リアルタイムＰＣＲ装置
【課題】反応領域に対する励起光の照射を高精度に制御できるリアルタイムＰＣＲ装置を提供すること。
【解決手段】遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置１であって、複数の反応領域Ａ１と、前記反応領域Ａ１を加熱する加熱部１４と、前記反応領域Ａ１ごとに複数設けられ、個別に励起光Ｌ１を発する光源と、前記反応領域Ａ１から蛍光Ｌ２を検出する蛍光検出部１５と、を少なくとも備えたリアルタイムＰＣＲ装置１とすること。
【解決手段】遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置１であって、複数の反応領域Ａ１と、前記反応領域Ａ１を加熱する加熱部１４と、前記反応領域Ａ１ごとに複数設けられ、個別に励起光Ｌ１を発する光源と、前記反応領域Ａ１から蛍光Ｌ２を検出する蛍光検出部１５と、を少なくとも備えたリアルタイムＰＣＲ装置１とすること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置に関する。より詳細には遺伝子発現等を解析するリアルタイムＰＣＲ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイをはじめとするハイブリダイゼーション検出技術の実用化が進んでいる。ＤＮＡチップは、多種・多様のＤＮＡプローブを基板表面に集積して固定したものである。このＤＮＡチップを用いて、ＤＮＡチップ基板表面のハイブリダイゼーションを検出することにより、細胞・組織等における遺伝子発現等を網羅的に解析することができる。
【０００３】
そして、このマイクロアレイにより得られたデータを、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて検証することが微量核酸の定量分析の標準的手法となっている。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲ法は、「熱変性→プライマーとのアニーリング→ポリメラーゼ伸長反応」という増幅サイクルを連続的に行うことで、ＤＮＡ等を数十万倍にも増幅させることができる。このようにして得られるＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングして前記微量核酸の定量分析を行う方法である。
【０００５】
そして、リアルタイムＰＣＲ法では、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した専用の装置等を用いて前記ＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングすることができる。このような装置として、リアルタイムＰＣＲ装置がある。
【０００６】
リアルタイムＰＣＲ装置は、試料にて増幅反応が進行する際に励起光を照射することで蛍光信号をリアルタイムで検出することができる反応処理装置であり、化学反応を含め、医療現場や遺伝子解析の研究に用いられるゲノムＤＮＡの観測を行なう検出器等として使用することができる。
【０００７】
例えば、ＤＮＡを増幅するＰＣＲ法において、二本鎖ＤＮＡを特性する際に用いられる蛍光色素を標識した場合、その二本鎖ＤＮＡを加熱することで蛍光色素の変化を観察することができるが、リアルタイムＰＣＲには幾つかの検出方法がある。
【０００８】
例えば、特異性の高いプライマーにより目的のターゲットのみを増幅可能の場合には、ＳＹＢＲＲ ＧＲＥＥＮ Ｉを用いるインターカレーター法が用いられる。
【０００９】
二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発するインターカレーターは、ＰＣＲ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。ターゲットに特異的な蛍光標識プローブを設計・合成する必要がなく、簡便にさまざまなターゲットの測定に利用できる。
【００１０】
また、よく似た配列を区別して検出する必要や、ＳＮＰｓのタイピングのようにマルチプレックス検出が必要な場合には、プローブ法を用いる。その一つに５´末端を蛍光物質で、３´末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法がある。
【００１１】
ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光発光は抑制される。伸長反応ステップでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのもつ５´→３´エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発光される。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の生成量をモニターすることができる。
【００１２】
このような方法によって、遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲで定量する原理を以下に述べる。まず、段階希釈した濃度既知の標準サンプルを鋳型として使用してＰＣＲを行なう。そして、一定の増幅産物量に達するサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を求める。このＣｔ値を横軸に、初発のＤＮＡ量を縦軸にプロットして、検量線を作成する。
【００１３】
未知濃度のサンプルについても、同じ条件下でＰＣＲ反応を行ってＣｔ値を求める。この値と前述した検量線とから、サンプル中の目的のＤＮＡ量が測定できることになる。
【００１４】
そして、リアルタイムＰＣＲ装置に関する技術として、特許文献１や特許文献２には増幅反応時の温度制御等に関する技術が開示されている。
【００１５】
【特許文献１】特開２００３−２９８０６８号公報。
【特許文献２】特開２００４−０２５４２６号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
前記リアルタイムＰＣＲ装置は、遺伝子発現量の検出において定量性に優れているという利点を有する。しかし、一度に解析できるサンプル数が少なく、網羅的な解析ができないという問題がある。また、複数の反応領域（ウェル）等へ光照射を行なう場合、１つの光源を使用し導光板等によって励起光を各反応領域に照射するバックライト方式等によって行なわれるが、導光板等のたわみやキズ等が原因となり各反応領域に照射する励起光の光量等が均一でなくなる場合がある。また、各反応領域に対して選択的に光照射を制御することや、励起光の波長領域を反応領域ごとに選択できないといった問題等もある。
【００１７】
そこで、本発明では、反応領域に対する励起光照射を高精度に制御できるリアルタイムＰＣＲ装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置であって、複数の反応領域と、前記反応領域を加熱する加熱部と、前記反応領域ごとに複数設けられ、個別に励起光を発する発光素子と、前記反応領域から蛍光を検出する蛍光検出部と、を少なくとも備えたリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。反応領域ごとに光源である発光素子を設けることで、各反応領域に対して照射する励起光の光量や励起波長等を高精度に制御することができる。
そして、本発明は、前記発光素子を電気的に個別制御することにより、前記励起光の光量又は励起波長を制御するリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。発光素子にかける電圧や電流等を個別制御することで、各反応領域に照射する励起光の光量また励起波長を個別かつ高精度に制御できる。
続いて、本発明は、前記発光素子は少なくともＬＥＤ素子から構成され、前記発光素子をドットマトリクス状に配置した励起光走査基板を備えたリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。発光素子として、少なくともＬＥＤ素子を用い、かつ発光素子をドットマトリクス状に配置することで、各反応領域へ照射する励起光をより高精度に制御することができ、その結果より高精度な網羅的解析を行なうことができる。
さらに、本発明は、前記発光素子はアクティブマトリクス型の発光素子であり、各反応領域に異なる励起波長を有する光を照射可能なリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。かかる発光素子をアクティブ走査させることで、反応領域ごとに異なる励起波長の光を照射することができる。
また、本発明は、前記発光素子としてＥＬ素子を用いるリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。発光素子としてＥＬ素子を用いることで、励起光の照射を高精度に制御することができ、応答性に優れた解析を高精度に行なうことができる。
また、本発明は、前記発光素子と前記反応領域との間に、特定波長の光を透過するフィルターを備えるリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。かかるフィルターを設けることで前記反応領域に対して特定波長光のみを照射できるため、より高精度の解析を行なうことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置によれば、反応領域への励起光の照射を高精度に制御できる。
【００２０】
以下、本発明に係る方法の実施形態例について、添付図面を参照にしながら説明する。なお、図面に示された実施形態等は、本発明の好適な実施形態を例示したものであり、これにより本発明が狭く解釈されることはない。
【００２１】
図１は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第１実施形態を側面視した概念図である。なお、以下に使用する図面では、説明の便宜上、装置の構成等については簡素化して示している。
【００２２】
図１中の符号１は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置を示している。このリアルタイムＰＣＲ装置１のサイズや層構造は、目的に応じて適宜選定可能であり、リアルタイムＰＣＲ装置１の形態構成についても本発明の目的に沿う範囲で設計又は変更が可能である。
【００２３】
リアルタイムＰＣＲ装置１は、複数の反応領域Ａ１を有するウェル基板１１と、励起光Ｌ１を照射する励起光走査基板１２とを備えており、さらに、特定波長光を透過するフィルター１３と、反応領域Ａ１を加熱する加熱部１４と、蛍光を検出する蛍光検出部１５とが測定基板１６に設けられている。そして、前記ウェル基板１１の上方に、反応領域Ａ１の加熱を定温制御するペルチェ素子１７が設けられている。
【００２４】
前記励起光走査基板１２には、各反応領域Ａ１に対応する発光素子１２１が基板上に設けられており、スペーサ１２２と、反射膜１２３と、フィルター１２４とを有している。各発光素子１２１から励起光Ｌ１が発せられ、スペーサ１２２を通過して各反応領域Ａ１に照射される。そして、蛍光Ｌ２を蛍光検出部１５により検出することで遺伝子発現量等を解析することができる。
【００２５】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１では、光源として発光素子１２１を反応領域Ａ１ごとに設けている。これにより、各反応領域Ａ１に均一な光量の励起光Ｌ１を照射することができる。また、各反応領域Ａ１に異なる波長の励起光Ｌ１を選択的に照射することもできるし、反応領域Ａ１について励起光Ｌ１の照射時間を個別に制御することもできる。その結果、各反応領域Ａ１への励起光Ｌ１の照射を高精度に制御できるため、高精度の遺伝子発現量の解析が可能となる。以下、リアルタイムＰＣＲ装置１の各構成について詳細に説明する。
【００２６】
ウェル基板１１は、複数の反応領域（ウェル）Ａ１を基板内に備えている。この反応領域Ａ１で所定の反応を行う。ウェル基板１１は、低蛍光発光プラスチック材料やガラスなどで形成することができる。また、反応領域Ａ１について、例えば人の遺伝子数に匹敵する数をウェル基板１１内にマトリクス状に配置することができ。
【００２７】
本発明では、ＰＣＲ反応のための反応領域Ａ１（ウェル）はマイクロ空間であることが望ましい。例えば、反応領域Ａ１を３００μｍ×３００μｍ×３００μｍ（約３０ｎＬ容量）とした場合、約４万個の反応領域Ａ１を並べるとしても、約６ｃｍ角の面積を有するデバイスですむ。このように省スペース化が可能であるとともに、高精度の網羅的解析を行なうこともできる。
【００２８】
ここで、個々の反応領域Ａ１の形状は特に限定されず、反応溶液を保持できる形状であれば、どのような形状でもよいが、励起光Ｌ１を照射する光路や、蛍光Ｌ２の光路等を考慮して適宜好適な形状を選択することができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ装置１では、反応領域Ａ１内で前記蛍光Ｌ２を反射させるため、反応領域Ａ１は曲面部分を有している。このような構造とすることで、蛍光Ｌ２を高精度に受光することができる。
【００２９】
また、本発明では、光散乱の影響および外光の影響による、検出感度の低下を抑制するために、反応領域Ａ１は遮光性材質（例えば、ダイヤモンドライクカーボン等）にてコーティングされていることが望ましい。
【００３０】
励起光走査基板１２は、発光素子１２１から発せられる励起光Ｌ１をウェル基板１１内の各反応領域Ａ１に導くものである。まず、各発光素子１２１から発せられる励起光Ｌ１は、前記励起光走査基板１２内部のスペーサ１２２に導入される。そして、前記励起光走査基板１２の底部には反射膜１２３が設けられており、ウェル基板１１へ励起光Ｌ１を効率よく導入することができる。この励起光Ｌ１が照射されることによって、各反応領域Ａ１内の反応液中の蛍光物質を励起させることができる。前記反射膜１２３の材料等については特に限定されないが、好適には、ダイクロイックミラーを用いることが望ましい。
【００３１】
本発明では、前記複数の反応領域Ａ１に特定波長の励起光を照射可能な光学手段として、反応領域Ａ１ごとに設けられた複数の発光素子１２１を光源として用いる。
【００３２】
そして、本発明では、各反応領域Ａ１を各発光素子１２１により直接照射できるため、励起光Ｌ１の光量をより多くとることができ、かつ各反応領域に均一な光量を励起照射することができる。あるいは、複数の反応領域Ａ１のなかで選択的に励起光Ｌ１を照射することができる。さらに、反応領域Ａ１に異なる波長や光量の励起光Ｌ１を選択的に照射することもできるため、１回の測定において複数の蛍光色素を使用でき、より網羅的な解析等を行なうことができる。
【００３３】
発光素子１２１は、特定波長の光を発光するものであればよく、その種類は特に限定されないが、好適には、ＥＬ発光素子、白色もしくは単色の発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることが望ましく、このようなものとして、有機ＥＬ素子（ＯＬＥＤ）や無機ＥＬ素子等を用いることができる。ＥＬ発光素子や発光ダイオードを用いることで、不要な紫外線や赤外線を含まない光を簡便に得ることができる。
【００３４】
また、本発明では、励起光走査基板１２に配置された発光素子１２１について、前記発光素子１２１を電気的に個別制御することが望ましい。例えば、発光素子１２１にかける電流や電圧等を個別に制御することで、照射する励起光Ｌ１の光量や励起波長を個別かつ選択的に制御することができる。
【００３５】
図２は、リアルタイムＰＣＲ装置１の励起光走査基板１２について発光素子１２１をマトリクス状に配置した一例を示す斜視図である。
【００３６】
本発明では、励起光走査基板１２に発光素子１２１をドットマトリクス状に配置することが好ましい。発光素子１２１をドットマトリクス状に配置することで、基板の省スペース化等も可能となり、高精度の網羅的解析を行なうことができる。
【００３７】
図２を例にして説明すれば、励起光走査基板１２に発光素子１２１がドットマトリクス状に配置され、各発光素子１２１からそれぞれ励起光Ｌ１を照射することができる。そして、この場合でも、各発光素子１２１を個別に制御することで、各反応領域Ａ１に照射する各励起光Ｌ１の波長や光量等を変化させることもできるし、各反応領域Ａ１に応じて選択的に励起光Ｌ１を照射することもできる。
【００３８】
さらに、本発明では、アクティブマトリクス型の発光素子を用いることが望ましく、例えば、アクティブマトリクス型のＥＬ発光素子等を用いることができる。応答速度が速く高精度の制御が可能であるアクティブマトリクス方式に、応答速度が速い特性を有するＥＬ発光素子を用いることで、より高精度に励起光照射を制御することができる。従って、応答性に優れた解析を行なうこともできる。その結果、遺伝子発現量の解析をより高精度かつリアルタイムに行なうことができる。
【００３９】
本発明で採用可能なアクティブマトリクス型の構造の一例としては、画素（各反応領域Ａ１に対応する、いわゆるＸ行とＹ列）と対向電極を用い、画素と対向電極との間を印加する構造等を採用できる。
【００４０】
そして、本発明では、薄膜トランジスタ等によって前記画素を駆動させることが望ましい。薄膜トランジスタを用いることでスイッチング機能（ＯＮ／ＯＦＦ機能）を光学手段に付与することができる。これによって、画素ごとに点灯制御することができるため、各反応領域Ａ１について励起光Ｌ１の照射制御することができる。本発明において用いられる前記薄膜トランジスタの種類については、特に限定されず、例えば、ポリ珪素や、α−珪素等のタイプを適宜使用できる。
【００４１】
さらに、本発明では、画素と対向電極との間を印加する電圧等の大きさを変化させることで、励起光Ｌ１の光量等を制御することができる。詳しくは、各画素についてデータ線を選択しながら、このデータ線の電圧レベルを変化させることで、励起光Ｌ１の光量等を制御することができる。即ち、各発光素子１２１について電気的信号を個別に制御することで、照射する励起光Ｌ１の光量等を個別かつ選択的に制御することができる。
【００４２】
また、前記発光素子１２１は、好適には、ＰＣＲ反応における温度制御において、所定温度範囲（例えば、４２℃〜７５℃）の間で点灯制御するように設定することが望ましい。このような点灯制御を行うことで、反応領域Ａ１で行われるポリメラーゼ反応等のステップについて、高精度かつリアルタイムに解析することができる。
【００４３】
図３は、励起光走査基板１２について発光素子１２１を個別に制御する回路の一例を示す図である。Ｘ配線電極（走査線；Ｘ１，Ｘ２）とＹ配線電極（データ線、電流供給線；Ｙ１〜Ｙ５）を設け、Ｘ配線電極とＹ配線電極の交点である画素（ピクセル）を設けている。画素は各反応領域Ａ１（図１参照）に対応させている。なお、図３では対向電極については省略している。
【００４４】
図３に示す各画素回路は、発光素子１２１（例えば、有機ＥＬ等）と、スイッチ素子（アクティブ素子）ａと、ドライブ素子ｂと、データ記憶のためのキャパシタｃとから構成されている。この構造では、陽極である画素と、対向電極（図示せず）との間に電圧印加（あるいは電流供給）されることで発光素子１２１を発光させることができる。
【００４５】
そして、対極電極と画素電極を駆動させるために、スイッチ素子ａを各画素回路内に設けており、スイッチ制御によって各画素の発光素子１２１を点灯制御させることができる。スイッチ素子としては、例えば薄膜トランジスタなどを好適に用いることができる。
【００４６】
各画素をアクティブ走査することで各画素（各反応領域Ａ１）の励起光Ｌ１を個別制御できる。しかも、各画素をリアルタイムに制御できるため、励起光系の制御をリアルタイムに行なうことができる。これにより、反応領域Ａ１ごとに選択的に励起光Ｌ１を照射することや、励起波長や光量を反応領域Ａ１ごとに変化させて照射することや、照射時間を反応領域Ａ１ごとに変化させることができる。
【００４７】
反応領域Ａ１に照射された励起光Ｌ１は、反応領域Ａ１内の反応液中のプローブの蛍光物質等に照射されることで蛍光Ｌ２を発するが、本発明では、特定波長の光のみを透過するフィルター１３を、反応領域Ａ１と蛍光検出部１５との間に設けることが望ましい。これにより、蛍光Ｌ２のみを蛍光検出部１５へ導くことができるため、より高精度の蛍光検出を行なうことができる。
【００４８】
本発明において、フィルター１３の材料等については、特定波長の光を透過する性質を有するものであればよく、特に限定されないが、好適には、ダイクロイックミラーを用いることが望ましい。
【００４９】
そして、蛍光Ｌ２は反応領域Ａ１の下方に設けられた蛍光検出部１５で検出・測定される。蛍光検出部１５は、反応領域Ａ１に照射された励起光Ｌ１に応答して、インターカレートしたプローブ中の蛍光色素が励起することで発せられる蛍光Ｌ２を検出・測定する。
【００５０】
また、本発明では、蛍光検出部１５を反応領域Ａ１ごとに設けることが望ましい。即ち、各反応領域Ａ１にて発光素子１２１と蛍光検出部１５とを設けることで、励起させた反応領域Ａ１に選択的に励起光Ｌ１を照射でき、かつ個別に蛍光Ｌ２を検出することができる。
【００５１】
さらに、本発明では、蛍光検出部１５は、受光した蛍光量を電気的信号に変換して検出する蛍光検出機構を用いることが望ましい。前記蛍光検出機構によって、受光した蛍光量を電気的信号に変換することができ、この電気的信号に基づいて蛍光量をリアルタイムに測定・検出することができる。検出する電気的信号の種類は特に限定されず、例えば電流値でもよいし、電圧値でもよい。この電気的信号を測定し続けることで、リアルタイムに蛍光量を検出することができるため、より高精度にリアルタイムに遺伝子の発現量を測定することができる。
【００５２】
本発明では、蛍光検出部１５の蛍光検出機構の検出媒体については、特に限定されないが、例えば、フォトダイオード等のフォトセンサーを用いることができ、好適にはＥＬ素子や薄膜トランジスタ等を用いることが望ましい。
【００５３】
フォトダイオードは、受光した光量と発生する電流量の比が安定しているため、高精度の受光素子として、リアルタイムＰＣＲ装置１に好適に使用することができる。そして、ＥＬ素子を用いることで、速い応答速度であり、蛍光受光による電流発生現象を素早く感度検出できる。従って、遺伝子発現量をリアルタイムでありながら、より高精度で分析できる。
【００５４】
リアルタイムＰＣＲ装置１では、加熱部１４を各反応領域Ａ１にそれぞれ設けることが望ましい。また、前記加熱部１４は個別に温度制御機構を備えることがより望ましく、これにより各反応領域Ａ１の温度制御を個別に行なうことができる。例えば、ＰＣＲサイクルを行う場合、熱変性→アニーリング→伸長反応のステップについてより高精度の温度制御を行うことができる。
【００５５】
また、前記反応領域Ａ１の加熱時間についても、前記反応領域Ａ１に対応する加熱部１４により個別に制御できることが望ましい。前記加熱部１４により、前記反応領域Ａ１ごとに加熱温度と加熱時間を個別に制御することで、前記反応領域Ａ１内の増幅反応等をより高精度で制御できる。
【００５６】
従来のリアルタイムＰＣＲ法に用いられるサーマルサイクラー等による温度制御はグラディエント機構が付加されている場合もあるが、各サンプルの温度制御が個別にできないという問題等がある。これに対して、本発明では、各反応領域Ａ１にそれぞれ加熱部１４を設けることで、各反応領域Ａ１を個別に温度制御することができる。
【００５７】
加熱部１４の構造等については特に限定されないが、好適には、薄膜トランジスタにより形成され、スイッチング制御されるヒーターを用いることが望ましい。薄膜トランジスタが有するスイッチング機能を利用して、各反応領域Ａ１の温度制御を個別に行うことができる。温度制御は、薄膜トランジスタに印加する電圧をコントロールしてソース（Ｓ）−ドレイン（Ｄ）間の電流値を可変としてもよいし、ソース（Ｓ）−ドレイン（Ｄ）間の電流を定電流電源としてコントロールしてもよい。
【００５８】
本発明において用いられる前記薄膜トランジスタの種類については、特に限定されず、例えば、ポリ珪素や、α−珪素等のタイプを適宜使用できる。
【００５９】
あるいは、加熱部１４は、発熱抵抗体で形成され、薄膜トランジスタによりスイッチング制御されるヒーターとしてもよい。即ち、薄膜トランジスタは、スイッチングとしてのみ利用してもよく、前記発熱抵抗体として、白金（Ｐｔ）、モリブデン（Ｍｏ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、炭化珪素、モリブデンシリサイド、ニッケル−クロム合金、鉄−クロム−アルミニウム合金等を用いることができる。この場合は、発熱抵抗体に流れる電流値を制御することで、温度制御が可能となる。
【００６０】
蛍光検出部１５は、加熱部１４と同じ測定基板１６上に形成されており、蛍光検出部１５の蛍光検出機構と制御媒体と、加熱部の温度制御機構の制御媒体とが、同一画素内に形成されている。同一画素内に形成される形態については、平面的に形成されている状態だけでなく、加熱部１４と蛍光検出部１５とが積層された状態の場合であってもよい。そして、加熱部１４の温度制御機構の制御媒体と、蛍光検出部１５の蛍光検出機構の制御媒体とを、同一画素内に設けることが好適であり、これによりデバイスとしての小型化を可能とできる。
【００６１】
前記熱制御媒体である薄膜トランジスタ素子等の画素回路内に、受光専用素子の画素回路を設けることで、同じ画素レイヤで、熱制御と蛍光検出が可能になり、リアルタイムの検出を高精度で行なうことができる。また、デバイス作成において積層構造等のような複雑な構造は不要となり、デバイスとしての小型化をさらに容易にすることができる。
【００６２】
そして、この温度制御用薄膜トランジスタと受光用薄膜トランジスタからなるユニットを、ゲート線（Ｘ方向）とデータ線（Ｙ方向）に沿ってマトリクス状に複数配置させることもできる。即ち、各反応領域Ａ１（図１参照）に対応して、前記ユニットをマトリクス状に配置することができる。
【００６３】
本発明では、反応領域Ａ１の温度制御を行なうためにペルチェ素子１６を備えることが望ましい。ＰＣＲサイクルは、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のステップに応じて温度制御を行なう必要があるが、ペルチェ素子１６を設けることで、定温制御がより容易であり、高精度の温度制御を行なうことができる。例えば、予め、反応領域Ａ１内の温度をＰＣＲサイクルの最低温度（例えば、５５℃）に維持しておくことができる。
【００６４】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１では、通常用いられているＰＣＲ法を行なうことができる。例えば、（１）増幅させたい目標ＤＮＡ、（２）目標ＤＮＡと特異的に結合する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマ−、（３）緩衝液、（４）酵素、（５）ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰのようなデオキシリボヌクレオチド三リン酸、等を用い、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のサイクルを繰り返すことで、前記目標ＤＮＡを所望する量まで増幅させること等ができる。
【００６５】
以下、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１を用いた測定手順の一例について説明する。
【００６６】
各反応領域Ａ１には、予め設計された異なる遺伝子配列を有するプライマーを投入する。投入方法については、特に限定されず、例えば、インクジェット等を用いる方法によることができる。このように各反応領域Ａ１に各プライマーを含む溶液を滴下して乾燥させる。
【００６７】
続いて、検体から抽出したTotal ＲＮＡを逆転写（reverse transcription）法によりｃＤＮＡに転写して、各反応領域Ａ１に投入する。これと併せて、増幅に必要となる各塩基の原材料となるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、インターカレータ（「ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮ Ｉ」）、ＤＮＡ伸長増幅反応に必要な酵素ＤＮＡポリメラーゼ等を投入する。
【００６８】
熱変性ステップでは、反応領域Ａ１内が９５℃となるように加熱部１４等により設定し、二本鎖のＤＮＡを変性させ一本鎖ＤＮＡにする。続くアニーリングステップでは、反応領域Ａ１内が５５℃となるように設定することで、プライマーが前記一本鎖ＤＮＡ相補的な塩基配列と結合させる。次のＤＮＡ伸長ステップでは、反応領域Ａ１内が７２℃となるように設定することで、プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ポリメラーゼ反応を進行させてｃＤＮＡを伸長させる。
【００６９】
このような「９５℃（熱変性）→５５℃（プライマーのハイブリダイゼーション）→７２℃（ＤＮＡ伸長）」の温度サイクル毎に、各反応領域Ａ１内のｃＤＮＡは２倍量に増幅されていく。そして、各反応領域Ａ１にそれぞれ設置された加熱部１４によって、各反応領域Ａ１内の温度を設計したプライマー反応の最適値に制御できる。また、プライマーのハイブリダイゼーション時間やポリメラーゼ反応時間も制御できるため、不要な反応副産物の生成も制御できる。その結果、各反応領域Ａ１内の遺伝子（ｃＤＮＡ）の増幅率を一定に揃えることができるため、精度のよいＰＣＲ反応を行なうことができる。
【００７０】
ＤＮＡの複製反応時に生成されたｄｓ−ＤＮＡには、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉがインターカレートする。このＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉは、ｄｓ−ＤＮＡにインターカレートし、その後に励起光Ｌ１を照射することで励起して蛍光を発光する物質である（励起光波長：４９７ｎｍ、発光波長：５２０ｎｍ）。
【００７１】
これにより、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製時に、発光素子１２１からの光が励起光走査基板１２を経由して励起光Ｌ１として、インターカレートしたＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉを励起させて蛍光Ｌ２を発光させる。この蛍光Ｌ２の発光量を前記温度サイクル毎に蛍光検出部１１で測定し、定量化する。そして、温度サイクル数とこれに対応する発光量との相関関係に基づいて、遺伝子発現量として初期ｃＤＮＡ量を求めることができる。
【００７２】
図４は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第２実施形態を側面視した概念図である。以下、第１実施形態との相違点を中心に説明し、共通する部分についてはその説明を割愛する。
【００７３】
このリアルタイムＰＣＲ装置２は、反応領域（ウェル）Ａ２に対応して励起光走査基板２２上に発光素子２２１が設けられている点や、加熱部２４や蛍光検出部２５を個別に設けた測定基板２６を備えている点では、第１の実施形態と共通する。しかし、励起光Ｌ１をウェル基板２１の上方から照射して、反応領域Ａ２内を透過した蛍光Ｌ２を検出する点等で相違する。
【００７４】
リアルタイムＰＣＲ装置２では、発光素子２２１から発せられる励起光Ｌ１が、励起光走査基板２２によって反応領域Ａ２に導かれる。励起光走査基板２２では、スペーサ２２２を励起光Ｌ１が通過し、反射膜２２３とフィルター２２４により反応領域Ａ２に励起光Ｌ１が導入される。
【００７５】
そして、該励起光Ｌ１は、反応領域Ａ２内の反応液中のプローブの蛍光物質等に照射されることで蛍光Ｌ２を発する。この蛍光Ｌ２は、反応領域Ａ２の下方に設けられたフィルター２３を通過して、蛍光検出部２５で検出・測定される。
【００７６】
また、温度制御は、反応領域Ａ２下方に設けられた加熱部２４により行われ、ペルチェ素子２７等によって定温制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第１実施形態を側面視した概念図である。
【図２】同実施形態の励起光走査基板１２について発光素子１２１をマトリクス状に配置した一例を示す斜視図である。
【図３】同実施形態の励起光走査基板１２について発光素子１２１を個別に制御する回路の一例を示す図である。
【図４】本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第２実施形態を側面視した概念図である。
【符号の説明】
【００７８】
１，２ リアルタイムＰＣＲ装置
１１，２１ ウェル基板
１２，２２ 励起光走査基板
１３，２３ フィルター
１４，２４ 加熱部
１５，２５ 蛍光検出部
１６，２６ 測定基板
１７，２７ ペルチェ素子
１２１，２２１ 発光素子
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リアルタイムＰＣＲ装置に関する。より詳細には遺伝子発現等を解析するリアルタイムＰＣＲ装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ＤＮＡチップやＤＮＡマイクロアレイをはじめとするハイブリダイゼーション検出技術の実用化が進んでいる。ＤＮＡチップは、多種・多様のＤＮＡプローブを基板表面に集積して固定したものである。このＤＮＡチップを用いて、ＤＮＡチップ基板表面のハイブリダイゼーションを検出することにより、細胞・組織等における遺伝子発現等を網羅的に解析することができる。
【０００３】
そして、このマイクロアレイにより得られたデータを、ＰＣＲ法（polymerase chain reaction；ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて検証することが微量核酸の定量分析の標準的手法となっている。
【０００４】
リアルタイムＰＣＲ法は、「熱変性→プライマーとのアニーリング→ポリメラーゼ伸長反応」という増幅サイクルを連続的に行うことで、ＤＮＡ等を数十万倍にも増幅させることができる。このようにして得られるＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングして前記微量核酸の定量分析を行う方法である。
【０００５】
そして、リアルタイムＰＣＲ法では、サーマルサイクラーと分光蛍光光度計を一体化した専用の装置等を用いて前記ＰＣＲ増幅産物をリアルタイムでモニタリングすることができる。このような装置として、リアルタイムＰＣＲ装置がある。
【０００６】
リアルタイムＰＣＲ装置は、試料にて増幅反応が進行する際に励起光を照射することで蛍光信号をリアルタイムで検出することができる反応処理装置であり、化学反応を含め、医療現場や遺伝子解析の研究に用いられるゲノムＤＮＡの観測を行なう検出器等として使用することができる。
【０００７】
例えば、ＤＮＡを増幅するＰＣＲ法において、二本鎖ＤＮＡを特性する際に用いられる蛍光色素を標識した場合、その二本鎖ＤＮＡを加熱することで蛍光色素の変化を観察することができるが、リアルタイムＰＣＲには幾つかの検出方法がある。
【０００８】
例えば、特異性の高いプライマーにより目的のターゲットのみを増幅可能の場合には、ＳＹＢＲＲ ＧＲＥＥＮ Ｉを用いるインターカレーター法が用いられる。
【０００９】
二本鎖ＤＮＡに結合することで蛍光を発するインターカレーターは、ＰＣＲ反応によって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を検出することにより、増幅産物の生成量をモニターすることができる。ターゲットに特異的な蛍光標識プローブを設計・合成する必要がなく、簡便にさまざまなターゲットの測定に利用できる。
【００１０】
また、よく似た配列を区別して検出する必要や、ＳＮＰｓのタイピングのようにマルチプレックス検出が必要な場合には、プローブ法を用いる。その一つに５´末端を蛍光物質で、３´末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチドをプローブとして用いるＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法がある。
【００１１】
ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光発光は抑制される。伸長反応ステップでは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのもつ５´→３´エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる抑制が解除されて蛍光が発光される。この蛍光強度を測定することで、増幅産物の生成量をモニターすることができる。
【００１２】
このような方法によって、遺伝子発現量をリアルタイムＰＣＲで定量する原理を以下に述べる。まず、段階希釈した濃度既知の標準サンプルを鋳型として使用してＰＣＲを行なう。そして、一定の増幅産物量に達するサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を求める。このＣｔ値を横軸に、初発のＤＮＡ量を縦軸にプロットして、検量線を作成する。
【００１３】
未知濃度のサンプルについても、同じ条件下でＰＣＲ反応を行ってＣｔ値を求める。この値と前述した検量線とから、サンプル中の目的のＤＮＡ量が測定できることになる。
【００１４】
そして、リアルタイムＰＣＲ装置に関する技術として、特許文献１や特許文献２には増幅反応時の温度制御等に関する技術が開示されている。
【００１５】
【特許文献１】特開２００３−２９８０６８号公報。
【特許文献２】特開２００４−０２５４２６号公報。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
前記リアルタイムＰＣＲ装置は、遺伝子発現量の検出において定量性に優れているという利点を有する。しかし、一度に解析できるサンプル数が少なく、網羅的な解析ができないという問題がある。また、複数の反応領域（ウェル）等へ光照射を行なう場合、１つの光源を使用し導光板等によって励起光を各反応領域に照射するバックライト方式等によって行なわれるが、導光板等のたわみやキズ等が原因となり各反応領域に照射する励起光の光量等が均一でなくなる場合がある。また、各反応領域に対して選択的に光照射を制御することや、励起光の波長領域を反応領域ごとに選択できないといった問題等もある。
【００１７】
そこで、本発明では、反応領域に対する励起光照射を高精度に制御できるリアルタイムＰＣＲ装置を提供することを主目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置であって、複数の反応領域と、前記反応領域を加熱する加熱部と、前記反応領域ごとに複数設けられ、個別に励起光を発する発光素子と、前記反応領域から蛍光を検出する蛍光検出部と、を少なくとも備えたリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。反応領域ごとに光源である発光素子を設けることで、各反応領域に対して照射する励起光の光量や励起波長等を高精度に制御することができる。
そして、本発明は、前記発光素子を電気的に個別制御することにより、前記励起光の光量又は励起波長を制御するリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。発光素子にかける電圧や電流等を個別制御することで、各反応領域に照射する励起光の光量また励起波長を個別かつ高精度に制御できる。
続いて、本発明は、前記発光素子は少なくともＬＥＤ素子から構成され、前記発光素子をドットマトリクス状に配置した励起光走査基板を備えたリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。発光素子として、少なくともＬＥＤ素子を用い、かつ発光素子をドットマトリクス状に配置することで、各反応領域へ照射する励起光をより高精度に制御することができ、その結果より高精度な網羅的解析を行なうことができる。
さらに、本発明は、前記発光素子はアクティブマトリクス型の発光素子であり、各反応領域に異なる励起波長を有する光を照射可能なリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。かかる発光素子をアクティブ走査させることで、反応領域ごとに異なる励起波長の光を照射することができる。
また、本発明は、前記発光素子としてＥＬ素子を用いるリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。発光素子としてＥＬ素子を用いることで、励起光の照射を高精度に制御することができ、応答性に優れた解析を高精度に行なうことができる。
また、本発明は、前記発光素子と前記反応領域との間に、特定波長の光を透過するフィルターを備えるリアルタイムＰＣＲ装置を提供する。かかるフィルターを設けることで前記反応領域に対して特定波長光のみを照射できるため、より高精度の解析を行なうことができる。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置によれば、反応領域への励起光の照射を高精度に制御できる。
【００２０】
以下、本発明に係る方法の実施形態例について、添付図面を参照にしながら説明する。なお、図面に示された実施形態等は、本発明の好適な実施形態を例示したものであり、これにより本発明が狭く解釈されることはない。
【００２１】
図１は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第１実施形態を側面視した概念図である。なお、以下に使用する図面では、説明の便宜上、装置の構成等については簡素化して示している。
【００２２】
図１中の符号１は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置を示している。このリアルタイムＰＣＲ装置１のサイズや層構造は、目的に応じて適宜選定可能であり、リアルタイムＰＣＲ装置１の形態構成についても本発明の目的に沿う範囲で設計又は変更が可能である。
【００２３】
リアルタイムＰＣＲ装置１は、複数の反応領域Ａ１を有するウェル基板１１と、励起光Ｌ１を照射する励起光走査基板１２とを備えており、さらに、特定波長光を透過するフィルター１３と、反応領域Ａ１を加熱する加熱部１４と、蛍光を検出する蛍光検出部１５とが測定基板１６に設けられている。そして、前記ウェル基板１１の上方に、反応領域Ａ１の加熱を定温制御するペルチェ素子１７が設けられている。
【００２４】
前記励起光走査基板１２には、各反応領域Ａ１に対応する発光素子１２１が基板上に設けられており、スペーサ１２２と、反射膜１２３と、フィルター１２４とを有している。各発光素子１２１から励起光Ｌ１が発せられ、スペーサ１２２を通過して各反応領域Ａ１に照射される。そして、蛍光Ｌ２を蛍光検出部１５により検出することで遺伝子発現量等を解析することができる。
【００２５】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１では、光源として発光素子１２１を反応領域Ａ１ごとに設けている。これにより、各反応領域Ａ１に均一な光量の励起光Ｌ１を照射することができる。また、各反応領域Ａ１に異なる波長の励起光Ｌ１を選択的に照射することもできるし、反応領域Ａ１について励起光Ｌ１の照射時間を個別に制御することもできる。その結果、各反応領域Ａ１への励起光Ｌ１の照射を高精度に制御できるため、高精度の遺伝子発現量の解析が可能となる。以下、リアルタイムＰＣＲ装置１の各構成について詳細に説明する。
【００２６】
ウェル基板１１は、複数の反応領域（ウェル）Ａ１を基板内に備えている。この反応領域Ａ１で所定の反応を行う。ウェル基板１１は、低蛍光発光プラスチック材料やガラスなどで形成することができる。また、反応領域Ａ１について、例えば人の遺伝子数に匹敵する数をウェル基板１１内にマトリクス状に配置することができ。
【００２７】
本発明では、ＰＣＲ反応のための反応領域Ａ１（ウェル）はマイクロ空間であることが望ましい。例えば、反応領域Ａ１を３００μｍ×３００μｍ×３００μｍ（約３０ｎＬ容量）とした場合、約４万個の反応領域Ａ１を並べるとしても、約６ｃｍ角の面積を有するデバイスですむ。このように省スペース化が可能であるとともに、高精度の網羅的解析を行なうこともできる。
【００２８】
ここで、個々の反応領域Ａ１の形状は特に限定されず、反応溶液を保持できる形状であれば、どのような形状でもよいが、励起光Ｌ１を照射する光路や、蛍光Ｌ２の光路等を考慮して適宜好適な形状を選択することができる。例えば、リアルタイムＰＣＲ装置１では、反応領域Ａ１内で前記蛍光Ｌ２を反射させるため、反応領域Ａ１は曲面部分を有している。このような構造とすることで、蛍光Ｌ２を高精度に受光することができる。
【００２９】
また、本発明では、光散乱の影響および外光の影響による、検出感度の低下を抑制するために、反応領域Ａ１は遮光性材質（例えば、ダイヤモンドライクカーボン等）にてコーティングされていることが望ましい。
【００３０】
励起光走査基板１２は、発光素子１２１から発せられる励起光Ｌ１をウェル基板１１内の各反応領域Ａ１に導くものである。まず、各発光素子１２１から発せられる励起光Ｌ１は、前記励起光走査基板１２内部のスペーサ１２２に導入される。そして、前記励起光走査基板１２の底部には反射膜１２３が設けられており、ウェル基板１１へ励起光Ｌ１を効率よく導入することができる。この励起光Ｌ１が照射されることによって、各反応領域Ａ１内の反応液中の蛍光物質を励起させることができる。前記反射膜１２３の材料等については特に限定されないが、好適には、ダイクロイックミラーを用いることが望ましい。
【００３１】
本発明では、前記複数の反応領域Ａ１に特定波長の励起光を照射可能な光学手段として、反応領域Ａ１ごとに設けられた複数の発光素子１２１を光源として用いる。
【００３２】
そして、本発明では、各反応領域Ａ１を各発光素子１２１により直接照射できるため、励起光Ｌ１の光量をより多くとることができ、かつ各反応領域に均一な光量を励起照射することができる。あるいは、複数の反応領域Ａ１のなかで選択的に励起光Ｌ１を照射することができる。さらに、反応領域Ａ１に異なる波長や光量の励起光Ｌ１を選択的に照射することもできるため、１回の測定において複数の蛍光色素を使用でき、より網羅的な解析等を行なうことができる。
【００３３】
発光素子１２１は、特定波長の光を発光するものであればよく、その種類は特に限定されないが、好適には、ＥＬ発光素子、白色もしくは単色の発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いることが望ましく、このようなものとして、有機ＥＬ素子（ＯＬＥＤ）や無機ＥＬ素子等を用いることができる。ＥＬ発光素子や発光ダイオードを用いることで、不要な紫外線や赤外線を含まない光を簡便に得ることができる。
【００３４】
また、本発明では、励起光走査基板１２に配置された発光素子１２１について、前記発光素子１２１を電気的に個別制御することが望ましい。例えば、発光素子１２１にかける電流や電圧等を個別に制御することで、照射する励起光Ｌ１の光量や励起波長を個別かつ選択的に制御することができる。
【００３５】
図２は、リアルタイムＰＣＲ装置１の励起光走査基板１２について発光素子１２１をマトリクス状に配置した一例を示す斜視図である。
【００３６】
本発明では、励起光走査基板１２に発光素子１２１をドットマトリクス状に配置することが好ましい。発光素子１２１をドットマトリクス状に配置することで、基板の省スペース化等も可能となり、高精度の網羅的解析を行なうことができる。
【００３７】
図２を例にして説明すれば、励起光走査基板１２に発光素子１２１がドットマトリクス状に配置され、各発光素子１２１からそれぞれ励起光Ｌ１を照射することができる。そして、この場合でも、各発光素子１２１を個別に制御することで、各反応領域Ａ１に照射する各励起光Ｌ１の波長や光量等を変化させることもできるし、各反応領域Ａ１に応じて選択的に励起光Ｌ１を照射することもできる。
【００３８】
さらに、本発明では、アクティブマトリクス型の発光素子を用いることが望ましく、例えば、アクティブマトリクス型のＥＬ発光素子等を用いることができる。応答速度が速く高精度の制御が可能であるアクティブマトリクス方式に、応答速度が速い特性を有するＥＬ発光素子を用いることで、より高精度に励起光照射を制御することができる。従って、応答性に優れた解析を行なうこともできる。その結果、遺伝子発現量の解析をより高精度かつリアルタイムに行なうことができる。
【００３９】
本発明で採用可能なアクティブマトリクス型の構造の一例としては、画素（各反応領域Ａ１に対応する、いわゆるＸ行とＹ列）と対向電極を用い、画素と対向電極との間を印加する構造等を採用できる。
【００４０】
そして、本発明では、薄膜トランジスタ等によって前記画素を駆動させることが望ましい。薄膜トランジスタを用いることでスイッチング機能（ＯＮ／ＯＦＦ機能）を光学手段に付与することができる。これによって、画素ごとに点灯制御することができるため、各反応領域Ａ１について励起光Ｌ１の照射制御することができる。本発明において用いられる前記薄膜トランジスタの種類については、特に限定されず、例えば、ポリ珪素や、α−珪素等のタイプを適宜使用できる。
【００４１】
さらに、本発明では、画素と対向電極との間を印加する電圧等の大きさを変化させることで、励起光Ｌ１の光量等を制御することができる。詳しくは、各画素についてデータ線を選択しながら、このデータ線の電圧レベルを変化させることで、励起光Ｌ１の光量等を制御することができる。即ち、各発光素子１２１について電気的信号を個別に制御することで、照射する励起光Ｌ１の光量等を個別かつ選択的に制御することができる。
【００４２】
また、前記発光素子１２１は、好適には、ＰＣＲ反応における温度制御において、所定温度範囲（例えば、４２℃〜７５℃）の間で点灯制御するように設定することが望ましい。このような点灯制御を行うことで、反応領域Ａ１で行われるポリメラーゼ反応等のステップについて、高精度かつリアルタイムに解析することができる。
【００４３】
図３は、励起光走査基板１２について発光素子１２１を個別に制御する回路の一例を示す図である。Ｘ配線電極（走査線；Ｘ１，Ｘ２）とＹ配線電極（データ線、電流供給線；Ｙ１〜Ｙ５）を設け、Ｘ配線電極とＹ配線電極の交点である画素（ピクセル）を設けている。画素は各反応領域Ａ１（図１参照）に対応させている。なお、図３では対向電極については省略している。
【００４４】
図３に示す各画素回路は、発光素子１２１（例えば、有機ＥＬ等）と、スイッチ素子（アクティブ素子）ａと、ドライブ素子ｂと、データ記憶のためのキャパシタｃとから構成されている。この構造では、陽極である画素と、対向電極（図示せず）との間に電圧印加（あるいは電流供給）されることで発光素子１２１を発光させることができる。
【００４５】
そして、対極電極と画素電極を駆動させるために、スイッチ素子ａを各画素回路内に設けており、スイッチ制御によって各画素の発光素子１２１を点灯制御させることができる。スイッチ素子としては、例えば薄膜トランジスタなどを好適に用いることができる。
【００４６】
各画素をアクティブ走査することで各画素（各反応領域Ａ１）の励起光Ｌ１を個別制御できる。しかも、各画素をリアルタイムに制御できるため、励起光系の制御をリアルタイムに行なうことができる。これにより、反応領域Ａ１ごとに選択的に励起光Ｌ１を照射することや、励起波長や光量を反応領域Ａ１ごとに変化させて照射することや、照射時間を反応領域Ａ１ごとに変化させることができる。
【００４７】
反応領域Ａ１に照射された励起光Ｌ１は、反応領域Ａ１内の反応液中のプローブの蛍光物質等に照射されることで蛍光Ｌ２を発するが、本発明では、特定波長の光のみを透過するフィルター１３を、反応領域Ａ１と蛍光検出部１５との間に設けることが望ましい。これにより、蛍光Ｌ２のみを蛍光検出部１５へ導くことができるため、より高精度の蛍光検出を行なうことができる。
【００４８】
本発明において、フィルター１３の材料等については、特定波長の光を透過する性質を有するものであればよく、特に限定されないが、好適には、ダイクロイックミラーを用いることが望ましい。
【００４９】
そして、蛍光Ｌ２は反応領域Ａ１の下方に設けられた蛍光検出部１５で検出・測定される。蛍光検出部１５は、反応領域Ａ１に照射された励起光Ｌ１に応答して、インターカレートしたプローブ中の蛍光色素が励起することで発せられる蛍光Ｌ２を検出・測定する。
【００５０】
また、本発明では、蛍光検出部１５を反応領域Ａ１ごとに設けることが望ましい。即ち、各反応領域Ａ１にて発光素子１２１と蛍光検出部１５とを設けることで、励起させた反応領域Ａ１に選択的に励起光Ｌ１を照射でき、かつ個別に蛍光Ｌ２を検出することができる。
【００５１】
さらに、本発明では、蛍光検出部１５は、受光した蛍光量を電気的信号に変換して検出する蛍光検出機構を用いることが望ましい。前記蛍光検出機構によって、受光した蛍光量を電気的信号に変換することができ、この電気的信号に基づいて蛍光量をリアルタイムに測定・検出することができる。検出する電気的信号の種類は特に限定されず、例えば電流値でもよいし、電圧値でもよい。この電気的信号を測定し続けることで、リアルタイムに蛍光量を検出することができるため、より高精度にリアルタイムに遺伝子の発現量を測定することができる。
【００５２】
本発明では、蛍光検出部１５の蛍光検出機構の検出媒体については、特に限定されないが、例えば、フォトダイオード等のフォトセンサーを用いることができ、好適にはＥＬ素子や薄膜トランジスタ等を用いることが望ましい。
【００５３】
フォトダイオードは、受光した光量と発生する電流量の比が安定しているため、高精度の受光素子として、リアルタイムＰＣＲ装置１に好適に使用することができる。そして、ＥＬ素子を用いることで、速い応答速度であり、蛍光受光による電流発生現象を素早く感度検出できる。従って、遺伝子発現量をリアルタイムでありながら、より高精度で分析できる。
【００５４】
リアルタイムＰＣＲ装置１では、加熱部１４を各反応領域Ａ１にそれぞれ設けることが望ましい。また、前記加熱部１４は個別に温度制御機構を備えることがより望ましく、これにより各反応領域Ａ１の温度制御を個別に行なうことができる。例えば、ＰＣＲサイクルを行う場合、熱変性→アニーリング→伸長反応のステップについてより高精度の温度制御を行うことができる。
【００５５】
また、前記反応領域Ａ１の加熱時間についても、前記反応領域Ａ１に対応する加熱部１４により個別に制御できることが望ましい。前記加熱部１４により、前記反応領域Ａ１ごとに加熱温度と加熱時間を個別に制御することで、前記反応領域Ａ１内の増幅反応等をより高精度で制御できる。
【００５６】
従来のリアルタイムＰＣＲ法に用いられるサーマルサイクラー等による温度制御はグラディエント機構が付加されている場合もあるが、各サンプルの温度制御が個別にできないという問題等がある。これに対して、本発明では、各反応領域Ａ１にそれぞれ加熱部１４を設けることで、各反応領域Ａ１を個別に温度制御することができる。
【００５７】
加熱部１４の構造等については特に限定されないが、好適には、薄膜トランジスタにより形成され、スイッチング制御されるヒーターを用いることが望ましい。薄膜トランジスタが有するスイッチング機能を利用して、各反応領域Ａ１の温度制御を個別に行うことができる。温度制御は、薄膜トランジスタに印加する電圧をコントロールしてソース（Ｓ）−ドレイン（Ｄ）間の電流値を可変としてもよいし、ソース（Ｓ）−ドレイン（Ｄ）間の電流を定電流電源としてコントロールしてもよい。
【００５８】
本発明において用いられる前記薄膜トランジスタの種類については、特に限定されず、例えば、ポリ珪素や、α−珪素等のタイプを適宜使用できる。
【００５９】
あるいは、加熱部１４は、発熱抵抗体で形成され、薄膜トランジスタによりスイッチング制御されるヒーターとしてもよい。即ち、薄膜トランジスタは、スイッチングとしてのみ利用してもよく、前記発熱抵抗体として、白金（Ｐｔ）、モリブデン（Ｍｏ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、炭化珪素、モリブデンシリサイド、ニッケル−クロム合金、鉄−クロム−アルミニウム合金等を用いることができる。この場合は、発熱抵抗体に流れる電流値を制御することで、温度制御が可能となる。
【００６０】
蛍光検出部１５は、加熱部１４と同じ測定基板１６上に形成されており、蛍光検出部１５の蛍光検出機構と制御媒体と、加熱部の温度制御機構の制御媒体とが、同一画素内に形成されている。同一画素内に形成される形態については、平面的に形成されている状態だけでなく、加熱部１４と蛍光検出部１５とが積層された状態の場合であってもよい。そして、加熱部１４の温度制御機構の制御媒体と、蛍光検出部１５の蛍光検出機構の制御媒体とを、同一画素内に設けることが好適であり、これによりデバイスとしての小型化を可能とできる。
【００６１】
前記熱制御媒体である薄膜トランジスタ素子等の画素回路内に、受光専用素子の画素回路を設けることで、同じ画素レイヤで、熱制御と蛍光検出が可能になり、リアルタイムの検出を高精度で行なうことができる。また、デバイス作成において積層構造等のような複雑な構造は不要となり、デバイスとしての小型化をさらに容易にすることができる。
【００６２】
そして、この温度制御用薄膜トランジスタと受光用薄膜トランジスタからなるユニットを、ゲート線（Ｘ方向）とデータ線（Ｙ方向）に沿ってマトリクス状に複数配置させることもできる。即ち、各反応領域Ａ１（図１参照）に対応して、前記ユニットをマトリクス状に配置することができる。
【００６３】
本発明では、反応領域Ａ１の温度制御を行なうためにペルチェ素子１６を備えることが望ましい。ＰＣＲサイクルは、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のステップに応じて温度制御を行なう必要があるが、ペルチェ素子１６を設けることで、定温制御がより容易であり、高精度の温度制御を行なうことができる。例えば、予め、反応領域Ａ１内の温度をＰＣＲサイクルの最低温度（例えば、５５℃）に維持しておくことができる。
【００６４】
本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１では、通常用いられているＰＣＲ法を行なうことができる。例えば、（１）増幅させたい目標ＤＮＡ、（２）目標ＤＮＡと特異的に結合する少なくとも２種のオリゴヌクレオチドプライマ−、（３）緩衝液、（４）酵素、（５）ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰのようなデオキシリボヌクレオチド三リン酸、等を用い、「熱変性→アニーリング（プライマーのハイブリダイゼーション）→伸長反応」のサイクルを繰り返すことで、前記目標ＤＮＡを所望する量まで増幅させること等ができる。
【００６５】
以下、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置１を用いた測定手順の一例について説明する。
【００６６】
各反応領域Ａ１には、予め設計された異なる遺伝子配列を有するプライマーを投入する。投入方法については、特に限定されず、例えば、インクジェット等を用いる方法によることができる。このように各反応領域Ａ１に各プライマーを含む溶液を滴下して乾燥させる。
【００６７】
続いて、検体から抽出したTotal ＲＮＡを逆転写（reverse transcription）法によりｃＤＮＡに転写して、各反応領域Ａ１に投入する。これと併せて、増幅に必要となる各塩基の原材料となるデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）、インターカレータ（「ＳＹＢＲ（登録商標）ＧＲＥＥＮ Ｉ」）、ＤＮＡ伸長増幅反応に必要な酵素ＤＮＡポリメラーゼ等を投入する。
【００６８】
熱変性ステップでは、反応領域Ａ１内が９５℃となるように加熱部１４等により設定し、二本鎖のＤＮＡを変性させ一本鎖ＤＮＡにする。続くアニーリングステップでは、反応領域Ａ１内が５５℃となるように設定することで、プライマーが前記一本鎖ＤＮＡ相補的な塩基配列と結合させる。次のＤＮＡ伸長ステップでは、反応領域Ａ１内が７２℃となるように設定することで、プライマーをＤＮＡ合成の開始点として、ポリメラーゼ反応を進行させてｃＤＮＡを伸長させる。
【００６９】
このような「９５℃（熱変性）→５５℃（プライマーのハイブリダイゼーション）→７２℃（ＤＮＡ伸長）」の温度サイクル毎に、各反応領域Ａ１内のｃＤＮＡは２倍量に増幅されていく。そして、各反応領域Ａ１にそれぞれ設置された加熱部１４によって、各反応領域Ａ１内の温度を設計したプライマー反応の最適値に制御できる。また、プライマーのハイブリダイゼーション時間やポリメラーゼ反応時間も制御できるため、不要な反応副産物の生成も制御できる。その結果、各反応領域Ａ１内の遺伝子（ｃＤＮＡ）の増幅率を一定に揃えることができるため、精度のよいＰＣＲ反応を行なうことができる。
【００７０】
ＤＮＡの複製反応時に生成されたｄｓ−ＤＮＡには、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉがインターカレートする。このＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉは、ｄｓ−ＤＮＡにインターカレートし、その後に励起光Ｌ１を照射することで励起して蛍光を発光する物質である（励起光波長：４９７ｎｍ、発光波長：５２０ｎｍ）。
【００７１】
これにより、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ複製時に、発光素子１２１からの光が励起光走査基板１２を経由して励起光Ｌ１として、インターカレートしたＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉを励起させて蛍光Ｌ２を発光させる。この蛍光Ｌ２の発光量を前記温度サイクル毎に蛍光検出部１１で測定し、定量化する。そして、温度サイクル数とこれに対応する発光量との相関関係に基づいて、遺伝子発現量として初期ｃＤＮＡ量を求めることができる。
【００７２】
図４は、本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第２実施形態を側面視した概念図である。以下、第１実施形態との相違点を中心に説明し、共通する部分についてはその説明を割愛する。
【００７３】
このリアルタイムＰＣＲ装置２は、反応領域（ウェル）Ａ２に対応して励起光走査基板２２上に発光素子２２１が設けられている点や、加熱部２４や蛍光検出部２５を個別に設けた測定基板２６を備えている点では、第１の実施形態と共通する。しかし、励起光Ｌ１をウェル基板２１の上方から照射して、反応領域Ａ２内を透過した蛍光Ｌ２を検出する点等で相違する。
【００７４】
リアルタイムＰＣＲ装置２では、発光素子２２１から発せられる励起光Ｌ１が、励起光走査基板２２によって反応領域Ａ２に導かれる。励起光走査基板２２では、スペーサ２２２を励起光Ｌ１が通過し、反射膜２２３とフィルター２２４により反応領域Ａ２に励起光Ｌ１が導入される。
【００７５】
そして、該励起光Ｌ１は、反応領域Ａ２内の反応液中のプローブの蛍光物質等に照射されることで蛍光Ｌ２を発する。この蛍光Ｌ２は、反応領域Ａ２の下方に設けられたフィルター２３を通過して、蛍光検出部２５で検出・測定される。
【００７６】
また、温度制御は、反応領域Ａ２下方に設けられた加熱部２４により行われ、ペルチェ素子２７等によって定温制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第１実施形態を側面視した概念図である。
【図２】同実施形態の励起光走査基板１２について発光素子１２１をマトリクス状に配置した一例を示す斜視図である。
【図３】同実施形態の励起光走査基板１２について発光素子１２１を個別に制御する回路の一例を示す図である。
【図４】本発明に係るリアルタイムＰＣＲ装置の第２実施形態を側面視した概念図である。
【符号の説明】
【００７８】
１，２ リアルタイムＰＣＲ装置
１１，２１ ウェル基板
１２，２２ 励起光走査基板
１３，２３ フィルター
１４，２４ 加熱部
１５，２５ 蛍光検出部
１６，２６ 測定基板
１７，２７ ペルチェ素子
１２１，２２１ 発光素子
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置であって、
複数の反応領域と、
前記反応領域を加熱する加熱部と、
前記反応領域ごとに設けられ、個別に励起光を発する複数の発光素子と、
前記反応領域から蛍光を検出する蛍光検出部と、
を少なくとも備えたリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項２】
前記発光素子を電気的に個別制御することにより、前記励起光の光量を制御することを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項３】
前記発光素子は少なくともＬＥＤ素子から構成され、前記発光素子がドットマトリクス状に配置された励起光走査基板を備えていることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項４】
前記発光素子はアクティブマトリクス型の発光素子であり、各反応領域に異なる励起波長を有する光を照射可能であることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項５】
前記発光素子は、ＥＬ素子であることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項６】
前記発光素子と前記反応領域との間に、特定波長の光を透過するフィルターを備えることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項１】
遺伝子発現量を検出するリアルタイムＰＣＲ装置であって、
複数の反応領域と、
前記反応領域を加熱する加熱部と、
前記反応領域ごとに設けられ、個別に励起光を発する複数の発光素子と、
前記反応領域から蛍光を検出する蛍光検出部と、
を少なくとも備えたリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項２】
前記発光素子を電気的に個別制御することにより、前記励起光の光量を制御することを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項３】
前記発光素子は少なくともＬＥＤ素子から構成され、前記発光素子がドットマトリクス状に配置された励起光走査基板を備えていることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項４】
前記発光素子はアクティブマトリクス型の発光素子であり、各反応領域に異なる励起波長を有する光を照射可能であることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項５】
前記発光素子は、ＥＬ素子であることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【請求項６】
前記発光素子と前記反応領域との間に、特定波長の光を透過するフィルターを備えることを特徴とする請求項１に記載のリアルタイムＰＣＲ装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−２７８８３２（Ｐ２００８−２７８８３２Ａ）
【公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１２７８１８（Ｐ２００７−１２７８１８）
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１１月２０日（２００８．１１．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【出願人】（０００００２１８５）ソニー株式会社 (34,172)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]