マクロファージ活性化阻害剤
下記の一般式（１）
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化２】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
で表される化合物は、マクロファージの活性化を阻害することができる。従って、一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するマクロファージ活性化阻害剤は、細菌やウイルスなどの病原体の感染に起因する疾患を予防、改善または治療のための薬剤として有用である。
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化２】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
で表される化合物は、マクロファージの活性化を阻害することができる。従って、一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するマクロファージ活性化阻害剤は、細菌やウイルスなどの病原体の感染に起因する疾患を予防、改善または治療のための薬剤として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ活性化阻害剤、感染症治療剤、ＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌やウイルスなどの病原体は、生体内に侵入してインフルエンザや黄色ブドウ球菌感染症などの感染症を引き起こすことが知られており、これらの感染症を予防・治療すべく、従来、様々な予防剤や治療剤が開発されている（特開平８−１２５７４号公報、特開平１０−２５１１４８号公報、特開平１０−２３１２４７号公報）。
【０００３】
近年、これらの感染症はマクロファージの活性化が伴うことが明らかとなっており、このマクロファージの活性化を抑制・阻害することができる薬剤は、感染症の治療剤として有用であると考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明者らは、細菌やウイルスなどの病原体の感染に起因する疾患や、アレルギーなどの免疫性疾患を予防、改善または治療するのに有用な、マクロファージ活性化阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、マクロファージの活性化を阻害する薬剤を提供すべく鋭意研究した結果、式（１ａ）で表される化合物（以下、この化合物を「（±）−ＤＨＭ２ＥＱ」と称する。）が、ＬＰＳ（リポ多糖：ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により刺激したマクロファージの活性化を強く阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明に係るマクロファージ活性化を阻害する阻害剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【化１】
【０００７】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【０００８】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化２】
【０００９】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００１０】
また、前記化合物は（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（下記の式（１ａ））または下記の式（１ｂ）で表される化合物（以下、この化合物を「（±）−ＤＨＭ３ＥＱ」と称する。）であることが好ましく、下記の式（２）であることが特に好ましく、Ｌ体（＋）の化合物を含有しないものが最も好ましい。
【化３】
【化４】
【００１１】
また、本発明に係るマクロファージ活性化を阻害する阻害剤は、マクロファージの活性化に起因する疾患を予防、改善または治療することを特徴とする。
【００１２】
前記感染症は、細菌の感染に起因するものであってもよいが、ウイルスの感染に起因するものであってもよい。
【００１３】
また、本発明に係るマクロファージ活性化を阻害する阻害剤は、前記マクロファージの活性化が、リポ多糖、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１βからなるグループから選ばれるいずれかの因子に起因することを特徴とする。
【００１４】
なお、マクロファージとは、貪食能を有する単球由来の大型細胞のことをいい、例えば、遊走性マクロファージ（ｆｒｅｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、血液単球（ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、肺胞マクロファージ（ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、腹腔マクロファージ（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、炎症部位肉芽腫マクロファージ（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｇｒａｎｕｌｏｍａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、定着性マクロファージ（ｆｉｘｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、クッパー細胞、中枢神経系の小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｃｅｌｌ）、皮下その他の結合組織にみられる組織球、脾臓・骨髄・リンパ節洞における細網内皮およびリンパ球間隙に突起を延ばしている樹枝状マクロファージ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、血管外膜細胞（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ ｃｅｌｌ）、中枢神経系の髄膜や脈管周囲のマクロファージ（ｍｅｎｉｎｇｅａｌ ａｎｄ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などがある。
【００１５】
本発明に係る感染症治療剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【化５】
【００１６】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【００１７】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化６】
【００１８】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００１９】
また、前記化合物は（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（下記の式（１ａ））または（±）−ＤＨＭ３ＥＱ（下記の式（１ｂ））であることが好ましく、下記の式（２）であることが特に好ましく、実質的にＬ体（＋）の化合物を含有しないものが最も好ましい。
【化７】
【化８】
【００２０】
本発明に係るＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【化９】
【００２１】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【００２２】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化１０】
【００２３】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００２４】
また、前記化合物は（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（下記の式（１ａ））または（±）−ＤＨＭ３ＥＱ（下記の式（１ｂ））であることが好ましく、下記の式（２）であることが特に好ましく、実質的にＬ体（＋）の化合物を含有しないものが最も好ましい。
【化１１】
【化１２】
【００２５】
本発明に係る、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【化１３】
【００２６】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【００２７】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化１４】
【００２８】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００２９】
また、前記化合物は（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（下記の式（１ａ））または（±）−ＤＨＭ３ＥＱ（下記の式（１ｂ））であることが好ましく、下記の式（２）であることが特に好ましく、実質的にＬ体（＋）の化合物を含有しないものが最も好ましい。
【化１５】
【化１６】
【００３０】
関連文献とのクロスリファレンス
なお、本願は、２００３年８月６日付けで出願した日本国特願２００３−２８８２８０号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
図１は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生を抑制する効果を示す図である。
【００３２】
図２は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生を抑制する効果を示す図である。
【００３３】
図３は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のｉＮＯＳ発現を抑制する効果を示す図である。
【００３４】
図４は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ−１β産生を抑制する効果を示す図である。
【００３５】
図５は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ−６産生を抑制する効果を示す図である。
【００３６】
図６は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＬ−１βにより活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＴＮＦ−α産生を抑制する効果を示す図である。
【００３７】
図７は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来Ｊ７７４．１細胞のＮＯ産生を抑制する効果を示す図である。
【００３８】
図８は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳで処理したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２の発現を抑制する効果をウエスタンブロッティングにより調べた結果を示す図である。
【００３９】
図９は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳ刺激によって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の大腸菌の貪食を抑制する結果を示す図である。
【００４０】
図１０は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＬ−１β刺激によって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の大腸菌の貪食を抑制する結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００４２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００４３】
ウイルスや細菌などの病原体の感染により、単核球細胞（例えば、マクロファージ、単球（末梢血単球などを含む）、好酸球など）は活性化され、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−８、ＩＬ−１０など）や、ケモカイン（ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ）、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２などを産生する。これらの産生は、細菌の構成成分であるＬＰＳが単核球細胞を刺激することや、ウイルス感染により活性化されたＴ細胞から分泌されるＩＦＮ−γなどのマクロファージ活性化因子により、ＮＦ−κＢの活性化を介して誘導されることが知られている。
【００４４】
そこで、本発明者らは、ＮＦ−κＢの活性化阻害剤である（±）−ＤＨＭ２ＥＱがマクロファージの活性化を阻害するのではないかと考え、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γにより刺激された活性化マクロファージ細胞に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を調べたところ、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはマクロファージの活性化の指標であるｉＮＯＳの発現、ＮＯ産生、ＩＬ−１βの分泌、ＴＮＦ−αの分泌を阻害した。また、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳやＩＬ−１βにより刺激された活性化マクロファージ細胞のＣＯＸ−２産生や貪食作用を阻害することを明らかにした。こうして（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージの活性化阻害作用を有することが明らかとなった。従って、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージ活性化阻害剤として有用である。
【００４５】
ところで、マクロファージの活性化に伴って産生される炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−８、ＩＬ−１０など）や、ケモカイン（ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ）、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２などは、各種感染症、ＩＶ型アレルギー性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病を含む神経変性疾患や多発性硬化症、脳虚血後の後遺症としての神経変性疾患、ＡＩＤＳなどの免疫不全症、動脈硬化症、歯周病、潰瘍性大腸炎やＣｒｏｈｎ病を含む炎症性腸疾患、２型糖尿病、固形癌などの腫瘍（腫瘍の進展も含む）、呼吸器疾患、肺疾患、自己免疫疾患ＳＬＥ（全身性エリトマトーデス）などの疾患や、細菌感染によるアトピー性疾患（アトピー性皮膚炎など）の重症化のメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）となることが知られている。従って、マクロファージの活性化を阻害する（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、上記のようなマクロファージの活性化に起因する疾患や、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化などの予防、改善、または治療するための薬剤としても有用である。
【００４６】
また、前記感染症は、細菌、ウイルス、寄生虫などの病原体の感染に起因するものであればどのようなものでもよく、細菌としては、例えば、グラム陰性菌、グラム陽性菌などが挙げられ、ウイルスとしては、例えば、ＨＴＬＶ−１（ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １）、インフルエンザウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ；Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）など）、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトパルボウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群；Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）ウイルス、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）、ニパウイルス（ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス、肺炎ウイルス、アデノウイルス、コクサキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ）などが挙げられる。
【００４７】
マクロファージは、ｉＮＯＳによって、多量かつ高濃度のＮＯを産生することが知られている。従って、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、過剰ＮＯによってもたらされる疾患、例えば、腫瘍（転移を含む）、動脈硬化、エイズ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染などの感染症、敗血症や、慢性関節リウマチ・多発性硬化症・皮膚炎・歯周病・ぜんそく・炎症のほか、心移植による拒絶、アルツハイマー病、心筋梗塞、１型糖尿病の自己免疫疾患などに対して予防、改善、または治療するための薬剤としても有用である。
【００４８】
また、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインは筋芽細胞の筋細胞への分化を阻害し（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１５，１１６９−８０，２００１）、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型を含む筋ジストロフィーの原因になることが知られている。従って、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージの活性化に起因した筋ジストロフィーなどの予防、改善、または治療するための薬剤としても有用である。
【００４９】
さらに、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、骨髄で起きる赤血球が活性化されすぎたマクロファージ（ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｅ食血細胞）により破壊される疾患である血球貪食症候群（ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）や、脳のマクロファージであるミクログリアなどの活性化がマヒを含む運動機能障害を引き起こす脳梗塞や、病変部に微生物の感染と活性化マクロファージの凝集がみられる腸疾患（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ）などに対して予防、改善、または治療するための薬剤としても有用である。
【００５０】
＝＝＝一般式（１）で表される化合物の製造方法＝＝＝
一般式（１）で表される化合物は、ｗｉｐｆらの合成法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１２号，１５４９−５６１頁，１９９５年）に準じて製造することができる。
【００５１】
一般式（１）で表される化合物は、例えば、下記の反応工程式に基づいて製造することができる。
下記の反応工程式において、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。また、Ｘはハロゲン原子であり、ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素原子が挙げられ、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が特に好ましい。
【化１７】
【００５２】
工程（ａ）：Ｎ−（２−アルカノイルオキシベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリンの調製
２，５−ジメトキシアニリンを溶媒（例えば、ピリジンなど）に溶解させ、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、式（３）のＯ−アルカノイルサリチロイルハライドの酢酸エチル溶液を加えて、攪拌しながら反応させる。水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルを加え、塩酸、水、重曹水、水で順次洗浄し、乾燥後、減圧濃縮、及び真空乾燥することにより式（４）で示されるＮ−（２−アルカノイルオキシベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリンが得られる。この化合物は精製せず、次の工程に使用できる。
【００５３】
工程（ｂ）：３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノンの調製
上記で得られた式（４）の化合物をＲ３ＯＨ（例えば、メタノール、エタノールなど）に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、ジアセトキシヨードベンゼンを加え、室温で攪拌しながら反応させる。減圧濃縮後、酢酸エチルを加え、重曹水、食塩水で順次洗浄し、酢酸エチル層を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製することにより、式（５）で示される３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノンが得られる。
【００５４】
工程（ｃ）：５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式（５）の化合物を溶剤（例えば、テトラヒドロフラン、メタノールなど）に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、過酸化水素水及び水酸化ナトリウムを加え、攪拌しながら反応させる。反応液に酢酸エチルを加え、塩酸溶液、チオ硫酸ナトリウム水溶液、食塩水で順次洗浄し、大気中で乾燥した後、真空乾燥する。残存する原料化合物を除去するため、残渣をアセトンに溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌して原料化合物を分解する。溶剤を減圧留去して得られた残渣に酢酸エチルを加え、水で洗浄する。酢酸エチル層を乾燥して得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して、式（６）で示される５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンが得られる。
【００５５】
工程（ｄ）：５，６−エポキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンの調製
式（６）の化合物を溶剤（例えば、塩化メチレンなど）に溶解させ、氷冷下で無機酸または有機酸（例えば、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体など）を加え、攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、溶剤層を濃縮した後、得られた残渣をメタノールで洗浄して式（７）で示される５，６−エポキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンが得られる。
【００５６】
工程（ｅ）：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式（７）の化合物を、溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ＴＨＦなど）に懸濁し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウムなど）を加えて反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチル、塩化メチレンなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮して、メタノールで懸濁、攪拌、洗浄して、式（８）で示される５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンが得られる。
【００５７】
工程（ｆ）：３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミドシクロヘキセンの調製
式（６）の化合物をメタノールなどの溶剤と重曹水混合溶媒に溶解し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウムなど）を加え、攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮、真空乾燥し、カラムクロマトグラフィーなどで精製して、式（９）で示される３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミドシクロヘキセンを得る。
【００５８】
工程（ｇ）：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式（９）の化合物を溶剤（例えば、アセトンなど）に溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、溶剤層を乾燥し、減圧濃縮して、精製して、式（１０）の５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンを得ることができる。
【００５９】
なお、式（３）のＯ−アルカノイルサリチロイルハライドとして、Ｏ−アセチルサリチロイルクロリドを用い、工程（ｂ）において式（４）の化合物を溶解させる溶媒として、メタノールを用いることにより、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（式（１ａ））及び（±）−ＤＨＭ３ＥＱ（式（１ｂ））を製造することができる。
【００６０】
＝＝＝式（２）で表される化合物の調製＝＝＝
近年、本発明者らは、（±）−ＤＨＭ２ＥＱより（−）−ＤＨＭ２ＥＱの方がより優れたＮＦ−κＢの活性化阻害作用を有することを見出している。従って、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは（±）−ＤＨＭ２ＥＱより優れたマクロファージ活性化阻害作用を有すると考えられる。このことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱよりマクロファージ活性化阻害効果の強い（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージの活性化に起因する疾患や、過剰ＮＯによってもたらされる疾患や、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化などの予防、改善、または治療するための薬剤としてより有用であると考えられる。また、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、（±）−ＤＨＭ２ＥＱより副作用が少ないことも期待できる。以下（−）−ＤＨＭ２ＥＱ（式（２））の調製について説明する。
【００６１】
式（２）で表される化合物は、下記の反応式に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（式（１ａ））のフェノール性水酸基を一旦シリル基で保護し、その化合物（１１）をキラルカラムにより式（１２）で表される化合物と式（１３）で表される化合物とに分割し、次いで式（１２）で表される化合物を脱保護することにより式（２）で表される化合物（（−）−ＤＨＭ２ＥＱ）を得ることができる（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０，８６５−８６９，２０００）。なお、式（１３）で表される化合物も上記と同様に脱保護することにより式（１４）で表される化合物（（＋）−ＤＨＭ２ＥＱ）を得ることも可能である。
【化１８】
【００６２】
また、式（２）で表される化合物（（±）−ＤＨＭ２ＥＱ）は、一般式（１５）
【化１９】
【００６３】
で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤を用いて（−）−ＤＨＭ２ＥＱ（Ｄ体のＤＨＭ２ＥＱ）と（＋）−ＤＨＭ２ＥＱ（Ｌ体−ＤＨＭ２ＥＱ）とに直接、光学分割することにより得ることもできる。
【００６４】
多糖の芳香族カルバメート誘導体としては、一般式（１５）中の置換基（−Ｒ４、−Ｒ５、−Ｒ６、−Ｒ７、及び−Ｒ８）が、水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数６〜１４の芳香族基、ハロゲン原子などにより構成される多糖の芳香族カルバメート誘導体を挙げることができるが、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）、セルローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）などが好ましく、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）が特に好ましい。前記ハロゲン原子は、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子などである。
【００６５】
なお、前記（±）−ＤＨＭ２ＥＱの光学分割は、一般式（１５）で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤が充填された光学活性カラム、例えば、ＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（１０ｍｍ ｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより行うことが好ましい。なお、移動相としては、例えば、０．１〜０．９ｖ／ｖ％の酢酸を添加したメタノールを用いることができる。
【００６６】
このようにして得られた（−）−ＤＨＭ２ＥＱ及び（＋）−ＤＨＭ２ＥＱは、それぞれの施光度をＪＡＳＣＯ ＤＩＰ−３６０旋光計で測定することにより、光学純度を算出することができる（（−）−ＤＨＭ２ＥＱは［α］２０Ｄ−２４１°（ｃ０．１ ＭｅＯＨ）であり、（＋）−ＤＨＭ２ＥＱは［α］２０Ｄ＋２３９°（ｃ０．１ ＭｅＯＨ）である。）。
【００６７】
本発明に係るマクロファージ活性化阻害剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するものであればどのようなものでもよいが、前記化合物が、（±）−ＤＨＭ２ＥＱや（±）−ＤＨＭ３ＥＱであることが好ましく、（−）−ＤＨＭ２ＥＱであることが特に好ましい。なお、本発明に係る、感染症治療剤、ＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤も、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するものであればどのようなものでもよいが、前記化合物が、（±）−ＤＨＭ２ＥＱや（±）−ＤＨＭ３ＥＱであることが好ましく、（−）−ＤＨＭ２ＥＱであることが特に好ましい。
【化２０】
【００６８】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【００６９】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化２１】
【００７０】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００７１】
また、本発明に係るマクロファージ活性化阻害剤は、（＋）−ＤＨＭ２ＥＱが含有せず、（−）−ＤＨＭ２ＥＱまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するものが最も好ましい。なお、本発明に係る、感染症治療剤、ＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤も、（＋）−ＤＨＭ２ＥＱが含有せず、（−）−ＤＨＭ２ＥＱまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するものが最も好ましい。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明の実施例について詳細に述べる。
【００７３】
［実施例１］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生の抑制＞
マクロファージでは、ＬＰＳなどのリポ多糖やＩＦＮ−γなどのインターフェロンにより、ｉＮＯＳの発現が誘導され、ＮＯ産生が起こることが知られている。そこで、マクロファージ由来の培養細胞を用いて、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを併用した時のＮＯ産生に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を検討した。
【００７４】
なお、産生されたＮＯは、細胞外へ排出され、培地中に溶けこんでＮＯ２−イオンとなって存在しているので、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を培地に添加することにより呈色反応させ、吸光度（ＯＤ５７０）を測定することにより、産生されたＮＯ量を求めた。そして、異なる濃度の（±）−ＤＨＭ２ＥＱに対して産生されたＮＯの各量を、マクロファージ活性化因子無添加のサンプル（コントロール）のＯＤ５７０を１００％としたときの相対値で比較した。その結果を図１に示す。
【００７５】
ＲＡＷ２６４．７細胞においては、ＬＰＳとＩＦＮ−γを添加すると（±）−ＤＨＭ２ＥＱ処理なしでコントロールに比べて３倍程度のＮＯ産生の上昇が見られた。そして、（±）−ＤＨＭ２ＥＱで処理すると、添加した（±）−ＤＨＭ２ＥＱ濃度依存的にＮＯ産生が抑制され、１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱによって、ＮＯ産生はほぼコントロールレベルにまで抑制された。
【００７６】
［実験方法］
９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ：Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）に４×１０５細胞／ｍｌに調製した細胞懸濁液を２００μｌずつ蒔き、ここに、０、１、３、１０μｇ／ｍｌに希釈した（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２時間培養後にＩＦＮ−γ（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加し、その後１８時間培養した。ここにＧｒｉｅｓｓ試薬を１００μｌ添加し、約１０分間反応させ、マイクロプレートリーダーを用いて、ＯＤ５７０を測定した。
【００７７】
［実施例２］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生の抑制＞
また、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを併用した時のマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生の（±）−ＤＨＭ２ＥＱによる抑制をｉｎ ｓｉｔｕで観察するために、ＤＡＦ−２ＤＡ（ｄｉａｍｉｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−２ ｄｉａｃｅｔａｔｅ；第一化学薬品）を用いて、細胞内のＮＯを直接観察した。その結果を図２に示す。
【００７８】
ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを添加しないコントロール（Ａ）に比べ、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを添加し、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加しないもの（Ｂ）は、細胞内でＮＯ産生が増強したが、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを添加し、１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加したもの（Ｃ）は、コントロールレベルにまでＮＯ産生が抑制された。このことは、特定の細胞において、ＮＯ産生が抑制されるのではなく、培養細胞全体として、一様にＮＯ産生が抑制されることを示す。
【００７９】
［実験方法］
まずＲＡＷ２６４．７細胞を６×１０５細胞／ｍｌの濃度で５００μｌずつチャンバースライドに蒔き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１日間培養後、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加し、２時間培養した。その後、ＩＦＮ−γ（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加して６時間培養し、培養液をＤＡＦ−２ＤＡが添加されたＰＢＳ（リン酸塩緩衝液；８ｇ／ｌ ＮａＣｌ，０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ，０．９１６ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４）に交換し、さらに２時間培養した後、蛍光顕微鏡で蛍光画像を観察した。
【００８０】
［実施例３］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞でのｉＮＯＳ発現の抑制＞
実施例１及び２により、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、活性化されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生を抑制することが明らかになった。細胞内でＮＯは酵素ｉＮＯＳによって生じるため、この抑制がｉＮＯＳの発現抑制によるのかどうかを調べたところ、図３に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその処理濃度依存的にｉＮＯＳの発現を抑制することが明らかとなった。
【００８１】
［実験方法］
まず１００ｍｍ ｄｉｓｈに４×１０５細胞／ｍｌとなるように細胞を蒔き、一晩培養後、最終濃度０，１，３，１０μｇ／ｍｌとなるように（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加し、２時間後にＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加して２４時間刺激した。その後、細胞懸濁液を集めて遠心器で分離し、調製したｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０，１％ＮＰ−４０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＶＯ４，０．１ｍｇ／ｍｌロイペプチン，１ｍＭ ＰＭＳＦ）６５μｌで細胞を溶解した。そして、細胞溶解液の上清をとりわけて、それぞれのタンパク濃度を測定し、所定重量のタンパク質を煮沸し、これをサンプルとした。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルからｎｉｔｒｏ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅに転写した後、抗ｉＮＯＳ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と反応させ、続いてヒツジ由来抗ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体（Ａｍａｒｓｈａｍ）と反応させた。その後、ＥＣＬ発色法により発色させ、フィルム（富士フィルム）に感光させて検出した。
【００８２】
［実施例４］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞からのＩＬ−１β分泌の抑制＞
次に、（±）−ＤＨＭ２ＥＱによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞における別のマクロファージ活性化のマーカーであるＩＬ−１βの分泌に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を調べた。その結果、図４に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその処理濃度依存的にＩＬ−１β産生を抑制することが明らかとなった。
【００８３】
［実験方法］
４８ウェルプレートにＲＡＷ２６４．７細胞を４×１０５細胞／ｍｌの濃度で５００μｌずつ蒔き、３７℃で１日間培養した。その後、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（最終濃度１，３，１０μｇ／ｍｌ）を添加して２時間培養した後、ＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加して２４時間刺激した。刺激後、細胞の上清を５００μｌずつ回収し、１５０００ｒｐｍで２分間遠心し、不溶性画分を除去してサンプルとした。
【００８４】
ＩＬ−１βの分泌量はｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｕ．Ｓ．）を用いて調べた。まず、ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β抗体（ポリクローナル抗体）があらかじめ固定化されている９６ウェルマイクロプレートに反応用緩衝液を５０μｌ添加し、ここに上記サンプルを５０μｌいれて軽くタッピングした後、プレートを付属のシールで遮光状態にしたまま室温で２時間静置反応させた。次に、１ウェルあたり５回ずつ、洗浄用緩衝液４００μｌを入れ、上清を吸引除去し、さらにペーパータオルにたたきつけて上清を完全に除去するという操作を繰り返した。次に、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ）標識されたｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ２次抗体を１ウェルあたり１００μｌ加え、さらに２時間室温でインキュベート後、同様に、ウェルを５回ずつ洗浄した。その後、発色液を１００μｌずつ加え、３０分間インキュベートし、その後反応停止液を１００μｌ入れ、マイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。その後、ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔに付属のｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ｓｔａｎｄａｒｄを用いて作成した検量線により、ＩＬ−１βの濃度を算出した。
【００８５】
［実施例５］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞からのＩＬ−６分泌の抑制＞
また、ＬＰＳにより活性化されたマクロファージにおける別のマクロファージの活性化マーカーであるＩＬ−６の分泌に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響をＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｅｃｈｎｅ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｕ．Ｓ．）を用いて実施例４の実験方法と同様に調べた。なお、ＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）によるＲＡＷ２６４．７細胞の刺激は２４時間で行った。また、検量線はＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔに付属のＩＬ−６ ｓｔａｎｄａｒｄにより作成した。その結果、図５に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその処理濃度依存的にＩＬ−６産生を抑制することが確認された。
【００８６】
［実施例６］
＜ＩＬ−１β刺激により活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞からのＴＮＦ−α分泌の抑制＞
次に、ＩＬ−１β刺激により活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞における別のマクロファージ活性化マーカーであるＴＮＦ−αの分泌に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を実施例５の実験方法と同様に調べた。なお、本実施例においては、ＬＰＳの代わりにＩＬ−１β（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）でＲＡＷ２６４．７細胞を６時間刺激した。その結果、図６に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその処理濃度依存的にＴＮＦ−α産生を抑制することが確認された。
【００８７】
［実施例７］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来Ｊ７７４．１細胞からのＮＯ産生の抑制＞
活性化された他種のマクロファージ由来Ｊ７７４．１細胞株におけるＮＯ産生に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を実施例１に記載の方法と同様に調べた。その結果、図７に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ処理なしでコントロール（活性化処理なし）に比べて１．５倍程度のＮＯ産生の上昇が見られたが、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ処理濃度依存的にＮＯ産生を抑制することがわかった。１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱではコントロールレベルまでＮＯ産生が抑制されていた。このように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱの細胞におけるＮＯ産生抑制作用はＲＡＷ２６４．７細胞に限らず、他種のマクロファージにおいても同様に認められることが分かった。
【００８８】
［実施例８］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるＣＯＸ−２の発現阻害効果＞
炎症性刺激や増殖因子によって活性化されたマクロファージにより、プロスタグランジンの合成酵素であるＣＯＸ−２が産生され、炎症、がん細胞の増殖、がんの発生、血管新生、腫瘍転移など様々な病態に関与することが知られている。また、最近では、自己免疫疾患ＳＬＥ（全身性エリトマトーデス）において、ＣＯＸ−２の発現の増加に伴い、自己応答性Ｔ細胞がアポトーシスに対する耐性を獲得することが知られている（Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０，４１１−４１５，２００４）。そこで、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを用いることにより、マクロファージの活性化を阻害し、ＣＯＸ−２の産生を抑制できるのではないかと考え、ＬＰＳ刺激により活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２の産生に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を調べた。その結果、図８に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその濃度依存的にＣＯＸ−２の産生を抑制することが明らかとなった。このことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージの活性化に伴って発現が誘導されるＣＯＸ−２により引き起こされる疾患の予防、改善、または治療するための薬剤としても有用であると考えられる。
【００８９】
［実験方法］
ＤＭＥＭ培地の入った１００ｍｍ ｄｉｓｈ（Ｃｏａｓｔｅｒ：Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）にＲＡＷ２６４．７細胞を４×１０６細胞／ｄｉｓｈとなるように蒔き、５％ＣＯ２，３７℃で一晩培養した。その後、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（最終濃度１，３，１０μｇ／ｍｌ）を添加して２時間培養し、ＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加して２４時間刺激した。その後、細胞を回収し、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０，１％ＮＰ−４０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＶＯ４，０．１ｍｇ／ｍｌロイペプチン，１ｍＭ ＰＭＳＦ）６５μｌで溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００９０】
その後、ＰＶＤＦ膜を用いてウェスタン・ブロッティングを行った。一次抗体は抗ＣＯＸ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製：３００倍希釈）を用い、二次抗体はロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製：３０００倍希釈）を用い、検出はＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって行った。
【００９１】
［実施例９］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージの食作用阻害効果＞
マクロファージは、細菌感染に際して、外来異物として、細菌又はその一部を取り込み、加水分解酵素などを含むリソソーム内で異物を消化することにより、生体の防御機構を担う。この際の異物を取り込む作用は貪食（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）といわれ、マクロファージの活性化の指標となる。そこで、ＬＰＳ又はＩＬ−１β刺激により活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の貪食能を指標にして、マクロファージ活性化に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を調べた。図９に示すように、マクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞による大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の貪食は、ＬＰＳ刺激により顕著に亢進したが、（±）−ＤＨＭ２ＥＱにより前処理した場合には、その処理濃度依存的に貪食作用が抑制されることが明らかになった。特に、１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱで前処理した場合には、ＬＰＳや（±）−ＤＨＭ２ＥＱで処理していないコントロールと同程度まで貪食作用を抑制することがわかった。また、図１０に示すように、ＩＬ−１β刺激によって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞に対しても、１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱで前処理することにより、ＩＬ−１βや（±）−ＤＨＭ２ＥＱで処理していないコントロールと同程度まで大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の貪食作用を抑制することが明らかになった。
【００９２】
［実験方法］
ＲＡＷ２６４．７細胞を４×１０５細胞／ｍｌの濃度で５００μｌずつチャンバースライドに蒔き、一晩培養後、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加し、２時間インキュベートした。インキュベート後、ＬＰＳ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を添加して１０分間インキュベートし、ＰＢＳ ７５０μｌで２回洗浄した。その後、ＰＢＳを除去し、直ちに蛍光標識大腸菌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｕ．Ｓ．）の溶液（蛍光標識大腸菌１ｍｇを５ｍｌのＰＢＳで希釈した溶液）を２５０μｌずつ加え、さらに２時間室温でインキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳ ７５０μｌで２回洗浄し、蛍光顕微鏡及び位相差顕微鏡でマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の貪食能を調べた。また、ＩＬ−１βを用いた活性化においてはＬＰＳの代わりにＩＬ−１β（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する他は上記と同様の方法でマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の貪食能を調べた。図９及び図１０に示すように、ＬＰＳ又はＩＬ−１βで刺激したマクロファージは、蛍光標識大腸菌を取り込むため、細胞が蛍光で標識され、形状は大きく平らになり、刺激をしない場合、及びＤＨＭ２ＥＱで処理した場合、形状は小さく球状になり、蛍光は細胞外に観察された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、細菌やウイルスなどの病原体の感染に起因する疾患や、アレルギーなどの免疫性疾患を予防、改善または治療するのに有用な、マクロファージ活性化阻害剤を提供することができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マクロファージ活性化阻害剤、感染症治療剤、ＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌やウイルスなどの病原体は、生体内に侵入してインフルエンザや黄色ブドウ球菌感染症などの感染症を引き起こすことが知られており、これらの感染症を予防・治療すべく、従来、様々な予防剤や治療剤が開発されている（特開平８−１２５７４号公報、特開平１０−２５１１４８号公報、特開平１０−２３１２４７号公報）。
【０００３】
近年、これらの感染症はマクロファージの活性化が伴うことが明らかとなっており、このマクロファージの活性化を抑制・阻害することができる薬剤は、感染症の治療剤として有用であると考えられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明者らは、細菌やウイルスなどの病原体の感染に起因する疾患や、アレルギーなどの免疫性疾患を予防、改善または治療するのに有用な、マクロファージ活性化阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、マクロファージの活性化を阻害する薬剤を提供すべく鋭意研究した結果、式（１ａ）で表される化合物（以下、この化合物を「（±）−ＤＨＭ２ＥＱ」と称する。）が、ＬＰＳ（リポ多糖：ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）により刺激したマクロファージの活性化を強く阻害することを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
すなわち、本発明に係るマクロファージ活性化を阻害する阻害剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【化１】
【０００７】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【０００８】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化２】
【０００９】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００１０】
また、前記化合物は（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（下記の式（１ａ））または下記の式（１ｂ）で表される化合物（以下、この化合物を「（±）−ＤＨＭ３ＥＱ」と称する。）であることが好ましく、下記の式（２）であることが特に好ましく、Ｌ体（＋）の化合物を含有しないものが最も好ましい。
【化３】
【化４】
【００１１】
また、本発明に係るマクロファージ活性化を阻害する阻害剤は、マクロファージの活性化に起因する疾患を予防、改善または治療することを特徴とする。
【００１２】
前記感染症は、細菌の感染に起因するものであってもよいが、ウイルスの感染に起因するものであってもよい。
【００１３】
また、本発明に係るマクロファージ活性化を阻害する阻害剤は、前記マクロファージの活性化が、リポ多糖、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１βからなるグループから選ばれるいずれかの因子に起因することを特徴とする。
【００１４】
なお、マクロファージとは、貪食能を有する単球由来の大型細胞のことをいい、例えば、遊走性マクロファージ（ｆｒｅｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、血液単球（ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｃｙｔｅ）、肺胞マクロファージ（ａｌｖｅｏｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、腹腔マクロファージ（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、炎症部位肉芽腫マクロファージ（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｇｒａｎｕｌｏｍａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、定着性マクロファージ（ｆｉｘｅｄ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、クッパー細胞、中枢神経系の小膠細胞（ｍｉｃｒｏｇｌｉａ ｃｅｌｌ）、皮下その他の結合組織にみられる組織球、脾臓・骨髄・リンパ節洞における細網内皮およびリンパ球間隙に突起を延ばしている樹枝状マクロファージ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）、血管外膜細胞（ａｄｖｅｎｔｉｔｉａｌ ｃｅｌｌ）、中枢神経系の髄膜や脈管周囲のマクロファージ（ｍｅｎｉｎｇｅａｌ ａｎｄ ｐｅｒｉｖａｓｃｕｌａｒ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）などがある。
【００１５】
本発明に係る感染症治療剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【化５】
【００１６】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【００１７】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化６】
【００１８】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００１９】
また、前記化合物は（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（下記の式（１ａ））または（±）−ＤＨＭ３ＥＱ（下記の式（１ｂ））であることが好ましく、下記の式（２）であることが特に好ましく、実質的にＬ体（＋）の化合物を含有しないものが最も好ましい。
【化７】
【化８】
【００２０】
本発明に係るＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【化９】
【００２１】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【００２２】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化１０】
【００２３】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００２４】
また、前記化合物は（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（下記の式（１ａ））または（±）−ＤＨＭ３ＥＱ（下記の式（１ｂ））であることが好ましく、下記の式（２）であることが特に好ましく、実質的にＬ体（＋）の化合物を含有しないものが最も好ましい。
【化１１】
【化１２】
【００２５】
本発明に係る、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有することを特徴とする。
【化１３】
【００２６】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【００２７】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化１４】
【００２８】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００２９】
また、前記化合物は（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（下記の式（１ａ））または（±）−ＤＨＭ３ＥＱ（下記の式（１ｂ））であることが好ましく、下記の式（２）であることが特に好ましく、実質的にＬ体（＋）の化合物を含有しないものが最も好ましい。
【化１５】
【化１６】
【００３０】
関連文献とのクロスリファレンス
なお、本願は、２００３年８月６日付けで出願した日本国特願２００３−２８８２８０号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
図１は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生を抑制する効果を示す図である。
【００３２】
図２は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生を抑制する効果を示す図である。
【００３３】
図３は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のｉＮＯＳ発現を抑制する効果を示す図である。
【００３４】
図４は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ−１β産生を抑制する効果を示す図である。
【００３５】
図５は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＩＬ−６産生を抑制する効果を示す図である。
【００３６】
図６は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＬ−１βにより活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＴＮＦ−α産生を抑制する効果を示す図である。
【００３７】
図７は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳによって活性化されたマクロファージ由来Ｊ７７４．１細胞のＮＯ産生を抑制する効果を示す図である。
【００３８】
図８は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳで処理したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２の発現を抑制する効果をウエスタンブロッティングにより調べた結果を示す図である。
【００３９】
図９は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳ刺激によって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の大腸菌の貪食を抑制する結果を示す図である。
【００４０】
図１０は、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＩＬ−１β刺激によって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の大腸菌の貪食を抑制する結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
【００４２】
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【００４３】
ウイルスや細菌などの病原体の感染により、単核球細胞（例えば、マクロファージ、単球（末梢血単球などを含む）、好酸球など）は活性化され、炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−８、ＩＬ−１０など）や、ケモカイン（ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ）、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２などを産生する。これらの産生は、細菌の構成成分であるＬＰＳが単核球細胞を刺激することや、ウイルス感染により活性化されたＴ細胞から分泌されるＩＦＮ−γなどのマクロファージ活性化因子により、ＮＦ−κＢの活性化を介して誘導されることが知られている。
【００４４】
そこで、本発明者らは、ＮＦ−κＢの活性化阻害剤である（±）−ＤＨＭ２ＥＱがマクロファージの活性化を阻害するのではないかと考え、ＬＰＳ及びＩＦＮ−γにより刺激された活性化マクロファージ細胞に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を調べたところ、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはマクロファージの活性化の指標であるｉＮＯＳの発現、ＮＯ産生、ＩＬ−１βの分泌、ＴＮＦ−αの分泌を阻害した。また、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、ＬＰＳやＩＬ−１βにより刺激された活性化マクロファージ細胞のＣＯＸ−２産生や貪食作用を阻害することを明らかにした。こうして（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージの活性化阻害作用を有することが明らかとなった。従って、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージ活性化阻害剤として有用である。
【００４５】
ところで、マクロファージの活性化に伴って産生される炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１α、ＩＬ−８、ＩＬ−１０など）や、ケモカイン（ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ）、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２などは、各種感染症、ＩＶ型アレルギー性疾患、アルツハイマー病やパーキンソン病を含む神経変性疾患や多発性硬化症、脳虚血後の後遺症としての神経変性疾患、ＡＩＤＳなどの免疫不全症、動脈硬化症、歯周病、潰瘍性大腸炎やＣｒｏｈｎ病を含む炎症性腸疾患、２型糖尿病、固形癌などの腫瘍（腫瘍の進展も含む）、呼吸器疾患、肺疾患、自己免疫疾患ＳＬＥ（全身性エリトマトーデス）などの疾患や、細菌感染によるアトピー性疾患（アトピー性皮膚炎など）の重症化のメディエーター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）となることが知られている。従って、マクロファージの活性化を阻害する（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、上記のようなマクロファージの活性化に起因する疾患や、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化などの予防、改善、または治療するための薬剤としても有用である。
【００４６】
また、前記感染症は、細菌、ウイルス、寄生虫などの病原体の感染に起因するものであればどのようなものでもよく、細菌としては、例えば、グラム陰性菌、グラム陽性菌などが挙げられ、ウイルスとしては、例えば、ＨＴＬＶ−１（ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １）、インフルエンザウイルス、エイズウイルス（ＨＩＶ；Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ Ｖｉｒｕｓ）など）、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、ヒトパルボウイルス、コロナウイルス、ＳＡＲＳ（重症急性呼吸器症候群；Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）ウイルス、ＲＳウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ Ｖｉｒｕｓ）、ニパウイルス（ｎｉｐａｈ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス、肺炎ウイルス、アデノウイルス、コクサキーウイルス（ｃｏｘｓａｃｋｉｅ ｖｉｒｕｓ）などが挙げられる。
【００４７】
マクロファージは、ｉＮＯＳによって、多量かつ高濃度のＮＯを産生することが知られている。従って、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、過剰ＮＯによってもたらされる疾患、例えば、腫瘍（転移を含む）、動脈硬化、エイズ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ感染などの感染症、敗血症や、慢性関節リウマチ・多発性硬化症・皮膚炎・歯周病・ぜんそく・炎症のほか、心移植による拒絶、アルツハイマー病、心筋梗塞、１型糖尿病の自己免疫疾患などに対して予防、改善、または治療するための薬剤としても有用である。
【００４８】
また、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインは筋芽細胞の筋細胞への分化を阻害し（ＦＡＳＥＢ Ｊ．１５，１１６９−８０，２００１）、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型を含む筋ジストロフィーの原因になることが知られている。従って、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージの活性化に起因した筋ジストロフィーなどの予防、改善、または治療するための薬剤としても有用である。
【００４９】
さらに、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、骨髄で起きる赤血球が活性化されすぎたマクロファージ（ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｅ食血細胞）により破壊される疾患である血球貪食症候群（ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）や、脳のマクロファージであるミクログリアなどの活性化がマヒを含む運動機能障害を引き起こす脳梗塞や、病変部に微生物の感染と活性化マクロファージの凝集がみられる腸疾患（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ）などに対して予防、改善、または治療するための薬剤としても有用である。
【００５０】
＝＝＝一般式（１）で表される化合物の製造方法＝＝＝
一般式（１）で表される化合物は、ｗｉｐｆらの合成法（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１２号，１５４９−５６１頁，１９９５年）に準じて製造することができる。
【００５１】
一般式（１）で表される化合物は、例えば、下記の反応工程式に基づいて製造することができる。
下記の反応工程式において、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、メチル基、エチル基が好ましく、メチル基が特に好ましい。また、Ｘはハロゲン原子であり、ハロゲン原子としては、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素原子が挙げられ、塩素原子、臭素原子が好ましく、塩素原子が特に好ましい。
【化１７】
【００５２】
工程（ａ）：Ｎ−（２−アルカノイルオキシベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリンの調製
２，５−ジメトキシアニリンを溶媒（例えば、ピリジンなど）に溶解させ、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、式（３）のＯ−アルカノイルサリチロイルハライドの酢酸エチル溶液を加えて、攪拌しながら反応させる。水を加えて反応を停止させた後、酢酸エチルを加え、塩酸、水、重曹水、水で順次洗浄し、乾燥後、減圧濃縮、及び真空乾燥することにより式（４）で示されるＮ−（２−アルカノイルオキシベンゾイル）−２，５−ジメトキシアニリンが得られる。この化合物は精製せず、次の工程に使用できる。
【００５３】
工程（ｂ）：３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノンの調製
上記で得られた式（４）の化合物をＲ３ＯＨ（例えば、メタノール、エタノールなど）に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、ジアセトキシヨードベンゼンを加え、室温で攪拌しながら反応させる。減圧濃縮後、酢酸エチルを加え、重曹水、食塩水で順次洗浄し、酢酸エチル層を減圧濃縮して得られた残渣をカラムクロマトグラフィーにて精製することにより、式（５）で示される３−（Ｏ−アルカノイルサリチロイルアミド）−４，４−ジアルコキシ−２，５−シクロヘキサジエノンが得られる。
【００５４】
工程（ｃ）：５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式（５）の化合物を溶剤（例えば、テトラヒドロフラン、メタノールなど）に溶解させ、−２０〜５０℃、好ましくは氷冷下で、過酸化水素水及び水酸化ナトリウムを加え、攪拌しながら反応させる。反応液に酢酸エチルを加え、塩酸溶液、チオ硫酸ナトリウム水溶液、食塩水で順次洗浄し、大気中で乾燥した後、真空乾燥する。残存する原料化合物を除去するため、残渣をアセトンに溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌して原料化合物を分解する。溶剤を減圧留去して得られた残渣に酢酸エチルを加え、水で洗浄する。酢酸エチル層を乾燥して得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製して、式（６）で示される５，６−エポキシ−４，４−ジアルコキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンが得られる。
【００５５】
工程（ｄ）：５，６−エポキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンの調製
式（６）の化合物を溶剤（例えば、塩化メチレンなど）に溶解させ、氷冷下で無機酸または有機酸（例えば、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体など）を加え、攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、溶剤層を濃縮した後、得られた残渣をメタノールで洗浄して式（７）で示される５，６−エポキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセン−１，４−ジオンが得られる。
【００５６】
工程（ｅ）：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式（７）の化合物を、溶媒（例えば、メタノール、エタノール、ＴＨＦなど）に懸濁し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウムなど）を加えて反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチル、塩化メチレンなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮して、メタノールで懸濁、攪拌、洗浄して、式（８）で示される５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−３−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンが得られる。
【００５７】
工程（ｆ）：３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミドシクロヘキセンの調製
式（６）の化合物をメタノールなどの溶剤と重曹水混合溶媒に溶解し、−７８〜５０℃、好ましくは氷冷下で、還元剤（例えば、水素化ホウ素ナトリウムなど）を加え、攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、塩酸、水で順次洗浄し、溶剤層を乾燥後、減圧濃縮、真空乾燥し、カラムクロマトグラフィーなどで精製して、式（９）で示される３，３−ジアルコキシ−４，５−エポキシ−６−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミドシクロヘキセンを得る。
【００５８】
工程（ｇ）：５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンの調製
式（９）の化合物を溶剤（例えば、アセトンなど）に溶解させ、ｐ−トルエンスルホン酸を加え、室温で攪拌しながら反応させる。反応液に溶剤（例えば、酢酸エチルなど）を加え、水で洗浄し、溶剤層を乾燥し、減圧濃縮して、精製して、式（１０）の５，６−エポキシ−４−ヒドロキシ−２−アルカノイルサリチロイルアミド−２−シクロヘキセノンを得ることができる。
【００５９】
なお、式（３）のＯ−アルカノイルサリチロイルハライドとして、Ｏ−アセチルサリチロイルクロリドを用い、工程（ｂ）において式（４）の化合物を溶解させる溶媒として、メタノールを用いることにより、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（式（１ａ））及び（±）−ＤＨＭ３ＥＱ（式（１ｂ））を製造することができる。
【００６０】
＝＝＝式（２）で表される化合物の調製＝＝＝
近年、本発明者らは、（±）−ＤＨＭ２ＥＱより（−）−ＤＨＭ２ＥＱの方がより優れたＮＦ−κＢの活性化阻害作用を有することを見出している。従って、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは（±）−ＤＨＭ２ＥＱより優れたマクロファージ活性化阻害作用を有すると考えられる。このことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱよりマクロファージ活性化阻害効果の強い（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージの活性化に起因する疾患や、過剰ＮＯによってもたらされる疾患や、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化などの予防、改善、または治療するための薬剤としてより有用であると考えられる。また、（−）−ＤＨＭ２ＥＱは、（±）−ＤＨＭ２ＥＱより副作用が少ないことも期待できる。以下（−）−ＤＨＭ２ＥＱ（式（２））の調製について説明する。
【００６１】
式（２）で表される化合物は、下記の反応式に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（式（１ａ））のフェノール性水酸基を一旦シリル基で保護し、その化合物（１１）をキラルカラムにより式（１２）で表される化合物と式（１３）で表される化合物とに分割し、次いで式（１２）で表される化合物を脱保護することにより式（２）で表される化合物（（−）−ＤＨＭ２ＥＱ）を得ることができる（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０，８６５−８６９，２０００）。なお、式（１３）で表される化合物も上記と同様に脱保護することにより式（１４）で表される化合物（（＋）−ＤＨＭ２ＥＱ）を得ることも可能である。
【化１８】
【００６２】
また、式（２）で表される化合物（（±）−ＤＨＭ２ＥＱ）は、一般式（１５）
【化１９】
【００６３】
で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤を用いて（−）−ＤＨＭ２ＥＱ（Ｄ体のＤＨＭ２ＥＱ）と（＋）−ＤＨＭ２ＥＱ（Ｌ体−ＤＨＭ２ＥＱ）とに直接、光学分割することにより得ることもできる。
【００６４】
多糖の芳香族カルバメート誘導体としては、一般式（１５）中の置換基（−Ｒ４、−Ｒ５、−Ｒ６、−Ｒ７、及び−Ｒ８）が、水素原子、炭素数１〜８のアルキル基、炭素数１〜８のアルコキシ基、炭素数６〜１４の芳香族基、ハロゲン原子などにより構成される多糖の芳香族カルバメート誘導体を挙げることができるが、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）、セルローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）などが好ましく、アミローストリス（３，５−ジメチルフェニルカルバメート）が特に好ましい。前記ハロゲン原子は、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、及びヨウ素原子などである。
【００６５】
なお、前記（±）−ＤＨＭ２ＥＱの光学分割は、一般式（１５）で表される基で置換された多糖の芳香族カルバメート誘導体を有効成分とする分離剤が充填された光学活性カラム、例えば、ＤＡＩＣＥＬ ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ（１０ｍｍ ｉ．ｄ．ｘ２５０ｍｍ）を用いた高速液体クロマトグラフィーにより行うことが好ましい。なお、移動相としては、例えば、０．１〜０．９ｖ／ｖ％の酢酸を添加したメタノールを用いることができる。
【００６６】
このようにして得られた（−）−ＤＨＭ２ＥＱ及び（＋）−ＤＨＭ２ＥＱは、それぞれの施光度をＪＡＳＣＯ ＤＩＰ−３６０旋光計で測定することにより、光学純度を算出することができる（（−）−ＤＨＭ２ＥＱは［α］２０Ｄ−２４１°（ｃ０．１ ＭｅＯＨ）であり、（＋）−ＤＨＭ２ＥＱは［α］２０Ｄ＋２３９°（ｃ０．１ ＭｅＯＨ）である。）。
【００６７】
本発明に係るマクロファージ活性化阻害剤は、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するものであればどのようなものでもよいが、前記化合物が、（±）−ＤＨＭ２ＥＱや（±）−ＤＨＭ３ＥＱであることが好ましく、（−）−ＤＨＭ２ＥＱであることが特に好ましい。なお、本発明に係る、感染症治療剤、ＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤も、下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するものであればどのようなものでもよいが、前記化合物が、（±）−ＤＨＭ２ＥＱや（±）−ＤＨＭ３ＥＱであることが好ましく、（−）−ＤＨＭ２ＥＱであることが特に好ましい。
【化２０】
【００６８】
式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、アルカノイル基としては、アセチル基、プロピオニル基、及びブタノイル基、並びにこれらの異性体基が挙げられ、特にアセチル基が好ましい。
【００６９】
Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。
【化２１】
【００７０】
式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基であり、アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基およびこれらの異性体基が挙げられ、特にメチル基、エチル基が好ましい。
【００７１】
また、本発明に係るマクロファージ活性化阻害剤は、（＋）−ＤＨＭ２ＥＱが含有せず、（−）−ＤＨＭ２ＥＱまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するものが最も好ましい。なお、本発明に係る、感染症治療剤、ＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤も、（＋）−ＤＨＭ２ＥＱが含有せず、（−）−ＤＨＭ２ＥＱまたはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するものが最も好ましい。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明の実施例について詳細に述べる。
【００７３】
［実施例１］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生の抑制＞
マクロファージでは、ＬＰＳなどのリポ多糖やＩＦＮ−γなどのインターフェロンにより、ｉＮＯＳの発現が誘導され、ＮＯ産生が起こることが知られている。そこで、マクロファージ由来の培養細胞を用いて、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを併用した時のＮＯ産生に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を検討した。
【００７４】
なお、産生されたＮＯは、細胞外へ排出され、培地中に溶けこんでＮＯ２−イオンとなって存在しているので、Ｇｒｉｅｓｓ試薬を培地に添加することにより呈色反応させ、吸光度（ＯＤ５７０）を測定することにより、産生されたＮＯ量を求めた。そして、異なる濃度の（±）−ＤＨＭ２ＥＱに対して産生されたＮＯの各量を、マクロファージ活性化因子無添加のサンプル（コントロール）のＯＤ５７０を１００％としたときの相対値で比較した。その結果を図１に示す。
【００７５】
ＲＡＷ２６４．７細胞においては、ＬＰＳとＩＦＮ−γを添加すると（±）−ＤＨＭ２ＥＱ処理なしでコントロールに比べて３倍程度のＮＯ産生の上昇が見られた。そして、（±）−ＤＨＭ２ＥＱで処理すると、添加した（±）−ＤＨＭ２ＥＱ濃度依存的にＮＯ産生が抑制され、１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱによって、ＮＯ産生はほぼコントロールレベルにまで抑制された。
【００７６】
［実験方法］
９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ：Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）に４×１０５細胞／ｍｌに調製した細胞懸濁液を２００μｌずつ蒔き、ここに、０、１、３、１０μｇ／ｍｌに希釈した（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２時間培養後にＩＦＮ−γ（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加し、その後１８時間培養した。ここにＧｒｉｅｓｓ試薬を１００μｌ添加し、約１０分間反応させ、マイクロプレートリーダーを用いて、ＯＤ５７０を測定した。
【００７７】
［実施例２］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生の抑制＞
また、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを併用した時のマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生の（±）−ＤＨＭ２ＥＱによる抑制をｉｎ ｓｉｔｕで観察するために、ＤＡＦ−２ＤＡ（ｄｉａｍｉｎｏ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−２ ｄｉａｃｅｔａｔｅ；第一化学薬品）を用いて、細胞内のＮＯを直接観察した。その結果を図２に示す。
【００７８】
ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを添加しないコントロール（Ａ）に比べ、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを添加し、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加しないもの（Ｂ）は、細胞内でＮＯ産生が増強したが、ＬＰＳ、ＩＦＮ−γを添加し、１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加したもの（Ｃ）は、コントロールレベルにまでＮＯ産生が抑制された。このことは、特定の細胞において、ＮＯ産生が抑制されるのではなく、培養細胞全体として、一様にＮＯ産生が抑制されることを示す。
【００７９】
［実験方法］
まずＲＡＷ２６４．７細胞を６×１０５細胞／ｍｌの濃度で５００μｌずつチャンバースライドに蒔き、３７℃、５％ＣＯ２の条件で１日間培養後、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加し、２時間培養した。その後、ＩＦＮ−γ（最終濃度１００ｎｇ／ｍｌ）及びＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加して６時間培養し、培養液をＤＡＦ−２ＤＡが添加されたＰＢＳ（リン酸塩緩衝液；８ｇ／ｌ ＮａＣｌ，０．２ｇ／ｌ ＫＣｌ，０．９１６ｇ／ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．２ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４）に交換し、さらに２時間培養した後、蛍光顕微鏡で蛍光画像を観察した。
【００８０】
［実施例３］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞でのｉＮＯＳ発現の抑制＞
実施例１及び２により、（±）−ＤＨＭ２ＥＱが、活性化されたＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ産生を抑制することが明らかになった。細胞内でＮＯは酵素ｉＮＯＳによって生じるため、この抑制がｉＮＯＳの発現抑制によるのかどうかを調べたところ、図３に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその処理濃度依存的にｉＮＯＳの発現を抑制することが明らかとなった。
【００８１】
［実験方法］
まず１００ｍｍ ｄｉｓｈに４×１０５細胞／ｍｌとなるように細胞を蒔き、一晩培養後、最終濃度０，１，３，１０μｇ／ｍｌとなるように（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加し、２時間後にＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加して２４時間刺激した。その後、細胞懸濁液を集めて遠心器で分離し、調製したｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０，１％ＮＰ−４０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＶＯ４，０．１ｍｇ／ｍｌロイペプチン，１ｍＭ ＰＭＳＦ）６５μｌで細胞を溶解した。そして、細胞溶解液の上清をとりわけて、それぞれのタンパク濃度を測定し、所定重量のタンパク質を煮沸し、これをサンプルとした。これをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ゲルからｎｉｔｒｏ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅに転写した後、抗ｉＮＯＳ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）と反応させ、続いてヒツジ由来抗ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ抗体（Ａｍａｒｓｈａｍ）と反応させた。その後、ＥＣＬ発色法により発色させ、フィルム（富士フィルム）に感光させて検出した。
【００８２】
［実施例４］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞からのＩＬ−１β分泌の抑制＞
次に、（±）−ＤＨＭ２ＥＱによって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞における別のマクロファージ活性化のマーカーであるＩＬ−１βの分泌に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を調べた。その結果、図４に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその処理濃度依存的にＩＬ−１β産生を抑制することが明らかとなった。
【００８３】
［実験方法］
４８ウェルプレートにＲＡＷ２６４．７細胞を４×１０５細胞／ｍｌの濃度で５００μｌずつ蒔き、３７℃で１日間培養した。その後、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（最終濃度１，３，１０μｇ／ｍｌ）を添加して２時間培養した後、ＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加して２４時間刺激した。刺激後、細胞の上清を５００μｌずつ回収し、１５０００ｒｐｍで２分間遠心し、不溶性画分を除去してサンプルとした。
【００８４】
ＩＬ−１βの分泌量はｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｕ．Ｓ．）を用いて調べた。まず、ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β抗体（ポリクローナル抗体）があらかじめ固定化されている９６ウェルマイクロプレートに反応用緩衝液を５０μｌ添加し、ここに上記サンプルを５０μｌいれて軽くタッピングした後、プレートを付属のシールで遮光状態にしたまま室温で２時間静置反応させた。次に、１ウェルあたり５回ずつ、洗浄用緩衝液４００μｌを入れ、上清を吸引除去し、さらにペーパータオルにたたきつけて上清を完全に除去するという操作を繰り返した。次に、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｙｄａｓｅ）標識されたｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ２次抗体を１ウェルあたり１００μｌ加え、さらに２時間室温でインキュベート後、同様に、ウェルを５回ずつ洗浄した。その後、発色液を１００μｌずつ加え、３０分間インキュベートし、その後反応停止液を１００μｌ入れ、マイクロプレートリーダーで波長４５０ｎｍにおけるＯＤ値を測定した。その後、ｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔに付属のｍｏｕｓｅ ＩＬ−１β ｓｔａｎｄａｒｄを用いて作成した検量線により、ＩＬ−１βの濃度を算出した。
【００８５】
［実施例５］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞からのＩＬ−６分泌の抑制＞
また、ＬＰＳにより活性化されたマクロファージにおける別のマクロファージの活性化マーカーであるＩＬ−６の分泌に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響をＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｔｅｃｈｎｅ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，Ｕ．Ｓ．）を用いて実施例４の実験方法と同様に調べた。なお、ＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）によるＲＡＷ２６４．７細胞の刺激は２４時間で行った。また、検量線はＩＬ−６ ＥＬＩＳＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔに付属のＩＬ−６ ｓｔａｎｄａｒｄにより作成した。その結果、図５に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその処理濃度依存的にＩＬ−６産生を抑制することが確認された。
【００８６】
［実施例６］
＜ＩＬ−１β刺激により活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞からのＴＮＦ−α分泌の抑制＞
次に、ＩＬ−１β刺激により活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞における別のマクロファージ活性化マーカーであるＴＮＦ−αの分泌に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を実施例５の実験方法と同様に調べた。なお、本実施例においては、ＬＰＳの代わりにＩＬ−１β（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）でＲＡＷ２６４．７細胞を６時間刺激した。その結果、図６に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその処理濃度依存的にＴＮＦ−α産生を抑制することが確認された。
【００８７】
［実施例７］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージ由来Ｊ７７４．１細胞からのＮＯ産生の抑制＞
活性化された他種のマクロファージ由来Ｊ７７４．１細胞株におけるＮＯ産生に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を実施例１に記載の方法と同様に調べた。その結果、図７に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ処理なしでコントロール（活性化処理なし）に比べて１．５倍程度のＮＯ産生の上昇が見られたが、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ処理濃度依存的にＮＯ産生を抑制することがわかった。１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱではコントロールレベルまでＮＯ産生が抑制されていた。このように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱの細胞におけるＮＯ産生抑制作用はＲＡＷ２６４．７細胞に限らず、他種のマクロファージにおいても同様に認められることが分かった。
【００８８】
［実施例８］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるＣＯＸ−２の発現阻害効果＞
炎症性刺激や増殖因子によって活性化されたマクロファージにより、プロスタグランジンの合成酵素であるＣＯＸ−２が産生され、炎症、がん細胞の増殖、がんの発生、血管新生、腫瘍転移など様々な病態に関与することが知られている。また、最近では、自己免疫疾患ＳＬＥ（全身性エリトマトーデス）において、ＣＯＸ−２の発現の増加に伴い、自己応答性Ｔ細胞がアポトーシスに対する耐性を獲得することが知られている（Ｎａｔｕｒｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０，４１１−４１５，２００４）。そこで、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを用いることにより、マクロファージの活性化を阻害し、ＣＯＸ−２の産生を抑制できるのではないかと考え、ＬＰＳ刺激により活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＣＯＸ−２の産生に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を調べた。その結果、図８に示すように、（±）−ＤＨＭ２ＥＱはその濃度依存的にＣＯＸ−２の産生を抑制することが明らかとなった。このことから、（±）−ＤＨＭ２ＥＱは、マクロファージの活性化に伴って発現が誘導されるＣＯＸ−２により引き起こされる疾患の予防、改善、または治療するための薬剤としても有用であると考えられる。
【００８９】
［実験方法］
ＤＭＥＭ培地の入った１００ｍｍ ｄｉｓｈ（Ｃｏａｓｔｅｒ：Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）にＲＡＷ２６４．７細胞を４×１０６細胞／ｄｉｓｈとなるように蒔き、５％ＣＯ２，３７℃で一晩培養した。その後、（±）−ＤＨＭ２ＥＱ（最終濃度１，３，１０μｇ／ｍｌ）を添加して２時間培養し、ＬＰＳ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を添加して２４時間刺激した。その後、細胞を回収し、ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ８．０，１％ＮＰ−４０，２０ｍＭ ＥＤＴＡ，１００ｍＭ ＮａＶＯ４，０．１ｍｇ／ｍｌロイペプチン，１ｍＭ ＰＭＳＦ）６５μｌで溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。
【００９０】
その後、ＰＶＤＦ膜を用いてウェスタン・ブロッティングを行った。一次抗体は抗ＣＯＸ−２抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製：３００倍希釈）を用い、二次抗体はロバ抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製：３０００倍希釈）を用い、検出はＥＣＬ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）によって行った。
【００９１】
［実施例９］
＜（±）−ＤＨＭ２ＥＱによるマクロファージの食作用阻害効果＞
マクロファージは、細菌感染に際して、外来異物として、細菌又はその一部を取り込み、加水分解酵素などを含むリソソーム内で異物を消化することにより、生体の防御機構を担う。この際の異物を取り込む作用は貪食（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）といわれ、マクロファージの活性化の指標となる。そこで、ＬＰＳ又はＩＬ−１β刺激により活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の貪食能を指標にして、マクロファージ活性化に対する（±）−ＤＨＭ２ＥＱの影響を調べた。図９に示すように、マクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞による大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の貪食は、ＬＰＳ刺激により顕著に亢進したが、（±）−ＤＨＭ２ＥＱにより前処理した場合には、その処理濃度依存的に貪食作用が抑制されることが明らかになった。特に、１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱで前処理した場合には、ＬＰＳや（±）−ＤＨＭ２ＥＱで処理していないコントロールと同程度まで貪食作用を抑制することがわかった。また、図１０に示すように、ＩＬ−１β刺激によって活性化されたマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞に対しても、１０μｇ／ｍｌの（±）−ＤＨＭ２ＥＱで前処理することにより、ＩＬ−１βや（±）−ＤＨＭ２ＥＱで処理していないコントロールと同程度まで大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）の貪食作用を抑制することが明らかになった。
【００９２】
［実験方法］
ＲＡＷ２６４．７細胞を４×１０５細胞／ｍｌの濃度で５００μｌずつチャンバースライドに蒔き、一晩培養後、（±）−ＤＨＭ２ＥＱを添加し、２時間インキュベートした。インキュベート後、ＬＰＳ（最終濃度１μｇ／ｍｌ）を添加して１０分間インキュベートし、ＰＢＳ ７５０μｌで２回洗浄した。その後、ＰＢＳを除去し、直ちに蛍光標識大腸菌（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｕ．Ｓ．）の溶液（蛍光標識大腸菌１ｍｇを５ｍｌのＰＢＳで希釈した溶液）を２５０μｌずつ加え、さらに２時間室温でインキュベートした。インキュベート後、ＰＢＳ ７５０μｌで２回洗浄し、蛍光顕微鏡及び位相差顕微鏡でマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の貪食能を調べた。また、ＩＬ−１βを用いた活性化においてはＬＰＳの代わりにＩＬ−１β（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する他は上記と同様の方法でマクロファージ由来ＲＡＷ２６４．７細胞の貪食能を調べた。図９及び図１０に示すように、ＬＰＳ又はＩＬ−１βで刺激したマクロファージは、蛍光標識大腸菌を取り込むため、細胞が蛍光で標識され、形状は大きく平らになり、刺激をしない場合、及びＤＨＭ２ＥＱで処理した場合、形状は小さく球状になり、蛍光は細胞外に観察された。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、細菌やウイルスなどの病原体の感染に起因する疾患や、アレルギーなどの免疫性疾患を予防、改善または治療するのに有用な、マクロファージ活性化阻害剤を提供することができる。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、マクロファージ活性化を阻害する阻害剤。
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化２】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２】
前記化合物が下記の式（１ａ）または式（１ｂ）であることを特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【化３】
【請求項３】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【化４】
【請求項４】
マクロファージの活性化に起因する疾患を予防、改善または治療することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項５】
前記疾患が感染症であることを特徴とする請求項４に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記感染症が細菌の感染に起因することを特徴とする請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記細菌がグラム陰性菌であることを特徴とする請求項６に記載の阻害剤。
【請求項８】
前記感染症がウイルスの感染に起因することを特徴とする請求項５に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記ウイルスがインフルエンザであることを特徴とする請求項８に記載の阻害剤。
【請求項１０】
前記疾患がＩＶ型アレルギー性疾患であることを特徴とする請求項４に記載の阻害剤。
【請求項１１】
病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を予防、改善または治療することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１２】
前記マクロファージの活性化が、リポ多糖、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１βからなるグループから選ばれるいずれかの因子に起因することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１３】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する感染症治療剤。
【化５】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化６】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項１４】
前記化合物が下記の式（１ａ）または式（１ｂ）であることを特徴とする請求項１３に記載の感染症治療剤。
【化７】
【請求項１５】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項１３に記載の感染症治療剤。
【化８】
【請求項１６】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤。
【化９】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化１０】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項１７】
前記化合物が下記の式（１ａ）または式（１ｂ）であることを特徴とする請求項１６に記載のＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤。
【化１１】
【請求項１８】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項１６に記載のＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤。
【化１２】
【請求項１９】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤。
【化１３】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化１４】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２０】
前記化合物が下記の式（１ａ）または式（１ｂ）であることを特徴とする請求項１９に記載の治療剤。
【化１５】
【請求項２１】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項１９に記載の治療剤。
【化１６】
【請求項１】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、マクロファージ活性化を阻害する阻害剤。
【化１】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化２】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２】
前記化合物が下記の式（１ａ）または式（１ｂ）であることを特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【化３】
【請求項３】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項１に記載の阻害剤。
【化４】
【請求項４】
マクロファージの活性化に起因する疾患を予防、改善または治療することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項５】
前記疾患が感染症であることを特徴とする請求項４に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記感染症が細菌の感染に起因することを特徴とする請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記細菌がグラム陰性菌であることを特徴とする請求項６に記載の阻害剤。
【請求項８】
前記感染症がウイルスの感染に起因することを特徴とする請求項５に記載の阻害剤。
【請求項９】
前記ウイルスがインフルエンザであることを特徴とする請求項８に記載の阻害剤。
【請求項１０】
前記疾患がＩＶ型アレルギー性疾患であることを特徴とする請求項４に記載の阻害剤。
【請求項１１】
病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を予防、改善または治療することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１２】
前記マクロファージの活性化が、リポ多糖、ＩＦＮ−γ、及びＩＬ−１βからなるグループから選ばれるいずれかの因子に起因することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の阻害剤。
【請求項１３】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する感染症治療剤。
【化５】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化６】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項１４】
前記化合物が下記の式（１ａ）または式（１ｂ）であることを特徴とする請求項１３に記載の感染症治療剤。
【化７】
【請求項１５】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項１３に記載の感染症治療剤。
【化８】
【請求項１６】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有するＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤。
【化９】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化１０】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項１７】
前記化合物が下記の式（１ａ）または式（１ｂ）であることを特徴とする請求項１６に記載のＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤。
【化１１】
【請求項１８】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項１６に記載のＩＶ型アレルギー性疾患の治療剤。
【化１２】
【請求項１９】
下記の一般式（１）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩を有効成分として含有する、病原体の感染によるアトピー性疾患の重症化を改善するための治療剤。
【化１３】
（式中、Ｒ１は水素原子またはＣ２〜４のアルカノイル基であり、Ｒ２は下記の式（Ａ）から（Ｇ）のいずれかで表される基である。）
【化１４】
（式中、Ｒ３はＣ１〜４のアルキル基である。）
【請求項２０】
前記化合物が下記の式（１ａ）または式（１ｂ）であることを特徴とする請求項１９に記載の治療剤。
【化１５】
【請求項２１】
前記化合物が下記の式（２）であることを特徴とする請求項１９に記載の治療剤。
【化１６】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０１３９６６
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【発行日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１２９５６（Ｐ２００５−５１２９５６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１２６０
【国際出願日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（３０５０２６８８４）株式会社シグナル・クリエーション (2)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年２月１７日（２００５．２．１７）
【発行日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１１２６０
【国際出願日】平成１６年８月５日（２００４．８．５）
【出願人】（３０５０２６８８４）株式会社シグナル・クリエーション (2)
【Ｆターム（参考）】
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