リアルタイムＰＣＲ法による食品媒介病原菌の網羅的迅速検出方法
【課題】迅速、簡便、安価に食品媒介病原菌を網羅的にスクリーニングすること
【解決手段】複数種類の食品媒介病原菌それぞれにおける所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組、および、蛍光インターカレータを、プレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注し、さらに、前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加し、これをリアルタイムＰＣＲによって増幅させた後、融解曲線分析をおこない、被験者に一定量を超えていずれかの食中毒菌の保有が認められるかをスクリーニングすることを特徴とする食品媒介病原菌検査方法。
【解決手段】複数種類の食品媒介病原菌それぞれにおける所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組、および、蛍光インターカレータを、プレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注し、さらに、前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加し、これをリアルタイムＰＣＲによって増幅させた後、融解曲線分析をおこない、被験者に一定量を超えていずれかの食中毒菌の保有が認められるかをスクリーニングすることを特徴とする食品媒介病原菌検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒の原因菌を含め食品媒介病原菌を迅速かつ網羅的にスクリーニングする方法およびこれに用いるプライマーペア並びにスクリーニング用ＰＣＲプレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒の検査は、長時間にわたる煩雑な分離・同定作業を必要とするため、これまで検査時間の短縮が試みられてきた。糞便からの食中毒菌の検査にはＰＣＲ法が広く応用され、近年ではＰＣＲ産物に特異的に結合する蛍光色素プローブや、非特異的にＰＣＲ増幅産物に結合するサイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）などを用いたリアルタイムＰＣＲが迅速検出に応用されるようになってきている。特に、たとえばＴａｑＭａｎ法に代表されるような蛍光色素プローブ法の場合は、その反応特異性を利用して定量的かつ精度の高い食中毒菌の同定が可能である。
【０００３】
しかしながら、蛍光色素プローブ法は、プローブが極めて高価であり、同一チャンネルを利用した同時検査は実質的に不可能であるという問題点があった。
【０００４】
実際、日本国内で発生する食中毒又は食品媒介感染症の病原菌は、発生頻度の高い上位８種で発生割合の９２％を占め、出現頻度はそれほど高くないものの更に１６種を加えた２４種類で実質的に１００％となる。これら２４種類の病原菌を識別するためのプローブを設計することは、金額の上からも現実的でなく、仮に用意したとしても、ＰＣＲの条件は個々の病原菌で異なるので、極端にいえば二十数回の（４チャンネルを用いた、インターナルコントロールを含むＴａｑＭａｎＰＣＲであっても８回の）ＰＣＲ増幅処理が必要となり、時間がかかってしまうという問題点があった。
【０００５】
ここで、食中毒が疑われる場合、最も重要視されるのはその再発防止であり、原因菌の絞り込みができれば対策が可能となるので、短時間に「あたり」をつけることが必要となる。したがって、実質的に時間のかかる蛍光色素プローブ法は効率的ではない、という問題点があった。
【０００６】
一方、サイバーグリーン法は、このような問題点はないが、ミスプライミング等に基づく蛍光が観測される場合があり、検出結果の信頼性に劣る場合があるという問題点があった。また、ＥＵのＩＳＯではプレートの各穴で反応が正常に進行していることを保証すべく、インターナルコントロール（内部標準：ＩＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ））を加えることが定められ、信頼性を向上させているが、サルモネラ菌や腸炎ビブリオなどの特定の食中毒菌の検証用のＩＡＣしか存在せず、どれが原因菌となっているかの特定には時間がかかるという問題点は依然として存在していた。換言すれば、網羅的に短時間で原因菌をスクリーニングする技術が依然として求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−４８６７０号公報
【特許文献２】特開２００７−２７４９３４号公報
【０００８】
【非特許文献１】Hiroshi Fukushima, et al, 'Duplex Real Time SYBR Green PCR Assaysfor Detection of 17 Species of Food- or Waterborne Patholgens in Stools' Journal of Clinical Microbiology,Vol.41, No.11, (2003)
【非特許文献２】福島博ら「リアルタイムＰＣＲ法による食中毒菌の迅速スクリーニングの検討」感染症学雑誌、第７９巻 第９号 （平成１７年）
【非特許文献３】Haukur Gudnason1, et al, 'Comparison of multiple DNA dyes forreal-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNAamplification and melting temperature' Nucleic Acids Research, Vol. 35, No. 19, (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
すなわち、解決しようとする問題点は、迅速、簡便、安価に食品媒介病原菌を網羅的にスクリーニングする点である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１に記載の食品媒介病原菌検査方法は、複数種類の食品媒介病原菌それぞれにおける所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組、および、蛍光インターカレータを、プレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注し、さらに、前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加し、これをリアルタイムＰＣＲによって増幅させた後、融解曲線分析をおこない、被験者に一定量を超えていずれかの食品媒介病原菌の保有が認められるかをスクリーニングすることを最も主要な特徴とする。
【００１１】
すなわち、請求項１に係る発明は、原因菌に依存せず、単色蛍光を観測するだけで複数の食中毒原因菌などの食品媒介病原菌のうちいずれに罹患しているかの迅速な同時スクリーニングが可能となる。より具体的には、Ｔｍ値が異なるようにプライマーを設計しているので、どの菌の量が多いか、また、その菌がどの程度存在するかを把握可能となり、また、ミスプライミング等が生じてもＴｍ値で検定するためスクリーニングの信頼性が向上する。また、複数人の被験者の同時検査が可能であるため、罹患の疑いがある被験者集団から、迅速な原因菌の特定を可能とする。換言すれば、本方法によれば、条件を均一化して複数の被験者から同時に複数の食品媒介病原菌をスクリーニング可能となる。なお、検出用ＤＮＡ断片は、株ないし種に特異的な遺伝子または病原に関連する遺伝子から選ばれるものであることはいうまでもない。
【００１２】
また、プライマーペアの組とは、食品媒介病原菌に対応した個々の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの集合をいい、たとえば、食品媒介病原菌が７種類ある場合には、７セットであることを意味する。Ｔｍ値とは、融解曲線分析により得られる融解温度をいう。蛍光インターカレータは、単色蛍光を発するインターカレータであれば特に限定されず、たとえば、後述するようにサイバーグリーンを挙げることができる。換言すれば、本発明は、単色蛍光を観測すれば足りるため、ＴａｑＭａｎプローブ法のように、マルチチャンネルを設ける必要がなく簡便に複数の食品媒介病原菌をスクリーニングできる技術といえる。
【００１３】
プレートないしチューブセットは、特に限定されず、たとえば、８×１２穴のプレートを挙げることができる。また、１穴に１種類ずつ添加する検出用ＤＮＡ断片とは、当該ＤＮＡ断片を含むＤＮＡであればよく、増幅される断片の前後に他のＤＮＡが一切ないものに限定されないものとする。なお、検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加するとは、陽性コントロールをとることを意味し、後述のインターナルコントロールを除いて、複数種類の検出用ＤＮＡ断片を同じ穴に添加しない（重複させない）ことを意味する。ここで、種類数分、とは、個数に限りのある穴を効率的に用いるため最低数を使用して、被験者の糞便液を添加する穴を残しておくという意であり、余裕がある場合には複数の穴に同一の検出用ＤＮＡ断片を添加する態様であっても良いものとする。同様に、人数分添加する、とは、穴に余裕がある場合には複数の穴に同一人の鋳型ＤＮＡを添加する態様であってもよい。
【００１４】
また、請求項２に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項１に記載の食品媒介病原菌検査方法において、プライマーペアの組と蛍光インターカレータに加えて、前記検出用ＤＮＡ断片のいずれのＴｍ値とも異なるＴｍ値をもつＤＮＡ断片を有するインターナルコントロールと、当該ＤＮＡ断片を増幅させるインターナルコントロール用プライマーペアと、をプレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注したことを主要な特徴とする。
【００１５】
すなわち、請求項２に係る発明は、ＰＣＲによる増幅が正常に行われているかの検証が容易となり、また、食品媒介病原菌の定量評価の信頼性を向上させることが可能となる。詳細には、被験者の糞便中に所定量の食品媒介病原菌が存在すれば（罹患していれば）、融解曲線分析によって所定温度で２回の蛍光ピークが観測され、食品媒介病原菌が存在しなくてもＰＣＲが正常であれば、インターナルコントロールに基づく蛍光ピークが所定温度で観測されることとなる。なお、インターナルコントロールのＴｍ値と検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値とは、２．０℃以上、好ましくは、３．０℃以上離れていると、検証が容易となる。
【００１６】
また、請求項３に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項１または２に記載の食品媒介病原菌検査方法において、前記検出用ＤＮＡ断片と前記鋳型ＤＮＡのいずれをも含まず、前記プライマーペアの組、前記蛍光インターカレータ、前記インターナルコントロール用プライマーペア、および、調整水、または、前記プライマーペアの組、前記蛍光インターカレータ、前記インターナルコントロール用プライマーペア、および、前記インターナルコントロールからなる液が分注された区をプレートないしチューブセットに設けたことを主要な特徴とする。
【００１７】
すなわち、請求項３に係る発明は、陰性コントロールのみ、または、インターナルコントロールのみをとることによりＰＣＲによる増幅結果の信頼性を向上させる。なお、上記以外にも、ＤＮＡ以外であれば、色素や試薬などＰＣＲに必要な化合物等が添加されていることは制限されないものとする。
【００１８】
また、請求項４に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項１、２または３に記載の食品媒介病原菌検査方法において、蛍光インターカレータが、サイバーグリーンＢＥＢＯ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＯ−１３、または、ＳＹＴＯ−８２であることを主要な特徴とする。
【００１９】
すなわち、請求項４は、汎用かつ安価なスクリーニング方法を提供可能となる。
【００２０】
また、請求項５に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項１〜４のいずれか一つに記載の食品媒介病原菌検査方法において、プレートないしチューブセットを区画し、プライマーペアの組を、発生頻度の高い第１の食品媒介病原菌群から選んだ１種の特定の検出用ＤＮＡ断片と、発生頻度が第１の食品媒介病原菌よりは高くない第２の食品媒介病原菌群から選んだ１種または２種の食品媒介病原菌の特定の検出用ＤＮＡ断片と、をそれぞれ増幅させるように、かつ、食品媒介病原菌種がそれぞれ重複しないように、グループ化し、１区画１グループとなるように割り当ててプライマーペアの組を分注し、各区画に前記割り当てられたグループに係る前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、各区画の残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加したことを主要な特徴とする。
【００２１】
すなわち、請求項５に係る発明は、複数の被験者から同時にかつ効率的に複数の食品媒介病原菌を網羅的にスクリーニング可能となる。特に、発生頻度の高い食品媒介病原菌を１グループに１種類のみとしているので、原因菌の特定の信頼性が向上する。
【００２２】
なお、区画するとは、線引きしてある必要はなく、概念的に分かれていれば特に限定されない。プレートの場合は、たとえば、各列の１穴目を陰性コントロール(ＰＣＲグレード水)、２穴目をインターナルコントロールのみ、３穴目〜５穴目を陽性コントロール（＋インターナルコントロール）、６穴目を被験者１（＋インターナルコントロール）、７穴目を被験者２（＋インターナルコントロール）、・・・、とするようにする例を挙げることができる。
【００２３】
また、請求項６に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項５に記載の食品媒介病原菌検査方法において、第１の食品媒介病原菌群は、耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ、ウエルシュ菌、サルモネラ菌、カンピロバクター・ジェジュニ、黄色ブドウ球菌、嘔吐毒産生セレウス菌、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌、から選ばれた群であり、第２の食品媒介病原菌群は、カンピロバクター・コリー、ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌、下痢毒産生セレウス菌、赤痢菌、コレラ菌、プロビデンシア・アルカリファンシエンス、プレシオモナス・シゲロイデス、ＬＴ遺伝子保有大腸菌、リステア菌、ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ、ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌、ＳＴ遺伝子保有大腸菌、エルシニア菌、エロモナス菌、ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌、から選ばれた群であることを主要な特徴とする。
【００２４】
すなわち、請求項６に係る発明は、食中毒の疑いがある場合に、日本国内で発生し検討すべきであるところの食品媒介病原菌を実質的に１００％スクリーニング可能となる。
【００２５】
なお、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌とは、腸管出血性大腸菌や病原性大腸菌にその遺伝子保有が認められるものであり、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌およびａａｇＲ遺伝子保有大腸菌は、株が異なるもののいわゆる腸管凝集接着性大腸菌を指し、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌およびｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌は、株が異なるもののいわゆる腸管出血性大腸菌を指す。また、ＬＴ遺伝子保有大腸菌はＬＴ毒素産生大腸菌を、ＳＴ遺伝子保有大腸菌はＳＴ毒素産生大腸菌を示す。ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌とは、分散接着性大腸菌にその遺伝子保有が認められるものである。
【００２６】
また、請求項７に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項５または６に記載の食品媒介病原菌検査方法において、グループ内の検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値を互いに０．６℃以上離れるようにプライマーペアを設計したことを主要な特徴とする。
【００２７】
すなわち、請求項７に係る発明は、日本国内で報告事例のある主要な食品媒介病原菌を効率的かつ精度高く網羅的にスクリーニング可能となる。なお、０．６℃以上であれば融解曲線分析による曲線ピークに基づいて分離観測が可能であるが、１．０℃以上Ｔｍ値が離れていることが好ましい。
【００２８】
また、請求項８に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項５または６に記載の食品媒介病原菌検査方法において、食品媒介病原菌が、耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３１および３２に示すものであり、カンピロバクター・コリーである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３３および３４に示すものであり、ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３５および３６に示すものであり、ウエルシュ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３７および３８に示すものであり、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１１に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３９および４０に示すものであり、下痢毒産生セレウス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１２に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４１および４２に示すものであり、サルモネラ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１３に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４３および４４に示すものであり、赤痢菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は１４であり、これに対するプライマーペアは配列番号４５および４６に示すものであり、コレラ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１５に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４７および４８であり、カンピロバクター・ジェジュニである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１６に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４９および５０に示すものであり、プロビデンシア・アルカリファンシエンスである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５１および５２に示すものであり、プレシオモナス・シゲロイデスである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５３および５４に示すものであり、黄色ブドウ球菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５５および５６に示すものであり、ＬＴ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５７および５８に示すものであり、リステア菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２１に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５９および６０に示すものに示すものであり、嘔吐毒産生セレウス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２２に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６１および６２に示すものであり、ＴＲＨ産生腸炎ビブリオである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２３に示すものに示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６３および６４に示すものであり、ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２４に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６５および６６に示すものであり、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２５に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６７および６８に示すものであり、ＳＴ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２６に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６９および７０に示すものであり、エルシニア菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７１および７２に示すものであり、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７３および７４に示すものであり、エロモナス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７５および７６に示すものであり、ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号３０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７７および７８に示すものであることを主要な特徴とする。
【００２９】
すなわち、請求項８に係る発明は、株ないし種に特異的な遺伝子または病原に関連する遺伝子を増幅するプライマーペアを用いて日本国内で報告事例のある主要な食品媒介病原菌を効率的かつ精度高く網羅的にスクリーニング可能となる。なお、これらの検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値は、およそ、７６℃〜９０℃に存在する。
【００３０】
また、請求項９に記載の発明は、請求項１〜８のいずれか一つに記載の食品媒介病原菌検査方法における、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のインターナルコントロールとしての使用であることを最も主要な特徴とする。
【００３１】
すなわち、請求項９に係る発明は、日本国内で報告事例のある主要な食品媒介病原菌を効率的かつ精度高く網羅的にスクリーニング可能となるインターナルコントロールを提供可能となる。Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉはニジマスの赤口病にしか見られない特徴的な遺伝子であり、人間の腸内に存在し得ないと考えられるので本方法におけるＩＡＣとして好適である。なお、このインターナルコントロール用のＤＮＡ断片としては、配列番号１に挙げるものがＴｍ＝８４．６℃±１．５℃であり、配列番号２に挙げるものがＴｍ＝７８．３℃±０．２℃である。よって、配列番号７〜３０に示した検出用ＤＮＡ断片とは、２℃〜６℃Ｔｍ値をずらすことができるので、ピークに基づく検出ないし検定が容易となる。
【００３２】
また、請求項１０に記載の発明は、融解曲線分析により食品媒介病原菌をスクリーニングするに際して使用するプライマーペアの組であって、増幅させるＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに０．６℃以上離れるように以下の群から選択した３ペア以上からなるプライマーペアの組であることを最も主要な特徴とする。その群とは、配列番号３１および３２に示すプライマーペア、配列番号３３および３４に示すプライマーペア、配列番号３５および３６に示すプライマーペア、配列番号３７および３８に示すプライマーペア、配列番号３９および４０に示すプライマーペア、配列番号４１および４２に示すプライマーペア、配列番号４３および４４に示すプライマーペア、配列番号４５および４６に示すプライマーペア、配列番号４７および４８に示すプライマーペア、配列番号４９および５０に示すプライマーペア、配列番号５１および５２に示すプライマーペア、配列番号５３および５４に示すプライマーペア、配列番号５５および５６に示すプライマーペア、配列番号５７および５８に示すプライマーペア、配列番号５９および６０に示すプライマーペア、配列番号６１および６２に示すプライマーペア、配列番号６３および６４に示すプライマーペア、配列番号６５および６６に示すプライマーペア、配列番号６７および６８に示すプライマーペア、配列番号６９および７０に示すプライマーペア、配列番号７１および７２に示すプライマーペア、配列番号７３および７４に示すプライマーペア、配列番号７５および７６に示すプライマーペア、配列番号７７および７８に示すプライマーペアである。
【００３３】
すなわち、請求項１０に係る発明は、株ないし種に特異的な遺伝子または病原に関連する遺伝子を増幅するプライマーペアを用いてリアルタイムＰＣＲにより、少なくとも３つの食品媒介病原菌を同時にスクリーニング可能となる。組合せにより、網羅的かつ効率的に迅速スクリーニングすることもできる。
【００３４】
また、請求項１１に記載の食品媒介病原菌スクリーニング用ＰＣＲプレートは、食中毒罹患の疑いのある複数の被験者から食品媒介病原菌をスクリーニングするための食品媒介病原菌スクリーニング用ＰＣＲプレートであって、発生頻度の高い第１の食品媒介病原菌群から選んだ１種と発生頻度が第１の食品媒介病原菌よりは高くない第２の食品媒介病原菌群から選んだ１種または２種により、食品媒介病原菌をそれぞれ重複しないように複数のグループに分け、プレートを区画して１区画１グループとなるように割り当て、プレートの各穴に、インターナルコントロールと、インターナルコントロール用プライマーペアと、蛍光インターカレータと、を分注し、さらに、グループ内の食品媒介病原菌それぞれの所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組を、当該グループに係る区画にそれぞれ分注し、かつ、各区画に当該区画に割り当てられたグループに係る前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、当該区画の残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加したことを最も主要な特徴とする。
【００３５】
すなわち、請求項１１に係る発明は、複数の被験者から同時にかつ効率的に複数の食品媒介病原菌を網羅的にスクリーニング可能となる。特に、発生頻度の高い食品媒介病原菌を１グループに１種類のみとしているので、原因菌の特定の信頼性が向上する。なお、このＰＣＲプレートには、請求項１〜１０に記載した各技術を適用できることはいうまでもない。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、迅速、簡便、安価に、食中毒菌を含み食品媒介病原菌を網羅的にスクリーニング可能となる。特に、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値を適正に選択しそのＤＮＡ断片（検出用ＤＮＡ断片）を増幅するプライマーペアの組をグループ化して分注することにより、国内で発生する食品媒介病原菌の実質的に総てを一括してリアルタイムＰＣＲによりスクリーニングすることが可能となる。
【００３７】
また、この一括してＰＣＲ反応させる場合に用いることが可能な、汎用的かつ信頼性の高いＩＡＣおよびＩＡＣプライマーペアを提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】９６穴（８×１２穴）ＰＣＲプレートの割り当てを示した図である。
【図２】ＰＣＲプロトコルを示した図である。
【図３】グループ１〜４について、陽性コントロールのサイクル数と蛍光強度との関係、および、融解曲線分析の結果を示した図である。
【図４】グループ５〜８について、陽性コントロールのサイクル数と蛍光強度との関係、および、融解曲線分析の結果を示した図である。
【図５】実際の食中毒が疑われた例の被験者の糞便液を用いてスクリーニングした融解曲線分析結果を示した図である。
【図６】図５の一部拡大図である。
【図７】実際の食中毒が疑われた別の例の被験者の糞便液を用いてスクリーニングした融解曲線分析結果を示した図である。
【図８】図７の一部拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明の実施の形態を図表を参照しながら詳細に説明する。
ここでは、８×１２穴（＝９６穴）のＰＣＲプレートを用いた２４種類の食品媒介病原菌のスクリーニング方法について説明する。なお、ここでは、説明の便宜上、株レベルで異なる菌も１（種）として表記するものとする。
プレートは、１列分の１２穴を一区画と考え、これを１グループとして、計８グループのスクリーニングをおこなう。１グループで３種類の食品媒介病原菌をスクリーニングし計２４種類の判別をおこなう。
【００４０】
日本で発生する食中毒は次の２４種類のいずれかの食品媒介病原菌であるといえる。ここでは、発生頻度の高い８種類を一つずつ各グループに割り当て、発生頻度の高くない１６種類の内の２種類ずつを各グループに割り当て、検出の効率化を図る。発生頻度の高い群と高くない群を次に示す。なお、括弧書きは、本願において必要に応じて用いる簡略表記とする。
【００４１】
（１）発生頻度の高い群
耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ（ＴＤＨ）、ウエルシュ菌、サルモネラ菌、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃｊ）、黄色ブドウ球菌、嘔吐毒産生セレウス菌（ＥＭＢｃ）、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌（ＥＨＥＣ）、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌（ＡＳＴ）
（２）発生頻度の高くない群
カンピロバクター・コリー（Ｃｃ）、ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌（ＥＡＥＣ）、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌（Ｓ１）、下痢毒産生セレウス菌（ＥＮＢｃ）、赤痢菌、コレラ菌、プロビデンシア・アルカリファンシエンス（Ｐａ）、プレシオモナス・シゲロイデス（Ｐｓ）、ＬＴ遺伝子保有大腸菌（ＬＴ）、リステア菌、ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ（ＴＲＨ）、ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌（Ｓ２）、ＳＴ遺伝子保有大腸菌（ＳＴ）、エルシニア菌、エロモナス菌、ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌（ＤＡＥＣ）
【００４２】
本願発明者は、鋭意検討の結果、これらの食品媒介病原菌のそれぞれについて、株ないし種に特異的な遺伝子または病原に関連する遺伝子の特定のＤＮＡ断片であって、その融解温度Ｔｍがグループ内で互いに分別可能な程度に異なるＤＮＡ断片と、このＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅させるプライマーペアと、を設計することに成功した。加えて、共通すなわち汎用のインターナルコントロール用のＤＮＡ断片およびそのプライマーペアを設計することに成功した。
【００４３】
＜インターナルコントロール：ＩＡＣ＞
インターナルコントロール（ＩＡＣ）は、鋭意検討の結果、Yersinia ruckeriの標的遺伝子１６ＳｒＲＮＡ（アクセッション番号Ｘ７５２７５）を採用することとした。これは、ニジマスの赤口病にのみ見られる遺伝子であって、人間の腸管内には存在しないためＩＡＣとして好適である。
【００４４】
後述の食品媒介病原菌の検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値は７６℃〜９０℃にあって、比較的低温側にあるものが多く、比較的高温側（８４℃以上）にあるものが３種である。したがって、ＩＡＣとしては、Ｔｍ値が低い検出用ＤＮＡ断片の場合には、Ｔｍ値の高いＤＮＡ断片を増幅するプライマーを、Ｔｍ値が高い検出用ＤＮＡ断片の場合には、Ｔｍ値の低いＤＮＡ断片を増幅するプライマーを設計した。
【００４５】
鋭意検討の結果、ＩＡＣの４７番目〜１１９番目のＤＮＡ断片（配列番号１）が、Ｔｍ＝８４．６℃（±１．５℃）であり、４２６番目〜４９３番目のＤＮＡ断片（配列番号２）が、Ｔｍ＝７８．３℃（±０．２℃）であることが分かった。よって、これらを増幅するプライマーを設計した。なお、前者を増幅するプライマーペア（以降ｙｅｒｓ８５と表記するものとする）のうち、センスプライマーを配列番号３にアンチセンスプライマーを配列番号４に示し、後者を増幅するプライマーペア（以降ｙｅｒｓ７８と表記するものとする）のうち、センスプライマーを配列番号５にアンチセンスプライマーを配列番号６に示した。
【００４６】
＜食中毒菌の検出用ＤＮＡ断片の設定およびそのプライマーペア＞
ＩＡＣの設計にあわせて、検出用ＤＮＡ断片とそのプライマーペアとを設計した。設計にあたっては、Ｔｍ値が７６℃〜９０℃までに分散し、グループ内でできるだけ１．０℃以上Ｔｍ値が異なるようにした。なお、融解曲線分析に際しては測定機器にも依存するが、０．６℃以上Ｔｍ値が離れていれば、分離観察が可能となる。鋭意検討の結果、次の検出用ＤＮＡ断片を決定した。
【００４７】
種名：標的遺伝子（アクセッション番号）：検出用ＤＮＡ断片のロケーション（配列番号）：Ｔｍ値の順に表記する。
・耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ：tdh（X54341）：264-498（配列番号７）:８１．０℃±０．３℃
・カンピロバクター・コリー：ceuE（X88849）：3513-3603（配列番号８）：７７．１℃±０．３℃
・ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌：aggR（Z18751）：358-454（配列番号９）：７８．４℃±０．８℃
・ウエルシュ菌：cpe（X81849）：583-736（配列番号１０）：７７．４℃±０．３℃
・ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌：stx1（EF441598）：415-509（配列番号１１）８０．８℃±０．３℃
・下痢毒産生セレウス菌：nheB（DQ153257）：2101-2252：（配列番号１２）:８１．４℃±０．２℃
・サルモネラ菌：invA（M90846）：167-285（配列番号１３）：８０．２℃±０．２℃
・赤痢菌：virA（D26468）：468-552（配列番号１４）：７９．０℃±０．３℃
・コレラ菌：ompW（X51948）：675-763（配列番号１５）：８１．８℃±０．３℃
・カンピロバクター・ジェジュニ：C. jejuni-specific DNA（AL111168）：381121-381206（配列番号１６）：７９．１℃±０．３℃
・プロビデンシア・アルカリファンシエンス：gyrB（AJ300547）：38-110（配列番号１７）：８０．２℃±０．２℃
・プレシオモナス・シゲロイデス：gyrB（AJ300545）：237-304（配列番号１８）：８２．２℃±０．３℃
・黄色ブドウ球菌：femB（AF106850）：277-370（配列番号１９）：８２．４℃±０．３℃
・ＬＴ遺伝子保有大腸菌：lt（S60731）：320-452（配列番号２０）：７８．０℃±０．４℃
・リステア菌：hly（EU372057）：3152-3257（配列番号２１）：７９．３℃±０．３℃
・嘔吐毒産生セレウス菌：ces（DQ360825）：8689-8793（配列番号２２）：７９．７℃±１．０℃
・ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ：trh（AY742213）：180-263（配列番号２３）：７８．７℃±１．７℃
・ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌：stx2（EF441616）：140-247（配列番号２４）：８１．９℃±０．８℃
・ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌：eaeA（Z11541）：899-1000（配列番号２５）：７９．６℃±０．２℃
・ＳＴ遺伝子保有大腸菌：st（M25607）：294-483（配列番号２６）:７７．６℃±０．３℃
・エルシニア菌：yadA（X13882）：1465-1564（配列番号２７）：８１．４℃±０．３℃
・ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌：astA（L11241）：63-168（配列番号２８）：８４．６℃±０．３℃
・エロモナス菌：ahh1（CP000462）：1653360-1653492（配列番号２９）：８８．９℃±０．２℃
・ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌：daaD（AF233530）：55-190（配列番号３０）：８９．９℃±０．２℃
【００４８】
次に、検出用ＤＮＡ断片に対するプライマーペアを記す。
種名：プライマーペアの配列番号：プライマーペアに対して付した識別名、の順に表記する。
・耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオのプライマーペア：配列番号３１および配列番号３２：tdh
・カンピロバクター・コリーのプライマーペア：配列番号３３および配列番号３４：CCceuE
・ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号３５および配列番号３６：aggR
・ウエルシュ菌のプライマーペア：配列番号３７および配列番号３８：GAP
・ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号３９および配列番号４０：JMS1
・下痢毒産生セレウス菌のプライマーペア：配列番号４１および配列番号４２：SG
・サルモネラ菌のプライマーペア：配列番号４３および配列番号４４：Styinva
・赤痢菌のプライマーペア：配列番号４５および配列番号４６：virA
・コレラ菌のプライマーペア：配列番号４７および配列番号４８：ompW
・カンピロバクター・ジェジュニのプライマーペア：配列番号４９および配列番号５０：AB
・プロビデンシア・アルカリファンシエンスのプライマーペア：配列番号５１および配列番号５２：PAG
・プレシオモナス・シゲロイデスのプライマーペア：配列番号５３および配列番号５４：PSG
・黄色ブドウ球菌のプライマーペア：配列番号５５および配列番号５６：FemB
・ＬＴ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号５７および配列番号５８：LT
・リステア菌：hly（EU372057）のプライマーペア：配列番号５９および配列番号６０：hly
・嘔吐毒産生セレウス菌のプライマーペア：配列番号６１および配列番号６２：ces
・ＴＲＨ産生腸炎ビブリオのプライマーペア：配列番号６３および配列番号６４：trh
・ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号６５および配列番号６６：JMS2
・ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号６７および配列番号６８：eaeA
・ＳＴ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号６９および配列番号７０：STa
・エルシニア菌のプライマーペア：配列番号７１および配列番号７２：yadA
・ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号７３および配列番号７４：EAST
・エロモナス菌のプライマーペア：配列番号７５および配列番号７６：AHH1
・ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号７７および配列番号７８：daaD
【００４９】
＜食中毒菌のグループ分け＞
Ｔｍ値と発生頻度の高い原因菌とに基づいて、グループ分けは以下のとおりとした。
・グループ１：耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ（TDH positive Vibrio parahaemolyticus）、
カンピロバクター・コリー（Campylobacter coli）、
ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌（EAEC）
・グループ２：ウエルシュ菌（Clostridium perfringens）、
ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌（EHEC (stx 1)）、
下痢毒産生セレウス菌（Enterotoxigenic B. cereus）
・グループ３：サルモネラ菌（Salmonella spp.）、
赤痢菌（Shigella）、
コレラ菌（V. cholerae）
・グループ４：カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、
プロビデンシア・アルカリファンシエンス（Providencia alcalifaciens）、
プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）
・グループ５：黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、
ＬＴ遺伝子保有大腸菌（ETEC (LT)）、
リステア菌（Listeria monocytogenes）
・グループ６：嘔吐毒産生セレウス菌（Emetic Bacillus cereus）、
ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ（TRH positive Vibrio parahaemolyticus）、
ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌（EHEC (stx 2)）
・グループ７：ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌（EHEC and EPEC）、
ＳＴ遺伝子保有大腸菌（ETEC (ST)）、
エルシニア菌（Y.enterocolitica and Y.pseudotuberculosis）
・グループ８：ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌（EAEC）、
エロモナス菌（Aeromonas hydrophila）、
ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌（DAEC）
【００５０】
このグループ分けにより、各グループ内ではＴｍ値が互いに０．６℃以上離れることとなり、融解曲線分析によるＴｍ値の分離が可能となる。また、ＩＡＣに関しては、グループ１〜グループ７についてはｙｅｒｓ８５を加え、グループ８についてはｙｅｒｓ７８を加えてＰＣＲ反応させることにより、ＩＡＣのＴｍ値をグループ内の検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値とも２℃〜６℃離すことができる。よって、このグループ分けにより、インターナルコントロールをとりながら分解能よく原因菌をスクリーニングできることとなる。
【００５１】
なお、グループ分けはこの例に限らず、ＩＡＣも含めてＴｍ値のピークが分離して評価可能な程度に離れていればよい。このとき、各グループに出現頻度の高いものを１種ずつ分配するようにするのが好ましい。
【００５２】
ＰＣＲプレートの各列の１２穴は、ＩＡＣのプライマーペア＋当該グループのプライマーペアの組＋蛍光インターカレータを添加し、各穴には、陰性コントロール、陽性コントロール、被験者の糞便液（検体）を順次添加する。第１列目にグループ１を割り当てた例で説明すると、添加するプライマーペアの組は、CCceuE＋aggR-Z＋tdhであり、これとyers85を１２穴総てに添加する。そして、第１穴〜第１２穴までは、以下を添加する。
【００５３】
第１穴：水
第２穴：ＩＡＣ
第３穴：カンピロバクター・コリーの鋳型ＤＮＡ＋ＩＡＣ
第４穴：ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌の鋳型ＤＮＡ＋ＩＡＣ
第５穴：耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオの鋳型ＤＮＡ＋ＩＡＣ
第６穴：被験者１の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体１）＋ＩＡＣ
第７穴：被験者２の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体２）＋ＩＡＣ
第８穴：被験者３の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体３）＋ＩＡＣ
第９穴：被験者４の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体４）＋ＩＡＣ
第１０穴：被験者５の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体５）＋ＩＡＣ
第１１穴：被験者６の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体６）＋ＩＡＣ
第１２穴：被験者７の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体７）＋ＩＡＣ
【００５４】
第２列〜第８列には、同様にグループ２〜グループ８を割り当てる。図１に全９６穴の割り当てを示す。図示したように、２４種類の原因菌のスクリーニングが１プレートで可能となる。第６穴〜第１２穴は、被験者１〜被験者７の糞便からの鋳型ＤＮＡを分注する。病院等では嘔吐や腹痛等を訴える者が同時期に集中することを契機として食中毒を疑うので、７検体もあればスクリーニングとしては十分有用である。
【実施例１】
【００５５】
次に、実際に検体を用いた例を説明する。
使用するＰＣＲ装置は、ＡＢＩ７５００（ＡＢＩ社）とし、反応サイクルは、図２のとおりのプロトコルとした。Ｓｔａｇｅ３で融解曲線分析をおこなう。このプロトコルから分かるように、本発明では、約２時間以内という短時間で２４種類の原因菌のスクリーニングが可能である。
【００５６】
各穴（反応チューブ）には、合計５０μリットルの反応液となるように、表１のとおりの調合とした。
【表１】
【００５７】
サイバーグリーンは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いた。ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅは、上記サイバーグリーンに添付の色素である。なお、検出用ＤＮＡ断片の濃度およびＩＡＣの濃度は、ＰＣＲのサイクル回数の終盤で蛍光強度が立ち上がるように予め調整しておく。具体的には、陽性コントロールは２０サイクル前後から蛍光観測がされるように、また、ＩＡＣは、２７サイクル前後で蛍光観測がされるように調整しておく。実際に濃度調整した場合の陽性コントロールの蛍光強度と融解曲線分析結果を図３および図４に示す。
【００５８】
また、被験者７人の糞便液はそれぞれの１０倍希釈液からQIAamp DNA stool Mini Kit（キアゲン社製）により鋳型ＤＮＡを抽出し、反応チューブ内の当該ＤＮＡ濃度が糞便１ｇ中の濃度の１／１００００となるように調整した。これは、常在菌が検出されない濃度である。
【００５９】
実際のスクリーニング例を説明する。島根県内Ａ地区で起きた食中毒が疑われたケースにおいて、被験者番号３１〜３７の７名の糞便液をスクリーニングした。結果を図５に示す。また、図６は、グループ２およびグループ４の拡大図である。図から明らかなように、総ての被験者にウエルシュ菌の保有が見られ、また、被験者３３および被験者３５には、カンピロバクター・ジェジュニの保有が見られる。よって、食中毒が発生しており、原因菌はこれらであることが推定できた。
【００６０】
同様に、島根県Ｂ地区で起きた食中毒が疑われたケースにおいて、被験者番号７１〜７７の７名の糞便液をスクリーニングした。結果を図７に示す。また、図８は、グループ４およびグループ８の拡大図である。図から明らかなように、被験者７１，７３，７４，７５にカンピロバクター・ジェジュニの保有が見られ、また、被験者７１には、ａｓｔＡ陽性大腸菌の保有が見られる。よって、食中毒が発生しており、原因菌はこれらであることが推定できた。
【００６１】
以上説明したように、本発明によれば、迅速、簡便、安価に食中毒菌を網羅的にスクリーニング可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
また、このスクリーニング用のＰＣＲプレートは適宜凍結乾燥しておくことにより、検査時に第１穴〜第５穴にＰＣＲグレード水、第６穴〜第１２穴に被験者の鋳型ＤＮＡを分注して使用しても良い。また、ＰＣＲプレートでなく、プライマーペアの組を凍結又は凍結乾燥しておいても良い。この組は、随意の組合せとすることができるが、たとえば、増幅させるＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに０．６℃以上離れるように上述の２４ペアから選択した３ペア以上の組としてもよい。凍結を−２０℃で行ったところ、４回の凍結融解後でも検出用ＤＮＡ断片を正常に増幅できることを確認している。なお、サイバーグリーンや必要な試薬も添加したものを凍結してもよい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食中毒の原因菌を含め食品媒介病原菌を迅速かつ網羅的にスクリーニングする方法およびこれに用いるプライマーペア並びにスクリーニング用ＰＣＲプレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
食中毒の検査は、長時間にわたる煩雑な分離・同定作業を必要とするため、これまで検査時間の短縮が試みられてきた。糞便からの食中毒菌の検査にはＰＣＲ法が広く応用され、近年ではＰＣＲ産物に特異的に結合する蛍光色素プローブや、非特異的にＰＣＲ増幅産物に結合するサイバーグリーン（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ）などを用いたリアルタイムＰＣＲが迅速検出に応用されるようになってきている。特に、たとえばＴａｑＭａｎ法に代表されるような蛍光色素プローブ法の場合は、その反応特異性を利用して定量的かつ精度の高い食中毒菌の同定が可能である。
【０００３】
しかしながら、蛍光色素プローブ法は、プローブが極めて高価であり、同一チャンネルを利用した同時検査は実質的に不可能であるという問題点があった。
【０００４】
実際、日本国内で発生する食中毒又は食品媒介感染症の病原菌は、発生頻度の高い上位８種で発生割合の９２％を占め、出現頻度はそれほど高くないものの更に１６種を加えた２４種類で実質的に１００％となる。これら２４種類の病原菌を識別するためのプローブを設計することは、金額の上からも現実的でなく、仮に用意したとしても、ＰＣＲの条件は個々の病原菌で異なるので、極端にいえば二十数回の（４チャンネルを用いた、インターナルコントロールを含むＴａｑＭａｎＰＣＲであっても８回の）ＰＣＲ増幅処理が必要となり、時間がかかってしまうという問題点があった。
【０００５】
ここで、食中毒が疑われる場合、最も重要視されるのはその再発防止であり、原因菌の絞り込みができれば対策が可能となるので、短時間に「あたり」をつけることが必要となる。したがって、実質的に時間のかかる蛍光色素プローブ法は効率的ではない、という問題点があった。
【０００６】
一方、サイバーグリーン法は、このような問題点はないが、ミスプライミング等に基づく蛍光が観測される場合があり、検出結果の信頼性に劣る場合があるという問題点があった。また、ＥＵのＩＳＯではプレートの各穴で反応が正常に進行していることを保証すべく、インターナルコントロール（内部標準：ＩＡＣ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌ））を加えることが定められ、信頼性を向上させているが、サルモネラ菌や腸炎ビブリオなどの特定の食中毒菌の検証用のＩＡＣしか存在せず、どれが原因菌となっているかの特定には時間がかかるという問題点は依然として存在していた。換言すれば、網羅的に短時間で原因菌をスクリーニングする技術が依然として求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００８−４８６７０号公報
【特許文献２】特開２００７−２７４９３４号公報
【０００８】
【非特許文献１】Hiroshi Fukushima, et al, 'Duplex Real Time SYBR Green PCR Assaysfor Detection of 17 Species of Food- or Waterborne Patholgens in Stools' Journal of Clinical Microbiology,Vol.41, No.11, (2003)
【非特許文献２】福島博ら「リアルタイムＰＣＲ法による食中毒菌の迅速スクリーニングの検討」感染症学雑誌、第７９巻 第９号 （平成１７年）
【非特許文献３】Haukur Gudnason1, et al, 'Comparison of multiple DNA dyes forreal-time PCR: effects of dye concentration and sequence composition on DNAamplification and melting temperature' Nucleic Acids Research, Vol. 35, No. 19, (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
すなわち、解決しようとする問題点は、迅速、簡便、安価に食品媒介病原菌を網羅的にスクリーニングする点である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
請求項１に記載の食品媒介病原菌検査方法は、複数種類の食品媒介病原菌それぞれにおける所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組、および、蛍光インターカレータを、プレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注し、さらに、前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加し、これをリアルタイムＰＣＲによって増幅させた後、融解曲線分析をおこない、被験者に一定量を超えていずれかの食品媒介病原菌の保有が認められるかをスクリーニングすることを最も主要な特徴とする。
【００１１】
すなわち、請求項１に係る発明は、原因菌に依存せず、単色蛍光を観測するだけで複数の食中毒原因菌などの食品媒介病原菌のうちいずれに罹患しているかの迅速な同時スクリーニングが可能となる。より具体的には、Ｔｍ値が異なるようにプライマーを設計しているので、どの菌の量が多いか、また、その菌がどの程度存在するかを把握可能となり、また、ミスプライミング等が生じてもＴｍ値で検定するためスクリーニングの信頼性が向上する。また、複数人の被験者の同時検査が可能であるため、罹患の疑いがある被験者集団から、迅速な原因菌の特定を可能とする。換言すれば、本方法によれば、条件を均一化して複数の被験者から同時に複数の食品媒介病原菌をスクリーニング可能となる。なお、検出用ＤＮＡ断片は、株ないし種に特異的な遺伝子または病原に関連する遺伝子から選ばれるものであることはいうまでもない。
【００１２】
また、プライマーペアの組とは、食品媒介病原菌に対応した個々の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの集合をいい、たとえば、食品媒介病原菌が７種類ある場合には、７セットであることを意味する。Ｔｍ値とは、融解曲線分析により得られる融解温度をいう。蛍光インターカレータは、単色蛍光を発するインターカレータであれば特に限定されず、たとえば、後述するようにサイバーグリーンを挙げることができる。換言すれば、本発明は、単色蛍光を観測すれば足りるため、ＴａｑＭａｎプローブ法のように、マルチチャンネルを設ける必要がなく簡便に複数の食品媒介病原菌をスクリーニングできる技術といえる。
【００１３】
プレートないしチューブセットは、特に限定されず、たとえば、８×１２穴のプレートを挙げることができる。また、１穴に１種類ずつ添加する検出用ＤＮＡ断片とは、当該ＤＮＡ断片を含むＤＮＡであればよく、増幅される断片の前後に他のＤＮＡが一切ないものに限定されないものとする。なお、検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加するとは、陽性コントロールをとることを意味し、後述のインターナルコントロールを除いて、複数種類の検出用ＤＮＡ断片を同じ穴に添加しない（重複させない）ことを意味する。ここで、種類数分、とは、個数に限りのある穴を効率的に用いるため最低数を使用して、被験者の糞便液を添加する穴を残しておくという意であり、余裕がある場合には複数の穴に同一の検出用ＤＮＡ断片を添加する態様であっても良いものとする。同様に、人数分添加する、とは、穴に余裕がある場合には複数の穴に同一人の鋳型ＤＮＡを添加する態様であってもよい。
【００１４】
また、請求項２に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項１に記載の食品媒介病原菌検査方法において、プライマーペアの組と蛍光インターカレータに加えて、前記検出用ＤＮＡ断片のいずれのＴｍ値とも異なるＴｍ値をもつＤＮＡ断片を有するインターナルコントロールと、当該ＤＮＡ断片を増幅させるインターナルコントロール用プライマーペアと、をプレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注したことを主要な特徴とする。
【００１５】
すなわち、請求項２に係る発明は、ＰＣＲによる増幅が正常に行われているかの検証が容易となり、また、食品媒介病原菌の定量評価の信頼性を向上させることが可能となる。詳細には、被験者の糞便中に所定量の食品媒介病原菌が存在すれば（罹患していれば）、融解曲線分析によって所定温度で２回の蛍光ピークが観測され、食品媒介病原菌が存在しなくてもＰＣＲが正常であれば、インターナルコントロールに基づく蛍光ピークが所定温度で観測されることとなる。なお、インターナルコントロールのＴｍ値と検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値とは、２．０℃以上、好ましくは、３．０℃以上離れていると、検証が容易となる。
【００１６】
また、請求項３に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項１または２に記載の食品媒介病原菌検査方法において、前記検出用ＤＮＡ断片と前記鋳型ＤＮＡのいずれをも含まず、前記プライマーペアの組、前記蛍光インターカレータ、前記インターナルコントロール用プライマーペア、および、調整水、または、前記プライマーペアの組、前記蛍光インターカレータ、前記インターナルコントロール用プライマーペア、および、前記インターナルコントロールからなる液が分注された区をプレートないしチューブセットに設けたことを主要な特徴とする。
【００１７】
すなわち、請求項３に係る発明は、陰性コントロールのみ、または、インターナルコントロールのみをとることによりＰＣＲによる増幅結果の信頼性を向上させる。なお、上記以外にも、ＤＮＡ以外であれば、色素や試薬などＰＣＲに必要な化合物等が添加されていることは制限されないものとする。
【００１８】
また、請求項４に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項１、２または３に記載の食品媒介病原菌検査方法において、蛍光インターカレータが、サイバーグリーンＢＥＢＯ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＯ−１３、または、ＳＹＴＯ−８２であることを主要な特徴とする。
【００１９】
すなわち、請求項４は、汎用かつ安価なスクリーニング方法を提供可能となる。
【００２０】
また、請求項５に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項１〜４のいずれか一つに記載の食品媒介病原菌検査方法において、プレートないしチューブセットを区画し、プライマーペアの組を、発生頻度の高い第１の食品媒介病原菌群から選んだ１種の特定の検出用ＤＮＡ断片と、発生頻度が第１の食品媒介病原菌よりは高くない第２の食品媒介病原菌群から選んだ１種または２種の食品媒介病原菌の特定の検出用ＤＮＡ断片と、をそれぞれ増幅させるように、かつ、食品媒介病原菌種がそれぞれ重複しないように、グループ化し、１区画１グループとなるように割り当ててプライマーペアの組を分注し、各区画に前記割り当てられたグループに係る前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、各区画の残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加したことを主要な特徴とする。
【００２１】
すなわち、請求項５に係る発明は、複数の被験者から同時にかつ効率的に複数の食品媒介病原菌を網羅的にスクリーニング可能となる。特に、発生頻度の高い食品媒介病原菌を１グループに１種類のみとしているので、原因菌の特定の信頼性が向上する。
【００２２】
なお、区画するとは、線引きしてある必要はなく、概念的に分かれていれば特に限定されない。プレートの場合は、たとえば、各列の１穴目を陰性コントロール(ＰＣＲグレード水)、２穴目をインターナルコントロールのみ、３穴目〜５穴目を陽性コントロール（＋インターナルコントロール）、６穴目を被験者１（＋インターナルコントロール）、７穴目を被験者２（＋インターナルコントロール）、・・・、とするようにする例を挙げることができる。
【００２３】
また、請求項６に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項５に記載の食品媒介病原菌検査方法において、第１の食品媒介病原菌群は、耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ、ウエルシュ菌、サルモネラ菌、カンピロバクター・ジェジュニ、黄色ブドウ球菌、嘔吐毒産生セレウス菌、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌、から選ばれた群であり、第２の食品媒介病原菌群は、カンピロバクター・コリー、ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌、下痢毒産生セレウス菌、赤痢菌、コレラ菌、プロビデンシア・アルカリファンシエンス、プレシオモナス・シゲロイデス、ＬＴ遺伝子保有大腸菌、リステア菌、ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ、ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌、ＳＴ遺伝子保有大腸菌、エルシニア菌、エロモナス菌、ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌、から選ばれた群であることを主要な特徴とする。
【００２４】
すなわち、請求項６に係る発明は、食中毒の疑いがある場合に、日本国内で発生し検討すべきであるところの食品媒介病原菌を実質的に１００％スクリーニング可能となる。
【００２５】
なお、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌とは、腸管出血性大腸菌や病原性大腸菌にその遺伝子保有が認められるものであり、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌およびａａｇＲ遺伝子保有大腸菌は、株が異なるもののいわゆる腸管凝集接着性大腸菌を指し、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌およびｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌は、株が異なるもののいわゆる腸管出血性大腸菌を指す。また、ＬＴ遺伝子保有大腸菌はＬＴ毒素産生大腸菌を、ＳＴ遺伝子保有大腸菌はＳＴ毒素産生大腸菌を示す。ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌とは、分散接着性大腸菌にその遺伝子保有が認められるものである。
【００２６】
また、請求項７に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項５または６に記載の食品媒介病原菌検査方法において、グループ内の検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値を互いに０．６℃以上離れるようにプライマーペアを設計したことを主要な特徴とする。
【００２７】
すなわち、請求項７に係る発明は、日本国内で報告事例のある主要な食品媒介病原菌を効率的かつ精度高く網羅的にスクリーニング可能となる。なお、０．６℃以上であれば融解曲線分析による曲線ピークに基づいて分離観測が可能であるが、１．０℃以上Ｔｍ値が離れていることが好ましい。
【００２８】
また、請求項８に記載の食品媒介病原菌検査方法は、請求項５または６に記載の食品媒介病原菌検査方法において、食品媒介病原菌が、耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３１および３２に示すものであり、カンピロバクター・コリーである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３３および３４に示すものであり、ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３５および３６に示すものであり、ウエルシュ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３７および３８に示すものであり、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１１に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３９および４０に示すものであり、下痢毒産生セレウス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１２に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４１および４２に示すものであり、サルモネラ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１３に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４３および４４に示すものであり、赤痢菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は１４であり、これに対するプライマーペアは配列番号４５および４６に示すものであり、コレラ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１５に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４７および４８であり、カンピロバクター・ジェジュニである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１６に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４９および５０に示すものであり、プロビデンシア・アルカリファンシエンスである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５１および５２に示すものであり、プレシオモナス・シゲロイデスである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５３および５４に示すものであり、黄色ブドウ球菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５５および５６に示すものであり、ＬＴ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５７および５８に示すものであり、リステア菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２１に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５９および６０に示すものに示すものであり、嘔吐毒産生セレウス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２２に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６１および６２に示すものであり、ＴＲＨ産生腸炎ビブリオである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２３に示すものに示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６３および６４に示すものであり、ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２４に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６５および６６に示すものであり、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２５に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６７および６８に示すものであり、ＳＴ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２６に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６９および７０に示すものであり、エルシニア菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７１および７２に示すものであり、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７３および７４に示すものであり、エロモナス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７５および７６に示すものであり、ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号３０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７７および７８に示すものであることを主要な特徴とする。
【００２９】
すなわち、請求項８に係る発明は、株ないし種に特異的な遺伝子または病原に関連する遺伝子を増幅するプライマーペアを用いて日本国内で報告事例のある主要な食品媒介病原菌を効率的かつ精度高く網羅的にスクリーニング可能となる。なお、これらの検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値は、およそ、７６℃〜９０℃に存在する。
【００３０】
また、請求項９に記載の発明は、請求項１〜８のいずれか一つに記載の食品媒介病原菌検査方法における、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のインターナルコントロールとしての使用であることを最も主要な特徴とする。
【００３１】
すなわち、請求項９に係る発明は、日本国内で報告事例のある主要な食品媒介病原菌を効率的かつ精度高く網羅的にスクリーニング可能となるインターナルコントロールを提供可能となる。Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉはニジマスの赤口病にしか見られない特徴的な遺伝子であり、人間の腸内に存在し得ないと考えられるので本方法におけるＩＡＣとして好適である。なお、このインターナルコントロール用のＤＮＡ断片としては、配列番号１に挙げるものがＴｍ＝８４．６℃±１．５℃であり、配列番号２に挙げるものがＴｍ＝７８．３℃±０．２℃である。よって、配列番号７〜３０に示した検出用ＤＮＡ断片とは、２℃〜６℃Ｔｍ値をずらすことができるので、ピークに基づく検出ないし検定が容易となる。
【００３２】
また、請求項１０に記載の発明は、融解曲線分析により食品媒介病原菌をスクリーニングするに際して使用するプライマーペアの組であって、増幅させるＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに０．６℃以上離れるように以下の群から選択した３ペア以上からなるプライマーペアの組であることを最も主要な特徴とする。その群とは、配列番号３１および３２に示すプライマーペア、配列番号３３および３４に示すプライマーペア、配列番号３５および３６に示すプライマーペア、配列番号３７および３８に示すプライマーペア、配列番号３９および４０に示すプライマーペア、配列番号４１および４２に示すプライマーペア、配列番号４３および４４に示すプライマーペア、配列番号４５および４６に示すプライマーペア、配列番号４７および４８に示すプライマーペア、配列番号４９および５０に示すプライマーペア、配列番号５１および５２に示すプライマーペア、配列番号５３および５４に示すプライマーペア、配列番号５５および５６に示すプライマーペア、配列番号５７および５８に示すプライマーペア、配列番号５９および６０に示すプライマーペア、配列番号６１および６２に示すプライマーペア、配列番号６３および６４に示すプライマーペア、配列番号６５および６６に示すプライマーペア、配列番号６７および６８に示すプライマーペア、配列番号６９および７０に示すプライマーペア、配列番号７１および７２に示すプライマーペア、配列番号７３および７４に示すプライマーペア、配列番号７５および７６に示すプライマーペア、配列番号７７および７８に示すプライマーペアである。
【００３３】
すなわち、請求項１０に係る発明は、株ないし種に特異的な遺伝子または病原に関連する遺伝子を増幅するプライマーペアを用いてリアルタイムＰＣＲにより、少なくとも３つの食品媒介病原菌を同時にスクリーニング可能となる。組合せにより、網羅的かつ効率的に迅速スクリーニングすることもできる。
【００３４】
また、請求項１１に記載の食品媒介病原菌スクリーニング用ＰＣＲプレートは、食中毒罹患の疑いのある複数の被験者から食品媒介病原菌をスクリーニングするための食品媒介病原菌スクリーニング用ＰＣＲプレートであって、発生頻度の高い第１の食品媒介病原菌群から選んだ１種と発生頻度が第１の食品媒介病原菌よりは高くない第２の食品媒介病原菌群から選んだ１種または２種により、食品媒介病原菌をそれぞれ重複しないように複数のグループに分け、プレートを区画して１区画１グループとなるように割り当て、プレートの各穴に、インターナルコントロールと、インターナルコントロール用プライマーペアと、蛍光インターカレータと、を分注し、さらに、グループ内の食品媒介病原菌それぞれの所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組を、当該グループに係る区画にそれぞれ分注し、かつ、各区画に当該区画に割り当てられたグループに係る前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、当該区画の残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加したことを最も主要な特徴とする。
【００３５】
すなわち、請求項１１に係る発明は、複数の被験者から同時にかつ効率的に複数の食品媒介病原菌を網羅的にスクリーニング可能となる。特に、発生頻度の高い食品媒介病原菌を１グループに１種類のみとしているので、原因菌の特定の信頼性が向上する。なお、このＰＣＲプレートには、請求項１〜１０に記載した各技術を適用できることはいうまでもない。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、迅速、簡便、安価に、食中毒菌を含み食品媒介病原菌を網羅的にスクリーニング可能となる。特に、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値を適正に選択しそのＤＮＡ断片（検出用ＤＮＡ断片）を増幅するプライマーペアの組をグループ化して分注することにより、国内で発生する食品媒介病原菌の実質的に総てを一括してリアルタイムＰＣＲによりスクリーニングすることが可能となる。
【００３７】
また、この一括してＰＣＲ反応させる場合に用いることが可能な、汎用的かつ信頼性の高いＩＡＣおよびＩＡＣプライマーペアを提供可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】９６穴（８×１２穴）ＰＣＲプレートの割り当てを示した図である。
【図２】ＰＣＲプロトコルを示した図である。
【図３】グループ１〜４について、陽性コントロールのサイクル数と蛍光強度との関係、および、融解曲線分析の結果を示した図である。
【図４】グループ５〜８について、陽性コントロールのサイクル数と蛍光強度との関係、および、融解曲線分析の結果を示した図である。
【図５】実際の食中毒が疑われた例の被験者の糞便液を用いてスクリーニングした融解曲線分析結果を示した図である。
【図６】図５の一部拡大図である。
【図７】実際の食中毒が疑われた別の例の被験者の糞便液を用いてスクリーニングした融解曲線分析結果を示した図である。
【図８】図７の一部拡大図である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、本発明の実施の形態を図表を参照しながら詳細に説明する。
ここでは、８×１２穴（＝９６穴）のＰＣＲプレートを用いた２４種類の食品媒介病原菌のスクリーニング方法について説明する。なお、ここでは、説明の便宜上、株レベルで異なる菌も１（種）として表記するものとする。
プレートは、１列分の１２穴を一区画と考え、これを１グループとして、計８グループのスクリーニングをおこなう。１グループで３種類の食品媒介病原菌をスクリーニングし計２４種類の判別をおこなう。
【００４０】
日本で発生する食中毒は次の２４種類のいずれかの食品媒介病原菌であるといえる。ここでは、発生頻度の高い８種類を一つずつ各グループに割り当て、発生頻度の高くない１６種類の内の２種類ずつを各グループに割り当て、検出の効率化を図る。発生頻度の高い群と高くない群を次に示す。なお、括弧書きは、本願において必要に応じて用いる簡略表記とする。
【００４１】
（１）発生頻度の高い群
耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ（ＴＤＨ）、ウエルシュ菌、サルモネラ菌、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃｊ）、黄色ブドウ球菌、嘔吐毒産生セレウス菌（ＥＭＢｃ）、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌（ＥＨＥＣ）、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌（ＡＳＴ）
（２）発生頻度の高くない群
カンピロバクター・コリー（Ｃｃ）、ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌（ＥＡＥＣ）、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌（Ｓ１）、下痢毒産生セレウス菌（ＥＮＢｃ）、赤痢菌、コレラ菌、プロビデンシア・アルカリファンシエンス（Ｐａ）、プレシオモナス・シゲロイデス（Ｐｓ）、ＬＴ遺伝子保有大腸菌（ＬＴ）、リステア菌、ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ（ＴＲＨ）、ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌（Ｓ２）、ＳＴ遺伝子保有大腸菌（ＳＴ）、エルシニア菌、エロモナス菌、ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌（ＤＡＥＣ）
【００４２】
本願発明者は、鋭意検討の結果、これらの食品媒介病原菌のそれぞれについて、株ないし種に特異的な遺伝子または病原に関連する遺伝子の特定のＤＮＡ断片であって、その融解温度Ｔｍがグループ内で互いに分別可能な程度に異なるＤＮＡ断片と、このＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅させるプライマーペアと、を設計することに成功した。加えて、共通すなわち汎用のインターナルコントロール用のＤＮＡ断片およびそのプライマーペアを設計することに成功した。
【００４３】
＜インターナルコントロール：ＩＡＣ＞
インターナルコントロール（ＩＡＣ）は、鋭意検討の結果、Yersinia ruckeriの標的遺伝子１６ＳｒＲＮＡ（アクセッション番号Ｘ７５２７５）を採用することとした。これは、ニジマスの赤口病にのみ見られる遺伝子であって、人間の腸管内には存在しないためＩＡＣとして好適である。
【００４４】
後述の食品媒介病原菌の検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値は７６℃〜９０℃にあって、比較的低温側にあるものが多く、比較的高温側（８４℃以上）にあるものが３種である。したがって、ＩＡＣとしては、Ｔｍ値が低い検出用ＤＮＡ断片の場合には、Ｔｍ値の高いＤＮＡ断片を増幅するプライマーを、Ｔｍ値が高い検出用ＤＮＡ断片の場合には、Ｔｍ値の低いＤＮＡ断片を増幅するプライマーを設計した。
【００４５】
鋭意検討の結果、ＩＡＣの４７番目〜１１９番目のＤＮＡ断片（配列番号１）が、Ｔｍ＝８４．６℃（±１．５℃）であり、４２６番目〜４９３番目のＤＮＡ断片（配列番号２）が、Ｔｍ＝７８．３℃（±０．２℃）であることが分かった。よって、これらを増幅するプライマーを設計した。なお、前者を増幅するプライマーペア（以降ｙｅｒｓ８５と表記するものとする）のうち、センスプライマーを配列番号３にアンチセンスプライマーを配列番号４に示し、後者を増幅するプライマーペア（以降ｙｅｒｓ７８と表記するものとする）のうち、センスプライマーを配列番号５にアンチセンスプライマーを配列番号６に示した。
【００４６】
＜食中毒菌の検出用ＤＮＡ断片の設定およびそのプライマーペア＞
ＩＡＣの設計にあわせて、検出用ＤＮＡ断片とそのプライマーペアとを設計した。設計にあたっては、Ｔｍ値が７６℃〜９０℃までに分散し、グループ内でできるだけ１．０℃以上Ｔｍ値が異なるようにした。なお、融解曲線分析に際しては測定機器にも依存するが、０．６℃以上Ｔｍ値が離れていれば、分離観察が可能となる。鋭意検討の結果、次の検出用ＤＮＡ断片を決定した。
【００４７】
種名：標的遺伝子（アクセッション番号）：検出用ＤＮＡ断片のロケーション（配列番号）：Ｔｍ値の順に表記する。
・耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ：tdh（X54341）：264-498（配列番号７）:８１．０℃±０．３℃
・カンピロバクター・コリー：ceuE（X88849）：3513-3603（配列番号８）：７７．１℃±０．３℃
・ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌：aggR（Z18751）：358-454（配列番号９）：７８．４℃±０．８℃
・ウエルシュ菌：cpe（X81849）：583-736（配列番号１０）：７７．４℃±０．３℃
・ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌：stx1（EF441598）：415-509（配列番号１１）８０．８℃±０．３℃
・下痢毒産生セレウス菌：nheB（DQ153257）：2101-2252：（配列番号１２）:８１．４℃±０．２℃
・サルモネラ菌：invA（M90846）：167-285（配列番号１３）：８０．２℃±０．２℃
・赤痢菌：virA（D26468）：468-552（配列番号１４）：７９．０℃±０．３℃
・コレラ菌：ompW（X51948）：675-763（配列番号１５）：８１．８℃±０．３℃
・カンピロバクター・ジェジュニ：C. jejuni-specific DNA（AL111168）：381121-381206（配列番号１６）：７９．１℃±０．３℃
・プロビデンシア・アルカリファンシエンス：gyrB（AJ300547）：38-110（配列番号１７）：８０．２℃±０．２℃
・プレシオモナス・シゲロイデス：gyrB（AJ300545）：237-304（配列番号１８）：８２．２℃±０．３℃
・黄色ブドウ球菌：femB（AF106850）：277-370（配列番号１９）：８２．４℃±０．３℃
・ＬＴ遺伝子保有大腸菌：lt（S60731）：320-452（配列番号２０）：７８．０℃±０．４℃
・リステア菌：hly（EU372057）：3152-3257（配列番号２１）：７９．３℃±０．３℃
・嘔吐毒産生セレウス菌：ces（DQ360825）：8689-8793（配列番号２２）：７９．７℃±１．０℃
・ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ：trh（AY742213）：180-263（配列番号２３）：７８．７℃±１．７℃
・ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌：stx2（EF441616）：140-247（配列番号２４）：８１．９℃±０．８℃
・ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌：eaeA（Z11541）：899-1000（配列番号２５）：７９．６℃±０．２℃
・ＳＴ遺伝子保有大腸菌：st（M25607）：294-483（配列番号２６）:７７．６℃±０．３℃
・エルシニア菌：yadA（X13882）：1465-1564（配列番号２７）：８１．４℃±０．３℃
・ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌：astA（L11241）：63-168（配列番号２８）：８４．６℃±０．３℃
・エロモナス菌：ahh1（CP000462）：1653360-1653492（配列番号２９）：８８．９℃±０．２℃
・ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌：daaD（AF233530）：55-190（配列番号３０）：８９．９℃±０．２℃
【００４８】
次に、検出用ＤＮＡ断片に対するプライマーペアを記す。
種名：プライマーペアの配列番号：プライマーペアに対して付した識別名、の順に表記する。
・耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオのプライマーペア：配列番号３１および配列番号３２：tdh
・カンピロバクター・コリーのプライマーペア：配列番号３３および配列番号３４：CCceuE
・ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号３５および配列番号３６：aggR
・ウエルシュ菌のプライマーペア：配列番号３７および配列番号３８：GAP
・ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号３９および配列番号４０：JMS1
・下痢毒産生セレウス菌のプライマーペア：配列番号４１および配列番号４２：SG
・サルモネラ菌のプライマーペア：配列番号４３および配列番号４４：Styinva
・赤痢菌のプライマーペア：配列番号４５および配列番号４６：virA
・コレラ菌のプライマーペア：配列番号４７および配列番号４８：ompW
・カンピロバクター・ジェジュニのプライマーペア：配列番号４９および配列番号５０：AB
・プロビデンシア・アルカリファンシエンスのプライマーペア：配列番号５１および配列番号５２：PAG
・プレシオモナス・シゲロイデスのプライマーペア：配列番号５３および配列番号５４：PSG
・黄色ブドウ球菌のプライマーペア：配列番号５５および配列番号５６：FemB
・ＬＴ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号５７および配列番号５８：LT
・リステア菌：hly（EU372057）のプライマーペア：配列番号５９および配列番号６０：hly
・嘔吐毒産生セレウス菌のプライマーペア：配列番号６１および配列番号６２：ces
・ＴＲＨ産生腸炎ビブリオのプライマーペア：配列番号６３および配列番号６４：trh
・ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号６５および配列番号６６：JMS2
・ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号６７および配列番号６８：eaeA
・ＳＴ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号６９および配列番号７０：STa
・エルシニア菌のプライマーペア：配列番号７１および配列番号７２：yadA
・ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号７３および配列番号７４：EAST
・エロモナス菌のプライマーペア：配列番号７５および配列番号７６：AHH1
・ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌のプライマーペア：配列番号７７および配列番号７８：daaD
【００４９】
＜食中毒菌のグループ分け＞
Ｔｍ値と発生頻度の高い原因菌とに基づいて、グループ分けは以下のとおりとした。
・グループ１：耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ（TDH positive Vibrio parahaemolyticus）、
カンピロバクター・コリー（Campylobacter coli）、
ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌（EAEC）
・グループ２：ウエルシュ菌（Clostridium perfringens）、
ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌（EHEC (stx 1)）、
下痢毒産生セレウス菌（Enterotoxigenic B. cereus）
・グループ３：サルモネラ菌（Salmonella spp.）、
赤痢菌（Shigella）、
コレラ菌（V. cholerae）
・グループ４：カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、
プロビデンシア・アルカリファンシエンス（Providencia alcalifaciens）、
プレシオモナス・シゲロイデス（Plesiomonas shigelloides）
・グループ５：黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、
ＬＴ遺伝子保有大腸菌（ETEC (LT)）、
リステア菌（Listeria monocytogenes）
・グループ６：嘔吐毒産生セレウス菌（Emetic Bacillus cereus）、
ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ（TRH positive Vibrio parahaemolyticus）、
ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌（EHEC (stx 2)）
・グループ７：ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌（EHEC and EPEC）、
ＳＴ遺伝子保有大腸菌（ETEC (ST)）、
エルシニア菌（Y.enterocolitica and Y.pseudotuberculosis）
・グループ８：ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌（EAEC）、
エロモナス菌（Aeromonas hydrophila）、
ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌（DAEC）
【００５０】
このグループ分けにより、各グループ内ではＴｍ値が互いに０．６℃以上離れることとなり、融解曲線分析によるＴｍ値の分離が可能となる。また、ＩＡＣに関しては、グループ１〜グループ７についてはｙｅｒｓ８５を加え、グループ８についてはｙｅｒｓ７８を加えてＰＣＲ反応させることにより、ＩＡＣのＴｍ値をグループ内の検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値とも２℃〜６℃離すことができる。よって、このグループ分けにより、インターナルコントロールをとりながら分解能よく原因菌をスクリーニングできることとなる。
【００５１】
なお、グループ分けはこの例に限らず、ＩＡＣも含めてＴｍ値のピークが分離して評価可能な程度に離れていればよい。このとき、各グループに出現頻度の高いものを１種ずつ分配するようにするのが好ましい。
【００５２】
ＰＣＲプレートの各列の１２穴は、ＩＡＣのプライマーペア＋当該グループのプライマーペアの組＋蛍光インターカレータを添加し、各穴には、陰性コントロール、陽性コントロール、被験者の糞便液（検体）を順次添加する。第１列目にグループ１を割り当てた例で説明すると、添加するプライマーペアの組は、CCceuE＋aggR-Z＋tdhであり、これとyers85を１２穴総てに添加する。そして、第１穴〜第１２穴までは、以下を添加する。
【００５３】
第１穴：水
第２穴：ＩＡＣ
第３穴：カンピロバクター・コリーの鋳型ＤＮＡ＋ＩＡＣ
第４穴：ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌の鋳型ＤＮＡ＋ＩＡＣ
第５穴：耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオの鋳型ＤＮＡ＋ＩＡＣ
第６穴：被験者１の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体１）＋ＩＡＣ
第７穴：被験者２の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体２）＋ＩＡＣ
第８穴：被験者３の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体３）＋ＩＡＣ
第９穴：被験者４の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体４）＋ＩＡＣ
第１０穴：被験者５の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体５）＋ＩＡＣ
第１１穴：被験者６の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体６）＋ＩＡＣ
第１２穴：被験者７の糞便からの鋳型ＤＮＡ（検体７）＋ＩＡＣ
【００５４】
第２列〜第８列には、同様にグループ２〜グループ８を割り当てる。図１に全９６穴の割り当てを示す。図示したように、２４種類の原因菌のスクリーニングが１プレートで可能となる。第６穴〜第１２穴は、被験者１〜被験者７の糞便からの鋳型ＤＮＡを分注する。病院等では嘔吐や腹痛等を訴える者が同時期に集中することを契機として食中毒を疑うので、７検体もあればスクリーニングとしては十分有用である。
【実施例１】
【００５５】
次に、実際に検体を用いた例を説明する。
使用するＰＣＲ装置は、ＡＢＩ７５００（ＡＢＩ社）とし、反応サイクルは、図２のとおりのプロトコルとした。Ｓｔａｇｅ３で融解曲線分析をおこなう。このプロトコルから分かるように、本発明では、約２時間以内という短時間で２４種類の原因菌のスクリーニングが可能である。
【００５６】
各穴（反応チューブ）には、合計５０μリットルの反応液となるように、表１のとおりの調合とした。
【表１】
【００５７】
サイバーグリーンは、ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（タカラバイオ社製）を用いた。ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅは、上記サイバーグリーンに添付の色素である。なお、検出用ＤＮＡ断片の濃度およびＩＡＣの濃度は、ＰＣＲのサイクル回数の終盤で蛍光強度が立ち上がるように予め調整しておく。具体的には、陽性コントロールは２０サイクル前後から蛍光観測がされるように、また、ＩＡＣは、２７サイクル前後で蛍光観測がされるように調整しておく。実際に濃度調整した場合の陽性コントロールの蛍光強度と融解曲線分析結果を図３および図４に示す。
【００５８】
また、被験者７人の糞便液はそれぞれの１０倍希釈液からQIAamp DNA stool Mini Kit（キアゲン社製）により鋳型ＤＮＡを抽出し、反応チューブ内の当該ＤＮＡ濃度が糞便１ｇ中の濃度の１／１００００となるように調整した。これは、常在菌が検出されない濃度である。
【００５９】
実際のスクリーニング例を説明する。島根県内Ａ地区で起きた食中毒が疑われたケースにおいて、被験者番号３１〜３７の７名の糞便液をスクリーニングした。結果を図５に示す。また、図６は、グループ２およびグループ４の拡大図である。図から明らかなように、総ての被験者にウエルシュ菌の保有が見られ、また、被験者３３および被験者３５には、カンピロバクター・ジェジュニの保有が見られる。よって、食中毒が発生しており、原因菌はこれらであることが推定できた。
【００６０】
同様に、島根県Ｂ地区で起きた食中毒が疑われたケースにおいて、被験者番号７１〜７７の７名の糞便液をスクリーニングした。結果を図７に示す。また、図８は、グループ４およびグループ８の拡大図である。図から明らかなように、被験者７１，７３，７４，７５にカンピロバクター・ジェジュニの保有が見られ、また、被験者７１には、ａｓｔＡ陽性大腸菌の保有が見られる。よって、食中毒が発生しており、原因菌はこれらであることが推定できた。
【００６１】
以上説明したように、本発明によれば、迅速、簡便、安価に食中毒菌を網羅的にスクリーニング可能となる。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
また、このスクリーニング用のＰＣＲプレートは適宜凍結乾燥しておくことにより、検査時に第１穴〜第５穴にＰＣＲグレード水、第６穴〜第１２穴に被験者の鋳型ＤＮＡを分注して使用しても良い。また、ＰＣＲプレートでなく、プライマーペアの組を凍結又は凍結乾燥しておいても良い。この組は、随意の組合せとすることができるが、たとえば、増幅させるＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに０．６℃以上離れるように上述の２４ペアから選択した３ペア以上の組としてもよい。凍結を−２０℃で行ったところ、４回の凍結融解後でも検出用ＤＮＡ断片を正常に増幅できることを確認している。なお、サイバーグリーンや必要な試薬も添加したものを凍結してもよい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数種類の食品媒介病原菌それぞれにおける所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組、および、蛍光インターカレータを、プレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注し、
さらに、
前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、
残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加し、
これをリアルタイムＰＣＲによって増幅させた後、融解曲線分析をおこない、被験者に一定量を超えていずれかの食品媒介病原菌の保有が認められるかをスクリーニングすることを特徴とする食品媒介病原菌検査方法。
【請求項２】
プライマーペアの組と蛍光インターカレータに加えて、
前記検出用ＤＮＡ断片のいずれのＴｍ値とも異なるＴｍ値をもつＤＮＡ断片を有するインターナルコントロールと、当該ＤＮＡ断片を増幅させるインターナルコントロール用プライマーペアと、
をプレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注したことを特徴とする請求項１に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項３】
前記検出用ＤＮＡ断片と前記鋳型ＤＮＡのいずれをも含まず、
前記プライマーペアの組、前記蛍光インターカレータ、前記インターナルコントロール用プライマーペア、および、調整水、または、
前記プライマーペアの組、前記蛍光インターカレータ、前記インターナルコントロール用プライマーペア、および、前記インターナルコントロールからなる液が分注された区をプレートないしチューブセットに設けたことを特徴とする請求項１または２に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項４】
蛍光インターカレータが、サイバーグリーン、ＢＥＢＯ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＯ−１３、または、ＳＹＴＯ−８２であることを特徴とする請求項１、２または３に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項５】
プレートないしチューブセットを区画し、
プライマーペアの組を、発生頻度の高い第１の食品媒介病原菌群から選んだ１種の特定の検出用ＤＮＡ断片と、発生頻度が第１の食品媒介病原菌よりは高くない第２の食品媒介病原菌群から選んだ１種または２種の食品媒介病原菌の特定の検出用ＤＮＡ断片と、をそれぞれ増幅させるように、かつ、食品媒介病原菌種がそれぞれ重複しないように、グループ化し、
１区画１グループとなるように割り当ててプライマーペアの組を分注し、
各区画に前記割り当てられたグループに係る前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、
各区画の残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加したことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項６】
第１の食品媒介病原菌群は、耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ、ウエルシュ菌、サルモネラ菌、カンピロバクター・ジェジュニ、黄色ブドウ球菌、嘔吐毒産生セレウス菌、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌、から選ばれた群であり、
第２の食品媒介病原菌群は、カンピロバクター・コリー、ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌、下痢毒産生セレウス菌、赤痢菌、コレラ菌、プロビデンシア・アルカリファンシエンス、プレシオモナス・シゲロイデス、ＬＴ遺伝子保有大腸菌、リステア菌、ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ、ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌、ＳＴ遺伝子保有大腸菌、エルシニア菌、エロモナス菌、ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌、から選ばれた群であることを特徴とする請求項５に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項７】
グループ内の検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値を互いに０．６℃以上離れるようにプライマーペアを設計したことを特徴とする請求項５または６に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項８】
食品媒介病原菌が、
耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３１および３２に示すものであり、
カンピロバクター・コリーである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３３および３４に示すものであり、
ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３５および３６に示すものであり、
ウエルシュ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３７および３８に示すものであり、
ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１１に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３９および４０に示すものであり、
下痢毒産生セレウス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１２に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４１および４２に示すものであり、
サルモネラ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１３に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４３および４４に示すものであり、
赤痢菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は１４であり、これに対するプライマーペアは配列番号４５および４６に示すものであり、
コレラ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１５に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４７および４８であり、
カンピロバクター・ジェジュニである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１６に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４９および５０に示すものであり、
プロビデンシア・アルカリファンシエンスである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５１および５２に示すものであり、
プレシオモナス・シゲロイデスである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５３および５４に示すものであり、
黄色ブドウ球菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５５および５６に示すものであり、
ＬＴ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５７および５８に示すものであり、
リステア菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２１に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５９および６０に示すものに示すものであり、
嘔吐毒産生セレウス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２２に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６１および６２に示すものであり、
ＴＲＨ産生腸炎ビブリオである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２３に示すものに示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６３および６４に示すものであり、
ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２４に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６５および６６に示すものであり、
ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２５に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６７および６８に示すものであり、
ＳＴ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２６に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６９および７０に示すものであり、
エルシニア菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７１および７２に示すものであり、
ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７３および７４に示すものであり、
エロモナス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７５および７６に示すものであり、
ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号３０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７７および７８に示すものであることを特徴とする請求項５または６に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一つに記載の食品媒介病原菌検査方法における、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のインターナルコントロールとしての使用。
【請求項１０】
融解曲線分析により食品媒介病原菌をスクリーニングするに際して使用するプライマーペアの組であって、増幅させるＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに０．６℃以上離れるように以下の群から選択した３ペア以上からなるプライマーペアの組。
配列番号３１および３２に示すプライマーペア、配列番号３３および３４に示すプライマーペア、配列番号３５および３６に示すプライマーペア、配列番号３７および３８に示すプライマーペア、配列番号３９および４０に示すプライマーペア、配列番号４１および４２に示すプライマーペア、配列番号４３および４４に示すプライマーペア、配列番号４５および４６に示すプライマーペア、配列番号４７および４８に示すプライマーペア、配列番号４９および５０に示すプライマーペア、配列番号５１および５２に示すプライマーペア、配列番号５３および５４に示すプライマーペア、配列番号５５および５６に示すプライマーペア、配列番号５７および５８に示すプライマーペア、配列番号５９および６０に示すプライマーペア、配列番号６１および６２に示すプライマーペア、配列番号６３および６４に示すプライマーペア、配列番号６５および６６に示すプライマーペア、配列番号６７および６８に示すプライマーペア、配列番号６９および７０に示すプライマーペア、配列番号７１および７２に示すプライマーペア、配列番号７３および７４に示すプライマーペア、配列番号７５および７６に示すプライマーペア、配列番号７７および７８に示すプライマーペア
【請求項１１】
食中毒罹患の疑いのある複数の被験者から食品媒介病原菌をスクリーニングするための食品媒介病原菌スクリーニング用ＰＣＲプレートであって、
発生頻度の高い第１の食品媒介病原菌群から選んだ１種と発生頻度が第１の食品媒介病原菌よりは高くない第２の食品媒介病原菌群から選んだ１種または２種により、食品媒介病原菌をそれぞれ重複しないように複数のグループに分け、
プレートを区画して１区画１グループとなるように割り当て、
プレートの各穴に、インターナルコントロールと、インターナルコントロール用プライマーペアと、蛍光インターカレータと、を分注し、
さらに、
グループ内の食品媒介病原菌それぞれの所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組を、当該グループに係る区画にそれぞれ分注し、
かつ、
各区画に当該区画に割り当てられたグループに係る前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、
当該区画の残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加したことを特徴とする食品媒介病原菌スクリーニング用ＰＣＲプレート。
【請求項１】
複数種類の食品媒介病原菌それぞれにおける所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組、および、蛍光インターカレータを、プレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注し、
さらに、
前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、
残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加し、
これをリアルタイムＰＣＲによって増幅させた後、融解曲線分析をおこない、被験者に一定量を超えていずれかの食品媒介病原菌の保有が認められるかをスクリーニングすることを特徴とする食品媒介病原菌検査方法。
【請求項２】
プライマーペアの組と蛍光インターカレータに加えて、
前記検出用ＤＮＡ断片のいずれのＴｍ値とも異なるＴｍ値をもつＤＮＡ断片を有するインターナルコントロールと、当該ＤＮＡ断片を増幅させるインターナルコントロール用プライマーペアと、
をプレートないしチューブセットのそれぞれの穴に分注したことを特徴とする請求項１に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項３】
前記検出用ＤＮＡ断片と前記鋳型ＤＮＡのいずれをも含まず、
前記プライマーペアの組、前記蛍光インターカレータ、前記インターナルコントロール用プライマーペア、および、調整水、または、
前記プライマーペアの組、前記蛍光インターカレータ、前記インターナルコントロール用プライマーペア、および、前記インターナルコントロールからなる液が分注された区をプレートないしチューブセットに設けたことを特徴とする請求項１または２に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項４】
蛍光インターカレータが、サイバーグリーン、ＢＥＢＯ、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ−９、ＳＹＴＯ−１３、または、ＳＹＴＯ−８２であることを特徴とする請求項１、２または３に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項５】
プレートないしチューブセットを区画し、
プライマーペアの組を、発生頻度の高い第１の食品媒介病原菌群から選んだ１種の特定の検出用ＤＮＡ断片と、発生頻度が第１の食品媒介病原菌よりは高くない第２の食品媒介病原菌群から選んだ１種または２種の食品媒介病原菌の特定の検出用ＤＮＡ断片と、をそれぞれ増幅させるように、かつ、食品媒介病原菌種がそれぞれ重複しないように、グループ化し、
１区画１グループとなるように割り当ててプライマーペアの組を分注し、
各区画に前記割り当てられたグループに係る前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、
各区画の残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加したことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項６】
第１の食品媒介病原菌群は、耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオ、ウエルシュ菌、サルモネラ菌、カンピロバクター・ジェジュニ、黄色ブドウ球菌、嘔吐毒産生セレウス菌、ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌、ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌、から選ばれた群であり、
第２の食品媒介病原菌群は、カンピロバクター・コリー、ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌、ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌、下痢毒産生セレウス菌、赤痢菌、コレラ菌、プロビデンシア・アルカリファンシエンス、プレシオモナス・シゲロイデス、ＬＴ遺伝子保有大腸菌、リステア菌、ＴＲＨ産生腸炎ビブリオ、ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌、ＳＴ遺伝子保有大腸菌、エルシニア菌、エロモナス菌、ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌、から選ばれた群であることを特徴とする請求項５に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項７】
グループ内の検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値を互いに０．６℃以上離れるようにプライマーペアを設計したことを特徴とする請求項５または６に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項８】
食品媒介病原菌が、
耐熱性溶血毒産生腸炎ビブリオである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３１および３２に示すものであり、
カンピロバクター・コリーである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３３および３４に示すものであり、
ａａｇＲ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３５および３６に示すものであり、
ウエルシュ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３７および３８に示すものであり、
ｓｔｘ１遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１１に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号３９および４０に示すものであり、
下痢毒産生セレウス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１２に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４１および４２に示すものであり、
サルモネラ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１３に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４３および４４に示すものであり、
赤痢菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は１４であり、これに対するプライマーペアは配列番号４５および４６に示すものであり、
コレラ菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１５に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４７および４８であり、
カンピロバクター・ジェジュニである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１６に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号４９および５０に示すものであり、
プロビデンシア・アルカリファンシエンスである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５１および５２に示すものであり、
プレシオモナス・シゲロイデスである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５３および５４に示すものであり、
黄色ブドウ球菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号１９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５５および５６に示すものであり、
ＬＴ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５７および５８に示すものであり、
リステア菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２１に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号５９および６０に示すものに示すものであり、
嘔吐毒産生セレウス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２２に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６１および６２に示すものであり、
ＴＲＨ産生腸炎ビブリオである場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２３に示すものに示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６３および６４に示すものであり、
ｓｔｘ２遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２４に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６５および６６に示すものであり、
ｅａｅＡ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２５に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６７および６８に示すものであり、
ＳＴ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２６に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号６９および７０に示すものであり、
エルシニア菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２７に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７１および７２に示すものであり、
ａｓｔＡ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２８に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７３および７４に示すものであり、
エロモナス菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号２９に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７５および７６に示すものであり、
ｄａａＤ遺伝子保有大腸菌である場合には、検出用ＤＮＡ断片は配列番号３０に示すものであり、これに対するプライマーペアは配列番号７７および７８に示すものであることを特徴とする請求項５または６に記載の食品媒介病原菌検査方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一つに記載の食品媒介病原菌検査方法における、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｒｕｃｋｅｒｉの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のインターナルコントロールとしての使用。
【請求項１０】
融解曲線分析により食品媒介病原菌をスクリーニングするに際して使用するプライマーペアの組であって、増幅させるＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに０．６℃以上離れるように以下の群から選択した３ペア以上からなるプライマーペアの組。
配列番号３１および３２に示すプライマーペア、配列番号３３および３４に示すプライマーペア、配列番号３５および３６に示すプライマーペア、配列番号３７および３８に示すプライマーペア、配列番号３９および４０に示すプライマーペア、配列番号４１および４２に示すプライマーペア、配列番号４３および４４に示すプライマーペア、配列番号４５および４６に示すプライマーペア、配列番号４７および４８に示すプライマーペア、配列番号４９および５０に示すプライマーペア、配列番号５１および５２に示すプライマーペア、配列番号５３および５４に示すプライマーペア、配列番号５５および５６に示すプライマーペア、配列番号５７および５８に示すプライマーペア、配列番号５９および６０に示すプライマーペア、配列番号６１および６２に示すプライマーペア、配列番号６３および６４に示すプライマーペア、配列番号６５および６６に示すプライマーペア、配列番号６７および６８に示すプライマーペア、配列番号６９および７０に示すプライマーペア、配列番号７１および７２に示すプライマーペア、配列番号７３および７４に示すプライマーペア、配列番号７５および７６に示すプライマーペア、配列番号７７および７８に示すプライマーペア
【請求項１１】
食中毒罹患の疑いのある複数の被験者から食品媒介病原菌をスクリーニングするための食品媒介病原菌スクリーニング用ＰＣＲプレートであって、
発生頻度の高い第１の食品媒介病原菌群から選んだ１種と発生頻度が第１の食品媒介病原菌よりは高くない第２の食品媒介病原菌群から選んだ１種または２種により、食品媒介病原菌をそれぞれ重複しないように複数のグループに分け、
プレートを区画して１区画１グループとなるように割り当て、
プレートの各穴に、インターナルコントロールと、インターナルコントロール用プライマーペアと、蛍光インターカレータと、を分注し、
さらに、
グループ内の食品媒介病原菌それぞれの所定の検出用ＤＮＡ断片を増幅させるプライマーペアの組であって、検出用ＤＮＡ断片のＴｍ値が互いに異なるように設計されたプライマーペアの組を、当該グループに係る区画にそれぞれ分注し、
かつ、
各区画に当該区画に割り当てられたグループに係る前記検出用ＤＮＡ断片を１穴に１種類ずつ種類数分添加し、
当該区画の残余の穴には被験者の糞便液から抽出した鋳型ＤＮＡを１穴に１人分ずつ人数分添加したことを特徴とする食品媒介病原菌スクリーニング用ＰＣＲプレート。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【公開番号】特開２０１０−２４６４１９（Ｐ２０１０−２４６４１９Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９６６３３（Ｐ２００９−９６６３３）
【出願日】平成２１年４月１３日（２００９．４．１３）
【出願人】（５９１２８２２０５）島根県 (122)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１３日（２００９．４．１３）
【出願人】（５９１２８２２０５）島根県 (122)
【Ｆターム（参考）】
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