マンノース・グルコース同時測定方法
【課題】
一般的な装置を用いて、安価に、マンノースとグルコースを同時に測定する方法を提供すること。
【解決手段】
試料中の単糖を標識し、ＨＰＬＣの一般的なシステムによりマンノースとグルコースを同時に測定する。
一般的な装置を用いて、安価に、マンノースとグルコースを同時に測定する方法を提供すること。
【解決手段】
試料中の単糖を標識し、ＨＰＬＣの一般的なシステムによりマンノースとグルコースを同時に測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在するグルコースと同時にマンノースを測定する方法および該方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースは糖尿病のマーカーとして様々な検査機器が市販されているが、グルコースと同様に、マンノースの測定も臨床的に重要であると考えられている。
【０００３】
例えば、マンノースの血中濃度は糖尿病や真菌感染症（特にカンジダ症）で上昇することが知られており、診断薬として期待されている（特許文献１）。また、血中マンノースと血中グルコースの両方を測定することにより、前糖尿病状態を把握できる可能性がある（特許文献２）。さらに、インスリンの上昇によりマンノースが低下する現象も認められており、インスリン作用の検査への応用が可能である（特許文献３）。
【０００４】
マンノースを指標とした糖尿病または前糖尿病状態の診断に関し、マンノースとグルコースの血中濃度を予め設定した基準値と比較することで前糖尿病状態をスクリーニングする方法が開示されている（特許文献２）。また、マンノースを指標として糖尿病患者の肝臓からの糖放出状態を検査する方法が開示されている（特許文献４）。また、血中マンノース濃度の測定値の経時変化によりインスリン作用不足を検出する方法が開示されている。（特許文献３）。
【０００５】
糖尿病はヒト以外の哺乳類においても深刻な疾患である。哺乳動物全般で糖尿病に罹ることが知られている。動物病院での症例としては主としてイヌ、ネコ、まれにウシの報告がされている。動物はヒトのように自覚症状を自ら表現することができないため、様々な哺乳動物で血中グルコ−スとマンノースを正確に測定することは動物の糖尿病の診断において非常に重要である。グルコ−スとマンノースの相対量は動物種によって異なるため、広い幅で検出可能な方法が求められている。
【０００６】
マンノースを測定する方法としては、酵素法、ＨＰＬＣポストカラム法、ＧＣ/ＭＳ、キャピラリーＧＣが一般に知られている。
【０００７】
酵素法は測定時間が短く、操作が簡便であることが利点である。しかしながら、必要な試薬（酵素）の種類が多く、非常に高価な方法である（特許文献１、特許文献５）。マンノースはグルコースのエピマーであり構造が類似しているため、グルコースを消去してからマンノースを測定する必要がある。このためグルコースとマンノースを同時に測定することはできない。さらに、グルコースを消去する時にはグルコースに特異性の高い酵素を用いるがマンノースにも影響を及ぼしてしまうという問題がある（非特許文献１）。
【０００８】
ＨＰＬＣポストカラム法（非特許文献２、特許文献３等）は、検出限界が優れており、また、グルコースを消去しなくてもマンノースの測定が可能である。しかしながら、装置が特殊であること、およびグルコースはマンノースとダイナミックレンジがかなり異なる（ヒトの場合で約１００：１）ため同時に測定することができないため別々に測定をしなければならず、測定時間が長いことが問題である。
【０００９】
ＧＣ/ＭＳ、キャピラリーＧＣ等は、煩雑な前処理と高度なメンテナンス技術を要し、実際に測定することは難しい（非特許文献３）。
【００１０】
２種類以上の糖および糖誘導体を同時に分離・分析できる分析装置として、カルシウムイオン配位子交換カラムと鉛イオン配位子交換カラムを直列に連結したＨＰＬＣを用いる構成の分析装置が記載されている（特許文献６）。しかし、この装置を用いて実際に体液中に微量にしか存在しないマンノースと体液中に高濃度に存在するグルコースを同時に測定することは不可能である。
【特許文献１】特開２００１−１９７９００
【特許文献２】特開２００２−２７７４７３
【特許文献３】特開２００２−１４８２６７
【特許文献４】特開２００３−２４８００３
【特許文献５】特開平１１−２６６８９６
【特許文献６】特開平１０−３００７４３
【非特許文献１】Clinical Chemistry 43: 3, 533-538頁, 1997年
【非特許文献２】Clinical Chemistry 49: 1, 181-183頁, 2003年
【非特許文献３】Biological Mass Spectrometry 23巻, 590-595頁, 1994年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明が解決しようとする課題は、一般的な装置を用いて、安価に、マンノースとグルコースを同時に測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
試料中の単糖を標識化し、ＨＰＬＣ（High-Performance Liquid Chromatography：高速液体クロマトグラフィー）の一般的なシステムによりマンノースとグルコースを測定することにより、上記課題が解決される。
【００１３】
すなわち、本願は以下の発明を提供する。
（１）試料中の単糖を標識化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のシステムにより標識化グルコースと標識化マンノースを測定することからなる、試料中のグルコースと試料中のマンノースを同時に測定する方法。
（２）上記（１）の方法において、ＨＰＬＣのシステムが低感度の検出器と高感度の検出器を備える検出装置を有し、低感度の検出器によって標識化グルコースとその内部標準物質の標識化単糖を検出し、高感度の検出器によって標識化マンノースとその内部標準物質の標識化単糖を検出することを特徴とする方法。
（３）上記（１）または（２）の方法において、単糖の還元末端を化学的に標識化する蛍光試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする方法。
（４）上記（１）から（３）のいずれかの方法において、単糖の還元末端をアミノベンジル化またはアミノピリジル化する標識化試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする方法。
（５）標識化試薬が４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）であることを特徴とする上記（４）の方法。
（６）上記（２）から（５）のいずれかの方法において、低感度の検出器が紫外光検出器であり、高感度の検出器が蛍光検出器であることを特徴とする方法。
（７）試料が被験対象から採取された体液である、上記（１）から（６）のいずれかの方法。
（８）上記（１）から（７）のいずれかの方法に使用するキットであって、内部標準物質を含有する試薬および単糖の蛍光標識に必要な試薬を含む、前記キット。
（９）上記（１）から（７）のいずれかの方法により、被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースを測定することを含む、糖尿病または前糖尿病状態を鑑別する方法。
【発明の効果】
【００１４】
従来では、マンノースとグルコースは構造が類似し、かつ濃度差があるためグルコースを消去しなければマンノースを測定することはできず、同時測定は困難であったが、本発明により初めて同時測定が可能となる。
【００１５】
また、動物種によってグルコースやマンノースの相対量が異なるが、本発明の検出は広い幅で可能であり、ヒトでもその他の患畜でもどのような動物種においても同様の方法を使用して測定できる。
【００１６】
本発明により、検出器を２段階にすることで、一般的な研究室にあるＨＰＬＣを用いて、一度の計測でグルコースとマンノースを同時に測定することが可能となる。標識化に用いる試薬やその他実験で使用する試薬は安価であり、一般のラボであればどこでも検査を行うことが可能である。また、血液検査の一つの指標とすることができれば、血液の前処理を含めた自動分析装置での測定も可能であり、有益な診断指標を簡便な方法で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明においては、被験対象から採取された試料中に存在する単糖を蛍光および紫外吸収を持つように標識化し、２段階の検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のシステムにより標識化グルコースと標識化マンノースを測定することが特徴である。本発明により、試料中に存在するグルコースを測定するのと同時に当該試料中に存在するマンノースを測定することが可能となる。
【００１９】
本発明の主要な適用対象は、ヒト並びにペットおよび家畜等の哺乳動物である。従って、本発明において、被験対象は哺乳動物全般である。本発明により、例えば、グルコースとマンノースの血中濃度を測定することにより、糖尿病または前糖尿病状態を診断することができるため、適用対象としては糖尿病に罹ることがある哺乳動物が挙げられる。適用対象の哺乳動物は、好ましくは、ヒト並びにイヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、サルその他のペット、ウシ、ウマ、ブタその他の家畜等の哺乳動物である。
【００２０】
本発明においては、好ましくは、被験対象から採取された体液を試料とする。試料とする体液は、臨床的にマンノース濃度を測定する意義のあるものであれば何でもよいが、特に血液（全血）、血清、血漿または尿などが挙げられる。
【００２１】
本発明の方法の一般的な工程としては、まず、被験対象から採取された試料を除タンパクおよび内部標準物質（キシロース、ラムノース）を添加したのち、単糖（Ｒ−ＣＨＯ）の還元末端に蛍光試薬を還元アミノ化反応により導入することにより標識化する。標識された単糖は蛍光または紫外吸収を持ち、市販の適当な糖鎖糖組成分析用カラムを用いてＨＰＬＣ分析を行うことができる。低感度の検出器によって標識化グルコースとその内部標準物質の標識化単糖（例えばキシロース）を検出する。高感度の検出器によって標識化マンノースとその内部標準物質の標識化単糖（例えばラムノース）を検出する（図７）。以下では、各工程について詳細に説明する。
【００２２】
まず、ＨＰＬＣ分析のための試料の前処理を行う。具体的には、ＨＰＬＣのカラムにタンパクが付着するのを防ぐために、試料からタンパク質を除く。除タンパクは当業者に周知の慣用的な手段により行うことができ、例えば、ゲルろ過、あるいは適当な試薬でタンパク質を変性、沈殿させる等の適当な手段により行うことができる。次に、除タンパクされた試料に既知量の内部標準物質を加える。あるいは、内部標準物質を含む溶液と除タンパク溶液とを兼ねて、除タンパクと内部標準物質の添加を同時に行うこともできる。
【００２３】
内部標準物質としてはマンノースおよびグルコースのいずれともクロマトグラムが重ならず、且つ元来の試料には含まれない単糖を用いることにより測定の精度を上げることができる。具体的には、内部標準物質として、ラムノースとキシロースを使用するのが望ましい。例えば、マンノースに対して既知量のラムノース、グルコースに対して既知量のキシロースを内部標準物質として用いることにより、マンノースとグルコースそれぞれの量を測定できる。あるいは、組合わせを入れ替えて、マンノースに対して既知量のキシロース、グルコースに対して既知量のラムノースを内部標準物質として用いることも可能である。
【００２４】
次に、試料中に存在する単糖を標識化する。試料中の単糖の標識化は、糖の還元末端を化学的に標識するための蛍光試薬を用いて行うことができる。このような蛍光試薬の具体的な例としては、単糖の還元末端のカルボニル基をアミノベンジルまたはアミノピリジル化する標識試薬を用いるのが望ましい。このような試薬は数多く報告されており、例としては、４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）、２−アミノピリジン（ＡＰ）、２−アミノ安息香酸（ＡＢＡ）、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢＡＤ）、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢＡＤ）、４−アミノベンゾニトリル（ＡＢＮ）、２−アミノ−６−シアノエチルピリジン（ＡＣＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。糖の還元末端を化学的に標識するための蛍光試薬の具体的なさらなる例としては、２−アミノアクリドン（ＡＭＡＣ）、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）、７−アミノナフタレン−１，３−ジスルホン酸（ＡＮＤＳ）、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、５−ジメチルアミノナフタレン−1−（Ｎ-（２-アミノメチル））スルホンアミド、その他の多環の芳香族アミンを用いることもできる。標識化された単糖は、蛍光および紫外吸収で検出可能となり、ＨＰＬＣのシステムによる組成分析が可能となる。
【００２５】
後述する実施例においては、４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）で試料中に存在するアルドース（すなわち、マンノース、グルコース、ラムノース、キシロース）をＡＢＥＥで標識化しているが、この場合アルドース（Ｒ−ＣＨＯ）の還元末端にＡＢＥＥを還元アミノ化反応により結合させて標識化する。
【００２６】
【化１】
【００２７】
４つの単糖すべてが標識化されると紫外光の励起によって蛍光を発する。また、紫外光の励起波長は吸収波長として検出できる（Yasuno,S.,et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.,61,1944(1997)）。蛍光の方がより鋭敏に検出できるので、濃度の高いグルコースとキシロースは紫外吸収で、濃度の低いマンノースとラムノースは蛍光で検出する。
【００２８】
ＨＰＬＣ分析は、市販の適当な糖鎖糖組成分析用カラムを用いて、一般的な糖組成分析の方法により行うことができる。使用するカラムと移動相により、標識された各単糖は構造に応じて溶出する時間が変わることがわかっているため、組成分析が可能となる。糖組成分析の一般的な手法については、例えば、「糖質Ｉ・糖タンパク質、新生化学実験講座３、日本生化学会編（東京化学同人）」等の一般的な教科書を参考にでき、ＨＰＬＣ分析の具体的な手法については、「高速液体クロマトグラィーハンドブック、改訂２版、日本分析化学関東支部編（丸善）」および、使用するＨＰＬＣカラムの使用説明書等を参考にすることができる。
【００２９】
本発明において、ＨＰＬＣのシステムは、低感度の検出器と高感度の検出器を備える検出装置を有することが特徴である。低感度の検出器としては紫外光検出器、高感度の検出器としては蛍光検出器を用いる。上述のように、低感度の検出器（紫外光検出器）によって標識化グルコースとその内部標準物質の単糖を検出し、高感度の検出器（蛍光検出器）によって標識化マンノースとその内部標準物質の単糖を検出する。低感度の検出器と高感度の検出器の順番はどちらが先でも構わない。ＡＢＥＥを標識剤に使用する場合、溶出の順番を考慮して、低濃度のピークが高濃度のピークの影響を受けるのを避けるために、グルコースに対してキシロース、マンノースに対してラムノースを内部標準物質として用いるのが好適である。他の標識剤を用いる際には、溶出の順番が変化することにより、内部標準とする単糖を適宜入れ替える方が良い場合もある。
【００３０】
このように、検出感度の異なる検出器を、直列に接続することにより、濃度差がおよそ１：１００であるマンノースとグルコースを同時に定量することができる。従来では、マンノースとグルコースは構造が類似し、かつ濃度差があるためグルコースを消去しなければマンノースを測定することはできず、同時測定は困難であったが、本発明により初めて同時測定が可能となった。ここでいう同時測定とは、一度のＨＰＬＣ分析で測定するという意味であり、前処理（試料の除タンパク）、標識化、そしてＨＰＬＣ分析までの一連の工程を一回行うだけでグルコースとマンノースを同時に定量することができる。後述の実施例においては、前処理に２０分、ＡＢＥＥ化に６０分、ＨＰＬＣ分析に３５分かかるだけで、非常に簡便且つ速やかにグルコースとマンノースの同時測定を行うことができた。
【００３１】
本発明においては、体液中に含まれないラムノースとキシロースを、それぞれマンノース、グルコースの内部標準溶液とするため、相関係数の高い検量線を得ることができる（例えば実施例の図１）。すなわち、血清中の他のバックグラウンドとなる妨害ピークや、内在物質の影響を受けず、誤差の少ない測定ができると考えられる。
【００３２】
後述する実施例の結果から、本発明によるマンノースとグルコースの検出限界は検量線（図１）の残差標準偏差の値に係数3.3を掛けた分析信号に対する濃度から、それぞれ0.09（μmol/l）、0.04(mmol/l)と求めることができた。これは既存のポストカラム法によるマンノースの検出限界(Clinical Chemistry 49:1 181-183,2003)の５μmol/lや、酵素法によるマンノースの検出限界（Metabolism, Vol 52, No 8(August),2003:p1019-1027）の0.5mg/ml（＝2.8μmol/l）より優れている。また、本発明の方法でのグルコースの定量結果は既存の一般的な酵素法との高い相関があることも実証された。
【００３３】
グルコ−スとマンノースの相対量は動物種によって異なるが、本発明の方法では、異なる生物種を測定対象としても、マンノースとグルコースの同時検出が可能である。検出は広い範囲で可能であり、例えグルコースが高値であってもマンノースとリテンションタイムが離れており、どちらの成分も分析可能である。発明者らは、本方法を用いてマンノース0.09〜320μmol/l、グルコース0.04〜64mmol/lの範囲で正確に検出可能であることを確認している。
【００３４】
具体例として、マンノースとグルコースの血中濃度について、ヒトのマンノースとグルコースの血中濃度は健康なヒトの早朝空腹時（女性10名、男性５名）で、マンノース：35.6±12.6μM、グルコース：4.64±0.87mMという報告がある。（Determination of D-Mannnose in Plasma by HPLC：Clinical Chemistry 49巻,NO.1,181-183頁,2003年）動物の場合はまだ報告が少ないが、例えば、Glycobiology vol.8 no.3, pp.285-295,1998、TableIに各種哺乳動物の血清中マンノース濃度のデータが記載されている。さらに同文献において、グルコースはマンノースの５０から１５０倍であったと記述がある。グルコースのデータとしては、例えば、本発明者らの文献（新井ら、D-glucose transport and glycolytic enzyme activities in erythrocytes of dogs, pigs, cats, horses, cattle and sheep: Resarch in Veterinary Science,58巻,195-196頁, 1995年）に記載がある。これら２つの文献からネコとイヌのデータを取り出すと、ネコ（Domestic cat）についてはマンノース135μM/グルコース4.7mM、イヌ（Domestic dog)についてはマンノース65μM/グルコース5.6mMとなる。これらの数値は、全て本発明の方法により正確な測定が可能な範囲に含まれることが明らかである。
【００３５】
また、本発明は、被験対象から採取された試料中に存在するグルコースを測定するのと同時に、当該試料中に存在するマンノースを測定する方法に使用するキットの形態として利用することも可能である。本発明のキットには、内部標準物質を含有する試薬、単糖の蛍光標識に必要な試薬、および取扱説明書等が含まれる。
【００３６】
さらに、上述の本発明の方法を用いて被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースとを測定することにより糖尿病または前糖尿病状態を鑑別する方法も本発明に含まれる。被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースとを測定し、それぞれの基準値と比較することにより糖尿病または前糖尿病状態を鑑別することができる。前糖尿病状態とは、境界型糖尿病あるいは耐糖能障害とも称され、糖尿病発症に至る前段階の状態であり、この状態を早期に鑑別して適切な治療を行うことにより糖尿病への進行を抑制できる。
【００３７】
ヒトにおいて血液中のグルコース濃度による診断基準は明確であり、本発明の方法により糖尿病または前糖尿病状態を鑑別できる。グルコース濃度の具体的な基準値については、例えば、日本糖尿病学会判定基準の数値（空腹時の血液中のグルコースが110-125mg/dlで前糖尿病状態、126mg/dl以上で糖尿病、あるいは７５ｇブドウ糖負荷後の血液中のグルコースの２時間値が140mg/dl以上で前糖尿病状態または糖尿病）を採用できるが、さらに独自の基準を採用することも可能である。また、被験対象がヒト以外の哺乳動物である場合は、それぞれの動物種に応じた適当な基準値を設定すべきである。マンノースについては、現在のところ、血液中のマンノース濃度と糖尿病または前糖尿病状態との関係について必ずしも確立された基準値があるわけではないが、本発明により血液中のグルコースとマンノースを同一の試料で同時に測定できるため、グルコース濃度の基準値との比較により正常型または糖尿病もしくは前糖尿病状態と鑑別された試料のマンノース濃度に基づくマンノース濃度の基準値を求めることが可能である。
【実施例】
【００３８】
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３９】
実施例１ イヌ血清中マンノースとグルコース濃度
方法
試薬：試薬は別途記述していないかぎり和光純薬から特級品を購入した。
サンプル：健康なイヌ３匹から静脈血の血清を得た。早朝空腹時と食後１時間３０分後に採血を行った。血液採取についてはシリンジもしくは真空管採血後、３０分程度放置後、遠心分離し上澄み液を血清とし、分析までは−２０℃で保存した。
【００４０】
標準溶液の調製：
標準溶液としてマンノース溶液2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320μmol/l、グルコース溶液0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64mmol/lの8点を調製した。
【００４１】
除タンパク溶液を含む内部標準溶液の調製：
内部標準物質としてL-ラムノースとD-キシロースをそれぞれマンノースとグルコースに対して用いた。内部標準溶液として分析時にL-ラムノースを1280μmol/l、D-キシロースを80mmol/lになるよう4.8mol/l過塩素酸溶液に溶解した。なお、この内部標準溶液は除タンパク溶液も兼ねている。
【００４２】
単糖のABEE標識化：
マイクロチューブに標準溶液またはサンプル（血清）100μｌと、内部標準溶液12.5μｌを入れ（つまり4.8mol/l過塩素酸溶液をサンプル100に対して12.5添加）、除タンパクのため試験管振盪機で10秒間混和後、遠心分離（13,000G、4℃、20分間）をおこなった。上清を別のマイクロチューブに10μｌ移し、そこに4-アミノ安息香酸エチルエステル（ABEE）標識化試薬（生化学工業製）を40μｌ添加し、試験管振盪機で5秒間混和してから80℃１時間保った後、放冷した。これを遠心分離（13,000G、4℃、10秒間）し蒸留水200μｌ、クロロホルム200μｌを添加し、試験管振盪機で10秒間混和後、遠心分離（13,000G、4℃、5分間）し、上清10μｌをHPLC分析に供した。
【００４３】
HPLC分析条件と標識化単糖の分析：
HPLC（島津製作所製）のシステムは送液ポンプ（LC-20AD）２台、オートサンプラー(SIL-20AC)、カラムオーブン（CTO-20AC）紫外可視分光光度計検出器(SPD-20A)、分光蛍光検出器(RF-10A XL)、コントローラー(LC solution)で構成した。カラムには逆相カラムであるHonenpak C18(生化学工業製、Code 800445)を用い、流速1ml/minでカラム温度30℃にて、分析をおこなった。紫外可視分光光度計検出器、分光蛍光検出器は直列に接続し、紫外可視分光光度計検出器では標識化グルコースと内部標準物質の標識化キシロースを分析し、分光蛍光検出器では標識化マンノースと内部標準物質の標識化ラムノースを分析した。紫外可視分光光度計検出器の検出波長は305nmとした。分光蛍光検出器は励起波長305nm、蛍光波長360nmで検出した。0.2mol/lホウ酸カリウム緩衝液（pH8.9）/アセトニトニル（93/7、V/V）、0.02%TFA溶液/アセトニトリル（50/50 、V/V）をそれぞれ溶液A、溶液Bとし、移動相として使用した。溶液Aは分離のために35分間流し、次に溶液Bをカラムの洗浄のために5分間流した。次の試料の分析前には平衡化のために溶液Aを10分間流した。
【００４４】
酵素法によるグルコース濃度の測定：
上述したイヌ血清サンプルを用い、血清中グルコースを酵素法であるグルコースC-IIテストワコーによって測定し、上述したHPLC分析法での測定結果と相関を取った。（表１、図４）
結果
図１(a),(b)に、マンノース検量線とグルコース検量線を示す。
【００４５】
図２にイヌ１空腹時血清をサンプルとした標識化マンノースのクロマトグラム、図３にイヌ１空腹時をサンプルとした標識化グルコースのクロマトグラムを示す。本発明の方法（ＨＰＬＣ法）および酵素法によるイヌ血清中マンノースとグルコース濃度の分析結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
図４に、イヌ血清グルコース濃度のHPLC分析法と酵素法との相関を示す。本法でのイヌ血清中グルコースの定量結果は既存の一般的な酵素法との高い相関が得られた。マンノースは既存の一般的な方法がないため比較を行わなかった。
【００４８】
血液中に含まれないL-ラムノースとD-キシロースを、それぞれマンノース、グルコースの内部標準溶液としたため、図１に示すような相関係数の高い検量線を得ることができた。すなわち、血清中の他のバックグラウンドとなる妨害ピークや、内在物質の影響を受けず、誤差の少ない測定ができると考える。
【００４９】
マンノースとグルコースの検出限界は検量線の残差標準偏差の値に係数3.3を掛けた分析信号に対する濃度から、それぞれ0.09（μmol/l）、0.04(mmol/l)と求めることができた。これは既存のポストカラム法によるマンノースの検出限界(Clinical Chemistry 49:1 181-183,2003)の５（μmol/l）や、酵素法によるマンノースの検出限界（Metabolism, Vol 52, No 8(August),2003:p1019-1027）の0.5mg/ml（＝2.8（μmol/l））より優れている。
【００５０】
実施例２ ネコ血清中マンノースとグルコース濃度
実施例１のサンプルをイヌ血清に代えて、正常ネコ血清と糖尿病ネコ血清を用いた他は、実施例１と同様の実験操作を行って、ネコ血清中のマンノースとグルコースを定量した。図５に、糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化マンノースのクロマトグラム、図６に、糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化グルコースのクロマトグラムを示す。
【００５１】
表２に分析結果を示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
検出感度の異なる検出器を、直列に接続することにより、濃度差がおよそ１：１００であるマンノースとグルコースを表１および２に示すように同時に定量することができた。従来では、マンノースとグルコースは構造が類似し、かつ濃度差があるためグルコースを消去しなければマンノースを測定することはできず、同時測定は困難であったが、今回初めて同時測定を可能にした。また実施例１ではイヌ、実施例２ではサンプルにネコの血清を用いたがどちらでも定量可能であった。特に実施例２では糖尿病ネコの血清を使用したが、グルコースが高値であってもマンノースとリテンションタイムが離れているため、どちらの成分も分析可能であることを示している。すなわち本発明が、異なる生物種を測定対象としても、マンノースとグルコースの同時検出が可能であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によりグルコースとマンノースを同時に定量することができるようなったため、糖尿病の症例の多面的な評価が可能になる。特に、血中グルコースと同時にマンノースを測定することで前糖尿病状態を把握することができ、このことから、前糖尿病状態の患者に適切に栄養指導を行うことで、糖尿病の予防を行うことができる。
【００５５】
また、一般的な血液検査の一つの指標とすることができれば、血液の前処理を含めた自動化も可能であり、有益な診断指標を簡便な方法で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】(a),(b)は、それぞれマンノース検量線とグルコース検量線である。
【図２】イヌ１空腹時血清をサンプルとした標識化マンノースのクロマトグラムである。
【図３】イヌ１空腹時血清をサンプルとした標識化グルコースのクロマトグラムである。
【図４】イヌ血清グルコース濃度のHPLC分析法と酵素法との相関を示す。
【図５】糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化マンノースのクロマトグラムである。
【図６】糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化グルコースのクロマトグラムである。
【図７】本発明によるマンノース、グルコース同時検出システムの模式図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中に存在するグルコースと同時にマンノースを測定する方法および該方法に使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコースは糖尿病のマーカーとして様々な検査機器が市販されているが、グルコースと同様に、マンノースの測定も臨床的に重要であると考えられている。
【０００３】
例えば、マンノースの血中濃度は糖尿病や真菌感染症（特にカンジダ症）で上昇することが知られており、診断薬として期待されている（特許文献１）。また、血中マンノースと血中グルコースの両方を測定することにより、前糖尿病状態を把握できる可能性がある（特許文献２）。さらに、インスリンの上昇によりマンノースが低下する現象も認められており、インスリン作用の検査への応用が可能である（特許文献３）。
【０００４】
マンノースを指標とした糖尿病または前糖尿病状態の診断に関し、マンノースとグルコースの血中濃度を予め設定した基準値と比較することで前糖尿病状態をスクリーニングする方法が開示されている（特許文献２）。また、マンノースを指標として糖尿病患者の肝臓からの糖放出状態を検査する方法が開示されている（特許文献４）。また、血中マンノース濃度の測定値の経時変化によりインスリン作用不足を検出する方法が開示されている。（特許文献３）。
【０００５】
糖尿病はヒト以外の哺乳類においても深刻な疾患である。哺乳動物全般で糖尿病に罹ることが知られている。動物病院での症例としては主としてイヌ、ネコ、まれにウシの報告がされている。動物はヒトのように自覚症状を自ら表現することができないため、様々な哺乳動物で血中グルコ−スとマンノースを正確に測定することは動物の糖尿病の診断において非常に重要である。グルコ−スとマンノースの相対量は動物種によって異なるため、広い幅で検出可能な方法が求められている。
【０００６】
マンノースを測定する方法としては、酵素法、ＨＰＬＣポストカラム法、ＧＣ/ＭＳ、キャピラリーＧＣが一般に知られている。
【０００７】
酵素法は測定時間が短く、操作が簡便であることが利点である。しかしながら、必要な試薬（酵素）の種類が多く、非常に高価な方法である（特許文献１、特許文献５）。マンノースはグルコースのエピマーであり構造が類似しているため、グルコースを消去してからマンノースを測定する必要がある。このためグルコースとマンノースを同時に測定することはできない。さらに、グルコースを消去する時にはグルコースに特異性の高い酵素を用いるがマンノースにも影響を及ぼしてしまうという問題がある（非特許文献１）。
【０００８】
ＨＰＬＣポストカラム法（非特許文献２、特許文献３等）は、検出限界が優れており、また、グルコースを消去しなくてもマンノースの測定が可能である。しかしながら、装置が特殊であること、およびグルコースはマンノースとダイナミックレンジがかなり異なる（ヒトの場合で約１００：１）ため同時に測定することができないため別々に測定をしなければならず、測定時間が長いことが問題である。
【０００９】
ＧＣ/ＭＳ、キャピラリーＧＣ等は、煩雑な前処理と高度なメンテナンス技術を要し、実際に測定することは難しい（非特許文献３）。
【００１０】
２種類以上の糖および糖誘導体を同時に分離・分析できる分析装置として、カルシウムイオン配位子交換カラムと鉛イオン配位子交換カラムを直列に連結したＨＰＬＣを用いる構成の分析装置が記載されている（特許文献６）。しかし、この装置を用いて実際に体液中に微量にしか存在しないマンノースと体液中に高濃度に存在するグルコースを同時に測定することは不可能である。
【特許文献１】特開２００１−１９７９００
【特許文献２】特開２００２−２７７４７３
【特許文献３】特開２００２−１４８２６７
【特許文献４】特開２００３−２４８００３
【特許文献５】特開平１１−２６６８９６
【特許文献６】特開平１０−３００７４３
【非特許文献１】Clinical Chemistry 43: 3, 533-538頁, 1997年
【非特許文献２】Clinical Chemistry 49: 1, 181-183頁, 2003年
【非特許文献３】Biological Mass Spectrometry 23巻, 590-595頁, 1994年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
発明が解決しようとする課題は、一般的な装置を用いて、安価に、マンノースとグルコースを同時に測定する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
試料中の単糖を標識化し、ＨＰＬＣ（High-Performance Liquid Chromatography：高速液体クロマトグラフィー）の一般的なシステムによりマンノースとグルコースを測定することにより、上記課題が解決される。
【００１３】
すなわち、本願は以下の発明を提供する。
（１）試料中の単糖を標識化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のシステムにより標識化グルコースと標識化マンノースを測定することからなる、試料中のグルコースと試料中のマンノースを同時に測定する方法。
（２）上記（１）の方法において、ＨＰＬＣのシステムが低感度の検出器と高感度の検出器を備える検出装置を有し、低感度の検出器によって標識化グルコースとその内部標準物質の標識化単糖を検出し、高感度の検出器によって標識化マンノースとその内部標準物質の標識化単糖を検出することを特徴とする方法。
（３）上記（１）または（２）の方法において、単糖の還元末端を化学的に標識化する蛍光試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする方法。
（４）上記（１）から（３）のいずれかの方法において、単糖の還元末端をアミノベンジル化またはアミノピリジル化する標識化試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする方法。
（５）標識化試薬が４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）であることを特徴とする上記（４）の方法。
（６）上記（２）から（５）のいずれかの方法において、低感度の検出器が紫外光検出器であり、高感度の検出器が蛍光検出器であることを特徴とする方法。
（７）試料が被験対象から採取された体液である、上記（１）から（６）のいずれかの方法。
（８）上記（１）から（７）のいずれかの方法に使用するキットであって、内部標準物質を含有する試薬および単糖の蛍光標識に必要な試薬を含む、前記キット。
（９）上記（１）から（７）のいずれかの方法により、被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースを測定することを含む、糖尿病または前糖尿病状態を鑑別する方法。
【発明の効果】
【００１４】
従来では、マンノースとグルコースは構造が類似し、かつ濃度差があるためグルコースを消去しなければマンノースを測定することはできず、同時測定は困難であったが、本発明により初めて同時測定が可能となる。
【００１５】
また、動物種によってグルコースやマンノースの相対量が異なるが、本発明の検出は広い幅で可能であり、ヒトでもその他の患畜でもどのような動物種においても同様の方法を使用して測定できる。
【００１６】
本発明により、検出器を２段階にすることで、一般的な研究室にあるＨＰＬＣを用いて、一度の計測でグルコースとマンノースを同時に測定することが可能となる。標識化に用いる試薬やその他実験で使用する試薬は安価であり、一般のラボであればどこでも検査を行うことが可能である。また、血液検査の一つの指標とすることができれば、血液の前処理を含めた自動分析装置での測定も可能であり、有益な診断指標を簡便な方法で得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１８】
本発明においては、被験対象から採取された試料中に存在する単糖を蛍光および紫外吸収を持つように標識化し、２段階の検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のシステムにより標識化グルコースと標識化マンノースを測定することが特徴である。本発明により、試料中に存在するグルコースを測定するのと同時に当該試料中に存在するマンノースを測定することが可能となる。
【００１９】
本発明の主要な適用対象は、ヒト並びにペットおよび家畜等の哺乳動物である。従って、本発明において、被験対象は哺乳動物全般である。本発明により、例えば、グルコースとマンノースの血中濃度を測定することにより、糖尿病または前糖尿病状態を診断することができるため、適用対象としては糖尿病に罹ることがある哺乳動物が挙げられる。適用対象の哺乳動物は、好ましくは、ヒト並びにイヌ、ネコ、ウサギ、げっ歯類、サルその他のペット、ウシ、ウマ、ブタその他の家畜等の哺乳動物である。
【００２０】
本発明においては、好ましくは、被験対象から採取された体液を試料とする。試料とする体液は、臨床的にマンノース濃度を測定する意義のあるものであれば何でもよいが、特に血液（全血）、血清、血漿または尿などが挙げられる。
【００２１】
本発明の方法の一般的な工程としては、まず、被験対象から採取された試料を除タンパクおよび内部標準物質（キシロース、ラムノース）を添加したのち、単糖（Ｒ−ＣＨＯ）の還元末端に蛍光試薬を還元アミノ化反応により導入することにより標識化する。標識された単糖は蛍光または紫外吸収を持ち、市販の適当な糖鎖糖組成分析用カラムを用いてＨＰＬＣ分析を行うことができる。低感度の検出器によって標識化グルコースとその内部標準物質の標識化単糖（例えばキシロース）を検出する。高感度の検出器によって標識化マンノースとその内部標準物質の標識化単糖（例えばラムノース）を検出する（図７）。以下では、各工程について詳細に説明する。
【００２２】
まず、ＨＰＬＣ分析のための試料の前処理を行う。具体的には、ＨＰＬＣのカラムにタンパクが付着するのを防ぐために、試料からタンパク質を除く。除タンパクは当業者に周知の慣用的な手段により行うことができ、例えば、ゲルろ過、あるいは適当な試薬でタンパク質を変性、沈殿させる等の適当な手段により行うことができる。次に、除タンパクされた試料に既知量の内部標準物質を加える。あるいは、内部標準物質を含む溶液と除タンパク溶液とを兼ねて、除タンパクと内部標準物質の添加を同時に行うこともできる。
【００２３】
内部標準物質としてはマンノースおよびグルコースのいずれともクロマトグラムが重ならず、且つ元来の試料には含まれない単糖を用いることにより測定の精度を上げることができる。具体的には、内部標準物質として、ラムノースとキシロースを使用するのが望ましい。例えば、マンノースに対して既知量のラムノース、グルコースに対して既知量のキシロースを内部標準物質として用いることにより、マンノースとグルコースそれぞれの量を測定できる。あるいは、組合わせを入れ替えて、マンノースに対して既知量のキシロース、グルコースに対して既知量のラムノースを内部標準物質として用いることも可能である。
【００２４】
次に、試料中に存在する単糖を標識化する。試料中の単糖の標識化は、糖の還元末端を化学的に標識するための蛍光試薬を用いて行うことができる。このような蛍光試薬の具体的な例としては、単糖の還元末端のカルボニル基をアミノベンジルまたはアミノピリジル化する標識試薬を用いるのが望ましい。このような試薬は数多く報告されており、例としては、４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）、２−アミノピリジン（ＡＰ）、２−アミノ安息香酸（ＡＢＡ）、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢＡＤ）、３−アミノベンズアミド（３−ＡＢＡＤ）、４−アミノベンゾニトリル（ＡＢＮ）、２−アミノ−６−シアノエチルピリジン（ＡＣＰ）等が挙げられるが、これらに限定されない。糖の還元末端を化学的に標識するための蛍光試薬の具体的なさらなる例としては、２−アミノアクリドン（ＡＭＡＣ）、８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ）、７−アミノナフタレン−１，３−ジスルホン酸（ＡＮＤＳ）、８−アミノピレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＰＴＳ）、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）、５−ジメチルアミノナフタレン−1−（Ｎ-（２-アミノメチル））スルホンアミド、その他の多環の芳香族アミンを用いることもできる。標識化された単糖は、蛍光および紫外吸収で検出可能となり、ＨＰＬＣのシステムによる組成分析が可能となる。
【００２５】
後述する実施例においては、４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）で試料中に存在するアルドース（すなわち、マンノース、グルコース、ラムノース、キシロース）をＡＢＥＥで標識化しているが、この場合アルドース（Ｒ−ＣＨＯ）の還元末端にＡＢＥＥを還元アミノ化反応により結合させて標識化する。
【００２６】
【化１】
【００２７】
４つの単糖すべてが標識化されると紫外光の励起によって蛍光を発する。また、紫外光の励起波長は吸収波長として検出できる（Yasuno,S.,et al., Biosci. Biotechnol. Biochem.,61,1944(1997)）。蛍光の方がより鋭敏に検出できるので、濃度の高いグルコースとキシロースは紫外吸収で、濃度の低いマンノースとラムノースは蛍光で検出する。
【００２８】
ＨＰＬＣ分析は、市販の適当な糖鎖糖組成分析用カラムを用いて、一般的な糖組成分析の方法により行うことができる。使用するカラムと移動相により、標識された各単糖は構造に応じて溶出する時間が変わることがわかっているため、組成分析が可能となる。糖組成分析の一般的な手法については、例えば、「糖質Ｉ・糖タンパク質、新生化学実験講座３、日本生化学会編（東京化学同人）」等の一般的な教科書を参考にでき、ＨＰＬＣ分析の具体的な手法については、「高速液体クロマトグラィーハンドブック、改訂２版、日本分析化学関東支部編（丸善）」および、使用するＨＰＬＣカラムの使用説明書等を参考にすることができる。
【００２９】
本発明において、ＨＰＬＣのシステムは、低感度の検出器と高感度の検出器を備える検出装置を有することが特徴である。低感度の検出器としては紫外光検出器、高感度の検出器としては蛍光検出器を用いる。上述のように、低感度の検出器（紫外光検出器）によって標識化グルコースとその内部標準物質の単糖を検出し、高感度の検出器（蛍光検出器）によって標識化マンノースとその内部標準物質の単糖を検出する。低感度の検出器と高感度の検出器の順番はどちらが先でも構わない。ＡＢＥＥを標識剤に使用する場合、溶出の順番を考慮して、低濃度のピークが高濃度のピークの影響を受けるのを避けるために、グルコースに対してキシロース、マンノースに対してラムノースを内部標準物質として用いるのが好適である。他の標識剤を用いる際には、溶出の順番が変化することにより、内部標準とする単糖を適宜入れ替える方が良い場合もある。
【００３０】
このように、検出感度の異なる検出器を、直列に接続することにより、濃度差がおよそ１：１００であるマンノースとグルコースを同時に定量することができる。従来では、マンノースとグルコースは構造が類似し、かつ濃度差があるためグルコースを消去しなければマンノースを測定することはできず、同時測定は困難であったが、本発明により初めて同時測定が可能となった。ここでいう同時測定とは、一度のＨＰＬＣ分析で測定するという意味であり、前処理（試料の除タンパク）、標識化、そしてＨＰＬＣ分析までの一連の工程を一回行うだけでグルコースとマンノースを同時に定量することができる。後述の実施例においては、前処理に２０分、ＡＢＥＥ化に６０分、ＨＰＬＣ分析に３５分かかるだけで、非常に簡便且つ速やかにグルコースとマンノースの同時測定を行うことができた。
【００３１】
本発明においては、体液中に含まれないラムノースとキシロースを、それぞれマンノース、グルコースの内部標準溶液とするため、相関係数の高い検量線を得ることができる（例えば実施例の図１）。すなわち、血清中の他のバックグラウンドとなる妨害ピークや、内在物質の影響を受けず、誤差の少ない測定ができると考えられる。
【００３２】
後述する実施例の結果から、本発明によるマンノースとグルコースの検出限界は検量線（図１）の残差標準偏差の値に係数3.3を掛けた分析信号に対する濃度から、それぞれ0.09（μmol/l）、0.04(mmol/l)と求めることができた。これは既存のポストカラム法によるマンノースの検出限界(Clinical Chemistry 49:1 181-183,2003)の５μmol/lや、酵素法によるマンノースの検出限界（Metabolism, Vol 52, No 8(August),2003:p1019-1027）の0.5mg/ml（＝2.8μmol/l）より優れている。また、本発明の方法でのグルコースの定量結果は既存の一般的な酵素法との高い相関があることも実証された。
【００３３】
グルコ−スとマンノースの相対量は動物種によって異なるが、本発明の方法では、異なる生物種を測定対象としても、マンノースとグルコースの同時検出が可能である。検出は広い範囲で可能であり、例えグルコースが高値であってもマンノースとリテンションタイムが離れており、どちらの成分も分析可能である。発明者らは、本方法を用いてマンノース0.09〜320μmol/l、グルコース0.04〜64mmol/lの範囲で正確に検出可能であることを確認している。
【００３４】
具体例として、マンノースとグルコースの血中濃度について、ヒトのマンノースとグルコースの血中濃度は健康なヒトの早朝空腹時（女性10名、男性５名）で、マンノース：35.6±12.6μM、グルコース：4.64±0.87mMという報告がある。（Determination of D-Mannnose in Plasma by HPLC：Clinical Chemistry 49巻,NO.1,181-183頁,2003年）動物の場合はまだ報告が少ないが、例えば、Glycobiology vol.8 no.3, pp.285-295,1998、TableIに各種哺乳動物の血清中マンノース濃度のデータが記載されている。さらに同文献において、グルコースはマンノースの５０から１５０倍であったと記述がある。グルコースのデータとしては、例えば、本発明者らの文献（新井ら、D-glucose transport and glycolytic enzyme activities in erythrocytes of dogs, pigs, cats, horses, cattle and sheep: Resarch in Veterinary Science,58巻,195-196頁, 1995年）に記載がある。これら２つの文献からネコとイヌのデータを取り出すと、ネコ（Domestic cat）についてはマンノース135μM/グルコース4.7mM、イヌ（Domestic dog)についてはマンノース65μM/グルコース5.6mMとなる。これらの数値は、全て本発明の方法により正確な測定が可能な範囲に含まれることが明らかである。
【００３５】
また、本発明は、被験対象から採取された試料中に存在するグルコースを測定するのと同時に、当該試料中に存在するマンノースを測定する方法に使用するキットの形態として利用することも可能である。本発明のキットには、内部標準物質を含有する試薬、単糖の蛍光標識に必要な試薬、および取扱説明書等が含まれる。
【００３６】
さらに、上述の本発明の方法を用いて被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースとを測定することにより糖尿病または前糖尿病状態を鑑別する方法も本発明に含まれる。被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースとを測定し、それぞれの基準値と比較することにより糖尿病または前糖尿病状態を鑑別することができる。前糖尿病状態とは、境界型糖尿病あるいは耐糖能障害とも称され、糖尿病発症に至る前段階の状態であり、この状態を早期に鑑別して適切な治療を行うことにより糖尿病への進行を抑制できる。
【００３７】
ヒトにおいて血液中のグルコース濃度による診断基準は明確であり、本発明の方法により糖尿病または前糖尿病状態を鑑別できる。グルコース濃度の具体的な基準値については、例えば、日本糖尿病学会判定基準の数値（空腹時の血液中のグルコースが110-125mg/dlで前糖尿病状態、126mg/dl以上で糖尿病、あるいは７５ｇブドウ糖負荷後の血液中のグルコースの２時間値が140mg/dl以上で前糖尿病状態または糖尿病）を採用できるが、さらに独自の基準を採用することも可能である。また、被験対象がヒト以外の哺乳動物である場合は、それぞれの動物種に応じた適当な基準値を設定すべきである。マンノースについては、現在のところ、血液中のマンノース濃度と糖尿病または前糖尿病状態との関係について必ずしも確立された基準値があるわけではないが、本発明により血液中のグルコースとマンノースを同一の試料で同時に測定できるため、グルコース濃度の基準値との比較により正常型または糖尿病もしくは前糖尿病状態と鑑別された試料のマンノース濃度に基づくマンノース濃度の基準値を求めることが可能である。
【実施例】
【００３８】
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
【００３９】
実施例１ イヌ血清中マンノースとグルコース濃度
方法
試薬：試薬は別途記述していないかぎり和光純薬から特級品を購入した。
サンプル：健康なイヌ３匹から静脈血の血清を得た。早朝空腹時と食後１時間３０分後に採血を行った。血液採取についてはシリンジもしくは真空管採血後、３０分程度放置後、遠心分離し上澄み液を血清とし、分析までは−２０℃で保存した。
【００４０】
標準溶液の調製：
標準溶液としてマンノース溶液2.5, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320μmol/l、グルコース溶液0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64mmol/lの8点を調製した。
【００４１】
除タンパク溶液を含む内部標準溶液の調製：
内部標準物質としてL-ラムノースとD-キシロースをそれぞれマンノースとグルコースに対して用いた。内部標準溶液として分析時にL-ラムノースを1280μmol/l、D-キシロースを80mmol/lになるよう4.8mol/l過塩素酸溶液に溶解した。なお、この内部標準溶液は除タンパク溶液も兼ねている。
【００４２】
単糖のABEE標識化：
マイクロチューブに標準溶液またはサンプル（血清）100μｌと、内部標準溶液12.5μｌを入れ（つまり4.8mol/l過塩素酸溶液をサンプル100に対して12.5添加）、除タンパクのため試験管振盪機で10秒間混和後、遠心分離（13,000G、4℃、20分間）をおこなった。上清を別のマイクロチューブに10μｌ移し、そこに4-アミノ安息香酸エチルエステル（ABEE）標識化試薬（生化学工業製）を40μｌ添加し、試験管振盪機で5秒間混和してから80℃１時間保った後、放冷した。これを遠心分離（13,000G、4℃、10秒間）し蒸留水200μｌ、クロロホルム200μｌを添加し、試験管振盪機で10秒間混和後、遠心分離（13,000G、4℃、5分間）し、上清10μｌをHPLC分析に供した。
【００４３】
HPLC分析条件と標識化単糖の分析：
HPLC（島津製作所製）のシステムは送液ポンプ（LC-20AD）２台、オートサンプラー(SIL-20AC)、カラムオーブン（CTO-20AC）紫外可視分光光度計検出器(SPD-20A)、分光蛍光検出器(RF-10A XL)、コントローラー(LC solution)で構成した。カラムには逆相カラムであるHonenpak C18(生化学工業製、Code 800445)を用い、流速1ml/minでカラム温度30℃にて、分析をおこなった。紫外可視分光光度計検出器、分光蛍光検出器は直列に接続し、紫外可視分光光度計検出器では標識化グルコースと内部標準物質の標識化キシロースを分析し、分光蛍光検出器では標識化マンノースと内部標準物質の標識化ラムノースを分析した。紫外可視分光光度計検出器の検出波長は305nmとした。分光蛍光検出器は励起波長305nm、蛍光波長360nmで検出した。0.2mol/lホウ酸カリウム緩衝液（pH8.9）/アセトニトニル（93/7、V/V）、0.02%TFA溶液/アセトニトリル（50/50 、V/V）をそれぞれ溶液A、溶液Bとし、移動相として使用した。溶液Aは分離のために35分間流し、次に溶液Bをカラムの洗浄のために5分間流した。次の試料の分析前には平衡化のために溶液Aを10分間流した。
【００４４】
酵素法によるグルコース濃度の測定：
上述したイヌ血清サンプルを用い、血清中グルコースを酵素法であるグルコースC-IIテストワコーによって測定し、上述したHPLC分析法での測定結果と相関を取った。（表１、図４）
結果
図１(a),(b)に、マンノース検量線とグルコース検量線を示す。
【００４５】
図２にイヌ１空腹時血清をサンプルとした標識化マンノースのクロマトグラム、図３にイヌ１空腹時をサンプルとした標識化グルコースのクロマトグラムを示す。本発明の方法（ＨＰＬＣ法）および酵素法によるイヌ血清中マンノースとグルコース濃度の分析結果を表１に示す。
【００４６】
【表１】
【００４７】
図４に、イヌ血清グルコース濃度のHPLC分析法と酵素法との相関を示す。本法でのイヌ血清中グルコースの定量結果は既存の一般的な酵素法との高い相関が得られた。マンノースは既存の一般的な方法がないため比較を行わなかった。
【００４８】
血液中に含まれないL-ラムノースとD-キシロースを、それぞれマンノース、グルコースの内部標準溶液としたため、図１に示すような相関係数の高い検量線を得ることができた。すなわち、血清中の他のバックグラウンドとなる妨害ピークや、内在物質の影響を受けず、誤差の少ない測定ができると考える。
【００４９】
マンノースとグルコースの検出限界は検量線の残差標準偏差の値に係数3.3を掛けた分析信号に対する濃度から、それぞれ0.09（μmol/l）、0.04(mmol/l)と求めることができた。これは既存のポストカラム法によるマンノースの検出限界(Clinical Chemistry 49:1 181-183,2003)の５（μmol/l）や、酵素法によるマンノースの検出限界（Metabolism, Vol 52, No 8(August),2003:p1019-1027）の0.5mg/ml（＝2.8（μmol/l））より優れている。
【００５０】
実施例２ ネコ血清中マンノースとグルコース濃度
実施例１のサンプルをイヌ血清に代えて、正常ネコ血清と糖尿病ネコ血清を用いた他は、実施例１と同様の実験操作を行って、ネコ血清中のマンノースとグルコースを定量した。図５に、糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化マンノースのクロマトグラム、図６に、糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化グルコースのクロマトグラムを示す。
【００５１】
表２に分析結果を示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
検出感度の異なる検出器を、直列に接続することにより、濃度差がおよそ１：１００であるマンノースとグルコースを表１および２に示すように同時に定量することができた。従来では、マンノースとグルコースは構造が類似し、かつ濃度差があるためグルコースを消去しなければマンノースを測定することはできず、同時測定は困難であったが、今回初めて同時測定を可能にした。また実施例１ではイヌ、実施例２ではサンプルにネコの血清を用いたがどちらでも定量可能であった。特に実施例２では糖尿病ネコの血清を使用したが、グルコースが高値であってもマンノースとリテンションタイムが離れているため、どちらの成分も分析可能であることを示している。すなわち本発明が、異なる生物種を測定対象としても、マンノースとグルコースの同時検出が可能であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明によりグルコースとマンノースを同時に定量することができるようなったため、糖尿病の症例の多面的な評価が可能になる。特に、血中グルコースと同時にマンノースを測定することで前糖尿病状態を把握することができ、このことから、前糖尿病状態の患者に適切に栄養指導を行うことで、糖尿病の予防を行うことができる。
【００５５】
また、一般的な血液検査の一つの指標とすることができれば、血液の前処理を含めた自動化も可能であり、有益な診断指標を簡便な方法で得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】(a),(b)は、それぞれマンノース検量線とグルコース検量線である。
【図２】イヌ１空腹時血清をサンプルとした標識化マンノースのクロマトグラムである。
【図３】イヌ１空腹時血清をサンプルとした標識化グルコースのクロマトグラムである。
【図４】イヌ血清グルコース濃度のHPLC分析法と酵素法との相関を示す。
【図５】糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化マンノースのクロマトグラムである。
【図６】糖尿病ネコ血清をサンプルとした標識化グルコースのクロマトグラムである。
【図７】本発明によるマンノース、グルコース同時検出システムの模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の単糖を標識化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のシステムにより標識化グルコースと標識化マンノースを測定することからなる、試料中のグルコースと試料中のマンノースを同時に測定する方法。
【請求項２】
ＨＰＬＣのシステムが低感度の検出器と高感度の検出器を備える検出装置を有し、低感度の検出器によって標識化グルコースとその内部標準物質の標識化単糖を検出し、高感度の検出器によって標識化マンノースとその内部標準物質の標識化単糖を検出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単糖の還元末端を化学的に標識化する蛍光試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
単糖の還元末端をアミノベンジル化またはアミノピリジル化する標識化試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
標識化試薬が４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
低感度の検出器が紫外光検出器であり、高感度の検出器が蛍光検出器であることを特徴とする、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
試料が被験対象から採取された体液である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法に使用するキットであって、内部標準物質を含有する試薬および単糖の蛍光標識に必要な試薬を含む、前記キット。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載の方法により、被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースを測定することを含む、糖尿病または前糖尿病状態を鑑別する方法。
【請求項１】
試料中の単糖を標識化し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のシステムにより標識化グルコースと標識化マンノースを測定することからなる、試料中のグルコースと試料中のマンノースを同時に測定する方法。
【請求項２】
ＨＰＬＣのシステムが低感度の検出器と高感度の検出器を備える検出装置を有し、低感度の検出器によって標識化グルコースとその内部標準物質の標識化単糖を検出し、高感度の検出器によって標識化マンノースとその内部標準物質の標識化単糖を検出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単糖の還元末端を化学的に標識化する蛍光試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
単糖の還元末端をアミノベンジル化またはアミノピリジル化する標識化試薬を用いて試料中の単糖を標識化することを特徴とする、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
標識化試薬が４−アミノ安息香酸エチルエステル（ＡＢＥＥ）であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
低感度の検出器が紫外光検出器であり、高感度の検出器が蛍光検出器であることを特徴とする、請求項２から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
試料が被験対象から採取された体液である、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の方法に使用するキットであって、内部標準物質を含有する試薬および単糖の蛍光標識に必要な試薬を含む、前記キット。
【請求項９】
請求項１から７のいずれかに記載の方法により、被験対象から採取された体液中のグルコースとマンノースを測定することを含む、糖尿病または前糖尿病状態を鑑別する方法。
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図１】
【公開番号】特開２００７−２１２２３５（Ｐ２００７−２１２２３５Ａ）
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３１１７５（Ｐ２００６−３１１７５）
【出願日】平成１８年２月８日（２００６．２．８）
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月８日（２００６．２．８）
【出願人】（８０３００００３４）学校法人日本医科大学 (37)
【Ｆターム（参考）】
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