ミエリン形成を増加させるための、ＭＭＰ２８阻害剤の使用
本発明は、ミエリン形成を増加させるための、ＭＭＰ２８阻害剤（例えば抗ＭＭＰ２８抗体）の使用に関する。本発明の方法は、脱髄又は不十分なミエリン形成疾患、障害又は症状を有する患者にＭＭＰ２８阻害剤を投与することにより行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢神経系及び中枢神経系のミエリン形成を増加させるためのＭＭＰ２８阻害剤の使用に関する。本発明の方法は、脱髄又は不十分なミエリン形成による障害、疾患又は症状に罹患する患者に、ＭＭＰ２８阻害剤（例えば抗ＭＭＰ２８抗体）を投与することにより達成される。
【背景技術】
【０００２】
ミエリン（脂質及びタンパク質リッチな物質）は、脊椎動物の中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の双方の多くのニューロンの軸索を囲み、それによりミエリン鞘を形成する。ミエリンは、軸索周辺の絶縁物質として機能し、軸索に沿った神経インパルスの効果的な伝導を促進する機能を果たす。
【０００３】
脱髄とは、ミエリン鞘を囲んでいる軸索の正味の分解又は破壊であり、それによりシグナルの混乱が生じる。ＣＮＳ脱髄は、多発性硬化症、癲癇、横脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経障害及び副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）など、特定の神経変性疾患において特徴的にみられる。ＣＮＳ脱髄はまた、特定の毒素（例えば重金属、金属キレート剤、タキソール、スラミン及びリゾレシチン）への暴露、又は特定のウイルス（例えばＨＩＶ及びヘルペスウイルス）又はミコバクテリウム（らい菌）への感染の結果、生じうる。自閉症、注意力欠陥／活動亢進障害、統合失調症、双極性障害、鬱状態及びアルツハイマー疾患などの特定の精神障害は、ＣＮＳにおける不十分なミエリン形成又は脱髄に関係している。
【０００４】
ＰＮＳ脱髄は、多くの疾患、障害又は症状に関連している（糖尿病性神経障害、ギラン−バレー病（急性脱髄性多発神経炎）、慢性炎症性脱髄多発神経根筋障害（ＣＩＰＤ）及びＨＩＶ炎症性脱髄性疾患など）。物理的な外傷による軸索損傷もまた、ＰＮＳ及びＣＮＳの脱髄を生じさせうる。
【０００５】
脱髄又は不十分なミエリン形成、疾患、障害又は症状が、世界的に何百万もの人々に影響を及ぼしているにもかかわらず、その治療は限られている。例えば、幾つかのタイプの治療（主に免疫系抑制剤）が、多発性硬化症の治療にとり有用であることが解っているが、それらは数的にも、有効性においても、また場合によっては毒性効果により、制限されている。特定の脱髄疾患（例えばＡＬＤ）では、食事を制限することによって、限られた範囲で治療が成功したが、この方法は、疾患徴候の発症前に使用される場合に最適である。特定のタイプの脱髄疾患（例えば白質萎縮症）の場合、骨髄移植によって進行を遅延させることができるが、その疾患は主に対症療法的に治療される。
【０００６】
マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、幾つかの細胞表面及び細胞周囲タンパク質と同様に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を分解できるエンドペプチターゼのファミリーの一部を構成する。ＭＭＰはまた、成長の間、及び成人期における多くのプロセス、特にＥＣＭのリモデリングのプロセスを調整する。ＭＭＰは幾つかの共通の構造的特徴を共有し、ＥＣＭに関連する機能を一般に有するにもかかわらず、それらは別個の機能を果たす。ＭＭＰ２８（またエピライシンとも呼ばれる）は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーの最新のメンバーである。国際公開第０２／２０７３９号パンフレット（特許文献１）は、別の２つの形態のＭＭＰ２８をコードする核酸分子を開示している。ＭＭＰ２８の機能はよくわかっていないが、特定の細胞タイプにおけるＭＭＰ２８増加が、損傷の修復、骨関節炎及びある種の癌などの幾つかの疾患状態と関連している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／２０７３９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＣＮＳ及び／又はＰＮＳにおける脱髄又は不十分なミエリン形成を特徴とする疾患、障害又は症状に対するさらなる治療法に対する切実なニーズが存在する。ミエリン形成を促進するための治療は、現在限られている。本願では、ＭＭＰ２８阻害剤（特に抗ＭＭＰ２８抗体）がミエリン形成を増加させ、それにより、多くの困難な神経系疾患、障害又は症状の治療に使用できるという、予想外の発見に関して記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＭＭＰ２８がミエリンを分解させ、またＭＭＰ２８の阻害剤がＣＮＳ及びＰＮＳにおけるミエリン形成を増加させるという発見に関する。かかる阻害剤としては、例えば抗ＭＭＰ２８抗体、小分子、ペプチド、リボザイム又はアンチセンス分子などが挙げられる。
【００１０】
したがって、本発明は、ヒトの患者におけるミエリン形成を増加させるための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤（例えば抗ＭＭＰ２８抗体、小分子、ペプチド、リボザイム又はアンチセンス分子）の使用に関する。一態様では、本発明は、ヒトの患者におけるミエリン形成を増加させるための医薬の製造における、抗ＭＭＰ２８抗体の使用に関する。
【００１１】
本発明は、糖尿病性神経障害、急性脱髄性多発神経障害、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害、ＨＩＶ炎症性脱髄性疾患、ヘルペスウイルス感染、ハンセン病、物理的外傷による軸索損傷又は軸索損傷による痛覚増加の治療用医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）の使用を包含する。
【００１２】
本発明は更に、多発性硬化症、白質萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病又は脊髄損傷の治療用医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）の使用を包含する。
【００１３】
本発明はまた、アルツハイマー疾患、統合失調症、うつ病、双極性障害又は注意欠如多動性障害の治療用の医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）の使用を包含する。
【００１４】
本発明の一態様は、ヒトの患者に有効量のＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）を投与することを含んでなる、ミエリン形成の増加により恩恵を受ける、疾患、障害又は症状を有するヒトの患者においてミエリン形成を増加させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは全長のヒトプロＭＭＰ２８タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列を示す。活性型ＭＭＰ２８を生成するために除去される配列が下線で示されている。メタロプロテアーゼ活性部位（アミノ酸２４０−２５０）を太字で示す。フューリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位はアミノ酸１１８−１２２の範囲である。図１Ｂは活性型のヒトＭＭＰ２８のアミノ酸配列を示す（配列番号７）。
【図２】ツメガエル（Ｘ）（配列番号４）、ヒト（Ｈ）（配列番号１）、マウス（Ｍ）（配列番号５）、ラット（Ｒ）（配列番号６）の全長プロＭＭＰ２８タンパク質のアミノ酸配列、並びにＸ、Ｈ、Ｍ及びＲにおける共通のアミノ酸配列（Ｃ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＭＭＰ２８タンパク質が特定のミエリン付随タンパク質を分解させ、またＭＭＰ２８の阻害剤、特に抗ＭＭＰ２８抗体が、ＣＮＳ及びＰＮＳにおいてミエリン形成を増加させるという発見に基づく。
【００１７】
「ＭＭＰ２８」とは、特に明記しない限り活性型のＭＭＰ２８タンパク質を指す。活性型のヒトＭＭＰ２８タンパク質（全長型のフューリン切断によって生じる）は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する。全長型のヒトＭＭＰ２８は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。プロペプチド領域（図１Ａの下線部）は、フューリンによる切断により除去され、活性型のタンパク質が生成する。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「患者」とは、哺乳動物（好ましくはヒト）を指す。特定の態様では、当該患者は更に、ＣＮＳ又はＰＮＳにおけるミエリン形成の増加により恩恵を受けるような、疾患、障害又は症状を有することを特徴とする。
【００１９】
「脱髄」とは、既存のミエリンの正味の分解又は破壊を指す。
【００２０】
「不十分なミエリン形成」とは、ミエリンの通常の活性を機能させるのに充分な程の、軸索を囲むミエリンが存在しないことを指す。
【００２１】
「ミエリン形成の増加」の効果を有する薬剤は、患者への当該薬剤の投与の後、軸索に付随するミエリンの正味の量を増加させる。軸索と関連するミエリンの量は、公知技術の方法（例えば磁気共鳴映像法、特に拡散テンソルイメージング）により測定することができる。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「抗体」（抗ＭＭＰ２８抗体に関連する）とは、ＭＭＰ２８（好ましくはヒトＭＭＰ２８）と結合する、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体のことを指す。本明細書の用語「モノクローナル抗体」とは、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を指す。「モノクローナル抗体」とは、単一のコピー又はクローンに由来する抗体（例えば原核生物、真核生物又はファージのクローン）のことを指し、それを得るための方法を指すものではない。
【００２３】
本明細書で用いられる「抗体」は、（ｉ）完全抗体（２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を含む）、（ｉｉ）抗原結合部を含んでなる抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２）、又は、（ｉｉｉ）リンカー配列と共に軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をコードするＤＮＡを結合することによって得られる、単鎖Ｆｖ断片、であってもよい（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ２６９−３１５，１９９４を参照）。抗原結合断片が特定されているか否かに関係なく、特に明記しない限り、本明細書で用いられる用語「抗体」とは、かかる断片並びに単鎖形態のものを含むものと理解される。抗体タンパク質がＭＭＰ２８との結合能力を保持する限り、それは本明細書で用いられる用語「抗体」又は「抗ＭＭＰ２８抗体」の範囲に含まれる。
【００２４】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、少なくとも１つの部分がヒト起源である抗体を意味する。例えば、ヒト化抗体はヒト以外の起源（例えばマウス）の抗体に由来する部分、及びヒト起源の抗体に由来する部分を含んでもよい。
【００２５】
ヒト化抗体を調製するための、当該技術分野で利用できる様々な方法が存在する。例えば、ヒト化抗体は、ＭＭＰ２８と結合する親抗体（例えばマウス抗体又はハイブリドーマによって得られる抗体）のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードする核酸配列を得るステップと、前記ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲｓ（非ヒト）を同定するステップと、かかるＣＤＲをコードする核酸配列を、選択されたヒトフレームワークをコードする核酸配列に融合させるステップと、により調製してもよい。任意に、フレームワーク領域にＣＤＲ領域をグラフティングする前に、ランダムに又は特定の部位で突然変異を生じさせ、ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することにより、ＣＤＲ領域を最適化してもよい。あるいは、ヒトフレームワーク領域への挿入の後に、当業者に公知の方法を使用してＣＤＲ領域を最適化してもよい。
【００２６】
マウス抗体のヒト化に関係する方法として、例えばＱｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２８６９，１９９１、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６））、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８））、及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８））などの文献に記載の方法を更に使用してもよい。
【００２７】
ヒト抗体とは、抗原感作に応答して特異的なヒト抗体を産生するために設計されたトランスジェニックマウスから得られる抗体である。完全なヒト抗体を産生するための１つの方法として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）のマウスの系統（それらのゲノム内にヒト重鎖及び軽鎖の遺伝子が含まれるように設計されている）を用いることが挙げられる（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５７，１９９７などを参照）。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）の系統は、Ａｂｇｅｎｉｘ社から入手可能である。
【００２８】
本発明は、患者のミエリン形成を増加させるための医薬の製造のための、抗ＭＭＰ２８抗体の使用に関する。好ましくは、上記患者はヒトである。
【００２９】
好ましい態様では、抗ＭＭＰ２８抗体はモノクローナル抗体（より好ましくはヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体）である。他の好ましい態様では、抗ＭＭＰ２８抗体は配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する。
【００３０】
一態様では、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）は、患者に投与することにより、ＣＮＳのミエリン形成を増加させることができる。好ましくは、上記患者は、ＣＮＳにおける脱髄又は不十分なミエリン形成により特徴づけられる疾患、障害又は症状を有するヒトの患者である。かかるＣＮＳにおける疾患、障害又は症状としては、限定されないが多発性硬化症、癲癇、白質萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病及び脊髄損傷が挙げられる。白質萎縮症はほとんどが遺伝性の障害であり、例えば副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフフィー、クラッベ病、ペリツェウス・メルツバッハ病、中枢低ミエリン形成を伴う小児期運動失調、カナバン病、アレキサンダー病、レフサム病及び脳腱黄色腫症などが挙げられる。更に、特定の精神状態又は障害（例えばアルツハイマー疾患、統合失調症、うつ病、双極性障害及び注意欠如多動性障害）が、不十分なミエリン形成及び／又は脱髄によって特徴づけられるという証拠が多く得られている。患者（好ましくは上述した疾患、障害又は症状のうちの少なくとも１つを有するヒトの患者）のＣＮＳにおけるミエリン形成を増加させるための医薬の製造のための、抗ＭＭＰ２８抗体の使用が本発明に包含される。
【００３１】
一態様では、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）は、患者に投与されることにより、ＰＮＳにおけるミエリン形成を増加させることができる。好ましくは、上記患者は、ＰＮＳにおける脱髄又は不十分なミエリン形成によって特徴づけられる疾患、障害又は症状を有するヒトの患者である。かかる疾患、障害又は症状としては、糖尿病性神経障害、ギラン・バレー病（また急性脱髄性多発神経障害とも呼ばれる）、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害（ＣＩＰＤ）、ＨＩＶ炎症性脱髄性疾患、ヘルペスウイルス感染、物理的外傷による軸索損傷（例えばウォーラー変性）、ハンセン病、及び軸索損害による痛覚の増加などが挙げられる。患者、好ましくは上述した疾患、障害又は症状のうちの少なくとも１つを有するヒトの患者のＰＮＳにおけるミエリン形成を増加させるための医薬の製造のための、抗ＭＭＰ２８抗体の使用が本発明に包含される。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、抗ＭＭＰ２８抗体を含んでなる医薬組成物を、ミエリン形成を増加させるために、患者に、有効量で投与する。好ましくは、上記医薬組成物は、同質のまたは実質的に同質の抗ＭＭＰ２８抗体の集団と、薬理学的に許容できる担体又は希釈剤と、を含んでなる。本明細書で用いられる用語「薬理学的に許容できる担体」とは、活性薬剤のための、非毒性の、一般的に不活性なビヒクルのことを意味し、それは該薬剤、又は上記組成物が投与される患者に対して悪影響を与えない。適切なビヒクル又は担体は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）に記載されている。かかる担体としては、例えば水溶液（例えばバッファ及び生理的食塩水）が挙げられる。更に、上記担体は、製剤のｐＨ、浸透性、粘性、透明性、着色性、無菌性、安定性又は溶解速度を改変若しくは維持するための、他の薬理学的に許容できる賦形剤を含有してもよい。
【００３３】
医薬組成物は、製造条件下、及び提供される容器（例えば密封されたバイアル、シリンジ又は他の送給装置（例えばペン））中での保存条件下で、無菌及び安定でなければならない。したがって、医薬組成物は、製剤化した後にフィルターで滅菌してもよく、又はさもなければ微生物学的に許容できるようにするのが好ましい。
【００３４】
抗ＭＭＰ２８抗体を含有する医薬組成物を投与する方法は、静脈内投与、皮下投与、頭蓋内投与、クモ膜下腔内投与、頭蓋内投与若しくは筋肉内投与であってもよい。多発性硬化症などの特定の疾患では、静脈ルートによる抗体の送達を促進する血液脳関門の破綻が生じうる。破綻していない血液脳関門を特徴とする他の疾患、障害又は症状の場合、薬理学的製剤を投与する好適な手段は、カテーテル及びポンプを用いて直接頭蓋内脳室注入を経て脳に注入することである。
【００３５】
「有効量」とは、投与を受けた患者のＣＮＳ及び／又はＰＮＳにおいてミエリン形成を増加させるのに必要な量（投与量、投与期間及び投与手段）を指す。抗ＭＭＰ２８抗体の有効量は、例えば疾患の段階、年齢、性別、個人の体重、投与手段及び個人において所望の反応を誘発する抗体の能力などの要因に応じて適宜変化させることができる。また有効量とは、上記治療的に有益な効果が、抗体による毒性効果若しくは有害なあらゆる効果を上回るときの量のことである。
【００３６】
有効量とは、少なくとも治療効果を患者に与えるのに必要な最小の投与量であり、かつ、毒性量より少ない投与量のことである。換言すると、抗ＭＭＰ２８抗体の有効量は、好ましくはヒトにおいて、（ｉ）ＰＮＳにおいてミエリン形成を増加させ、及び／又は、（ｉｉ）ＣＮＳにおいてミエリン形成を増加させる、量のことである。
【００３７】
医学の分野で周知のように、患者への投与量は、患者の体のサイズ、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与時間及び経路、投与の頻度、健康状態及び並行して投与される他の薬剤、などの多くの要因に依存する。更に投与量は、疾患の種類及び重篤度に応じて変化させてもよい。典型的な投与量は、例えば０．００１〜１０００ｍｇの範囲であってもよいが、特に上記の要因を考慮して、この典型的な範囲以下又は以上の投与量となってもよい。毎週の非経口投与レジメは、総体重に対して約０．１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。定期的な評価を行うことにより進行をモニターしてもよく、またそれに従い投与量を調整してもよい。
【００３８】
示唆されたこれらの抗体の量は、多くの場合、医師の裁量の範囲内で決定される。適当な投与量及びスケジューリングを選択する際の鍵となる要因は、得られる結果である。この場合に考慮される要因としては、治療しようとする具体的な障害、個々の患者の治療条件、障害の原因、抗体を送達する部位、抗体の具体的なタイプ、投与方法、投与レジメ及び医師にとり公知の他の要因が挙げられる。
【００３９】
ＣＮＳ及びＰＮＳにおいて発現されるＭＭＰ２８
ＭＭＰ２８の空間的−時間的局在化を、発生中のマウス胚を用いて評価した。全胚の断片を、胎児日齢１０（Ｅ１０）〜Ｅ１７まで毎日固定し、ＭＭＰ２８タンパク質に関して染色した。標準的な免疫組織化学的な方法を使用した結果、ＭＭＰ２８タンパク質の濃度及び局在化状態が、発生段階に応じて変化することが解った。Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ社製のＣＬ２ＭＭＰ−２８を抗ＭＭＰ２８抗体として使用した。二次的抗体及びペルオキシダーゼ標識化は、ベクタステインＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ社製）に従って実施した。
【００４０】
Ｅ１０〜Ｅ１２において、ＭＭＰ２８発現は、胚全体にわたって少なかった。Ｅ１３から、ＭＭＰ２８発現が増加し、発生中の脊髄において最も強い染色が見られた。Ｅ１３では、四肢の神経におけるＭＭＰ２８発現は未だ見られなかった。Ｅ１４では、神経系全体にわたってＭＭＰ２８の発現が劇的に増加した。後期の発生段階（Ｅ１５〜Ｅ１７）の間において、神経に関連するＭＭＰ２８は減少したが、ＣＮＳ全体にわたっては依然として検出可能であった。神経系におけるＭＭＰ２８の発現が、ＣＮＳ及びＰＮＳにおいて見られた。身体全体の神経と同様に、四肢内の神経では、Ｅ１４において、ＭＭＰ２８が発現することが明らかとなった。ＭＭＰ２８は、ＣＮＳ内では、脳及び脊髄において強く発現された。また脳神経がＭＭＰ２８を発現することも解った。また、免疫蛍光顕微鏡及び共焦顕微鏡により検出した結果、ＭＭＰ２８が１２週齢のマウスの脊髄において発現されることも解った。
【００４１】
ＭＭＰ２８による、特定のミエリン付随タンパク質の分解
神経細胞外環境でのＭＭＰ２８切断活性から得られるポリペプチドを同定した。ツメガエル属ＭＭＰ２８（ＸＭＭＰ２８）と哺乳類ＭＭＰ２８との間の保存された発現パターン、及びアミノ酸配列レベルの類似性（図２を参照）から、ツメガエル属ＭＭＰ２８及び哺乳類のＭＭＰ２８は、同じ若しくは類似する基質を切断すると考えられる。全長のＸＭＭＰ２８は、全長のヒトＭＭＰ２８と５６％同一であり、また全長のマウスＭＭＰ２８と５５％同一である。ＸＭＭＰ２８は、その哺乳類の対応物と同様に、シグナル配列、及び抑制性システインスイッチを含むプロドメイン、並びにそれに続く触媒ドメイン及びＣ末端のヘモペキシン様ドメインからなる。ツメガエル属、マウス及びヒトＭＭＰ２８全体のホモロジーは、推定の機能領域の中で最も高い：触媒ドメイン（６５％同一性）、抑制性システインスイッチ（８５％同一性）及びフューリン切断シグナル（１００％同一性）。
【００４２】
ツメガエル属ＭＭＰ２８（ＸＭＭＰ２８、配列番号４）を、３７℃で２４時間、ロングエバンスラットのＥ１７脳由来の組織と共に、プロテアーゼバッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＢｒｉｊ−３５及び１０μＭ ＺｎＣｌ２）中でインキュベートした。脳消化物を次に、３ｋＤａフィルタを通して遠心分離し、残渣及び大分子のタンパク質を除去した。フロースルー中に入る小分子ペプチドをトリプシンで処理してペプチドのサイズを減少させ、次に液体クロマトグラフィによりペプチドを分離し、更にそれに続くペプチド質量分析でＸＭＭＰ２８分解の後に生じるペプチドを同定した。ミエリンの成分であるＮｏｇｏ−Ａ（主にＣＮＳ発現と関連する）（ＲＧＳＧＳＶＤＥＴＬＦＡＬＰＡＡＳＥＰＶＩＰＳＳＡＥＫＩ、配列番号９）、及びＣＮＳ及びＰＮＳの両方において発現される神経細胞接着分子（すなわちＮＣＡＭ−１）（ＫＳＥＰＱＥＳＥＡＫＰＡＰＴＥＶＫＴ、配列番号８）に対応するペプチドの分解産物は、ＸＭＭＰ２８で処理されたサンプルにおいて特異的に同定されたが、酵素を含まないコントロールサンプルではそれは失われたか又は相対的に低い発見量であった。
【００４３】
これらのＸＭＭＰ２８／脳消化物中のミエリン付随タンパク質Ｎｏｇｏ−Ａ、ＮＣＡＭ−１、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質及びミエリン付随グリコプロテイン（すなわちＭＡＧ）のウエスタンブロット分析を実施し、ＸＭＭＰ２８とのインキュベートによりこれらのタンパク質の分解が生じるか否かを解析した。ＮＣＡＭ−１及びＭＡＧと同様に、全長Ｎｏｇｏ−Ａタンパク質は、ＸＭＭＰ２８処理された脳サンプルにおいて減少していた。分解は、特定のミエリンタンパク質に限られていた。ミエリン塩基性タンパク質及びＰＬＰは、このアッセイにおいてサイズが減少しなかった。したがって、ＭＭＰ２８はＮｏｇｏ−Ａ、ＮＣＡＭ−１及びＭＡＧを切断する。
【００４４】
ＭＭＰ２８ポリクローナル抗体の生成
２つの異なるペプチド（ｉ）ＦＡＫＱＧＮＫＷＹＫＱＨＬＳＹＲＬ（配列番号２）及び（ｉｉ）ＫＲＬＧＲＤＡＬＬＳＷ（配列番号３）に対するポリクローナル抗体を、ウサギ体内で産生させた。これらのペプチドは、ヒトＭＭＰ２８中には存在するが、他の周知のヒトタンパク質（他のあらゆるヒトＭＭＰタンパク質も含む）には存在しない。したがって、これらのペプチドにより産生される抗体は、他のいかなるＭＭＰタンパク質とも結合するとは考えられない。配列番号２のペプチドは、配列番号１の全長ヒトＭＭＰ２８のアミノ酸１２３−１３９にわたるものである。配列番号３のペプチドは、配列番号１の全長ヒトＭＭＰ２８のアミノ酸２６３−２７３にわたるものである。ＳＷＩＳＳ−Ｍｏｄｅｌを使用したヒトＭＭＰ２８構造のコンピュータモデルによる予測によると、これらの２つのペプチドは、ヒトＭＭＰ２８タンパク質の表面に存在し、メタロプロテアーゼ活性部位の反対側に位置する。
【００４５】
各々のペプチドを合成し、ＫＬＨとコンジュゲートさせ、標準的な免疫方法を使用してウサギに注射した。免疫化したウサギの血清中に得られるＭＭＰ２８抗体を、標準的な親和性クロマトグラフィ技術を使用して、得られるペプチドに対するアフィニティ精製に供した。２回目の抗体精製を、Ａｂ Ｓｐｉｎ Ｔｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）中で、プロテインＧセファロースを使用して実施した。抗体を、８００μＬの０．１ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）で溶出させ、６０μＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。精製された抗体の濃度を分光光度計で測定した結果、２６０ｎＭであった。
【００４６】
ウサギにより生成された抗体（ＡＢ１８３及びＡＢ１８０）は、ウエスタンブロット分析により示されるとおり、精製ヒトＭＭＰ２８とは結合したが、ヒトＭＭＰ２とは結合しなかった。ＡＢ１８３は、配列番号２に示される配列を基に産生され、またその配列のポリペプチドと結合し、各々独立に、ヒトＭＭＰ２８タンパク質の範囲内に包含される。ＡＢ１８０は、配列番号３に示される配列を基に産生され、またその配列のポリペプチドと結合し、各々独立に、ヒトＭＭＰ２８タンパク質の範囲内に包含される。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例は、単に説明を目的として記載するものであって、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【００４８】
実施例１：ＡＢ１８３及びＡＢ１８０は in vitro でＭＭＰ２８活性を阻害する
このアッセイは、ペプチド基質に対する精製ヒトＭＭＰ２８タンパク質（全長型及び活性化型の混合物）の活性、並びに抗ＭＭＰ２８抗体（ＡＢ１８３及びＡＢ１８０）のＭＭＰ２８活性を調整する能力を測定するものである。精製ＭＭＰ２８を蛍光生成ｐａｎ−ＭＭＰ基質とインキュベートした後、蛍光の増加を測定した。ヒトＭＭＰ２を、陽性コントロールとして使用した。ＯＭＮＩ−ＭＭＰ（商標）（大部分のＭＭＰｓに対する、十分にクエンチされた蛍光生成ペプチド基質（Ｂｉｏｍｏｌ社製、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ））を、２０ｍＭにＤＭＳＯ中で希釈した後、これらのアッセイに使用した。
【００４９】
試験に供するＭＭＰタンパク質（すなわちＭＭＰ２８又はＭＭＰ２）を、２回精製したＡＢ１８０又はＡＢ１８３の有りまたは無しで、最終的に５０μＬの体積になるように水と混合し、ＭＭＰタンパク質を２０ｎＭ、抗体を６０ｎＭ若しくは１０ｎＭの濃度とした。ＭＭＰ／ＡＢ混合物を、一定に振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした。次に蛍光生成ペプチド基質を、１０×プロテアーゼ アッセイバッファと共に、ＭＭＰ／ＡＢ混合物に１０μＭの最終濃度となるように添加し、最終的な１００μＬの反応液を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＢｒｉｊ−３５及び１０μＭ ＺｎＣｌ２の組成とした。反応は、アルミホイルでおおわれた黒い９６穴プレートにおいて実施し、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。次に、１秒／ウェルで、３４０ｎｍ励起・４０５ｎｍ放出で蛍光測定した。
【００５０】
ＭＭＰ２８は、０ｎＭ〜８０ｎＭで試験したとき、単独で、投与量依存的に基質を切断した。同様の結果が、ＭＭＰ２単独の場合でも得られた。５ｎＭ（１００μＬ反応液中）の最終濃度のＡＢ１８０により、基質のＭＭＰ２８による切断が約６６％阻害され、一方、３０ｎＭの最終濃度のＡＢ１８０により、基質のＭＭＰ２８による切断が約９８％阻害され、それらが蛍光の減弱として反映された。５ｎＭの最終濃度のＡＢ１８３により、基質のＭＭＰ２８による切断が約６０％阻害され、一方、３０ｎＭの最終濃度のＡＢ１８３により、基質のＭＭＰ２８による切断が約６９％阻害された。両方の抗体の使用により、１０ｎＭのＭＭＰ２８単独使用の場合と比較し、顕著に基質の切断を減少させた（ｐ＝＜０．０５）。ＡＢ１８０又はＡＢ１８３をＭＭＰ２と共に使用したとき、基質の切断の検出可能な阻害が観察されなかった。
【００５１】
実施例２：ＭＭＰ２８阻害剤（ＡＢ１８０及びＡＢ１８３）はミエリン形成を増加させる
ミエリン形成している後根神経節（ＤＲＧ）の培養組織を、Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｅｎ、Ａ．その他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．７２：５６５−５７３（２００３）に記載の方法に従い確立した。妊娠したロングエバンスマウスから、妊娠１７日目で胚を分離し、冷却したＬ１５培地に置いた。後根神経節を脊椎から取り除き、６０ｍｍのシャーレ中の２ｍｌのＬ１５培地中に置き、３７℃で１５分間、０．２５％のトリプシンで処理した。ピペットの先端を使用して細胞を分離させ、顕微鏡検査により分離を観察した。細胞を次に、３回、１０％のウシ胎児血清を有するＬ１５培地で洗浄し、１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）及び２％のＢ２７サプリメント（成長培地）を有するＮｅｕｒａｌｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、２１１０３）中に再懸濁した。細胞を４日間増殖させ（５％のＣＯ２中、３７℃）、新鮮な成長培地（アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ含む）を次に添加し、ミエリン形成を開始させ、２〜３日毎に培地を交換した。
【００５２】
これらの実験において、軸索関連のミエリン付随糖タンパク質（ＭＡＧ）を、初期のミエリン形成（Ｏｗｅｎｓ及びＢｕｎｇｅ（Ｇｌｉａ２）：１１９−１２８、１９８９）のバイオマーカーとして使用した。ＭＭＰ２８及びＭＡＧの神経における発現を、抗ＭＡＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）又は抗ＭＭＰ２８抗体（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ社製）を用いた、標準的な免疫組織化学技術によりモニターした。ミエリン形成の開始前、並びにミエリン形成の開始後１日及び３日において、ＤＲＧ培養組織（膠細胞（すなわちミエリン生成シュワン細胞）又は軸索）における検出可能なＭＡＧが見られなかった。しかしながら、軸索において、観察可能なＭＭＰ２８のベースラインレベルが存在した。ＭＭＰ２８は、膠細胞において全く観察されなかった。ミエリン形成の開始の６日後に、ミエリン形成の初期段階が、膠細胞中のＭＡＧの存在（特に神経−膠細胞が相互作用する幾つかの部位に沿って）として検出できた。この成長段階で、ＭＭＰ２８レベルは顕著に低下しなかった。ミエリン形成の開始の１４日後に、ＭＡＧの軸索における凝集及びＭＭＰ２８レベルの実質的な減少が見られた。したがって、ミエリン形成が進行しないとき、ＭＭＰ２８レベルはベースラインに留まり、またＭＡＧは検知不能なレベルであるが、ミエリン形成が進行する（すなわちミエリン形成が増加する）とき、ＭＭＰ２８レベルは減少し、ＭＡＧレベルは増加する。
【００５３】
６日目における、３０ｎＭの濃度での培養組織へのＡＢ１８０又はＡＢ１８３の添加により、軸索関連ＭＡＧの増加が生じ、それは２４時間後に、免疫組織化学染色により観察することができる。ＡＢ１８０及びＡＢ１８３の効果は、処理された及び未処理のウェル中の、ＭＡＧ染色で陽性の軸索束の数を計数することによって定量化できる。７日目において、合計６つのウェル中の軸索束の数（抗体処理の有無において）を合計した。得られる数値を下記の表１に示す。これらのデータは、ＭＭＰ２８抗体が、軸索関連ミエリンの形成を著しく強化することを証明するものである（ｐ＝＜０．０５）。このアッセイを用いることにより、あらゆる候補ＭＭＰ２８阻害剤を試験することができる。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実施例３：ｉｎ ｖｉｖｏクプリゾンアッセイ
マウスに、３〜１３週間にわたり、食餌中に０．２％のクプリゾンを添加して摂取させた。この毒素の使用により、脳梁及び脊髄などの、脳内のミエリン形成が高度になされる領域において脱髄がなされる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ ＧＫら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２００１；１１：１０７Ｙ１６）。脱髄の検出は、脳梁のＭＲＩ又は組織学的解析により実施できる。クプリゾンを食餌から除去したときに再ミエリン形成がなされ、また短い期間処理されたマウスにおいては、より高いミエリン形成が見られた。ミエリン形成の強化を、放射線学的評価並びに組織学的評価によって、この再ミエリン形成期間に評価した。腹腔内注射によって抗体処理を行った。特にＭＭＰ２８と結合する抗体が、再ミエリン形成を強化又はミエリン形成を促進すると考えられた。
【００５６】
実施例４：ＭＳ病変におけるＭＭＰ２８発現
Ａ．ヒトの脳病変
この実施例は、通常の脳組織と比較して、多発性硬化症（ＭＳ）に罹患するヒト患者のヒト脳病変では、ＭＭＰ２８タンパク質濃度が高くなることを示すものである。ヒトＭＳ患者（Ｂｉｏｍａｘ社製、Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）由来の５μｍの冷凍小脳組織切片を室温に解凍し、５６℃で１６時間、０．１％のＬｕｘｏｌファストブルー溶液（０．１ｇのＬｕｘｏｌファストブルー（Ａｃｒｏｓ社製）、０．５ｍｌの酢酸、９５％エタノールで１００ｍｌに調製）中に置いた。スライドを次にＬｕｘｏｌファストブルーから取り出し、９５％エタノールで洗浄し、蒸留・脱イオン水（ｄｄＨ２Ｏ）でリンスし、３０秒間、０．０５％の炭酸リチウム（Ａｃｒｏｓ社製）で分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）させた。分化させた後、スライドを更にｄｄＨ２Ｏでリンスし、顕微鏡で観察し、白質の分化を確認した。スライドを更に、４０秒間、０．１％のＣｒｅｓｙｌ ｅｃｈｔ ｖｉｏｌｅｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中でインキュベートし、核及び灰白質を対比染色した。過剰なＣｒｅｓｙｌ ｅｃｈｔ ｖｉｏｌｅｔを、ｄｄＨ２Ｏを用いてスライドから除去した。スライドを、５分間の９５％エタノール処理、次に１００％エタノール及びキシレンで順次脱水処理することによって識別した。Ｐｅｒｍｏｕｎｔを使用して、カバーグラスの下に上記断片を永久的に固定した。倒立顕微鏡を使用して、顕微鏡検査法により組織を分析した。ＭＳ病変内におけるタンパク質発現の変化を同定するため、ＭＭＰ−２８（Ｃｅｒｄｅｒｌａｎｅ社製）及びＭＡＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）と反応する抗体を用いた標準的な技術による免疫組織化学的な解析を実施した。核を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、Ｓｉｇｍａ社製）により対比染色した。
【００５７】
多発性硬化症患者から得た小脳病変において、上記の染色を実施し、ミエリン形成が減少した病変を、Ｌｕｘｏｌブルー染色によって同定した。より詳細なＬｕｘｏｌブルー染色により証明されるように、これらの領域は、ミエリン形成がなされ、通常のミエリン形成された組織によって囲まれている小脳領域であると考えられた。ミエリンの減少を確認するため、更に、ミエリンタンパク質であるミエリン付随糖タンパク質（ＭＡＧ）に関して、連続する次の断面で免疫組織化学を実施した。予想通り、Ｌｕｘｏｌブルー染色によって通常どおり同定される領域でＭＡＧタンパク質が強く発現され、通常のミエリン形成が示された。同定されたＭＳ病変の境界内部においては、ＭＡＧ染色は実質的に減少していた。ＭＭＰ−２８に対する免疫組織化学を、同じ断面において実施した。小脳の通常の領域全体にわたり、軸索関連のＭＭＰ−２８染色は同定されなかったが、ＭＳ病変の全体にわたっては、ＭＭＰ−２８に関する染色で陽性を示した軸索であると形態学的に推定される多数の構造が見られた。ＭＡＧ染色については、これらの構造との共局在化は見られなかった。これらの結果は、通常のミエリン化小脳におけるＭＭＰ−２８の発現が顕著なレベルではなかったが、脱ミエリン化領域では、ＭＭＰ−２８が発現している脱ミエリン化軸索が存在することを示した。
【００５８】
Ｂ．ＥＡＥモデル脊髄病変
ＥＡＥとは、ヒトのＭＳモデルとして有用な、ＣＤＲ＋Ｔ細胞媒介性の中枢神経系の脱髄疾患である。ヒトＭＳ患者の脊髄病変について記載している最近のレビューでは、かかる病変が疾患症状と顕著に相関することを強調している（Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ７：１２０３−１２１１，２００７）。氷上での超音波処理によりＣＦＡ中でＨ３７ ＲＡ／ＰＢＳ（１：１）と共に乳化させた２．５ｍｇ／ｍｌのＨ３７ ＲＡ粉末（５ｍｇ／ｍｌ、Ｄｉｆｃｏ＃２３１１４１）及び１．５ｍｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５（ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、ＰＭＧ−３６６０−ＰＩ）を含有するフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）２００μＬを用いて、約８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに対し、０日目及び７日目に右側腹部の皮下に免疫して疾患を誘導した。百日咳毒素（２．５μｇ／ｍｌの２００μＬ）を、０日目に第１次免疫として、更に第１次免疫後４８時間に再び投与した。
【００５９】
病態を進行させ、免疫の４週間後（動物の運動制御機能が低下する時期）にマウスを安楽死させた。安楽死の際に脊髄を摘出し、長手方向の脊髄断片を、抗ＭＡＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）及び抗ＭＭＰ２８抗体（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ社製）を用いて、標準的な免疫組織化学法を使用して染色した。ＥＡＥマウスの脊髄内の軸索ではＭＭＰ２８が発現しており、またこのＭＭＰ２８発現は、薄いＭＡＧで囲まれているか又はＭＡＧで囲まれていない軸索中で見られた。ＭＭＰ−２８陽性の軸索は、正常なマウスの脊髄では同定されなかった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢神経系及び中枢神経系のミエリン形成を増加させるためのＭＭＰ２８阻害剤の使用に関する。本発明の方法は、脱髄又は不十分なミエリン形成による障害、疾患又は症状に罹患する患者に、ＭＭＰ２８阻害剤（例えば抗ＭＭＰ２８抗体）を投与することにより達成される。
【背景技術】
【０００２】
ミエリン（脂質及びタンパク質リッチな物質）は、脊椎動物の中枢神経系（ＣＮＳ）及び末梢神経系（ＰＮＳ）の双方の多くのニューロンの軸索を囲み、それによりミエリン鞘を形成する。ミエリンは、軸索周辺の絶縁物質として機能し、軸索に沿った神経インパルスの効果的な伝導を促進する機能を果たす。
【０００３】
脱髄とは、ミエリン鞘を囲んでいる軸索の正味の分解又は破壊であり、それによりシグナルの混乱が生じる。ＣＮＳ脱髄は、多発性硬化症、癲癇、横脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経障害及び副腎脳白質ジストロフィー（ＡＬＤ）など、特定の神経変性疾患において特徴的にみられる。ＣＮＳ脱髄はまた、特定の毒素（例えば重金属、金属キレート剤、タキソール、スラミン及びリゾレシチン）への暴露、又は特定のウイルス（例えばＨＩＶ及びヘルペスウイルス）又はミコバクテリウム（らい菌）への感染の結果、生じうる。自閉症、注意力欠陥／活動亢進障害、統合失調症、双極性障害、鬱状態及びアルツハイマー疾患などの特定の精神障害は、ＣＮＳにおける不十分なミエリン形成又は脱髄に関係している。
【０００４】
ＰＮＳ脱髄は、多くの疾患、障害又は症状に関連している（糖尿病性神経障害、ギラン−バレー病（急性脱髄性多発神経炎）、慢性炎症性脱髄多発神経根筋障害（ＣＩＰＤ）及びＨＩＶ炎症性脱髄性疾患など）。物理的な外傷による軸索損傷もまた、ＰＮＳ及びＣＮＳの脱髄を生じさせうる。
【０００５】
脱髄又は不十分なミエリン形成、疾患、障害又は症状が、世界的に何百万もの人々に影響を及ぼしているにもかかわらず、その治療は限られている。例えば、幾つかのタイプの治療（主に免疫系抑制剤）が、多発性硬化症の治療にとり有用であることが解っているが、それらは数的にも、有効性においても、また場合によっては毒性効果により、制限されている。特定の脱髄疾患（例えばＡＬＤ）では、食事を制限することによって、限られた範囲で治療が成功したが、この方法は、疾患徴候の発症前に使用される場合に最適である。特定のタイプの脱髄疾患（例えば白質萎縮症）の場合、骨髄移植によって進行を遅延させることができるが、その疾患は主に対症療法的に治療される。
【０００６】
マトリックス・メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、幾つかの細胞表面及び細胞周囲タンパク質と同様に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分を分解できるエンドペプチターゼのファミリーの一部を構成する。ＭＭＰはまた、成長の間、及び成人期における多くのプロセス、特にＥＣＭのリモデリングのプロセスを調整する。ＭＭＰは幾つかの共通の構造的特徴を共有し、ＥＣＭに関連する機能を一般に有するにもかかわらず、それらは別個の機能を果たす。ＭＭＰ２８（またエピライシンとも呼ばれる）は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）ファミリーの最新のメンバーである。国際公開第０２／２０７３９号パンフレット（特許文献１）は、別の２つの形態のＭＭＰ２８をコードする核酸分子を開示している。ＭＭＰ２８の機能はよくわかっていないが、特定の細胞タイプにおけるＭＭＰ２８増加が、損傷の修復、骨関節炎及びある種の癌などの幾つかの疾患状態と関連している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第０２／２０７３９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ＣＮＳ及び／又はＰＮＳにおける脱髄又は不十分なミエリン形成を特徴とする疾患、障害又は症状に対するさらなる治療法に対する切実なニーズが存在する。ミエリン形成を促進するための治療は、現在限られている。本願では、ＭＭＰ２８阻害剤（特に抗ＭＭＰ２８抗体）がミエリン形成を増加させ、それにより、多くの困難な神経系疾患、障害又は症状の治療に使用できるという、予想外の発見に関して記載する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＭＭＰ２８がミエリンを分解させ、またＭＭＰ２８の阻害剤がＣＮＳ及びＰＮＳにおけるミエリン形成を増加させるという発見に関する。かかる阻害剤としては、例えば抗ＭＭＰ２８抗体、小分子、ペプチド、リボザイム又はアンチセンス分子などが挙げられる。
【００１０】
したがって、本発明は、ヒトの患者におけるミエリン形成を増加させるための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤（例えば抗ＭＭＰ２８抗体、小分子、ペプチド、リボザイム又はアンチセンス分子）の使用に関する。一態様では、本発明は、ヒトの患者におけるミエリン形成を増加させるための医薬の製造における、抗ＭＭＰ２８抗体の使用に関する。
【００１１】
本発明は、糖尿病性神経障害、急性脱髄性多発神経障害、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害、ＨＩＶ炎症性脱髄性疾患、ヘルペスウイルス感染、ハンセン病、物理的外傷による軸索損傷又は軸索損傷による痛覚増加の治療用医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）の使用を包含する。
【００１２】
本発明は更に、多発性硬化症、白質萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病又は脊髄損傷の治療用医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）の使用を包含する。
【００１３】
本発明はまた、アルツハイマー疾患、統合失調症、うつ病、双極性障害又は注意欠如多動性障害の治療用の医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）の使用を包含する。
【００１４】
本発明の一態様は、ヒトの患者に有効量のＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）を投与することを含んでなる、ミエリン形成の増加により恩恵を受ける、疾患、障害又は症状を有するヒトの患者においてミエリン形成を増加させる方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは全長のヒトプロＭＭＰ２８タンパク質（配列番号１）のアミノ酸配列を示す。活性型ＭＭＰ２８を生成するために除去される配列が下線で示されている。メタロプロテアーゼ活性部位（アミノ酸２４０−２５０）を太字で示す。フューリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位はアミノ酸１１８−１２２の範囲である。図１Ｂは活性型のヒトＭＭＰ２８のアミノ酸配列を示す（配列番号７）。
【図２】ツメガエル（Ｘ）（配列番号４）、ヒト（Ｈ）（配列番号１）、マウス（Ｍ）（配列番号５）、ラット（Ｒ）（配列番号６）の全長プロＭＭＰ２８タンパク質のアミノ酸配列、並びにＸ、Ｈ、Ｍ及びＲにおける共通のアミノ酸配列（Ｃ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、ＭＭＰ２８タンパク質が特定のミエリン付随タンパク質を分解させ、またＭＭＰ２８の阻害剤、特に抗ＭＭＰ２８抗体が、ＣＮＳ及びＰＮＳにおいてミエリン形成を増加させるという発見に基づく。
【００１７】
「ＭＭＰ２８」とは、特に明記しない限り活性型のＭＭＰ２８タンパク質を指す。活性型のヒトＭＭＰ２８タンパク質（全長型のフューリン切断によって生じる）は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有する。全長型のヒトＭＭＰ２８は、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する。プロペプチド領域（図１Ａの下線部）は、フューリンによる切断により除去され、活性型のタンパク質が生成する。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「患者」とは、哺乳動物（好ましくはヒト）を指す。特定の態様では、当該患者は更に、ＣＮＳ又はＰＮＳにおけるミエリン形成の増加により恩恵を受けるような、疾患、障害又は症状を有することを特徴とする。
【００１９】
「脱髄」とは、既存のミエリンの正味の分解又は破壊を指す。
【００２０】
「不十分なミエリン形成」とは、ミエリンの通常の活性を機能させるのに充分な程の、軸索を囲むミエリンが存在しないことを指す。
【００２１】
「ミエリン形成の増加」の効果を有する薬剤は、患者への当該薬剤の投与の後、軸索に付随するミエリンの正味の量を増加させる。軸索と関連するミエリンの量は、公知技術の方法（例えば磁気共鳴映像法、特に拡散テンソルイメージング）により測定することができる。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「抗体」（抗ＭＭＰ２８抗体に関連する）とは、ＭＭＰ２８（好ましくはヒトＭＭＰ２８）と結合する、モノクローナル若しくはポリクローナル抗体のことを指す。本明細書の用語「モノクローナル抗体」とは、キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体を指す。「モノクローナル抗体」とは、単一のコピー又はクローンに由来する抗体（例えば原核生物、真核生物又はファージのクローン）のことを指し、それを得るための方法を指すものではない。
【００２３】
本明細書で用いられる「抗体」は、（ｉ）完全抗体（２つの全長の軽鎖及び２つの全長の重鎖を含む）、（ｉｉ）抗原結合部を含んでなる抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２）、又は、（ｉｉｉ）リンカー配列と共に軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）及び重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）をコードするＤＮＡを結合することによって得られる、単鎖Ｆｖ断片、であってもよい（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、第１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ２６９−３１５，１９９４を参照）。抗原結合断片が特定されているか否かに関係なく、特に明記しない限り、本明細書で用いられる用語「抗体」とは、かかる断片並びに単鎖形態のものを含むものと理解される。抗体タンパク質がＭＭＰ２８との結合能力を保持する限り、それは本明細書で用いられる用語「抗体」又は「抗ＭＭＰ２８抗体」の範囲に含まれる。
【００２４】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、少なくとも１つの部分がヒト起源である抗体を意味する。例えば、ヒト化抗体はヒト以外の起源（例えばマウス）の抗体に由来する部分、及びヒト起源の抗体に由来する部分を含んでもよい。
【００２５】
ヒト化抗体を調製するための、当該技術分野で利用できる様々な方法が存在する。例えば、ヒト化抗体は、ＭＭＰ２８と結合する親抗体（例えばマウス抗体又はハイブリドーマによって得られる抗体）のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードする核酸配列を得るステップと、前記ＨＣＶＲ及びＬＣＶＲのＣＤＲｓ（非ヒト）を同定するステップと、かかるＣＤＲをコードする核酸配列を、選択されたヒトフレームワークをコードする核酸配列に融合させるステップと、により調製してもよい。任意に、フレームワーク領域にＣＤＲ領域をグラフティングする前に、ランダムに又は特定の部位で突然変異を生じさせ、ＣＤＲ中の１つ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸で置換することにより、ＣＤＲ領域を最適化してもよい。あるいは、ヒトフレームワーク領域への挿入の後に、当業者に公知の方法を使用してＣＤＲ領域を最適化してもよい。
【００２６】
マウス抗体のヒト化に関係する方法として、例えばＱｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：２８６９，１９９１、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２（１９８６））、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８））、及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎらの方法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４（１９８８））などの文献に記載の方法を更に使用してもよい。
【００２７】
ヒト抗体とは、抗原感作に応答して特異的なヒト抗体を産生するために設計されたトランスジェニックマウスから得られる抗体である。完全なヒト抗体を産生するための１つの方法として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）のマウスの系統（それらのゲノム内にヒト重鎖及び軽鎖の遺伝子が含まれるように設計されている）を用いることが挙げられる（Ｍｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６−１５７，１９９７などを参照）。ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）の系統は、Ａｂｇｅｎｉｘ社から入手可能である。
【００２８】
本発明は、患者のミエリン形成を増加させるための医薬の製造のための、抗ＭＭＰ２８抗体の使用に関する。好ましくは、上記患者はヒトである。
【００２９】
好ましい態様では、抗ＭＭＰ２８抗体はモノクローナル抗体（より好ましくはヒトモノクローナル抗体又はヒト化モノクローナル抗体）である。他の好ましい態様では、抗ＭＭＰ２８抗体は配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する。
【００３０】
一態様では、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）は、患者に投与することにより、ＣＮＳのミエリン形成を増加させることができる。好ましくは、上記患者は、ＣＮＳにおける脱髄又は不十分なミエリン形成により特徴づけられる疾患、障害又は症状を有するヒトの患者である。かかるＣＮＳにおける疾患、障害又は症状としては、限定されないが多発性硬化症、癲癇、白質萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病及び脊髄損傷が挙げられる。白質萎縮症はほとんどが遺伝性の障害であり、例えば副腎脳白質ジストロフィー、異染性白質ジストロフフィー、クラッベ病、ペリツェウス・メルツバッハ病、中枢低ミエリン形成を伴う小児期運動失調、カナバン病、アレキサンダー病、レフサム病及び脳腱黄色腫症などが挙げられる。更に、特定の精神状態又は障害（例えばアルツハイマー疾患、統合失調症、うつ病、双極性障害及び注意欠如多動性障害）が、不十分なミエリン形成及び／又は脱髄によって特徴づけられるという証拠が多く得られている。患者（好ましくは上述した疾患、障害又は症状のうちの少なくとも１つを有するヒトの患者）のＣＮＳにおけるミエリン形成を増加させるための医薬の製造のための、抗ＭＭＰ２８抗体の使用が本発明に包含される。
【００３１】
一態様では、ＭＭＰ２８阻害剤（好ましくは抗ＭＭＰ２８抗体）は、患者に投与されることにより、ＰＮＳにおけるミエリン形成を増加させることができる。好ましくは、上記患者は、ＰＮＳにおける脱髄又は不十分なミエリン形成によって特徴づけられる疾患、障害又は症状を有するヒトの患者である。かかる疾患、障害又は症状としては、糖尿病性神経障害、ギラン・バレー病（また急性脱髄性多発神経障害とも呼ばれる）、慢性炎症性脱髄性多発神経根筋障害（ＣＩＰＤ）、ＨＩＶ炎症性脱髄性疾患、ヘルペスウイルス感染、物理的外傷による軸索損傷（例えばウォーラー変性）、ハンセン病、及び軸索損害による痛覚の増加などが挙げられる。患者、好ましくは上述した疾患、障害又は症状のうちの少なくとも１つを有するヒトの患者のＰＮＳにおけるミエリン形成を増加させるための医薬の製造のための、抗ＭＭＰ２８抗体の使用が本発明に包含される。
【００３２】
本発明の好ましい態様では、抗ＭＭＰ２８抗体を含んでなる医薬組成物を、ミエリン形成を増加させるために、患者に、有効量で投与する。好ましくは、上記医薬組成物は、同質のまたは実質的に同質の抗ＭＭＰ２８抗体の集団と、薬理学的に許容できる担体又は希釈剤と、を含んでなる。本明細書で用いられる用語「薬理学的に許容できる担体」とは、活性薬剤のための、非毒性の、一般的に不活性なビヒクルのことを意味し、それは該薬剤、又は上記組成物が投与される患者に対して悪影響を与えない。適切なビヒクル又は担体は、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄ．Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）に記載されている。かかる担体としては、例えば水溶液（例えばバッファ及び生理的食塩水）が挙げられる。更に、上記担体は、製剤のｐＨ、浸透性、粘性、透明性、着色性、無菌性、安定性又は溶解速度を改変若しくは維持するための、他の薬理学的に許容できる賦形剤を含有してもよい。
【００３３】
医薬組成物は、製造条件下、及び提供される容器（例えば密封されたバイアル、シリンジ又は他の送給装置（例えばペン））中での保存条件下で、無菌及び安定でなければならない。したがって、医薬組成物は、製剤化した後にフィルターで滅菌してもよく、又はさもなければ微生物学的に許容できるようにするのが好ましい。
【００３４】
抗ＭＭＰ２８抗体を含有する医薬組成物を投与する方法は、静脈内投与、皮下投与、頭蓋内投与、クモ膜下腔内投与、頭蓋内投与若しくは筋肉内投与であってもよい。多発性硬化症などの特定の疾患では、静脈ルートによる抗体の送達を促進する血液脳関門の破綻が生じうる。破綻していない血液脳関門を特徴とする他の疾患、障害又は症状の場合、薬理学的製剤を投与する好適な手段は、カテーテル及びポンプを用いて直接頭蓋内脳室注入を経て脳に注入することである。
【００３５】
「有効量」とは、投与を受けた患者のＣＮＳ及び／又はＰＮＳにおいてミエリン形成を増加させるのに必要な量（投与量、投与期間及び投与手段）を指す。抗ＭＭＰ２８抗体の有効量は、例えば疾患の段階、年齢、性別、個人の体重、投与手段及び個人において所望の反応を誘発する抗体の能力などの要因に応じて適宜変化させることができる。また有効量とは、上記治療的に有益な効果が、抗体による毒性効果若しくは有害なあらゆる効果を上回るときの量のことである。
【００３６】
有効量とは、少なくとも治療効果を患者に与えるのに必要な最小の投与量であり、かつ、毒性量より少ない投与量のことである。換言すると、抗ＭＭＰ２８抗体の有効量は、好ましくはヒトにおいて、（ｉ）ＰＮＳにおいてミエリン形成を増加させ、及び／又は、（ｉｉ）ＣＮＳにおいてミエリン形成を増加させる、量のことである。
【００３７】
医学の分野で周知のように、患者への投与量は、患者の体のサイズ、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与時間及び経路、投与の頻度、健康状態及び並行して投与される他の薬剤、などの多くの要因に依存する。更に投与量は、疾患の種類及び重篤度に応じて変化させてもよい。典型的な投与量は、例えば０．００１〜１０００ｍｇの範囲であってもよいが、特に上記の要因を考慮して、この典型的な範囲以下又は以上の投与量となってもよい。毎週の非経口投与レジメは、総体重に対して約０．１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．３μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであってもよい。定期的な評価を行うことにより進行をモニターしてもよく、またそれに従い投与量を調整してもよい。
【００３８】
示唆されたこれらの抗体の量は、多くの場合、医師の裁量の範囲内で決定される。適当な投与量及びスケジューリングを選択する際の鍵となる要因は、得られる結果である。この場合に考慮される要因としては、治療しようとする具体的な障害、個々の患者の治療条件、障害の原因、抗体を送達する部位、抗体の具体的なタイプ、投与方法、投与レジメ及び医師にとり公知の他の要因が挙げられる。
【００３９】
ＣＮＳ及びＰＮＳにおいて発現されるＭＭＰ２８
ＭＭＰ２８の空間的−時間的局在化を、発生中のマウス胚を用いて評価した。全胚の断片を、胎児日齢１０（Ｅ１０）〜Ｅ１７まで毎日固定し、ＭＭＰ２８タンパク質に関して染色した。標準的な免疫組織化学的な方法を使用した結果、ＭＭＰ２８タンパク質の濃度及び局在化状態が、発生段階に応じて変化することが解った。Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｓ社製のＣＬ２ＭＭＰ−２８を抗ＭＭＰ２８抗体として使用した。二次的抗体及びペルオキシダーゼ標識化は、ベクタステインＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ社製）に従って実施した。
【００４０】
Ｅ１０〜Ｅ１２において、ＭＭＰ２８発現は、胚全体にわたって少なかった。Ｅ１３から、ＭＭＰ２８発現が増加し、発生中の脊髄において最も強い染色が見られた。Ｅ１３では、四肢の神経におけるＭＭＰ２８発現は未だ見られなかった。Ｅ１４では、神経系全体にわたってＭＭＰ２８の発現が劇的に増加した。後期の発生段階（Ｅ１５〜Ｅ１７）の間において、神経に関連するＭＭＰ２８は減少したが、ＣＮＳ全体にわたっては依然として検出可能であった。神経系におけるＭＭＰ２８の発現が、ＣＮＳ及びＰＮＳにおいて見られた。身体全体の神経と同様に、四肢内の神経では、Ｅ１４において、ＭＭＰ２８が発現することが明らかとなった。ＭＭＰ２８は、ＣＮＳ内では、脳及び脊髄において強く発現された。また脳神経がＭＭＰ２８を発現することも解った。また、免疫蛍光顕微鏡及び共焦顕微鏡により検出した結果、ＭＭＰ２８が１２週齢のマウスの脊髄において発現されることも解った。
【００４１】
ＭＭＰ２８による、特定のミエリン付随タンパク質の分解
神経細胞外環境でのＭＭＰ２８切断活性から得られるポリペプチドを同定した。ツメガエル属ＭＭＰ２８（ＸＭＭＰ２８）と哺乳類ＭＭＰ２８との間の保存された発現パターン、及びアミノ酸配列レベルの類似性（図２を参照）から、ツメガエル属ＭＭＰ２８及び哺乳類のＭＭＰ２８は、同じ若しくは類似する基質を切断すると考えられる。全長のＸＭＭＰ２８は、全長のヒトＭＭＰ２８と５６％同一であり、また全長のマウスＭＭＰ２８と５５％同一である。ＸＭＭＰ２８は、その哺乳類の対応物と同様に、シグナル配列、及び抑制性システインスイッチを含むプロドメイン、並びにそれに続く触媒ドメイン及びＣ末端のヘモペキシン様ドメインからなる。ツメガエル属、マウス及びヒトＭＭＰ２８全体のホモロジーは、推定の機能領域の中で最も高い：触媒ドメイン（６５％同一性）、抑制性システインスイッチ（８５％同一性）及びフューリン切断シグナル（１００％同一性）。
【００４２】
ツメガエル属ＭＭＰ２８（ＸＭＭＰ２８、配列番号４）を、３７℃で２４時間、ロングエバンスラットのＥ１７脳由来の組織と共に、プロテアーゼバッファ（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＢｒｉｊ−３５及び１０μＭ ＺｎＣｌ２）中でインキュベートした。脳消化物を次に、３ｋＤａフィルタを通して遠心分離し、残渣及び大分子のタンパク質を除去した。フロースルー中に入る小分子ペプチドをトリプシンで処理してペプチドのサイズを減少させ、次に液体クロマトグラフィによりペプチドを分離し、更にそれに続くペプチド質量分析でＸＭＭＰ２８分解の後に生じるペプチドを同定した。ミエリンの成分であるＮｏｇｏ−Ａ（主にＣＮＳ発現と関連する）（ＲＧＳＧＳＶＤＥＴＬＦＡＬＰＡＡＳＥＰＶＩＰＳＳＡＥＫＩ、配列番号９）、及びＣＮＳ及びＰＮＳの両方において発現される神経細胞接着分子（すなわちＮＣＡＭ−１）（ＫＳＥＰＱＥＳＥＡＫＰＡＰＴＥＶＫＴ、配列番号８）に対応するペプチドの分解産物は、ＸＭＭＰ２８で処理されたサンプルにおいて特異的に同定されたが、酵素を含まないコントロールサンプルではそれは失われたか又は相対的に低い発見量であった。
【００４３】
これらのＸＭＭＰ２８／脳消化物中のミエリン付随タンパク質Ｎｏｇｏ−Ａ、ＮＣＡＭ−１、ミエリン塩基性タンパク質、プロテオリピドタンパク質及びミエリン付随グリコプロテイン（すなわちＭＡＧ）のウエスタンブロット分析を実施し、ＸＭＭＰ２８とのインキュベートによりこれらのタンパク質の分解が生じるか否かを解析した。ＮＣＡＭ−１及びＭＡＧと同様に、全長Ｎｏｇｏ−Ａタンパク質は、ＸＭＭＰ２８処理された脳サンプルにおいて減少していた。分解は、特定のミエリンタンパク質に限られていた。ミエリン塩基性タンパク質及びＰＬＰは、このアッセイにおいてサイズが減少しなかった。したがって、ＭＭＰ２８はＮｏｇｏ−Ａ、ＮＣＡＭ−１及びＭＡＧを切断する。
【００４４】
ＭＭＰ２８ポリクローナル抗体の生成
２つの異なるペプチド（ｉ）ＦＡＫＱＧＮＫＷＹＫＱＨＬＳＹＲＬ（配列番号２）及び（ｉｉ）ＫＲＬＧＲＤＡＬＬＳＷ（配列番号３）に対するポリクローナル抗体を、ウサギ体内で産生させた。これらのペプチドは、ヒトＭＭＰ２８中には存在するが、他の周知のヒトタンパク質（他のあらゆるヒトＭＭＰタンパク質も含む）には存在しない。したがって、これらのペプチドにより産生される抗体は、他のいかなるＭＭＰタンパク質とも結合するとは考えられない。配列番号２のペプチドは、配列番号１の全長ヒトＭＭＰ２８のアミノ酸１２３−１３９にわたるものである。配列番号３のペプチドは、配列番号１の全長ヒトＭＭＰ２８のアミノ酸２６３−２７３にわたるものである。ＳＷＩＳＳ−Ｍｏｄｅｌを使用したヒトＭＭＰ２８構造のコンピュータモデルによる予測によると、これらの２つのペプチドは、ヒトＭＭＰ２８タンパク質の表面に存在し、メタロプロテアーゼ活性部位の反対側に位置する。
【００４５】
各々のペプチドを合成し、ＫＬＨとコンジュゲートさせ、標準的な免疫方法を使用してウサギに注射した。免疫化したウサギの血清中に得られるＭＭＰ２８抗体を、標準的な親和性クロマトグラフィ技術を使用して、得られるペプチドに対するアフィニティ精製に供した。２回目の抗体精製を、Ａｂ Ｓｐｉｎ Ｔｒａｐカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）中で、プロテインＧセファロースを使用して実施した。抗体を、８００μＬの０．１ｍＭのグリシン（ｐＨ２．５）で溶出させ、６０μＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和した。精製された抗体の濃度を分光光度計で測定した結果、２６０ｎＭであった。
【００４６】
ウサギにより生成された抗体（ＡＢ１８３及びＡＢ１８０）は、ウエスタンブロット分析により示されるとおり、精製ヒトＭＭＰ２８とは結合したが、ヒトＭＭＰ２とは結合しなかった。ＡＢ１８３は、配列番号２に示される配列を基に産生され、またその配列のポリペプチドと結合し、各々独立に、ヒトＭＭＰ２８タンパク質の範囲内に包含される。ＡＢ１８０は、配列番号３に示される配列を基に産生され、またその配列のポリペプチドと結合し、各々独立に、ヒトＭＭＰ２８タンパク質の範囲内に包含される。
【実施例】
【００４７】
以下の実施例は、単に説明を目的として記載するものであって、本発明の範囲を限定することを目的とするものではない。
【００４８】
実施例１：ＡＢ１８３及びＡＢ１８０は in vitro でＭＭＰ２８活性を阻害する
このアッセイは、ペプチド基質に対する精製ヒトＭＭＰ２８タンパク質（全長型及び活性化型の混合物）の活性、並びに抗ＭＭＰ２８抗体（ＡＢ１８３及びＡＢ１８０）のＭＭＰ２８活性を調整する能力を測定するものである。精製ＭＭＰ２８を蛍光生成ｐａｎ−ＭＭＰ基質とインキュベートした後、蛍光の増加を測定した。ヒトＭＭＰ２を、陽性コントロールとして使用した。ＯＭＮＩ−ＭＭＰ（商標）（大部分のＭＭＰｓに対する、十分にクエンチされた蛍光生成ペプチド基質（Ｂｉｏｍｏｌ社製、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ））を、２０ｍＭにＤＭＳＯ中で希釈した後、これらのアッセイに使用した。
【００４９】
試験に供するＭＭＰタンパク質（すなわちＭＭＰ２８又はＭＭＰ２）を、２回精製したＡＢ１８０又はＡＢ１８３の有りまたは無しで、最終的に５０μＬの体積になるように水と混合し、ＭＭＰタンパク質を２０ｎＭ、抗体を６０ｎＭ若しくは１０ｎＭの濃度とした。ＭＭＰ／ＡＢ混合物を、一定に振とうしながら３７℃で１時間インキュベートした。次に蛍光生成ペプチド基質を、１０×プロテアーゼ アッセイバッファと共に、ＭＭＰ／ＡＢ混合物に１０μＭの最終濃度となるように添加し、最終的な１００μＬの反応液を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０５％のＢｒｉｊ−３５及び１０μＭ ＺｎＣｌ２の組成とした。反応は、アルミホイルでおおわれた黒い９６穴プレートにおいて実施し、３７℃で２４時間にわたりインキュベートした。次に、１秒／ウェルで、３４０ｎｍ励起・４０５ｎｍ放出で蛍光測定した。
【００５０】
ＭＭＰ２８は、０ｎＭ〜８０ｎＭで試験したとき、単独で、投与量依存的に基質を切断した。同様の結果が、ＭＭＰ２単独の場合でも得られた。５ｎＭ（１００μＬ反応液中）の最終濃度のＡＢ１８０により、基質のＭＭＰ２８による切断が約６６％阻害され、一方、３０ｎＭの最終濃度のＡＢ１８０により、基質のＭＭＰ２８による切断が約９８％阻害され、それらが蛍光の減弱として反映された。５ｎＭの最終濃度のＡＢ１８３により、基質のＭＭＰ２８による切断が約６０％阻害され、一方、３０ｎＭの最終濃度のＡＢ１８３により、基質のＭＭＰ２８による切断が約６９％阻害された。両方の抗体の使用により、１０ｎＭのＭＭＰ２８単独使用の場合と比較し、顕著に基質の切断を減少させた（ｐ＝＜０．０５）。ＡＢ１８０又はＡＢ１８３をＭＭＰ２と共に使用したとき、基質の切断の検出可能な阻害が観察されなかった。
【００５１】
実施例２：ＭＭＰ２８阻害剤（ＡＢ１８０及びＡＢ１８３）はミエリン形成を増加させる
ミエリン形成している後根神経節（ＤＲＧ）の培養組織を、Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｅｎ、Ａ．その他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．７２：５６５−５７３（２００３）に記載の方法に従い確立した。妊娠したロングエバンスマウスから、妊娠１７日目で胚を分離し、冷却したＬ１５培地に置いた。後根神経節を脊椎から取り除き、６０ｍｍのシャーレ中の２ｍｌのＬ１５培地中に置き、３７℃で１５分間、０．２５％のトリプシンで処理した。ピペットの先端を使用して細胞を分離させ、顕微鏡検査により分離を観察した。細胞を次に、３回、１０％のウシ胎児血清を有するＬ１５培地で洗浄し、１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）及び２％のＢ２７サプリメント（成長培地）を有するＮｅｕｒａｌｂａｓａｌ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、２１１０３）中に再懸濁した。細胞を４日間増殖させ（５％のＣＯ２中、３７℃）、新鮮な成長培地（アスコルビン酸を５０μｇ／ｍｌ含む）を次に添加し、ミエリン形成を開始させ、２〜３日毎に培地を交換した。
【００５２】
これらの実験において、軸索関連のミエリン付随糖タンパク質（ＭＡＧ）を、初期のミエリン形成（Ｏｗｅｎｓ及びＢｕｎｇｅ（Ｇｌｉａ２）：１１９−１２８、１９８９）のバイオマーカーとして使用した。ＭＭＰ２８及びＭＡＧの神経における発現を、抗ＭＡＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）又は抗ＭＭＰ２８抗体（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ社製）を用いた、標準的な免疫組織化学技術によりモニターした。ミエリン形成の開始前、並びにミエリン形成の開始後１日及び３日において、ＤＲＧ培養組織（膠細胞（すなわちミエリン生成シュワン細胞）又は軸索）における検出可能なＭＡＧが見られなかった。しかしながら、軸索において、観察可能なＭＭＰ２８のベースラインレベルが存在した。ＭＭＰ２８は、膠細胞において全く観察されなかった。ミエリン形成の開始の６日後に、ミエリン形成の初期段階が、膠細胞中のＭＡＧの存在（特に神経−膠細胞が相互作用する幾つかの部位に沿って）として検出できた。この成長段階で、ＭＭＰ２８レベルは顕著に低下しなかった。ミエリン形成の開始の１４日後に、ＭＡＧの軸索における凝集及びＭＭＰ２８レベルの実質的な減少が見られた。したがって、ミエリン形成が進行しないとき、ＭＭＰ２８レベルはベースラインに留まり、またＭＡＧは検知不能なレベルであるが、ミエリン形成が進行する（すなわちミエリン形成が増加する）とき、ＭＭＰ２８レベルは減少し、ＭＡＧレベルは増加する。
【００５３】
６日目における、３０ｎＭの濃度での培養組織へのＡＢ１８０又はＡＢ１８３の添加により、軸索関連ＭＡＧの増加が生じ、それは２４時間後に、免疫組織化学染色により観察することができる。ＡＢ１８０及びＡＢ１８３の効果は、処理された及び未処理のウェル中の、ＭＡＧ染色で陽性の軸索束の数を計数することによって定量化できる。７日目において、合計６つのウェル中の軸索束の数（抗体処理の有無において）を合計した。得られる数値を下記の表１に示す。これらのデータは、ＭＭＰ２８抗体が、軸索関連ミエリンの形成を著しく強化することを証明するものである（ｐ＝＜０．０５）。このアッセイを用いることにより、あらゆる候補ＭＭＰ２８阻害剤を試験することができる。
【００５４】
【表１】
【００５５】
実施例３：ｉｎ ｖｉｖｏクプリゾンアッセイ
マウスに、３〜１３週間にわたり、食餌中に０．２％のクプリゾンを添加して摂取させた。この毒素の使用により、脳梁及び脊髄などの、脳内のミエリン形成が高度になされる領域において脱髄がなされる（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ ＧＫら、Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ２００１；１１：１０７Ｙ１６）。脱髄の検出は、脳梁のＭＲＩ又は組織学的解析により実施できる。クプリゾンを食餌から除去したときに再ミエリン形成がなされ、また短い期間処理されたマウスにおいては、より高いミエリン形成が見られた。ミエリン形成の強化を、放射線学的評価並びに組織学的評価によって、この再ミエリン形成期間に評価した。腹腔内注射によって抗体処理を行った。特にＭＭＰ２８と結合する抗体が、再ミエリン形成を強化又はミエリン形成を促進すると考えられた。
【００５６】
実施例４：ＭＳ病変におけるＭＭＰ２８発現
Ａ．ヒトの脳病変
この実施例は、通常の脳組織と比較して、多発性硬化症（ＭＳ）に罹患するヒト患者のヒト脳病変では、ＭＭＰ２８タンパク質濃度が高くなることを示すものである。ヒトＭＳ患者（Ｂｉｏｍａｘ社製、Ｉｊａｍｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）由来の５μｍの冷凍小脳組織切片を室温に解凍し、５６℃で１６時間、０．１％のＬｕｘｏｌファストブルー溶液（０．１ｇのＬｕｘｏｌファストブルー（Ａｃｒｏｓ社製）、０．５ｍｌの酢酸、９５％エタノールで１００ｍｌに調製）中に置いた。スライドを次にＬｕｘｏｌファストブルーから取り出し、９５％エタノールで洗浄し、蒸留・脱イオン水（ｄｄＨ２Ｏ）でリンスし、３０秒間、０．０５％の炭酸リチウム（Ａｃｒｏｓ社製）で分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ）させた。分化させた後、スライドを更にｄｄＨ２Ｏでリンスし、顕微鏡で観察し、白質の分化を確認した。スライドを更に、４０秒間、０．１％のＣｒｅｓｙｌ ｅｃｈｔ ｖｉｏｌｅｔ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）中でインキュベートし、核及び灰白質を対比染色した。過剰なＣｒｅｓｙｌ ｅｃｈｔ ｖｉｏｌｅｔを、ｄｄＨ２Ｏを用いてスライドから除去した。スライドを、５分間の９５％エタノール処理、次に１００％エタノール及びキシレンで順次脱水処理することによって識別した。Ｐｅｒｍｏｕｎｔを使用して、カバーグラスの下に上記断片を永久的に固定した。倒立顕微鏡を使用して、顕微鏡検査法により組織を分析した。ＭＳ病変内におけるタンパク質発現の変化を同定するため、ＭＭＰ−２８（Ｃｅｒｄｅｒｌａｎｅ社製）及びＭＡＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）と反応する抗体を用いた標準的な技術による免疫組織化学的な解析を実施した。核を、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、Ｓｉｇｍａ社製）により対比染色した。
【００５７】
多発性硬化症患者から得た小脳病変において、上記の染色を実施し、ミエリン形成が減少した病変を、Ｌｕｘｏｌブルー染色によって同定した。より詳細なＬｕｘｏｌブルー染色により証明されるように、これらの領域は、ミエリン形成がなされ、通常のミエリン形成された組織によって囲まれている小脳領域であると考えられた。ミエリンの減少を確認するため、更に、ミエリンタンパク質であるミエリン付随糖タンパク質（ＭＡＧ）に関して、連続する次の断面で免疫組織化学を実施した。予想通り、Ｌｕｘｏｌブルー染色によって通常どおり同定される領域でＭＡＧタンパク質が強く発現され、通常のミエリン形成が示された。同定されたＭＳ病変の境界内部においては、ＭＡＧ染色は実質的に減少していた。ＭＭＰ−２８に対する免疫組織化学を、同じ断面において実施した。小脳の通常の領域全体にわたり、軸索関連のＭＭＰ−２８染色は同定されなかったが、ＭＳ病変の全体にわたっては、ＭＭＰ−２８に関する染色で陽性を示した軸索であると形態学的に推定される多数の構造が見られた。ＭＡＧ染色については、これらの構造との共局在化は見られなかった。これらの結果は、通常のミエリン化小脳におけるＭＭＰ−２８の発現が顕著なレベルではなかったが、脱ミエリン化領域では、ＭＭＰ−２８が発現している脱ミエリン化軸索が存在することを示した。
【００５８】
Ｂ．ＥＡＥモデル脊髄病変
ＥＡＥとは、ヒトのＭＳモデルとして有用な、ＣＤＲ＋Ｔ細胞媒介性の中枢神経系の脱髄疾患である。ヒトＭＳ患者の脊髄病変について記載している最近のレビューでは、かかる病変が疾患症状と顕著に相関することを強調している（Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ７：１２０３−１２１１，２００７）。氷上での超音波処理によりＣＦＡ中でＨ３７ ＲＡ／ＰＢＳ（１：１）と共に乳化させた２．５ｍｇ／ｍｌのＨ３７ ＲＡ粉末（５ｍｇ／ｍｌ、Ｄｉｆｃｏ＃２３１１４１）及び１．５ｍｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５（ミエリン乏突起神経膠細胞糖タンパク、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製、ＰＭＧ−３６６０−ＰＩ）を含有するフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）２００μＬを用いて、約８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに対し、０日目及び７日目に右側腹部の皮下に免疫して疾患を誘導した。百日咳毒素（２．５μｇ／ｍｌの２００μＬ）を、０日目に第１次免疫として、更に第１次免疫後４８時間に再び投与した。
【００５９】
病態を進行させ、免疫の４週間後（動物の運動制御機能が低下する時期）にマウスを安楽死させた。安楽死の際に脊髄を摘出し、長手方向の脊髄断片を、抗ＭＡＧ抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）及び抗ＭＭＰ２８抗体（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ社製）を用いて、標準的な免疫組織化学法を使用して染色した。ＥＡＥマウスの脊髄内の軸索ではＭＭＰ２８が発現しており、またこのＭＭＰ２８発現は、薄いＭＡＧで囲まれているか又はＭＡＧで囲まれていない軸索中で見られた。ＭＭＰ−２８陽性の軸索は、正常なマウスの脊髄では同定されなかった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの患者のミエリン形成を増加させるための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤の使用。
【請求項２】
ヒトの患者のミエリン形成を増加させるための医薬の製造における、抗ＭＭＰ２８抗体の使用。
【請求項３】
前記ミエリン形成の増加が、末梢神経系内で生じる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ミエリン形成の増加が、中枢神経系内で生じる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
糖尿病性神経障害、急性脱髄性多発性神経障害、慢性炎症性脱髄性多発性神経根筋障害、ＨＩＶ炎症性脱髄性疾患、ヘルペスウイルス感染、ハンセン病、物理的外傷による軸索損傷、又は軸索損傷による痛感の増加を治療するための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤の使用。
【請求項６】
多発性硬化症、白質萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病又は脊髄損傷を治療するための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤の使用。
【請求項７】
アルツハイマー疾患、統合失調症、うつ病、双極性障害又は注意欠如多動性障害を治療するための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤の使用。
【請求項８】
前記阻害剤が、抗ＭＭＰ２８抗体である、請求項５から７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２、３、４又は８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体がヒト抗体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する、請求項２から４及び請求項８から１２のいずれか１に項記載の使用。
【請求項１】
ヒトの患者のミエリン形成を増加させるための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤の使用。
【請求項２】
ヒトの患者のミエリン形成を増加させるための医薬の製造における、抗ＭＭＰ２８抗体の使用。
【請求項３】
前記ミエリン形成の増加が、末梢神経系内で生じる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記ミエリン形成の増加が、中枢神経系内で生じる、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項５】
糖尿病性神経障害、急性脱髄性多発性神経障害、慢性炎症性脱髄性多発性神経根筋障害、ＨＩＶ炎症性脱髄性疾患、ヘルペスウイルス感染、ハンセン病、物理的外傷による軸索損傷、又は軸索損傷による痛感の増加を治療するための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤の使用。
【請求項６】
多発性硬化症、白質萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病又は脊髄損傷を治療するための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤の使用。
【請求項７】
アルツハイマー疾患、統合失調症、うつ病、双極性障害又は注意欠如多動性障害を治療するための医薬の製造における、ＭＭＰ２８阻害剤の使用。
【請求項８】
前記阻害剤が、抗ＭＭＰ２８抗体である、請求項５から７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２、３、４又は８に記載の使用。
【請求項１０】
前記抗体がヒト抗体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１２】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項９に記載の使用。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと結合する、請求項２から４及び請求項８から１２のいずれか１に項記載の使用。
【図１】
【図２−１】
【図２−２】
【図２−１】
【図２−２】
【公表番号】特表２０１０−５２４９４９（Ｐ２０１０−５２４９４９Ａ）
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５０４１５６（Ｐ２０１０−５０４１５６）
【出願日】平成２０年４月４日（２００８．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５９３３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３０８１４
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年７月２２日（２０１０．７．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年４月４日（２００８．４．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５９３３５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１３０８１４
【国際公開日】平成２０年１０月３０日（２００８．１０．３０）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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