メチル化ＤＮＡの解析方法
【課題】疾患の発症、例えば、細胞のがん化に関連する遺伝子の発現等に関与しているＤＮＡのメチル化の異常を解析するため、メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ効率よく解析することができる、メチル化ＤＮＡの解析方法を提供する。
【解決手段】ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られたＤＮＡ断片を得、試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行なう、メチル化ＤＮＡの解析方法。制限酵素が、ＣｐＧ部位を含まない塩基配列を認識して切断部位を切断する制限酵素である、メチル化ＤＮＡの解析方法。
【解決手段】ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られたＤＮＡ断片を得、試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットを用いて核酸増幅反応を行なう、メチル化ＤＮＡの解析方法。制限酵素が、ＣｐＧ部位を含まない塩基配列を認識して切断部位を切断する制限酵素である、メチル化ＤＮＡの解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化ＤＮＡの解析方法に関する。より詳しくは、メチル化ＤＮＡの解析方法、プライマーセット、メチル化ＤＮＡの濃縮工程の信頼性の判定方法、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法、及びメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのＣｐＧ部位のメチル化は、遺伝子発現に大きな影響を与えている。例えば、ＤＮＡのメチル化の異常は、疾患の発症、例えば、細胞のがん化に関連する遺伝子の発現等に関与していることが知られている。そのため、がん等の疾患の診断方法や治療方法の開発のために、種々の遺伝子におけるＤＮＡのメチル化が、網羅的に解析されている。
【０００３】
ＤＮＡのメチル化の解析では、例えば、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化結合タンパク質を用いるメチル化ＤＮＡ免疫沈降法等によりメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれ、その後、得られた濃縮物に含まれるＤＮＡのプロファイリングが行なわれている。かかるＤＮＡのメチル化の解析では、メチル化ＤＮＡの濃縮物に非メチル化ＤＮＡが含まれていた場合、解析の効率の低下を招くことがある。例えば、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法では、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体、メチル化結合タンパク質又はビーズに対して、非メチル化ＤＮＡが非特異的に結合又は吸着する場合がある。そのため、かかるＤＮＡのメチル化の解析では、メチル化ＤＮＡの濃縮物中における非メチル化ＤＮＡの有無や含有量の確認が行なわれている。
【０００４】
メチル化ＤＮＡの濃縮物中における非メチル化ＤＮＡの検出は、メチル化されていないとされていたハウスキーピング遺伝子を指標として行なわれている（非特許文献１及び２を参照のこと）。非特許文献１に記載の方法では、グリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＡＰＤＨ」という）遺伝子が非メチル化ＤＮＡの指標として用いられている。かかる非特許文献１に記載の方法では、検出されたＧＡＰＤＨ遺伝子で標準化することにより、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法で得られたメチル化ＤＮＡの濃縮物の濃縮量が決定されている。また、非特許文献２に記載の方法では、非メチル化ＤＮＡとして、ＧＡＰＤＨ遺伝子及びβ−アクチン遺伝子が用いられている。かかる非特許文献２に記載の方法では、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法で得られたメチル化ＤＮＡの濃縮物中にＧＡＰＤＨ遺伝子及びβ−アクチン遺伝子が検出されないことを指標として、メチル化ＤＮＡの濃縮率を評価している。
【０００５】
しかしながら、実際には、ＧＡＰＤＨ遺伝子及びβ−アクチン遺伝子それぞれのＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていることがある。そのため、ＧＡＰＤＨ遺伝子、β−アクチン遺伝子等のハウスキーピング遺伝子を指標として用いた場合、メチル化ＤＮＡの濃縮物中における非メチル化ＤＮＡを正確に検出できない場合がある。そのため、メチル化ＤＮＡの濃縮物の濃縮率、純度の評価、や濃縮工程の信頼性の判定が正確に行なうことができない場合があった。
【０００６】
また、指標とするハウスキーピング遺伝子のメチル化の状態を、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡ配列を決定することで確認し、メチル化ＤＮＡの濃縮物の濃縮率等の正確性を担保することは可能である。しかしながら、この場合、メチル化の状態を確認する作業が煩雑であり、時間がかかる。結果として、簡便に、かつ効率よくメチル化ＤＮＡの濃縮物を用いた、メチル化ＤＮＡの解析ができないという問題があった。
【非特許文献１】イラナ ケシェット(Ilana Keshet)、他１０名、「癌細胞におけるデ・ノボ メチル化の有益な機構の証拠(Evidence for an instructive mechanism of de novo methylation incancer cells)」、ネーチャージェネティクス(NATURE GENETICS)、第３８巻、第２号、２０００６年１月２４日発行、ｐ．１４９−１５３
【非特許文献２】ハヤシ ヒロシ、他７名、「オリゴヌクレオチドタイリングアレイを用いるヒトゲノムにおけるＤＮＡメチル化の高分解能マッピング(High-resolution mapping of DNA methylation in human genome usingoligonucleotide tiling array)」、ヒューマン ジェネティックス(HumanGenetics)、第１２０巻、２００６年９月２６日発行、ｐ．７０１−７１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ効率よく解析することができるメチル化ＤＮＡの解析方法を提供することを１つの課題とする。また、本発明は、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの有無や量を、簡便に、かつ正確に検出することができるプライマーセットを提供することを他の課題とする。さらに、本発明は、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を、簡便に、かつ正確に判定することができるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法を提供することを他の課題とする。また、本発明は、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出することができるメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法を提供することを他の課題とする。さらに、本発明は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡの濃縮率を簡便に、かつ正確に算出することができるメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法を提供することを他の課題とする。本発明は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を簡便に、かつ正確に評価することができる、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法を提供することを他の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、（Ｅ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定する工程、及び（Ｆ）メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、を含む、メチル化ＤＮＡの解析方法；
（２）前記工程（Ｆ）が、前記工程（Ｅ）において、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定された場合に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程である、（１）に記載の解析方法；
（３）制限酵素が、４〜６塩基認識の制限酵素である（１）又は（２）に記載の解析方法；
（４）制限酵素が、ＣｐＧ部位を含まない塩基配列を認識して切断部位を切断する制限酵素である（１）〜（３）いずれかに記載の解析方法；
（５）制限酵素が、ＭｓｅＩである（１）〜（４）いずれかに記載の解析方法；
（６）前記工程（Ｂ）において、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、メチル化ＤＮＡを濃縮する（１）〜（５）いずれかに記載の解析方法；
（７）ＤＮＡ含有試料が、癌細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料である（１）〜（６）いずれかに記載の解析方法；
（８）ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうち、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型として核酸増幅反応を行なうためのプライマーセット；
（９）ＤＮＡ断片が、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のいずれかに示される塩基配列からなるＤＮＡ鎖と、該ＤＮＡ鎖の相補鎖とからなるＤＮＡ断片である（８）に記載のプライマーセット；
（１０）配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：５に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、配列番号：６に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：７に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、又は配列番号：８に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：９に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせからなる（９）に記載のプライマーセット；
（１１）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、（Ｇ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物中に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、及び（Ｈ）前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｇ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する工程、を含む、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法；
（１２）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法；
（１３）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｉ）下記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応：（ｉ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、（ｉｉ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、（ｉｉｉ）前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、（ｉｖ）前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、を行なう工程、（Ｊ）前記工程（Ｉ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び（Ｋ）前記工程（Ｊ）で測定された増幅産物の量に基づいて、前記工程（Ｂ）におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する工程、を含む、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法；
（１４）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｌ）下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：（ｉ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、（ｉｉ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応を行なう工程、（Ｍ）前記工程（Ｌ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び（Ｎ）前記工程（Ｍ）で測定された増幅産物の量に基づいて、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価する工程、を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法；
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析方法は、メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ効率よく解析することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のプライマーセットは、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの有無や量を、簡便に、かつ正確に検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法は、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を、簡便に、かつ正確に判定することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法は、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡの濃縮率を簡便に、かつ正確に算出することができるという優れた効果を奏する。本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を簡便に、かつ正確に評価することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを、制限酵素を用いて断片化することにより得られたＤＮＡ断片のうち、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットに１つの大きな特徴がある。このプライマーセットを用い、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型として核酸増幅反応を行なうことにより、非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出することができる。以下、まず、本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法、及びプライマーセットを説明する。
【００１１】
本発明の検出方法は、（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
を含む。
【００１２】
本発明の検出方法は、ＤＮＡ含有試料中のＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうち、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットが用いられている。鋳型となるＤＮＡ断片は、ＣｐＧ部位を有していない。そのため、ヒト等の生体内のゲノムＤＮＡにおいて、このＤＮＡ断片の領域は、メチル化されることがない。したがって、このＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの存在の指標とすれば、正確にメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出を行なうことができる。よって、本発明の検出方法では、メチル化ＤＮＡ濃縮物と前記プライマーセットとを用いた核酸増幅反応を行ない、核酸増幅反応により得られる増幅産物を検出することで、正確、かつ簡便にメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出することができる。
【００１３】
本明細書において、メチル化ＤＮＡとは、ＤＮＡ中におけるＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されて、５−メチルシトシンとなっているＤＮＡをいう。また、本明細書において、非メチル化ＤＮＡとは、ＤＮＡ中におけるＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＤＮＡをいう。ＣｐＧ部位は、ゲノム中に存在する５’−ＣｐＧ−３’からなる、シトシンとグアニンのジヌクレオチドの部位であり、メチル化の対象となる部位である。かかるＣｐＧ部位は、遺伝子発現の調節、がん、インプリンティング等に関与する。
【００１４】
図１に本発明の検出方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００１５】
本発明の検出方法では、まず、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る（ステップＳ１）。ステップＳ１は、前記工程（Ａ）に該当する。
【００１６】
ＤＮＡ含有試料は、生体由来のＤＮＡを含有する試料であればよい。例えば、ヒトから採取された組織や細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料が挙げられる。特に、メチル化ＤＮＡの解析の対象となる、癌患者から採取された癌組織や癌細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料が好ましい。
【００１７】
なお、ＤＮＡは、公知の方法を用いて、組織や細胞から抽出することができる。例えば、生体から採取された組織や細胞を、界面活性剤を用いて溶解させた後、フェノールなどを用いてタンパク質を除去することにより、ＤＮＡを得ることができる。また、ＤＮＡは、市販のＤＮＡ抽出キット等により抽出してもよい。抽出されたＤＮＡは、水や適切な緩衝液に溶解させてもよい。
【００１８】
制限酵素は、４〜６塩基認識の制限酵素が好ましい。本発明では、４〜６塩基認識の制限酵素を用いることにより、ＤＮＡを、核酸増幅における鋳型として適した大きさとなるように断片化させることができる。
【００１９】
制限酵素は、ＣｐＧ部位を含まない塩基配列を認識して切断部位を切断する制限酵素であればよい。より具体的には、ＭｓｅＩ、ＡｌｕＩ、ＸｂａＩ等が挙げられる。制限酵素は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。制限酵素によるＤＮＡの処理は、用いられる制限酵素に応じた反応条件下で行なわれる。
【００２０】
つぎに、得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る（ステップＳ２）。ステップＳ２は、前記工程（Ｂ）に該当する。
【００２１】
メチル化ＤＮＡの濃縮は、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いることにより行なわれる。メチル化ＤＮＡの濃縮方法としては、例えば、
〔１〕 抗メチル化シトシン抗体や抗メチル化シチジン抗体を用いて、メチル化ＤＮＡを免疫沈降させ、メチル化ＤＮＡを回収する方法（ＭｅＤＩＰ法）；
〔２〕 メチル化ＤＮＡ結合タンパク質と、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質に対する抗体とを用いて、メチル化ＤＮＡを免疫沈降させ、メチル化ＤＮＡを回収する方法;及び
〔３〕 メチル化ＤＮＡをヒスチジンタグ融合メチル化ＤＮＡ結合タンパク質に結合させ、メチル化ＤＮＡが結合したヒスチジンタグ融合メチル化ＤＮＡ結合タンパク質をニッケル固定化担体で回収し、メチル化ＤＮＡを回収する方法；
等が挙げられる。
【００２２】
抗メチル化シトシン抗体及び抗メチル化シチジン抗体は、ＤＮＡ内のメチル化シトシン（５−メチルシトシン）やメチル化シチジンに特異的に結合する抗体であればよい。例えば、メチル化シチジン又は分子内に当該メチル化シトシンを含むＤＮＡを抗原として用いて慣用の手法により動物を免疫させることにより作製することができる。また、市販の抗メチル化シトシン抗体や抗メチル化シチジン抗体を用いることもできる。
【００２３】
その後、得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう（ステップＳ３）。ステップＳ３の操作は、前記工程（Ｃ）に該当する。これにより、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片の全体又は一部の領域に対応する核酸が増幅される。なお、図１のステップＳ３における、対照ＤＮＡは、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を示す。
【００２４】
核酸増幅反応を行なう核酸増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法、転写増幅法等が挙げられる。なかでも、増幅産物の定量が迅速かつ簡便にできる観点から、ポリメラーゼ連鎖反応法のひとつであるリアルタイムＰＣＲが望ましい。リアルタイムＰＣＲでは、例えば、増幅産物のＤＮＡをリアルタイムでモニタリングし、指数関数的増幅領域で、該ＤＮＡの定量を行なう。そのため、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅速度論に基づき、正確に、該ＤＮＡを定量することができる。リアルタイムＰＣＲとしては、例えば、蛍光を発するインターカレーターを用いるインターカレーター法、増幅産物の配列に特異的な蛍光色素標識オリゴヌクレオチドからなるプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、サイクリングプローブなど）を用いるプローブ法等が挙げられる。これらのなかでは、増幅産物の検出及び定量を簡便に行なうことができる観点から、インターカレーター法が好ましい。インターカレーター法では、インターカレーターは、ポリメラーゼ連鎖反応により合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する物質である。インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡとして得られる増幅産物に結合しているインターカレーターの蛍光に基づく蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。インターカレーターとしては、例えば、モレキュラープローブインコーポレーティッド製ＳＹＢＲ（登録商標） ｇｒｅｅｎなどが挙げられる。
【００２５】
次に、上記核酸増幅反応で得られた増幅産物を検出する（ステップＳ４）。ステップＳ４は、前記工程（Ｄ）に該当する。本発明の検出方法では、増幅産物が検出されることが、メチル化ＤＮＡ濃縮物中に非メチル化ＤＮＡが存在することの指標となる。
【００２６】
増幅産物の検出は、公知の方法によって確認することができる。例えば、慣用のアガロースゲル電気泳動、標識プローブを増幅産物にハイブリダイズさせて検出する方法、核酸増幅で生じる副生成物の濁りを検出する方法等により行なわれる。
【００２７】
ここで、本発明のプライマーセットについて説明する。
【００２８】
本発明のプライマーセットによれば、核酸増幅反応によりＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とし、核酸増幅反応を行なうことができる。そのため、本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により得られる増幅産物を非メチル化ＤＮＡの指標として、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを正確に検出することができる。また、本発明のプライマーセットによれば、核酸増幅反応を行なうだけで、非メチル化ＤＮＡを検出することができる。そのため、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に検出することができる。
【００２９】
本発明のプライマーセットは、ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片における、一方のＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーと、該ＤＮＡ鎖の相補鎖にハイブリダイズするプライマーとを含む。すなわち、それぞれのプライマーがハイブリダイズする標的配列は、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片の塩基配列に存在する。なお、「相補鎖」とは、二本鎖ＤＮＡにおける一方のＤＮＡ鎖と対をなすＤＮＡ鎖をいう。
【００３０】
本発明のプライマーセットが、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）に用いられるプライマーセットの場合、フォワードプライマーとリバースプライマーのＴｍ値の差は、好ましくは２℃以内が望ましい。また、プライマーセットの各プライマーの塩基配列中におけるグアニン及びシトシンの割合は、好ましくは４０〜６０％が望ましい。プライマーセットの１つのプライマーの塩基配列中において、グアニンは４以上連続していないことが望ましい。プライマーセットの各プライマーの長さは、１７〜２５ヌクレオチド長が望ましい。さらに、プライマーセットの各プライマーは、ＰＣＲの際のアニーリング温度を、好ましくはＴｍに近い温度に設定することが望ましい。
【００３１】
例えば、ヒトゲノムＤＮＡをＭｓｅＩで処理した場合、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片としては、例えば、配列番号：１、配列番号：２、又は配列番号：３に示される塩基配列を有するＤＮＡ断片等が挙げられる。これらのＤＮＡ断片は、その塩基配列中に、ＣｐＧ部位を含んでいないため、ヒトゲノムＤＮＡにおける非メチル化ＤＮＡの指標として好適である。
【００３２】
配列番号：１、配列番号：２、及び配列番号：３に示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとしては、
〔１〕 配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマー（CGF1-F: 5'-GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGC-3'）と配列番号：５に示される塩基配列からなるプライマー（CGF1-Rv:5'-CCCACACTCCATTTCCATTCCTC-3'）との組み合わせからなるプライマーセット、
〔２〕 配列番号：６に示される塩基配列からなるプライマー（CGF2-F: 5'-GGGTACTTTGCCAATATAGCCATGC-3'）と配列番号：７に示される塩基配列からなるプライマー(CGF2-Rv: 5'-TGGCTAAGTGGGAGGGAGAACAG-3'）との組み合わせからなるプライマーセット、
〔３〕 配列番号：８に示される塩基配列からなるプライマー(CGF3-F: 5'-GGATGGGAGACACCTGGTTCA-3'）と配列番号：８に示される塩基配列からなるプライマー(CGF3-Rv: 5'-GGATGGACCAGCTGCTTTGTACTC-3'）との組み合わせからなるプライマーセット
が挙げられる。これらのプライマーセットによれば、非メチル化ＤＮＡの指標として適した増幅産物を得ることができる。
【００３３】
プライマーセットは、核酸増幅反応を行なう核酸増幅法の種類に応じて、公知の方法で設計することができる。また、プライマーを設計するためのプライマー設計用ソフトウエアも市販されている。前記プライマー設計用ソフトウエアとしては、例えば、ソフトウエア開発株式会社製の商品名：ＧＥＮＥＴＹＸ、ソフトウエア開発株式会社製の商品名：ｐｒｉｍｅｒ３等が挙げられる。
【００３４】
本発明の検出方法は、簡便に、かつ正確にメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出を行うことができる。そのため、本発明の検出方法を用いれば、メチル化ＤＮＡ濃縮物であるメチル化ＤＮＡ検出用試料が、メチル化ＤＮＡの解析に適切であるか否かを、簡便に、かつ正確に判定することができる。そのため、時間がかかり煩雑な、ハウスキーピング遺伝子のメチル化の状態を確認する作業がなくなる。結果として、簡便に、かつ効率よくメチル化ＤＮＡの濃縮物を用いた、メチル化ＤＮＡの解析が可能となる。したがって、本発明には、メチル化ＤＮＡの解析方法も包含される。
【００３５】
本発明の解析方法は、
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
（Ｅ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定する工程、及び
（Ｆ） メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
を含む。
【００３６】
また、前記工程（Ｆ）は、前記工程（Ｅ）において、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定された場合に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程であるのが好ましい。この場合、適切なメチル化ＤＮＡ検出用試料を用いることで、正確なメチル化ＤＮＡの解析が可能となる。また、不適切なメチル化ＤＮＡ検出用試料を検体から除外することにより、より効率的なメチル化ＤＮＡの解析が可能となる。
【００３７】
図２に本発明の解析方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。なお、図２のフローチャートは、工程（Ｆ）において、メチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切な場合に、メチル化ＤＮＡを解析する実施形態を示している。
【００３８】
本発明の解析方法における前記工程（Ａ）〜（Ｄ）は、前述した本発明の検出方法における工程（Ａ）〜（Ｄ）の操作と同様である。すなわち、図２に示されるステップＳ５〜Ｓ８では、図１に示されるステップＳ１〜Ｓ４と同様の操作が行なわれる。
【００３９】
本発明の解析方法では、前記工程（Ｅ）において、増幅産物の検出結果に基づいて、得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定する（ステップＳ９）。増幅産物が、過剰に検出された場合、ステップＳ６（工程（Ｂ））で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であると判定できる。逆に、増幅産物が、検出されない又は殆ど検出されない場合は、ステップＳ６（工程（Ｂ））で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定できる。
【００４０】
例えば、上述のリアルタイムＰＣＲを用いて、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる対照ＤＮＡの量を測定した際に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる対照ＤＮＡの量が所定の量を超えた場合、このメチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であると判定できる。逆に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる対照ＤＮＡの量が所定の量以下の場合は、このメチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定できる。なお、所定の量は、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる全ＤＮＡ量やメチル化ＤＮＡの解析条件などを考慮して、経験的に適宜に設定される。
【００４１】
また、本発明の解析方法では、後述するＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットをさらに用いれば、メチル化ＤＮＡの濃縮率や純度からも、メチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定することができる。すなわち、濃縮率や純度が低い場合、メチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であると判定できる。逆に、濃縮率や純度が高い場合、メチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定できる。
【００４２】
なお、ステップＳ９（工程（Ｅ））において、メチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であると判定された場合、ステップＳ５（工程（Ａ））にもどり、メチル化ＤＮＡ濃縮物を取得する操作を再度行なえばよい。
【００４３】
次に、メチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定された場合、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する（ステップＳ１０）。すなわち、ステップＳ１０は、本発明の解析方法における前記工程（Ｆ）に該当する。
【００４４】
メチル化ＤＮＡの解析で行なわれる手法は、メチル化ＤＮＡ濃縮物をメチル化ＤＮＡ検出用試料として用いる公知の解析手法であれば、特に制限されない。メチル化ＤＮＡの解析手法としては、例えば、疾患関連遺伝子のＤＮＡ、転写因子のＤＮＡ、発現制御因子のＤＮＡ、プロモーター領域のＤＮＡ等を固定化したＤＮＡチップを用いた解析方法が挙げられる。ＤＮＡチップとしては、遺伝子の発現情報で、解読済みのゲノムデータから等間隔に抜き出した塩基配列を検出用プローブとしてタイル状に固定化したタイリングアレイが好ましい。
【００４５】
なお、上述のように、前記ステップＳ９及びステップＳ１０の記載は、工程（Ｆ）において、メチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切な場合に、メチル化ＤＮＡを解析する場合のフローを説明するものである。したがって、本発明の解析方法は、図２のフローチャートに示されるフローに限定されない。
【００４６】
例えば、本発明の解析方法は、ステップ１０の後にステップ９が実行されるフローも包含する。すなわち、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析した後に、該メチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であったか否かを判定する。ここで、メチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であったと判定された場合、メチル化ＤＮＡの解析は終了する。逆に、メチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であったと判定された場合、ステップＳ５（工程（Ａ））にもどり、メチル化ＤＮＡ濃縮物を取得する操作を再度行なうことになる。
【００４７】
本発明の検出方法は、簡便に、かつ正確にメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出を行なうことができる。そのため、本発明の検出方法を用いれば、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を簡便に、かつ正確に判定することもできる。したがって、本発明には、メチル化ＤＮＡ解析結果の信頼性の判定方法も包含される。
【００４８】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法は、
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｈ）で得られた増幅産物を検出する工程、
（Ｇ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物中に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、及び
（Ｈ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｇ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する工程、
を含む方法である。
【００４９】
図３に本発明の判定方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００５０】
本発明の判定方法における工程（Ａ）〜（Ｄ）は、上述の検出方法における工程（Ａ）〜（Ｄ）の操作と同様である。すなわち、図３に示されるステップＳ１１〜Ｓ１４は、図１に示されるステップＳ１〜Ｓ４と同様の操作が行われる。
【００５１】
本発明の判定方法では、ステップＳ１２（工程（Ｂ））で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物の一部が、メチル化ＤＮＡの解析に用いられる（ステップＳ１５）。すなわち、ステップＳ１５は、本発明の判定方法における工程（Ｇ）に該当する。なお、メチル化ＤＮＡの解析は、上述の本発明の解析方法におけるステップＳ１０（工程（Ｆ））におけるメチル化ＤＮＡの解析と同様の手法により行なわれる。
【００５２】
なお、メチル化ＤＮＡ濃縮物の残りの一部は、ステップＳ１３の（工程（Ｃ））の対照ＤＮＡの増幅、及びステップＳ１４（工程（Ｄ））の増幅産物の検出に用いられる。
【００５３】
増幅産物の検出の後、増幅産物の検出結果に基づいて、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する（ステップＳ１６）。すなわち、ステップＳ１５は、本発明の判定方法における前記工程（Ｈ）に該当する。ここで、ステップＳ１５（工程（Ｈ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定は、上述したステップＳ９（工程（Ｅ））におけるメチル化ＤＮＡ検出用試料が適切であるか否かの判定と、同様の手法で行うことができる。すなわち、増幅産物が、過剰に検出された場合、ステップＳ１５（工程（Ｇ））におけるメチル化ＤＮＡの解析結果は信頼性が低いと判定できる。逆に、増幅産物が、検出されない又はほとんど検出されない場合は、信頼度が高いと判定できる。
【００５４】
上述の本発明のプライマーセットと、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いることで、メチル化ＤＮＡの濃縮率を算出することができる。本発明には、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法も包含される。
【００５５】
本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法は、
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｉ） 下記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応：
（ｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉｉ） 前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｖ） 前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｊ） 前記工程（Ｉ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｋ） 前記工程（Ｊ）で測定された増幅産物の量に基づいて、前記工程（Ｂ）におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する工程、
を含む方法である。
【００５６】
図４に本発明の算出方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００５７】
本発明の算出方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の検出方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）の操作と同様である。すなわち、すなわち、図４に示されるステップＳ１７及びＳ１８は、図１に示されるステップＳ１及びＳ２と同様の操作が行われる。
【００５８】
本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法では、工程（Ｉ）において、前記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応を行なう（ステップＳ１９〜Ｓ２２）。ここで、ステップＳ１９は（ｉ）の核酸増幅反応を、ステップＳ２０は（ｉｉ）の核酸増幅反応を、ステップＳ２１は（ｉｉｉ）の核酸増幅反応を、ステップＳ２２は（ｉｖ）の核酸増幅反応を示す。
【００５９】
なお、核酸増幅反応は、増幅産物の量を定量的に測定できる公知の核酸増幅法により行なうことができる。例えば、上述したリアルタイムＰＣＲの他に、リアルタイムＬＡＭＰが挙げられる。ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法により核酸を増幅すると、核酸の増幅に伴って反応液の光学的状態（濁度、吸光度、蛍光強度など）が変化する。この光学的状態を、リアルタイムに測定することにより、増幅産物の量を定量的に測定することができる。
【００６０】
リアルタイムＬＡＭＰを用いる場合、核酸の増幅に伴い副産物としてピロリン酸マグネシウムが多量に生成される。このピロリン酸マグネシウムは不溶性であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液の濁度（又は吸光度）をリアルタイムで光学的に測定することにより、増幅産物の量を定量的に測定することができる。また、リアルタイムＬＡＭＰ法においても、上記インターカレーター法を用いることができる。
【００６１】
（ｉ）及び（ｉｉｉ）の核酸増幅反応（ステップＳ１９及びＳ２１）で用いられる、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットとしては、本発明のプライマーセットを用いることができる。
【００６２】
また、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の核酸増幅反応（ステップＳ２０及びＳ２２）で用いられる、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちメチル化シトシンを有するＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットとしては、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡにおいて、シトシンがメチル化されていることが知られている塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットであればよい。具体的には、ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうち、メチル化シトシンを有するＤＮＡ断片の一方のＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーと、該ＤＮＡ鎖の相補鎖にハイブリダイズするプライマーとからなり、該メチル化シトシンを有するＤＮＡ断片の全体又は一部を増幅するためのプライマーセット等が挙げられる。
【００６３】
例えば、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡがＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡの場合、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとしては、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼｐｉ遺伝子（ＧＳＴＰ１）のプロモーター領域の塩基配列を標的配列としてハイブリダイズするプライマーを含むプライマーセットが挙げられる。より具体的には、ＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡをＭｓｅＩで処理した場合、GSTP1-Fプライマー(5'-GAGGCCTTCGCTGGAGTT-3'、配列番号：１６)とGSTP1-Rプライマー(5'-GTACTCACTGGTGGCGAAGA-3'、配列番号：１７)とからなるGSTP1プライマーセットが挙げられる。
【００６４】
つぎに、工程（Ｊ）において、得られた増幅産物の量を測定する（ステップＳ２３）。増幅産物の量の測定は、上述のように、工程（Ｉ）で用いた核酸増幅法に応じ、公知の手法により行なわれる。
【００６５】
その後、工程（Ｋ）において、前記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量に基づき、メチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する（ステップＳ２４）。（ｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる非メチル化ＤＮＡ（対照ＤＮＡ）の割合の指標となる。（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡの割合の指標となる。（ｉｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に含まれる非メチル化ＤＮＡ（対照ＤＮＡ）の割合の指標となる。（ｉｖ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に含まれるメチル化ＤＮＡの割合の指標となる。
【００６６】
メチル化ＤＮＡの濃縮率は、下記式（１）：
【００６７】
メチル化ＤＮＡの濃縮率＝〔（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量／（ｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量〕／〔（ｉｖ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量）／（ｉｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量〕・・・（１）
【００６８】
により算出することができる。
【００６９】
また、（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量を測定することにより、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価することもできる。従って、本発明には、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法も包含される。
【００７０】
本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法は、
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｌ） 下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｍ） 前記工程（Ｌ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｎ） 前記工程（Ｍ）で測定された増幅産物の量に基づいて、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価する工程を含む。
【００７１】
図５に本発明の評価方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００７２】
本発明の評価方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の検出方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）の操作と同様である。すなわち、図５に示されるステップＳ２５及びＳ２６は、図１に示されるステップＳ１及びＳ２と同様の操作が行われる。
【００７３】
また、本発明の評価方法における工程（Ｌ）の（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応は、本発明の算出方法における工程（Ｉ）の（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応の操作と同様である。すなわち、図５に示されるステップＳ２７及びＳ２８は、図４に示されるステップＳ１９及びＳ２０と同様の操作が行われる。
【００７４】
本発明の評価方法における工程（Ｍ）における増幅産物の量の測定は、本発明の算出方法における工程（Ｊ）の増幅産物の量の測定と同様である。すなわち、図５に示されるステップＳ２９は、図４に示されるステップＳ２３と同様の操作が行われる。
【００７５】
本発明の評価方法では、工程（Ｎ）において、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量に基づき、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価する（ステップＳ３０）。メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度は、（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量を比較することにより評価することができる。例えば、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度は、（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量を、（ｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量で割った値が大きいほど、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度が高いと評価することができる。逆に、値が小さいほど、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度が低いと評価することができる。
【００７６】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
（制限酵素処理によるゲノムＤＮＡの断片化の確認）
乳癌細胞株ＭＣＦ７から抽出したゲノムＤＮＡ １μgを、制限酵素と、３７℃で２時間インキュベーションし、ゲノムＤＮＡの断片化を行なった。ゲノムＤＮＡの断片化に使用した制限酵素及び制限酵素の組み合わせ、並びに緩衝液を以下に示す。
（１）ＭｓｅＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製） NEB buffer2 緩衝液
（２）ＡｌｕＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製） NEB buffer2 緩衝液
（３）ＭｓｅＩとＡｌｕＩとの組み合わせ NEB buffer2 緩衝液
（４）ＭｓｅＩとＸｂａＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）との組み合わせ NEB
buffer2 緩衝液
（５）ＡｌｕＩとＸｂａＩとの組み合わせ NEB buffer2 緩衝液
【００７８】
得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供して、ＤＮＡ断片の大きさを確認した。その結果を図６に示す。図６は、ＤＮＡ断片の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。図６中、レーン１は、１ｋｂラダーのマーカー、レーン２は、未処理のＤＮＡ、レーン３は、ＭｓｅＩ処理後のＤＮＡ断片、レーン４は、ＡｌｕＩ処理後のＤＮＡ断片、レーン５は、ＭｓｅＩとＡｌｕＩとの組み合わせによる処理後のＤＮＡ断片、レーン６は、ＭｓｅＩとＸｂａＩとの組み合わせによる処理後のＤＮＡ断片、レーン７は、ＡｌｕＩとＸｂａＩとの組み合わせによる処理後のＤＮＡ断片、レーン８は、１ｋｂラダーのマーカー、レーン９は、１００ｂｐラダーのマーカーを示す。
【００７９】
図６に示される結果から、いずれの制限酵素を用いた場合でも、ＤＮＡ断片の大きさが３００〜１０００ｂｐとなっているため、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法に適した大きさのＤＮＡ断片が得られていることがわかる。
【００８０】
（実施例２）
（ＧＡＰＤＨ遺伝子のメチル化ＤＮＡの解析）
ハウスキーピング遺伝子の一つであり、ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないと考えられているＧＡＰＤＨ遺伝子のメチル化状態を調べた。
【００８１】
ＤＮＡ抽出キット（キアジェン社製、商品名：QIAmp Blood Maxi Kit）を用いて、乳癌細部株ＭＣＦ７からゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡ ２μｇに、０．３Ｍ ＮａＯＨ ４００μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後の産物に、１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液４００μＬを添加し、７０℃で４０分間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。得られた産物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製し、分析用試料を得た。この分析用試料を用いて、以下のＰＣＲを行なった。
【００８２】
前記分析用試料１μＬに対して、ＤＮＡポリメラーゼ〔商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ〕０．１２μＬと、緩衝液（タカラバイオ株式会社製、商品名：10× Ex Taq Buffer）１．５μＬと、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１．２μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと水９．９８μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。前記ＰＣＲ用反応液を用いて、ＰＣＲを行なった。
【００８３】
フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットとして、フォワードプライマー〔GAPDH-seq1-F:5'-GAGATTTTTTTAAAATTAAGTGGGG-3'（配列番号：１０）〕とリバースプライマー〔GAPDH-seq1-Rv:5'-ATAAAAAAACCAATCCCCAAAAC-3'（配列番号：１１）〕とからなるＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセット、及びフォワードプライマー〔GAPDH-seq2-F:5'-TAGAGGGGTGATGTGGGGAGTA-3'（配列番号：１２）〕とリバースプライマー〔GAPDH-seq2-Rv:5'-CTAACCCCAACCACATACCAAAA-3'（配列番号：１３）〕とからなるＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットを用いた。
【００８４】
ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセットを用いたＰＣＲの条件は、９５℃４分３０秒のインキュベーション後、９５℃３０秒間と６３℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件とした。また、ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットを用いたＰＣＲの条件は、９５℃４．５分間のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６．７℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件とした。
【００８５】
得られたＰＣＲ産物を、クローニングキット（インビトロジェン社製、商品名：TA
cloning kit）を用いて、前記クローニングキットに添付のベクターに組み込み、プラスミドを得た。得られたプラスミドと、Ｍ１３Ｒｖプライマーとを用いて、ＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。解析結果を図７及び図８に示す。
【００８６】
図７は、ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列に含まれるＣｐＧ領域のメチル化の状態を示す模式図である。ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列には、１７箇所のＣｐＧ部位が存在する。図中、白丸はメチル化されていないＣｐＧ部位を示し、黒丸はメチル化されているＣｐＧ部位をしめす。
【００８７】
図８は、ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列に含まれるＣｐＧ領域のメチル化の状態を示す模式図である。ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列には、１４箇所のＣｐＧ部位が存在する。図中、白丸はメチル化されていないＣｐＧ部位を示し、黒丸はメチル化されているＣｐＧ部位をしめす。
【００８８】
図７及び図８から明らかなように、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていることがわかる。このように、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子は、メチル化ＤＮＡの解析の対象となるＤＮＡによって、非メチル化ＤＮＡの指標として不適切な場合があることが明らかになった。
【００８９】
（実施例３）
（非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列に基づき、制限酵素としてＭｓｅＩを用いてヒトゲノムＤＮＡを処理して得られるＣｐＧ部位を含まないＤＮＡ断片を選別した。その結果、配列番号：１、配列番号：２、及び配列番号：３で示されるＤＮＡ断片を選別した。
【００９０】
次に、選別されたＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、このＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行うためのプライマーセットを設計した。プライマーセットの設計条件を以下に示す。
（１）フォワードプライマーとリバースプライマーのＴｍ値の差が２℃以内
（２）プライマーの塩基配列中におけるグアニンとシトシンの割合が４０〜６０％
（３）プライマーの塩基配列中においてグアニンが４以上連続しない
（４）プライマーの長さが１７〜２５ｂｐ
（５）Ｔｍに近い温度でアニーリング温度を設定する
【００９１】
上記の設計条件により、配列番号：１で示されるＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセット１、配列番号：２で示されるＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセット２、及び配列番号：３で示されるＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセット３を設計した。各プライマーセットに含まれるプライマーを以下に示す。
プライマーセット１：
CGF1-Fプライマー（5'-GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGC-3'、配列番号：４）
CGF1-Rvプライマー（5'-CCCACACTCCATTTCCATTCCTC-3'、配列番号：５）
プライマーセット２：
CGF2-Fプライマー（5'-GGGTACTTTGCCAATATAGCCATGC-3'、配列番号：６）
CGF2-Rvプライマー(5'-TGGCTAAGTGGGAGGGAGAACAG-3'、配列番号：７）
プライマーセット３：
CGF3-Fプライマー(5'-GGATGGGAGACACCTGGTTCA-3'、配列番号：８）
CGF3-Rvプライマー(5'-GGATGGACCAGCTGCTTTGTACTC-3'、配列番号：９）
【００９２】
（メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
ＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡにおいて、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼｐｉ遺伝子（ＧＳＴＰ１）のプロモーター領域が、メチル化されていることが知られている。 そこで、制限酵素としてＭｓｅＩを用いてヒトゲノムＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片から、ＧＳＴＰ１のプロモーター領域の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするGSTP1プライマーセットを設計した。なお、設計条件は上記、非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計と同様である。GSTP1プライマーセットに含まれるプライマーを以下に示す。
GSTP1プライマーセット：
GSTP1-Fプライマー(5'-GAGGCCTTCGCTGGAGTT-3'、配列番号：１６)
GSTP1-Rプライマー(5'-GTACTCACTGGTGGCGAAGA-3'、配列番号：１７)
【００９３】
（分析用試料の調製）
乳癌細胞株ＭＣＦ７のゲノムＤＮＡ ４μｇと、制限酵素ＭｓｅＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）とを３７℃で一晩インキュベーションし、３００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む試料を得た。得られたＤＮＡ断片を含む試料を、９５℃で１０分間インキュベーションして熱変性させ、調製用試料を得た。なお、後述のＰＣＲで用いるための調製用試料も、同様の操作で調製した。
【００９４】
得られた調製用試料に、緩衝液（アップステート社製、商品名：ChIP dilution buffer）６８μＬと、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社製、商品名：protein G sepharose beads）３０２μＬとを添加し、得られた混合物を、４℃で１時間回転させながらインキュベーションした。その後、得られた混合物の上清を回収した。
【００９５】
得られた上清に、抗メチル化シチジン抗体を添加し、得られた混合物を４℃で一晩回転させながらインキュベーションすることにより、メチル化ＤＮＡの免疫沈降を行なった。
【００９６】
その後、免疫沈降アッセイ用キット（アップステート社製、商品名：Chromatin Immuoprecipitation Assay Kit）と、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社製、商品名：Protein G Sepharose beads）とを用いて、免疫沈降後のＤＮＡ−抗体複合体を回収し、複合体からＤＮＡを回収した。
【００９７】
回収されたＤＮＡを含む試料に、プロテイナーゼＫ（シグマ社製）を終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物を５０℃で１時間インキュベーションした。その後、得られた混合物から、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いてＤＮＡを精製し、分析用試料を得た。この分析用試料を用いて、以下のＰＣＲを行った。また、抗メチル化シチジン抗体に代えて、マウスＩｇＧ抗体を用いたことを除き、同様に操作を行なうことで得られた試料を、対照用試料とした。
【００９８】
（各プライマーセットを用いたＰＣＲ）
分析用試料１μＬに、ＰＣＲ用試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製、商品名：2X fast Start SYBR Green Master Mix）１２．５μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと水９．５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。前記ＰＣＲ用反応液を用いて、ＰＣＲを行なった。対照として、分析用試料の代わりに、調製用試料及び対照用試料を用いてＰＣＲ用反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。
【００９９】
なお、フォワードプライマー水溶液とリバースプライマー水溶液には、上述したプライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３及びGSTP1プライマーセットの、フォワードプライマーとリバースプライマーとがそれぞれ含まれている。
【０１００】
ＰＣＲの条件は、９５℃１０分のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６℃１５秒間と７２℃３０秒間とからなる反応を１サイクルとする４５サイクルと、９５℃１分間と６６℃３０秒間と９５℃３０秒間とからなる反応とを行なう条件とした。
【０１０１】
（アガロースゲル電気泳動による増幅された核酸の検出）
ＰＣＲにより増幅された核酸をアガロースゲル電気泳動により検出した。プライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３及びGSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲ後の電気泳動パターンを示す図面代用写真を図９に示す。
【０１０２】
図９中、レーン１は、調製用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン２は、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン３は、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。また、図９中、パネル（ａ）は、GSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｂ）は、プライマーセット１を用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｃ）は、プライマーセット２を用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｄ）は、プライマーセット３を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。
【０１０３】
図９のパネル（ｂ）〜（ｄ）それぞれのレーン２とレーン３とに示される結果から、プライマーセット１〜３を用いた場合、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量と、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量とがほぼ同等であることがわかる。したがって、プライマーセット１〜３の鋳型となるＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片は、抗メチル化シチジン抗体を用いたメチル化ＤＮＡ免疫沈降法によって濃縮されないことがわかる。
【０１０４】
（比較例１）
実施例２によりＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡにおいて、ＧＡＰＤＨ遺伝子がメチル化されていることが確認された。そこで、実際にＧＡＰＤＨ遺伝子が、抗メチル化シチジン抗体を用いたメチル化ＤＮＡ免疫沈降法によって濃縮されるか否かを確認した。
【０１０５】
（ＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するためのプライマーの設計）
制限酵素としてＭｓｅＩを用いてヒトゲノムＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片から、ＧＡＰＤＨ遺伝子の塩基配列を含むメチル化されたＤＮＡ断片を鋳型とするGAPDHプライマーセットを設計した。なお、設計条件は上記、非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計と同様である。GAPDHプライマーセットに含まれるプライマーを以下に示す。
GAPDHプライマーセット：
GAPDH-Fプライマー（5'-GGCACCCTATGGACACGC-3'、配列番号：１４）
GAPDH-Rプライマー（5'-GGAAAGCCAGTCCCCAGAAC-3'、配列番号：１５）
【０１０６】
（プライマーセットを用いたＰＣＲ）
実施例３と同様の操作により、GAPDHプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行なった。また、対照として、GSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲも行なった。
【０１０７】
（アガロースゲル電気泳動による増幅された核酸の検出）
実施例３と同様に、ＰＣＲにより増幅された核酸をアガロースゲル電気泳動により検出した。GSTP1プライマーセット及びGAPDHプライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真を図１０に示す。図１０中、パネル（ａ）は、GSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｂ）は、GAPDHプライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。
【０１０８】
図１０のパネル（ｂ）のレーン２とレーン３とに示される結果から、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量に比べ、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量が増加していることがわかる。したがって、GAPDHプライマーセットでは、非メチル化ＤＮＡを検出することができないことがわかる。比較例１の結果は、実施例２の結果と共に、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子は、非メチル化ＤＮＡの指標として不適切な場合があることを示すものである。
【０１０９】
これらの結果から、プライマーセット１〜３のように設計されたプライマーセットにより、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出できることがわかる。
【０１１０】
（実施例４）
（GSTP1プライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲの検量線の作成）
乳癌細胞株ＭＣＦ７のゲノムＤＮＡの希釈系列を作製した。得られた希釈系列１μＬに、ＰＣＲ用試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製、商品名：2X fast Start SYBR Green Master Mix）１２．５μＬと、前記GSTP1プライマーセットのGSTP1-Fプライマーを含むフォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、前記GSTP1プライマーセットのGSTP1-Rプライマーを含むリバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、水９．５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。
【０１１１】
前記ＰＣＲ用反応液を用いてＰＣＲを行い、検量線を作成した。なお、ＰＣＲは、９５℃１０分のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６℃１５秒間と７２℃３０秒間とからなる反応を１サイクルとする４５サイクルと、９５℃１分間と６６℃３０秒間と９５℃３０秒間とからなる反応とを行なう条件下で行なった。
【０１１２】
（プライマーセット３を用いたリアルタイムＰＣＲの検量線の作成）
GSTP1プライマーセットの代わりにプライマーセット３を用いて、同様の操作で検量線を作成した。
【０１１３】
（分析用試料の調製）
乳癌細胞株ＭＣＦ７のゲノムＤＮＡ ４μｇと、制限酵素ＭｓｅＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）とを３７℃で一晩インキュベーションし、３００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む試料を得た。得られたＤＮＡ断片を含む試料を、９５℃で１０分間インキュベーションして熱変性さ、調製用試料を得た。なお、後述のＰＣＲで用いるための調製用試料も、同様の操作で調製した。
【０１１４】
熱変性後のＤＮＡ断片
４μｇに、緩衝液（アップステート社製、商品名：ChIP dilution buffer）６８μＬと、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社製、商品名：protein G sepharose beads）３０２μＬとを添加し、得られた混合物を、４℃で１時間回転させながらインキュベーションした。その後、得られた混合物の上清を回収した。
【０１１５】
得られた上清に、抗メチル化シチジン抗体を添加し、得られた混合物を４℃で一晩回転させながらインキュベーションすることにより、メチル化ＤＮＡの免疫沈降を行なった。
【０１１６】
その後、免疫沈降アッセイ用キット（アップステート社製、商品名：Chromatin Immuoprecipitation Assay Kit）と、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社製、商品名：Protein G Sepharose beads）とを用いて、免疫沈降後のＤＮＡ−抗体複合体を回収し、複合体からＤＮＡを回収した。
【０１１７】
回収されたＤＮＡを含む試料に、プロテイナーゼＫ（シグマ社製）を終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物を５０℃で１時間インキュベーションした。その後、得られた混合物から、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いてＤＮＡを精製し、分析用試料を得た。また、抗メチル化シチジン抗体に代えて、抗マウスＩｇＧ抗体を用いたことを除き、同様に操作を行うことで、対照用試料を得た。
【０１１８】
（GSTP1プライマーセットを用いた、試料中のメチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片の量の算出）
分析用試料１μＬに対して、ＰＣＲ用試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製、商品名：2X fast Start SYBR Green Master Mix）１２．５μＬと、前記GSTP1プライマーセットのGSTP1-Fプライマーを含むフォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、前記GSTP1プライマーセットのGSTP1-Rプライマーを含むリバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、水９．５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。前記ＰＣＲ用反応液を用いて、ＰＣＲを行なった。対照として、調製用試料及び対照用試料を用いたＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件は、９５℃１０分のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６℃１５秒間と７２℃３０秒間とからなる反応を１サイクルとする４５サイクルと、９５℃１分間と６６℃３０秒間と９５℃３０秒間とからなる反応とを行なう条件とした。
【０１１９】
ＰＣＲの結果と上述の検量線に基づき、調製用試料、分析用試料及び対照用試料に含まれるＧＳＴＰ１のＤＮＡ（メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片）の量を算出した。以下、メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片を、単にメチル化ＤＮＡ断片と記載する。
【０１２０】
（プライマーセット３を用いた、試料中の非メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片の量の算出）
GSTP1プライマーセットに代えて、プライマーセット３を用いて、調製用試料、分析用試料及び対照用試料に含まれる非メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片の量を算出した。以下、非メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片を、単に非メチル化ＤＮＡ断片と記載する。
【０１２１】
（メチル化ＤＮＡ濃縮物（分析用試料）の純度の評価）
算出されたメチル化ＤＮＡ断片の量及び非メチル化ＤＮＡ断片の量とに基づき、調製用試料、対照用試料及び分析用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を、下記式（４）により算出した。
【０１２２】
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)＝メチル化ＤＮＡ断片の量(ng)/ 非メチル化ＤＮＡ断片の量(ng)・・・（４）
【０１２３】
試料中におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示すグラフを図１１に示す。図１１中、レーン１は、調製用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示す。レーン２は、対照用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示す。レーン３は、分析用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示す。
【０１２４】
図１１に示される結果から、調製用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合は、０．０２ｎｇ／ｎｇであり、対照用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合は、０．０７ｎｇ／ｎｇであることがわかる。一方、抗メチル化シチジン抗体を用いて免疫沈降を行なった分析用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合は４．５ｎｇ／ｎｇであることがわかる。かかる結果から、調製用試料及び対照用試料に比べ、メチル化ＤＮＡ濃縮物である分析用試料では、メチル化ＤＮＡであるＧＳＴＰ１ ＤＮＡの割合が増えていることがわかる。
【０１２５】
（実施例５）
実施例４で算出した、分析用試料（メチル化ＤＮＡ濃縮物）のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合と、対照用試料又は調製用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合とを用いて、メチル化ＤＮＡの濃縮率を算出することができる。例えば、式（５）：
【０１２６】
メチル化ＤＮＡの濃縮率
＝〔分析用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)〕／〔調製用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)〕・・・（５）
【０１２７】
により算出することができる。ここで、実施例４の結果から、分析用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)は４．５(ng/ng)であり、調製用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)＝０．０２(ng/ng)である。従って、式５を用いて分析用試料のメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出すると、濃縮率は２２５倍となる。なお、調製用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)に代えて、対照用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)を用いることもできる。
【０１２８】
以上の結果から、本発明のプライマーセットであるプライマーセット３と、
メチル化ＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットであるGSTP1プライマーセットを用いることより、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価やメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出できることが示唆された。
【０１２９】
（実施例６）
乳癌細胞であるＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡに代えて、乳癌細胞株ＭＤＡ２３１のゲノムＤＮＡを用い、実施例３と同様の操作により、プライマーセット２を用いてメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを検出した。
【０１３０】
なお、乳癌細胞株ＭＤＡ２３１のゲノムＤＮＡにおいて、ＣＤＨ１遺伝子のプロモーター領域がメチル化されていることが知られている。そこで、メチル化ＤＮＡ検出用プライマーとしては、制限酵素としてＭｓｅＩを用いてヒトゲノムＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片から、ＣＤＨ１遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするCDH1プライマーセットを用いた。なお、CDH1プライマーセットの設計条件は、実施例３の非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計と同様である。GSTP1プライマーセットに含まれるプライマーを以下に示す。
GSTP1プライマーセット：
CDH1-Fプライマー(5'-GTGAACCCTCAGCCAATCAG-3'、配列番号：１８)
CDH1-Rvプライマー(5'-AGTTCCGACGCCACTGAG-3'、配列番号：１９)
【０１３１】
プライマーセット２及びをCDH1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真を図１２に示す。図１２中、レーン１は、調製用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン２は、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン３は、分析用試料（メチル化ＤＮＡ濃縮物）を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。また、図１２中、パネル（ａ）は、CDH1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｂ）は、プライマーセット２を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。
【０１３２】
図１２に示される結果から、プライマーセット２を用いた場合、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量と、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量とがほぼ同等であることがわかる。一方、CDH1プライマーセットを用いた場合、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量に比べ、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量が増加していることがわかる。このことから、本発明のプライマーセットであるプライマーセット２を用いることにより、癌細胞の種類に関係なく、メチル化ＤＮＡ濃縮物中のメチル化ＤＮＡを検出することができることが示唆された。
【０１３３】
（実施例７）
乳癌細胞株ＭＣＦ７のゲノムＤＮＡに代えて、正常乳腺上皮細胞ＨＭＥＣ細胞のゲノムＤＮＡを用い、実施例３と同様の操作により、プライマーセット１及びGSTP1プライマーセットを用いてメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを検出した。なお、正常乳腺上皮細胞において、ＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域がメチル化されていないことが知られている。
【０１３４】
プライマーセット１及びGSTP1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真を図１３に示す。図１３中、レーン１は、調製用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン２は、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン３は、分析用試料（メチル化ＤＮＡ濃縮物）を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。また、図１３中、パネル（ａ）は、GSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｂ）は、プライマーセット２を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。
【０１３５】
図１３のレーン２及び３に示される結果から、プライマーセット１及びGSTP1プライマーセットのいずれも、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量と、分析用試料（メチル化ＤＮＡ濃縮物）を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量とがほぼ同等であることがわかる。このことから、本発明のプライマーセットであるプライマーセット１は、正常細胞から調製されたメチル化ＤＮＡ濃縮物中のメチル化ＤＮＡも検出することができることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】本発明の検出方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図２】本発明の解析方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図３】本発明の判定方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図４】本発明の算出方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図５】本発明の評価方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図６】ＤＮＡ断片の電気泳動パターンを示す図面代用写真である
【図７】ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列に含まれるＣｐＧ領域のメチル化の状態を示す模式図である。
【図８】ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列に含まれるＣｐＧ領域のメチル化の状態を示す模式図である。
【図９】プライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３及びGSTP1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【図１０】GSTP1プライマーセット及びGAPDHプライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【図１１】試料中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示すグラフである。
【図１２】プライマーセット２及びをCDH1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【図１３】プライマーセット１及びGSTP1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３７】
配列番号：１は、プライマーセットの標的配列である。
配列番号：２は、プライマーセットの標的配列である。
配列番号：３は、プライマーセットの標的配列である。
配列番号：４は、プライマーの配列である。
配列番号：５は、プライマーの配列である。
配列番号：６は、プライマーの配列である。
配列番号：７は、プライマーの配列である。
配列番号：８は、プライマーの配列である。
配列番号：９は、プライマーの配列である。
配列番号：１０は、プライマーの配列である。
配列番号：１１は、プライマーの配列である。
配列番号：１２は、プライマーの配列である。
配列番号：１３は、プライマーの配列である。
配列番号：１４は、プライマーの配列である。
配列番号：１５は、プライマーの配列である。
配列番号：１６は、プライマーの配列である。
配列番号：１７は、プライマーの配列である。
配列番号：１８は、プライマーの配列である。
配列番号：１９は、プライマーの配列である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、メチル化ＤＮＡの解析方法に関する。より詳しくは、メチル化ＤＮＡの解析方法、プライマーセット、メチル化ＤＮＡの濃縮工程の信頼性の判定方法、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法、及びメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのＣｐＧ部位のメチル化は、遺伝子発現に大きな影響を与えている。例えば、ＤＮＡのメチル化の異常は、疾患の発症、例えば、細胞のがん化に関連する遺伝子の発現等に関与していることが知られている。そのため、がん等の疾患の診断方法や治療方法の開発のために、種々の遺伝子におけるＤＮＡのメチル化が、網羅的に解析されている。
【０００３】
ＤＮＡのメチル化の解析では、例えば、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化結合タンパク質を用いるメチル化ＤＮＡ免疫沈降法等によりメチル化ＤＮＡの濃縮が行なわれ、その後、得られた濃縮物に含まれるＤＮＡのプロファイリングが行なわれている。かかるＤＮＡのメチル化の解析では、メチル化ＤＮＡの濃縮物に非メチル化ＤＮＡが含まれていた場合、解析の効率の低下を招くことがある。例えば、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法では、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体、メチル化結合タンパク質又はビーズに対して、非メチル化ＤＮＡが非特異的に結合又は吸着する場合がある。そのため、かかるＤＮＡのメチル化の解析では、メチル化ＤＮＡの濃縮物中における非メチル化ＤＮＡの有無や含有量の確認が行なわれている。
【０００４】
メチル化ＤＮＡの濃縮物中における非メチル化ＤＮＡの検出は、メチル化されていないとされていたハウスキーピング遺伝子を指標として行なわれている（非特許文献１及び２を参照のこと）。非特許文献１に記載の方法では、グリセルアルデヒド ３−リン酸デヒドロゲナーゼ（以下、「ＧＡＰＤＨ」という）遺伝子が非メチル化ＤＮＡの指標として用いられている。かかる非特許文献１に記載の方法では、検出されたＧＡＰＤＨ遺伝子で標準化することにより、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法で得られたメチル化ＤＮＡの濃縮物の濃縮量が決定されている。また、非特許文献２に記載の方法では、非メチル化ＤＮＡとして、ＧＡＰＤＨ遺伝子及びβ−アクチン遺伝子が用いられている。かかる非特許文献２に記載の方法では、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法で得られたメチル化ＤＮＡの濃縮物中にＧＡＰＤＨ遺伝子及びβ−アクチン遺伝子が検出されないことを指標として、メチル化ＤＮＡの濃縮率を評価している。
【０００５】
しかしながら、実際には、ＧＡＰＤＨ遺伝子及びβ−アクチン遺伝子それぞれのＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていることがある。そのため、ＧＡＰＤＨ遺伝子、β−アクチン遺伝子等のハウスキーピング遺伝子を指標として用いた場合、メチル化ＤＮＡの濃縮物中における非メチル化ＤＮＡを正確に検出できない場合がある。そのため、メチル化ＤＮＡの濃縮物の濃縮率、純度の評価、や濃縮工程の信頼性の判定が正確に行なうことができない場合があった。
【０００６】
また、指標とするハウスキーピング遺伝子のメチル化の状態を、亜硫酸水素塩で処理したＤＮＡ配列を決定することで確認し、メチル化ＤＮＡの濃縮物の濃縮率等の正確性を担保することは可能である。しかしながら、この場合、メチル化の状態を確認する作業が煩雑であり、時間がかかる。結果として、簡便に、かつ効率よくメチル化ＤＮＡの濃縮物を用いた、メチル化ＤＮＡの解析ができないという問題があった。
【非特許文献１】イラナ ケシェット(Ilana Keshet)、他１０名、「癌細胞におけるデ・ノボ メチル化の有益な機構の証拠(Evidence for an instructive mechanism of de novo methylation incancer cells)」、ネーチャージェネティクス(NATURE GENETICS)、第３８巻、第２号、２０００６年１月２４日発行、ｐ．１４９−１５３
【非特許文献２】ハヤシ ヒロシ、他７名、「オリゴヌクレオチドタイリングアレイを用いるヒトゲノムにおけるＤＮＡメチル化の高分解能マッピング(High-resolution mapping of DNA methylation in human genome usingoligonucleotide tiling array)」、ヒューマン ジェネティックス(HumanGenetics)、第１２０巻、２００６年９月２６日発行、ｐ．７０１−７１１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ効率よく解析することができるメチル化ＤＮＡの解析方法を提供することを１つの課題とする。また、本発明は、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの有無や量を、簡便に、かつ正確に検出することができるプライマーセットを提供することを他の課題とする。さらに、本発明は、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を、簡便に、かつ正確に判定することができるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法を提供することを他の課題とする。また、本発明は、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出することができるメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法を提供することを他の課題とする。さらに、本発明は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡの濃縮率を簡便に、かつ正確に算出することができるメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法を提供することを他の課題とする。本発明は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を簡便に、かつ正確に評価することができる、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法を提供することを他の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、
（１）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、（Ｅ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定する工程、及び（Ｆ）メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、を含む、メチル化ＤＮＡの解析方法；
（２）前記工程（Ｆ）が、前記工程（Ｅ）において、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定された場合に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程である、（１）に記載の解析方法；
（３）制限酵素が、４〜６塩基認識の制限酵素である（１）又は（２）に記載の解析方法；
（４）制限酵素が、ＣｐＧ部位を含まない塩基配列を認識して切断部位を切断する制限酵素である（１）〜（３）いずれかに記載の解析方法；
（５）制限酵素が、ＭｓｅＩである（１）〜（４）いずれかに記載の解析方法；
（６）前記工程（Ｂ）において、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、メチル化ＤＮＡを濃縮する（１）〜（５）いずれかに記載の解析方法；
（７）ＤＮＡ含有試料が、癌細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料である（１）〜（６）いずれかに記載の解析方法；
（８）ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうち、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型として核酸増幅反応を行なうためのプライマーセット；
（９）ＤＮＡ断片が、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のいずれかに示される塩基配列からなるＤＮＡ鎖と、該ＤＮＡ鎖の相補鎖とからなるＤＮＡ断片である（８）に記載のプライマーセット；
（１０）配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：５に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、配列番号：６に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：７に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、又は配列番号：８に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：９に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせからなる（９）に記載のプライマーセット；
（１１）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、（Ｇ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物中に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、及び（Ｈ）前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｇ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する工程、を含む、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法；
（１２）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｃ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び（Ｄ）前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法；
（１３）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｉ）下記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応：（ｉ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、（ｉｉ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、（ｉｉｉ）前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、（ｉｖ）前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、を行なう工程、（Ｊ）前記工程（Ｉ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び（Ｋ）前記工程（Ｊ）で測定された増幅産物の量に基づいて、前記工程（Ｂ）におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する工程、を含む、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法；
（１４）（Ａ）ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、（Ｂ）前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、（Ｌ）下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：（ｉ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、（ｉｉ）前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応を行なう工程、（Ｍ）前記工程（Ｌ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び（Ｎ）前記工程（Ｍ）で測定された増幅産物の量に基づいて、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価する工程、を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法；
に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析方法は、メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ効率よく解析することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のプライマーセットは、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの有無や量を、簡便に、かつ正確に検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法は、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を、簡便に、かつ正確に判定することができるという優れた効果を奏する。また、本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法は、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出することができるという優れた効果を奏する。さらに、本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡの濃縮率を簡便に、かつ正確に算出することができるという優れた効果を奏する。本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法は、種々のメチル化ＤＮＡ濃縮手段によるメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を簡便に、かつ正確に評価することができるという優れた効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡを、制限酵素を用いて断片化することにより得られたＤＮＡ断片のうち、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットに１つの大きな特徴がある。このプライマーセットを用い、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型として核酸増幅反応を行なうことにより、非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出することができる。以下、まず、本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法、及びプライマーセットを説明する。
【００１１】
本発明の検出方法は、（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
を含む。
【００１２】
本発明の検出方法は、ＤＮＡ含有試料中のＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうち、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットが用いられている。鋳型となるＤＮＡ断片は、ＣｐＧ部位を有していない。そのため、ヒト等の生体内のゲノムＤＮＡにおいて、このＤＮＡ断片の領域は、メチル化されることがない。したがって、このＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの存在の指標とすれば、正確にメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出を行なうことができる。よって、本発明の検出方法では、メチル化ＤＮＡ濃縮物と前記プライマーセットとを用いた核酸増幅反応を行ない、核酸増幅反応により得られる増幅産物を検出することで、正確、かつ簡便にメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出することができる。
【００１３】
本明細書において、メチル化ＤＮＡとは、ＤＮＡ中におけるＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されて、５−メチルシトシンとなっているＤＮＡをいう。また、本明細書において、非メチル化ＤＮＡとは、ＤＮＡ中におけるＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないＤＮＡをいう。ＣｐＧ部位は、ゲノム中に存在する５’−ＣｐＧ−３’からなる、シトシンとグアニンのジヌクレオチドの部位であり、メチル化の対象となる部位である。かかるＣｐＧ部位は、遺伝子発現の調節、がん、インプリンティング等に関与する。
【００１４】
図１に本発明の検出方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００１５】
本発明の検出方法では、まず、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理し、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る（ステップＳ１）。ステップＳ１は、前記工程（Ａ）に該当する。
【００１６】
ＤＮＡ含有試料は、生体由来のＤＮＡを含有する試料であればよい。例えば、ヒトから採取された組織や細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料が挙げられる。特に、メチル化ＤＮＡの解析の対象となる、癌患者から採取された癌組織や癌細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料が好ましい。
【００１７】
なお、ＤＮＡは、公知の方法を用いて、組織や細胞から抽出することができる。例えば、生体から採取された組織や細胞を、界面活性剤を用いて溶解させた後、フェノールなどを用いてタンパク質を除去することにより、ＤＮＡを得ることができる。また、ＤＮＡは、市販のＤＮＡ抽出キット等により抽出してもよい。抽出されたＤＮＡは、水や適切な緩衝液に溶解させてもよい。
【００１８】
制限酵素は、４〜６塩基認識の制限酵素が好ましい。本発明では、４〜６塩基認識の制限酵素を用いることにより、ＤＮＡを、核酸増幅における鋳型として適した大きさとなるように断片化させることができる。
【００１９】
制限酵素は、ＣｐＧ部位を含まない塩基配列を認識して切断部位を切断する制限酵素であればよい。より具体的には、ＭｓｅＩ、ＡｌｕＩ、ＸｂａＩ等が挙げられる。制限酵素は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。制限酵素によるＤＮＡの処理は、用いられる制限酵素に応じた反応条件下で行なわれる。
【００２０】
つぎに、得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る（ステップＳ２）。ステップＳ２は、前記工程（Ｂ）に該当する。
【００２１】
メチル化ＤＮＡの濃縮は、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いることにより行なわれる。メチル化ＤＮＡの濃縮方法としては、例えば、
〔１〕 抗メチル化シトシン抗体や抗メチル化シチジン抗体を用いて、メチル化ＤＮＡを免疫沈降させ、メチル化ＤＮＡを回収する方法（ＭｅＤＩＰ法）；
〔２〕 メチル化ＤＮＡ結合タンパク質と、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質に対する抗体とを用いて、メチル化ＤＮＡを免疫沈降させ、メチル化ＤＮＡを回収する方法;及び
〔３〕 メチル化ＤＮＡをヒスチジンタグ融合メチル化ＤＮＡ結合タンパク質に結合させ、メチル化ＤＮＡが結合したヒスチジンタグ融合メチル化ＤＮＡ結合タンパク質をニッケル固定化担体で回収し、メチル化ＤＮＡを回収する方法；
等が挙げられる。
【００２２】
抗メチル化シトシン抗体及び抗メチル化シチジン抗体は、ＤＮＡ内のメチル化シトシン（５−メチルシトシン）やメチル化シチジンに特異的に結合する抗体であればよい。例えば、メチル化シチジン又は分子内に当該メチル化シトシンを含むＤＮＡを抗原として用いて慣用の手法により動物を免疫させることにより作製することができる。また、市販の抗メチル化シトシン抗体や抗メチル化シチジン抗体を用いることもできる。
【００２３】
その後、得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう（ステップＳ３）。ステップＳ３の操作は、前記工程（Ｃ）に該当する。これにより、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片の全体又は一部の領域に対応する核酸が増幅される。なお、図１のステップＳ３における、対照ＤＮＡは、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を示す。
【００２４】
核酸増幅反応を行なう核酸増幅方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応法、鎖置換反応法、リガーゼ連鎖反応法、転写増幅法等が挙げられる。なかでも、増幅産物の定量が迅速かつ簡便にできる観点から、ポリメラーゼ連鎖反応法のひとつであるリアルタイムＰＣＲが望ましい。リアルタイムＰＣＲでは、例えば、増幅産物のＤＮＡをリアルタイムでモニタリングし、指数関数的増幅領域で、該ＤＮＡの定量を行なう。そのため、ポリメラーゼ連鎖反応における増幅速度論に基づき、正確に、該ＤＮＡを定量することができる。リアルタイムＰＣＲとしては、例えば、蛍光を発するインターカレーターを用いるインターカレーター法、増幅産物の配列に特異的な蛍光色素標識オリゴヌクレオチドからなるプローブ（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ、サイクリングプローブなど）を用いるプローブ法等が挙げられる。これらのなかでは、増幅産物の検出及び定量を簡便に行なうことができる観点から、インターカレーター法が好ましい。インターカレーター法では、インターカレーターは、ポリメラーゼ連鎖反応により合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する物質である。インターカレーター法では、二本鎖ＤＮＡとして得られる増幅産物に結合しているインターカレーターの蛍光に基づく蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。インターカレーターとしては、例えば、モレキュラープローブインコーポレーティッド製ＳＹＢＲ（登録商標） ｇｒｅｅｎなどが挙げられる。
【００２５】
次に、上記核酸増幅反応で得られた増幅産物を検出する（ステップＳ４）。ステップＳ４は、前記工程（Ｄ）に該当する。本発明の検出方法では、増幅産物が検出されることが、メチル化ＤＮＡ濃縮物中に非メチル化ＤＮＡが存在することの指標となる。
【００２６】
増幅産物の検出は、公知の方法によって確認することができる。例えば、慣用のアガロースゲル電気泳動、標識プローブを増幅産物にハイブリダイズさせて検出する方法、核酸増幅で生じる副生成物の濁りを検出する方法等により行なわれる。
【００２７】
ここで、本発明のプライマーセットについて説明する。
【００２８】
本発明のプライマーセットによれば、核酸増幅反応によりＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とし、核酸増幅反応を行なうことができる。そのため、本発明のプライマーセットを用いた核酸増幅反応により得られる増幅産物を非メチル化ＤＮＡの指標として、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを正確に検出することができる。また、本発明のプライマーセットによれば、核酸増幅反応を行なうだけで、非メチル化ＤＮＡを検出することができる。そのため、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に検出することができる。
【００２９】
本発明のプライマーセットは、ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片における、一方のＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーと、該ＤＮＡ鎖の相補鎖にハイブリダイズするプライマーとを含む。すなわち、それぞれのプライマーがハイブリダイズする標的配列は、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片の塩基配列に存在する。なお、「相補鎖」とは、二本鎖ＤＮＡにおける一方のＤＮＡ鎖と対をなすＤＮＡ鎖をいう。
【００３０】
本発明のプライマーセットが、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）に用いられるプライマーセットの場合、フォワードプライマーとリバースプライマーのＴｍ値の差は、好ましくは２℃以内が望ましい。また、プライマーセットの各プライマーの塩基配列中におけるグアニン及びシトシンの割合は、好ましくは４０〜６０％が望ましい。プライマーセットの１つのプライマーの塩基配列中において、グアニンは４以上連続していないことが望ましい。プライマーセットの各プライマーの長さは、１７〜２５ヌクレオチド長が望ましい。さらに、プライマーセットの各プライマーは、ＰＣＲの際のアニーリング温度を、好ましくはＴｍに近い温度に設定することが望ましい。
【００３１】
例えば、ヒトゲノムＤＮＡをＭｓｅＩで処理した場合、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片としては、例えば、配列番号：１、配列番号：２、又は配列番号：３に示される塩基配列を有するＤＮＡ断片等が挙げられる。これらのＤＮＡ断片は、その塩基配列中に、ＣｐＧ部位を含んでいないため、ヒトゲノムＤＮＡにおける非メチル化ＤＮＡの指標として好適である。
【００３２】
配列番号：１、配列番号：２、及び配列番号：３に示される塩基配列を有するＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとしては、
〔１〕 配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマー（CGF1-F: 5'-GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGC-3'）と配列番号：５に示される塩基配列からなるプライマー（CGF1-Rv:5'-CCCACACTCCATTTCCATTCCTC-3'）との組み合わせからなるプライマーセット、
〔２〕 配列番号：６に示される塩基配列からなるプライマー（CGF2-F: 5'-GGGTACTTTGCCAATATAGCCATGC-3'）と配列番号：７に示される塩基配列からなるプライマー(CGF2-Rv: 5'-TGGCTAAGTGGGAGGGAGAACAG-3'）との組み合わせからなるプライマーセット、
〔３〕 配列番号：８に示される塩基配列からなるプライマー(CGF3-F: 5'-GGATGGGAGACACCTGGTTCA-3'）と配列番号：８に示される塩基配列からなるプライマー(CGF3-Rv: 5'-GGATGGACCAGCTGCTTTGTACTC-3'）との組み合わせからなるプライマーセット
が挙げられる。これらのプライマーセットによれば、非メチル化ＤＮＡの指標として適した増幅産物を得ることができる。
【００３３】
プライマーセットは、核酸増幅反応を行なう核酸増幅法の種類に応じて、公知の方法で設計することができる。また、プライマーを設計するためのプライマー設計用ソフトウエアも市販されている。前記プライマー設計用ソフトウエアとしては、例えば、ソフトウエア開発株式会社製の商品名：ＧＥＮＥＴＹＸ、ソフトウエア開発株式会社製の商品名：ｐｒｉｍｅｒ３等が挙げられる。
【００３４】
本発明の検出方法は、簡便に、かつ正確にメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出を行うことができる。そのため、本発明の検出方法を用いれば、メチル化ＤＮＡ濃縮物であるメチル化ＤＮＡ検出用試料が、メチル化ＤＮＡの解析に適切であるか否かを、簡便に、かつ正確に判定することができる。そのため、時間がかかり煩雑な、ハウスキーピング遺伝子のメチル化の状態を確認する作業がなくなる。結果として、簡便に、かつ効率よくメチル化ＤＮＡの濃縮物を用いた、メチル化ＤＮＡの解析が可能となる。したがって、本発明には、メチル化ＤＮＡの解析方法も包含される。
【００３５】
本発明の解析方法は、
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
（Ｅ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定する工程、及び
（Ｆ） メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
を含む。
【００３６】
また、前記工程（Ｆ）は、前記工程（Ｅ）において、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定された場合に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程であるのが好ましい。この場合、適切なメチル化ＤＮＡ検出用試料を用いることで、正確なメチル化ＤＮＡの解析が可能となる。また、不適切なメチル化ＤＮＡ検出用試料を検体から除外することにより、より効率的なメチル化ＤＮＡの解析が可能となる。
【００３７】
図２に本発明の解析方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。なお、図２のフローチャートは、工程（Ｆ）において、メチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切な場合に、メチル化ＤＮＡを解析する実施形態を示している。
【００３８】
本発明の解析方法における前記工程（Ａ）〜（Ｄ）は、前述した本発明の検出方法における工程（Ａ）〜（Ｄ）の操作と同様である。すなわち、図２に示されるステップＳ５〜Ｓ８では、図１に示されるステップＳ１〜Ｓ４と同様の操作が行なわれる。
【００３９】
本発明の解析方法では、前記工程（Ｅ）において、増幅産物の検出結果に基づいて、得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定する（ステップＳ９）。増幅産物が、過剰に検出された場合、ステップＳ６（工程（Ｂ））で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であると判定できる。逆に、増幅産物が、検出されない又は殆ど検出されない場合は、ステップＳ６（工程（Ｂ））で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定できる。
【００４０】
例えば、上述のリアルタイムＰＣＲを用いて、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる対照ＤＮＡの量を測定した際に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる対照ＤＮＡの量が所定の量を超えた場合、このメチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であると判定できる。逆に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる対照ＤＮＡの量が所定の量以下の場合は、このメチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定できる。なお、所定の量は、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる全ＤＮＡ量やメチル化ＤＮＡの解析条件などを考慮して、経験的に適宜に設定される。
【００４１】
また、本発明の解析方法では、後述するＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットをさらに用いれば、メチル化ＤＮＡの濃縮率や純度からも、メチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定することができる。すなわち、濃縮率や純度が低い場合、メチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であると判定できる。逆に、濃縮率や純度が高い場合、メチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定できる。
【００４２】
なお、ステップＳ９（工程（Ｅ））において、メチル化ＤＮＡ濃縮物はメチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であると判定された場合、ステップＳ５（工程（Ａ））にもどり、メチル化ＤＮＡ濃縮物を取得する操作を再度行なえばよい。
【００４３】
次に、メチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定された場合、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する（ステップＳ１０）。すなわち、ステップＳ１０は、本発明の解析方法における前記工程（Ｆ）に該当する。
【００４４】
メチル化ＤＮＡの解析で行なわれる手法は、メチル化ＤＮＡ濃縮物をメチル化ＤＮＡ検出用試料として用いる公知の解析手法であれば、特に制限されない。メチル化ＤＮＡの解析手法としては、例えば、疾患関連遺伝子のＤＮＡ、転写因子のＤＮＡ、発現制御因子のＤＮＡ、プロモーター領域のＤＮＡ等を固定化したＤＮＡチップを用いた解析方法が挙げられる。ＤＮＡチップとしては、遺伝子の発現情報で、解読済みのゲノムデータから等間隔に抜き出した塩基配列を検出用プローブとしてタイル状に固定化したタイリングアレイが好ましい。
【００４５】
なお、上述のように、前記ステップＳ９及びステップＳ１０の記載は、工程（Ｆ）において、メチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切な場合に、メチル化ＤＮＡを解析する場合のフローを説明するものである。したがって、本発明の解析方法は、図２のフローチャートに示されるフローに限定されない。
【００４６】
例えば、本発明の解析方法は、ステップ１０の後にステップ９が実行されるフローも包含する。すなわち、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析した後に、該メチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であったか否かを判定する。ここで、メチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であったと判定された場合、メチル化ＤＮＡの解析は終了する。逆に、メチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として不適切であったと判定された場合、ステップＳ５（工程（Ａ））にもどり、メチル化ＤＮＡ濃縮物を取得する操作を再度行なうことになる。
【００４７】
本発明の検出方法は、簡便に、かつ正確にメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出を行なうことができる。そのため、本発明の検出方法を用いれば、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を簡便に、かつ正確に判定することもできる。したがって、本発明には、メチル化ＤＮＡ解析結果の信頼性の判定方法も包含される。
【００４８】
本発明のメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法は、
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｈ）で得られた増幅産物を検出する工程、
（Ｇ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物中に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、及び
（Ｈ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｇ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する工程、
を含む方法である。
【００４９】
図３に本発明の判定方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００５０】
本発明の判定方法における工程（Ａ）〜（Ｄ）は、上述の検出方法における工程（Ａ）〜（Ｄ）の操作と同様である。すなわち、図３に示されるステップＳ１１〜Ｓ１４は、図１に示されるステップＳ１〜Ｓ４と同様の操作が行われる。
【００５１】
本発明の判定方法では、ステップＳ１２（工程（Ｂ））で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物の一部が、メチル化ＤＮＡの解析に用いられる（ステップＳ１５）。すなわち、ステップＳ１５は、本発明の判定方法における工程（Ｇ）に該当する。なお、メチル化ＤＮＡの解析は、上述の本発明の解析方法におけるステップＳ１０（工程（Ｆ））におけるメチル化ＤＮＡの解析と同様の手法により行なわれる。
【００５２】
なお、メチル化ＤＮＡ濃縮物の残りの一部は、ステップＳ１３の（工程（Ｃ））の対照ＤＮＡの増幅、及びステップＳ１４（工程（Ｄ））の増幅産物の検出に用いられる。
【００５３】
増幅産物の検出の後、増幅産物の検出結果に基づいて、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する（ステップＳ１６）。すなわち、ステップＳ１５は、本発明の判定方法における前記工程（Ｈ）に該当する。ここで、ステップＳ１５（工程（Ｈ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定は、上述したステップＳ９（工程（Ｅ））におけるメチル化ＤＮＡ検出用試料が適切であるか否かの判定と、同様の手法で行うことができる。すなわち、増幅産物が、過剰に検出された場合、ステップＳ１５（工程（Ｇ））におけるメチル化ＤＮＡの解析結果は信頼性が低いと判定できる。逆に、増幅産物が、検出されない又はほとんど検出されない場合は、信頼度が高いと判定できる。
【００５４】
上述の本発明のプライマーセットと、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いることで、メチル化ＤＮＡの濃縮率を算出することができる。本発明には、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法も包含される。
【００５５】
本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法は、
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｉ） 下記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応：
（ｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉｉ） 前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｖ） 前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｊ） 前記工程（Ｉ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｋ） 前記工程（Ｊ）で測定された増幅産物の量に基づいて、前記工程（Ｂ）におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する工程、
を含む方法である。
【００５６】
図４に本発明の算出方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００５７】
本発明の算出方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の検出方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）の操作と同様である。すなわち、すなわち、図４に示されるステップＳ１７及びＳ１８は、図１に示されるステップＳ１及びＳ２と同様の操作が行われる。
【００５８】
本発明のメチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法では、工程（Ｉ）において、前記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応を行なう（ステップＳ１９〜Ｓ２２）。ここで、ステップＳ１９は（ｉ）の核酸増幅反応を、ステップＳ２０は（ｉｉ）の核酸増幅反応を、ステップＳ２１は（ｉｉｉ）の核酸増幅反応を、ステップＳ２２は（ｉｖ）の核酸増幅反応を示す。
【００５９】
なお、核酸増幅反応は、増幅産物の量を定量的に測定できる公知の核酸増幅法により行なうことができる。例えば、上述したリアルタイムＰＣＲの他に、リアルタイムＬＡＭＰが挙げられる。ＰＣＲ法やＬＡＭＰ法により核酸を増幅すると、核酸の増幅に伴って反応液の光学的状態（濁度、吸光度、蛍光強度など）が変化する。この光学的状態を、リアルタイムに測定することにより、増幅産物の量を定量的に測定することができる。
【００６０】
リアルタイムＬＡＭＰを用いる場合、核酸の増幅に伴い副産物としてピロリン酸マグネシウムが多量に生成される。このピロリン酸マグネシウムは不溶性であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液の濁度（又は吸光度）をリアルタイムで光学的に測定することにより、増幅産物の量を定量的に測定することができる。また、リアルタイムＬＡＭＰ法においても、上記インターカレーター法を用いることができる。
【００６１】
（ｉ）及び（ｉｉｉ）の核酸増幅反応（ステップＳ１９及びＳ２１）で用いられる、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットとしては、本発明のプライマーセットを用いることができる。
【００６２】
また、（ｉｉ）及び（ｉｖ）の核酸増幅反応（ステップＳ２０及びＳ２２）で用いられる、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちメチル化シトシンを有するＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーセットとしては、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡにおいて、シトシンがメチル化されていることが知られている塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットであればよい。具体的には、ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうち、メチル化シトシンを有するＤＮＡ断片の一方のＤＮＡ鎖にハイブリダイズするプライマーと、該ＤＮＡ鎖の相補鎖にハイブリダイズするプライマーとからなり、該メチル化シトシンを有するＤＮＡ断片の全体又は一部を増幅するためのプライマーセット等が挙げられる。
【００６３】
例えば、ＤＮＡ含有試料に含まれるＤＮＡがＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡの場合、ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとしては、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼｐｉ遺伝子（ＧＳＴＰ１）のプロモーター領域の塩基配列を標的配列としてハイブリダイズするプライマーを含むプライマーセットが挙げられる。より具体的には、ＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡをＭｓｅＩで処理した場合、GSTP1-Fプライマー(5'-GAGGCCTTCGCTGGAGTT-3'、配列番号：１６)とGSTP1-Rプライマー(5'-GTACTCACTGGTGGCGAAGA-3'、配列番号：１７)とからなるGSTP1プライマーセットが挙げられる。
【００６４】
つぎに、工程（Ｊ）において、得られた増幅産物の量を測定する（ステップＳ２３）。増幅産物の量の測定は、上述のように、工程（Ｉ）で用いた核酸増幅法に応じ、公知の手法により行なわれる。
【００６５】
その後、工程（Ｋ）において、前記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量に基づき、メチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する（ステップＳ２４）。（ｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれる非メチル化ＤＮＡ（対照ＤＮＡ）の割合の指標となる。（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡの割合の指標となる。（ｉｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に含まれる非メチル化ＤＮＡ（対照ＤＮＡ）の割合の指標となる。（ｉｖ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量は、メチル化ＤＮＡの濃縮前の試料に含まれるメチル化ＤＮＡの割合の指標となる。
【００６６】
メチル化ＤＮＡの濃縮率は、下記式（１）：
【００６７】
メチル化ＤＮＡの濃縮率＝〔（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量／（ｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量〕／〔（ｉｖ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量）／（ｉｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量〕・・・（１）
【００６８】
により算出することができる。
【００６９】
また、（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量を測定することにより、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価することもできる。従って、本発明には、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法も包含される。
【００７０】
本発明のメチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法は、
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｌ） 下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｍ） 前記工程（Ｌ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｎ） 前記工程（Ｍ）で測定された増幅産物の量に基づいて、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価する工程を含む。
【００７１】
図５に本発明の評価方法の一実施態様を示すフローチャートを示す。
【００７２】
本発明の評価方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）は、本発明の検出方法における工程（Ａ）及び（Ｂ）の操作と同様である。すなわち、図５に示されるステップＳ２５及びＳ２６は、図１に示されるステップＳ１及びＳ２と同様の操作が行われる。
【００７３】
また、本発明の評価方法における工程（Ｌ）の（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応は、本発明の算出方法における工程（Ｉ）の（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応の操作と同様である。すなわち、図５に示されるステップＳ２７及びＳ２８は、図４に示されるステップＳ１９及びＳ２０と同様の操作が行われる。
【００７４】
本発明の評価方法における工程（Ｍ）における増幅産物の量の測定は、本発明の算出方法における工程（Ｊ）の増幅産物の量の測定と同様である。すなわち、図５に示されるステップＳ２９は、図４に示されるステップＳ２３と同様の操作が行われる。
【００７５】
本発明の評価方法では、工程（Ｎ）において、前記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量に基づき、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価する（ステップＳ３０）。メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度は、（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量を比較することにより評価することができる。例えば、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度は、（ｉｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量を、（ｉ）の核酸増幅反応により得られた増幅産物の量で割った値が大きいほど、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度が高いと評価することができる。逆に、値が小さいほど、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度が低いと評価することができる。
【００７６】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
（制限酵素処理によるゲノムＤＮＡの断片化の確認）
乳癌細胞株ＭＣＦ７から抽出したゲノムＤＮＡ １μgを、制限酵素と、３７℃で２時間インキュベーションし、ゲノムＤＮＡの断片化を行なった。ゲノムＤＮＡの断片化に使用した制限酵素及び制限酵素の組み合わせ、並びに緩衝液を以下に示す。
（１）ＭｓｅＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製） NEB buffer2 緩衝液
（２）ＡｌｕＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製） NEB buffer2 緩衝液
（３）ＭｓｅＩとＡｌｕＩとの組み合わせ NEB buffer2 緩衝液
（４）ＭｓｅＩとＸｂａＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ社製）との組み合わせ NEB
buffer2 緩衝液
（５）ＡｌｕＩとＸｂａＩとの組み合わせ NEB buffer2 緩衝液
【００７８】
得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動に供して、ＤＮＡ断片の大きさを確認した。その結果を図６に示す。図６は、ＤＮＡ断片の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。図６中、レーン１は、１ｋｂラダーのマーカー、レーン２は、未処理のＤＮＡ、レーン３は、ＭｓｅＩ処理後のＤＮＡ断片、レーン４は、ＡｌｕＩ処理後のＤＮＡ断片、レーン５は、ＭｓｅＩとＡｌｕＩとの組み合わせによる処理後のＤＮＡ断片、レーン６は、ＭｓｅＩとＸｂａＩとの組み合わせによる処理後のＤＮＡ断片、レーン７は、ＡｌｕＩとＸｂａＩとの組み合わせによる処理後のＤＮＡ断片、レーン８は、１ｋｂラダーのマーカー、レーン９は、１００ｂｐラダーのマーカーを示す。
【００７９】
図６に示される結果から、いずれの制限酵素を用いた場合でも、ＤＮＡ断片の大きさが３００〜１０００ｂｐとなっているため、メチル化ＤＮＡ免疫沈降法に適した大きさのＤＮＡ断片が得られていることがわかる。
【００８０】
（実施例２）
（ＧＡＰＤＨ遺伝子のメチル化ＤＮＡの解析）
ハウスキーピング遺伝子の一つであり、ＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていないと考えられているＧＡＰＤＨ遺伝子のメチル化状態を調べた。
【００８１】
ＤＮＡ抽出キット（キアジェン社製、商品名：QIAmp Blood Maxi Kit）を用いて、乳癌細部株ＭＣＦ７からゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡ ２μｇに、０．３Ｍ ＮａＯＨ ４００μＬを添加し、３７℃で１０分間インキュベーションした。つぎに、インキュベーション後の産物に、１０Ｍ亜硫酸水素ナトリウム溶液４００μＬを添加し、７０℃で４０分間インキュベーションすることにより、亜硫酸水素塩処理を行なった。得られた産物に含まれるＤＮＡを、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いて精製し、分析用試料を得た。この分析用試料を用いて、以下のＰＣＲを行なった。
【００８２】
前記分析用試料１μＬに対して、ＤＮＡポリメラーゼ〔商品名：ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ〕０．１２μＬと、緩衝液（タカラバイオ株式会社製、商品名：10× Ex Taq Buffer）１．５μＬと、２．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１．２μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）０．６μＬと水９．９８μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。前記ＰＣＲ用反応液を用いて、ＰＣＲを行なった。
【００８３】
フォワードプライマーとリバースプライマーとからなるプライマーセットとして、フォワードプライマー〔GAPDH-seq1-F:5'-GAGATTTTTTTAAAATTAAGTGGGG-3'（配列番号：１０）〕とリバースプライマー〔GAPDH-seq1-Rv:5'-ATAAAAAAACCAATCCCCAAAAC-3'（配列番号：１１）〕とからなるＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセット、及びフォワードプライマー〔GAPDH-seq2-F:5'-TAGAGGGGTGATGTGGGGAGTA-3'（配列番号：１２）〕とリバースプライマー〔GAPDH-seq2-Rv:5'-CTAACCCCAACCACATACCAAAA-3'（配列番号：１３）〕とからなるＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットを用いた。
【００８４】
ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセットを用いたＰＣＲの条件は、９５℃４分３０秒のインキュベーション後、９５℃３０秒間と６３℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件とした。また、ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットを用いたＰＣＲの条件は、９５℃４．５分間のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６．７℃１５秒間と７２℃３０秒間とを１サイクルとする４０サイクルの反応を行なう条件とした。
【００８５】
得られたＰＣＲ産物を、クローニングキット（インビトロジェン社製、商品名：TA
cloning kit）を用いて、前記クローニングキットに添付のベクターに組み込み、プラスミドを得た。得られたプラスミドと、Ｍ１３Ｒｖプライマーとを用いて、ＰＣＲ産物の塩基配列を解析した。解析結果を図７及び図８に示す。
【００８６】
図７は、ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列に含まれるＣｐＧ領域のメチル化の状態を示す模式図である。ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列には、１７箇所のＣｐＧ部位が存在する。図中、白丸はメチル化されていないＣｐＧ部位を示し、黒丸はメチル化されているＣｐＧ部位をしめす。
【００８７】
図８は、ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列に含まれるＣｐＧ領域のメチル化の状態を示す模式図である。ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列には、１４箇所のＣｐＧ部位が存在する。図中、白丸はメチル化されていないＣｐＧ部位を示し、黒丸はメチル化されているＣｐＧ部位をしめす。
【００８８】
図７及び図８から明らかなように、ＧＡＰＤＨ遺伝子のＣｐＧ部位のシトシンがメチル化されていることがわかる。このように、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子は、メチル化ＤＮＡの解析の対象となるＤＮＡによって、非メチル化ＤＮＡの指標として不適切な場合があることが明らかになった。
【００８９】
（実施例３）
（非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
ヒトゲノムＤＮＡの塩基配列に基づき、制限酵素としてＭｓｅＩを用いてヒトゲノムＤＮＡを処理して得られるＣｐＧ部位を含まないＤＮＡ断片を選別した。その結果、配列番号：１、配列番号：２、及び配列番号：３で示されるＤＮＡ断片を選別した。
【００９０】
次に、選別されたＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、このＤＮＡ断片を鋳型としてＰＣＲを行うためのプライマーセットを設計した。プライマーセットの設計条件を以下に示す。
（１）フォワードプライマーとリバースプライマーのＴｍ値の差が２℃以内
（２）プライマーの塩基配列中におけるグアニンとシトシンの割合が４０〜６０％
（３）プライマーの塩基配列中においてグアニンが４以上連続しない
（４）プライマーの長さが１７〜２５ｂｐ
（５）Ｔｍに近い温度でアニーリング温度を設定する
【００９１】
上記の設計条件により、配列番号：１で示されるＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセット１、配列番号：２で示されるＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセット２、及び配列番号：３で示されるＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセット３を設計した。各プライマーセットに含まれるプライマーを以下に示す。
プライマーセット１：
CGF1-Fプライマー（5'-GGAGGAGTCAAGAGAAGTTGGAAGC-3'、配列番号：４）
CGF1-Rvプライマー（5'-CCCACACTCCATTTCCATTCCTC-3'、配列番号：５）
プライマーセット２：
CGF2-Fプライマー（5'-GGGTACTTTGCCAATATAGCCATGC-3'、配列番号：６）
CGF2-Rvプライマー(5'-TGGCTAAGTGGGAGGGAGAACAG-3'、配列番号：７）
プライマーセット３：
CGF3-Fプライマー(5'-GGATGGGAGACACCTGGTTCA-3'、配列番号：８）
CGF3-Rvプライマー(5'-GGATGGACCAGCTGCTTTGTACTC-3'、配列番号：９）
【００９２】
（メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計）
ＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡにおいて、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼｐｉ遺伝子（ＧＳＴＰ１）のプロモーター領域が、メチル化されていることが知られている。 そこで、制限酵素としてＭｓｅＩを用いてヒトゲノムＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片から、ＧＳＴＰ１のプロモーター領域の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするGSTP1プライマーセットを設計した。なお、設計条件は上記、非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計と同様である。GSTP1プライマーセットに含まれるプライマーを以下に示す。
GSTP1プライマーセット：
GSTP1-Fプライマー(5'-GAGGCCTTCGCTGGAGTT-3'、配列番号：１６)
GSTP1-Rプライマー(5'-GTACTCACTGGTGGCGAAGA-3'、配列番号：１７)
【００９３】
（分析用試料の調製）
乳癌細胞株ＭＣＦ７のゲノムＤＮＡ ４μｇと、制限酵素ＭｓｅＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）とを３７℃で一晩インキュベーションし、３００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む試料を得た。得られたＤＮＡ断片を含む試料を、９５℃で１０分間インキュベーションして熱変性させ、調製用試料を得た。なお、後述のＰＣＲで用いるための調製用試料も、同様の操作で調製した。
【００９４】
得られた調製用試料に、緩衝液（アップステート社製、商品名：ChIP dilution buffer）６８μＬと、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社製、商品名：protein G sepharose beads）３０２μＬとを添加し、得られた混合物を、４℃で１時間回転させながらインキュベーションした。その後、得られた混合物の上清を回収した。
【００９５】
得られた上清に、抗メチル化シチジン抗体を添加し、得られた混合物を４℃で一晩回転させながらインキュベーションすることにより、メチル化ＤＮＡの免疫沈降を行なった。
【００９６】
その後、免疫沈降アッセイ用キット（アップステート社製、商品名：Chromatin Immuoprecipitation Assay Kit）と、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社製、商品名：Protein G Sepharose beads）とを用いて、免疫沈降後のＤＮＡ−抗体複合体を回収し、複合体からＤＮＡを回収した。
【００９７】
回収されたＤＮＡを含む試料に、プロテイナーゼＫ（シグマ社製）を終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物を５０℃で１時間インキュベーションした。その後、得られた混合物から、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いてＤＮＡを精製し、分析用試料を得た。この分析用試料を用いて、以下のＰＣＲを行った。また、抗メチル化シチジン抗体に代えて、マウスＩｇＧ抗体を用いたことを除き、同様に操作を行なうことで得られた試料を、対照用試料とした。
【００９８】
（各プライマーセットを用いたＰＣＲ）
分析用試料１μＬに、ＰＣＲ用試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製、商品名：2X fast Start SYBR Green Master Mix）１２．５μＬと、フォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、リバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと水９．５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。前記ＰＣＲ用反応液を用いて、ＰＣＲを行なった。対照として、分析用試料の代わりに、調製用試料及び対照用試料を用いてＰＣＲ用反応液を調製し、ＰＣＲを行なった。
【００９９】
なお、フォワードプライマー水溶液とリバースプライマー水溶液には、上述したプライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３及びGSTP1プライマーセットの、フォワードプライマーとリバースプライマーとがそれぞれ含まれている。
【０１００】
ＰＣＲの条件は、９５℃１０分のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６℃１５秒間と７２℃３０秒間とからなる反応を１サイクルとする４５サイクルと、９５℃１分間と６６℃３０秒間と９５℃３０秒間とからなる反応とを行なう条件とした。
【０１０１】
（アガロースゲル電気泳動による増幅された核酸の検出）
ＰＣＲにより増幅された核酸をアガロースゲル電気泳動により検出した。プライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３及びGSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲ後の電気泳動パターンを示す図面代用写真を図９に示す。
【０１０２】
図９中、レーン１は、調製用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン２は、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン３は、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。また、図９中、パネル（ａ）は、GSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｂ）は、プライマーセット１を用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｃ）は、プライマーセット２を用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｄ）は、プライマーセット３を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。
【０１０３】
図９のパネル（ｂ）〜（ｄ）それぞれのレーン２とレーン３とに示される結果から、プライマーセット１〜３を用いた場合、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量と、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量とがほぼ同等であることがわかる。したがって、プライマーセット１〜３の鋳型となるＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片は、抗メチル化シチジン抗体を用いたメチル化ＤＮＡ免疫沈降法によって濃縮されないことがわかる。
【０１０４】
（比較例１）
実施例２によりＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡにおいて、ＧＡＰＤＨ遺伝子がメチル化されていることが確認された。そこで、実際にＧＡＰＤＨ遺伝子が、抗メチル化シチジン抗体を用いたメチル化ＤＮＡ免疫沈降法によって濃縮されるか否かを確認した。
【０１０５】
（ＧＡＰＤＨ遺伝子を増幅するためのプライマーの設計）
制限酵素としてＭｓｅＩを用いてヒトゲノムＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片から、ＧＡＰＤＨ遺伝子の塩基配列を含むメチル化されたＤＮＡ断片を鋳型とするGAPDHプライマーセットを設計した。なお、設計条件は上記、非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計と同様である。GAPDHプライマーセットに含まれるプライマーを以下に示す。
GAPDHプライマーセット：
GAPDH-Fプライマー（5'-GGCACCCTATGGACACGC-3'、配列番号：１４）
GAPDH-Rプライマー（5'-GGAAAGCCAGTCCCCAGAAC-3'、配列番号：１５）
【０１０６】
（プライマーセットを用いたＰＣＲ）
実施例３と同様の操作により、GAPDHプライマーセットを用いて、ＰＣＲを行なった。また、対照として、GSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲも行なった。
【０１０７】
（アガロースゲル電気泳動による増幅された核酸の検出）
実施例３と同様に、ＰＣＲにより増幅された核酸をアガロースゲル電気泳動により検出した。GSTP1プライマーセット及びGAPDHプライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真を図１０に示す。図１０中、パネル（ａ）は、GSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｂ）は、GAPDHプライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。
【０１０８】
図１０のパネル（ｂ）のレーン２とレーン３とに示される結果から、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量に比べ、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量が増加していることがわかる。したがって、GAPDHプライマーセットでは、非メチル化ＤＮＡを検出することができないことがわかる。比較例１の結果は、実施例２の結果と共に、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子は、非メチル化ＤＮＡの指標として不適切な場合があることを示すものである。
【０１０９】
これらの結果から、プライマーセット１〜３のように設計されたプライマーセットにより、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを、簡便に、かつ正確に検出できることがわかる。
【０１１０】
（実施例４）
（GSTP1プライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲの検量線の作成）
乳癌細胞株ＭＣＦ７のゲノムＤＮＡの希釈系列を作製した。得られた希釈系列１μＬに、ＰＣＲ用試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製、商品名：2X fast Start SYBR Green Master Mix）１２．５μＬと、前記GSTP1プライマーセットのGSTP1-Fプライマーを含むフォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、前記GSTP1プライマーセットのGSTP1-Rプライマーを含むリバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、水９．５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。
【０１１１】
前記ＰＣＲ用反応液を用いてＰＣＲを行い、検量線を作成した。なお、ＰＣＲは、９５℃１０分のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６℃１５秒間と７２℃３０秒間とからなる反応を１サイクルとする４５サイクルと、９５℃１分間と６６℃３０秒間と９５℃３０秒間とからなる反応とを行なう条件下で行なった。
【０１１２】
（プライマーセット３を用いたリアルタイムＰＣＲの検量線の作成）
GSTP1プライマーセットの代わりにプライマーセット３を用いて、同様の操作で検量線を作成した。
【０１１３】
（分析用試料の調製）
乳癌細胞株ＭＣＦ７のゲノムＤＮＡ ４μｇと、制限酵素ＭｓｅＩ（ニューイングランドバイオラボ社製）とを３７℃で一晩インキュベーションし、３００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片を含む試料を得た。得られたＤＮＡ断片を含む試料を、９５℃で１０分間インキュベーションして熱変性さ、調製用試料を得た。なお、後述のＰＣＲで用いるための調製用試料も、同様の操作で調製した。
【０１１４】
熱変性後のＤＮＡ断片
４μｇに、緩衝液（アップステート社製、商品名：ChIP dilution buffer）６８μＬと、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社製、商品名：protein G sepharose beads）３０２μＬとを添加し、得られた混合物を、４℃で１時間回転させながらインキュベーションした。その後、得られた混合物の上清を回収した。
【０１１５】
得られた上清に、抗メチル化シチジン抗体を添加し、得られた混合物を４℃で一晩回転させながらインキュベーションすることにより、メチル化ＤＮＡの免疫沈降を行なった。
【０１１６】
その後、免疫沈降アッセイ用キット（アップステート社製、商品名：Chromatin Immuoprecipitation Assay Kit）と、プロテインＧビーズ（ＧＥヘルスケア社製、商品名：Protein G Sepharose beads）とを用いて、免疫沈降後のＤＮＡ−抗体複合体を回収し、複合体からＤＮＡを回収した。
【０１１７】
回収されたＤＮＡを含む試料に、プロテイナーゼＫ（シグマ社製）を終濃度１ｍｇ／ｍＬとなるように添加し、得られた混合物を５０℃で１時間インキュベーションした。その後、得られた混合物から、ＤＮＡ精製キット（キアジェン社製、商品名：Qiaquick PCR purification kit）を用いてＤＮＡを精製し、分析用試料を得た。また、抗メチル化シチジン抗体に代えて、抗マウスＩｇＧ抗体を用いたことを除き、同様に操作を行うことで、対照用試料を得た。
【０１１８】
（GSTP1プライマーセットを用いた、試料中のメチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片の量の算出）
分析用試料１μＬに対して、ＰＣＲ用試薬（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社製、商品名：2X fast Start SYBR Green Master Mix）１２．５μＬと、前記GSTP1プライマーセットのGSTP1-Fプライマーを含むフォワードプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、前記GSTP1プライマーセットのGSTP1-Rプライマーを含むリバースプライマー水溶液（１０μＭ）１μＬと、水９．５μＬとを添加して、ＰＣＲ用反応液を調製した。前記ＰＣＲ用反応液を用いて、ＰＣＲを行なった。対照として、調製用試料及び対照用試料を用いたＰＣＲを行なった。ＰＣＲの条件は、９５℃１０分のインキュベーションの後、９５℃３０秒間と６６℃１５秒間と７２℃３０秒間とからなる反応を１サイクルとする４５サイクルと、９５℃１分間と６６℃３０秒間と９５℃３０秒間とからなる反応とを行なう条件とした。
【０１１９】
ＰＣＲの結果と上述の検量線に基づき、調製用試料、分析用試料及び対照用試料に含まれるＧＳＴＰ１のＤＮＡ（メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片）の量を算出した。以下、メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片を、単にメチル化ＤＮＡ断片と記載する。
【０１２０】
（プライマーセット３を用いた、試料中の非メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片の量の算出）
GSTP1プライマーセットに代えて、プライマーセット３を用いて、調製用試料、分析用試料及び対照用試料に含まれる非メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片の量を算出した。以下、非メチル化ＤＮＡの指標となるＤＮＡ断片を、単に非メチル化ＤＮＡ断片と記載する。
【０１２１】
（メチル化ＤＮＡ濃縮物（分析用試料）の純度の評価）
算出されたメチル化ＤＮＡ断片の量及び非メチル化ＤＮＡ断片の量とに基づき、調製用試料、対照用試料及び分析用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を、下記式（４）により算出した。
【０１２２】
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)＝メチル化ＤＮＡ断片の量(ng)/ 非メチル化ＤＮＡ断片の量(ng)・・・（４）
【０１２３】
試料中におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示すグラフを図１１に示す。図１１中、レーン１は、調製用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示す。レーン２は、対照用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示す。レーン３は、分析用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示す。
【０１２４】
図１１に示される結果から、調製用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合は、０．０２ｎｇ／ｎｇであり、対照用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合は、０．０７ｎｇ／ｎｇであることがわかる。一方、抗メチル化シチジン抗体を用いて免疫沈降を行なった分析用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合は４．５ｎｇ／ｎｇであることがわかる。かかる結果から、調製用試料及び対照用試料に比べ、メチル化ＤＮＡ濃縮物である分析用試料では、メチル化ＤＮＡであるＧＳＴＰ１ ＤＮＡの割合が増えていることがわかる。
【０１２５】
（実施例５）
実施例４で算出した、分析用試料（メチル化ＤＮＡ濃縮物）のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合と、対照用試料又は調製用試料のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合とを用いて、メチル化ＤＮＡの濃縮率を算出することができる。例えば、式（５）：
【０１２６】
メチル化ＤＮＡの濃縮率
＝〔分析用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)〕／〔調製用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)〕・・・（５）
【０１２７】
により算出することができる。ここで、実施例４の結果から、分析用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)は４．５(ng/ng)であり、調製用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)＝０．０２(ng/ng)である。従って、式５を用いて分析用試料のメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出すると、濃縮率は２２５倍となる。なお、調製用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)に代えて、対照用試料におけるメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合(ng/ng)を用いることもできる。
【０１２８】
以上の結果から、本発明のプライマーセットであるプライマーセット３と、
メチル化ＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットであるGSTP1プライマーセットを用いることより、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価やメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出できることが示唆された。
【０１２９】
（実施例６）
乳癌細胞であるＭＣＦ７細胞のゲノムＤＮＡに代えて、乳癌細胞株ＭＤＡ２３１のゲノムＤＮＡを用い、実施例３と同様の操作により、プライマーセット２を用いてメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを検出した。
【０１３０】
なお、乳癌細胞株ＭＤＡ２３１のゲノムＤＮＡにおいて、ＣＤＨ１遺伝子のプロモーター領域がメチル化されていることが知られている。そこで、メチル化ＤＮＡ検出用プライマーとしては、制限酵素としてＭｓｅＩを用いてヒトゲノムＤＮＡを処理して得られるＤＮＡ断片から、ＣＤＨ１遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を含むＤＮＡ断片を鋳型とするCDH1プライマーセットを用いた。なお、CDH1プライマーセットの設計条件は、実施例３の非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーの設計と同様である。GSTP1プライマーセットに含まれるプライマーを以下に示す。
GSTP1プライマーセット：
CDH1-Fプライマー(5'-GTGAACCCTCAGCCAATCAG-3'、配列番号：１８)
CDH1-Rvプライマー(5'-AGTTCCGACGCCACTGAG-3'、配列番号：１９)
【０１３１】
プライマーセット２及びをCDH1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真を図１２に示す。図１２中、レーン１は、調製用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン２は、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン３は、分析用試料（メチル化ＤＮＡ濃縮物）を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。また、図１２中、パネル（ａ）は、CDH1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｂ）は、プライマーセット２を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。
【０１３２】
図１２に示される結果から、プライマーセット２を用いた場合、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量と、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量とがほぼ同等であることがわかる。一方、CDH1プライマーセットを用いた場合、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量に比べ、分析用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量が増加していることがわかる。このことから、本発明のプライマーセットであるプライマーセット２を用いることにより、癌細胞の種類に関係なく、メチル化ＤＮＡ濃縮物中のメチル化ＤＮＡを検出することができることが示唆された。
【０１３３】
（実施例７）
乳癌細胞株ＭＣＦ７のゲノムＤＮＡに代えて、正常乳腺上皮細胞ＨＭＥＣ細胞のゲノムＤＮＡを用い、実施例３と同様の操作により、プライマーセット１及びGSTP1プライマーセットを用いてメチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡを検出した。なお、正常乳腺上皮細胞において、ＧＳＴＰ１遺伝子のプロモーター領域がメチル化されていないことが知られている。
【０１３４】
プライマーセット１及びGSTP1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真を図１３に示す。図１３中、レーン１は、調製用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン２は、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物、レーン３は、分析用試料（メチル化ＤＮＡ濃縮物）を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。また、図１３中、パネル（ａ）は、GSTP1プライマーセットを用いたＰＣＲ後に得られた産物、パネル（ｂ）は、プライマーセット２を用いたＰＣＲ後に得られた産物を示す。
【０１３５】
図１３のレーン２及び３に示される結果から、プライマーセット１及びGSTP1プライマーセットのいずれも、対照用試料を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量と、分析用試料（メチル化ＤＮＡ濃縮物）を用いたＰＣＲ後に得られた産物の量とがほぼ同等であることがわかる。このことから、本発明のプライマーセットであるプライマーセット１は、正常細胞から調製されたメチル化ＤＮＡ濃縮物中のメチル化ＤＮＡも検出することができることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】本発明の検出方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図２】本発明の解析方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図３】本発明の判定方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図４】本発明の算出方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図５】本発明の評価方法の一実施態様を示すフローチャートである。
【図６】ＤＮＡ断片の電気泳動パターンを示す図面代用写真である
【図７】ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ１プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列に含まれるＣｐＧ領域のメチル化の状態を示す模式図である。
【図８】ＧＡＰＤＨ−ｓｅｑ２プライマーセットで増幅されるＧＡＰＤＨ遺伝子のＤＮＡ配列に含まれるＣｐＧ領域のメチル化の状態を示す模式図である。
【図９】プライマーセット１、プライマーセット２、プライマーセット３及びGSTP1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【図１０】GSTP1プライマーセット及びGAPDHプライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【図１１】試料中のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの割合を示すグラフである。
【図１２】プライマーセット２及びをCDH1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【図１３】プライマーセット１及びGSTP1プライマーセットを用いた場合のＰＣＲ後の産物の電気泳動パターンを示す図面代用写真である。
【配列表フリーテキスト】
【０１３７】
配列番号：１は、プライマーセットの標的配列である。
配列番号：２は、プライマーセットの標的配列である。
配列番号：３は、プライマーセットの標的配列である。
配列番号：４は、プライマーの配列である。
配列番号：５は、プライマーの配列である。
配列番号：６は、プライマーの配列である。
配列番号：７は、プライマーの配列である。
配列番号：８は、プライマーの配列である。
配列番号：９は、プライマーの配列である。
配列番号：１０は、プライマーの配列である。
配列番号：１１は、プライマーの配列である。
配列番号：１２は、プライマーの配列である。
配列番号：１３は、プライマーの配列である。
配列番号：１４は、プライマーの配列である。
配列番号：１５は、プライマーの配列である。
配列番号：１６は、プライマーの配列である。
配列番号：１７は、プライマーの配列である。
配列番号：１８は、プライマーの配列である。
配列番号：１９は、プライマーの配列である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
（Ｅ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定する工程、及び
（Ｆ） メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの解析方法。
【請求項２】
前記工程（Ｆ）が、前記工程（Ｅ）において、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定された場合に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程である、請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
制限酵素が、４〜６塩基認識の制限酵素である請求項１又は２に記載の解析方法。
【請求項４】
制限酵素が、ＣｐＧ部位を含まない塩基配列を認識して切断部位を切断する制限酵素である請求項１〜３いずれかに記載の解析方法。
【請求項５】
制限酵素が、ＭｓｅＩである請求項１〜４いずれかに記載の解析方法。
【請求項６】
前記工程（Ｂ）において、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、メチル化ＤＮＡを濃縮する請求項１〜５いずれかに記載の解析方法。
【請求項７】
ＤＮＡ含有試料が、癌細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料である請求項１〜６いずれかに記載の解析方法。
【請求項８】
ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうち、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型として核酸増幅反応を行なうためのプライマーセット。
【請求項９】
ＤＮＡ断片が、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のいずれかに示される塩基配列からなるＤＮＡ鎖と、該ＤＮＡ鎖の相補鎖とからなるＤＮＡ断片である請求項８に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：５に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、
配列番号：６に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：７に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、又は
配列番号：８に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：９に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせからなる請求項９に記載のプライマーセット。
【請求項１１】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
（Ｇ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物中に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
及び
（Ｈ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｇ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法。
【請求項１２】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法。
【請求項１３】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｉ） 下記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応：
（ｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉｉ） 前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｖ） 前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｊ） 前記工程（Ｉ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｋ） 前記工程（Ｊ）で測定された増幅産物の量に基づいて、前記工程（Ｂ）におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法。
【請求項１４】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｌ） 下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｍ） 前記工程（Ｌ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｎ） 前記工程（Ｍ）で測定された増幅産物の量に基づいて、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法。
【請求項１】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
（Ｅ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物が、メチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であるか否かを判定する工程、及び
（Ｆ） メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの解析方法。
【請求項２】
前記工程（Ｆ）が、前記工程（Ｅ）において、前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物がメチル化ＤＮＡ検出用試料として適切であると判定された場合に、メチル化ＤＮＡ濃縮物に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程である、請求項１に記載の解析方法。
【請求項３】
制限酵素が、４〜６塩基認識の制限酵素である請求項１又は２に記載の解析方法。
【請求項４】
制限酵素が、ＣｐＧ部位を含まない塩基配列を認識して切断部位を切断する制限酵素である請求項１〜３いずれかに記載の解析方法。
【請求項５】
制限酵素が、ＭｓｅＩである請求項１〜４いずれかに記載の解析方法。
【請求項６】
前記工程（Ｂ）において、抗メチル化シトシン抗体、抗メチル化シチジン抗体又はメチル化ＤＮＡ結合タンパク質を用いて、メチル化ＤＮＡを濃縮する請求項１〜５いずれかに記載の解析方法。
【請求項７】
ＤＮＡ含有試料が、癌細胞から調製されたＤＮＡを含有する試料である請求項１〜６いずれかに記載の解析方法。
【請求項８】
ＤＮＡを制限酵素で処理して得られるＤＮＡ断片のうち、ＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型として核酸増幅反応を行なうためのプライマーセット。
【請求項９】
ＤＮＡ断片が、配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３のいずれかに示される塩基配列からなるＤＮＡ鎖と、該ＤＮＡ鎖の相補鎖とからなるＤＮＡ断片である請求項８に記載のプライマーセット。
【請求項１０】
配列番号：４に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：５に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、
配列番号：６に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：７に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせ、又は
配列番号：８に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号：９に示される塩基配列からなるプライマーとの組み合わせからなる請求項９に記載のプライマーセット。
【請求項１１】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
（Ｇ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物中に含まれるメチル化ＤＮＡを解析する工程、
及び
（Ｈ） 前記工程（Ｄ）における増幅産物の検出結果に基づいて、前記工程（Ｇ）におけるメチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性を判定する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの解析結果の信頼性の判定方法。
【請求項１２】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｃ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記工程（Ａ）で得られるＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いて核酸増幅反応を行なう工程、及び
（Ｄ） 前記工程（Ｃ）で得られた増幅産物を検出する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物中の非メチル化ＤＮＡの検出方法。
【請求項１３】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｉ） 下記（ｉ）〜（ｉｖ）の核酸増幅反応：
（ｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉｉ） 前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｖ） 前記工程（Ａ）で得られたＤＮＡ断片を含む試料と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｊ） 前記工程（Ｉ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｋ） 前記工程（Ｊ）で測定された増幅産物の量に基づいて、前記工程（Ｂ）におけるメチル化ＤＮＡの濃縮率を算出する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡの濃縮率の算出方法。
【請求項１４】
（Ａ） ＤＮＡ含有試料を制限酵素で処理して、ＤＮＡ断片を含有する試料を得る工程、
（Ｂ） 前記工程（Ａ）で得られた試料に含まれるメチル化ＤＮＡを濃縮して、メチル化ＤＮＡ濃縮物を得る工程、
（Ｌ） 下記（ｉ）及び（ｉｉ）の核酸増幅反応：
（ｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちＣｐＧ部位を有さないＤＮＡ断片を鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
（ｉｉ） 前記工程（Ｂ）で得られたメチル化ＤＮＡ濃縮物と、前記ＤＮＡ断片のうちメチル化ＤＮＡを鋳型とするプライマーセットとを用いた核酸増幅反応、
を行なう工程、
（Ｍ） 前記工程（Ｌ）で得られた増幅産物の量を測定する工程、及び
（Ｎ） 前記工程（Ｍ）で測定された増幅産物の量に基づいて、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度を評価する工程、
を含む、メチル化ＤＮＡ濃縮物の純度の評価方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図７】
【図８】
【図６】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公開番号】特開２００９−２３２７６１（Ｐ２００９−２３２７６１Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８３８０６（Ｐ２００８−８３８０６）
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２７日（２００８．３．２７）
【出願人】（３９００１４９６０）シスメックス株式会社 (810)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]