲市賀田湾より採取したマクサを９９．５％メタノール（和光純薬）で抽出し用いた。サンプルは１０ｍｇ／ｍｌとなるようにメタノールに溶解し、更に培養液で希釈し希釈系列を作成した。各濃度のサンプル溶液１００μｌを添加し全量を２００μｌ／ウェルとした。炭酸ガスインキュベータを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で７日間培養した。
【００２８】
培養開始３日目にサンプルを追加するため、各ウェルの上澄液１５０μｌを除去し、新たにサンプル溶液と１０−８Ｍの１，２５（ＯＨ）２ＶＤ３、１０−６ＭのＰＧＥ２の混合液を各７５μｌを、各ウェルに添加し再び同一条件で培養した。７日間培養した後、培養液を除去し、１０％ホルマリン含有ＰＢＳ溶液を０．０５ｍｌ／ウェル加えて１５分間固定した。細胞はウェル底に固着した。次にエタノールを０．１ｍｌ／ウェル添加し、１分間再固定した。その後、乾燥させ、ＴＲＡＰ反応に供し、破骨細胞を染色した。
【００２９】
ＴＲＡＰとは破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性フォスファターゼの略称であり、ＴＲＡＰ反応液はナフトールＡＳ−ＭＸフォスフェートを１５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアルデヒドに溶解し、１５ｍｌのバッファー（５０ｍＭの酒石酸ナトリウムを含む０．１ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝５．０）にｆａｓｔ ｒｅｄ ｖｉｏｌｅｔ １ｂ ｓａｌｔを９ｍｇ添加した溶液と混合して調製した。
ＴＲＡＰ反応により染色された、核を２個以上有する破骨細胞を顕微鏡下に計測し、１ウェル当たりの破骨細胞数を計測し、コントロールは被検物質の代わりに同量のメタノールを１０％牛胎児血清含有α−ＮＥＭ培地に添加したものである。コントロールを１００として溶媒と濃度に関連して、相対的破骨細胞数を図１に示した。コントロールに対する有意差の検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った。コントロール群と比較して危険率５．０％、１．０％、で有意差があった場合、それぞれ＋、＋＋で示す。
【００３０】
細胞毒性試験
共存培養後、培養液を１００μｌ除去し、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬を０．０２ｍｌ／ウェル添加した。次いで、炭酸ガスインキュベーターを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％の条件で３０分間培養した。培養終了後、培養液を除去し、ジメチルスルホキシドを１００μｌ／ウェル加えて波長λ＝５７０ｎｍの吸光度を測定して図１に併記した。この場合もサンプル液の代わりにメタノールを添加し培養したコントロールを１００として各実験結果の相対的破骨細胞数を示した。コントロールに対する有意差の検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った。コントロール群と比較して危険率５．０％で有意差があった場合、＊で示す。
ＭＴＴ試薬は、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリィ）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−タータゾリウムブロマイドを５ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）に溶解して調製した。
【００３１】
図１から明らかなように、マクサ抽出物０．７８〜６．２５μｇ／ｍｌの濃度で濃度依存的な破骨細胞形成抑制効果がみられ、細胞毒性はみられなかった。したがって、マクサ抽出物は骨粗鬆症を始め、骨代謝性疾患に有効であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】マクサ抽出物による効果を示すグラフであり、コントロールを１００とする相対的な細胞生存率と破骨細胞形成数を示した。
【技術分野】
【０００１】
本発明はマクサ抽出物が有する破骨細胞形成抑制作用に関する。本発明における破骨細胞形成抑制作用とは、骨粗鬆症の予防、骨粗鬆症の進行・進展の防止、及び／又は骨粗鬆症患者における骨の状態の改善のため、更には骨の健康状態を維持するために、ヒト若しくはヒト以外の動物に与えられる医薬品（動物用治療薬も含む）用、飲食品用、及び飼料用またはペットフードの組成物を意味する。
【背景技術】
【０００２】
骨は骨吸収と骨形成を繰り返しており、骨形成に関与する細胞が骨芽細胞であり、骨吸収に関与する細胞が破骨細胞である。骨の成長、維持および修復は、これらの細胞の形成と吸収の速度バランスに依存しており、そのバランスが崩れることにより、骨吸収が骨形成を上回り、骨粗鬆症などの骨密度が減少する骨疾患がもたらされる。よって骨吸収が骨形成を上回らないことが骨密度の維持や増強に重要である。
【０００３】
骨粗鬆症は代謝疾患、内分泌障害、加齢等により骨吸収と骨形成のバランスが崩れたために骨量が減少し、骨の粗鬆化をきたす疾病である。症状は厳しい腰背痛と骨の粗鬆化に起因する骨折を呈し、老人の場合これを契機に寝たきりとなり、生活の質を低下させ、死亡に至ることもある。抗骨粗鬆症剤としては、腰背痛の緩和作用、骨吸収抑制作用、骨形成促進作用を有する薬剤が考えられ、カルシウム製剤、女性ホルモン製剤、活性型ビタミンＤ３製剤、ビタミンＫ２製剤、ビスフォスフォネート製剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、カルシトニン製剤、イソフラボン系薬剤、蛋白同化ホルモン製剤などが使用されているが、臨床上、薬効や副作用の点において十分に満足できる製剤は未だなく、効果が高く副作用の少ない抗骨粗鬆症剤が望まれている。また、骨粗鬆症を予防する食品としては、大豆イソフラボン、ビタミンＫ２高産生納豆菌などが使用されている。また、カゼインフォスフォペプチドをはじめとして、骨の材料として必要なカルシウムの腸管吸収促進作用を持つ物質が知られている。しかし、これらのカルシウム吸収促進作用を有する物質は、消化管から体内へのカルシウム吸収を促進するものであり、骨へのカルシウム沈着を促進するものではない。そのため、骨代謝の改善や骨強化に十分な効果を得られない場合がある。従って骨に対して直接働きかける食品成分が望まれている。
【０００４】
マクサは、学名をＧｅｌｉｄｉｕｍ ｅｌｅｇａｎｓ Ｋｕｔｚｉｎｇと称し、紅藻類テングサ目テングサ科に分類され、古くから「ところてん」の食品原料としても利用されている。またマクサに関して、ＢＭＰ２産生増強作用、骨ＡＬＰ活性上昇作用といった骨芽細胞分化促進作用を示す記述は見られるが、破骨細胞形成抑制作用を示した記述は見られない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
マクサは「ところてん」の食品原料としても利用されているテングサ科の海藻の一種である。また、マクサに関して破骨細胞形成抑制作用を示した学術的な記述は見られない。本発明は、食品原料として利用されているマクサが、骨代謝を改善する剤または組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、マクサ抽出物が骨代謝改善に有用である破骨細胞形成抑制作用を有することを見出し、それを基に本発明を完成するに至った。
【０００７】
マクサが上記効果を有していることは全く知られていなかった。
【０００８】
即ち本発明が提供するのは以下の通りである。
【０００９】
［１］マクサ抽出物を有効成分とする骨代謝改善剤。
【００１０】
［２］マクサ抽出物を含有する組成物を有効成分とする骨代謝改善剤。
【００１１】
［３］［１］または［２］に記載の骨代謝改善剤からなる破骨細胞分化抑制剤。
【００１２】
［４］［１］〜［３］に記載の骨代謝改善剤を含有する飲食用組成物。
【００１３】
［５］［１］〜［３］に記載の骨代謝改善剤を含有する医薬用組成物。
【００１４】
［６］骨疾患の改善または予防を目的とした［１］〜［５］に記載の剤または組成物。
【００１５】
［７］骨疾患が骨粗鬆症である［６］に記載の剤または組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の骨代謝改善剤、またはこれを含有する組成物は、破骨細胞の分化抑制をすることから、骨吸収の抑制が期待できる。従って、骨粗鬆症をはじめとする骨吸収を伴う骨疾患の治療、改善および予防に有用である。さらに、食品原料として利用されている材料から本発明の剤または組成物を製造することが可能であるので、安全性や付加価値、廃棄物の有効利用が期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本明細書の骨代謝改善剤は、マクサ抽出物を含有する骨代謝改善効果を有する剤および組成物である。上記の化合物の含有量は限定されないが、骨代謝改善効果を発揮できる範囲で含まれていれば良い。
【００１８】
マクサは、古くから「ところてん」の食品原料としても利用されている海藻である。本発明で用いたマクサ抽出物は、上述のマクサからメタノールで抽出することによって得られるが、その他有機溶媒や水、緩衝液など、マクサから成分を抽出できる方法であれば限定されない。
【００１９】
本発明の骨代謝改善剤、またはこれを含有する各種組成物は、マクサ抽出物を含む材料であれば、そのまま用いることができるが、好ましくは、より摂取に適した形の組成物や、含有量の高い組成物、もしくは精製物とした上で有効成分として用いるほうが好ましい。また、前述の方法により得られたマクサ抽出物や粗精製物もしくは精製物は、所望により任意の食品もしくは医薬品で用いられる製剤化処理を行うこともできる。その場合の製剤化処理は限定されないが、例えば食用油脂や乳化剤などの助剤を用いた乳化処理、粉末化、造粒などが挙げられる。そのようにして得られた製剤は、吸収性や、摂取の容易さ、取り扱いの容易さの観点から有利である。
【００２０】
本発明でいう骨代謝改善作用とは、生体内で骨吸収を抑制する作用のことをいう。骨吸収の抑制は、骨粗鬆症をはじめとする骨量の減少を伴う疾患の予防に有用である。本明細書で提供する剤および組成物は、破骨細胞の分化を抑制し、骨吸収の抑制を介して生体内の骨代謝を改善することができる。この骨代謝改善作用は骨粗鬆症などの骨量が減少する疾患の予防や改善に有用である。
【００２１】
骨代謝改善作用は、評価物質を直接動物に投与して評価する方法もあるが、培養細胞を用いて骨吸収を抑制する作用に関連する破骨細胞形成抑制活性や培養破骨細胞による骨吸収抑制活性を評価する方法がある。破骨細胞形成抑制活性は、骨髄細胞、脾臓細胞、マクロファージなどの細胞を用いて評価することもできる。これら細胞を用いた評価では、破骨細胞を分化させる作用を有するＲＡＮＫＬやＭ−ＣＳＦを添加した培地を用いて破骨細胞の分化抑制を評価する方法や、骨芽細胞と共培養してプロスタグランジンＥ２、副腎皮質ホルモン、インターロイキン−１、活性型ビタミンＤ３や、リポポリサッカライドなどの破骨細胞分化刺激試薬を添加した培地を用いて破骨細胞の分化抑制を評価する方法が挙げられる。これらの培養法において、破骨細胞形成抑制の評価は、破骨細胞に特異的に発現する酒石酸耐性酸フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）の発現により評価することができる。具体的にはＴＲＡＰにより発色する基質を用いた染色法による破骨細胞数のカウント法、もしくはＴＲＡＰにより発色する基質を用いた比色法などが挙げられる。これらのうち少なくとも１種の測定において、サンプルの活性が一般に溶媒対照と比較し、低い値を示す場合、そのサンプルを「破骨細胞分化抑制活性あり」と評価する。
【００２２】
本発明の飲食用組成物は、上記の骨代謝改善剤を含有する組成物であり、これらを一般的な食品に混合したものである。また、公知の食品として適当な担体や助剤などを使用してカプセル剤、錠剤、顆粒剤など服用しやすい形態にしたものでもよい。ここに言う飲食用とは、例えば、一般食品、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品）、健康食品、栄養補助食品、ペットフードなどである。ここにいう一般食品とは、飲料、乳製品、発酵乳、乳酸菌飲料、加工乳、コーヒー飲料、ジュース、アイスクリーム、飴、ビスケット、ウェハース、ゼリー、スープ、麺類、を含むがそれに限定されるものではない。好ましくは飲料、乳製品、加工乳、発酵乳、乳酸菌飲料、ウェハース、ゼリーを含む。
【００２３】
本発明の医薬用組成物は、上記の骨代謝改善剤を含有する組成物であり、上記剤そのものであってもよいし、所望により医薬的に許容される担体を含有する組成物であってもよい。その用途は限定されず、例えば一般用医薬品（ＯＴＣ）など容易に入手可能な医薬品又は医薬部外品などが挙げられる。医薬用組成物の形態は限定されず、例えば、丸薬剤、液剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル錠剤、トローチ剤、シロップ剤、ドライシロップ剤などである。好ましくはカプセル剤、液剤、エリクシル、錠剤、カシェ、座薬などとするほうが良い。また医薬的に許容される担体とは、経口、経腸、経皮、および皮下投与のために好適である任意の材料であり、例えば水、ゼラチン、アラビアガム、ラクトース、微結晶性セルロース、スターチ、ナトリウムスターチグリコレート、燐酸水素カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、コロイド性二酸化ケイ素、などが挙げられる。
【００２４】
本発明は、骨粗鬆症をはじめとする骨疾患に対して骨密度を改善する効果のある物質を含有させても良い。骨密度改善効果のある物質としては、今まで公知の物質を用いることができるが、例えば、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ラクトスクロースなどのオリゴ糖類、ビタミンＫ、ビタミンＤ、ビタミンＣ、葉酸などのビタミン類、カルシウム、マグネシウム、鉄、マンガン、亜鉛、などのミネラル類、ダイジン、グリシチン、ゲニスチン、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステインなどの大豆イソフラボン、大豆胚軸抽出物、カゼインホスホペプチドなどのペプチド類、またはザクロ等の抽出物、グルコサミン、コンドロイチン、およびコラーゲンを単独又はそれらを組み合わせることが好ましい。またその形態は限定されず、飲食用組成物、医薬用組成物を含む。これらの含有量は限定されないが、骨疾患に対して効果が発揮できる範囲で含まれていれば良い。
【００２５】
本発明の組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物に投与することにより、骨粗鬆症をはじめとする骨疾患を処置、改善または予防することができる。具体的には、閉経、加齢、不動化、ステロイド剤の使用、および免疫抑制剤の使用による骨粗鬆症の他、慢性関節リウマチ、歯槽膿漏、歯根膜炎、変形関節炎などが挙げられる。
【実施例】
以下に本発明をより詳細に説明する為に実施例を挙げるが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。
【００２６】
破骨細胞形成抑制試験
マウス由来の骨髄細胞と骨芽細胞株化細胞の共存培養法を用いた。破骨細胞形成抑制活性は破骨細胞（多核、ＴＲＡＰ陽性）の形成した数をカウントして評価した。
マウス（雄性、５〜７週齢）の脛骨、大腿骨から採取した骨髄細胞２．０×１０５／ウェルと、マウス由来ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１骨芽細胞様細胞株１．０×１０４／ウェルを１０−８Ｍの１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ３〔以下、１，２５（ＯＨ）２ＶＤ３とする〕と１０−６ＭプロスタグランジンＥ２〔以下、ＰＧＥ２とする〕の混合液と培養液で混合させ分注した。培養液は１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ａｌｐｈａ Ｍｅｄｉｕｍ）であった。これを９６穴プレートに１００μｌ／ウェルになるように分注した。
【００２７】
サンプルは三重県尾鷲市賀田湾より採取したマクサを９９．５％メタノール（和光純薬）で抽出し用いた。サンプルは１０ｍｇ／ｍｌとなるようにメタノールに溶解し、更に培養液で希釈し希釈系列を作成した。各濃度のサンプル溶液１００μｌを添加し全量を２００μｌ／ウェルとした。炭酸ガスインキュベータを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で７日間培養した。
【００２８】
培養開始３日目にサンプルを追加するため、各ウェルの上澄液１５０μｌを除去し、新たにサンプル溶液と１０−８Ｍの１，２５（ＯＨ）２ＶＤ３、１０−６ＭのＰＧＥ２の混合液を各７５μｌを、各ウェルに添加し再び同一条件で培養した。７日間培養した後、培養液を除去し、１０％ホルマリン含有ＰＢＳ溶液を０．０５ｍｌ／ウェル加えて１５分間固定した。細胞はウェル底に固着した。次にエタノールを０．１ｍｌ／ウェル添加し、１分間再固定した。その後、乾燥させ、ＴＲＡＰ反応に供し、破骨細胞を染色した。
【００２９】
ＴＲＡＰとは破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性フォスファターゼの略称であり、ＴＲＡＰ反応液はナフトールＡＳ−ＭＸフォスフェートを１５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアルデヒドに溶解し、１５ｍｌのバッファー（５０ｍＭの酒石酸ナトリウムを含む０．１ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝５．０）にｆａｓｔ ｒｅｄ ｖｉｏｌｅｔ １ｂ ｓａｌｔを９ｍｇ添加した溶液と混合して調製した。
ＴＲＡＰ反応により染色された、核を２個以上有する破骨細胞を顕微鏡下に計測し、１ウェル当たりの破骨細胞数を計測し、コントロールは被検物質の代わりに同量のメタノールを１０％牛胎児血清含有α−ＮＥＭ培地に添加したものである。コントロールを１００として溶媒と濃度に関連して、相対的破骨細胞数を図１に示した。コントロールに対する有意差の検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った。コントロール群と比較して危険率５．０％、１．０％、で有意差があった場合、それぞれ＋、＋＋で示す。
【００３０】
細胞毒性試験
共存培養後、培養液を１００μｌ除去し、５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬を０．０２ｍｌ／ウェル添加した。次いで、炭酸ガスインキュベーターを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％の条件で３０分間培養した。培養終了後、培養液を除去し、ジメチルスルホキシドを１００μｌ／ウェル加えて波長λ＝５７０ｎｍの吸光度を測定して図１に併記した。この場合もサンプル液の代わりにメタノールを添加し培養したコントロールを１００として各実験結果の相対的破骨細胞数を示した。コントロールに対する有意差の検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ‘ｓ ｔ−ｔｅｓｔにより行った。コントロール群と比較して危険率５．０％で有意差があった場合、＊で示す。
ＭＴＴ試薬は、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリィ）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−タータゾリウムブロマイドを５ｍｇ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）に溶解して調製した。
【００３１】
図１から明らかなように、マクサ抽出物０．７８〜６．２５μｇ／ｍｌの濃度で濃度依存的な破骨細胞形成抑制効果がみられ、細胞毒性はみられなかった。したがって、マクサ抽出物は骨粗鬆症を始め、骨代謝性疾患に有効であることが実証された。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】マクサ抽出物による効果を示すグラフであり、コントロールを１００とする相対的な細胞生存率と破骨細胞形成数を示した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マクサ抽出物を有効成分として含有する骨代謝改善剤。
【請求項２】
マクサ抽出物を含有する組成物を有効成分として含有する骨代謝改善剤。
【請求項３】
［１］または［２］に記載の骨代謝改善剤からなる破骨細胞分化抑制剤。
【請求項４】
［１］〜［３］に記載の骨代謝改善剤を含有する飲食用組成物。
【請求項５】
［１］〜［３］に記載の骨代謝改善剤を含有する医薬用組成物。
【請求項６】
骨疾患の改善または予防を目的とした［１］〜［５］に記載の剤または組成物。
【請求項７】
骨疾患が骨粗鬆症である［６］に記載の剤または組成物。
【請求項１】
マクサ抽出物を有効成分として含有する骨代謝改善剤。
【請求項２】
マクサ抽出物を含有する組成物を有効成分として含有する骨代謝改善剤。
【請求項３】
［１］または［２］に記載の骨代謝改善剤からなる破骨細胞分化抑制剤。
【請求項４】
［１］〜［３］に記載の骨代謝改善剤を含有する飲食用組成物。
【請求項５】
［１］〜［３］に記載の骨代謝改善剤を含有する医薬用組成物。
【請求項６】
骨疾患の改善または予防を目的とした［１］〜［５］に記載の剤または組成物。
【請求項７】
骨疾患が骨粗鬆症である［６］に記載の剤または組成物。
【図１】
【公開番号】特開２０１２−２０１６８１（Ｐ２０１２−２０１６８１Ａ）
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−８７７２５（Ｐ２０１１−８７７２５）
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【出願人】（３０００７６６８８）有限会社湘南予防医科学研究所 (54)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月２２日（２０１２．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２３年３月２５日（２０１１．３．２５）
【出願人】（３０００７６６８８）有限会社湘南予防医科学研究所 (54)
【Ｆターム（参考）】
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