メチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法
【課題】簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供する。
【解決手段】（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、（２）第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第二工程、及び、本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを、固定化メチル化ＤＮＡ抗体から分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第一前工程）等から構成される生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等を提供する。
【解決手段】（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、（２）第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第二工程、及び、本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを、固定化メチル化ＤＮＡ抗体から分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第一前工程）等から構成される生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるＤＮＡのメチル化状態を評価するための方法としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法が存在している（例えば、非特許文献１及び２参照）。この測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを抽出する必要がある。該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ支持体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。次いで、抽出されたＤＮＡの目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法としては、例えば、（１）亜硫酸塩等を用いて該ＤＮＡを修飾した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）に供することにより目的領域を増幅する方法、（２）メチル化感受性制限酵素を用いて該ＤＮＡを消化した後、ＰＣＲに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。
【０００３】
【非特許文献１】Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M., High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7.
【非特許文献２】Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive- representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2284-9.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記のいずれの方法とも、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要する。更に、ＰＣＲが、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を用いて液相中にて行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記プライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、これらの操作は極めて繁雑である。このように、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は以下の発明を含む。
[発明１]
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、
（２）第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第二工程、及び、（３）下記の各本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを、固定化固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第一前工程）と、
第一前工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ｂ工程（本工程）とを有し、
更に第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
[発明２]
固定化固定化メチル化DNA抗体がメチルシトシン抗体である発明１に記載の方法。
[発明３]
生物由来検体が哺乳動物の血液、体液、血清、血漿、細胞溶解液又は組織溶解液である発明１又は２に記載の方法。
[発明４]
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料、又は予め精製されてなるＤＮＡ試料である発明１〜３のいずれか一に記載の方法。
[発明５]
第一工程が、
目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと、を混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で選択された一本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一（Ｂ）工程と、から構成される発明１〜４のいずれか一に記載の方法。
[発明６]
メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素、又はHhaIである発明１〜５のいずれか一に記載の方法。
[発明７]
第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を行う発明１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
[発明８]
第二工程が、
第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料に含まれるメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化された一本鎖ＤＮＡに分離する第二（Ａ）工程と、
第二（Ａ）工程で得られたメチル化一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる第二（Ｂ）工程とからなり、
第二（Ａ）工程でメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化一本鎖ＤＮＡに分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する発明１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法等を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液（ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムＤＮＡを挙げることができる。また該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料も挙げられ、この場合には、本発明における「ゲノムＤＮＡ」とは、微生物、ウイルスのゲノムＤＮＡを意味するものである。哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明の利用が期待できる。
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
尚、前記ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料は、該ゲノムＤＮＡが有する後述する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であってもよく、又は所定の方法により予め精製されてなるＤＮＡ試料であってもよい。
【０００８】
「メチル化されたＤＮＡ」とは、下記のようなＤＮＡを意味するものである。通常、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する塩基は４種類である。これらの塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、このようなＤＮＡのメチル化修飾は、５’ −ＣＧ−３’ で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンに限られている。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。このようなメチル化修飾により生じたＤＮＡを意味するものである。
本発明における「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
【０００９】
「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）は、該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べたいＤＮＡ領域であって、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有するものであり、例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡの領域等を挙げることができる。
【００１０】
具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。配列番号２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号２で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列において、塩基番号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。配列番号３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号３で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号３で示される塩基配列において、塩基番号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。配列番号４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号４で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列において、塩基番号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号５で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号５で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。配列番号６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号６で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号６で示される塩基配列において、塩基番号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１６】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。配列番号７で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号７で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列において、塩基番号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１７】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列が挙げられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’ 側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号８で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号８で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号８で示される塩基配列において、塩基番号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１８】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。配列番号９で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号９で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列において、塩基番号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１９】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。配列番号１０で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１０で示される塩基配列において、塩基番号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２０】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。配列番号１１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１１で示される塩基配列において、塩基番号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。配列番号１２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１２で示される塩基配列において、塩基番号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。配列番号１３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１３で示される塩基配列において、塩基番号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。配列番号１４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１４で示される塩基配列において、塩基番号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。配列番号１５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１５で示される塩基配列において、塩基番号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。配列番号１６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１６で示される塩基配列において、塩基番号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２６】
「メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体を意味する。具体的には、メチルシトシン抗体であり、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができる。。また、市販されているメチル化DNA抗体であっても、本特許記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。
メチル化DNA抗体は、メチル化された塩基、メチル化ＤＮＡ等を抗原として、通常の方法により作成できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、或いは、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本特許ではメチル化ＤＮＡ、或いはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
【００２７】
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法を挙げることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌ Ａを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。或いは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下或いは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内或いは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。
最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法などが挙げられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。
細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）などが挙げられる。
【００２８】
一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されていれば抗メチル化抗体と結合することができる。従って、本発明における「メチル化された一本鎖ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されている一本鎖ＤＮＡを意味しており、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧの全てがメチル化されている一本鎖ＤＮＡに限った意味ではない。
【００２９】
本発明における「（目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、）増幅されたＤＮＡの量」とは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの増幅後の量そのもの、即ち、本発明の後述する第三工程で求めた量を意味するものである。例えば、生物由来検体が１ｍＬの血清であった場合には、血清１ｍＬ中に含まれる前記のメチル化されたＤＮＡに基づいて増幅されたＤＮＡの量を意味する。
【００３０】
「相補性によって結合（相補的な（塩基対合による）結合）」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。例えば、ＤＮＡを構成する二本鎖の各々一本鎖ＤＮＡを構成する塩基が、プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、より具体的には、複数の連続した、チミンとシトシン、グアニンとアデニンの水素結合による塩基結合により、二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。相補性によって結合することを「相補的な結合」と呼ぶこともある。「相補的な結合」は、「相補的に塩基対合しうる」又は「相補性により結合」と表現することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに「相補性を有する」[相補性である]と表現することもある。尚、人工的に作成されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンがシトシン、アデニン、チミンと水素結合の水素結合で結合することも意味する。
「目的とするＤＮＡ領域（に対して相補性である塩基配列）を含む一本鎖ＤＮＡ」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」と表現することもある。
【００３１】
第一工程において、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う。
「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合には、該メチル化感受性制限酵素を該ＤＮＡに作用させても、該ＤＮＡは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合には、該メチル化感受性制限酵素を該ＤＮＡに作用させれば、該ＤＮＡは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であるHpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、すでにGruenbaumらにより明らかにされている（Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515）。
【００３２】
メチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、具体的には例えば、前記ＤＮＡを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含むＤＮＡを増幅可能なプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの増幅（増幅産物）の有無を調べる方法を挙げることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたＤＮＡの量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定することができる。
即ち、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡがメチル化されていれば、前記のメチル化感受性制限酵素がメチル化状態であるＤＮＡを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができる。即ち、前記のメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、該メチル化感受性制限酵素により切断される。また仮に生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、該メチル化感受性制限酵素により切断されない。従って、消化処理を実施した後、後述のように、前記の目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたＰＣＲを実施することにより、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、ＰＣＲによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、ＰＣＲによる増幅産物が得られることになる。
【００３３】
第一工程は、具体的には例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが哺乳類由来のゲノムＤＮＡの場合には、以下のように実施すればよい。哺乳類由来のゲノムＤＮＡに、最適な10×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を3μL、1mg/mL BSA水溶液を3μL、メチル化感受性制限酵素HpaII又はHhaI（10U/μL）等を夫々1.5μL加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜３時間インキュベーションすればよい。
【００３４】
また第一工程における、メチル化感受性制限酵素処理の好ましい態様としては、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加する方法が挙げられる。具体的には、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと、を混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ａ）工程と、第一（Ａ）工程で選択された一本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一（Ｂ）工程と、から構成されてもよい。具体的には例えば、メチル化感受性制限酵素処理をするための溶液中にマスキング用オリゴヌクレオチドを添加すればよい。
この第一（Ａ）工程と第一（Ｂ）工程とを経ることによって、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が一本鎖ＤＮＡであっても、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素により消化することができる。また、第一（Ａ）工程と第一（Ｂ）工程は連続して実施しても構わないし、同時に実施しても構わない。
【００３５】
「マスキング用オリゴヌクレオチド」とは、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、一本鎖ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、少なくとも１箇所（全ての個所でも良い）と相補的に結合することで二本鎖を形成し（即ち、前記箇所を二本鎖状態にして）、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるように、また、試料が一本鎖ＤＮＡである場合、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖ＤＮＡも消化でき、その消化効率は、二本鎖ＤＮＡに対する方が一本鎖ＤＮＡに対するよりも高い）での前記箇所の消化効率を向上させることができるようにするためのオリゴヌクレオチドであり、且つ、目的とする領域のＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとの二本鎖の形成を阻害しないオリゴヌクレオチドを意味する。また、該マスキング用オリゴヌクレオチドは、後述のリバース用プライマー（正鎖）を伸長プライマーとして、該マスキング用オリゴヌクレオチド（負鎖）を鋳型として、伸長プライマーを伸長させる反応に利用できないオリゴヌクレオチドでなければならない。尚、塩基長としては、８〜２００塩基長が望ましい。
【００３６】
ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、１種類でもよく複数種類でも良い。複数種類を用いると、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡのメチル化感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖状態になり、メチル化感受性制限酵素での、後述の「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができる。マスキング用オリゴヌクレオチドは、例えば、目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、メチル化している場合には消化せずにメチル化していない場合には消化したい箇所（例えば、疾患患者検体では100%メチル化されており、健常者検体では100%メチル化されていない箇所等）に応じて設計し、これを使用することが特に有用である。
【００３７】
尚、第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない（所謂「ＤＮＡの切れ残し」）虞を挙げることができる。このような虞が問題となる場合には、メチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができるので、目的とするＤＮＡ領域としては、メチル化感受性制限酵素の認識部位を少なくとも１つ以上有しており、その認識部位が多ければ多いほどよいと考えられる。
【００３８】
尚、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。ここで、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡの消化物を固定化オリゴヌクレオチドで選択する場合には、短い鋳型ＤＮＡの方がより選択され易く、また、ＰＣＲで目的領域を増幅する場合にも、鋳型ＤＮＡが短い方がよいと考えられるので、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。尚、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限酵素処理法を用いればよい。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。該方法は、上記のような「ＤＮＡの切れ残し」を無くすのに有用である。
【００３９】
生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ由来の試料をメチル化感受性制限酵素により消化する方法としては、生物由来検体がゲノムＤＮＡ自体の場合には前記の方法と同様な方法でよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には前記の方法と同様な方法に準じて、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、25ngのＤＮＡ量に対して500倍量（10U）又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施すればよい。
ゲノムＤＮＡは、基本的には二本鎖ＤＮＡとして存在している。したがって、本操作においては、一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HhaI）だけでなく、二本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等）を用いることができる。
【００４０】
他に、第一工程の態様としては、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第二工程を実施する等を挙げることができる。目的とするＤＮＡ領域に一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で切断される塩基配列が無い場合には、第一工程を実施せずに第二工程を実施しても構わない。
【００４１】
本発明測定方法の第二工程では、第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する。また、第二工程は、第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料に含まれるメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化された一本鎖ＤＮＡに分離する第二（Ａ）工程と、第二（Ａ）工程で得られたメチル化一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる第二（Ｂ）工程とから構成されてもよい。
【００４２】
本発明測定方法の第二（Ａ）工程において、「第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料に含まれるメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化された一本鎖ＤＮＡに分離する」際、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにするための一般的は操作を行えばよい。具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料を適当量の超純水に溶解し、95℃で10分間加熱し、氷中で急冷すればよい。
【００４３】
本発明測定方法の第二（Ｂ）工程における
【００４４】
第二（Ｂ）工程においては、第一工程で得られたＤＮＡから、メチル化された一本鎖ＤＮＡを、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させることにより選択する。固定化メチル化DNA抗体は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを選択するために用いられる。また、固定化メチル化DNA抗体は、支持体に固定化され得るものであればよく、「支持体に固定化され得るもの」とは、固定化メチル化DNA抗体を支持体へ直接的、或いは間接的に固定できることを意味する。このように固定化されるためには、固定化メチル化DNA抗体を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従って、支持体に固定すればよい（固相への結合）。具体的には、固定化メチル化DNA抗体をビオチン化して得られたビオチン化固定化メチル化DNA抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、固定化メチル化DNA抗体を、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、シランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、或いは前記合成樹脂等、若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、共有結合には、例えば、トリグリセライドを５個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等により共有結合させる方法も挙げられる。
更に、固定化メチル化DNA抗体を直接支持体に固定化してもよく、また、固定化メチル化DNA抗体に対する抗体（二次抗体）を支持体に固定化し、二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。
尚、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択する際に本固定化固定化メチル化DNA抗体が支持体に固定化されていればよく、（１）該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化固定化メチル化DNA抗体との結合前の段階で、本固定化固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、また（２）該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化固定化メチル化DNA抗体との結合後の段階で、本固定化固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい。
【００４５】
第二（Ｂ）工程において、「メチル化された一本鎖ＤＮＡを、固定化固定化メチル化DNA抗体と結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する」際、具体的には例えば、固定化固定化メチル化DNA抗体として、「ビオチン標識されたビオチン化メチルシトシン抗体」を使用して、以下のように実施すればよい。
（ａ）ビオチン化メチルシトシン抗体を適当量（例えば、0.1μg/50μL）アビジン被覆ＰＣＲチューブに添加し、その後、室温で約１時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体とストレプトアビジンの固定化を促す。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、１００μＬ/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をＰＣＲチューブ内に残す。
（ｂ）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡをバッファー（例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM Dithothreitol）とを混合して、９５℃で数分間加熱する。その後、約０〜４℃の温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温し、一本鎖ＤＮＡを形成させる。その後、室温に戻す。
（ｃ）形成された前記一本鎖ＤＮＡを、ビオチン化メチルシトシン抗体が固定化されたアビジン被覆ＰＣＲチューブに添加し、その後、室温で約１時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体と、前記一本鎖ＤＮＡのうちメチル化された一本鎖ＤＮＡとの結合を促す（結合体の形成）（この段階で、少なくともメチル化されてないＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡは、結合体を形成しない。）。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、１００μＬ/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、結合体をＰＣＲチューブ内に残す（結合体の選択）。
（ｂ）において使用するバッファーとしては、生物試料由来のゲノムＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ分離するために適していれば良く、前記バッファーに限ったわけではない。
（ａ）及び（ｃ）における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていない固定化メチル化DNA抗体、固定化メチル化DNA抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ、または、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離の固定化メチル化DNA抗体、溶液中に浮遊している一本鎖ＤＮＡ等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、ＤＥＬＦＩＡバッファー（PerkinElmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）、ＴＥバッファー等でも良い。
【００４６】
他に第二（Ａ）工程において、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際の好ましい態様としては、カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることができる。カウンターオリゴヌクレオチドとは、目的とするＤＮＡ領域と同じ塩基配列を短いオリゴヌクレオチドに分割したものである。通常１０〜１００塩基、より好ましくは、２０〜５０塩基の長さに設計したものであればよい。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、フォーワード用プライマーあるいはリバース用プライマーが目的とするＤＮＡ領域と相補的に結合する塩基配列上には設計しない。カウンターオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに比し、大過剰で添加され、目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）にした後、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる際に、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖（負鎖）と目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）が相補性により再結合することを妨げるために添加する。目的とするＤＮＡ領域にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて、ＤＮＡのメチル化頻度又はそれに相関関係のある指標値を測定する際に、目的領域が一本鎖である方がメチル化ＤＮＡ抗体に結合しやすいからである。尚、カンウターオリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域に比べて、少なくとも１０倍、通常は１００倍以上の量が添加されることが望ましい。
【００４７】
「メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する」とは、具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを選択するために、生物由来生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をカウンターオリゴヌクレオチドと混合して、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させればよい。例えば、前記ＤＮＡ試料と、前記カウンターオリゴヌクレオチドを、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合して、９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温し、次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻せばよい。
【００４８】
第三工程において、下記の各本工程の前工程として、第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを、固定化固定化メチル化DNA抗体から分離して遊離の一本鎖状態のＤＮＡにする工程（第一前工程）と、
第一前工程で遊離の一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）と、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ｂ工程（本工程）とを有し、
更に第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
【００４９】
第三工程では、まず、下記の各本工程の前工程のうち第一前工程として、第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを固定化固定化メチル化ＤＮＡ抗体から一旦分離して一本鎖状態であるＤＮＡにする。具体的には例えば、第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡに、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を得る。その後、第二前工程では、具体的には例えば、第一前工程で得られた一本鎖状態のＤＮＡ（正鎖）とフォワードプライマーを、滅菌超純水を17.85μL、最適な緩衝液（例えば、100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2）を3μL、2mM dNTPを3μL、5N ベタインを6μL加え、次いで該混合物にAmpliTaq（ＤＮＡポリメラーゼの１種：5U/μL）を0.15μL加えて液量を30μLとした溶液中で混合し、37℃で約2時間インキュベーションし、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる。第三前工程においては、具体的には例えば、第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡに、アニーリングバッファーを添加することにより混合物を得て、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡに一旦分離する。
その後、本工程として、
(i) 生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）に、前記のフォワード用プライマーをアニーリングさせるために、例えば、前記のフォワード用プライマーのＴｍ値の約０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。
(iii)上記(i)でアニーリングさせた前記の一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記のフォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる（即ち、第Ａ工程）。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明の第二前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする（即ち、第Ｂ工程）。具体的には例えば、上記(iii)のＡ工程と同様に、第二前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)更に第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと（例えば、第Ａ工程及び第Ｂ工程）により、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
【００５０】
第三工程は、具体的には、第一前工程から開始して本工程に至るまでの反応を、一つのＰＣＲ反応として実施することもできる。また、第一前工程から第三前工程まで、各々、独立した反応として実施し、本工程のみをＰＣＲ反応として実施することもできる。
【００５１】
選択された一本鎖ＤＮＡに含まれる目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）を増幅する方法としては、例えば、ＰＣＲを用いることができる。目的領域を増幅する際に、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。ＰＣＲ反応液としては、例えば、本発明の第二工程で得たＤＮＡに、50μMのプライマーの溶液を0.15μlと、2mM dNTPを2.5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、20mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を2.5μlと、AmpliTaq Gold (耐熱性DNAポリメラーゼの一種： 5U/μl)を0.2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液を挙げることができる。
目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）は、ＧＣリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、ＤＭＳＯ等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間更に72℃にて30秒間を１サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件が挙げられる。かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施後、蛍光標識体の量の測定によりＰＣＲ反応での増幅量を評価することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたＰＣＲを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を用いればよい。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して２倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量ＰＣＲ法として知られる方法である。該リアルタイムＰＣＲ法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムＰＣＲ法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
【００５２】
本発明は、下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100％メチル化されているＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100%メチル化されていないＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量はほぼ０に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて低メチル化状態（hypomethylation）で、且つ、疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて高メチル化状態（hypermethylation）であるＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたＤＮＡの量は、０に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。更に、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
【００５３】
このような本発明における、目的領域のメチル化されたＤＮＡ量の測定を行うための各種方法で使用し得る制限酵素、プライマー又はプローブは、検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これら制限酵素、プライマー又はプローブ等を試薬として含有する検出用キットや、これらプライマー又はプローブ等が支持体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明又は本発明メチル化割合測定方法の権利範囲は、該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
実施例１
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００５６】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計９本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する）。
【００５７】
配列番号１７で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-Ｍ(７)、配列番号１８で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）、配列番号１９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-ＵＭを合成して、夫々につき０．００１ｐｍｏｌ/１０μＬ ＴＥバッファー溶液を調製した。
【００５８】
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチド＞
Ｎは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7)：
5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ （配列番号１７）
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド＞
Ｎは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)：
5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ （配列番号１８）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
GPR7-2079-2176/98mer-UM：
5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ （配列番号１９）
【００５９】
得られた夫々の溶液（各溶液について３本ずつ調製）について、以下のＡ処理、Ｂ処理またはＣ処理を施した（各１本ずつ調製）。
【００６０】
Ａ処理群（無処理群）：前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）を５μＬとを加えて、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【００６１】
Ｂ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）：前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）を５μＬと、ＨｐａＩＩを１０Ｕとを加えて、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【００６２】
Ｃ群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩ処理群）：前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、ＨｐａＩＩを１０Ｕと、配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡをマスキング用オリゴヌクレオチドとして５ｐｍｏｌ加えて、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【００６３】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
MA：5’ - GCCACCCGGCGCGA -3’ （配列番号２０）
【００６４】
各々の反応液を３７℃で１晩インキュベーションした。（以上、本発明の第一工程に相当する）
【００６５】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明の第二工程に相当する）。
【００６６】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液（ＰＦ１及びＰＲ１）及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域（ＧＰＲ７-２０７９-２１７６、配列番号２３、メチルシトシンもCで表す）におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００６７】
＜プライマー＞
ＰＦ１：5’ -GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3’ （配列番号２１）
ＰＲ１：5’ -GCACGACGAGTGTGACGATC-3’ （配列番号２２）
【００６８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
GPR7-2079-2176：5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ （配列番号２３）
【００６９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、３μＭに調製された配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各５μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μLを０．２５μLと、５Ｎベタイン水溶液を１０μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明の第三工程に相当する。）。
【００７０】
その結果を図１に示した。Ａ処理群（無処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）と、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）では、増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られた。アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。Ｂ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）の場合も、Ａ処理群と同様の結果であった。Ｃ処理群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩ処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）では、増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られたが、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００７１】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、また、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加・混合しメチル化感受性制限酵素で処理することにより、マスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素認識部位がメチル化されていない目的とするＤＮＡ領域を消化できること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できることが確認された。
【００７２】
実施例２
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００７３】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００７４】
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号２４及び配列番号２５で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号２６、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
【００７５】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ （配列番号２４）
ＰＲ２：5’ - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号２５）
【００７６】
＜DNAフラグメント＞
Ｘ：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号２６）
【００７７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
【００７８】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこれらの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＸ、配列番号２７）を得た。
【００７９】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＸ：5’ - CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ （配列番号２７）
【００８０】
得られたＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/5μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/5μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【００８１】
得られたＤＮＡフラグメントＭＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【００８２】
前記のＤＮＡフラグメントＸの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＸの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【００８３】
前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液５μＬに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした各々の混合液を３７℃で３時間インキュベーションした（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
【００８４】
配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’ の負鎖に相補性により結合可能な配列番号２９〜配列番号４０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ１２を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【００８５】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’ ：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ （配列番号２８）
【００８６】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5’ - GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3’ （配列番号２９）
Ｃ２：5’ - GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3’ （配列番号３０）
Ｃ３：5’ - CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3’ （配列番号３１）
Ｃ４：5’ - AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3’ （配列番号３２）
Ｃ５：5’ - ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3’ （配列番号３３）
Ｃ６：5’ - TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3’ （配列番号３４）
Ｃ７：5’ - CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3’ （配列番号３５）
Ｃ８：5’ - ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3’ （配列番号３６）
Ｃ９：5’ - ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3’ （配列番号３７）
Ｃ１０：5’ - TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3’ （配列番号３８）
Ｃ１１：5’ - CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3’ （配列番号３９）
Ｃ１２：5’ - CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3’ （配列番号４０）
【００８７】
前記の反応液に、調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【００８８】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。
【００８９】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２４及び配列番号２５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ２及びＰＲ２の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’ におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００９０】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ （配列番号２４）
ＰＲ２：5’ - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号２５）
【００９１】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’ ：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ （配列番号２８）
【００９２】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第四工程に相当する。）。
【００９３】
その結果を図２に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００９４】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【００９５】
実施例３
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００９６】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００９７】
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号４１及び配列番号４２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号４３、Genbank Accession No. ac009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。
【００９８】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ３：5’ - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ （配列番号４１）
ＰＲ３：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号４２）
【００９９】
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ （配列番号４３）
【０１００】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。
【０１０１】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＹ、配列番号４４）を得た。
【０１０２】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＹ：5’ - GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3’ （配列番号４４）
【０１０３】
得られたＤＮＡフラグメントＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/5μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/5μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０４】
得られたＤＮＡフラグメントＭＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０５】
前記のＤＮＡフラグメントＹの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＹの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１０６】
前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液５μＬに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした各々の混合液を３７℃で３時間インキュベーションした（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
【０１０７】
配列番号４５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’ の負鎖に相補性により結合可能な配列番号４６、塩基配列４７及び配列番号４８で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１３、Ｃ１４、及びＣ１５を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１０８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’ ：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ （配列番号４５）
【０１０９】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１３：5’ - GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ （配列番号４６）
Ｃ１４：5’ - CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3’ （配列番号４７）
Ｃ１５：5’ - CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG -3’ （配列番号４８）
【０１１０】
前記の反応液に、調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１１１】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。
【０１１２】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号４１及び配列番号４２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ３及びＰＲ３の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号４５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’ におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１１３】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ３：5’ - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ （配列番号４１）
ＰＲ３：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号４２）
【０１１４】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’ ：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ （配列番号４５）
【０１１５】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６０℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【０１１６】
その結果を図３に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されなかった。
【０１１７】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【０１１８】
実施例４
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１１９】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１２０】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号４９及び配列番号５０で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号５１、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。
【０１２１】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号４９）
ＰＲ４：5’ - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号５０）
【０１２２】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５１）
【０１２３】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０１２４】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を３回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＴ、配列番号５２）を得た。
【０１２５】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＴ：5’ - GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５２）
【０１２６】
得られたＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/5μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/5μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１２７】
得られたＤＮＡフラグメントＭＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１２８】
前記のＤＮＡフラグメントＴの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＴの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１２９】
前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液５μＬに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした各々の混合液を３７℃で３時間インキュベーションした（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
【０１３０】
配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔ’ の負鎖に相補性により結合可能な配列番号５４〜配列番号５７で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１６〜Ｃ１９を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１３１】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ’ ：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５３）
【０１３２】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１６：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号５４）
Ｃ１７：5’ - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’ （配列番号５５）
Ｃ１８：5’ - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’ （配列番号５６）
Ｃ１９：5’ - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’ （配列番号５７）
【０１３３】
前記の反応液に、調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１３４】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。
【０１３５】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号４９及び配列番号５０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ４及びＰＲ４の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔ’ におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１３６】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号４９）
ＰＲ４：5’ - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号５０）
【０１３７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ’ ：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５３）
【０１３８】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２８サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第四工程に相当する。）。
【０１３９】
その結果を図４に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【０１４０】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【０１４１】
実施例５
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１４２】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１４３】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１４４】
得られた酵母ゲノムＤＮＡの一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を３回繰り返し、メチル化酵母ゲノムＤＮＡを得た。
【０１４５】
得られた酵母ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/5μL TE溶液
溶液Ｂ：1ng/5μL TE溶液
溶液Ｃ：0.1ng/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１４６】
得られたメチル化酵母ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：10ng/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：1ng/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１４７】
上記の酵母ゲノムＤＮＡの溶液及びメチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１４８】
ＰＣＲチューブに、上記に調製したゲノムＤＮＡ溶液５μLと、制限酵素ＸｓｐＩを５Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）１μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１４９】
さらに上記の反応液に、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした各々の混合液を３７℃で３時間インキュベーションした（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
【０１５０】
配列番号５８で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴ’（Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）の負鎖に相補性により結合可能な配列番号５４〜配列番号５７及び配列番号５９〜配列番号６２で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１６〜Ｃ２３を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１５１】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ’：5’ - TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3’ （配列番号５８）
【０１５２】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１６：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号５４）
Ｃ１７：5’ - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’ （配列番号５５）
Ｃ１８：5’ - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’ （配列番号５６）
Ｃ１９：5’ - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’ （配列番号５７）
Ｃ２０：5’ - AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3’ （配列番号５９）
Ｃ２１：5’ - GCGATCGCACACGAGGAGACA -3’ （配列番号６０）
Ｃ２２：5’ - AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3’ （配列番号６１）
Ｃ２３：5’ - AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3’ （配列番号６２）
【０１５３】
前記の酵母ゲノムＤＮＡ及びメチル化酵母ゲノムＤＮＡの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０１５４】
前記の反応液に、調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１５５】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。
【０１５６】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号４９及び配列番号５０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ４及びＰＲ４の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔ’ におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１５７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号４９）
ＰＲ４：5’ - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号５０）
【０１５８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ’ ：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５３）
【０１５９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３１サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第四工程に相当する。）。
【０１６０】
その結果を図５に示した。メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されなかった。
【０１６１】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１は、実施例１において、調製されたサンプルから配列番号２３で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、での結果を示している。
【０１６４】
【図２】図２は、実施例２において、調製されたサンプルから配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１６５】
【図３】図３は、実施例３において、調製されたサンプルから配列番号４５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１６６】
【図４】図４は、実施例４において、調製されたサンプルから配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１６７】
【図５】図５は、実施例５において、調製されたサンプルから配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＣ」、メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液「Ｃ」、メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＢ」、メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液「Ｂ」、メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＡ」、メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１６８】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１７
実験のために設計された部分メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１８
実験のために設計された部分メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１９
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２０
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号２４
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２７
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号２８
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号２９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４１
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号４４
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号４５
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号４６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４９
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５０
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５１
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号５２
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号５３
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号５４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５８
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号５９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるＤＮＡのメチル化状態を評価するための方法としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法が存在している（例えば、非特許文献１及び２参照）。この測定方法では、まず、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを抽出する必要がある。該抽出方法としては、例えば、ゲル濾過、シリカ支持体、有機溶媒等による抽出方法等が知られているが、いずれの抽出方法も操作が煩雑である。次いで、抽出されたＤＮＡの目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法としては、例えば、（１）亜硫酸塩等を用いて該ＤＮＡを修飾した後、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成の連鎖反応（Polymerase Chain Reaction；以下、ＰＣＲと記すこともある。）に供することにより目的領域を増幅する方法、（２）メチル化感受性制限酵素を用いて該ＤＮＡを消化した後、ＰＣＲに供することにより、目的領域を増幅する方法等を挙げることができる。
【０００３】
【非特許文献１】Clark SJ, Harrison J, Paul CL, Frommer M., High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 1994 Aug 11;22(15):2990-7.
【非特許文献２】Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive- representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors.Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2284-9.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、上記のいずれの方法とも、ＰＣＲに供するまでの操作（具体的には例えば、メチル化検出のためのＤＮＡの修飾及びその後の生成物の精製等）に非常に時間と労力とを要する。更に、ＰＣＲが、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの塩基配列に対して相補的な１組のオリゴヌクレオチドプライマー（以下、プライマー対と記すこともある。）を用いて液相中にて行われるために、増幅されたＤＮＡ断片を精製した後、これをＰＣＲのための反応容器へ移し換える操作、また目的領域を増幅させるための前記プライマー対を含む反応試薬を反応系に添加するための操作等も必要である。更に、増幅しようとする目的領域のＤＮＡの増幅を確認するために、電気泳動等の分析操作に供する必要もあり、これらの操作は極めて繁雑である。このように、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定するための一連の操作には、多大な手間が存在していた。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討を重ねた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は以下の発明を含む。
[発明１]
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、
（２）第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第二工程、及び、（３）下記の各本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを、固定化固定化メチル化DNA抗体から分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第一前工程）と、
第一前工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ｂ工程（本工程）とを有し、
更に第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
[発明２]
固定化固定化メチル化DNA抗体がメチルシトシン抗体である発明１に記載の方法。
[発明３]
生物由来検体が哺乳動物の血液、体液、血清、血漿、細胞溶解液又は組織溶解液である発明１又は２に記載の方法。
[発明４]
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料、又は予め精製されてなるＤＮＡ試料である発明１〜３のいずれか一に記載の方法。
[発明５]
第一工程が、
目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと、を混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で選択された一本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一（Ｂ）工程と、から構成される発明１〜４のいずれか一に記載の方法。
[発明６]
メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素、又はHhaIである発明１〜５のいずれか一に記載の方法。
[発明７]
第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を行う発明１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
[発明８]
第二工程が、
第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料に含まれるメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化された一本鎖ＤＮＡに分離する第二（Ａ）工程と、
第二（Ａ）工程で得られたメチル化一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる第二（Ｂ）工程とからなり、
第二（Ａ）工程でメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化一本鎖ＤＮＡに分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する発明１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、簡便にＤＮＡを定量又は検出する方法等を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明における「生物由来検体」としては、例えば、細胞溶解液、組織溶解液（ここでの組織とは、血液、リンパ節等を含む広義の意味である。）若しくは、哺乳動物においては、血漿、血清、リンパ液等の体液、体分泌物（尿や乳汁等）等の生体試料及びこれら生体試料から抽出して得られたゲノムＤＮＡを挙げることができる。また該生物由来検体としては、例えば、微生物、ウイルス等由来の試料も挙げられ、この場合には、本発明における「ゲノムＤＮＡ」とは、微生物、ウイルスのゲノムＤＮＡを意味するものである。哺乳動物由来の検体が血液である場合には、定期健康診断や簡便な検査等での本発明の利用が期待できる。
ゲノムＤＮＡを哺乳動物由来の検体から得るには、例えば、市販のＤＮＡ抽出用キット等を用いてＤＮＡを抽出すればよい。
因みに、血液を検体として用いる場合には、血液から通常の方法に準じて血漿又は血清を調製し、調製された血漿又は血清を検体として、その中に含まれる遊離ＤＮＡ（胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡが含まれる）を分析すると、血球由来のＤＮＡを避けて胃癌細胞等の癌細胞由来のＤＮＡを解析することができ、胃癌細胞等の癌細胞、それを含む組織等を検出する感度を向上させることができる。
尚、前記ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料は、該ゲノムＤＮＡが有する後述する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であってもよく、又は所定の方法により予め精製されてなるＤＮＡ試料であってもよい。
【０００８】
「メチル化されたＤＮＡ」とは、下記のようなＤＮＡを意味するものである。通常、遺伝子（ゲノムＤＮＡ）を構成する塩基は４種類である。これらの塩基のうち、シトシンのみがメチル化されるという現象が知られており、このようなＤＮＡのメチル化修飾は、５’ −ＣＧ−３’ で示される塩基配列（Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表す。以下、該塩基配列を「ＣｐＧ」と記すこともある。）中のシトシンに限られている。シトシンにおいてメチル化される部位は、その５位である。細胞分裂に先立つＤＮＡ複製に際して、複製直後は鋳型鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンのみがメチル化された状態となるが、メチル基転移酵素の働きにより即座に新生鎖の「ＣｐＧ」中のシトシンもメチル化される。従って、ＤＮＡのメチル化の状態は、ＤＮＡ複製後も、新しい２組のＤＮＡにそのまま引き継がれることになる。このようなメチル化修飾により生じたＤＮＡを意味するものである。
本発明における「ＣｐＧ対」とは、ＣｐＧで示される塩基配列と、これに相補するＣｐＧが結合してなる二本鎖オリゴヌクレオチドを意味するものである。
【０００９】
「目的とするＤＮＡ領域」（以下、目的領域と記すこともある。）は、該領域に含まれるシトシンのメチル化有無を調べたいＤＮＡ領域であって、少なくとも１種類以上のメチル化感受性制限酵素の認識部位を有するものであり、例えば、Lysyl oxidase、HRAS-like suppressor、bA305P22.2.1、Gamma filamin、HAND1、Homologue of RIKEN 2210016F16、FLJ32130、PPARG angiopoietin-related protein、Thrombomodulin、p53-responsive gene 2、Fibrillin2、Neurofilament3、disintegrin and metalloproteinase domain 23、G protein-coupled receptor 7、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2等の有用タンパク質遺伝子のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンを含むＤＮＡの領域等を挙げることができる。
【００１０】
具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がLysyl oxidase遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のLysyl oxidase遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF270645に記載される塩基配列の塩基番号16001〜18661で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１で示される塩基配列においては、ヒト由来のLysyl oxidaseタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2031〜2033に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号１で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１で示される塩基配列において、塩基番号1539、1560、1574、1600、1623、1635、1644、1654、1661、1682、1686、1696、1717、1767、1774、1783、1785、1787、1795等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子がHRAS-like suppressor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC068162に記載される塩基配列の塩基番号172001〜173953で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号２で示される塩基配列においては、ヒト由来のHRAS-like suppressor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1743〜1953に示されている。配列番号２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号２で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号２で示される塩基配列において、塩基番号1316、1341、1357、1359、1362、1374、1390、1399、1405、1409、1414、1416、1422、1428、1434、1449、1451、1454、1463、1469、1477、1479、1483、1488、1492、1494、1496、1498、1504、1510、1513、1518、1520等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、bA305P22.2.1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のbA305P22.2.1遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL121673に記載される塩基配列の塩基番号13001〜13889で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号３で示される塩基配列においては、ヒト由来のbA305P22.2.1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号849〜851に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号663〜889に示されている。配列番号３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号３で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号３で示される塩基配列において、塩基番号329、335、337、351、363、373、405、424、427、446、465、472、486等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Gamma filamin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のGamma filamin遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC074373に記載される塩基配列の塩基番号63528〜64390で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号４で示される塩基配列においては、ヒト由来のGamma filaminタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号572〜574に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号463〜863に示されている。配列番号４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号４で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号４で示される塩基配列において、塩基番号329、333、337、350、353、360、363、370、379、382、384、409、414、419、426、432、434、445、449、459、472、474、486、490、503、505等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、HAND1遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHAND1遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026688に記載される塩基配列の塩基番号24303〜26500で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号５で示される塩基配列においては、ヒト由来のHAND1タンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号1656〜1658に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号1400〜2198に示されている。配列番号５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号５で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号５で示される塩基配列において、塩基番号1153、1160、1178、1187、1193、1218、1232、1266、1272、1292、1305、1307、1316、1356、1377、1399、1401、1422、1434等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Homologue of RIKEN 2210016F16遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AL354733に記載される塩基配列の塩基番号157056〜159000で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号６で示される塩基配列においては、ヒト由来のHomologue of RIKEN 2210016F16タンパク質のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1392〜1945に示されている。配列番号６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号６で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号６で示される塩基配列において、塩基番号1172、1175、1180、1183、1189、1204、1209、1267、1271、1278、1281、1313、1319、1332、1334、1338、1346、1352、1358、1366、1378、1392、1402、1433、1436、1438等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１６】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、FLJ32130遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFLJ32130遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号７で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC002310に記載される塩基配列の塩基番号1〜2379で示される塩基配列の相補的塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号７で示される塩基配列においては、ヒト由来のFLJ32130タンパク質のアミノ酸末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2136〜2138に示されており、上記エクソン１と考えられる塩基配列は、塩基番号2136〜2379に示されている。配列番号７で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号７で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号７で示される塩基配列において、塩基番号1714、1716、1749、1753、1762、1795、1814、1894、1911、1915、1925、1940、1955、1968等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１７】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、PPARG angiopoietin-related protein遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related protein遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号８で示される塩基配列が挙げられる。配列番号８で示される塩基配列においては、ヒト由来のPPARG angiopoietin-related proteinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号717〜719に示されており、上記エクソン１の５’ 側部分の塩基配列は、塩基番号1957〜2661に示されている。配列番号８で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号８で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号８で示される塩基配列において、塩基番号35、43、51、54、75、85、107、127、129、143、184、194、223、227、236、251、258等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１８】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Thrombomodulin遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のThrombomodulin遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号９で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF495471に記載される塩基配列の塩基番号1〜6096で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号９で示される塩基配列においては、ヒト由来のThrombomodulinタンパク質のアミノ末端のメチオニンをコードするATGコドンが、塩基番号2590〜2592に示されており、上記エクソン１の塩基配列は、塩基番号2048〜6096に示されている。配列番号９で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシン、とりわけ配列番号９で示される塩基配列においてＣｐＧが密に存在する領域中に存在するＣｐＧ中のシトシンは、例えば、胃癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、胃癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号９で示される塩基配列において、塩基番号1539、1551、1571、1579、1581、1585、1595、1598、1601、1621、1632、1638、1645、1648、1665、1667、1680、1698、1710、1724、1726、1756等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００１９】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、p53-responsive gene 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１０で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009471に記載される塩基配列の塩基番号113501〜116000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１０で示される塩基配列においては、ヒト由来のp53-responsive gene 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1558〜1808に示されている。配列番号１０で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１０で示される塩基配列において、塩基番号1282、1284、1301、1308、1315、1319、1349、1351、1357、1361、1365、1378、1383等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２０】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Fibrillin2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１１で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC113387に記載される塩基配列の塩基番号118801〜121000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１１で示される塩基配列においては、ヒト由来のFibrillin2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1091〜1345に示されている。配列番号１１で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１１で示される塩基配列において、塩基番号679、687、690、699、746、773、777、783、795、799、812、823、830、834、843等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２１】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Neurofilament3遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１２で示される塩基配列（Genbank Accession No.AF106564に記載される塩基配列の塩基番号28001〜30000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１２で示される塩基配列においては、ヒト由来のNeurofilament3遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号614〜1694に示されている。配列番号１２で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１２で示される塩基配列において、塩基番号428、432、443、451、471、475、482、491、499、503、506、514、519、532、541、544、546、563、566、572、580等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２２】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、disintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のCpGで示される塩基配列としては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１３で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009225に記載される塩基配列の塩基番号21001〜23300で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１３で示される塩基配列においては、ヒト由来のdisintegrin and metalloproteinase domain 23遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1194〜1630に示されている。配列番号１３で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１３で示される塩基配列において、塩基番号998、1003、1007、1011、1016、1018、1020、1026、1028、1031、1035、1041、1043、1045、1051、1053、1056、1060、1066、1068、1070、1073、1093、1096、1106、1112、1120、1124、1126等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２３】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G protein-coupled receptor 7遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１４で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC009800に記載される塩基配列の塩基番号75001〜78000で示される塩基配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１４で示される塩基配列においては、ヒト由来のG protein-coupled receptor 7遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1666〜2652に示されている。配列番号１４で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１４で示される塩基配列において、塩基番号1480、1482、1485、1496、1513、1526、1542、1560、1564、1568、1570、1580、1590、1603、1613、1620等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２４】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、G-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、のプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１５で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC008971に記載される塩基配列の塩基番号57001〜60000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１５で示される塩基配列においては、ヒト由来のG-protein coupled somatostatin and angiotensin-like peptide receptor遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号776〜2632に示されている。配列番号１５で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１５で示される塩基配列において、塩基番号470、472、490、497、504、506、509、514、522、540、543、552、566、582、597、610、612等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２５】
また具体的には例えば、有用タンパク質遺伝子が、Solute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子である場合には、そのプロモーター領域、非翻訳領域又は翻訳領域（コーディング領域）の塩基配列中に存在する一つ以上のＣｐＧで示される塩基配列としては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１と、その５’ 上流に位置するプロモーター領域とが含まれるゲノムＤＮＡの塩基配列を挙げることができ、より具体的には、配列番号１６で示される塩基配列（Genbank Accession No.AC026802に記載される塩基配列の塩基番号78801〜81000で示される塩基配列の相補的配列に相当する。）が挙げられる。配列番号１６で示される塩基配列においては、ヒト由来のSolute carrier family 6 neurotransmitter transporter noradrenalin member 2遺伝子のエクソン１の塩基配列は、塩基番号1479〜1804に示されている。配列番号１６で示される塩基配列中に存在するＣｐＧで示される塩基配列中のシトシンは、例えば、膵臓癌細胞等の癌細胞において高いメチル化頻度（即ち、高メチル化状態（hypermethylation））を示す。更に具体的には、膵臓癌細胞においてメチル化頻度が高いシトシンとしては、例えば、配列番号１６で示される塩基配列において、塩基番号1002、1010、1019、1021、1051、1056、1061、1063、1080、1099、1110、1139、1141、1164、1169、1184等で示される塩基番号であるシトシンを挙げることができる。
【００２６】
「メチル化ＤＮＡ抗体」とは、ＤＮＡ中のメチル化された塩基を抗原として結合する抗体を意味する。具体的には、メチルシトシン抗体であり、一本鎖ＤＮＡ中の５位がメチル化されたシトシンを認識して結合する性質を有している抗体を挙げることができる。。また、市販されているメチル化DNA抗体であっても、本特許記載のメチル化状態のＤＮＡを特異的に認識して、特異的に結合できる抗体であればよい。
メチル化DNA抗体は、メチル化された塩基、メチル化ＤＮＡ等を抗原として、通常の方法により作成できる。具体的にメチルシトシン抗体を作成するためには、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、或いは、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を抗原として作製された抗体からＤＮＡ中のメチルシトシンへの特異的な結合を指標として選抜することで作製できる。
動物に抗原を免疫して得られる抗体としては、精製した抗原を免疫した後、ＩｇＧ画分の抗体（ポリクローナル抗体）を利用する方法と、単一のクローンを生産する抗体（モノクローナル抗体）を利用する方法がある。本特許ではメチル化ＤＮＡ、或いはメチルシトシンを特異的に認識できる抗体であることが望ましいため、モノクローナル抗体を利用することが望ましい。
【００２７】
モノクローナル抗体を作製する方法としては、細胞融合法による方法を挙げることができる。例えば、細胞融合法は免疫したマウス由来の脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞とを細胞融合させることでハイブリドーマを作製し、ハイブリドーマの生産する抗体を選抜して、メチルシトシン抗体（モノクローナル抗体）を作製できる。細胞融合法でモノクローナル抗体を作製する場合は、抗原を精製する必要がなく、例えば、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等の混合物を抗原として、免疫に用いる動物に投与できる。投与方法としては、５−メチルシチジン、５−メチルシトシン、又は、５−メチルシトシンを含むＤＮＡ等を、直接、抗体を産生させるマウスへ投与する。抗体が産生されにくい場合は、抗原を支持体へ結合させて免疫しても良い。また、アジュバント溶液（例えば、流動パラフィンとＡｒａｃｅｌ Ａを混合し、アジュバントとして結核菌の死菌を混合したもの）と抗原をよく混合することや、リポソームに組み入れて免疫することで、抗原の免疫性を上げることができる。或いは、抗原を含む溶液とアジュバント溶液を等量添加し、十分に乳液状にしてから、マウスの皮下或いは腹腔内に注射する方法や、ミョウバン水とよく混合してから百日咳死菌をアジュバントとして添加する方法がある。尚、最初の免疫をしてから適当な期間の後、マウスの腹腔内或いは静脈内に追加免疫することもできる。また、抗原の量が少ない場合には、抗原が浮遊する溶液を、直接マウス脾臓に注入して免疫しても良い。
最終免疫から数日後に脾臓を摘出し脂肪組織を剥離してから、脾細胞浮遊液を作製する。この脾細胞と、例えばＨＧＰＲＴ欠損骨髄腫細胞とを細胞融合してハイブリドーマを作製する。細胞融合剤としては脾細胞（Ｂ細胞）と骨髄腫細胞を効率的に融合できる方法ならば何でもよく、例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる方法などが挙げられる。また、高電圧パルスを用いる方法で細胞融合をしても良い。
細胞融合操作の後、ＨＡＴ培地で培養し、脾細胞と骨髄腫細胞が融合したハイブリドーマのクローンを選択し、スクリーニングが可能になるまで細胞が成育するのを待つ。目的とする抗体を生産するハイブリドーマを選択するための抗体の検出法や抗体力価の測定法には、抗原抗体反応系を利用できる。具体的には、可溶性抗原に対する抗体測定法で、放射性同位元素免疫定量法（ＲＩＡ）、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）などが挙げられる。
【００２８】
一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されていれば抗メチル化抗体と結合することができる。従って、本発明における「メチル化された一本鎖ＤＮＡ」とは、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧが少なくとも一箇所以上メチル化されている一本鎖ＤＮＡを意味しており、一本鎖ＤＮＡ中に存在するＣｐＧの全てがメチル化されている一本鎖ＤＮＡに限った意味ではない。
【００２９】
本発明における「（目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、）増幅されたＤＮＡの量」とは、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的領域におけるメチル化されたＤＮＡの増幅後の量そのもの、即ち、本発明の後述する第三工程で求めた量を意味するものである。例えば、生物由来検体が１ｍＬの血清であった場合には、血清１ｍＬ中に含まれる前記のメチル化されたＤＮＡに基づいて増幅されたＤＮＡの量を意味する。
【００３０】
「相補性によって結合（相補的な（塩基対合による）結合）」とは、塩基同士の水素結合による塩基対合により二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。例えば、ＤＮＡを構成する二本鎖の各々一本鎖ＤＮＡを構成する塩基が、プリンとピリミジンの塩基対合により二本鎖を形成することであり、より具体的には、複数の連続した、チミンとシトシン、グアニンとアデニンの水素結合による塩基結合により、二本鎖ＤＮＡを形成することを意味する。相補性によって結合することを「相補的な結合」と呼ぶこともある。「相補的な結合」は、「相補的に塩基対合しうる」又は「相補性により結合」と表現することもある。また、相補的に結合しうる塩基配列を互いに「相補性を有する」[相補性である]と表現することもある。尚、人工的に作成されるオリゴヌクレオチドに含まれるイノシンがシトシン、アデニン、チミンと水素結合の水素結合で結合することも意味する。
「目的とするＤＮＡ領域（に対して相補性である塩基配列）を含む一本鎖ＤＮＡ」とは、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡとの結合体（二本鎖）を形成するために必要な塩基配列、即ち、目的とするＤＮＡ領域の塩基配列の一部に相補的な塩基配列を含む塩基配列であることを意味し、「相補的塩基配列」と表現することもある。また、相補的塩基配列は、「相補的」と表現することもある。
【００３１】
第一工程において、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う。
「メチル化感受性制限酵素」とは、例えば、メチル化されたシトシンを含む認識配列を消化せず、メチル化されていないシトシンを含む認識配列のみを消化することのできる制限酵素等を意味する。即ち、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されているＤＮＡの場合には、該メチル化感受性制限酵素を該ＤＮＡに作用させても、該ＤＮＡは切断されない。これに対して、メチル化感受性制限酵素が本来認識することができる認識配列に含まれるシトシンがメチル化されていないＤＮＡの場合には、該メチル化感受性制限酵素を該ＤＮＡに作用させれば、該ＤＮＡは切断される。このようなメチル化感受性酵素の具体的な例としては、例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素であるHpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等を挙げることができる。尚、前記のメチル化感受性制限酵素は、すでにGruenbaumらにより明らかにされている（Nucleic Acid Research, 9、 2509-2515）。
【００３２】
メチル化感受性制限酵素による消化の有無を調べる方法としては、具体的には例えば、前記ＤＮＡを鋳型とし、解析対象とするシトシンを認識配列に含むＤＮＡを増幅可能なプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ＤＮＡの増幅（増幅産物）の有無を調べる方法を挙げることができる。解析対象とするシトシンがメチル化されている場合には、増幅産物が得られる。一方、解析対象とするシトシンがメチル化されていない場合には、増幅産物が得られない。このようにして、増幅されたＤＮＡの量を比較することにより、解析対象となるシトシンのメチル化されている割合を測定することができる。
即ち、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡがメチル化されていれば、前記のメチル化感受性制限酵素がメチル化状態であるＤＮＡを切断しないという特性を利用することにより、前記の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたか否かを区別することができる。即ち、前記のメチル化感受性制限酵素で消化処理することにより、仮に生物由来検体生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、該メチル化感受性制限酵素により切断される。また仮に生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、該メチル化感受性制限酵素により切断されない。従って、消化処理を実施した後、後述のように、前記の目的とするＤＮＡ領域を増幅可能な一対のプライマーを用いたＰＣＲを実施することにより、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記制限酵素の認識部位の中に存在している少なくとも１つ以上のＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていないのであれば、ＰＣＲによる増幅産物は得られず、一方、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおける前記のメチル化感受性制限酵素の認識部位の中に存在している全てのＣｐＧ対におけるシトシンがメチル化されていたのであれば、ＰＣＲによる増幅産物が得られることになる。
【００３３】
第一工程は、具体的には例えば、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが哺乳類由来のゲノムＤＮＡの場合には、以下のように実施すればよい。哺乳類由来のゲノムＤＮＡに、最適な10×緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithothreitol）を3μL、1mg/mL BSA水溶液を3μL、メチル化感受性制限酵素HpaII又はHhaI（10U/μL）等を夫々1.5μL加え、次いで該混合物に滅菌超純水を加えて液量を30μLとし、37℃で１時間〜３時間インキュベーションすればよい。
【００３４】
また第一工程における、メチル化感受性制限酵素処理の好ましい態様としては、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加する方法が挙げられる。具体的には、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと、を混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ａ）工程と、第一（Ａ）工程で選択された一本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一（Ｂ）工程と、から構成されてもよい。具体的には例えば、メチル化感受性制限酵素処理をするための溶液中にマスキング用オリゴヌクレオチドを添加すればよい。
この第一（Ａ）工程と第一（Ｂ）工程とを経ることによって、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が一本鎖ＤＮＡであっても、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素により消化することができる。また、第一（Ａ）工程と第一（Ｂ）工程は連続して実施しても構わないし、同時に実施しても構わない。
【００３５】
「マスキング用オリゴヌクレオチド」とは、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであり、一本鎖ＤＮＡ中の目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、少なくとも１箇所（全ての個所でも良い）と相補的に結合することで二本鎖を形成し（即ち、前記箇所を二本鎖状態にして）、二本鎖ＤＮＡのみを基質とするメチル化感受性制限酵素でも前記箇所を消化できるように、また、試料が一本鎖ＤＮＡである場合、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素は二本鎖ＤＮＡも消化でき、その消化効率は、二本鎖ＤＮＡに対する方が一本鎖ＤＮＡに対するよりも高い）での前記箇所の消化効率を向上させることができるようにするためのオリゴヌクレオチドであり、且つ、目的とする領域のＤＮＡを含む一本鎖ＤＮＡと一本鎖固定化オリゴヌクレオチドとの二本鎖の形成を阻害しないオリゴヌクレオチドを意味する。また、該マスキング用オリゴヌクレオチドは、後述のリバース用プライマー（正鎖）を伸長プライマーとして、該マスキング用オリゴヌクレオチド（負鎖）を鋳型として、伸長プライマーを伸長させる反応に利用できないオリゴヌクレオチドでなければならない。尚、塩基長としては、８〜２００塩基長が望ましい。
【００３６】
ゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に混合させるマスキング用オリゴヌクレオチドは、１種類でもよく複数種類でも良い。複数種類を用いると、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡのメチル化感受性制限酵素の認識部位の多くが二本鎖状態になり、メチル化感受性制限酵素での、後述の「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができる。マスキング用オリゴヌクレオチドは、例えば、目的とするＤＮＡ領域に含まれる数箇所あるメチル化感受性制限酵素の認識配列のうち、メチル化している場合には消化せずにメチル化していない場合には消化したい箇所（例えば、疾患患者検体では100%メチル化されており、健常者検体では100%メチル化されていない箇所等）に応じて設計し、これを使用することが特に有用である。
【００３７】
尚、第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理での懸念点として、メチル化されていないシトシンを含む認識配列を完全に消化できない（所謂「ＤＮＡの切れ残し」）虞を挙げることができる。このような虞が問題となる場合には、メチル化感受性制限酵素の認識部位が多く存在すれば、「ＤＮＡの切れ残し」を最小限に抑えることができるので、目的とするＤＮＡ領域としては、メチル化感受性制限酵素の認識部位を少なくとも１つ以上有しており、その認識部位が多ければ多いほどよいと考えられる。
【００３８】
尚、「生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料」が、該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料であることを好ましい態様の一つとして挙げることができる。ここで、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡの消化物を固定化オリゴヌクレオチドで選択する場合には、短い鋳型ＤＮＡの方がより選択され易く、また、ＰＣＲで目的領域を増幅する場合にも、鋳型ＤＮＡが短い方がよいと考えられるので、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素を生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料に直接使用し消化処理を実施してもよい。尚、目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素により消化処理する方法としては、一般的な制限酵素処理法を用いればよい。
これらの好ましい態様は、生物由来検体そのものを予め上記のような制限酵素で消化処理しておくことにより、メチル化量を精度良く求めることができるためである。該方法は、上記のような「ＤＮＡの切れ残し」を無くすのに有用である。
【００３９】
生物由来検体に含まれるゲノムＤＮＡ由来の試料をメチル化感受性制限酵素により消化する方法としては、生物由来検体がゲノムＤＮＡ自体の場合には前記の方法と同様な方法でよく、生物由来検体が組織溶解液、細胞溶解液等の場合には前記の方法と同様な方法に準じて、大過剰のメチル化感受性制限酵素、例えば、25ngのＤＮＡ量に対して500倍量（10U）又はそれ以上のメチル化感受性制限酵素を用いて消化処理を実施すればよい。
ゲノムＤＮＡは、基本的には二本鎖ＤＮＡとして存在している。したがって、本操作においては、一本鎖を消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HhaI）だけでなく、二本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素（例えば、HpaII、BstUI、NarI、SacII、HhaI等）を用いることができる。
【００４０】
他に、第一工程の態様としては、一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素での消化処理を実施せずに第二工程を実施する等を挙げることができる。目的とするＤＮＡ領域に一本鎖ＤＮＡを消化できるメチル化感受性制限酵素で切断される塩基配列が無い場合には、第一工程を実施せずに第二工程を実施しても構わない。
【００４１】
本発明測定方法の第二工程では、第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する。また、第二工程は、第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料に含まれるメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化された一本鎖ＤＮＡに分離する第二（Ａ）工程と、第二（Ａ）工程で得られたメチル化一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる第二（Ｂ）工程とから構成されてもよい。
【００４２】
本発明測定方法の第二（Ａ）工程において、「第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料に含まれるメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化された一本鎖ＤＮＡに分離する」際、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにするための一般的は操作を行えばよい。具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料を適当量の超純水に溶解し、95℃で10分間加熱し、氷中で急冷すればよい。
【００４３】
本発明測定方法の第二（Ｂ）工程における
【００４４】
第二（Ｂ）工程においては、第一工程で得られたＤＮＡから、メチル化された一本鎖ＤＮＡを、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させることにより選択する。固定化メチル化DNA抗体は、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを選択するために用いられる。また、固定化メチル化DNA抗体は、支持体に固定化され得るものであればよく、「支持体に固定化され得るもの」とは、固定化メチル化DNA抗体を支持体へ直接的、或いは間接的に固定できることを意味する。このように固定化されるためには、固定化メチル化DNA抗体を通常の遺伝子工学的な操作方法又は市販のキット・装置等に従って、支持体に固定すればよい（固相への結合）。具体的には、固定化メチル化DNA抗体をビオチン化して得られたビオチン化固定化メチル化DNA抗体をストレプトアビジンで被覆した支持体（例えば、ストレプトアビジンで被覆したＰＣＲチューブ、ストレプトアビジンで被覆した磁気ビーズ等）に固定する方法を挙げることができる。
また、固定化メチル化DNA抗体を、アミノ基、チオール基、アルデヒド基等の活性官能基を有する分子を共有結合させた後、シランカップリング剤等で表面を活性化させたガラス、多糖類誘導体、シリカゲル、或いは前記合成樹脂等、若しくは耐熱性プラスチック製の支持体に共有結合させる方法もある。尚、共有結合には、例えば、トリグリセライドを５個直列に連結して成るようなスペーサー、クロスリンカー等により共有結合させる方法も挙げられる。
更に、固定化メチル化DNA抗体を直接支持体に固定化してもよく、また、固定化メチル化DNA抗体に対する抗体（二次抗体）を支持体に固定化し、二次抗体にメチル化抗体を結合させることで支持体に固定してもよい。
尚、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を選択する際に本固定化固定化メチル化DNA抗体が支持体に固定化されていればよく、（１）該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化固定化メチル化DNA抗体との結合前の段階で、本固定化固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよく、また（２）該一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と本固定化固定化メチル化DNA抗体との結合後の段階で、本固定化固定化メチル化DNA抗体と支持体との結合により固定化されるものであってもよい。
【００４５】
第二（Ｂ）工程において、「メチル化された一本鎖ＤＮＡを、固定化固定化メチル化DNA抗体と結合させることにより、前記の一本鎖ＤＮＡを選択する」際、具体的には例えば、固定化固定化メチル化DNA抗体として、「ビオチン標識されたビオチン化メチルシトシン抗体」を使用して、以下のように実施すればよい。
（ａ）ビオチン化メチルシトシン抗体を適当量（例えば、0.1μg/50μL）アビジン被覆ＰＣＲチューブに添加し、その後、室温で約１時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体とストレプトアビジンの固定化を促す。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、１００μＬ/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、支持体に固定化されたビオチン化メチルシトシン抗体をＰＣＲチューブ内に残す。
（ｂ）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡをバッファー（例えば、33mM Tris-Acetate pH 7.9、66mM KOAc、10mM MgOAc2、0.5mM Dithothreitol）とを混合して、９５℃で数分間加熱する。その後、約０〜４℃の温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温し、一本鎖ＤＮＡを形成させる。その後、室温に戻す。
（ｃ）形成された前記一本鎖ＤＮＡを、ビオチン化メチルシトシン抗体が固定化されたアビジン被覆ＰＣＲチューブに添加し、その後、室温で約１時間静置し、ビオチン化メチルシトシン抗体と、前記一本鎖ＤＮＡのうちメチル化された一本鎖ＤＮＡとの結合を促す（結合体の形成）（この段階で、少なくともメチル化されてないＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡは、結合体を形成しない。）。その後、残溶液の除去及び洗浄を行う。洗浄バッファー[例えば、0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を、１００μＬ/チューブの割合で添加し、溶液を取り除く。この洗浄操作を数回繰り返し、結合体をＰＣＲチューブ内に残す（結合体の選択）。
（ｂ）において使用するバッファーとしては、生物試料由来のゲノムＤＮＡ由来の二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡへ分離するために適していれば良く、前記バッファーに限ったわけではない。
（ａ）及び（ｃ）における洗浄操作は、溶液中に浮遊している固定化されていない固定化メチル化DNA抗体、固定化メチル化DNA抗体に結合しなかった溶液中に浮遊しているメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ、または、後述の制限酵素で消化された溶液中に浮遊しているＤＮＡ等を反応溶液から取り除くため重要である。尚、洗浄バッファーは、上記の遊離の固定化メチル化DNA抗体、溶液中に浮遊している一本鎖ＤＮＡ等の除去に適していれば良く、前記洗浄バッファーに限らず、ＤＥＬＦＩＡバッファー（PerkinElmer社製、Tris-HCl pH 7.8 with Tween 80）、ＴＥバッファー等でも良い。
【００４６】
他に第二（Ａ）工程において、メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際の好ましい態様としては、カウンターオリゴヌクレオチドを添加すること等を挙げることができる。カウンターオリゴヌクレオチドとは、目的とするＤＮＡ領域と同じ塩基配列を短いオリゴヌクレオチドに分割したものである。通常１０〜１００塩基、より好ましくは、２０〜５０塩基の長さに設計したものであればよい。尚、カウンターオリゴヌクレオチドは、フォーワード用プライマーあるいはリバース用プライマーが目的とするＤＮＡ領域と相補的に結合する塩基配列上には設計しない。カウンターオリゴヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに比し、大過剰で添加され、目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）にした後、固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる際に、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖（負鎖）と目的とするＤＮＡ領域を一本鎖（正鎖）が相補性により再結合することを妨げるために添加する。目的とするＤＮＡ領域にメチル化ＤＮＡ抗体を結合させて、ＤＮＡのメチル化頻度又はそれに相関関係のある指標値を測定する際に、目的領域が一本鎖である方がメチル化ＤＮＡ抗体に結合しやすいからである。尚、カンウターオリゴヌクレオチドは、目的とするＤＮＡ領域に比べて、少なくとも１０倍、通常は１００倍以上の量が添加されることが望ましい。
【００４７】
「メチル化された一本鎖ＤＮＡを分離する際にカウンターオリゴヌクレオチドを添加する」とは、具体的には、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料から、メチル化された一本鎖ＤＮＡを選択するために、生物由来生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をカウンターオリゴヌクレオチドと混合して、目的とするＤＮＡ領域の相補鎖とカウンターオリゴヌクレオチドとの二本鎖を形成させればよい。例えば、前記ＤＮＡ試料と、前記カウンターオリゴヌクレオチドを、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合して、９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温し、次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻せばよい。
【００４８】
第三工程において、下記の各本工程の前工程として、第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを、固定化固定化メチル化DNA抗体から分離して遊離の一本鎖状態のＤＮＡにする工程（第一前工程）と、
第一前工程で遊離の一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）と、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、遊離の一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ｂ工程（本工程）とを有し、
更に第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
【００４９】
第三工程では、まず、下記の各本工程の前工程のうち第一前工程として、第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを固定化固定化メチル化ＤＮＡ抗体から一旦分離して一本鎖状態であるＤＮＡにする。具体的には例えば、第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡに、アニーリングバッファーを添加することにより、混合物を得る。次いで、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）を得る。その後、第二前工程では、具体的には例えば、第一前工程で得られた一本鎖状態のＤＮＡ（正鎖）とフォワードプライマーを、滅菌超純水を17.85μL、最適な緩衝液（例えば、100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2）を3μL、2mM dNTPを3μL、5N ベタインを6μL加え、次いで該混合物にAmpliTaq（ＤＮＡポリメラーゼの１種：5U/μL）を0.15μL加えて液量を30μLとした溶液中で混合し、37℃で約2時間インキュベーションし、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる。第三前工程においては、具体的には例えば、第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡに、アニーリングバッファーを添加することにより混合物を得て、得られた混合物を９５℃で数分間加熱することにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡに一旦分離する。
その後、本工程として、
(i) 生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）に、前記のフォワード用プライマーをアニーリングさせるために、例えば、前記のフォワード用プライマーのＴｍ値の約０〜２０℃低い温度まで速やかに冷却し、その温度で数分間保温する。
(ii)その後、室温に戻す。
(iii)上記(i)でアニーリングさせた前記の一本鎖状態であるＤＮＡを鋳型として、前記のフォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる（即ち、第Ａ工程）。具体的には例えば、後述の説明や前述の本発明の第二前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(iv)生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’ 末端より更に３’ 末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の一本鎖状態であるＤＮＡを伸長形成された二本鎖ＤＮＡとする（即ち、第Ｂ工程）。具体的には例えば、上記(iii)のＡ工程と同様に、第二前工程における伸長反応での操作方法等に準じて実施すればよい。
(v)更に第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すこと（例えば、第Ａ工程及び第Ｂ工程）により、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する。
【００５０】
第三工程は、具体的には、第一前工程から開始して本工程に至るまでの反応を、一つのＰＣＲ反応として実施することもできる。また、第一前工程から第三前工程まで、各々、独立した反応として実施し、本工程のみをＰＣＲ反応として実施することもできる。
【００５１】
選択された一本鎖ＤＮＡに含まれる目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）を増幅する方法としては、例えば、ＰＣＲを用いることができる。目的領域を増幅する際に、予め蛍光等で標識されたプライマーを使用してその標識を指標とすれば、電気泳動等の煩わしい操作を実施せずに増幅産物の有無を評価できる。ＰＣＲ反応液としては、例えば、本発明の第二工程で得たＤＮＡに、50μMのプライマーの溶液を0.15μlと、2mM dNTPを2.5μlと、10×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、20mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を2.5μlと、AmpliTaq Gold (耐熱性DNAポリメラーゼの一種： 5U/μl)を0.2μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を25μlとした反応液を挙げることができる。
目的とするＤＮＡ領域（即ち、目的領域）は、ＧＣリッチな塩基配列が多いため、時に、ベタイン、ＤＭＳＯ等を適量加えて反応を実施してもよい。反応条件としては、例えば、前記のような反応液を、95℃にて10分間保温した後、95℃にて30秒間次いで55〜65℃にて30秒間更に72℃にて30秒間を１サイクルとする保温を30〜40サイクル行う条件が挙げられる。かかるＰＣＲを行った後、得られた増幅産物を検出する。例えば、予め標識されたプライマーを使用した場合には、先と同様の洗浄・精製操作を実施後、蛍光標識体の量の測定によりＰＣＲ反応での増幅量を評価することができる。また、標識されていない通常のプライマーを用いたＰＣＲを実施した場合は、金コロイド粒子、蛍光等で標識したプローブ等をアニーリングさせ、目的領域に結合した該プローブの量を測定することにより検出することができる。また、増幅産物の量をより精度よく求めるには、例えば、リアルタイムＰＣＲ法を用いればよい。リアルタイムＰＣＲ法とは、ＰＣＲをリアルタイムでモニターし、得られたモニター結果をカイネティックス分析する方法であり、例えば、遺伝子量に関して２倍程度のほんのわずかな差異をも検出できる高精度の定量ＰＣＲ法として知られる方法である。該リアルタイムＰＣＲ法には、例えば、鋳型依存性核酸ポリメラーゼプローブ等のプローブを用いる方法、サイバーグリーン等のインターカレーターを用いる方法等を挙げることができる。リアルタイムＰＣＲ法のための装置及びキットは市販されるものを利用してもよい。以上の如く、検出については特に限定されることはなく、これまでに周知のあらゆる方法による検出が可能である。これら方法では、反応容器を移し換えることなく検出までの操作が可能となる。
【００５２】
本発明は、下記のような場面において利用すればよい。
各種疾患（例えば、癌）においてＤＮＡのメチル化異常が起こることが知られており、このＤＮＡメチル化異常を検出することにより、各種疾患の度合いを測定することが可能と考えられている。
例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100％メチル化されているＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量は多くなり、例えば、疾患由来の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて100%メチル化されていないＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明を実施すれば、メチル化されたＤＮＡの量はほぼ０に近い値となるであろう。また、例えば、健常者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて低メチル化状態（hypomethylation）で、且つ、疾患患者の生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡにおいて高メチル化状態（hypermethylation）であるＤＮＡ領域があり、そのＤＮＡ領域について、本発明を実施すれば、健常者の場合には、メチル化されたＤＮＡの量は、０に近い値を示し、一方、疾患患者の場合には、健常者の場合における値よりも有意に高い値を示すため、この値の差異に基づき、「疾患の度合い」を判定することができる。ここでの「疾患の度合い」とは、一般に該分野において使用される意味と同様であって、具体的には、例えば、生物由来検体が細胞である場合には該細胞の悪性度を意味し、また、例えば、生物由来検体が組織である場合には該組織における疾患細胞の存在量等を意味している。更に、生物由来検体が血漿・血清である場合にはその個体が疾患を有する確率を意味している。従って、本発明は、メチル化異常を調べることにより、各種疾患を診断することを可能にする。
【００５３】
このような本発明における、目的領域のメチル化されたＤＮＡ量の測定を行うための各種方法で使用し得る制限酵素、プライマー又はプローブは、検出用キットの試薬として有用である。本発明は、これら制限酵素、プライマー又はプローブ等を試薬として含有する検出用キットや、これらプライマー又はプローブ等が支持体上に固定化されてなる検出用チップも提供しており、本発明又は本発明メチル化割合測定方法の権利範囲は、該方法の実質的な原理を利用してなる前記のような検出用キットや検出用チップのような形態での使用ももちろん含むものである。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００５５】
実施例１
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.1μg/100μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００５６】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計９本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明で使用する固定化メチル化DNA抗体の調製に相当する）。
【００５７】
配列番号１７で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-Ｍ(７)、配列番号１８で示される塩基配列からなるＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）、配列番号１９で示される塩基配列からなるアンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６／９８ｍｅｒ-ＵＭを合成して、夫々につき０．００１ｐｍｏｌ/１０μＬ ＴＥバッファー溶液を調製した。
【００５８】
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチド＞
Ｎは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-M(7)：
5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGNGCNGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ （配列番号１７）
＜ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチド＞
Ｎは5-メチルシトシンを示す。
GPR7-2079-2176/98mer-HM(5)：
5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCNGGCCGCACCTACAGNGCCGNGNGNGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ （配列番号１８）
＜アンメチル化オリゴヌクレオチド＞
GPR7-2079-2176/98mer-UM：
5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ （配列番号１９）
【００５９】
得られた夫々の溶液（各溶液について３本ずつ調製）について、以下のＡ処理、Ｂ処理またはＣ処理を施した（各１本ずつ調製）。
【００６０】
Ａ処理群（無処理群）：前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）を５μＬとを加えて、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【００６１】
Ｂ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）：前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/mL）を５μＬと、ＨｐａＩＩを１０Ｕとを加えて、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【００６２】
Ｃ群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩ処理群）：前記で調製したサンプルに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を５μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を５μＬと、ＨｐａＩＩを１０Ｕと、配列番号２０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドＭＡをマスキング用オリゴヌクレオチドとして５ｐｍｏｌ加えて、更に該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとした。
【００６３】
＜マスキング用オリゴヌクレオチド＞
MA：5’ - GCCACCCGGCGCGA -3’ （配列番号２０）
【００６４】
各々の反応液を３７℃で１晩インキュベーションした。（以上、本発明の第一工程に相当する）
【００６５】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したオリゴヌクレオチド反応液５０μLを加え、室温で１時間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作を更に２回繰り返した（以上、本発明の第二工程に相当する）。
【００６６】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの各溶液（ＰＦ１及びＰＲ１）及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、目的とするＤＮＡ領域（ＧＰＲ７-２０７９-２１７６、配列番号２３、メチルシトシンもCで表す）におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００６７】
＜プライマー＞
ＰＦ１：5’ -GTTGGCCACTGCGGAGTCG-3’ （配列番号２１）
ＰＲ１：5’ -GCACGACGAGTGTGACGATC-3’ （配列番号２２）
【００６８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
GPR7-2079-2176：5’ - GTTGGCCACTGCGGAGTCGCGCCGGGTGGCCGGCCGCACCTACAGCGCCGCGCGCGCGGTGAGCCTGGCCGTGTGGGGGATCGTCACACTCGTCGTGC -3’ （配列番号２３）
【００６９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、３μＭに調製された配列番号２１及び配列番号２２で示される塩基配列からなるプライマーの溶液各５μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold）５Ｕ／μLを０．２５μLと、５Ｎベタイン水溶液を１０μＬとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで５９℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、２％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明の第三工程に相当する。）。
【００７０】
その結果を図１に示した。Ａ処理群（無処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）と、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）では、増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られた。アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。Ｂ処理群（ＨｐａＩＩ処理群）の場合も、Ａ処理群と同様の結果であった。Ｃ処理群（マスキング用オリゴヌクレオチド添加＋ＨｐａＩＩ処理群）の場合、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）では、増幅が確認されその増幅産物（目的とするＤＮＡ領域：ＧＰＲ７−２０７９−２１７６）が得られたが、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）、及び、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００７１】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを選択することが可能であること、また、マスキング用オリゴヌクレオチドを添加・混合しメチル化感受性制限酵素で処理することにより、マスキング用オリゴヌクレオチドで保護されたメチル化感受性制限酵素認識部位がメチル化されていない目的とするＤＮＡ領域を消化できること、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されていないＤＮＡを増幅することなく、メチル化されたＤＮＡのみを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量できることが確認された。
【００７２】
実施例２
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００７３】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００７４】
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号２４及び配列番号２５で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマープライマー（ＰＦ２及びＰＲ２）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｘ、配列番号２６、Genbank Accession No. NT_029419等に示される塩基番号25687390-25687775に相当する領域）を増幅した。
【００７５】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ （配列番号２４）
ＰＲ２：5’ - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号２５）
【００７６】
＜DNAフラグメント＞
Ｘ：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’（配列番号２６）
【００７７】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６１℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＸを精製した。
【００７８】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこれらの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＸ、配列番号２７）を得た。
【００７９】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＸ：5’ - CTCAGCACCCAGGNGGCNGNGATCATGAGGNGNGAGNGGNGNGNGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGNGGGTGGCACACNGNGATGTAGNGGTNGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCNGANGCAAACATGCNGAACACCTGCAGGTGCTTCACCANGNGGCACAGCCAGTNGGGGCNGNGGAAGNGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGNGGCAGCACCTGGAAGAATGCCANGGCCAGGTNGGCCAGGCTGAGGTGTNGGATGAAGAGGTGCATGNGGGANGTCTTGNGNGGNGTCNGGTGCAGAGCCAGCAGTANGCTGCTGTTGCCCAGCANGGCCACNGNGAAAGTCACNGCCAGCANGGNGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ （配列番号２７）
【００８０】
得られたＤＮＡフラグメントＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/5μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/5μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【００８１】
得られたＤＮＡフラグメントＭＸについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【００８２】
前記のＤＮＡフラグメントＸの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＸの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【００８３】
前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液５μＬに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした各々の混合液を３７℃で３時間インキュベーションした（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
【００８４】
配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’ の負鎖に相補性により結合可能な配列番号２９〜配列番号４０で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１〜Ｃ１２を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【００８５】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’ ：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ （配列番号２８）
【００８６】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１：5’ - GCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCG -3’ （配列番号２９）
Ｃ２：5’ - GCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACG -3’ （配列番号３０）
Ｃ３：5’ - CGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGA -3’ （配列番号３１）
Ｃ４：5’ - AGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATG -3’ （配列番号３２）
Ｃ５：5’ - ACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCC -3’ （配列番号３３）
Ｃ６：5’ - TAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGC -3’ （配列番号３４）
Ｃ７：5’ - CGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGG -3’ （配列番号３５）
Ｃ８：5’ - ATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACG -3’ （配列番号３６）
Ｃ９：5’ - ATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAAC -3’ （配列番号３７）
Ｃ１０：5’ - TGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTC -3’ （配列番号３８）
Ｃ１１：5’ - CGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGG -3’ （配列番号３９）
Ｃ１２：5’ - CAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGG -3’ （配列番号４０）
【００８７】
前記の反応液に、調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【００８８】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。
【００８９】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号２４及び配列番号２５で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ２及びＰＲ２の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｘ’ におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【００９０】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ２：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCC -3’ （配列番号２４）
ＰＲ２：5’ - CTGGCCAAACTGGAGATCGC -3’ （配列番号２５）
【００９１】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｘ’ ：5’ - CTCAGCACCCAGGCGGCCGCGATCATGAGGCGCGAGCGGCGCGCGGGCTGTTGCAGAGTCTTGAGCGGGTGGCACACCGCGATGTAGCGGTCGGCTGTCATGACTACCAGCATGTAGGCCGACGCAAACATGCCGAACACCTGCAGGTGCTTCACCACGCGGCACAGCCAGTCGGGGCCGCGGAAGCGGTAGGTGATGTCCCAGCACATTTGCGGCAGCACCTGGAAGAATGCCACGGCCAGGTCGGCCAGGCTGAGGTGTCGGATGAAGAGGTGCATGCGGGACGTCTTGCGCGGCGTCCGGTGCAGAGCCAGCAGTACGCTGCTGTTGCCCAGCACGGCCACCGCGAAAGTCACCGCCAGCACGGCGATCTCCAGTTTGGCCAG -3’ （配列番号２８）
【００９２】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６１℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第四工程に相当する。）。
【００９３】
その結果を図２に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【００９４】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【００９５】
実施例３
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【００９６】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【００９７】
クロンテック社より購入されたヒト血液由来ゲノムＤＮＡについて、以下の配列番号４１及び配列番号４２で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ３及びＰＲ３）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｙ、配列番号４３、Genbank Accession No. ac009800等に示される塩基番号76606-76726に相当する領域）を増幅した。
【００９８】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ３：5’ - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ （配列番号４１）
ＰＲ３：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号４２）
【００９９】
＜DNAフラグメント＞
Ｙ：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ （配列番号４３）
【０１００】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを５ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて３０秒間次いで６０℃にて３０秒間更に７２℃にて４５秒間を１サイクルとする保温を５０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＹを精製した。
【０１０１】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を５回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＹ、配列番号４４）を得た。
【０１０２】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＹ：5’ - GNGCNGGGTCNGGGCCNGATGNGTTGGNGGGCCAGGGCTCNGAGAANGAGGNGTTGTCCATCTCAANGAGGGCAGAGGAGCNGGNGACCTGGNGTCCCCCAAGGANGCCCTANGGAGCTCA -3’ （配列番号４４）
【０１０３】
得られたＤＮＡフラグメントＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/5μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/5μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０４】
得られたＤＮＡフラグメントＭＹについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１０５】
前記のＤＮＡフラグメントＹの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＹの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１０６】
前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液５μＬに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした各々の混合液を３７℃で３時間インキュベーションした（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
【０１０７】
配列番号４５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’ の負鎖に相補性により結合可能な配列番号４６、塩基配列４７及び配列番号４８で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１３、Ｃ１４、及びＣ１５を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１０８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’ ：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ （配列番号４５）
【０１０９】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１３：5’ - GCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ （配列番号４６）
Ｃ１４：5’ - CTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTG -3’ （配列番号４７）
Ｃ１５：5’ - CGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGG -3’ （配列番号４８）
【０１１０】
前記の反応液に、調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１１１】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。
【０１１２】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号４１及び配列番号４２で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ３及びＰＲ３の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号４５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｙ’ におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１１３】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ３：5’ - TGAGCTCCGTAGGGCGTCC -3’ （配列番号４１）
ＰＲ３：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCC -3’ （配列番号４２）
【０１１４】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｙ’ ：5’ - GCGCCGGGTCCGGGCCCGATGCGTTGGCGGGCCAGGGCTCCGAGAACGAGGCGTTGTCCATCTCAACGAGGGCAGAGGAGCCGGCGACCTGGCGTCCCCCAAGGACGCCCTACGGAGCTCA -3’ （配列番号４５）
【０１１５】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで６０℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２５サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する。）。
【０１１６】
その結果を図３に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されなかった。
【０１１７】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【０１１８】
実施例４
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１１９】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１２０】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
得られたゲノムＤＮＡから、以下の配列番号４９及び配列番号５０で示されるＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー（ＰＦ４及びＰＲ４）及び反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、供試サンプルとして用いられるＤＮＡフラグメント（Ｔ、配列番号５１、Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384569-384685に相当する領域）を増幅した。
【０１２１】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号４９）
ＰＲ４：5’ - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号５０）
【０１２２】
＜DNAフラグメント＞
Ｔ：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５１）
【０１２３】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするゲノムＤＮＡを10ｎｇと、5μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μｌと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μlと、１０×緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μｌと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）5U/μlを０．２５μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μｌとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間更に７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を４０サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認し、Wizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により、ＤＮＡフラグメントＴを精製した。
【０１２４】
得られたＤＮＡフラグメント溶液の一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を３回繰り返し、メチル化したＤＮＡフラグメント（ＭＴ、配列番号５２）を得た。
【０１２５】
＜ＤＮＡフラグメント＞（Ｎは5-メチルシトシンを示す）
ＭＴ：5’ - GGACCTGTGTTTGANGGGTATAACACTAAGTTGNGCAATTTGCTGTATTGNGAAATCNGCCNGGANGATATCACTCTTGAGNGCATGTGCNGTTTCNGAGAANGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５２）
【０１２６】
得られたＤＮＡフラグメントＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：100pg/5μL TE溶液
溶液Ｂ：10pg/5μL TE溶液
溶液Ｃ：1pg/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１２７】
得られたＤＮＡフラグメントＭＴについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：100pg/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：10pg/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：1pg/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１２８】
前記のＤＮＡフラグメントＴの溶液及びメチル化したＤＮＡフラグメントＭＴの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１２９】
前記で調製したＤＮＡフラグメント溶液５μＬに、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした各々の混合液を３７℃で３時間インキュベーションした（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
【０１３０】
配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔ’ の負鎖に相補性により結合可能な配列番号５４〜配列番号５７で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１６〜Ｃ１９を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１３１】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ’ ：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５３）
【０１３２】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１６：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号５４）
Ｃ１７：5’ - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’ （配列番号５５）
Ｃ１８：5’ - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’ （配列番号５６）
Ｃ１９：5’ - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’ （配列番号５７）
【０１３３】
前記の反応液に、調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１３４】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。
【０１３５】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号４９及び配列番号５０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ４及びＰＲ４の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔ’ におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１３６】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号４９）
ＰＲ４：5’ - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号５０）
【０１３７】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ’ ：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５３）
【０１３８】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を２８サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第四工程に相当する。）。
【０１３９】
その結果を図４に示した。メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認されその増幅産物が得られた。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されずその増幅産物は得られなかった。
【０１４０】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【０１４１】
実施例５
市販のメチルシトシン抗体（Aviva Systems Biology社製）を、市販ビオチン化キット（Biotin Labeling Kit-NH2、同仁化学研究所製）を用いて、カタログに記載された方法に準じて、ビオチン標識した。得られたビオチン標識メチルシトシン抗体を溶液[抗体約0.25 μg/μL 0.1% BSA含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）溶液]として冷蔵保存した。
【０１４２】
ストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブ（計８本）に、合成して得られたビオチン標識メチルシトシン抗体の0.1 μg/50 μL溶液を各５０μLの割合で添加し、約１時間室温で放置してＰＣＲチューブに固定化した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法で使用する固定化メチル化ＤＮＡ抗体の調製に相当する）。
【０１４３】
パン酵母酵母株Ｘ２１８０−１ＡをＹＰＤ培地（1% Yeast extract、2% Peptone、2% Glucose, pH 5.6-6.0）で、濁度がOD600 0.6-1.0 になるまで培養し、10,000g で10分間遠心して、1ｘ107の酵母細胞を調製した。調製した酵母細胞から、Methods in Yeast Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory)に記載されているような、一般的な酵母ゲノムの調製法を用いて酵母ゲノムを取得した。
調製した酵母細胞を、バッファーＡ（1M ソルビトール、 0.1M EDTA、pH 7.4）に懸濁し、0.1% 2-メルカプトエタノール（終濃度１４ｍＭ）及び100U zymolase（10 mg/ml）を添加して、溶液が透明になるまで 30°C で１時間、撹拌しながらインキュベートした。550gで10分間遠心してプロトプラストを回収後、バッファーＢ（50 mM Tris-HCl、pH 7.4、 20 mM EDTA）に懸濁してから、ドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、65℃で30分間インキュベートした。続いて、体積比2/5量の5M CH3COOKを添加して混和してから30分間氷冷後、15,000gで30分間遠心して上清を回収した。回収した上清に体積比1/10量の3M CH3COONaと等量のイソプロパノ−ルを加えてよく混和し、15,000g ４℃で30分間遠心して得られた沈澱を７０％エタノールでリンスして回収した。沈澱を乾燥させてから、１ｍl のTEバッファー（10 mM Tris-HCl、pH 8.0、1 mM EDTA）に溶解し、40μg/mlになるようにＲＮａｓｅ Ａ（Sigma社製）を加えて３７℃で１時間インキュベートし、続いて、混合液にproteinase K（Sigma社製）を５００μｇ／ｍｌ及びドデシル硫酸ナトリウムを１％（ｗ／ｖ）になるように加えた後、これを５５℃で約１６時間振とうした。振とう終了後、当該混合物をフェノール[1M Tris-HCl（pH 8.0）にて飽和]・クロロホルム抽出処理した。水層を回収し、これにＮａＣｌを０．５Ｎとなるよう加えた後、これをエタノール沈澱処理して生じた沈澱を回収した。回収された沈澱を７０％エタノールでリンスすることにより、ゲノムＤＮＡを得た。
【０１４４】
得られた酵母ゲノムＤＮＡの一部について、SssI methylase (NEB社製)を１μｌと、１０ｘNEBuffer２(NEB社製)を１０μlと、S-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１００μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて１５-３０分間インキュベーションし、さらにS-adenosyl methionine (3.2 mM, NEB社製)を１μｌを追加して37℃にて１５-３０分間インキュベーションした。これをWizard SV Gel/PCR Kit（PROMEGA社）により精製した。さらにこの操作を３回繰り返し、メチル化酵母ゲノムＤＮＡを得た。
【０１４５】
得られた酵母ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を調製した。
溶液Ａ：10ng/5μL TE溶液
溶液Ｂ：1ng/5μL TE溶液
溶液Ｃ：0.1ng/5μL TE溶液
溶液Ｄ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１４６】
得られたメチル化酵母ゲノムＤＮＡについて、以下の溶液を調製した。
溶液ＭＡ：10ng/5μL TE溶液
溶液ＭＢ：1ng/5μL TE溶液
溶液ＭＣ：0.1ng/5μL TE溶液
溶液ＭＤ：TE溶液（ネガティブコントロール液）
【０１４７】
上記の酵母ゲノムＤＮＡの溶液及びメチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液の夫々について、以下の処理を施した。
【０１４８】
ＰＣＲチューブに、上記に調製したゲノムＤＮＡ溶液５μLと、制限酵素ＸｓｐＩを５Ｕと、ＸｓｐＩに最適な１０ｘ緩衝液（200mM Tris-HCl pH 8.5、100mM MgCl2、10mM Dithiothreitol、1000mM KCl）１μlとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を１０μｌとしたものを調製した。当該反応液を、37℃にて1時間インキュベーションした。
【０１４９】
さらに上記の反応液に、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）を２μＬと、ＢＳＡ（Bovine serum albumin 1mg/ml）を２μＬと、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩを１２Ｕを加え、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を２０μＬとした各々の混合液を３７℃で３時間インキュベーションした（以上、本発明測定方法の第一工程に相当する）。
【０１５０】
配列番号５８で示される塩基配列からなるＤＮＡフラグメントＴ’（Genbank Accession No. NC_001139等に示される酵母染色体VIIの塩基番号384523-384766に相当する領域）の負鎖に相補性により結合可能な配列番号５４〜配列番号５７及び配列番号５９〜配列番号６２で示される塩基配列からなるカウンターオリゴヌクレオチドＣ１６〜Ｃ２３を合成し、夫々の濃度が０．０１μＭであるＴＥバッファー溶液を調製した。
【０１５１】
＜ＤＮＡフラグメント＞
Ｔ’：5’ - TAGGAAATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCCTATTATTAGAGGGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACTGCGATCGCACACGAGGAGACACAGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGACAAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3’ （配列番号５８）
【０１５２】
＜カウンターオリゴヌクレオチド＞
Ｃ１６：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号５４）
Ｃ１７：5’ - AACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGT -3’ （配列番号５５）
Ｃ１８：5’ - ATTGCGAAATCCGCCCGGACGATAT -3’ （配列番号５６）
Ｃ１９：5’ - CACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTC -3’ （配列番号５７）
Ｃ２０：5’ - AATACATTCCGAGGGCGCCCGCACAAGGCC -3’ （配列番号５９）
Ｃ２１：5’ - GCGATCGCACACGAGGAGACA -3’ （配列番号６０）
Ｃ２２：5’ - AGCGTCACGTGTTTTGCCATTTTGTACGAC -3’ （配列番号６１）
Ｃ２３：5’ - AAATGAACCGCCTGGCCACGCCTCTAATC -3’ （配列番号６２）
【０１５３】
前記の酵母ゲノムＤＮＡ及びメチル化酵母ゲノムＤＮＡの夫々の反応液について、以下の処理を施した。
【０１５４】
前記の反応液に、調製したカウンターオリゴヌクレオチド溶液１０μLと、緩衝液（330mM Tris-Acetate pH 7.9、660mM KOAc、100mM MgOAc2、5mM Dithiothreitol）５μＬと、100ｍＭのＭｇＣｌ２溶液５μＬと、1ｍｇ/ｍＬのＢＳＡ溶液５μＬを添加し、さらに当該混合物に滅菌超純水を加えて液量を５０μＬとし、混合した。その後、本ＰＣＲチューブを９５℃で１０分間加熱し、７０℃まで速やかに冷却し、その温度で１０分間保温した。次いで、５０℃まで冷却し１０分間保温し、さらに３７℃で１０分間保温した後、室温に戻した（以上、本発明測定方法の第二工程に相当する）。
【０１５５】
前記のビオチン標識メチルシトシン抗体が固定化されたストレプトアビジン被覆済みＰＣＲチューブに、前記で調製したＤＮＡフラグメントの反応液５０μLを加え、室温で３０分間放置した。その後、溶液をピペッティングにより取り除き、１００μＬの洗浄バッファー[0.05% Tween20含有リン酸バッファー（1mM KH2PO4、3mM Na2HPO 7H2O、154mM NaCl pH7.4）]を添加した後、当該バッファーをピペッティングにより取り除いた。この操作をさらに２回繰り返した（以上、本発明測定方法の第三工程に相当する）。
【０１５６】
次に、上記のＰＣＲチューブに、配列番号４９及び配列番号５０で示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーＰＦ４及びＰＲ４の各溶液及び、下記の反応条件を用いてＰＣＲを行うことにより、配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域Ｔ’ におけるメチル化されたＤＮＡを増幅した。
【０１５７】
＜ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー＞
ＰＦ４：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTAT -3’ （配列番号４９）
ＰＲ４：5’ - AGTACAGATCTGGCGTTCTCG -3’ （配列番号５０）
【０１５８】
＜目的とするＤＮＡ領域＞
Ｔ’ ：5’ - GGACCTGTGTTTGACGGGTATAACACTAAGTTGCGCAATTTGCTGTATTGCGAAATCCGCCCGGACGATATCACTCTTGAGCGCATGTGCCGTTTCCGAGAACGCCAGATCTGTACT -3’ （配列番号５３）
【０１５９】
ＰＣＲの反応液としては、鋳型とするＤＮＡに、５μＭに調製されたオリゴヌクレオチドプライマー溶液各３μLと、each ２ｍＭ ｄＮＴＰを５μLと、緩衝液(100mM Tris-HCl pH 8.3、500mM KCl、15mM MgCl2、0.01％ Gelatin)を５μLと、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ（AmpliTaq Gold、ＡＢＩ社製）５Ｕ／μLを０．２５μLとを混合し、これに滅菌超純水を加えて液量を５０μLとしたものを用いた。当該反応液を、９５℃にて１０分間保温した後、９５℃にて２０秒間次いで５８℃にて３０秒間さらに７２℃にて３０秒間を１サイクルとする保温を３１サイクル行う条件でＰＣＲを行った。
ＰＣＲを行った後、１．５％アガロースゲル電気泳動により増幅を確認した。その結果は、以下の通りであった（以上、本発明測定方法の第四工程に相当する。）。
【０１６０】
その結果を図５に示した。メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液ＭＡ、ＭＢ及びＭＣでは、増幅が確認された。ネガティブコントロール溶液ＭＤでは、増幅が確認されなかった。メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤでは、増幅が確認されなかった。
【０１６１】
以上より、固定化したメチルシトシン抗体で、メチル化された目的とするＤＮＡ領域を含むＤＮＡを選択することが可能であること、また、メチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡをより高感度に検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
本発明により、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を簡便に測定する方法等を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１は、実施例１において、調製されたサンプルから配列番号２３で示された塩基配列からなる領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を２％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。 図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ａ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ｂ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、ＨｐａＩＩの認識配列がメチル化されている部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−Ｍ（７）溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｍ」、ＨｐａＩＩの認識配列の一部がメチル化されていない部分メチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＨＭ（５）溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｈ」、アンメチル化オリゴヌクレオチドＧＰＲ７−２０７９−２１７６/９８ｍｅｒ−ＵＭ溶液の「Ｃ」処理が施されたサンプル「Ｕ」、での結果を示している。
【０１６４】
【図２】図２は、実施例２において、調製されたサンプルから配列番号２８で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＸの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＸの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１６５】
【図３】図３は、実施例３において、調製されたサンプルから配列番号４５で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＹの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＹの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１６６】
【図４】図４は、実施例４において、調製されたサンプルから配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液「ＭＣ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液「Ｃ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液「ＭＢ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液「Ｂ」、メチル化されたＤＮＡフラグメントＭＴの溶液「ＭＡ」、メチル化されていないＤＮＡフラグメントＴの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１６７】
【図５】図５は、実施例５において、調製されたサンプルから配列番号５３で示される塩基配列からなる目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡをＰＣＲにて増幅し、得られた増幅産物を１．５％アガロースゲル電気泳動した結果を示した図である。図中の一番左のレーンから、ＤＮＡマーカー「ＭＫ」、メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＤ」（ネガティブコントロール）、メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液「Ｄ」（ネガティブコントロール）、メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＣ」、メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液「Ｃ」、メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＢ」、メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液「Ｂ」、メチル化酵母ゲノムＤＮＡの溶液「ＭＡ」、メチル化されていない酵母ゲノムＤＮＡの溶液「Ａ」、での結果を示している。
【０１６８】
［配列表フリーテキスト］
配列番号１７
実験のために設計された部分メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１８
実験のために設計された部分メチル化オリゴヌクレオチド
配列番号１９
実験のために設計されたアンメチル化オリゴヌクレオチド
配列番号２０
実験のために設計されたマスキング用オリゴヌクレオチド
配列番号２１
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２２
ＰＣＲのために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２３
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号２４
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２５
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号２６
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号２７
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号２８
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号２９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３３
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号３９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４１
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４２
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号４３
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号４４
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号４５
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号４６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４８
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号４９
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５０
実験のために設計されたオリゴヌクレオチドプライマー
配列番号５１
実験のために設計されたＤＮＡフラグメント
配列番号５２
実験のために設計されたメチル化ＤＮＡフラグメント
配列番号５３
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号５４
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５５
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５６
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５７
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号５８
目的とするＤＮＡ領域からなるオリゴヌクレオチド
配列番号５９
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６０
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６１
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
配列番号６２
実験のために設計されたカウンターオリゴヌクレオチド
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、
（２）第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第二工程、及び、
（３）下記の各本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを、固定化メチル化ＤＮＡ抗体から分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第一前工程）と、
第一前工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ｂ工程（本工程）とを有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物由来検体が哺乳動物の血液、体液、血清、血漿、細胞溶解液又は組織溶解液である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料、又は予め精製されてなるＤＮＡ試料である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第一工程が、
目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと、を混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で選択された一本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一（Ｂ）工程と、から構成される請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素、又はHhaIである請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を行う請求項１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項８】
第二工程が、
第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料に含まれるメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化された一本鎖ＤＮＡに分離する第二（Ａ）工程と、
第二（Ａ）工程で得られたメチル化一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる第二（Ｂ）工程とからなり、
第二（Ａ）工程でメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化一本鎖ＤＮＡに分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡの含量を測定する方法であって、
（１）生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料をメチル化感受性制限酵素による消化処理を行う第一工程、
（２）第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料からメチル化された一本鎖ＤＮＡを取得し、該一本鎖ＤＮＡと、固定化メチル化ＤＮＡ抗体とを結合させて一本鎖ＤＮＡを選択する第二工程、及び、
（３）下記の各本工程の前工程として第二工程で選択された一本鎖ＤＮＡを、固定化メチル化ＤＮＡ抗体から分離して一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）にする工程（第一前工程）と、
第一前工程で一本鎖状態にされたゲノム由来のＤＮＡ（正鎖）を、一本鎖状態であるＤＮＡ（正鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（正鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（正鎖）、に対して相補性である塩基配列（負鎖）を有する伸長プライマー（フォーワード用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を二本鎖ＤＮＡに伸長形成させる工程（第二前工程）と、
第二前工程で伸長形成された二本鎖ＤＮＡを、目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）に一旦分離する工程（第三前工程）を有し、且つ、本工程として
（ａ）生成した目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）を鋳型として、前記フォワード用プライマーを伸長プライマーとして、該伸長プライマーを一回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ａ工程（本工程）と、
（ｂ）生成した目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）を鋳型として、前記の目的とするＤＮＡ領域に対して相補性である塩基配列を含む一本鎖ＤＮＡ（負鎖）が有する塩基配列の部分塩基配列（負鎖）であって、且つ、前記の目的とするＤＮＡ領域の塩基配列（正鎖）に対して相補性である塩基配列（負鎖）の３’末端よりさらに３’末端側に位置する部分塩基配列（負鎖）、に対して相補性である塩基配列（正鎖）を有する伸長プライマー（リバース用プライマー）を伸長プライマーとして、該伸長プライマーを１回伸長させることにより、前記の目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡとして伸長形成させる第Ｂ工程（本工程）とを有し、
さらに第三工程の各本工程を、前記各本工程で得られた伸長形成された二本鎖ＤＮＡを一本鎖状態に一旦分離した後、繰り返すことにより、前記の目的とするＤＮＡ領域におけるメチル化されたＤＮＡを検出可能な量になるまで増幅し、増幅されたＤＮＡの量を定量する第三工程、を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
固定化メチル化ＤＮＡ抗体がメチルシトシン抗体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物由来検体が哺乳動物の血液、体液、血清、血漿、細胞溶解液又は組織溶解液である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡ由来のＤＮＡ試料が、該ゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域を認識切断部位としない制限酵素で予め消化処理されてなるＤＮＡ試料、又は予め精製されてなるＤＮＡ試料である請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
第一工程が、
目的とするＤＮＡ領域を含む一本鎖ＤＮＡ（正鎖）と、メチル化感受性制限酵素の認識部位の塩基配列と相補的な塩基配列からなるマスキング用オリゴヌクレオチドと、を混合することにより、該メチル化感受性制限酵素の認識部位が保護されてなる一本鎖ＤＮＡを選択する第一（Ａ）工程と、
第一（Ａ）工程で選択された一本鎖ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化処理する第一（Ｂ）工程と、から構成される請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
メチル化感受性制限酵素が、生物由来検体中に含まれるゲノムＤＮＡが有する目的とするＤＮＡ領域の中に認識切断部位を有する制限酵素、又はHhaIである請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
第一工程におけるメチル化感受性制限酵素による消化処理を行わずに第二工程を行う請求項１〜６のいずれかの請求項記載の方法。
【請求項８】
第二工程が、
第一工程で得られた消化処理が行われたＤＮＡ試料に含まれるメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化された一本鎖ＤＮＡに分離する第二（Ａ）工程と、
第二（Ａ）工程で得られたメチル化一本鎖ＤＮＡと固定化メチル化ＤＮＡ抗体と結合させる第二（Ｂ）工程とからなり、
第二（Ａ）工程でメチル化された二本鎖ＤＮＡをメチル化一本鎖ＤＮＡに分離する際に、カウンターオリゴヌクレオチドを添加する請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００９−２２５７６０（Ｐ２００９−２２５７６０Ａ）
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−７７９６７（Ｐ２００８−７７９６７）
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２５日（２００８．３．２５）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
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