モーレラ属細菌及びプライマー
【課題】宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を提供すること、及び、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を作出する際に利用可能なプライマーを提供すること。
【解決手段】相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊され、栄養要求性を示すことを特徴とするモーレラ属細菌、及び、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と隣接する領域を増幅する特定なプライマー。
【解決手段】相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊され、栄養要求性を示すことを特徴とするモーレラ属細菌、及び、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と隣接する領域を増幅する特定なプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はモーレラ属細菌の組換え体に関し、詳しくは相同性組み換えにより染色体上の遺伝子を欠失又は破壊して栄養要求性を付与したモーレラ属細菌及び栄養要求性株の作出に利用可能なプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
温暖化対策や、化石燃料の消費抑制のため、新たなエネルギーに関する研究が進められている。特に、エタノールは近年、燃料としての需要が高まっており、有用物としての価値が高い。
【０００３】
産業廃ガスや木質系バイオマスのガス化・改質にともなって排出されるガスに含まれる気体状の二酸化炭素や一酸化炭素、水素などを原料として、クロストリジウムなどの（好熱性）酢酸生成菌によって、酢酸やエタノールなどの有用物を生産させ回収する技術がある（例えば特許文献１）。
【０００４】
この技術は、サトウキビやトウモロコシといった食糧にもなりうる農作物を原料として用いるものではないので、食料価格への影響が無く、また、二酸化炭素を原料としているので温暖化ガスの削減効果も期待できる技術である。
【０００５】
モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ） ｓｐ．ＨＵＣ２２−１（クロストリジウム・エスピー
Ｎｏ．２２−１株(ＦＥＲＭ Ｐ−１８８５２)）は、特許文献１の技術に用いることが可能な、好熱性酢酸生産菌の菌株であり、４５〜６５℃、ｐＨ４．５〜７．５で生育可能、５５〜６０℃、ｐＨ５．７〜６．７で最も高い増殖を示し、エタノール生産性が高く、Ｈ2、エタノール、酢酸に対する耐性のバランスが良好である（非特許文献１）。また、非
特許文献２には、Ｈ2−ＣＯ2を基質とし、ｐＨ５．８一定制御の条件で反復回分培養を行ったところ、合計エタノール生産量は１５．４ｍｍｏｌ／（Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ）であったことが記載されている。
【特許文献１】特開２００３−３３９３７１号公報
【非特許文献１】酒井他「水素と二酸化炭素からエタノールを生産する好熱性細菌Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１」（Ethanol productionfrom H2 and CO2 by a newly isolated thermophilic bacterium, Moorella sp. HUC22-1）バイオテクノロジー レターズ、２００４、２６、１６０７−１６１２
【非特許文献２】酒井他「モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属菌を用いた反復回分培養における水素と二酸化炭素からの酢酸及びエタノールの生産」（Acetateand ethanol production from H2 and CO2 by Moorella sp. using a repeated batchculture.） ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング、２００５、９９、２５２−２５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
好熱性酢酸生産菌をエタノールの発酵生産に用いることは、酵母や中温性酢酸生産菌を用いる場合に比べて、（１）培養温度が高温（５０〜８０℃）であるため減圧蒸留によるエタノールの回収が容易になる、（２）好熱性菌の場合の加熱するコストの方が酵母などの場合の冷却するコストに比べて安い、（３）培養温度が高温であるため、自然条件に左右されにくく安定したオペレーションが可能になる、（４）培養が高温、無酸素の状態で行われるため、コンタミネーションの危険が非常に少ない、等の利点があるが、未だ研究段階であり、商業的な生産を実現するためには、微生物の生産効率を向上させることが必
要である。
【０００７】
本発明者らは、エタノール生産能力が優れた菌株を得るために、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１に対してＮＴＧなど化学物質による変異処理を行ったが継代後もエタノール高生産を維持する株は得られなかった。
【０００８】
そこで本発明者らは、標的とする遺伝子をピンポイントに導入、あるいは破壊できる、分子生物学的育種によるエタノール高生産株の作製を試みることにした。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉの様な一般的な菌の場合とは異なり、好熱性嫌気性細菌を宿主とした遺伝子導入法は報告例が少なく、特にモーレラ属の細菌を宿主とした遺伝子導入法はこれまで全く報告されていない。
【０００９】
まず、分子生物学的育種のひとつであるプラスミドベクターを用いた遺伝子導入を試みたが、この方法では形質転換が確認された株は得られなかった。
【００１０】
そこで、本発明者らは、相同性部位を探し出し、相同性組換え法による組換えを試み、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を作出することに成功した。
【００１１】
すなわち、本発明の課題は、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を提供することにある。
【００１２】
また、本発明の他の課題は、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を作出する際に利用可能なプライマーを提供することにある。
【００１３】
さらに、本発明の他の課題は以下の記載によって明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題は以下の発明によって解決される。
【００１５】
（請求項１)
相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失または破壊され、栄養要求性を示すことを特徴とするモーレラ属細菌。
【００１６】
（請求項２）
染色体上の遺伝子が、ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子であり、栄養要求性がウラシル要求性であることを特徴とする請求項１記載のモーレラ属細菌。
【００１７】
（請求項３）
染色体上の遺伝子が、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載のモーレラ属細菌。
【００１８】
（請求項４）
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．２２−１−Ｕ（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−６０６）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている請求項１〜３の何れかに記載のモーレラ属細菌。
【００１９】
（請求項５）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊された栄養要求性株を作出する際に用いるプライマーであって、オロチン酸ホスホリボシルト
ランスフェラーゼをコードする遺伝子と隣接する領域を増幅する配列番号１及び／又は配列番号２で示されるプライマー。
【００２０】
（請求項６）
請求項５のプライマーにより増幅された配列を鋳型として、隣接領域のみを増幅する配列番号５及び／又は配列番号６で示されるプライマー。
【００２１】
（請求項７）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊された栄養要求性株を作出する際に用いるプライマーであって、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の欠失又は破壊を確認する配列番号９及び／又は配列番号１０で示されるプライマー。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を提供することができる。
【００２３】
また、本発明によれば、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を作出する際に利用可能なプライマーを提供することができる。
【００２４】
すなわち、本発明のモーレラ属細菌は、相同性部位と、欠失又は破壊された遺伝子がわかっている栄養要求性株である。
【００２５】
本発明のモーレラ属細菌を宿主細胞として、相同性部位の間に欠失又は破壊された遺伝子、有用遺伝子をもつプラスミドを作製して更に相同性組換えを行うことで、優れた菌株を作出することができる。
【００２６】
例えば、有用遺伝子が、エタノール生産に関与する遺伝子であれば、エタノール生産性が高い菌株を作出するために宿主細胞として使用することができる。有用遺伝子を目的に沿って選ぶことにより、宿主細胞として広い用途に使うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００２８】
染色体上の遺伝子の欠失または破壊には、相同性組換えの技術を用いる。
【００２９】
相同性組換えは、１対の２本鎖ＤＮＡの相同的な塩基配列を持つ部分に起こる組換えであり、人工的にゲノム上の特定遺伝子を変化させる手段の１つである。ゲノム上の特定の塩基配列と相同性を持つＤＮＡを細胞に導入すると、この相同部分で組換えを起こし、外来のＤＮＡがゲノムに取り込まれる。これを利用して特定の遺伝子を破壊したり別の遺伝子と置き換えたりすることが可能となる。
【００３０】
また、ゲノムＤＮＡへの相同性組換えによる遺伝子導入には、プラスミドベクターを用いた方法に比べて、導入した遺伝子を多コピーで持たせることが困難という問題点はあるものの、プラスミドの脱落を防ぐために常に培地に抗生物質を添加する等、選択圧をかけ続ける必要性が無く、形質が安定しているという利点もある。
【００３１】
相同性組換え（ダブルクロスオーバー）による遺伝子の破壊には、遺伝子に隣接した上流、下流領域（遺伝子のタンパク質コード領域の一部を含んでも良い）をクローン化し、クローン化した隣接上流、下流領域からなるプラスミド（ベクター）を作り、このプラス
ミドで宿主細胞を形質転換することによって行う。隣接配列は、対応する目的細胞ゲノムの配列に対し、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは９８％、またさらにより好ましくは９９％相同性を有する。このプラスミドには、遺伝子の全タンパク質コード領域を含んではならないが、標的遺伝子のタンパク質コード領域の一部分を含んでも構わない。この隣接領域は、少なくとも１００塩基対であり、理論的には隣接配列の長さに上限はないが、４０００塩基対までが好ましく、より好ましい隣接領域は、５００塩基対から１２００塩基対までの長さである。
【００３２】
遺伝子の欠失又は破壊によって付与される栄養要求性株の具体的な種類は特に限定されるものではなく、例えば、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求性株；ウラシル、アデニン等の核酸塩基要求性株；ビタミン要求性株；等を挙げることができるが、このうちでもウラシル要求性を付与することが、下記の理由で望ましい。
【００３３】
ウラシル要求性は、ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を破壊することで得ることができる。
【００３４】
ピリミジン塩基（チミン、シトシン、ウラシル）の生合成経路は細菌から菌類、植物、動物に至るまで共通の酵素系によって構成されており、極一部の病原菌を除くすべての生物にとって必須の経路である。この経路はすべてのピリミジン塩基の前駆体であるＵＭＰ（ウリジン一リン酸）に至る６つの酵素反応から成ることが分かっている。６つの酵素（及びそれをコードする遺伝子）と、Ｅ．ｃｏｌｉ及びSalmonella typhimuriumにおけるピリミジン塩基の生合成経路を図１に示す。これらの酵素をコードする遺伝子を破壊された株はＵＭＰを生合成出来なくなるために、ウラシル要求性株となる。
【００３５】
これらのうち、ｐｙｒＥ（オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子）もしくはｐｙｒＦ（オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子）を破壊された株については、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）によるポジティブセレクションが可能であることが分かっている。５−ＦＯＡは、遺伝子破壊が無い株ではオロチン酸（orotate）の代わりにピリミジン経路に取り込まれ、最終的にＲＮＡに
取り込まれて正常なＲＮＡの合成を阻害し、菌体を死滅させるが、ｐｙｒＥ破壊株及びｐｙｒＦ破壊株では代謝されることがないために菌体は生存できる。このことを利用すると、５−ＦＯＡと十分な量のウラシルを含む培地を用いることで、前述の相同性組換えによってｐｙｒＥもしくはｐｙｒＦの破壊株を選択、単離することが可能となる。このｐｙｒＥもしくはｐｙｒＦを選択マーカーに用いれば、選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を導入する方法に比べ、菌が元々持っていた遺伝子なので、確実に発現させることができると考えられる。このため、ウラシル要求性の付与には、ｐｙｒＥ或いはｐｙｒＦ遺伝子を破壊させることが好ましい。
【００３６】
モーレラ属細菌において、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｐｙｒＥ）を相同性組換えにより欠失または破壊するには、（１）まずｐｙｒＥと、その上流及び下流の隣接領域をクローニングしてプラスミドに組み込み、（２）さらにそのプラスミドからｐｙｒＥ部分を除いたプラスミドを作製することが必要である。
【００３７】
上記（１）のクローニングには配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いることができる。なお、配列番号１はフォワード、配列番号２はリバースのプライマーである。配列番号１及び２は、ｐｙｒＥ遺伝子と、ｐｙｒＥ遺伝子の上流および下流に隣接する約１０００ｂｐを増幅することができる。
【００３８】
上記（１）で増幅した領域からｐｙｒＥ遺伝子部分のみを除くために配列番号５及び／
又は配列番号６のプライマーを用いることができる。なお、配列番号５はフォワード、配列番号６はリバースのプライマーである。配列番号５は、上記（１）でクローニングした配列のうちｐｙｒＥ遺伝子のＯＲＦまで、配列番号６はｐｙｒＥ遺伝子ＯＲＦの終了部分から下流隣接領域の末端までを増幅するため、上記（１）で増幅した領域を鋳型として配列番号５、６のプライマーを用いてＰＣＲを行うと、ｐｙｒＥ遺伝子を除いた領域のみが増幅される。
【００３９】
配列番号９および１０のプライマーは、作出した細胞からｐｙｒＥが欠失又は破壊されているかを確認する時に使用することができる。
【００４０】
本発明のプライマーは、Moorella thermoacetia、M．thermoautotrophica、M．glycerini等のモーレラ属細菌、エタノール生産効率が高い菌株の作出のためには、好ましくは水素と二酸化炭素、又は一酸化炭素の合成ガスからエタノールを生産する能力を有するモーレラ属細菌、より好ましくはＭｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、相同性組換えにより欠失又は破壊する際に利用可能なプライマーである。
【００４１】
本発明のモーレラ属細菌は、Moorella thermoacetia、M．thermoautotrophica、M．glycerini等のモーレラ属細菌に栄養要求性を付与したものであり、エタノール生産効率が高い菌株の作出の上では、その中でも水素と二酸化炭素、又は一酸化炭素の合成ガスからエタノールを生産する能力を有するモーレラ属細菌に栄養要求性を付与したものであり、更にはＭｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１に栄養要求性を付与したものが好ましい。
【００４２】
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１のｐｙｒＥ遺伝子を相同性組換えによって破壊しウラシル要求性を付与した菌株は、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．２２−１−Ｕ（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−６０６）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００４３】
培養的な性質は、以下の通りである。
【００４４】
改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ 寒天培地（※１）において、嫌気的、５５℃、培養日数３〜５日で直径１〜２ｍｍの円形コロニーを形成する。
ｉ）色： 白
ｉｉ）表面の形状：スムーズ
ｉｉｉ）透明度：不透明
【００４５】
※１ 改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ 寒天培地
ＮＨ４Ｃｌ １．０ｇ
ＫＣｌ ０．１ｇ
ＭｇＳＯ４ ０．２ｇ
ＮａＣｌ ０．８ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ
ＣａＣｌ２ ０．０２ｇ
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １．０ｇ
（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ無添加の場合 Ｕｒａｃｉｌ ０．０１ｇ）
ＮａＨＣＯ３ ２．０ｇ
Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ ０．３ｇ
Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉ） １０ｍｌ
Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＩＩ） １０ｍｌ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
（Ａｇａｒ（高温用） ２０ｇ）
（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ５．０ｇ）
ｐＨ ５．９（滅菌前）
滅菌温度・時間 １２１℃ １５分
【００４６】
なお、上記の（Ｉ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ及び（ＩＩ） Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎは以下の組成である。
【００４７】
（Ｉ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ２．０ｇ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １．０ｇ
Ｆｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ ０．８ｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＳｅＯ４ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＷＯ４ ０．０２ｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
【００４８】
（ＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｂｉｏｔｉｎ ２．０ｍｇ
Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ２．０ｍｇ
Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ １０ｍｇ
Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ ５．０ｍｇ
Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ ５．０ｍｇ
Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｄ−Ｃａ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ ５．０ｍｇ
Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ０．１ｍｇ
ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｔｈｉｏｃｔｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
【００４９】
この菌株は、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子が欠失しているため、ウラシル要求性を有する。
【００５０】
また、フルクトースから酢酸及びエタノールを生成する。二酸化炭素と水素、または一酸化炭素と二酸化炭素から、酢酸及びエタノールを生成する。
【００５１】
この菌株は、相同性部位と、破壊遺伝子がわかっているので、例えばエタノール生産性の向上に寄与する遺伝子のような有用遺伝子を導入してエタノール生産能力が優れた菌株の作出を試みる際に、本発明のモーレラ属細菌を宿主細胞として利用することができる。
【００５２】
すなわち、２つの相同性部位の間にｐｙｒＥ遺伝子及び導入したい遺伝子（有用遺伝子）を入れたベクターを作製し、再組換えすることで目的遺伝子の導入と、ウラシル生合成能の復活による選抜を行って、更なる組換え細胞を得ることができる。
【実施例】
【００５３】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。
【００５４】
なお、以下必要に応じてウラシル要求性を付与したＭｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．菌株は、ｐｙｒＥ破壊株と称し、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１株は、ＨＵＣ２２−１あるいは野生株と称することがある。
【００５５】
実施例１
１．Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１株からのゲノムＤＮＡの抽出
グラム陽性菌であるＭｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１からのゲノムＤＮＡの抽出には、Marmur法（参考文献１）を改変した以下の方法を用いた。
【００５６】
フルクトースを基質として定常期まで培養した培養液２０ｍｌを3,000rpm、１５分間遠心して集菌し、上清を除去した。得られた菌体に１．５ｍｌのＴＥｂｕｆｆｅｒ（10 mM Tris, 1 mM EDTA-2Na）と５ｍｇのリゾチーム（粉末）を加えて懸濁し、３７℃で３０分間ゆっくりと振とうした。その後、２．５ｍｌの溶菌液[100 mM Tris-HCl (pH 8.0),300 mM NaCl, 20 mM EDTA-2Na, 2%SDS, 100 μg／ml Proteinase K]を加えて混合させ、５５℃で６０分間静置し、菌体を溶解させた。菌体溶解液に１．２５ｍｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）混液を加えて室温で１０分間振盪して完全に混合させたのち、11,000rpm、５分間遠心して３層に分離し、上層を新しいチューブに移した。この操作を計２回繰り返し、タンパクを除去した。得られた溶液量の１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液(ｐＨ５．２)と２．５倍量のエタノールを加えて静かに混合させ、室温で１０分間静置したのち、11,000rpm、１５分間遠心して上清を除去し、ＤＮＡを沈殿させた。その後、７５％エタノールを５ｍｌ加えて11,000 rpm、５分間遠心して上清を除去し、ＤＮＡをリンスした。最後に、11,000rpm、３０秒間遠心して余分なエタノールを完全に除去し、２００μｌの超純水に溶解させ、−２０℃に保存した。得られたゲノムＤＮＡは、超純水で１０倍に希釈し、分光光度計（Ultrospec3000, Pharmacia Biotech）のＤＮＡ定量モードで濃度と純度を確認した。
【００５７】
２．M. thermoacetica ATCC 39073株のゲノムデータベースからのｐｙｒＥの検索
Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている、ＨＵＣ２２−１株の近縁種であるM. thermoacetica
ATCC 39073株のゲノムデータベース（accession number: CP000232）から、ＢＬＡＳＴ
検索を用いてｐｙｒＥと思われる遺伝子の検索を行った。
【００５８】
３．ＨＵＣ２２−１株ゲノム由来のｐｙｒＥのクローニング
上記１で得られたＨＵＣ２２−１株のゲノムＤＮＡを鋳型に、Premix TaqTM（TaKaRa Ex TaqTMVersion）を用いてＰＣＲを行い、上記２で見つかったｐｙｒＥと思われる遺伝子を、ＯＲＦの前後約1,000 bpずつを含めて増幅した。ＰＣＲ反応液組成と反応条件を表１に、用いたプライマーの配列を表２に示す。反応終了後、各ＰＣＲ産物を０．７％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００５９】
その結果、ｐｙｒＥについて予想されたサイズの単一バンドが確認された。
【００６０】
次に、pGEM(商標)−T Easy Vector Systemを用いたＴＡクローニングによってpGEM(商
標)−T Easy vectorに組み込み、E. coli DH5aにヒートショック法で導入し、形質転換させた。100 μg／ml ampicillin、0.1mM IPTG、及び40 μg／ml X-galを含むＬＢプレートで一晩培養し、Blue/White selectionによって目的遺伝子がクローニングされたプラスミドを持つコロニーを選択した。選択した各コロニーをそれぞれ100μg／ml ampicillinを含む２ｍｌのＬＢ培地に植菌し、さらに一晩振とう培養した後、Quantum Prep(商標) Plasmid Miniprep Kitを用いてプラスミドを回収した。回収された各プラスミドは、適当な制限酵素で切断された後、０．７％アガロースゲル電気泳動で目的の断片がクローニングされていることが確認された。確認された各プラスミドにクローニングされた断片の配列決定は、広島大学 自然科学研究支援開発センター 遺伝子実験部門のＤＮＡ塩基配列
決定サービスに依頼した。まず、Ｍ１３フォワードプライマーとＭ１３リバースプライマーを用いて両端から配列を決定し、さらに内側の配列については、表３に示すプライマーを用いて決定した。
【００６１】
その結果、M. thermoacetica ATCC 39073株のゲノムデータベースに示されている配列
と９９％以上の相同性を持つことが確認された。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
【表３】
【００６５】
４．ｐｙｒＥ破壊用プラスミドｐＧＤＰｙｒＥの構築
Satoらの方法（参考文献２）に従い、相同性組換え（ダブルクロスオーバー）によるｐｙｒＥの破壊（図２）を行うためのプラスミドを構築した。構築の概略を図３に示す。上記３で得られたプラスミドｐＧＥＭＰｙｒＥを鋳型にPremix TaqTM（TaKaRaEx TaqTM Version）を用いてアダプターＰＣＲを行い、プラスミド上のｐｙｒＥのＯＲＦを除いた部分を増幅するとともに、その両末端にＢａｍＨＩサイトを付与した。ＰＣＲ反応液組成と反応条件を表４に、用いたプライマーの配列を表５に示す。得られたＰＣＲ産物を０．７％アガロースゲル電気泳動で確認した後、制限酵素ＢａｍＨＩで一晩反応させて切断し、MagExtractor(商標)−PCR ＆ Gel Clean Upを用いて精製した。その後、DNA Ligation Kit Ver. 2を用いてライゲーションさせ、ｐｙｒＥ破壊用プラスミドｐＧＤＰｙｒＥ（図３）を構築した。
【００６６】
【表４】
【００６７】
【表５】
【００６８】
５．ｐｙｒＥ破壊用プラスミドｐＧＤＰｙｒＥ２の構築
ダブルクロスオーバーを起こすための相同性領域をより短くしても形質転換が行えるのかを確認するために、上記４で構築したｐＧＤＰｙｒＥから、ＰＣＲにより前後の相同性領域が５００ｂｐずつになるように断片を取り出し、pGEM(商標)−TEasy vectorに再クローニングしたプラスミドｐＧＤＰｙｒＥ２（図３）を構築した（クローニングの方法は上記３と同様）。ＰＣＲ反応液組成と反応条件を表６に、用いたプライマーの配列を表７に示す。
【００６９】
【表６】
【００７０】
【表７】
【００７１】
６．相同性組換えによるＨＵＣ２２−１株ゲノム上のｐｙｒＥの破壊
ＨＵＣ２２−１株に対する遺伝子導入には、エレクトロポレーション法を用いた。Satoらの方法（参考文献２）を参考に、以下の手順で行った。
【００７２】
使用する培地、バッファーはすべて嫌気的、無菌的に調製したものを用い、また操作はすべて二酸化炭素ガスを吹き付けながら嫌気的に行った。フルクトースを基質に対数増殖後期（濁度、波長６６０ｎｍ、ＯＤ660＝１．５〜２．０）まで培養した本菌の培養液２０ｍｌを6,000 rpm、４℃で５分間遠心して上清を除去し、菌体を回収した。菌体を５ｍｌの２７２ｍＭ スクロース溶液に再懸濁し、6,000 rpm、４℃で５分間遠心して洗浄し、上清を除去した。この洗浄を計２回繰り返した後、菌体を１ｍｌの２７２ｍＭスクロース溶液に再懸濁した。菌体に導入するＤＮＡ（ｐＧＤＰｙｒＥもしくはｐＧＤＰｙｒＥ２）５〜１０μｇを含む溶液を添加して混合した。ネガティブコントロールの場合はＤＮＡ溶液の代わりに超純水を同じ量添加した。氷中で１０分間静置した後、予め氷中で冷却しておいた２ｍｍギャップのエレクトロポレーション用キュベット（ELECTROPORATIONCUVETTES PLUSTM, BTX）に１００μｌを移し、エレクトロポレーション装置（ECM 630, BTX）にセットして、2.0 kV（10.0 kV／cm）、400Ω、50 μＦの条件でパルスを１回かけた。パルスをかけ終わった溶液を、注射針（ニプロ）を取り付けたプラスチック注射器（テルモ）を用いて回収し、８ｍｌ容量のバイアル瓶に入った２ｍｌのフルクトース培地（１０μg／ｍｌのウラシルを含む）に加えた。氷中で１０分間静置した後、５５℃で１０時間前培養を行った。
【００７３】
選択物質である０．２％（ｗ／ｖ）の５−ＦＯＡと１０μｇ／ｍｌのウラシルと２％（ｗ／ｖ）の高温培養用寒天（ナカライテスク）を含むフルクトース培地に前培養液全量を加えてロールチューブを作製した。ただし、ポジティブコントロールに対しては５−ＦＯＡを加えなかった。作製したロールチューブを５５℃に静置し４〜７日間培養した後、得られたコロニーを滅菌したパスツールピペットを用いて嫌気的に採取し、０．２％（ｗ／ｖ）の５−ＦＯＡと１０μｇ／ｍｌのウラシルを含むフルクトース液体培地へ植え継いだ。
【００７４】
２回の植え継ぎの後、一部をウラシルも酵母エキスも含まない完全合成培地へ植え継いだところ、野生株は問題なく増殖できたのに対し、これらの株は全く増殖できなかった。
【００７５】
また、この完全合成培地に１０μｇ／ｍｌのウラシルのみを添加すると、これらの株は増殖できるようになった。これらのことから、これらの株がウラシル要求性株に形質転換していることが確認された（ｐｙｒＥ破壊株）。
【００７６】
形質転換の効率は、ｐＧＤＰｙｒＥを用いた場合ＤＮＡ１μｇ当たり約３５個、ｐＧＤＰｙｒＥ２を用いた場合には、ＤＮＡ１μｇ当たり約８個であった。
【００７７】
７．ＰＣＲによるｐｙｒＥの破壊の確認
野生株とｐｙｒＥ破壊株のゲノムＤＮＡを鋳型にPremix TaqTM（TaKaRa Ex TaqTM Version）を用いてPCRを行い、ｐｙｒＥの破壊の確認を行った。ＰＣＲ反応液組成と反応条件を表８に、各遺伝子に対して用いたプライマーの配列を表９に示す。反応終了後、各ＰＣＲ産物のサイズを０．７％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００７８】
その結果、野生株で見られるバンド（約2,600 bp）が無くなっていることが確認できた。
【００７９】
また、ｐｙｒＥ破壊株ではｐｙｒＥの上流は少なくとも約８ｋｂｐ、下流は少なくとも２ｋｂｐの長さにわたって配列が失われている可能性が高いことがわかった。
【００８０】
【表８】
【００８１】
【表９】
【００８２】
[参考文献]
（１）Marmur, J.: A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid frommicro-organisms. J. Mol. Biol. 1961; 3: 208-18
（２）Sato, T., Fukui, T., Atomi, H., and Imanaka, T.: Improved and versatiletransformation system allowing multiple genetic manipulations of thehyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ.Microbiol. 2005; 71: 3889-99
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ピリミジン塩基の生合成経路
【図２】相同性組換え（ダブルクロスオーバー）によるｐｙｒＥの破壊
【図３】ｐｙｒＥ破壊用プラスミドｐＧＤＰｙｒＥ及びｐＧＤＰｙｒＥ２の構築
【技術分野】
【０００１】
本発明はモーレラ属細菌の組換え体に関し、詳しくは相同性組み換えにより染色体上の遺伝子を欠失又は破壊して栄養要求性を付与したモーレラ属細菌及び栄養要求性株の作出に利用可能なプライマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
温暖化対策や、化石燃料の消費抑制のため、新たなエネルギーに関する研究が進められている。特に、エタノールは近年、燃料としての需要が高まっており、有用物としての価値が高い。
【０００３】
産業廃ガスや木質系バイオマスのガス化・改質にともなって排出されるガスに含まれる気体状の二酸化炭素や一酸化炭素、水素などを原料として、クロストリジウムなどの（好熱性）酢酸生成菌によって、酢酸やエタノールなどの有用物を生産させ回収する技術がある（例えば特許文献１）。
【０００４】
この技術は、サトウキビやトウモロコシといった食糧にもなりうる農作物を原料として用いるものではないので、食料価格への影響が無く、また、二酸化炭素を原料としているので温暖化ガスの削減効果も期待できる技術である。
【０００５】
モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ） ｓｐ．ＨＵＣ２２−１（クロストリジウム・エスピー
Ｎｏ．２２−１株(ＦＥＲＭ Ｐ−１８８５２)）は、特許文献１の技術に用いることが可能な、好熱性酢酸生産菌の菌株であり、４５〜６５℃、ｐＨ４．５〜７．５で生育可能、５５〜６０℃、ｐＨ５．７〜６．７で最も高い増殖を示し、エタノール生産性が高く、Ｈ2、エタノール、酢酸に対する耐性のバランスが良好である（非特許文献１）。また、非
特許文献２には、Ｈ2−ＣＯ2を基質とし、ｐＨ５．８一定制御の条件で反復回分培養を行ったところ、合計エタノール生産量は１５．４ｍｍｏｌ／（Ｌ−ｒｅａｃｔｏｒ）であったことが記載されている。
【特許文献１】特開２００３−３３９３７１号公報
【非特許文献１】酒井他「水素と二酸化炭素からエタノールを生産する好熱性細菌Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１」（Ethanol productionfrom H2 and CO2 by a newly isolated thermophilic bacterium, Moorella sp. HUC22-1）バイオテクノロジー レターズ、２００４、２６、１６０７−１６１２
【非特許文献２】酒井他「モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属菌を用いた反復回分培養における水素と二酸化炭素からの酢酸及びエタノールの生産」（Acetateand ethanol production from H2 and CO2 by Moorella sp. using a repeated batchculture.） ジャーナル オブ バイオサイエンス アンド バイオエンジニアリング、２００５、９９、２５２−２５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
好熱性酢酸生産菌をエタノールの発酵生産に用いることは、酵母や中温性酢酸生産菌を用いる場合に比べて、（１）培養温度が高温（５０〜８０℃）であるため減圧蒸留によるエタノールの回収が容易になる、（２）好熱性菌の場合の加熱するコストの方が酵母などの場合の冷却するコストに比べて安い、（３）培養温度が高温であるため、自然条件に左右されにくく安定したオペレーションが可能になる、（４）培養が高温、無酸素の状態で行われるため、コンタミネーションの危険が非常に少ない、等の利点があるが、未だ研究段階であり、商業的な生産を実現するためには、微生物の生産効率を向上させることが必
要である。
【０００７】
本発明者らは、エタノール生産能力が優れた菌株を得るために、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１に対してＮＴＧなど化学物質による変異処理を行ったが継代後もエタノール高生産を維持する株は得られなかった。
【０００８】
そこで本発明者らは、標的とする遺伝子をピンポイントに導入、あるいは破壊できる、分子生物学的育種によるエタノール高生産株の作製を試みることにした。しかしながら、Ｅ．ｃｏｌｉの様な一般的な菌の場合とは異なり、好熱性嫌気性細菌を宿主とした遺伝子導入法は報告例が少なく、特にモーレラ属の細菌を宿主とした遺伝子導入法はこれまで全く報告されていない。
【０００９】
まず、分子生物学的育種のひとつであるプラスミドベクターを用いた遺伝子導入を試みたが、この方法では形質転換が確認された株は得られなかった。
【００１０】
そこで、本発明者らは、相同性部位を探し出し、相同性組換え法による組換えを試み、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を作出することに成功した。
【００１１】
すなわち、本発明の課題は、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を提供することにある。
【００１２】
また、本発明の他の課題は、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を作出する際に利用可能なプライマーを提供することにある。
【００１３】
さらに、本発明の他の課題は以下の記載によって明らかになる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
上記課題は以下の発明によって解決される。
【００１５】
（請求項１)
相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失または破壊され、栄養要求性を示すことを特徴とするモーレラ属細菌。
【００１６】
（請求項２）
染色体上の遺伝子が、ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子であり、栄養要求性がウラシル要求性であることを特徴とする請求項１記載のモーレラ属細菌。
【００１７】
（請求項３）
染色体上の遺伝子が、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載のモーレラ属細菌。
【００１８】
（請求項４）
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．２２−１−Ｕ（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−６０６）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている請求項１〜３の何れかに記載のモーレラ属細菌。
【００１９】
（請求項５）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊された栄養要求性株を作出する際に用いるプライマーであって、オロチン酸ホスホリボシルト
ランスフェラーゼをコードする遺伝子と隣接する領域を増幅する配列番号１及び／又は配列番号２で示されるプライマー。
【００２０】
（請求項６）
請求項５のプライマーにより増幅された配列を鋳型として、隣接領域のみを増幅する配列番号５及び／又は配列番号６で示されるプライマー。
【００２１】
（請求項７）
モーレラ属細菌において、相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊された栄養要求性株を作出する際に用いるプライマーであって、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の欠失又は破壊を確認する配列番号９及び／又は配列番号１０で示されるプライマー。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を提供することができる。
【００２３】
また、本発明によれば、宿主細胞として広い用途に使うことが可能なモーレラ属細菌を作出する際に利用可能なプライマーを提供することができる。
【００２４】
すなわち、本発明のモーレラ属細菌は、相同性部位と、欠失又は破壊された遺伝子がわかっている栄養要求性株である。
【００２５】
本発明のモーレラ属細菌を宿主細胞として、相同性部位の間に欠失又は破壊された遺伝子、有用遺伝子をもつプラスミドを作製して更に相同性組換えを行うことで、優れた菌株を作出することができる。
【００２６】
例えば、有用遺伝子が、エタノール生産に関与する遺伝子であれば、エタノール生産性が高い菌株を作出するために宿主細胞として使用することができる。有用遺伝子を目的に沿って選ぶことにより、宿主細胞として広い用途に使うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
【００２８】
染色体上の遺伝子の欠失または破壊には、相同性組換えの技術を用いる。
【００２９】
相同性組換えは、１対の２本鎖ＤＮＡの相同的な塩基配列を持つ部分に起こる組換えであり、人工的にゲノム上の特定遺伝子を変化させる手段の１つである。ゲノム上の特定の塩基配列と相同性を持つＤＮＡを細胞に導入すると、この相同部分で組換えを起こし、外来のＤＮＡがゲノムに取り込まれる。これを利用して特定の遺伝子を破壊したり別の遺伝子と置き換えたりすることが可能となる。
【００３０】
また、ゲノムＤＮＡへの相同性組換えによる遺伝子導入には、プラスミドベクターを用いた方法に比べて、導入した遺伝子を多コピーで持たせることが困難という問題点はあるものの、プラスミドの脱落を防ぐために常に培地に抗生物質を添加する等、選択圧をかけ続ける必要性が無く、形質が安定しているという利点もある。
【００３１】
相同性組換え（ダブルクロスオーバー）による遺伝子の破壊には、遺伝子に隣接した上流、下流領域（遺伝子のタンパク質コード領域の一部を含んでも良い）をクローン化し、クローン化した隣接上流、下流領域からなるプラスミド（ベクター）を作り、このプラス
ミドで宿主細胞を形質転換することによって行う。隣接配列は、対応する目的細胞ゲノムの配列に対し、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは９８％、またさらにより好ましくは９９％相同性を有する。このプラスミドには、遺伝子の全タンパク質コード領域を含んではならないが、標的遺伝子のタンパク質コード領域の一部分を含んでも構わない。この隣接領域は、少なくとも１００塩基対であり、理論的には隣接配列の長さに上限はないが、４０００塩基対までが好ましく、より好ましい隣接領域は、５００塩基対から１２００塩基対までの長さである。
【００３２】
遺伝子の欠失又は破壊によって付与される栄養要求性株の具体的な種類は特に限定されるものではなく、例えば、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求性株；ウラシル、アデニン等の核酸塩基要求性株；ビタミン要求性株；等を挙げることができるが、このうちでもウラシル要求性を付与することが、下記の理由で望ましい。
【００３３】
ウラシル要求性は、ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を破壊することで得ることができる。
【００３４】
ピリミジン塩基（チミン、シトシン、ウラシル）の生合成経路は細菌から菌類、植物、動物に至るまで共通の酵素系によって構成されており、極一部の病原菌を除くすべての生物にとって必須の経路である。この経路はすべてのピリミジン塩基の前駆体であるＵＭＰ（ウリジン一リン酸）に至る６つの酵素反応から成ることが分かっている。６つの酵素（及びそれをコードする遺伝子）と、Ｅ．ｃｏｌｉ及びSalmonella typhimuriumにおけるピリミジン塩基の生合成経路を図１に示す。これらの酵素をコードする遺伝子を破壊された株はＵＭＰを生合成出来なくなるために、ウラシル要求性株となる。
【００３５】
これらのうち、ｐｙｒＥ（オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子）もしくはｐｙｒＦ（オロチジン−５−リン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子）を破壊された株については、５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）によるポジティブセレクションが可能であることが分かっている。５−ＦＯＡは、遺伝子破壊が無い株ではオロチン酸（orotate）の代わりにピリミジン経路に取り込まれ、最終的にＲＮＡに
取り込まれて正常なＲＮＡの合成を阻害し、菌体を死滅させるが、ｐｙｒＥ破壊株及びｐｙｒＦ破壊株では代謝されることがないために菌体は生存できる。このことを利用すると、５−ＦＯＡと十分な量のウラシルを含む培地を用いることで、前述の相同性組換えによってｐｙｒＥもしくはｐｙｒＦの破壊株を選択、単離することが可能となる。このｐｙｒＥもしくはｐｙｒＦを選択マーカーに用いれば、選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子を導入する方法に比べ、菌が元々持っていた遺伝子なので、確実に発現させることができると考えられる。このため、ウラシル要求性の付与には、ｐｙｒＥ或いはｐｙｒＦ遺伝子を破壊させることが好ましい。
【００３６】
モーレラ属細菌において、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ｐｙｒＥ）を相同性組換えにより欠失または破壊するには、（１）まずｐｙｒＥと、その上流及び下流の隣接領域をクローニングしてプラスミドに組み込み、（２）さらにそのプラスミドからｐｙｒＥ部分を除いたプラスミドを作製することが必要である。
【００３７】
上記（１）のクローニングには配列番号１及び配列番号２のプライマーを用いることができる。なお、配列番号１はフォワード、配列番号２はリバースのプライマーである。配列番号１及び２は、ｐｙｒＥ遺伝子と、ｐｙｒＥ遺伝子の上流および下流に隣接する約１０００ｂｐを増幅することができる。
【００３８】
上記（１）で増幅した領域からｐｙｒＥ遺伝子部分のみを除くために配列番号５及び／
又は配列番号６のプライマーを用いることができる。なお、配列番号５はフォワード、配列番号６はリバースのプライマーである。配列番号５は、上記（１）でクローニングした配列のうちｐｙｒＥ遺伝子のＯＲＦまで、配列番号６はｐｙｒＥ遺伝子ＯＲＦの終了部分から下流隣接領域の末端までを増幅するため、上記（１）で増幅した領域を鋳型として配列番号５、６のプライマーを用いてＰＣＲを行うと、ｐｙｒＥ遺伝子を除いた領域のみが増幅される。
【００３９】
配列番号９および１０のプライマーは、作出した細胞からｐｙｒＥが欠失又は破壊されているかを確認する時に使用することができる。
【００４０】
本発明のプライマーは、Moorella thermoacetia、M．thermoautotrophica、M．glycerini等のモーレラ属細菌、エタノール生産効率が高い菌株の作出のためには、好ましくは水素と二酸化炭素、又は一酸化炭素の合成ガスからエタノールを生産する能力を有するモーレラ属細菌、より好ましくはＭｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１のオロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を、相同性組換えにより欠失又は破壊する際に利用可能なプライマーである。
【００４１】
本発明のモーレラ属細菌は、Moorella thermoacetia、M．thermoautotrophica、M．glycerini等のモーレラ属細菌に栄養要求性を付与したものであり、エタノール生産効率が高い菌株の作出の上では、その中でも水素と二酸化炭素、又は一酸化炭素の合成ガスからエタノールを生産する能力を有するモーレラ属細菌に栄養要求性を付与したものであり、更にはＭｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１に栄養要求性を付与したものが好ましい。
【００４２】
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１のｐｙｒＥ遺伝子を相同性組換えによって破壊しウラシル要求性を付与した菌株は、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．２２−１−Ｕ（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−６０６）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。
【００４３】
培養的な性質は、以下の通りである。
【００４４】
改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ 寒天培地（※１）において、嫌気的、５５℃、培養日数３〜５日で直径１〜２ｍｍの円形コロニーを形成する。
ｉ）色： 白
ｉｉ）表面の形状：スムーズ
ｉｉｉ）透明度：不透明
【００４５】
※１ 改変型ＡＴＣＣ １７５４ ＰＥＴＣ 寒天培地
ＮＨ４Ｃｌ １．０ｇ
ＫＣｌ ０．１ｇ
ＭｇＳＯ４ ０．２ｇ
ＮａＣｌ ０．８ｇ
ＫＨ２ＰＯ４ ０．１ｇ
ＣａＣｌ２ ０．０２ｇ
Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ １．０ｇ
（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ無添加の場合 Ｕｒａｃｉｌ ０．０１ｇ）
ＮａＨＣＯ３ ２．０ｇ
Ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ＨＣｌ ０．３ｇ
Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｉ） １０ｍｌ
Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ （ＩＩ） １０ｍｌ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
（Ａｇａｒ（高温用） ２０ｇ）
（Ｆｒｕｃｔｏｓｅ ５．０ｇ）
ｐＨ ５．９（滅菌前）
滅菌温度・時間 １２１℃ １５分
【００４６】
なお、上記の（Ｉ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ及び（ＩＩ） Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎは以下の組成である。
【００４７】
（Ｉ）Ｔｒａｃｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ２．０ｇ
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １．０ｇ
Ｆｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ ０．８ｇ
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２ｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００２ｇ
ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＳｅＯ４ ０．０２ｇ
Ｎａ２ＷＯ４ ０．０２ｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
【００４８】
（ＩＩ）Ｖｉｔａｍｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
Ｂｉｏｔｉｎ ２．０ｍｇ
Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ ２．０ｍｇ
Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ−ＨＣｌ １０ｍｇ
Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｌ ５．０ｍｇ
Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ ５．０ｍｇ
Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｄ−Ｃａ−ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ ５．０ｍｇ
Ｖｉｔａｍｉｎ Ｂ12 ０．１ｍｇ
ｐ−Ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｔｈｉｏｃｔｉｃ ａｃｉｄ ５．０ｍｇ
Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒ １０００ｍｌ
【００４９】
この菌株は、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードするｐｙｒＥ遺伝子が欠失しているため、ウラシル要求性を有する。
【００５０】
また、フルクトースから酢酸及びエタノールを生成する。二酸化炭素と水素、または一酸化炭素と二酸化炭素から、酢酸及びエタノールを生成する。
【００５１】
この菌株は、相同性部位と、破壊遺伝子がわかっているので、例えばエタノール生産性の向上に寄与する遺伝子のような有用遺伝子を導入してエタノール生産能力が優れた菌株の作出を試みる際に、本発明のモーレラ属細菌を宿主細胞として利用することができる。
【００５２】
すなわち、２つの相同性部位の間にｐｙｒＥ遺伝子及び導入したい遺伝子（有用遺伝子）を入れたベクターを作製し、再組換えすることで目的遺伝子の導入と、ウラシル生合成能の復活による選抜を行って、更なる組換え細胞を得ることができる。
【実施例】
【００５３】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例によって限定されない。
【００５４】
なお、以下必要に応じてウラシル要求性を付与したＭｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．菌株は、ｐｙｒＥ破壊株と称し、Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１株は、ＨＵＣ２２−１あるいは野生株と称することがある。
【００５５】
実施例１
１．Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１株からのゲノムＤＮＡの抽出
グラム陽性菌であるＭｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ＨＵＣ２２−１からのゲノムＤＮＡの抽出には、Marmur法（参考文献１）を改変した以下の方法を用いた。
【００５６】
フルクトースを基質として定常期まで培養した培養液２０ｍｌを3,000rpm、１５分間遠心して集菌し、上清を除去した。得られた菌体に１．５ｍｌのＴＥｂｕｆｆｅｒ（10 mM Tris, 1 mM EDTA-2Na）と５ｍｇのリゾチーム（粉末）を加えて懸濁し、３７℃で３０分間ゆっくりと振とうした。その後、２．５ｍｌの溶菌液[100 mM Tris-HCl (pH 8.0),300 mM NaCl, 20 mM EDTA-2Na, 2%SDS, 100 μg／ml Proteinase K]を加えて混合させ、５５℃で６０分間静置し、菌体を溶解させた。菌体溶解液に１．２５ｍｌのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）混液を加えて室温で１０分間振盪して完全に混合させたのち、11,000rpm、５分間遠心して３層に分離し、上層を新しいチューブに移した。この操作を計２回繰り返し、タンパクを除去した。得られた溶液量の１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液(ｐＨ５．２)と２．５倍量のエタノールを加えて静かに混合させ、室温で１０分間静置したのち、11,000rpm、１５分間遠心して上清を除去し、ＤＮＡを沈殿させた。その後、７５％エタノールを５ｍｌ加えて11,000 rpm、５分間遠心して上清を除去し、ＤＮＡをリンスした。最後に、11,000rpm、３０秒間遠心して余分なエタノールを完全に除去し、２００μｌの超純水に溶解させ、−２０℃に保存した。得られたゲノムＤＮＡは、超純水で１０倍に希釈し、分光光度計（Ultrospec3000, Pharmacia Biotech）のＤＮＡ定量モードで濃度と純度を確認した。
【００５７】
２．M. thermoacetica ATCC 39073株のゲノムデータベースからのｐｙｒＥの検索
Ｇｅｎｂａｎｋに登録されている、ＨＵＣ２２−１株の近縁種であるM. thermoacetica
ATCC 39073株のゲノムデータベース（accession number: CP000232）から、ＢＬＡＳＴ
検索を用いてｐｙｒＥと思われる遺伝子の検索を行った。
【００５８】
３．ＨＵＣ２２−１株ゲノム由来のｐｙｒＥのクローニング
上記１で得られたＨＵＣ２２−１株のゲノムＤＮＡを鋳型に、Premix TaqTM（TaKaRa Ex TaqTMVersion）を用いてＰＣＲを行い、上記２で見つかったｐｙｒＥと思われる遺伝子を、ＯＲＦの前後約1,000 bpずつを含めて増幅した。ＰＣＲ反応液組成と反応条件を表１に、用いたプライマーの配列を表２に示す。反応終了後、各ＰＣＲ産物を０．７％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００５９】
その結果、ｐｙｒＥについて予想されたサイズの単一バンドが確認された。
【００６０】
次に、pGEM(商標)−T Easy Vector Systemを用いたＴＡクローニングによってpGEM(商
標)−T Easy vectorに組み込み、E. coli DH5aにヒートショック法で導入し、形質転換させた。100 μg／ml ampicillin、0.1mM IPTG、及び40 μg／ml X-galを含むＬＢプレートで一晩培養し、Blue/White selectionによって目的遺伝子がクローニングされたプラスミドを持つコロニーを選択した。選択した各コロニーをそれぞれ100μg／ml ampicillinを含む２ｍｌのＬＢ培地に植菌し、さらに一晩振とう培養した後、Quantum Prep(商標) Plasmid Miniprep Kitを用いてプラスミドを回収した。回収された各プラスミドは、適当な制限酵素で切断された後、０．７％アガロースゲル電気泳動で目的の断片がクローニングされていることが確認された。確認された各プラスミドにクローニングされた断片の配列決定は、広島大学 自然科学研究支援開発センター 遺伝子実験部門のＤＮＡ塩基配列
決定サービスに依頼した。まず、Ｍ１３フォワードプライマーとＭ１３リバースプライマーを用いて両端から配列を決定し、さらに内側の配列については、表３に示すプライマーを用いて決定した。
【００６１】
その結果、M. thermoacetica ATCC 39073株のゲノムデータベースに示されている配列
と９９％以上の相同性を持つことが確認された。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
【表３】
【００６５】
４．ｐｙｒＥ破壊用プラスミドｐＧＤＰｙｒＥの構築
Satoらの方法（参考文献２）に従い、相同性組換え（ダブルクロスオーバー）によるｐｙｒＥの破壊（図２）を行うためのプラスミドを構築した。構築の概略を図３に示す。上記３で得られたプラスミドｐＧＥＭＰｙｒＥを鋳型にPremix TaqTM（TaKaRaEx TaqTM Version）を用いてアダプターＰＣＲを行い、プラスミド上のｐｙｒＥのＯＲＦを除いた部分を増幅するとともに、その両末端にＢａｍＨＩサイトを付与した。ＰＣＲ反応液組成と反応条件を表４に、用いたプライマーの配列を表５に示す。得られたＰＣＲ産物を０．７％アガロースゲル電気泳動で確認した後、制限酵素ＢａｍＨＩで一晩反応させて切断し、MagExtractor(商標)−PCR ＆ Gel Clean Upを用いて精製した。その後、DNA Ligation Kit Ver. 2を用いてライゲーションさせ、ｐｙｒＥ破壊用プラスミドｐＧＤＰｙｒＥ（図３）を構築した。
【００６６】
【表４】
【００６７】
【表５】
【００６８】
５．ｐｙｒＥ破壊用プラスミドｐＧＤＰｙｒＥ２の構築
ダブルクロスオーバーを起こすための相同性領域をより短くしても形質転換が行えるのかを確認するために、上記４で構築したｐＧＤＰｙｒＥから、ＰＣＲにより前後の相同性領域が５００ｂｐずつになるように断片を取り出し、pGEM(商標)−TEasy vectorに再クローニングしたプラスミドｐＧＤＰｙｒＥ２（図３）を構築した（クローニングの方法は上記３と同様）。ＰＣＲ反応液組成と反応条件を表６に、用いたプライマーの配列を表７に示す。
【００６９】
【表６】
【００７０】
【表７】
【００７１】
６．相同性組換えによるＨＵＣ２２−１株ゲノム上のｐｙｒＥの破壊
ＨＵＣ２２−１株に対する遺伝子導入には、エレクトロポレーション法を用いた。Satoらの方法（参考文献２）を参考に、以下の手順で行った。
【００７２】
使用する培地、バッファーはすべて嫌気的、無菌的に調製したものを用い、また操作はすべて二酸化炭素ガスを吹き付けながら嫌気的に行った。フルクトースを基質に対数増殖後期（濁度、波長６６０ｎｍ、ＯＤ660＝１．５〜２．０）まで培養した本菌の培養液２０ｍｌを6,000 rpm、４℃で５分間遠心して上清を除去し、菌体を回収した。菌体を５ｍｌの２７２ｍＭ スクロース溶液に再懸濁し、6,000 rpm、４℃で５分間遠心して洗浄し、上清を除去した。この洗浄を計２回繰り返した後、菌体を１ｍｌの２７２ｍＭスクロース溶液に再懸濁した。菌体に導入するＤＮＡ（ｐＧＤＰｙｒＥもしくはｐＧＤＰｙｒＥ２）５〜１０μｇを含む溶液を添加して混合した。ネガティブコントロールの場合はＤＮＡ溶液の代わりに超純水を同じ量添加した。氷中で１０分間静置した後、予め氷中で冷却しておいた２ｍｍギャップのエレクトロポレーション用キュベット（ELECTROPORATIONCUVETTES PLUSTM, BTX）に１００μｌを移し、エレクトロポレーション装置（ECM 630, BTX）にセットして、2.0 kV（10.0 kV／cm）、400Ω、50 μＦの条件でパルスを１回かけた。パルスをかけ終わった溶液を、注射針（ニプロ）を取り付けたプラスチック注射器（テルモ）を用いて回収し、８ｍｌ容量のバイアル瓶に入った２ｍｌのフルクトース培地（１０μg／ｍｌのウラシルを含む）に加えた。氷中で１０分間静置した後、５５℃で１０時間前培養を行った。
【００７３】
選択物質である０．２％（ｗ／ｖ）の５−ＦＯＡと１０μｇ／ｍｌのウラシルと２％（ｗ／ｖ）の高温培養用寒天（ナカライテスク）を含むフルクトース培地に前培養液全量を加えてロールチューブを作製した。ただし、ポジティブコントロールに対しては５−ＦＯＡを加えなかった。作製したロールチューブを５５℃に静置し４〜７日間培養した後、得られたコロニーを滅菌したパスツールピペットを用いて嫌気的に採取し、０．２％（ｗ／ｖ）の５−ＦＯＡと１０μｇ／ｍｌのウラシルを含むフルクトース液体培地へ植え継いだ。
【００７４】
２回の植え継ぎの後、一部をウラシルも酵母エキスも含まない完全合成培地へ植え継いだところ、野生株は問題なく増殖できたのに対し、これらの株は全く増殖できなかった。
【００７５】
また、この完全合成培地に１０μｇ／ｍｌのウラシルのみを添加すると、これらの株は増殖できるようになった。これらのことから、これらの株がウラシル要求性株に形質転換していることが確認された（ｐｙｒＥ破壊株）。
【００７６】
形質転換の効率は、ｐＧＤＰｙｒＥを用いた場合ＤＮＡ１μｇ当たり約３５個、ｐＧＤＰｙｒＥ２を用いた場合には、ＤＮＡ１μｇ当たり約８個であった。
【００７７】
７．ＰＣＲによるｐｙｒＥの破壊の確認
野生株とｐｙｒＥ破壊株のゲノムＤＮＡを鋳型にPremix TaqTM（TaKaRa Ex TaqTM Version）を用いてPCRを行い、ｐｙｒＥの破壊の確認を行った。ＰＣＲ反応液組成と反応条件を表８に、各遺伝子に対して用いたプライマーの配列を表９に示す。反応終了後、各ＰＣＲ産物のサイズを０．７％アガロースゲル電気泳動で確認した。
【００７８】
その結果、野生株で見られるバンド（約2,600 bp）が無くなっていることが確認できた。
【００７９】
また、ｐｙｒＥ破壊株ではｐｙｒＥの上流は少なくとも約８ｋｂｐ、下流は少なくとも２ｋｂｐの長さにわたって配列が失われている可能性が高いことがわかった。
【００８０】
【表８】
【００８１】
【表９】
【００８２】
[参考文献]
（１）Marmur, J.: A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid frommicro-organisms. J. Mol. Biol. 1961; 3: 208-18
（２）Sato, T., Fukui, T., Atomi, H., and Imanaka, T.: Improved and versatiletransformation system allowing multiple genetic manipulations of thehyperthermophilic archaeon Thermococcus kodakaraensis. Appl. Environ.Microbiol. 2005; 71: 3889-99
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】ピリミジン塩基の生合成経路
【図２】相同性組換え（ダブルクロスオーバー）によるｐｙｒＥの破壊
【図３】ｐｙｒＥ破壊用プラスミドｐＧＤＰｙｒＥ及びｐＧＤＰｙｒＥ２の構築
【特許請求の範囲】
【請求項１】
相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊され、栄養要求性を示すことを特徴とするモーレラ属細菌。
【請求項２】
染色体上の遺伝子が、ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子であり、栄養要求性がウラシル要求性であることを特徴とする請求項１記載のモーレラ属細菌。
【請求項３】
染色体上の遺伝子が、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載のモーレラ属細菌。
【請求項４】
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．２２−１−Ｕ（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−６０６）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている請求項１〜３の何れかに記載のモーレラ属細菌。
【請求項５】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊された栄養要求性株を作出する際に用いるプライマーであって、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と隣接する領域を増幅する配列番号１及び／又は配列番号２で示されるプライマー。
【請求項６】
請求項５のプライマーにより増幅された配列を鋳型として、隣接領域のみを増幅する配列番号５及び／又は配列番号６で示されるプライマー。
【請求項７】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊された栄養要求性株を作出する際に用いるプライマーであって、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の欠失又は破壊を確認する配列番号９及び／又は配列番号１０で示されるプライマー。
【請求項１】
相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊され、栄養要求性を示すことを特徴とするモーレラ属細菌。
【請求項２】
染色体上の遺伝子が、ピリミジン塩基の生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子であり、栄養要求性がウラシル要求性であることを特徴とする請求項１記載のモーレラ属細菌。
【請求項３】
染色体上の遺伝子が、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１又は２記載のモーレラ属細菌。
【請求項４】
Ｍｏｏｒｅｌｌａ ｓｐ．２２−１−Ｕ（受領番号 ＮＩＴＥ ＡＰ−６０６）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている請求項１〜３の何れかに記載のモーレラ属細菌。
【請求項５】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊された栄養要求性株を作出する際に用いるプライマーであって、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と隣接する領域を増幅する配列番号１及び／又は配列番号２で示されるプライマー。
【請求項６】
請求項５のプライマーにより増幅された配列を鋳型として、隣接領域のみを増幅する配列番号５及び／又は配列番号６で示されるプライマー。
【請求項７】
モーレラ属細菌において、相同性組換えによって染色体上の遺伝子が欠失又は破壊された栄養要求性株を作出する際に用いるプライマーであって、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の欠失又は破壊を確認する配列番号９及び／又は配列番号１０で示されるプライマー。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１０−１７１３１（Ｐ２０１０−１７１３１Ａ）
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１８０６５７（Ｐ２００８−１８０６５７）
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１月２８日（２０１０．１．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（０００００５９０２）三井造船株式会社 (1,723)
【出願人】（５０４１３６５６８）国立大学法人広島大学 (924)
【Ｆターム（参考）】
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