モノクローナル抗体及びこれを産生するハイブリドーマ
本発明は、ｈＥＰＲの簡便な高感度検出法を確立し、ｈＥＰＲを発現するヒト腫瘍の新規検出法を提供する。具体的には、本発明は、ヒト型エピレグリン（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ｈＥＰＲ）を特異的に認識するモノクローナル抗体、及びこれを産生するハイブリドーマ、該抗体を用いたｈＥＰＲの高感度検出法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、ヒト型エピレグリン（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ｈＥＰＲ）を特異的に認識するモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＭｏＡｂ）、該ＭｏＡｂを産生するハイブリドーマ、該ＭｏＡｂとｈＥＰＲを認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いたサンプル中のｈＥＰＲを特異的に検出する免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
従来、癌細胞において特異的かつ高頻度に出現する遺伝子異常があることが知られており、これに起因して発現する蛋白質がみつかれば、それは癌診断、治療の標的分子となり得ると考えられている。その中で、上皮成長因子ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ファミリーに属する分子群とその受容体ＥｒｂＢファミリー分子群は、癌の増殖、悪性化に関与する分子として癌診断や治療の標的とされてきた（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７，２６３９−２６４８（１９９９）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１９８，１６５−１８４（１９９４）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，７０７−７１２（１９８９）；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０：９１−９５（２０００）；Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．，１；６：Ｄ６８５−７０７（２００１））。
ＥＧＦファミリーメンバーであるエピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＰＲ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、正常細胞の増殖を促進し、ある種の癌細胞に対し増殖を抑制するというｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌな性質を持ち、その発現（ｍＲＮＡ）は、胎盤、単球を除き正常組織において極めて低く、ある種の癌細胞では亢進していることが報告されている（例えばＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，Ｖｏｌ．２７０，ｐ．７４９５−７５００；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９７，Ｖｏｌ．３２６，ｐ．６９−７５を参照のこと）。
また、臨床においても、膀胱癌、膵臓癌において発現が亢進しており、有用な癌診断マーカーになることが指摘されている（例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０００，Ｖｏｌ．１４，２７３（３），ｐ．１０１９−１０２４；ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｊａｎ−Ｆｅｂ，２０ １Ａ９：ｐ．９１−９５；Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，Ｖｏｌ．６１，ｐ．６２２７−６２３３を参照のこと）。
これまで、ヒト型エピレグリン（ｈＥＰＲ）を認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いて、ＥＰＲポリペプチドを検出した報告はある（例えばＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，Ｖｏｌ．２７０，ｐ．７４９５−７５００；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９７，Ｖｏｌ．３２６，ｐ．６９−７５を参照のこと）が、濃縮操作を必要とする、ラジオアイソトープラベルが必要など、スループットのよい、高感度検出方法はなく、また、生体中のＥＰＲポリペプチドを検出したという報告もない。従って、ｈＥＰＲの簡便な高感度検出法が確立できれば、癌診断法として、癌の早期発見に有用な手段となり得る。
【発明の開示】
ＥＰＲと他のＥＧＦファミリーメンバーのタンパク質とは、アミノ酸配列の同一性が２４−５０％であることが知られている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，Ｖｏｌ．２７０，ｐ．７４９５−７５００参照）。また、ＥＰＲは種間の配列相同性が非常に高く、例えばヒトとマウスのＥＰＲでは４６個のアミノ酸残基中６個のアミノ酸が異なるだけであり、上記のポリクローナル抗体では、上記のように操作が煩雑なだけでなく、これらを識別して検出することができなかった。更に、従来の検出では感度が高々１ｎｇ／ｍｌ程度であり、生体内におけるＥＰＲの検出は不可能であった。
本発明は、ｈＥＰＲの簡便な高感度検出法を確立し、ヒト腫瘍の検出に役立てることを課題とする。特に、腫瘍の検出等のために有用な、ピコグラムレベルのｈＥＰＲの存在を簡便に検出できる方法を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、ｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を産生するハイブリドーマ２種類（１Ｃ３、３Ｅ８）を取得するに至った。更に、このＭｏＡｂとｈＥＰＲ−ＰｏｌｙＡｂを組み合わせたＳａｎｄｗｉｃｈ Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ法（Ｓ−ＥＬＩＳＡ）を確立し、高感度で且つハイスループットな検出システムを完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供する。
（１） ヒト型エピレグリン（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ｈＥＰＲ）を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（２） 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４７である、上記（１）に記載のハイブリドーマ。
（３） 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４８である、上記（１）に記載のハイブリドーマ。
（４） 上記（１）〜（３）のいずれかに記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（５） 上記（２）または（３）に記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを認識し、かつｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体。
（６） 上記（４）に記載のモノクローナル抗体とｈＥＰＲを認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いることを特徴とする、サンプル中のｈＥＰＲをｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に検出する方法。
（７） 上記（４）に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ｈＥＰＲを発現する細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法。
（８） ｈＥＰＲを発現する細胞がヒト腫瘍である、上記（７）に記載の方法。
（９） 上記（４）に記載のモノクローナル抗体を含む、ヒト腫瘍の検出のためのキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０７０８６４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のハイブリドーマの産生する抗ｈＥＰＲモノクローナル抗体の力価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。
図２は、ビオチン化抗ｈＥＰＲポリクローナル抗体の力価測定の結果を示す。
図３は、ステップワイズ法及び同時添加法を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｓ−ＥＬＩＳＡ）系の検出感度を示す。
図４は、一次抗体として１Ｃ３モノクローナル抗体を用いたＳ−ＥＬＩＳＡ法による本方法の特異性の検討結果を示す。本システムでは、ＥＧＦファミリー分子、マウス型ＥＰＲとは反応せず、ｈＥＰＲとのみ反応した。
図５は、ヒト血清中ｈＥＰＲのウェスタンブロット解析結果を示す。分子量マーカー位置（キロダルトン；ｋＤａ）を左側に示した。
図６は、ヒト血清中のｈＥＰＲをＳ−ＥＬＩＳＡ法により検出した結果を示す。
図７は、各種細胞培養液中のｈＥＰＲを検出した結果を示す。
発明を実施するための形態
以下に本発明をより詳細に説明するが、当業者であれば本明細書の記載に基づき、当分野において公知の技術を用いて本発明を種々の態様で実施することが可能であり、本発明は下記の形態に特に限定されるものではない。
本明細書において、「ｈＥＰＲ」とは、特に断らない限りにおいてヒト型エピレグリンの前駆体、成熟体又はその断片をさす。また、「前駆体」とは、酵素切断前の膜結合型の形態をいい、「成熟体」とは、細胞膜から分離したアミノ酸４６残基からなるポリペプチド（配列番号１）を意味する。断片としては該ポリペプチドのアミノ酸残基２０個以上、より好ましくは３０個以上の断片であり、ヒト型エピレグリンに特有の配列を必須に有する。ヒト型エピレグリンに特有の配列とは、特に限定することを意味するものではないが、例えば、ヒト型エピレグリンとマウス型エピレグリンとの比較において異なっていることが知られている、配列番号１のアミノ酸配列における２番目、１１番目、２６〜２９番目、及び３９番目のアミノ酸を含む配列である。ヒトとマウスでこれらの部位のアミノ酸残基が異なることは、同じ出願人の特許出願であるＷＯ９４／２９３４０に記載されている。これらの部位を含むアミノ酸配列を有する断片は、ヒトとマウス由来のＥＰＲ断片で高次構造が異なる。尚、「ヒト型エピレグリン」及び「マウス型エピレグリン」とは、ヒト及びマウスで天然に存在するＥＰＲと同じアミノ酸配列を有するものであるが、必ずしも天然から抽出したタンパク質に限定するものではなく、例えば組み換え体、合成したポリペプチドをも包含することを意図するものである。
「特異的に認識する」とは、ｈＥＰＲには認識する（または、結合する）が他のＥＧＦファミリーのタンパク質やマウス型ＥＰＲ等の非ヒト型ＥＰＲには実質的に認識しない（結合しない）ことを意味する。例えば、ｈＥＰＲの前駆体、成熟体そして断片化されたポリペプチドとは認識する（結合する）が、ＥＧＦやＴＧＦ−α、マウス型ＥＰＲ等とは実質的に認識しない（結合しない）ことを意味する。具体的には、他のＥＧＦファミリーのタンパク質やマウス型ＥＰＲ等の非ヒト型ＥＰＲに対する結合親和性と比較して１００倍以上、好ましくは１，０００倍以上、更に好ましくは１０，０００倍以上の結合親和性を有することをいう。
ここで、「実質的に認識（結合）しない」とは、当分野において通常用いられる検出手段及び本発明の検出方法によって結合が確認されないことをいう。具体的には、ｈＥＰＲの前駆体、成熟体そして断片化されたポリペプチドとサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｓ−ＥＬＩＳＡ）法あるいはウェスタンブロット法等で陽性反応を呈するが、ＥＧＦファミリーのＥＧＦやＴＧＦ−α、またマウス等のヒト以外の哺乳動物由来のＥＰＲとは反応を示さない（検出されない）ことを意味する。
「抗体」とは、完全な全長分子からなるｈＥＰＲ及びｈＥＰＲ断片と特異的に結合するポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）又はモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）、又はこれらの抗体の部分フラグメント（例えばパパインまたはペプシンで分解して得られる断片（ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’）等を意味し、後述するような製造方法に従って製造することができる。
本発明に係るハイブリドーマ及びモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。尚、当業者であれば、以下の記載及び当分野において公知の技術に基づき、適宜改変した方法を用い得る。
（１）抗原の調製
抗原となるｈＥＰＲのアミノ酸配列及びこれをコードするヌクレオチド配列については、ＷＯ９４／２９３４０に記載されている。アミノ酸配列を配列番号１に、ヌクレオチド配列を配列番号２に示す。尚、ＷＯ９４／２９３４０においては、ＥＰＲを腫瘍細胞増殖阻害因子と記載している。
ヒト型リコンビナントＥＰＲは、ＷＯ９４／２９３４０に記載のように、ｈＥＰＲをコードするＤＮＡ（配列番号２）の断片を含む発現ベクターを構築し、宿主細胞、例えば、限定するものではないが好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌に導入して発現させることによって得ることができる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を用いて発現させた後、培養液を限外濾過膜（１０００ｋＤａ）を用いて２０倍に濃縮後、ｐＨを７．４に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて調製し、陰イオン交換カラム、例えば、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにより精製を行うことができる。この場合、素通り画分のｐＨを５．０に調整し、陽イオン交換カラム、例えばＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅにより精製する。次に逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ４カラム）による精製を行うことで電気泳動法による単一バンドまで精製することができる。
あるいはまた、ｈＥＰＲは、配列番号１に示すアミノ酸配列に基づき、例えば固相法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．８５，ｐ．２１８５（１９６３））によって化学合成することができる。固相法による化学合成は、通常ペプチド自動合成器を用いて標準的な方法で行うことができる。
（２）ポリクローナル抗体の調製
抗原ペプチド溶液を、温血動物に対してそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに計４〜６回程度投与することにより免疫する。用いられる温血動物は、例えば、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等が挙げられる。３回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、抗原として用いたペプチドを９６ウェルのマイクロタイタープレートに固定し、ＥＬＩＳＡ法によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。精製方法は、例えば硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、プロテインＡ／Ｇなどの活性吸着剤によるアフィニティークロマトグラフィー等の精製法を挙げることができ、さらにｈＥＰＲを固相化したカラムを用いて精製することによりｈＥＰＲに対する特異性を向上させることができる。
（３）モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体産生細胞の作製は、抗原を免疫された温血動物から抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、ＭｏＡｂ抗体産生ハイブリドーマ細胞を調製することができる。融合操作は既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒ等の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６、４９５（１９７５））に従い実施できる。骨髄腫細胞としては、限定するものではないが、例えばＰＡＩ、Ｐ３Ｕ１（ヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ；ＨＳＲＲＢ）、日本、カタログＮｏ．ＪＣＲＢ０１１３及びＪＣＲＢ０７０８）などが挙げられる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルス（ＨＶＪ）をあげることができるが、好ましくは分子量１０００〜６０００のＰＥＧである。１０〜８０％程度の濃度で添加し、２０〜４０℃でインキュベートすることにより、効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体の選別は、公知の方法に準じて行うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なわれる。選別及び育種用培地としては、例えば、１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地などを用いることができる。培養は、通常５％炭酸ガス下、培養温度２０〜４０℃にて５日〜３週間行なわれる。
ハイブリドーマ細胞を培養したウェルから培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によって抗原ペプチドと反応がある抗体を選択することができる。まず９６ウェルプレートに抗原ペプチドを固相化した後、仔牛血清でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の上清を、Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と３７℃、１時間反応させた後、Ｔｅｔｒａ Ｍｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｄｉｄｉｎｅ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴＭＢ；フナコシ）を基質に用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、４５０／５４０ｎｍの吸光度を測定して３程度の値がでた抗体を選択し，限界希釈法によるクローニングを行う。
かくして得られる目的とするハイブリドーマ細胞を培養してその培養上清よりＭｏＡｂを得ることができる。あるいはハイブリドーマ細胞を例えばマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に腹腔内投与し、その腹水中からＭｏＡｂを得ることもできる。
モノクローナル抗体の精製は上記の通常のＰｏＡｂの分離精製と同様に行うことができる。
尚、本発明のｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する好適なハイブリドーマとして、本発明者等は２種のハイブリドーマを平成１４年９月２５日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９０３３及びＦＥＲＭ Ｐ−１９０３４として寄託し、更に平成１６年２月２７日にそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４７及びＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４８としてブタペスト条約に基づく国際寄託に移管している。
更に、本発明のモノクローナル抗体として、上記のハイブリドーマ、特に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４７及びＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４８のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを認識し、かつｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体が包含される。このモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、上記ｈＥＰＲに特有の配列に含まれるアミノ酸残基を含む。
本発明はまた、上記本発明のモノクローナル抗体とｈＥＰＲを認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いることを特徴とする、サンプル中のｈＥＰＲをｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に検出する方法を提供する。サンプルとしては、被験者から採取した血液、体液、組織等からの抽出液等が挙げられる。該方法は、限定するものではないが、好ましくはＳ−ＥＬＩＳＡ法であり、抗原となるｈＥＰＲを含む可能性のあるサンプルと本発明のモノクローナル抗体とを接触させる工程と、該工程で生成する抗原−抗体複合体とポリクローナル抗体とを接触させる工程を含むサンドイッチアッセイである。上記の工程を順次行っても（ステップワイズ法）、また同時に行っても（同時添加法）良い。Ｓ−ＥＬＩＳＡ法については、例えば「単クローン抗体、ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」（岩崎辰夫ら、講談社サイエンティフィック）に記載されており、当業者であれば本明細書の記載に基づいて本発明の方法を実施することができる。本発明の検出方法は非常に検出感度が高く、１０ｐｇ／ｍｌ以上のｈＥＰＲであれば特異的に検出することが可能であるので、生体内におけるｈＥＰＲの発現濃度（２０〜３０ｐｇ／ｍｌ程度）であれば充分な検出が可能である。
本発明はまた、上記本発明のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ｈＥＰＲを発現する細胞、特にヒト腫瘍のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける検出方法を提供する。ｈＥＰＲは、細胞において発現した後、細胞膜から分泌されるため、細胞外液における検出が可能であり、サンプルは必ずしも細胞自体を含有する必要はない。
上記方法は、ヒト由来のサンプルと本発明のモノクローナル抗体を接触させる工程と、サンプル中のｈＥＰＲの存在を該モノクローナル抗体との結合の有無を指標として検出する工程とを含む。対象となるヒト腫瘍としては、例えば肺癌、大腸癌、膀胱癌、子宮癌、結腸癌等が挙げられるが、特に限定するものではない。
本発明の検出方法は感度が高いことを特徴とするため、サンプルの濃縮等の操作を必要とせず、検出を簡便かつ迅速に行うことができる。本方法は、サンプル中のｈＥＰＲ濃度が１０ｐｇ／ｍｌ以上の場合に、Ｓ−ＥＬＩＳＡ法等で検出することができるが、充分な検出にはサンプル中のｈＥＰＲ濃度が２５ｐｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
本発明の検出方法を使用して、特定の腫瘍細胞等におけるｈＥＰＲの発現の有無及び発現レベルを決定し、更にはｈＥＰＲの発現と腫瘍発生とのメカニズムとの関連性等についての解明にも寄与することができる。更に、ｈＥＰＲを高発現する腫瘍細胞と正常細胞における発現量に関するデータに基づいて、特定の被験者におけるその腫瘍の有無を容易に検出することができる。
本発明はまた、上記本発明のモノクローナル抗体を含む、ヒト腫瘍の検出のためのキットを提供する。
本発明のキットには、上記本発明のモノクローナル抗体の他、ポリクローナル抗体、緩衝剤、発色試薬、標識試薬、希釈液等を適宜含めることができる。好ましくは、本発明のキットは、Ｓ−ＥＬＩＳＡを行うためのキットである。
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、上記したように、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ ハイブリドーマの作製
リコンビナントｈＥＰＲ（１ｍｇ／ｍｌ）（ＷＯ９４／２９３４０号に記載の方法に従って作製）１００μｌの生理食塩水溶液にフロイント完全アジュバントを同量添加してエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ ６週齢）の背中に免疫した。２週間後に、５０μｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド（ｈＥＰＲ）生理食塩水溶液とフロイント不完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫し、以降１週間毎に追加免疫を行った。免疫後４０日目に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ペニシリン，ストレプトマイシン入り）中でリンパ球を取り出し、０．１７Ｍの塩化アンモニウムで赤血球処理を行った。取り出したリンパ球をポリエチレングリコール法（ＰＥＧ４０００）によりマウス骨髄腫由来のミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。得られたハイブリドーマ細胞をフィーダー細胞入りのＨＡＴ培地に懸濁して９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に分注し、１５日間培養した。
実施例２ モノクローナル抗体のスクリーニング
実施例１で得られたハイブリドーマ細胞を培養したウェルから培養上清を回収し，ＥＬＩＳＡ法によって抗原ペプチドと反応があるＭｏＡｂを選択した。
まず９６ウェルプレートに１００μｌの１０μｇ／ｍｌ抗原ペプチドを添加し、４℃、一晩固相化後、２００μｌの１０％仔牛血清で３７℃、一晩ブロッキングを行った。ハイブリドーマ細胞の上清１００μｌを添加して３７℃、２時間反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）修飾抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１０００倍に希釈して３７℃、１時間反応させ、Ｔｅｔｒａ Ｍｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｄｉｄｉｎｅ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴＭＢ；フナコシ）を基質に用いて発色させた。
１００μｌの４Ｎ硫酸を添加して反応を停止させた後、４５０−５４０ｎｍの吸光度を測定して吸光度３程度の値がでたＭｏＡｂ、１Ｃ３及び３Ｅ８を選択し、限界希釈法によるクローニングを行った。
７日前、３日前にそれぞれ０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に選択したＭｏＡｂ、１Ｃ３、３Ｅ８のハイブリドーマ細胞を腹腔内注射し、約１０日後に腹水を採取した。採取した腹水は室温で３０分おいた後、４℃で一晩静置し、１５０００ｘ ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収した。
選択した２種のＭｏＡｂの力価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を図１に示す。横軸に表示された量のリコンビナントｈＥＰＲをマイクロウェルプレートに固相化させ、１Ｃ３または３Ｅ８（１μｇ／ｍｌ）を添加して反応後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）修飾抗マウス抗体、及びＴＭＢを用いて発色させた。その結果、２種類のＭｏＡｂとも濃度依存性の反応を示した。
尚、得られたＭｏＡｂ１Ｃ３、３Ｅ８を産生するハイブリドーマを平成１４年９月２５日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９０３３及びＦＥＲＭ Ｐ−１９０３４として寄託した。
実施例３ ポリクローナル抗体の調製
リコンビナントｈＥＰＲ（１ｍｇ／ｍｌ）生理食塩水溶液１ｍｌと１ｍｌのフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）を超音波処理によってエマルジョン化し、ウサギ（日本白色、体重２．７ｋｇ、雌；日本クレア）の背中１０箇所以上に分けて免疫した。１ヶ月後に０．５ｍｌのリコンビナントｈＥＰＲ（１ｍｇ／ｍｌ）生理食塩水溶液１ｍｌと同量のフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を超音波処理によってエマルジョン化したものを用いて同様に２次免疫し、以降１週間毎に１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌリコンビナントｈＥＰＲ生理食塩水溶液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫した。採血は免疫した１週間後に行い、採取した血液はパスツールピペットでよく撹拌し室温で１時間おいた後、４℃で一晩静置の後、５，０００ｘｇ１０分間遠心して抗血清を得た。
抗血清を４０％硫安塩析し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で一晩透析後、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製し、ＩｇＧ画分を得た。さらに抗体を精製するためにＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）約１ｍｌに対し、リコンビナントｈＥＰＲ １ｍｇを取扱説明書の記載に基づいて通常の方法で結合させカラムを作製した。上記で得たＩｇＧ画分をｐＨ８．０に調製し、このカラムに１０時間以上循環し、カラムに吸着した抗体を５０ｍＭ Ｇｌｙｓｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ．２．５）／０．１５ＭｎａＣｌで溶出し、すぐに１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨを中性にもどし、５０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ．７．４）／０．１５Ｍにて透析し、ｈＥＰＲ特異抗体とした。
特異抗体をビオチン化試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて通常用いられている方法によりビオチン化した。ビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂの力価は、以下の方法で測定した。ｈＥＰＲを２００ｎｇ／ｍｌ（１００μｌ／ｗｅｌｌ）を最高濃度に５倍希釈し９６ウェルマイクロプレートに固相化した。２５％ブロックエース（大日本製薬；２００μｌ／ｗｅｌｌ）でブロッキング後、ビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（０．１２５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ（５０％ブロックエース（大日本製薬）を用いて希釈）：１００μｌ／ｗｅｌｌ）を添加して室温で２時間反応後、Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１０００倍希釈液１００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、室温で３０分反応させた。ＴＭＢ添加後、室温で３０分反応後、４Ｎ−硫酸で反応を止め、４５０−５４０ｎｍの吸光度を測定して実施例２と同様に固相化した抗原に対する力価を検出した。その結果、いずれも抗原濃度依存性の反応を示し、使用可能な力価であることを確認した（図２）。
実施例４ サンドイッチＥＬＩＳＡ系の確立
実施例２で得られたモノクローナル抗体、及び実施例３で得られたポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系を作製した。
モノクローナル抗体、１Ｃ３を１μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ／ｗｅｌｌマイクロプレートに添加して４℃で２４時間インキュベートし、固相化した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５（ＴＢＳＴ）２００μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。次に、２５％ブロックエース２００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、４℃で２４時間インキュベートしてブロッキングを行った。
ステップワイズ法（Ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｍｅｔｈｏｄ）として、ＴＢＳＴ２００μｌ／ｗｅｌｌでウェルを３回洗浄後、ｈＥＰＲを１ｎｇ／ｍｌより２倍系列で希釈して添加後、室温で２時間反応させ、次にビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（１μｇ／ｍｌ；１００μｌ／ｗｅｌｌ）を添加し、室温で２時間反応させた。
また、同時添加法（Ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｏｄ）として、抗原のｈＥＰＲとビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂを同時添加し、室温で２時間反応させた。
ＴＢＳＴでウェルを５回洗浄後、アビジン−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１０００倍希釈液１００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、室温で３０分反応させた後、４Ｎ−硫酸で反応を止め、４５０／５４０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、同時添加法とステップワイズ法で検出感度に差がなく、いずれも感度が生体内存在量を測定するのに十分な感度（２５ｐｇ／ｍｌ）であった（図３）。一次抗体として３Ｅ８を用いて同様な試験を行った場合も同様な結果を得た。
実施例５ サンドイッチＥＬＩＳＡ系の特異性
実施例４に示した方法（同時添加法）で本システムの特異性を確認した。
一次抗体として１Ｃ３ ＭｏＡｂ（１μｇ／ｍｌ，１００μｌ／ｗｅｌｌ）を固相化させ、２５％ブロックエース（２００μｌ／ｗｅｌｌ）でブロッキング後、ＥＰＲの属するＥＧＦファミリーメンバーの分子群（６種類；表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＧＦ−α）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＢ−ＥＧＦ），ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ；ＢＴＣ），アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＡＲ），ヘレグリン−α（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ−α；ＨＲＧ−α）：いずれもＲ＆Ｄ社、またはＳｉｇｍａ社より購入）、マウス型ＥＰＲ（ヒト型ＥＰＲと同様に製造）、またはヒト型ＥＰＲをそれぞれ横軸に表示された量で抗原としてビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ｗｅｌｌ；ｆｉｎａｌ１μｇ／ｍｌ）と共に添加した。ＥＧＦファミリーメンバー６種類とマウス型ＥＰＲは最高濃度２００ｎｇ／ｍｌから４段階の５倍希釈系列で添加した（１００μｌ／ｗｅｌｌ）。ヒト型ＥＰＲは最高濃度２００ｐｇ／ｍｌから同様に４段階５倍希釈系列で添加した。次いで、ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰと反応させた後、ＴＭＢを用いて発色させた。
その結果、図４に示すように、ｈＥＰＲは高感度に検出したが、他の分子、すなわちＥＧＦファミリー分子及びマウス型ＥＰＲは１０００倍高い濃度でも全分子ともに検出せず、本サンドイッチＥＬＩＳＡ系の特異性が確認できた。一次抗体として３Ｅ８を用いて同様な試験を行った場合も同様な結果を得た。
実施例６ ヒト血清中のヒト型ＥＰＲのウェスタンブロット解析
ヒト血清（Ｒｏｃｋｌａｎｄ ＩＮＣ．）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて１０倍に希釈した。この希釈血清にリコンビナントｈＥＰＲを添加し、最終濃度がｌａｎｅ１：０ｐｇ／ｍｌ，ｌａｎｅ２：８ｐｇ／ｍｌ、ｌａｎｅ３：４０ｐｇ／ｍｌ、ｌａｎｅ４：２００ｐｇ／ｍｌ、ｌａｎｅ５：１０００ｐｇ／ｍｌになるように５倍系列で希釈して試料を作製した。こうして得られた試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（第一化学）に転写した後、ｈＥＰＲを認識する各抗体、抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ、ＭｏＡｂ１Ｃ３、及び３Ｅ８（１μｇ／ｍｌ）を用いてイムノブロッティング法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，７４９５−７５００）により解析した結果、各抗体ともに特異的に３．７〜８．２キロダルトン（ｋＤａ）の位置にｈＥＰＲを検出した（図５）。尚、ＰｏＡｂと１Ｃ３ＭｏＡｂにおいて約２８ｋＤａにバンドが認められたが、抗原（−）のレーンでも検出されていることから非特異的検出バンドと考えられた。
実施例７ ヒト血清中ヒト型ＥＰＲのＥＬＩＳＡ法による検出
モノクローナル抗体、１Ｃ３或いは３Ｅ８を１μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ／ｗｅｌｌマイクロプレートに添加し、４℃で２４時間インキュベートして固着した。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５（ＴＢＳＴ）２００μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した後、２５％ブロックエースを２００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で２４時間インキュベートしブロッキングを行った。ＴＢＳＴ ２００μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、２倍希釈ヒト血清を用いてｈＥＰＲを最高濃度４００ｐｇ／ｍｌより２倍系列で希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した。同時にビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（２μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴで５回洗浄後、Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１０００倍希釈液１００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、室温で３０分反応させた後、４Ｎ−硫酸で反応を止め、ＴＭＢを用いて発色させて４５０／５４０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、図６に示すように、１Ｃ３及び３Ｅ８のいずれも２５ｐｇ／ｍｌ濃度のｈＥＰＲを十分検出可能であった。
実施例８ 培養ヒト癌細胞の産生するＥＰＲの検出
マウス（ＩＣ３８、ＲＡＷ２６４．７、ＮＩＨ３Ｔ３クローンＴ７、ＭｏＡｂ−３）及びヒト（Ｔ−２４、Ａ−５４９、ＨＣＴ１１６、ｃｏｌｏ２０５、ｃｏｌｏ２０１、ＨｅＬａ、ＮＢ６９、Ａ４３１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＫＢ、ＴＲ−１３）由来の各種培養細胞を、１０６個／１０ｍｌ／ｄｉｓｈで３日間、１０％牛胎児血清存在下培養した培養液を用いて、Ｓ−ＥＬＩＳＡによるｈＥＰＲの検出を行った。
１Ｃ３ ＭｏＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで固相化させ、ブロッキング後、各種細胞培養液５０μｌ／ｗｅｌｌとビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（２μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで同時添加し、室温で２時間インキュベートした。以降の操作は実施例４と同様に行った。尚、対照のためにｈＥＰＲを添加した、またはしていない血清（１０％ＦＢＳ、ヒト血清、０．１％ＢＳＡ（ｈＥＰＲ １ｎｇ／ｍｌ）、ヒト血清（ＥＰＲ １ｎｇ／ｍｌ））で同様の操作を行った。
その結果、マウス型ＥＰＲ産生細胞ＮＩＨ３Ｔ３クローンＴ７をはじめ、マウス細胞の培養液ではＡ４５０ｎｍの吸収は認められなかったのに対し、ヒト型癌細胞ではＡ−５４９（ヒト肺癌細胞）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌）、ｃｏｌｏ２０１（ヒト大腸癌）、ｃｏｌｏ２０５（ヒト大腸癌）、Ｔ−２４（ヒト膀胱癌）においていずれも高いｈＥＰＲの産生が確認され（図７）、培養液中のｈＥＰＲを特異的に検出できることが確認された。尚、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）、ＮＢ６９（ヒト神経芽細胞腫）、ＫＢ（ヒト表皮癌（口腔））、Ａ４３１（ヒト表皮癌（表皮））、ＳＫ−ＢＲ−３（ヒト乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ヒト乳癌）、ＴＲ−１３（ヒト腎癌）のヒト癌細胞の培養液では検出できなかった。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、ヒト血液中、組織中等の生体内に存在するｈＥＰＲを特異的かつ高感度に検出するシステムの提供が可能となり、ｈＥＰＲを発現する腫瘍細胞の存在を検出する癌診断等に有用である。更に、本発明の方法を用い、ｈＥＰＲの発現の有無、更にはｈＥＰＲの発現と腫瘍発生とのメカニズムとの関連性等についての解明にも寄与することが期待される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【技術分野】
本発明は、ヒト型エピレグリン（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ｈＥＰＲ）を特異的に認識するモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ＭｏＡｂ）、該ＭｏＡｂを産生するハイブリドーマ、該ＭｏＡｂとｈＥＰＲを認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いたサンプル中のｈＥＰＲを特異的に検出する免疫学的測定方法に関する。
【背景技術】
従来、癌細胞において特異的かつ高頻度に出現する遺伝子異常があることが知られており、これに起因して発現する蛋白質がみつかれば、それは癌診断、治療の標的分子となり得ると考えられている。その中で、上皮成長因子ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）ファミリーに属する分子群とその受容体ＥｒｂＢファミリー分子群は、癌の増殖、悪性化に関与する分子として癌診断や治療の標的とされてきた（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１７，２６３９−２６４８（１９９９）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１１９８，１６５−１８４（１９９４）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，７０７−７１２（１９８９）；Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０：９１−９５（２０００）；Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．，１；６：Ｄ６８５−７０７（２００１））。
ＥＧＦファミリーメンバーであるエピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＥＰＲ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験において、正常細胞の増殖を促進し、ある種の癌細胞に対し増殖を抑制するというｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌな性質を持ち、その発現（ｍＲＮＡ）は、胎盤、単球を除き正常組織において極めて低く、ある種の癌細胞では亢進していることが報告されている（例えばＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，Ｖｏｌ．２７０，ｐ．７４９５−７５００；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９７，Ｖｏｌ．３２６，ｐ．６９−７５を参照のこと）。
また、臨床においても、膀胱癌、膵臓癌において発現が亢進しており、有用な癌診断マーカーになることが指摘されている（例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０００，Ｖｏｌ．１４，２７３（３），ｐ．１０１９−１０２４；ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０００，Ｊａｎ−Ｆｅｂ，２０ １Ａ９：ｐ．９１−９５；Ｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，Ｖｏｌ．６１，ｐ．６２２７−６２３３を参照のこと）。
これまで、ヒト型エピレグリン（ｈＥＰＲ）を認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いて、ＥＰＲポリペプチドを検出した報告はある（例えばＴｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，Ｖｏｌ．２７０，ｐ．７４９５−７５００；Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９７，Ｖｏｌ．３２６，ｐ．６９−７５を参照のこと）が、濃縮操作を必要とする、ラジオアイソトープラベルが必要など、スループットのよい、高感度検出方法はなく、また、生体中のＥＰＲポリペプチドを検出したという報告もない。従って、ｈＥＰＲの簡便な高感度検出法が確立できれば、癌診断法として、癌の早期発見に有用な手段となり得る。
【発明の開示】
ＥＰＲと他のＥＧＦファミリーメンバーのタンパク質とは、アミノ酸配列の同一性が２４−５０％であることが知られている（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９５，Ｖｏｌ．２７０，ｐ．７４９５−７５００参照）。また、ＥＰＲは種間の配列相同性が非常に高く、例えばヒトとマウスのＥＰＲでは４６個のアミノ酸残基中６個のアミノ酸が異なるだけであり、上記のポリクローナル抗体では、上記のように操作が煩雑なだけでなく、これらを識別して検出することができなかった。更に、従来の検出では感度が高々１ｎｇ／ｍｌ程度であり、生体内におけるＥＰＲの検出は不可能であった。
本発明は、ｈＥＰＲの簡便な高感度検出法を確立し、ヒト腫瘍の検出に役立てることを課題とする。特に、腫瘍の検出等のために有用な、ピコグラムレベルのｈＥＰＲの存在を簡便に検出できる方法を提供する。
本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、ｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）を産生するハイブリドーマ２種類（１Ｃ３、３Ｅ８）を取得するに至った。更に、このＭｏＡｂとｈＥＰＲ−ＰｏｌｙＡｂを組み合わせたＳａｎｄｗｉｃｈ Ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ法（Ｓ−ＥＬＩＳＡ）を確立し、高感度で且つハイスループットな検出システムを完成するに至った。
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（９）を提供する。
（１） ヒト型エピレグリン（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ｈＥＰＲ）を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（２） 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４７である、上記（１）に記載のハイブリドーマ。
（３） 受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４８である、上記（１）に記載のハイブリドーマ。
（４） 上記（１）〜（３）のいずれかに記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（５） 上記（２）または（３）に記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを認識し、かつｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体。
（６） 上記（４）に記載のモノクローナル抗体とｈＥＰＲを認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いることを特徴とする、サンプル中のｈＥＰＲをｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に検出する方法。
（７） 上記（４）に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ｈＥＰＲを発現する細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法。
（８） ｈＥＰＲを発現する細胞がヒト腫瘍である、上記（７）に記載の方法。
（９） 上記（４）に記載のモノクローナル抗体を含む、ヒト腫瘍の検出のためのキット。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００３−０７０８６４号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明のハイブリドーマの産生する抗ｈＥＰＲモノクローナル抗体の力価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示す。
図２は、ビオチン化抗ｈＥＰＲポリクローナル抗体の力価測定の結果を示す。
図３は、ステップワイズ法及び同時添加法を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｓ−ＥＬＩＳＡ）系の検出感度を示す。
図４は、一次抗体として１Ｃ３モノクローナル抗体を用いたＳ−ＥＬＩＳＡ法による本方法の特異性の検討結果を示す。本システムでは、ＥＧＦファミリー分子、マウス型ＥＰＲとは反応せず、ｈＥＰＲとのみ反応した。
図５は、ヒト血清中ｈＥＰＲのウェスタンブロット解析結果を示す。分子量マーカー位置（キロダルトン；ｋＤａ）を左側に示した。
図６は、ヒト血清中のｈＥＰＲをＳ−ＥＬＩＳＡ法により検出した結果を示す。
図７は、各種細胞培養液中のｈＥＰＲを検出した結果を示す。
発明を実施するための形態
以下に本発明をより詳細に説明するが、当業者であれば本明細書の記載に基づき、当分野において公知の技術を用いて本発明を種々の態様で実施することが可能であり、本発明は下記の形態に特に限定されるものではない。
本明細書において、「ｈＥＰＲ」とは、特に断らない限りにおいてヒト型エピレグリンの前駆体、成熟体又はその断片をさす。また、「前駆体」とは、酵素切断前の膜結合型の形態をいい、「成熟体」とは、細胞膜から分離したアミノ酸４６残基からなるポリペプチド（配列番号１）を意味する。断片としては該ポリペプチドのアミノ酸残基２０個以上、より好ましくは３０個以上の断片であり、ヒト型エピレグリンに特有の配列を必須に有する。ヒト型エピレグリンに特有の配列とは、特に限定することを意味するものではないが、例えば、ヒト型エピレグリンとマウス型エピレグリンとの比較において異なっていることが知られている、配列番号１のアミノ酸配列における２番目、１１番目、２６〜２９番目、及び３９番目のアミノ酸を含む配列である。ヒトとマウスでこれらの部位のアミノ酸残基が異なることは、同じ出願人の特許出願であるＷＯ９４／２９３４０に記載されている。これらの部位を含むアミノ酸配列を有する断片は、ヒトとマウス由来のＥＰＲ断片で高次構造が異なる。尚、「ヒト型エピレグリン」及び「マウス型エピレグリン」とは、ヒト及びマウスで天然に存在するＥＰＲと同じアミノ酸配列を有するものであるが、必ずしも天然から抽出したタンパク質に限定するものではなく、例えば組み換え体、合成したポリペプチドをも包含することを意図するものである。
「特異的に認識する」とは、ｈＥＰＲには認識する（または、結合する）が他のＥＧＦファミリーのタンパク質やマウス型ＥＰＲ等の非ヒト型ＥＰＲには実質的に認識しない（結合しない）ことを意味する。例えば、ｈＥＰＲの前駆体、成熟体そして断片化されたポリペプチドとは認識する（結合する）が、ＥＧＦやＴＧＦ−α、マウス型ＥＰＲ等とは実質的に認識しない（結合しない）ことを意味する。具体的には、他のＥＧＦファミリーのタンパク質やマウス型ＥＰＲ等の非ヒト型ＥＰＲに対する結合親和性と比較して１００倍以上、好ましくは１，０００倍以上、更に好ましくは１０，０００倍以上の結合親和性を有することをいう。
ここで、「実質的に認識（結合）しない」とは、当分野において通常用いられる検出手段及び本発明の検出方法によって結合が確認されないことをいう。具体的には、ｈＥＰＲの前駆体、成熟体そして断片化されたポリペプチドとサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｓ−ＥＬＩＳＡ）法あるいはウェスタンブロット法等で陽性反応を呈するが、ＥＧＦファミリーのＥＧＦやＴＧＦ−α、またマウス等のヒト以外の哺乳動物由来のＥＰＲとは反応を示さない（検出されない）ことを意味する。
「抗体」とは、完全な全長分子からなるｈＥＰＲ及びｈＥＰＲ断片と特異的に結合するポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）又はモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）、又はこれらの抗体の部分フラグメント（例えばパパインまたはペプシンで分解して得られる断片（ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２またはＦａｂ’）等を意味し、後述するような製造方法に従って製造することができる。
本発明に係るハイブリドーマ及びモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。尚、当業者であれば、以下の記載及び当分野において公知の技術に基づき、適宜改変した方法を用い得る。
（１）抗原の調製
抗原となるｈＥＰＲのアミノ酸配列及びこれをコードするヌクレオチド配列については、ＷＯ９４／２９３４０に記載されている。アミノ酸配列を配列番号１に、ヌクレオチド配列を配列番号２に示す。尚、ＷＯ９４／２９３４０においては、ＥＰＲを腫瘍細胞増殖阻害因子と記載している。
ヒト型リコンビナントＥＰＲは、ＷＯ９４／２９３４０に記載のように、ｈＥＰＲをコードするＤＮＡ（配列番号２）の断片を含む発現ベクターを構築し、宿主細胞、例えば、限定するものではないが好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌に導入して発現させることによって得ることができる。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ菌を用いて発現させた後、培養液を限外濾過膜（１０００ｋＤａ）を用いて２０倍に濃縮後、ｐＨを７．４に１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて調製し、陰イオン交換カラム、例えば、Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにより精製を行うことができる。この場合、素通り画分のｐＨを５．０に調整し、陽イオン交換カラム、例えばＳ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅにより精製する。次に逆相カラムクロマトグラフィー（Ｃ４カラム）による精製を行うことで電気泳動法による単一バンドまで精製することができる。
あるいはまた、ｈＥＰＲは、配列番号１に示すアミノ酸配列に基づき、例えば固相法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．８５，ｐ．２１８５（１９６３））によって化学合成することができる。固相法による化学合成は、通常ペプチド自動合成器を用いて標準的な方法で行うことができる。
（２）ポリクローナル抗体の調製
抗原ペプチド溶液を、温血動物に対してそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに計４〜６回程度投与することにより免疫する。用いられる温血動物は、例えば、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット等が挙げられる。３回皮下免疫を行った時点で試採血を行い、抗体価を測定することが好ましい。血清中の抗体価の測定は、抗原として用いたペプチドを９６ウェルのマイクロタイタープレートに固定し、ＥＬＩＳＡ法によって行うことができる。抗体価が十分上昇したことを確認した後、全採血し、通常行われる方法により抗体を分離精製することができる。精製方法は、例えば硫安塩析法、ＤＥＡＥセルロース等の陰イオン交換体を利用するイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過法、プロテインＡ／Ｇなどの活性吸着剤によるアフィニティークロマトグラフィー等の精製法を挙げることができ、さらにｈＥＰＲを固相化したカラムを用いて精製することによりｈＥＰＲに対する特異性を向上させることができる。
（３）モノクローナル抗体の調製
モノクローナル抗体産生細胞の作製は、抗原を免疫された温血動物から抗体価の認められた個体を選択し、最終免疫の２〜５日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、ＭｏＡｂ抗体産生ハイブリドーマ細胞を調製することができる。融合操作は既知の方法、例えばＫｏｈｌｅｒ等の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２５６、４９５（１９７５））に従い実施できる。骨髄腫細胞としては、限定するものではないが、例えばＰＡＩ、Ｐ３Ｕ１（ヒューマンサイエンス研究資源バンク（Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ；ＨＳＲＲＢ）、日本、カタログＮｏ．ＪＣＲＢ０１１３及びＪＣＲＢ０７０８）などが挙げられる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルス（ＨＶＪ）をあげることができるが、好ましくは分子量１０００〜６０００のＰＥＧである。１０〜８０％程度の濃度で添加し、２０〜４０℃でインキュベートすることにより、効率よく細胞融合を実施できる。
モノクローナル抗体の選別は、公知の方法に準じて行うことができる。通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なわれる。選別及び育種用培地としては、例えば、１０〜２０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地などを用いることができる。培養は、通常５％炭酸ガス下、培養温度２０〜４０℃にて５日〜３週間行なわれる。
ハイブリドーマ細胞を培養したウェルから培養上清を回収し、ＥＬＩＳＡ法によって抗原ペプチドと反応がある抗体を選択することができる。まず９６ウェルプレートに抗原ペプチドを固相化した後、仔牛血清でブロッキングする。ハイブリドーマ細胞の上清を、Ｍｏｕｓｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ／ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と３７℃、１時間反応させた後、Ｔｅｔｒａ Ｍｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｄｉｄｉｎｅ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴＭＢ；フナコシ）を基質に用いて発色させる。酸で反応を停止させた後、４５０／５４０ｎｍの吸光度を測定して３程度の値がでた抗体を選択し，限界希釈法によるクローニングを行う。
かくして得られる目的とするハイブリドーマ細胞を培養してその培養上清よりＭｏＡｂを得ることができる。あるいはハイブリドーマ細胞を例えばマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に腹腔内投与し、その腹水中からＭｏＡｂを得ることもできる。
モノクローナル抗体の精製は上記の通常のＰｏＡｂの分離精製と同様に行うことができる。
尚、本発明のｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体を産生する好適なハイブリドーマとして、本発明者等は２種のハイブリドーマを平成１４年９月２５日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９０３３及びＦＥＲＭ Ｐ−１９０３４として寄託し、更に平成１６年２月２７日にそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４７及びＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４８としてブタペスト条約に基づく国際寄託に移管している。
更に、本発明のモノクローナル抗体として、上記のハイブリドーマ、特に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４７及びＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４８のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを認識し、かつｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体が包含される。このモノクローナル抗体によって認識されるエピトープは、上記ｈＥＰＲに特有の配列に含まれるアミノ酸残基を含む。
本発明はまた、上記本発明のモノクローナル抗体とｈＥＰＲを認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いることを特徴とする、サンプル中のｈＥＰＲをｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に検出する方法を提供する。サンプルとしては、被験者から採取した血液、体液、組織等からの抽出液等が挙げられる。該方法は、限定するものではないが、好ましくはＳ−ＥＬＩＳＡ法であり、抗原となるｈＥＰＲを含む可能性のあるサンプルと本発明のモノクローナル抗体とを接触させる工程と、該工程で生成する抗原−抗体複合体とポリクローナル抗体とを接触させる工程を含むサンドイッチアッセイである。上記の工程を順次行っても（ステップワイズ法）、また同時に行っても（同時添加法）良い。Ｓ−ＥＬＩＳＡ法については、例えば「単クローン抗体、ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」（岩崎辰夫ら、講談社サイエンティフィック）に記載されており、当業者であれば本明細書の記載に基づいて本発明の方法を実施することができる。本発明の検出方法は非常に検出感度が高く、１０ｐｇ／ｍｌ以上のｈＥＰＲであれば特異的に検出することが可能であるので、生体内におけるｈＥＰＲの発現濃度（２０〜３０ｐｇ／ｍｌ程度）であれば充分な検出が可能である。
本発明はまた、上記本発明のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ｈＥＰＲを発現する細胞、特にヒト腫瘍のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける検出方法を提供する。ｈＥＰＲは、細胞において発現した後、細胞膜から分泌されるため、細胞外液における検出が可能であり、サンプルは必ずしも細胞自体を含有する必要はない。
上記方法は、ヒト由来のサンプルと本発明のモノクローナル抗体を接触させる工程と、サンプル中のｈＥＰＲの存在を該モノクローナル抗体との結合の有無を指標として検出する工程とを含む。対象となるヒト腫瘍としては、例えば肺癌、大腸癌、膀胱癌、子宮癌、結腸癌等が挙げられるが、特に限定するものではない。
本発明の検出方法は感度が高いことを特徴とするため、サンプルの濃縮等の操作を必要とせず、検出を簡便かつ迅速に行うことができる。本方法は、サンプル中のｈＥＰＲ濃度が１０ｐｇ／ｍｌ以上の場合に、Ｓ−ＥＬＩＳＡ法等で検出することができるが、充分な検出にはサンプル中のｈＥＰＲ濃度が２５ｐｇ／ｍｌ以上であることが好ましい。
本発明の検出方法を使用して、特定の腫瘍細胞等におけるｈＥＰＲの発現の有無及び発現レベルを決定し、更にはｈＥＰＲの発現と腫瘍発生とのメカニズムとの関連性等についての解明にも寄与することができる。更に、ｈＥＰＲを高発現する腫瘍細胞と正常細胞における発現量に関するデータに基づいて、特定の被験者におけるその腫瘍の有無を容易に検出することができる。
本発明はまた、上記本発明のモノクローナル抗体を含む、ヒト腫瘍の検出のためのキットを提供する。
本発明のキットには、上記本発明のモノクローナル抗体の他、ポリクローナル抗体、緩衝剤、発色試薬、標識試薬、希釈液等を適宜含めることができる。好ましくは、本発明のキットは、Ｓ−ＥＬＩＳＡを行うためのキットである。
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、上記したように、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ ハイブリドーマの作製
リコンビナントｈＥＰＲ（１ｍｇ／ｍｌ）（ＷＯ９４／２９３４０号に記載の方法に従って作製）１００μｌの生理食塩水溶液にフロイント完全アジュバントを同量添加してエマルジョン化し、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ ６週齢）の背中に免疫した。２週間後に、５０μｌの１ｍｇ／ｍｌ抗原ペプチド（ｈＥＰＲ）生理食塩水溶液とフロイント不完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫し、以降１週間毎に追加免疫を行った。免疫後４０日目に脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地（ペニシリン，ストレプトマイシン入り）中でリンパ球を取り出し、０．１７Ｍの塩化アンモニウムで赤血球処理を行った。取り出したリンパ球をポリエチレングリコール法（ＰＥＧ４０００）によりマウス骨髄腫由来のミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１株と融合させ、ハイブリドーマ細胞を作製した。得られたハイブリドーマ細胞をフィーダー細胞入りのＨＡＴ培地に懸濁して９６穴プレート（Ｎｕｎｃ）に分注し、１５日間培養した。
実施例２ モノクローナル抗体のスクリーニング
実施例１で得られたハイブリドーマ細胞を培養したウェルから培養上清を回収し，ＥＬＩＳＡ法によって抗原ペプチドと反応があるＭｏＡｂを選択した。
まず９６ウェルプレートに１００μｌの１０μｇ／ｍｌ抗原ペプチドを添加し、４℃、一晩固相化後、２００μｌの１０％仔牛血清で３７℃、一晩ブロッキングを行った。ハイブリドーマ細胞の上清１００μｌを添加して３７℃、２時間反応させた後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）修飾抗マウス抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を１０００倍に希釈して３７℃、１時間反応させ、Ｔｅｔｒａ Ｍｅｔｈｙｌ Ｂｅｎｄｉｄｉｎｅ Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴＭＢ；フナコシ）を基質に用いて発色させた。
１００μｌの４Ｎ硫酸を添加して反応を停止させた後、４５０−５４０ｎｍの吸光度を測定して吸光度３程度の値がでたＭｏＡｂ、１Ｃ３及び３Ｅ８を選択し、限界希釈法によるクローニングを行った。
７日前、３日前にそれぞれ０．５ｍｌのプリスタンを腹腔内投与したマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）に選択したＭｏＡｂ、１Ｃ３、３Ｅ８のハイブリドーマ細胞を腹腔内注射し、約１０日後に腹水を採取した。採取した腹水は室温で３０分おいた後、４℃で一晩静置し、１５０００ｘ ｒｐｍ、１０分間遠心して上清を回収した。
選択した２種のＭｏＡｂの力価をＥＬＩＳＡ法により測定した結果を図１に示す。横軸に表示された量のリコンビナントｈＥＰＲをマイクロウェルプレートに固相化させ、１Ｃ３または３Ｅ８（１μｇ／ｍｌ）を添加して反応後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）修飾抗マウス抗体、及びＴＭＢを用いて発色させた。その結果、２種類のＭｏＡｂとも濃度依存性の反応を示した。
尚、得られたＭｏＡｂ１Ｃ３、３Ｅ８を産生するハイブリドーマを平成１４年９月２５日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１−１−１ 中央第６）にそれぞれ受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１９０３３及びＦＥＲＭ Ｐ−１９０３４として寄託した。
実施例３ ポリクローナル抗体の調製
リコンビナントｈＥＰＲ（１ｍｇ／ｍｌ）生理食塩水溶液１ｍｌと１ｍｌのフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ）を超音波処理によってエマルジョン化し、ウサギ（日本白色、体重２．７ｋｇ、雌；日本クレア）の背中１０箇所以上に分けて免疫した。１ヶ月後に０．５ｍｌのリコンビナントｈＥＰＲ（１ｍｇ／ｍｌ）生理食塩水溶液１ｍｌと同量のフロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ）を超音波処理によってエマルジョン化したものを用いて同様に２次免疫し、以降１週間毎に１ｍｌの１ｍｇ／ｍｌリコンビナントｈＥＰＲ生理食塩水溶液と１ｍｌのフロイント不完全アジュバントを超音波処理によってエマルジョン化したものを追加免疫した。採血は免疫した１週間後に行い、採取した血液はパスツールピペットでよく撹拌し室温で１時間おいた後、４℃で一晩静置の後、５，０００ｘｇ１０分間遠心して抗血清を得た。
抗血清を４０％硫安塩析し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で一晩透析後、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により精製し、ＩｇＧ画分を得た。さらに抗体を精製するためにＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）約１ｍｌに対し、リコンビナントｈＥＰＲ １ｍｇを取扱説明書の記載に基づいて通常の方法で結合させカラムを作製した。上記で得たＩｇＧ画分をｐＨ８．０に調製し、このカラムに１０時間以上循環し、カラムに吸着した抗体を５０ｍＭ Ｇｌｙｓｉｎｅ−ＨＣｌ（ｐＨ．２．５）／０．１５ＭｎａＣｌで溶出し、すぐに１Ｍ ＴｒｉｓでｐＨを中性にもどし、５０ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ．７．４）／０．１５Ｍにて透析し、ｈＥＰＲ特異抗体とした。
特異抗体をビオチン化試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて通常用いられている方法によりビオチン化した。ビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂの力価は、以下の方法で測定した。ｈＥＰＲを２００ｎｇ／ｍｌ（１００μｌ／ｗｅｌｌ）を最高濃度に５倍希釈し９６ウェルマイクロプレートに固相化した。２５％ブロックエース（大日本製薬；２００μｌ／ｗｅｌｌ）でブロッキング後、ビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（０．１２５μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ（５０％ブロックエース（大日本製薬）を用いて希釈）：１００μｌ／ｗｅｌｌ）を添加して室温で２時間反応後、Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１０００倍希釈液１００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、室温で３０分反応させた。ＴＭＢ添加後、室温で３０分反応後、４Ｎ−硫酸で反応を止め、４５０−５４０ｎｍの吸光度を測定して実施例２と同様に固相化した抗原に対する力価を検出した。その結果、いずれも抗原濃度依存性の反応を示し、使用可能な力価であることを確認した（図２）。
実施例４ サンドイッチＥＬＩＳＡ系の確立
実施例２で得られたモノクローナル抗体、及び実施例３で得られたポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡ系を作製した。
モノクローナル抗体、１Ｃ３を１μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ／ｗｅｌｌマイクロプレートに添加して４℃で２４時間インキュベートし、固相化した。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５（ＴＢＳＴ）２００μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した。次に、２５％ブロックエース２００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、４℃で２４時間インキュベートしてブロッキングを行った。
ステップワイズ法（Ｓｔｅｐｗｉｓｅ ｍｅｔｈｏｄ）として、ＴＢＳＴ２００μｌ／ｗｅｌｌでウェルを３回洗浄後、ｈＥＰＲを１ｎｇ／ｍｌより２倍系列で希釈して添加後、室温で２時間反応させ、次にビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（１μｇ／ｍｌ；１００μｌ／ｗｅｌｌ）を添加し、室温で２時間反応させた。
また、同時添加法（Ｓａｍｅ ｔｉｍｅ ｍｅｔｈｏｄ）として、抗原のｈＥＰＲとビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂを同時添加し、室温で２時間反応させた。
ＴＢＳＴでウェルを５回洗浄後、アビジン−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１０００倍希釈液１００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、室温で３０分反応させた後、４Ｎ−硫酸で反応を止め、４５０／５４０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、同時添加法とステップワイズ法で検出感度に差がなく、いずれも感度が生体内存在量を測定するのに十分な感度（２５ｐｇ／ｍｌ）であった（図３）。一次抗体として３Ｅ８を用いて同様な試験を行った場合も同様な結果を得た。
実施例５ サンドイッチＥＬＩＳＡ系の特異性
実施例４に示した方法（同時添加法）で本システムの特異性を確認した。
一次抗体として１Ｃ３ ＭｏＡｂ（１μｇ／ｍｌ，１００μｌ／ｗｅｌｌ）を固相化させ、２５％ブロックエース（２００μｌ／ｗｅｌｌ）でブロッキング後、ＥＰＲの属するＥＧＦファミリーメンバーの分子群（６種類；表皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−α；ＴＧＦ−α）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ＥＧＦ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ；ＨＢ−ＥＧＦ），ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ；ＢＴＣ），アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ；ＡＲ），ヘレグリン−α（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ−α；ＨＲＧ−α）：いずれもＲ＆Ｄ社、またはＳｉｇｍａ社より購入）、マウス型ＥＰＲ（ヒト型ＥＰＲと同様に製造）、またはヒト型ＥＰＲをそれぞれ横軸に表示された量で抗原としてビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ｗｅｌｌ；ｆｉｎａｌ１μｇ／ｍｌ）と共に添加した。ＥＧＦファミリーメンバー６種類とマウス型ＥＰＲは最高濃度２００ｎｇ／ｍｌから４段階の５倍希釈系列で添加した（１００μｌ／ｗｅｌｌ）。ヒト型ＥＰＲは最高濃度２００ｐｇ／ｍｌから同様に４段階５倍希釈系列で添加した。次いで、ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰと反応させた後、ＴＭＢを用いて発色させた。
その結果、図４に示すように、ｈＥＰＲは高感度に検出したが、他の分子、すなわちＥＧＦファミリー分子及びマウス型ＥＰＲは１０００倍高い濃度でも全分子ともに検出せず、本サンドイッチＥＬＩＳＡ系の特異性が確認できた。一次抗体として３Ｅ８を用いて同様な試験を行った場合も同様な結果を得た。
実施例６ ヒト血清中のヒト型ＥＰＲのウェスタンブロット解析
ヒト血清（Ｒｏｃｋｌａｎｄ ＩＮＣ．）を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて１０倍に希釈した。この希釈血清にリコンビナントｈＥＰＲを添加し、最終濃度がｌａｎｅ１：０ｐｇ／ｍｌ，ｌａｎｅ２：８ｐｇ／ｍｌ、ｌａｎｅ３：４０ｐｇ／ｍｌ、ｌａｎｅ４：２００ｐｇ／ｍｌ、ｌａｎｅ５：１０００ｐｇ／ｍｌになるように５倍系列で希釈して試料を作製した。こうして得られた試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を用いて電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（第一化学）に転写した後、ｈＥＰＲを認識する各抗体、抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ、ＭｏＡｂ１Ｃ３、及び３Ｅ８（１μｇ／ｍｌ）を用いてイムノブロッティング法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，７４９５−７５００）により解析した結果、各抗体ともに特異的に３．７〜８．２キロダルトン（ｋＤａ）の位置にｈＥＰＲを検出した（図５）。尚、ＰｏＡｂと１Ｃ３ＭｏＡｂにおいて約２８ｋＤａにバンドが認められたが、抗原（−）のレーンでも検出されていることから非特異的検出バンドと考えられた。
実施例７ ヒト血清中ヒト型ＥＰＲのＥＬＩＳＡ法による検出
モノクローナル抗体、１Ｃ３或いは３Ｅ８を１μｇ／ｍｌ濃度で１００μｌ／ｗｅｌｌマイクロプレートに添加し、４℃で２４時間インキュベートして固着した。プレートを０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５（ＴＢＳＴ）２００μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄した後、２５％ブロックエースを２００μｌ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で２４時間インキュベートしブロッキングを行った。ＴＢＳＴ ２００μｌ／ｗｅｌｌで３回洗浄後、２倍希釈ヒト血清を用いてｈＥＰＲを最高濃度４００ｐｇ／ｍｌより２倍系列で希釈し、５０μｌ／ｗｅｌｌで添加した。同時にビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（２μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで添加し、室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴで５回洗浄後、Ａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）１０００倍希釈液１００μｌ／ｗｅｌｌを添加し、室温で３０分反応させた後、４Ｎ−硫酸で反応を止め、ＴＭＢを用いて発色させて４５０／５４０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、図６に示すように、１Ｃ３及び３Ｅ８のいずれも２５ｐｇ／ｍｌ濃度のｈＥＰＲを十分検出可能であった。
実施例８ 培養ヒト癌細胞の産生するＥＰＲの検出
マウス（ＩＣ３８、ＲＡＷ２６４．７、ＮＩＨ３Ｔ３クローンＴ７、ＭｏＡｂ−３）及びヒト（Ｔ−２４、Ａ−５４９、ＨＣＴ１１６、ｃｏｌｏ２０５、ｃｏｌｏ２０１、ＨｅＬａ、ＮＢ６９、Ａ４３１、ＳＫ−ＢＲ−３、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＫＢ、ＴＲ−１３）由来の各種培養細胞を、１０６個／１０ｍｌ／ｄｉｓｈで３日間、１０％牛胎児血清存在下培養した培養液を用いて、Ｓ−ＥＬＩＳＡによるｈＥＰＲの検出を行った。
１Ｃ３ ＭｏＡｂ（１μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／ｗｅｌｌで固相化させ、ブロッキング後、各種細胞培養液５０μｌ／ｗｅｌｌとビオチン化抗ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ（２μｇ／ｍｌ）を５０μｌ／ｗｅｌｌで同時添加し、室温で２時間インキュベートした。以降の操作は実施例４と同様に行った。尚、対照のためにｈＥＰＲを添加した、またはしていない血清（１０％ＦＢＳ、ヒト血清、０．１％ＢＳＡ（ｈＥＰＲ １ｎｇ／ｍｌ）、ヒト血清（ＥＰＲ １ｎｇ／ｍｌ））で同様の操作を行った。
その結果、マウス型ＥＰＲ産生細胞ＮＩＨ３Ｔ３クローンＴ７をはじめ、マウス細胞の培養液ではＡ４５０ｎｍの吸収は認められなかったのに対し、ヒト型癌細胞ではＡ−５４９（ヒト肺癌細胞）、ＨＣＴ１１６（ヒト大腸癌）、ｃｏｌｏ２０１（ヒト大腸癌）、ｃｏｌｏ２０５（ヒト大腸癌）、Ｔ−２４（ヒト膀胱癌）においていずれも高いｈＥＰＲの産生が確認され（図７）、培養液中のｈＥＰＲを特異的に検出できることが確認された。尚、ＨｅＬａ（ヒト子宮頸癌）、ＮＢ６９（ヒト神経芽細胞腫）、ＫＢ（ヒト表皮癌（口腔））、Ａ４３１（ヒト表皮癌（表皮））、ＳＫ−ＢＲ−３（ヒト乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ヒト乳癌）、ＴＲ−１３（ヒト腎癌）のヒト癌細胞の培養液では検出できなかった。
【産業上の利用の可能性】
本発明により、ヒト血液中、組織中等の生体内に存在するｈＥＰＲを特異的かつ高感度に検出するシステムの提供が可能となり、ｈＥＰＲを発現する腫瘍細胞の存在を検出する癌診断等に有用である。更に、本発明の方法を用い、ｈＥＰＲの発現の有無、更にはｈＥＰＲの発現と腫瘍発生とのメカニズムとの関連性等についての解明にも寄与することが期待される。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト型エピレグリン（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ｈＥＰＲ）を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４７である、請求項１に記載のハイブリドーマ。
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４８である、請求項１に記載のハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項２または３に記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを認識し、かつｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項４に記載のモノクローナル抗体とｈＥＰＲを認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いることを特徴とする、サンプル中のｈＥＰＲをｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に検出する方法。
【請求項７】
請求項４に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ｈＥＰＲを発現する細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項８】
ｈＥＰＲを発現する細胞がヒト腫瘍である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項４に記載のモノクローナル抗体を含む、ヒト腫瘍の検出のためのキット。
【請求項１】
ヒト型エピレグリン（ｈｕｍａｎ ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ；ｈＥＰＲ）を特異的に認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４７である、請求項１に記載のハイブリドーマ。
【請求項３】
受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６４８である、請求項１に記載のハイブリドーマ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項５】
請求項２または３に記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるエピトープを認識し、かつｈＥＰＲを特異的に認識するモノクローナル抗体。
【請求項６】
請求項４に記載のモノクローナル抗体とｈＥＰＲを認識するポリクローナル抗体（ｈＥＰＲ−ＰｏＡｂ）を用いることを特徴とする、サンプル中のｈＥＰＲをｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的に検出する方法。
【請求項７】
請求項４に記載のモノクローナル抗体を用いることを特徴とする、ｈＥＰＲを発現する細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法。
【請求項８】
ｈＥＰＲを発現する細胞がヒト腫瘍である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項４に記載のモノクローナル抗体を含む、ヒト腫瘍の検出のためのキット。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１０４７
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０３６２１（Ｐ２００５−５０３６２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３４２４
【国際出願日】平成１６年３月１５日（２００４．３．１５）
【出願人】（０００００２８１９）大正製薬株式会社 (437)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【発行日】平成１８年６月２９日（２００６．６．２９）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００３４２４
【国際出願日】平成１６年３月１５日（２００４．３．１５）
【出願人】（０００００２８１９）大正製薬株式会社 (437)
【Ｆターム（参考）】
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