リグナン配糖化酵素およびその利用

【課題】リグナン配糖体を供給するために、リグナン配糖化活性を有する酵素を提供する。
【解決手段】リグナン配糖体生成に関与する酵素を同定し、当該酵素ポリペプチドのアミノ酸配列および当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を同定し、これらの配列情報に基づいて、リグナン配糖体を産生する形質転換体を作製すること。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リグナンに対して糖を転移する活性を有する酵素、および当該酵素の利用方法に関するものである。
【０００２】
ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍ）は、ゴマ科ゴマ属（Ｓｅｓａｍｕｍ）に属する１年生の植物である。ゴマの原産地は、中央アフリカといわれている。ゴマは、約６０００年の歴史を有する最古の栽培油糧植物とされ、世界中で栽培されてきた。ゴマは、古来から貴重な食品であり、健康に良い食品の代表として知られている。特に、ゴマ種子、ゴマ種子から得た油、ゴマ種子からの抽出物が利用されている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。ゴマ種子に含まれる成分は、その約５０％が脂質であり、約２０％が蛋白質である。ゴマに含まれる脂質の主要成分は、オレイン酸およびリノール酸を主体とするトリグリセリドである。ゴマはまた、ビタミンＢ１、Ｂ２、Ｅなどをさらに含む。リグナンと総称される植物の二次代謝物（例えば、セサミンおよびセサモリンなど）が、上記の成分以外にゴマに含まれており、特にゴマリグナンは、ゴマ種子における特徴的な成分である（例えば、非特許文献２を参照のこと）。
【０００３】
リグナンは、Ｃ₆Ｃ₃骨格を有するフェニルプロパノイド化合物２分子が、主としてこれらの８−８’位を介して重合（８，８’−結合）した化合物である。リグナンは、植物における生体防御機構に寄与していると考えられている。
【０００４】
代表的なリグナンとしては、ゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍ）に含まれるセサミン、セサミノール、セサモリンおよびセサモリノール；レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）に含まれる（＋）−ピノレジノール、（−）−アルクチゲニンおよび（−）−マタイレジノール；ソシマ（Ｄａｐｈｎｅｔａｎｇｕｔｉｃａ）に含まれる（−）−ピノレジノールおよび（−）−ラリシレジノール；アマ（Ｌｉｎｕｍｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）に含まれる（＋）−セコイソラリシレジノールなどが挙げられる。これらのリグナンの分子構造は多様である。
【０００５】
ゴマリグナンの１つであるセサミンは、多彩な生理活性作用を有しており、コレステロール代謝、肝機能および免疫機能の改善に有効である（例えば、非特許文献１を参照のこと）。セサミンをゴマ種子またはゴマの絞り粕から分離精製する方法がすでに実用化されており（例えば、特許文献１および特許文献２を参照のこと）、セサミンを主成分とするアルコール分解促進作用を有する肝機能改善／増強剤が市販されている（商品名：セサミン、発売元：サントリー株式会社）。またセサミン以外の他のリグナン（例えば、セサミノール、セサモリンなど）もまた生理活性作用を有することが報告されている（例えば、非特許文献３を参照のこと）。
【０００６】
リグナンの生合成については、例えば、非特許文献４を参照のこと。非特許文献４には、コニフェリルアルコールが重合して合成されるピノレジノールが生合成上の最初のリグナンであること、そしてピノレジノールから個々の植物種において特有な生合成経路を経由して多様なリグナンが合成されることが示されている。以下に、一般的なリグナン生合成の模式図を示す。
【０００７】
【化１】

【０００８】
（＋）−ピノレジノールにピペリトール合成酵素が作用することによってピペリトールが合成され、次いで、このピペリトールにセサミン合成酵素が作用することによってセサミンが合成される。
【０００９】
リグナンの生合成に関与する酵素として、レンギョウ（Ｆｏｒｓｙｔｈｉａｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）などにおいてピノレジノールの合成に寄与するデリジェントタンパク質が報告されている（例えば、非特許文献５および特許文献３を参照のこと）。また、リグナンの生合成に関与する酵素の遺伝子およびその利用として、レンギョウのピノレジノール−ラリシレジノール還元酵素遺伝子（例えば、非特許文献６および特許文献３を参照のこと）、Ｔｈｕｊａｐｌｉｃａｔａのピノレジノール−ラリシレジノール還元酵素遺伝子（例えば、非特許文献７を参照のこと）ならびに組換えセコイソラリシレシノールデヒドロゲナーゼおよびその使用方法（例えば、非特許文献８および特許文献４を参照のこと）が報告されている。さらに、Ｌａｒｒｅａｔｒｉｄｅｎｔａｔａから、ラレアトリシン水酸化酵素遺伝子がクローニングされている（例えば、非特許文献９を参照のこと）。
【００１０】
ゴマリグナンの生合成については、ゴマ種子で発現している遺伝子を３０００クローン程度網羅的に解析することによって、デリジェントタンパク質、種子貯蔵タンパク質、脂質合成に関わる遺伝子断片を得たという報告もある（例えば、非特許文献１０を参照のこと）。また、脂肪酸合成に関与する遺伝子（例えば、非特許文献１１、非特許文献１２および非特許文献１３を参照のこと）および種子の貯蔵タンパク質の遺伝子などが、ゴマからクローニングされている。
【００１１】
近年、リグナンだけでなくリグナンの配糖体もまた注目されている。上記したリグナン分子のうちのいくつかは、配糖体として植物中に存在することが知られている。例えば、ゴマ種子中には、セサミノール配糖体（セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド；セサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−２）−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド；およびセサミノール２’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−２）−Ｏ−（−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−６））−β−Ｄ−グルコピラノシド））、およびピノレジノール配糖体（ピノレジノール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシド；ピノレジノール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−２）−β−Ｄ−グルコピラノシド；ピノレジノール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル（１−６）−Ｏ−（β−Ｄ−グルコピラノシル（１−６））β−Ｄ−グルコピラノシド；およびピノレジノールジ−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド））などが存在し、レンギョウには、（＋）−ピノレジノール−４’−Ｏ−β−Ｄグルコシドおよび（−）−マタイレジノール−４−Ｏ−グルコシドが、アマには、セコラリシレジノールジグルコシドおよびピノレジノールジグルコシドなどが存在する（例えば、非特許文献１、１４〜１６を参照のこと）。
【００１２】
配糖体は、配糖化酵素または糖転移酵素と呼ばれる酵素によってフラボノイドなどの多様な化合物の配糖化（糖転移）反応が触媒されることによって生成される。これまでに、いくつかの糖転移酵素のアミノ酸配列およびその機能が解明されている。フラボノイドまたはアントシアニジンの３位の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：フラボノイド３−グルコシルトランスフェラーゼ）の遺伝子が、トウモロコシ、リンドウ、ブドウなどから得られている（例えば、非特許文献１７を参照のこと）。また、アントシアニンの５位の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素（ＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼ）の遺伝子が、シソ、バーベナなどから得られている（例えば、非特許文献１８を参照のこと）。
【００１３】
ゴマに含まれるピノレジノール配糖体およびセサミノール配糖体（例えば、非特許文献１および非特許文献１９を参照のこと）は、水溶性領域で強い抗酸化性を示すので、脂溶性抗酸化剤（例えば、トコフェロール）とは異なる応用が期待されている。また、リグナン配糖体について以下のような作用機構が提唱されている：リグナン配糖体は、抗酸化性を示す官能基であるフェノール性水酸基が自身の有する糖によって保護されているが、体内へ摂取された後に、腸内細菌の有するβ−グルコシダーゼの作用によって加水分解され、アグリコン部分である脂溶性のリグナンが生成される。このアグリコンが腸内に吸収されて血液を経由して各種臓器に運ばれて、臓器の生体膜などにおける酸化障害を防ぐ。このような作用機構に基づいて、リグナン配糖体は動脈硬化予防食品としての応用が期待されている（例えば、非特許文献２０を参照のこと）。
【００１４】
植物の二次代謝物などの生合成経路を改変することによって、有用な物質の生成および／または有用な植物の育種が行われている。このような技術は、代謝工学と呼ばれている。このような技術を用いれば、任意の化合物を大量生産すること、および／または不要な物質の生産を抑制することが可能になる。従って、リグナンおよびその配糖体の生合成に関与する遺伝子を用いてリグナンおよびその配糖体の合成を代謝工学的に行うことは、上述したようなこれらの物質の有用性に鑑みて産業上有用である。しかし、リグナン、特にゴマリグナンの生合成に関与する遺伝子に関する知見は、前述のように限られており、さらに、リグナン配糖体の生成を触媒する配糖化酵素は見出されていないので、さらなる遺伝子の取得が望まれていた。
【特許文献１】特開２００１−１３９５７９公報（平成１３年５月２２日公開）
【特許文献２】特開平１０−７６７６号公報（平成１０年１月１３日公開）
【特許文献３】特表２００１−５０７９３１公報（平成１３年６月１９日公開）
【特許文献４】特表２００２−５１２７９０公報（平成１４年５月１８日公開）
【非特許文献１】ゴマその科学と機能性、並木満夫編：丸善プラネット社（１９９８）
【非特許文献２】Ｂｅｄｉｇｉａｎ，Ｄ．，ら、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓａｎｄＥｃｏｌｏｇｙ１３，１３３−１３９（１９８５）
【非特許文献３】日本農芸化学会誌、７６：８０５−８１３（２００２）
【非特許文献４】Ｌｉｇｎａｎｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｓｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１：６４０−７１３（１９９９）
【非特許文献５】ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，１２３：４５３（２０００）
【非特許文献６】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２９４７３（１９９６）
【非特許文献７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：６１８（１９９９）
【非特許文献８】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（１６）：１２６１４−２３（２００１）
【非特許文献９】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１００：１０６４１（２００３）
【非特許文献１０】ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５２：１１０７（２００３）
【非特許文献１１】Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．；６６（１０）：２１４６−５３（２００２）
【非特許文献１２】ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．；１２８（４）：１２００−１１（２００２）
【非特許文献１３】ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．；３７（２）：２０１−５（１９９６））
【非特許文献１４】生薬学雑誌、第３２巻、第１９４頁（１９７８）
【非特許文献１５】Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１４：６４９（２００３）
【非特許文献１６】Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５８：５８７（２００１）
【非特許文献１７】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４３３８（２００１）
【非特許文献１８】Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７４０５（１９９９）
【非特許文献１９】Ｋａｔｓｕｚａｋｉ，Ｈ．ら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６，２０８７−２０８８（１９９２）
【非特許文献２０】Ｔ．Ｏｓａｗａ：Ａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｒａｄｉａｔｉｏｎｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ２：ｐ．３２７，ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
セサミノール配糖体は、種子だけでなく発芽種子において生成されることが知られている（例えば、非特許文献１を参照のこと）。ゴマ種子において、発芽時のセサミンおよびセサモリンの急速な減少に伴って、リグナン配糖体（例えば、セサミノールジグルコシドなど）が生成される（日本農芸化学会誌、６９：６８（１９９５）を参照のこと）。このことは、ゴマ種子の発芽時にリグナン配糖化酵素（すなわち、リグナンに対する糖転移酵素）が活性化されて、その結果、リグナンが配糖化されるということを示唆している。また、ゴマ種子中のβ−グルコシダーゼが高い糖転移活性を有していること、および発芽初期の段階においてβ−グルコシダーゼの有する糖転移活性が増加することに基づいて、このβ−グルコシダーゼの有する糖転移活性の増加が配糖体の増加と密接な関連があるということが示唆された（日本農芸化学会誌、６９：６８（１９９５）を参照のこと）。しかしながら、このβ−グルコシダーゼの有する糖転移活性がリグナン配糖化に関与していることを示す知見はない。
【００１６】
糖転移反応を触媒するという特定の機能を有するタンパク質は、異なる植物種においてもそのアミノ酸配列が類似しているということが知られている（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：４３３８（２００１）を参照のこと）。従って、アミノ酸配列およびその基質が明らかとなっている糖転移酵素のオルソログを他の植物種から得ることは、現在の技術水準を従えば困難ではない。実際に、ペチュニアのＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼの遺伝子は、シソのＵＤＰ−グルコース：アントシアニン５−グルコシルトランスフェラーゼの遺伝子の配列情報を用いてクローニングされた（例えば、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４０１−１１（２００２）を参照のこと）。
【００１７】
しかしながら、上述したように、リグナンに対して糖を転移する活性を有する酵素およびそれをコードする遺伝子が単離された報告は、これまで存在しなかった。リグナン配糖化活性を有する酵素が単離されていない以上、このような新規配糖化酵素を取得することは技術的に困難であり、そして酵素取得のための具体的な手順が示されていない以上、このような新規配糖化酵素を取得するためには多大の試行錯誤を要する。
【００１８】
アラビドプシスやイネのような全ゲノム構造が明らかになっている植物であっても、それらの種子におけるリグナン配糖体の蓄積は報告されていない。すなわち、リグナン配糖化活性を有する酵素は、これまで存在しなかった。
【００１９】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、リグナン配糖化活性を有する酵素、特に、リグナン類の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素、好ましくはセサミノールからセサミノール配糖体、ピノレジノールからピノレジノール配糖体への反応を触媒する酵素を提供することである。換言すれば、本発明の目的は、リグナンに対して糖を転移する活性を有する酵素を用いて、代謝工学的にリグナン配糖体を供給することである。
【００２０】
さらに本発明の目的は、リグナンまたはリグナン配糖体を効率よく生成するために、リグナンとリグナン配糖体との含量比を増加または減少させた植物（特に、ゴマ）を代謝工学的に作製する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明に係るポリペプチドは、リグナン配糖化活性を有することを特徴としている。
【００２２】
本発明に係るポリペプチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２、４、８２もしくは９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２、４、８２もしくは９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴としているポリペプチドであることを特徴としている。
【００２３】
本発明に係るポリヌクレオチドは、上記のポリペプチドをコードすることを特徴としている。
【００２４】
本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードしかつ：
（ａ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
のいずれかであることを特徴としている。
【００２５】
本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードしかつ：
（ａ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド
のいずれかであることを特徴としている。
【００２６】
本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードしかつ：
（ａ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のいずれかであることを特徴としている。
【００２７】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、上記のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなることを特徴としている。
【００２８】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、上記のポリペプチドの発現を抑制することが好ましい。
【００２９】
本発明に係るベクターは、上記のポリヌクレオチドを含むことを特徴としている。
【００３０】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記のベクターを用いることを特徴としている。
【００３１】
本発明に係る形質転換体は、上記のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴としている。
【００３２】
本発明に係る形質転換体は、リグナンおよびリグナン配糖体の含有比が改変されていることが好ましい。
【００３３】
本発明に係る形質転換体は、生物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましい。
【００３４】
本発明に係る形質転換体は、上記生物が植物であることが好ましい。
【００３５】
本発明に係る形質転換体は、上記植物がゴマ、レンギョウまたはアマであることが好ましい。
【００３６】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記の形質転換体を用いることを特徴としている。
【００３７】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記の形質転換体を用いることが好ましい。
【００３８】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記のリグナン配糖体のアグリコンが、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることが好ましい。
【００３９】
本発明に係る細胞は、上記のベクターを含有することを特徴としている。
【００４０】
本発明に係る細胞は、ゴマ、レンギョウまたはアマの細胞であることが好ましい。
【００４１】
本発明に係るポリペプチドの生産方法は、上記の細胞を用いることを特徴としている。
【００４２】
本発明に係るリグナン配糖体の生産方法は、上記の細胞を用いることを特徴としている。
【００４３】
本発明に係るリグナン配糖体の生産方法は、上記のリグナン配糖体のアグリコンが、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることが好ましい。
【００４４】
本発明に係るリグナン配糖体の生産方法は、上記のポリペプチドを用いることが好ましい。
【００４５】
本発明に係るリグナン配糖体の生産方法は、上記のリグナン配糖体のアグリコンが、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることが好ましい。
【００４６】
本発明に係る食品または工業製品は、上記の生産方法により得られたリグナン配糖体を含有することを特徴としている。
【００４７】
本発明に係る食品または工業製品は、上記のリグナン配糖体のアグリコンが、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることが好ましい。
【００４８】
本発明に係る生物中のリグナン配糖体の含有量を増加させる方法は、上記のポリヌクレオチドを、リグナンを産生する生物に導入する工程を包含することを特徴としている。
【００４９】
本発明に係る生物中のリグナン配糖体の含有量を増加させる方法は、上記のリグナンを産生する生物がゴマ、レンギョウまたはアマであることが好ましい。
【００５０】
本発明に係る生物中のリグナン配糖体の含有量を増加させる方法は、上記のリグナンがピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることが好ましい。
【００５１】
本発明に係る生物中のリグナン配糖体の含有量を減少させる方法は、上記のオリゴヌクレオチドを、リグナンを産生する生物に導入する工程を包含することを特徴としている。
【００５２】
本発明に係る生物中のリグナン配糖体の含有量を減少させる方法は、上記のリグナンを産生する生物がゴマ、レンギョウまたはアマであることが好ましい。
【００５３】
本発明に係る生物中のリグナン配糖体の含有量を減少させる方法は、上記のリグナンがピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることが好ましい。
【発明の効果】
【００５４】
本発明に係るポリペプチド（リグナン配糖化酵素）を利用すれば、生物（特に、植物）においてリグナンおよびリグナン配糖体の量を人為的に調節することができるという効果を奏する。また、これらの組換え酵素を用いてリグナンを配糖化することによって、インビトロおよびインビボにおいて物性（溶解度、動物の吸収効率など）を改変することができるという効果を奏する。また、ＳｉＧＴ８を利用することによって、自然界に存在しないリグナン配糖体を人工的に生産することができるという効果を奏する。これらの効果に基づいて、本発明は、新しい生理機能物質を開発することができる。
【００５５】
本発明に係るリグナン配糖化酵素を遺伝子組換え技術を用いて所望の生物に発現させることによって、セサミノールからセサミノール配糖体を、および／またはピノレジノールからピノレジノール配糖体を人工的に生産できるという効果を奏する。また、本発明に係るリグナン配糖化酵素を遺伝子組換え技術を用いて所望の生物に発現させることによって、リグナンとリグナン配糖体との量を人為的に制御した植物および／または微生物を作出することができるという効果を奏する。
【００５６】
これにより、これらリグナンの体内動態を変化させる（脂溶性のリグナンと水溶性のリグナン配糖体との比を容易に決定する）ことができるという効果を奏する。すなわち、体内で吸収されやすいリグナン配当体と体内に吸収されにくいリグナンとの間のバランスを調節することができるという効果を奏する。また、リグナンを配糖化することによってリグナンの水への溶解度を向上させることができるので、リグナンを含有する飲料の作製に利用することができる。
【００５７】
また、セサミノール配糖体またはピノレジノール配糖体を生産する植物において、本発明に係るリグナン配糖化酵素の発現を抑制することによって、アグリコン（すなわち、配糖体の非糖部分）を遊離させて、リグナン（特に、セサミノールおよび／またはピノレジノール）の量を増加させることもできるという効果を奏する。さらに、本発明に係るリグナン配糖化酵素を用いれば、新規リグナン配糖体であるピペリトール配糖体をピペリトールから人工的に生産することができるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５８】
本発明者らは、植物由来の糖転移酵素の間で保存されている領域を複数組合わせて複合プローブとして用いて、ゴマ種子ｃＤＮＡライブラリーからゴマ糖転移酵素遺伝子群（以下、ＳｉＧＴ遺伝子と称する）を網羅的に取得した。取得した遺伝子群からゴマ糖転移酵素（以下、ＳｉＧＴと称する）を大腸菌において発現させた。得られた組換えタンパク質をセサミノールまたはピノレジノールと反応させた後、ＨＰＬＣ分析、ＬＣ−ＭＳ分析、およびＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、セサミノール配糖体またはピノレジノール配糖体の生成を触媒する酵素を選択した。その結果、ＳｉＧＴ８が、セサミノールからセサミノール配糖体を生成する反応、およびピノレジノールからピノレジノール配糖体を生成する反応を触媒することが明らかとなった。また、ＳｉＧＴ１０はセサミノールからセサミノール配糖体を生成する反応を触媒することが明らかとなった。さらに、ＳｉＧＴ８が、現在までに報告のない新規なリグナン配糖体であるピペリトール配糖体を生成するピペリトール配糖化活性を有していることを見出した。
【００５９】
以下、本発明に係るリグナン配糖化活性を有するポリペプチド、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらの利用について詳述する。
【００６０】
（１）ポリペプチド
本発明者らは、リグナン、特に、セサミノールおよび／またはピノレジノールを主な基質にする新規糖転移酵素を見出し、本発明を完成するに至った。さらに本発明者らは、上記新規糖転移酵素がピペリトールを配糖化することを見出した。これまでに、ピペリトール配糖体は見出されていない。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、「ペプチド」または「タンパク質」と交換可能に使用される。また、ポリペプチドの「フラグメント」は、当該ポリペプチドの部分断片が意図される。本発明に係るポリペプチドはまた、天然供給源より単離されても、化学合成されてもよい。
【００６２】
用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、その天然の環境から取り出されたポリペプチドまたはタンパク質が意図される。例えば、宿主細胞中で発現された組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって実質的に精製されている天然または組換えのポリペプチドおよびタンパク質と同様に、単離されていると考えられる。
【００６３】
本発明に係るポリペプチドは、天然の精製産物、化学合成手順の産物、および原核生物宿主または真核生物宿主（例えば、細菌細胞、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む）から組換え技術によって産生された産物を含む。組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明に係るポリペプチドは、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。さらに、本発明に係るポリペプチドはまた、いくつかの場合、宿主媒介プロセスの結果として、開始の改変メチオニン残基を含み得る。
【００６４】
１つの局面において、本発明は、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、「リグナン配糖化活性」は、リグナンを配糖化する活性、すなわち、リグナンに糖を転移する活性が意図される。すなわち、本明細書中で使用される場合、配糖化酵素と糖転移酵素とは、相互交換可能に使用される。
【００６５】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号２、４、８２または９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。
【００６６】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、配列番号２、４、８２または９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの変異体でありかつリグナン配糖化活性を有するポリペプチドが好ましい。
【００６７】
このような変異体としては、欠失、挿入、逆転、反復、およびタイプ置換（例えば、親水性の残基の別の残基への置換、しかし通常は強く親水性の残基を強く疎水性の残基には置換しない）を含む変異体が挙げられる。特に、ポリペプチドにおける「中性」アミノ酸置換は、一般的にそのポリペプチドの活性にほとんど影響しない。
【００６８】
ポリペプチドのアミノ酸配列中のいくつかのアミノ酸が、このポリペプチドの構造または機能に有意に影響することなく容易に改変され得ることは、当該分野において周知である。さらに、人為的に改変させるだけではく、天然のタンパク質において、当該タンパク質の構造または機能を有意に変化させない変異体が存在することもまた周知である。
【００６９】
当業者は、周知技術を使用してポリペプチドのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸を容易に変異させることができる。例えば、公知の点変異導入法に従えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の塩基を変異させることができる。また、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの任意の部位に対応するプライマーを設計して欠失変異体または付加変異体を作製することができる。さらに、本明細書中に記載される方法を用いれば、作製した変異体が所望の活性を有するか否かを容易に決定し得る。
【００７０】
好ましい変異体は、保存性もしくは非保存性アミノ酸置換、欠失、または添加を有する。好ましくは、サイレント置換、添加、および欠失であり、特に好ましくは、保存性置換である。これらは、本発明に係るポリペプチド活性を変化させない。
【００７１】
代表的に保存性置換と見られるのは、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの中での１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒの間の置換である。
【００７２】
上記に詳細に示されるように、どのアミノ酸の変化が表現型的にサイレントでありそうか（すなわち、機能に対して有意に有害な効果を有しそうにないか）に関するさらなるガイダンスは、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ら「ＤｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇｔｈｅＭｅｓｓａｇｅｉｎＰｒｏｔｅｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅｓ：ＴｏｌｅｒａｎｃｅｔｏＡｍｉｎｏＡｃｉｄＳｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）（本明細書中に参考として援用される）に見出され得る。
【００７３】
本実施形態に係るポリペプチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２、４、８２または９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２、４、８２または９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなるポリペプチドであることが好ましい。このような変異ポリペプチドは、上述したように、公知の変異ポリペプチド作製法により人為的に導入された変異を有するポリペプチドに限定されるものではなく、天然に存在するポリペプチドを単離精製したものであってもよい。
【００７４】
本発明に係るポリペプチドは、アミノ酸がペプチド結合しているポリペプチドであればよいが、これに限定されるものではなく、ポリペプチド以外の構造を含む複合ポリペプチドであってもよい。本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド以外の構造」としては、糖鎖やイソプレノイド基等を挙げることができるが、特に限定されない。
【００７５】
また、本発明に係るポリペプチドは、付加的なポリペプチドを含むものであってもよい。付加的なポリペプチドとしては、例えば、ＨｉｓやＭｙｃ、Ｆｌａｇ等のエピトープ標識ポリペプチドが挙げられる。
【００７６】
また、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入して、そのポリペプチドを細胞内発現させた状態であってもよいし、細胞、組織などから単離精製されてもよい。また、本発明に係るポリペプチドは、化学合成されてもよい。
【００７７】
他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、融合タンパク質のような改変された形態で組換え発現され得る。例えば、本発明に係るポリペプチドの付加的なアミノ酸、特に荷電性アミノ酸の領域が、宿主細胞内での、精製の間または引き続く操作および保存の間の安定性および持続性を改善するために、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。
【００７８】
本実施形態に係るポリペプチドは、例えば、融合されたポリペプチドの精製を容易にするペプチドをコードする配列であるタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）にＮ末端またはＣ末端へ付加され得る。このような配列は、ポリペプチドの最終調製の前に除去され得る。本発明のこの局面の特定の好ましい実施態様において、タグアミノ酸配列は、ヘキサ−ヒスチジンペプチド（例えば、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供されるタグ）であり、他の中では、それらの多くは公的および／または商業的に入手可能である。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８２１−８２４（１９８９）（本明細書中に参考として援用される）において記載されるように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を提供する。「ＨＡ」タグは、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）タンパク質由来のエピトープに対応する精製のために有用な別のペプチドであり、それは、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ３７：７６７（１９８４）（本明細書中に参考として援用される）によって記載されている。他のそのような融合タンパク質は、ＮまたはＣ末端にてＦｃに融合される本実施形態に係るポリペプチドまたはそのフラグメントを含む。
【００７９】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、下記で詳述されるように組換え生成されても、化学合成されてもよい。
【００８０】
組換え生成は、当該分野において周知の方法を使用して行なうことができ、例えば、以下に詳述されるようなベクターおよび細胞を用いて行なうことができる。
【００８１】
合成ペプチドは、化学合成の公知の方法を使用して合成され得る。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎは、４週間未満で調製されそして特徴付けられたＨＡ１ポリペプチドセグメントの単一アミノ酸改変体を示す１０〜２０ｍｇの２４８の異なる１３残基ペプチドのような多数のペプチドの合成のための簡単な方法を記載している。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：５１３１−５１３５（１９８５）。この「ＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＭｕｌｔｉｐｌｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ（ＳＭＰＳ）」プロセスは、さらにＨｏｕｇｈｔｅｎら（１９８６）の米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。この手順において、種々のペプチドの固相合成のための個々の樹脂は、別々の溶媒透過性パケットに含まれ、固相法に関連する多くの同一の反復工程の最適な使用を可能にする。完全なマニュアル手順は、５００〜１０００以上の合成が同時に行われるのを可能にする（Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、前出、５１３４）。これらの文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００８２】
下記に詳細に記載するように、本発明に係るポリペプチドは、リグナンを配糖化してリグナン配糖体を得るための方法およびキットにおいて有用である。
【００８３】
本発明に係るポリペプチドは、リグナン（特に、ピノレジノール、セサミノール、またはピペリトール）の配糖化反応を触媒することができる。
【００８４】
このように、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも、配列番号２、４、８２または９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列を含んでいればよいといえる。すなわち、配列番号２、４、８２または９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列と特定の機能（例えば、タグ）を有する任意のアミノ酸配列とからなるポリペプチドも本発明に含まれることに留意すべきである。また、配列番号２、４、８２または９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列および当該任意のアミノ酸配列は、それぞれの機能を阻害しないように適切なリンカーペプチドで連結されていてもよい。
【００８５】
また、本発明に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドがセサミノールまたはピノレジノールを配糖化する活性以外にピペリトールを配糖化する活性を有しているので、当該ポリペプチドの用途としてセサミノールまたはピノレジノールを配糖化してこれらの配糖体を生成することのみに限定されるべきではない。
【００８６】
つまり、本発明の目的は、リグナンを配糖化する活性を有するポリペプチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリペプチド作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるリグナンを配糖化する活性を有するポリペプチドも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【００８７】
（２）ポリヌクレオチド
１つの局面において、本発明は、リグナン配糖化活性を有する本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」は、「遺伝子」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。本明細書中で使用される場合、用語「塩基配列」は、「核酸配列」または「ヌクレオチド配列」と交換可能に使用され、デオキシリボヌクレオチド（Ａ、Ｇ、ＣおよびＴと省略される）の配列として示される。また、「配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドまたはそのフラグメント」とは、配列番号１の各デオキシヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃおよび／またはＴによって示される配列を含むポリヌクレオチドまたはその断片部分が意図される。
【００８８】
本発明に係るポリヌクレオチドは、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態、またはＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）で存在し得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としても知られる）であり得るか、またはそれは、非コード鎖（アンチセンス鎖としても知られる）であり得る。
【００８９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチドが数個ないし数十個結合したものが意図され、「ポリヌクレオチド」と交換可能に使用される。オリゴヌクレオチドは、短いものはジヌクレオチド（二量体）、トリヌクレオチド（三量体）といわれ、長いものは３０マーまたは１００マーというように重合しているヌクレオチドの数で表される。オリゴヌクレオチドは、より長いポリヌクレオチドのフラグメントとして生成されても、化合合成されてもよい。
【００９０】
本発明に係るポリヌクレオチドのフラグメントは、少なくとも１２ｎｔ（ヌクレオチド）、好ましくは約１５ｎｔ、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、なおより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは少なくとも約４０ｎｔの長さのフラグメントが意図される。少なくとも２０ｎｔの長さのフラグメントによって、例えば、配列番号１に示される塩基配列からの２０以上の連続した塩基を含むフラグメントが意図される。本明細書を参照すれば配列番号１に示される塩基配列が提供されるので、当業者は，配列番号１に基づくＤＮＡフラグメントを容易に作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断または超音波による剪断は、種々のサイズのフラグメントを作製するために容易に使用され得る。あるいは、このようなフラグメントは、合成的に作製され得る。適切なフラグメント（オリゴヌクレオチド）が、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ＡＢＩ，８５０ＬｉｎｃｏｌｎＣｅｎｔｅｒＤｒ．，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ９４４０４）３９２型シンセサイザーなどによって合成される。
【００９１】
また本発明に係るポリヌクレオチドは、その５’側または３’側で上述のタグ標識（タグ配列またはマーカー配列）をコードするポリヌクレオチドに融合され得る。
【００９２】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。
【００９３】
別の局面において、本発明は、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異体を提供する。「変異体」は、天然の対立遺伝子変異体のように、天然に生じ得る。「対立遺伝子変異体」によって、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの交換可能な形態の１つが意図される。天然に存在しない変異体は、例えば当該分野で周知の変異誘発技術を用いて生成され得る。
【００９４】
一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列において１または数個の塩基が欠失、挿入、置換、または付加された変異体が好ましい。変異体は、コードもしくは非コード領域、またはその両方において変異され得る。コード領域における変異は、保存的または非保存的なアミノ酸の欠失、挿入、置換、または付加を生成し得る。
【００９５】
本実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり、かつ
（ａ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド
のいずれかであることが好ましい。
【００９６】
他の実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、単離したポリヌクレオチドが好ましい。
【００９７】
本実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
【００９８】
ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている方法のような周知の方法で行うことができる。通常、温度が高いほど、塩濃度が低いほどストリンジェンシーは高くなり（ハイブリダイズし難くなる）、より相同なポリヌクレオチドを取得することができる。適切なハイブリダイゼーション温度は、塩基配列やその塩基配列の長さによって異なり、例えば、アミノ酸６個をコードする１８塩基からなるＤＮＡフラグメントをプローブとして用いる場合、５０℃以下の温度が好ましい。
【００９９】
本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図される。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、参照のポリヌクレオチドの少なくとも約１５ヌクレオチド（ｎｔ）、そしてより好ましくは少なくとも約２０ｎｔ、さらにより好ましくは少なくとも約３０ｎｔ、そしてさらにより好ましくは約３０〜７０ｎｔにハイブリダイズするポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が意図される。このようなポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドは、本明細書中においてより詳細に考察されるような診断用プライマーおよび診断用プローブとしても有用である。
【０１００】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１、３、８１または９０のいずれか１つに示される塩基配列と少なくとも８０％同一、より好ましくは少なくとも８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチドを提供する。
【０１０１】
本実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、以下：
（ａ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド、
のいずれかであることが好ましい。
【０１０２】
例えば、「本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照（ＱＵＥＲＹ）塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチド」によって、対象塩基配列が、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの参照塩基配列の１００ヌクレオチチド（塩基）あたり５つまでの不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を含み得ることを除いて、参照配列に同一である、ということが意図される。換言すれば、参照塩基配列に少なくとも９５％同一の塩基配列からなるポリヌクレオチドを得るために、参照配列における塩基の５％までが、欠失され得るかまたは別の塩基で置換され得るか、あるいは参照配列における全塩基の５％までの多くの塩基が、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの不一致は、参照塩基配列の５’または３’末端位置または参照配列における塩基中で個々にかまたは参照配列内の１以上の隣接した群においてのいずれかで分散されて、これらの末端部分の間のどこでも起こり得る。この参照配列は、本明細書中で記載されるように、配列番号２、４、８２または９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、改変体、誘導体またはアナログであり得る。
【０１０３】
任意の特定の核酸分子が、例えば、配列番号１、３、８１または９０に示される塩基配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、公知のコンピュータープログラム（例えば、Ｂｅｓｔｆｉｔｐｒｏｇｒａｍ（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ８ｆｏｒＵｎｉｘ（登録商標），ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ，ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｋ，５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１１）を使用して決定され得る。Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同性アルゴリズムを用いて、２つの配列間の最も良好な相同性セグメントを見出す（ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄＭａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２〜４８９（１９８１））。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを用いて、特定の配列が、本発明に従う参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合は、同一性のパーセントが参照塩基配列の全長にわたって計算され、そして参照配列におけるヌクレオチド数全体の５％までの相同性におけるギャップが許容されるように、パラメーターが設定される。
【０１０４】
特定の実施形態では、参照（ＱＵＥＲＹ）配列（本発明に係る配列）と対象配列との間の同一性（全体的な配列整列ともいわれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇらのアルゴリズム（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ．６：２３７〜２４５（１９９０））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを使用して決定される。％同一性を計算するために、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において使用される好ましいパラメーターは：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、ＭｉｓｍａｔｃｈＰｅｎａｌｔｙ＝１、ＪｏｉｎｉｎｇＰｅｎａｌｔｙ＝３０、ＲａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎＧｒｏｕｐＬｅｎｇｔｈ＝０、ＣｕｔｏｆｆＳｃｏｒｅ＝１、ＧａｐＰｅｎａｌｔｙ＝５、ＧａｐＳｉｚｅＰｅｎａｌｔｙ＝０．０５、ＷｉｎｄｏｗＳｉｚｅ＝５００または対象塩基配列の長さ（どちらかより短い方）である。この実施形態に従って、対象配列が、５’または３’欠失に起因して（内部の欠失が理由ではなく）ＱＵＥＲＹ配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが、同一性パーセントを算定する場合に、対象配列の５’短縮化および３’短縮化を考慮しないという事実を考慮して、手動の補正が結果に対してなされる。ＱＵＥＲＹ配列と比較して５’末端または３’末端が短縮化された対象配列については、同一性パーセントは、一致／整列していない、対象配列の５’および３’であるＱＵＥＲＹ配列の塩基数を、ＱＵＥＲＹ配列の総塩基のパーセントとして計算することにより補正される。ヌクレオチドが一致／整列しているか否かの決定は、ＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定される。次いで、このパーセントが、指定されたパラメーターを使用する上記のＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントから差し引かれ、最終的な同一性パーセントスコアに到達する。この補正されたスコアが、本実施形態の目的で使用されるものである。ＱＵＥＲＹ配列と一致／整列していない対象配列の５’塩基および３’塩基の外側の塩基のみが、ＦＡＳＴＤＢ整列に示されるように、同一性パーセントスコアを手動で調整する目的で計算される。例えば、９０塩基の対象配列が、同一性パーセントを決定するために１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と整列される。その欠失は、対象配列の５’末端で生じ、従ってＦＡＳＴＤＢ整列は、５’末端の最初の１０塩基の一致／整列を示さない。１０個の不対合塩基は、配列の１０％（整合していない５’末端および３’末端での塩基の数／ＱＵＥＲＹ配列中の塩基の総数）を表し、そのため１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算される同一性パーセントのスコアから差し引かれる。残りの９０残基が完全に整合する場合、最終的な同一性パーセントは９０％である。別の例において、９０残基の対象配列が、１００塩基のＱＵＥＲＹ配列と比較される。この場合、その欠失は内部欠失であり、そのためＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端または３’末端の塩基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算定される同一性パーセントは、手動で補正されない。再度、ＱＵＥＲＹ配列と整合／整列しない対象配列の５’末端および３’末端の塩基のみが手動で補正される。他の手動の補正は、本実施形態の目的のためにはなされない。
【０１０５】
別の局面において、本発明は、上記ポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなるオリゴヌクレオチドを提供する。
【０１０６】
本発明に係るオリゴヌクレオチドがリグナン配糖化ポリペプチドをコードしない場合でさえ、当業者は、本発明に係るポリヌクレオチドが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーとして本発明に係るポリペプチドを作製するために使用され得ることを容易に理解する。リグナン配糖化ポリペプチドをコードしない本発明に係るオリゴヌクレオチドの他の用途としては、以下が挙げられる：（１）ｃＤＮＡライブラリー中のリグナン配糖化酵素遺伝子またはその対立遺伝子もしくはスプライシング改変体の単離；（２）リグナン配糖化酵素遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、分裂中期染色体スプレッドへのインサイチュハイブリダイゼーション（例えば、「ＦＩＳＨ」）（Ｖｅｒｍａら，ＨｕｍａｎＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）に記載される）；および（３）特定の組織におけるリグナン配糖化酵素ｍＲＮＡ発現を検出するためのノーザンブロット分析。
【０１０７】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡやＲＮＡを包含する。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡメカニズムによる遺伝子発現操作のためのツールとして使用することができる。アンチセンスＲＮＡ技術によって、内因性遺伝子に由来する遺伝子産物の減少が観察される。本発明に係るオリゴヌクレオチドを導入することによって、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドの含量を低下させ得、その結果、植物中のリグナン配糖体含量または含量比を制御（増加または減少）させることができる。本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）の配列やベクター配列（発現ベクター配列を含む）などの配列を含むものであってもよい。
【０１０８】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得する方法としては、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を単離する種々の公知の方法が挙げられる。例えば、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列の一部と特異的にハイブリダイズするプローブを調製して、ゲノムＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすれば、本発明に係るポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを取得することができる。このようなプローブとしては、本発明に係るポリヌクレオチドの塩基配列またはその相補配列の少なくとも一部に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）であればよい。
【０１０９】
このようなハイブリダイゼーションによって選択されるポリヌクレオチドとしては、天然のポリヌクレオチド（例えば、ゴマ科植物やコケ科植物などの植物由来のポリヌクレオチド）が挙げられるが、植物以外に由来するポリヌクレオチドであってもよい。
【０１１０】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得する別の方法として、ＰＣＲを用いる方法が挙げられる。このＰＣＲ増幅方法は、例えば、本発明に係るポリヌクレオチドのｃＤＮＡの５’側および／または３’側の配列（またはその相補配列）を利用してプライマーを調製する工程、これらのプライマーを用いてゲノムＤＮＡ（またはｃＤＮＡ）等をテンプレートにしてＰＣＲ増幅する工程を包含することを特徴としており、本方法を使用すれば、本発明に係るポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を大量に取得することができる。
【０１１１】
本発明に係るポリヌクレオチドを取得するための供給源としては、特に限定されないが、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールを含む生物材料であることが好ましい。本明細書中で使用される場合、用語「生物材料」は、生物学的サンプル（生物体から得られた組織サンプルまたは細胞サンプル）が意図される。下述する実施例においては、ゴマを用いているが、これに限定されない。
【０１１２】
本発明に係るポリヌクレオチドを使用すれば、形質転換体または細胞においてリグナン配糖化活性を有するポリペプチドを合成することができる。
【０１１３】
本発明に係るポリヌクレオチドを用いれば、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを検出することによって、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドを発現する生物を容易に検出することができる。
【０１１４】
本発明に係るオリゴヌクレオチドは、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するハイブリダイゼーションプローブまたは当該ポリヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして利用することによって、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドを発現する生物または組織を容易に検出することができる。なおさらに、上記オリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用して、上記生物体またはその組織もしくは細胞におけるリグナン配糖化活性を有するポリペプチドの発現を抑制することができる。
【０１１５】
本発明に係るポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドがセサミノールまたはピノレジノールを配糖化する活性以外にピペリトールを配糖化する活性を有しているので、本発明に係るポリヌクレオチドの用途としてセサミノールまたはピノレジノールを配糖化してこれらの配糖体を生成することのみに限定されるべきではない。
【０１１６】
つまり、本発明の目的は、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールを配糖化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および当該ポリヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載したポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの作製方法等に存するのではない。したがって、上記各方法以外によって取得されるピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールを配糖化する活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもまた本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１１７】
（３）本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドの利用
本発明はさらに、本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いることによって生物（好ましくは、植物）中のリグナンおよびリグナン配糖体の量を制御（増加または減少）するための方法および当該制御された生物（好ましくは、植物）の利用を提供する。
【０１１８】
（Ａ）ベクター
本発明は、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドを生成するために使用されるベクターを提供する。本発明に係るベクターは、インビトロ翻訳に用いるベクターであっても組換え発現に用いるベクターであってもよい。
【０１１９】
本発明に係るベクターは、上述した本発明に係るポリヌクレオチドを含むものであれば、特に限定されない。例えば、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのｃＤＮＡが挿入された組換え発現ベクターなどが挙げられる。組換え発現ベクターの作製方法としては、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどを用いる方法が挙げられるが特に限定されない。
【０１２０】
ベクターの具体的な種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現可能なベクターが適宜選択され得る。すなわち、宿主細胞の種類に応じて、確実に本発明に係るポリヌクレオチドを発現させるために適宜プロモーター配列を選択し、これと本発明に係るポリヌクレオチドを各種プラスミド等に組み込んだベクターを発現ベクターとして用いればよい。
【０１２１】
本発明に係る発現ベクターは、導入されるべき宿主の種類に依存して、発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有する。細菌用発現ベクターのプロモーターとしては、慣用的なプロモーター（例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター等）が使用され、酵母用プロモーターとしては、例えば、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、ＰＨ０５プロモーター等が挙げられ、糸状菌用プロモーターとしては、例えば、アミラーゼ、ｔｒｐＣ等が挙げられる。また動物細胞宿主用プロモーターとしては、ウイルス性プロモーター（例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター等）が挙げられる。発現ベクターの作製は、制限酵素および／またはリガーゼ等を用いる慣用的な手法に従って行うことができる。発現ベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
【０１２２】
上記発現ベクターを用いて形質転換された宿主を、培養、栽培または飼育した後、培養物等から慣用的な手法（例えば、濾過、遠心分離、細胞の破砕、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等）に従えば、目的タンパク質を回収、精製することができる。
【０１２３】
発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むことが好ましい。このようなマーカーとしては、真核生物細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における培養についてはテトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１２４】
上記選択マーカーを用いれば、本発明に係るポリヌクレオチドが宿主細胞に導入されたか否か、さらには宿主細胞中で確実に発現しているか否かを確認することができる。あるいは、本発明に係るポリペプチドを融合ポリペプチドとして発現させてもよく、例えば、オワンクラゲ由来の緑色蛍光ポリペプチドＧＦＰ（ＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｔｅｉｎ）をマーカーとして用い、本発明に係るポリペプチドをＧＦＰ融合ポリペプチドとして発現させてもよい。
【０１２５】
上記の宿主細胞は、特に限定されるものではなく、従来公知の各種細胞を好適に用いることができる。具体的には、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）等の細菌、酵母（出芽酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、分裂酵母Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓｌａｅｖｉｓ）の卵母細胞等を挙げることができるが、特に限定されない。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は当分野で周知である。
【０１２６】
上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法、すなわち形質転換法も特に限定されるものではなく、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の従来公知の方法を好適に用いることができる。また、例えば、本発明に係るポリペプチドを昆虫で転移発現させる場合には、バキュロウイルスを用いた発現系を用いればよい。
【０１２７】
本発明に係るベクターを使用すれば、上記ポリヌクレオチドを生物または細胞に導入すれば、当該生物または細胞中にリグナン配糖化活性を有するポリペプチドを発現させることができる。さらに、本発明に係るベクターを無細胞タンパク質合成系に用いれば、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドを合成することができる。
【０１２８】
このように、本発明に係るベクターは、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含めばよいといえる。すなわち、発現ベクター以外のベクターも、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１２９】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種およびベクター作製方法を用いて取得したベクターも本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１３０】
（Ｂ）形質転換体または細胞
本発明は、上述したリグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入された形質転換体または細胞を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「形質転換体」は、組織または器官だけでなく、生物個体を含むことが意図される。
【０１３１】
形質転換体または細胞の作製方法（生産方法）は特に限定されないが、例えば、上述した組換えベクターを宿主に導入して形質転換する方法が挙げられる。また、形質転換の対象となる生物も特に限定されるものではなく、上記宿主細胞で例示した各種微生物、植物または動物が挙げられる。
【０１３２】
本発明に係る形質転換体または細胞は、これらの形質転換体または細胞が天然に有するリグナンおよび／またはリグナン配糖体の組成が改変されていることを特徴とする。本発明に係る形質転換体または細胞は、植物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることが好ましく、ゴマ、レンギョウまたはアマであることが特に好ましい。このような形質転換体または細胞は、本発明に係るリグナン配糖体含有量を制御する方法を用いることによって、リグナンを産生する生物中のリグナン配糖体の含有量を増加または減少させることができる。
【０１３３】
一実施形態において、本発明に係る形質転換体は、植物形質転換体であり得る。本実施形態に係る植物形質転換体は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように植物中に導入することによって取得される。
【０１３４】
組換え発現ベクターを用いる場合、植物体の形質転換に用いられる組換え発現ベクターは、当該植物内で本発明に係るポリヌクレオチドを発現させることが可能なベクターであれば特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター）を有するベクター、または外的な刺激によって誘導性に活性化されるプロモーターを有するベクターが挙げられる。
【０１３５】
本発明において形質転換の対象となる植物は、植物体全体、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）または植物培養細胞、あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどのいずれをも意味する。形質転換に用いられる植物としては、特に限定されず、単子葉植物綱または双子葉植物綱に属する植物のいずれでもよい。
【０１３６】
植物への遺伝子の導入には、当業者に公知の形質転換方法（例えば、アグロバクテリウム法、遺伝子銃、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法など）が用いられる。例えば、アグロバクテリウムを介する方法と直接植物細胞に導入する方法が周知である。アグロバクテリウム法を用いる場合は、構築した植物用発現ベクターを適当なアグロバクテリウム（例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ））に導入し、この株をリーフディスク法（内宮博文著、植物遺伝子操作マニュアル（１９９０）２７〜３１頁、講談社サイエンティフィック、東京）などに従って無菌培養葉片に感染させ、形質転換植物を得ることができる。また、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｍｉｃｒｉｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、６７、３２５（１９９０））が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクターをアグロバクテリウムに導入し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＭａｎｕａｌ（Ｓ．Ｂ．Ｇｅｌｖｉｎら、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載の方法で植物細胞または植物組織に導入する方法である。ここで、「植物組織」とは、植物細胞の培養によって得られるカルスを含む。アグロバクテリウム法を用いて形質転換を行う場合には、バイナリーベクター（ｐＢＩ１２１またはｐＰＺＰ２０２など）を使用することができる。
【０１３７】
また、遺伝子を直接植物細胞または植物組織に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法が知られている。遺伝子銃を用いる場合は、植物体、植物器官、植物組織自体をそのまま使用してもよく、切片を調製した後に使用してもよく、プロトプラストを調製して使用してもよい。このように調製した試料を遺伝子導入装置（例えばＰＤＳ−１０００（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）など）を用いて処理することができる。処理条件は植物または試料によって異なるが、通常は４５０〜２０００ｐｓｉ程度の圧力、４〜１２ｃｍ程度の距離で行う。
【０１３８】
遺伝子が導入された細胞または植物組織は、まずハイグロマイシン耐性などの薬剤耐性で選択され、次いで定法によって植物体に再生される。形質転換細胞から植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である。
【０１３９】
植物培養細胞を宿主として用いる場合は、形質転換は、組換えベクターを遺伝子銃、エレクトロポレーション法などで培養細胞に導入する。形質転換の結果得られるカルスやシュート、毛状根などは、そのまま細胞培養、組織培養または器官培養に用いることが可能であり、また従来知られている植物組織培養法を用い、適当な濃度の植物ホルモン（オーキシン、サイトカイニン、ジベレリン、アブシジン酸、エチレン、ブラシノライドなど）の投与などによって植物体に再生させることができる。
【０１４０】
遺伝子が植物に導入されたか否かの確認は、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法などによって行うことができる。例えば、形質転換植物からＤＮＡを調製し、ＤＮＡ特異的プライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲは、前記プラスミドを調製するために使用した条件と同様の条件で行うことができる。その後は、増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動などを行い、臭化エチジウム、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ液などによって染色し、そして増幅産物を１本のバンドとして検出することによって、形質転換されたことを確認することができる。また、予め蛍光色素などによって標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレートなどの固相に増幅産物を結合させ、蛍光または酵素反応などによって増幅産物を確認する方法も採用することができる。
【０１４１】
本発明に係るポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれた形質転換植物体が一旦取得されれば、当該植物体の有性生殖または無性生殖によって子孫を得ることができる。また、当該植物体またはその子孫、あるいはこれらのクローンから、例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラストなどを得て、それらを基に当該植物体を量産することができる。したがって、本発明には、本発明に係るポリヌクレオチドが発現可能に導入された植物体、もしくは、当該植物体と同一の性質を有する当該植物体の子孫、またはこれら由来の組織も含まれる。
【０１４２】
また、種々の植物に対する形質転換方法が既に報告されている。本発明に係る形質転換体植物としては、例えば、ゴマ、イネ、タバコ、オオムギ、コムギ、ナタネ、ポテト、トマト、ポプラ、バナナ、ユーカリ、サツマイモ、タイズ、アルファルファ、ルーピン、トウモロコシ、カリフラワー、バラ、キク、カーネーション、キンギョソウ、シクラメン、ラン、トルコギキョウ、フリージア、ガーベラ、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、ペチュニア、トレニア、チューリップ、レンギョウ、シロイヌナズナ、およびミヤコグサなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４３】
好ましい実施形態において、ゴマを使用して、本発明に係る形質転換体を作製することができる。ゴマの形質転換体の作製方法としては、例えば、Ｔ．Ａｓａｍｉｚｕ：ＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｅｓａｍｅｐｌａｎｔｓｕｓｉｎｇＭＡＴｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ：ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅｇｅｎｅｓ．ＳｅｓａｍｅＮｅｗｓｌｅｔｔｅｒ１６：２２〜２５（２００２）に記載されるような公知の方法が挙げられる。
【０１４４】
このようにして得た形質転換ゴマを用いれば、当該ゴマ内でリグナン配糖体を生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでリグナン配糖体（ピペリトール、セサミノールおよび／またはピノレジノール）を生産することができる。
【０１４５】
他の好ましい実施形態において、本発明に係る形質転換体として、タバコを好適に用いることができる。タバコは、ペチュニアなどとともに、形質転換が容易な代表的植物であり、細胞壁を取り除いた細胞の１個（プロトプラスト）から、植物１個体への再生が可能である。この再生された植物１個体は、多細胞に由来する１個体とは異なりキメラ状に陥らないため、形質転換体の作製を効率よく行うことができる。
【０１４６】
タバコの形質転換に好ましい方法としては、リーフディスク法が挙げられる。この方法は、操作が容易であり、かつ１枚の葉切片からいくつもの独立した形質転換体を得ることができる方法である。形質転換の方法はたとえば「新生物化学実験の手引き３核酸の分離・分析と遺伝子実験法化学同人１９９６年」に記載されている。
【０１４７】
具体的には、無菌的に育てたタバコの葉から、無菌シャーレ上でリーフディスクを切り出し、切り出したリーフディスクをＮＢ培地にて前培養する。次に、前培養したリーフディスクをアグロバクテリウムの感染菌液に浸して共存培養し、リーフディスクをカルベニシリンとカナマイシンとを補充したＮＢ培地に埋め込み、リーフディスクからカルスが形成されてシュートができるまで継代した後、シュートを得る。シュートが生長して茎葉部の区別が明確になった時点で、茎から切り取って抗生物質およびホルモンを含まないＭＳ培地に移す。切り取ったシュートから根が生じた後に、これを温室で育てる。シュートをホルモン含有培地に移して発根を促すと同時に、このシュートから葉を一部切り出してきてカルベニシリンおよびカナマイシンを補充した検定培地に移植する。移植の約１０日後に、葉がカルス化しているものはカナマイシン耐性個体とみなして回収し、褐変化してしまったものはカナマイシン感受性個体とみなして破棄する。
【０１４８】
このようにして得た形質転換タバコを用いれば、当該タバコ内でリグナン配糖体を生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでリグナン配糖体（ピペリトール、セサミノールおよび／またはピノレジノール）を生産することができる。
【０１４９】
別の好ましい実施形態において、本発明に係る形質転換体として、イネを好適に用いることができる。イネ形質転換体を作製する一実施形態を以下に記載する。
【０１５０】
本発明に係るポリヌクレオチドをハイグロマイシン耐性遺伝子を含有するバイナリーベクターｐＰＺＰ２０２に導入し、形質転換ベクターを構築する。本発明に係るポリヌクレオチドは、プロモーターＣａＭＶ３５Ｓとインフレームで作動可能に連結される。
【０１５１】
得られた形質転換ベクターを用いて、エレクトロポーレーションにより、５０ｍｇ／ｌのカナマイシンおよびハイグロマイシンの選択下でＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＥＨＡ１０１株を形質転換する。得られたアグロバクテリウム株は、使用するまで凍結保存する。
【０１５２】
野生型の種子から穎を除き玄米とし、これを７０％エタノールで３分間殺菌し、殺菌蒸留水で３回洗浄した後、さらに５０％の次亜塩酸ナトリウム溶液で３０分間殺菌し、そして殺菌蒸留水で５回洗浄する。この玄米を、３０ｇ／ｌスクロース、０．３ｇ／ｌカザミノ酸、２．８ｇ／ｌのプロリン、２．０ｍｇ／ｌの２，４−Ｄを添加し、４．０ｇ／ｌのゲルライトで固化させたＮ６培地（Ｃｈｕら、１９７５、Ｓｃｉ．Ｓｉｎｉｃａ、１８、６５９−６６８）を含むカルス誘導培地上に置く。なお、培地ｐＨはオートクレーブ前にｐＨ５．８に調整する。玄米を、２８℃で４週間明所で生育させ、約５ｍｍの大きさのカルスを得る。このカルスをアグロバクテリウム感染に用いる。
【０１５３】
グリセロール中で凍結保存した上記のアグロバクテリウムを、２０ｍｇ／ｌのカナマシイン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシン、１００ｍｇ／ｌのスペクノマイシンを含みｐＨ７．２に調整し、１５ｇ／ｌの寒天で固化したＡＢ培地（Ｃｈｉｌｔｏｎら、１９７４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７１、３６７２−３６７６）上で暗所で２８℃３日間の培養を行う。アグロバクテリウム菌体を集め、１０ｍｇ／ｌのアセトンシリンゴン（Ｈｉｅｉら、１９９４、ＰｌａｎｔＪ．、６、２７１−２８２）を含む液体ＡＡＭ培地（Ｈｉｅｉら、１９９４）に懸濁する。得られた懸濁液の中に上記のカルスを２分間浸漬した後、殺菌したペーパータオルで余分の水分を除き、これを１０ｍｇ／ｌアセトンシリンゴンを含む上記のカルス誘導培地に置き、暗所で２８℃、３日間の共存培養を行い、アグロバクテリウムを感染させる。得られた感染カルスを殺菌蒸留水で１０回洗浄し、最後に５００ｍｇ／ｌのカルベニシリンを含む殺菌蒸留水で１回洗浄した後、殺菌したペーパータオルで余分の水分を除く。このカルスを１０ｍｇ／ｌアセトンシリンゴン、５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、３００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含む上記のカルス誘導培地で２８℃、２週間の培養を行い、さらに５０ｍｇ／ｌハイグロマイシン、１００ｍｇ／ｌカルベニシリンを含むカルス誘導培地で４週間の培養を行う。ハイグロマイシン耐性カルスを選択し、３０ｇ／ｌのスクロース、３０ｇ／ｌのソルビトール、２ｇ／ｌのカザミノ酸、２．２ｍｇ／ｌのカイネチン、１．０ｍｇ／ｌのＮＡＡ、１００ｍｇ／ｌのカルベニシリン、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンおよび４ｇ／ｌのゲルライトを含むｐＨ５．８のＭＳ基礎培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．、１５、４７３−４９７）を含む再生培地に移す。
【０１５４】
このようにして得られる形質転換体は、ハイグロマイシンを含む再生培地で容易に再生し、土壌に移して栽培することができる。
【０１５５】
このようにして得た形質転換イネを用いれば、当該イネ内でリグナン配糖体を生産するため、低コストかつ環境に低負荷な生産プロセスでリグナン配糖体（ピペリトール、セサミノールおよび／またはピノレジノール）を生産することができる。
【０１５６】
本発明に係る形質転換体は、リグナン（特に、ピノレジノール、セサミノール、またはピペリトール）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該リグナンの配糖体を生産することができる。
【０１５７】
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された形質転換体を用いれば、植物などの生物に内在するリグナンを配糖化する反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでリグナン配糖体の大量調製が可能になる。さらに本発明は、リグナン配糖体を大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
【０１５８】
本発明に係る形質転換体を用いれば、リグナン配糖化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。
【０１５９】
一実施形態において、本発明に係る細胞は、種々の細菌宿主であり得る。本実施形態に係る細胞は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む組換えベクターを、当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが発現され得るように細胞中に導入することによって取得される。
【０１６０】
宿主としては、原核生物または真核生物を用いることができる。原核生物宿主としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）など）、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓなどを用いることができる。真核生物宿主としては、下等真核生物（例えば、酵母または糸状菌などの真核生物微生物）を用いることができる。酵母としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属微生物（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅなど）が挙げられ、糸状菌としては、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属微生物（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒなど）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属微生物が挙げられる。また、動物細胞または植物細胞が宿主として使用され得る。動物細胞としては、マウス、ハムスター、サル、ヒト等の細胞が挙げられる。さらに、昆虫細胞（例えば、カイコ細胞、またはカイコの成虫）もまた宿主として使用され得る。
【０１６１】
当業者は、本明細書中の記載に従えば、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入されれば、細菌から高等植物までの広範な生物にリグナン配糖化能を付与することができるということを容易に理解する。
【０１６２】
本発明に係る細胞は、リグナン（特に、ピノレジノール、セサミノール、またはピペリトール）を含む生物であれば、生物種を問わず、上記ポリヌクレオチドを導入することで当該リグナンの配糖体を生産することができる。
【０１６３】
本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターが導入された細胞を用いれば、当該細胞内でリグナン配糖化反応を触媒することができるので、低コストかつ環境に対して低負荷な生産プロセスでリグナン配糖体の大量調製が可能になる。さらに本発明は、リグナン配糖体を大量調製することによって安価な食品または工業製品を提供することができる。
【０１６４】
本発明に係る細胞を用いれば、リグナン配糖化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することができる。
【０１６５】
このように、本発明に係る形質転換体または細胞は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていればよいといえる。すなわち、組換え発現ベクター以外の手段によって生成された形質転換体または細胞も、本発明の技術的範囲に含まれる点に留意すべきである。
【０１６６】
また上述したように、本発明に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドがセサミノールおよび／またはピノレジノールを配糖化する活性以外にピペリトールを配糖化する活性を有しているので、本発明に係る形質転換体または細胞の用途としてセサミノールおよび／またはピノレジノールを配糖化してこれらの配糖体を生成することのみに限定されるべきではない。
【０１６７】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体または細胞を提供することにあるのであって、本明細書中に具体的に記載した個々のベクター種および導入方法に存するのではない。したがって、上記以外のベクター種および細胞種、ならびにベクター作製方法および細胞導入方法を用いて取得した形質転換体または細胞も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１６８】
（Ｃ）ポリペプチドの生産方法
本発明は、本発明に係るポリペプチドを生産する方法を提供する。本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、リグナン配糖化反応を触媒するポリペプチドを低コストでありかつ環境に低負荷な条件下で提供することが可能となる。また、本発明に係るポリペプチドの生産方法を用いれば、リグナン配糖化反応を触媒するポリペプチドを容易に生産することが可能となる。
【０１６９】
一実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを用いることを特徴とする。
【０１７０】
本実施形態の１つの局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを無細胞タンパク質合成系に用いることが好ましい。無細胞タンパク質合成系を用いる場合、種々の市販のキットを用いればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターと無細胞タンパク質合成液とをインキュベートする工程を包含する。
【０１７１】
本実施形態の他の局面において、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、組換え発現系を用いることが好ましい。組換え発現系を用いる場合、本発明に係るポリヌクレオチドを組換え発現ベクターに組み込んだ後、公知の方法により発現可能に宿主に導入し、宿主内で翻訳されて得られる上記ポリペプチドを精製するという方法などを採用することができる。組換え発現ベクターは、プラスミドであってもなくてもよく、宿主に目的ポリヌクレオチドを導入することができればよい。好ましくは、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上記ベクターを宿主に導入する工程を包含する。
【０１７２】
このように宿主に外来ポリヌクレオチドを導入する場合、発現ベクターは、外来ポリヌクレオチドを発現するように宿主内で機能するプロモーターを組み込んであることが好ましい。組換え的に産生されたポリペプチドを精製する方法は、用いた宿主、ポリペプチドの性質によって異なるが、タグの利用等によって比較的容易に目的のポリペプチドを精製することが可能である。
【０１７３】
本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを含む細胞または組織の抽出液から当該ポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。ポリペプチドを精製する工程は、周知の方法（例えば、細胞または組織を破壊した後に遠心分離して可溶性画分を回収する方法）で細胞や組織から細胞抽出液を調製した後、この細胞抽出液から周知の方法（例えば、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィー）によって精製する工程が好ましいが、これらに限定されない。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が精製のために用いられる。
【０１７４】
別の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然に発現する細胞または組織から当該ポリペプチドを精製することを特徴とする。本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述した抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明に係るポリペプチドを天然に発現する細胞または組織を同定する工程を包含することが好ましい。また、本実施形態に係るポリペプチドの生産方法は、上述したポリペプチドを精製する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１７５】
さらに他の実施形態において、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、本発明に係るポリペプチドを化学合成することを特徴とする。当業者は、本明細書中に記載される本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて周知の化学合成技術を適用すれば、本発明に係るポリペプチドを化学合成できることを、容易に理解する。
【０１７６】
以上のように、本発明に係るポリペプチドを生産する方法によって取得されるポリペプチドは、天然に存在する変異ポリペプチドであっても、人為的に作製された変異ポリペプチドであってもよい。
【０１７７】
変異ポリペプチドを作製する方法についても、特に限定されない。例えば、部位特異的変異誘発法（例えば、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ−Ｇｏｔｏｈ，Ｇｅｎｅ１５２，２７１−２７５（１９９５）参照）、ＰＣＲ法を利用して塩基配列に点変異を導入し変異ポリペプチドを作製する方法、またはトランスポゾンの挿入による突然変異株作製法などの周知の変異ポリペプチド作製法を用いることによって、変異ポリペプチドを作製することができる。変異ポリペプチドの作製には市販のキットを利用してもよい。
【０１７８】
このように、本発明に係るポリペプチドの生産方法は、少なくとも、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列、またはリグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて公知慣用技術を用いればよいといえる。
【０１７９】
つまり、本発明の目的は、リグナン配糖化活性を有するポリペプチドの生産方法を提供することにあるのであって、上述した種々の工程以外の工程を包含する生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１８０】
（Ｄ）リグナン配糖体生産方法
これまで、リグナンおよびリグナン配糖体の生産はゴマからの抽出により行われているので、大量生産ができない等の問題点を有していたが、本発明に従えば、リグナンおよびリグナン配糖体を低コストで大量生産できる。
【０１８１】
本発明は、本発明に係るポリペプチドを発現する生物体または細胞を用いてリグナン配糖体を生産する方法を提供する。上記生物体は、天然の未改変生物体であっても組換え発現系を用いた形質転換体であってもよい。本発明に係るリグナン配糖体生産方法は、リグナン（特に、ピノレジノール、セサミノール、またはピペリトール）を効率よく生産することができる。
【０１８２】
一実施形態において、本発明に係るリグナン配糖体生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドで形質転換された生物体またはその組織を用いてリグナン配糖体を生産することを特徴とする。好ましくは、上記生物体は、上述した形質転換体植物または細菌であり、特に好ましくは、大腸菌、ゴマ、レンギョウまたはアマである。
【０１８３】
本実施形態の好ましい局面において、本発明に係るリグナン配糖体生産方法は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程を包含する。ポリヌクレオチドを上記生物体に導入する工程としては、上述した種々の遺伝子導入方法を用いればよい。本実施形態のこの局面において、上記生物体は形質転換される前に産生したリグナン配糖体と形質転換後に産生するリグナン配糖体との間でその組成が異なる。具体的には、上記生物体から得られるリグナンおよびその配糖体は、その含有率が増加する。本実施形態のこの局面に係るリグナン配糖体生産方法は、上記生物体からリグナン配糖体を抽出する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１８４】
他の実施形態において、本発明に係るリグナン配糖体生産方法は、本発明に係るポリペプチドを天然に発現する生物体に、本発明に係るオリゴヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドとして導入する工程を包含する。オリゴヌクレオチドを上記生物体に導入する工程としては、上述したアンチセンスＲＮＡ技術を用いればよい。本実施形態に係るリグナン配糖体生産方法は、上述した抗体またはオリゴヌクレオチドを用いて本発明に係るポリペプチドを天然に発現する生物体を同定する工程をさらに包含することが好ましい。本実施形態のこの局面に係るリグナン配糖体生産方法は、上記上記生物体からリグナン配糖体を抽出する工程をさらに包含することが好ましい。
【０１８５】
本実施形態において、上記生物体は上記オリゴヌクレオチドを導入される前に産生したリグナン配糖体と導入後に産生するリグナン配糖体との間でその組成が異なる。具体的には、上記生物体から得られるリグナンおよびその配糖体は、その含有率が減少する。
【０１８６】
このように、本発明に係るリグナン配糖体の生産方法は、少なくとも、本発明に係るポリペプチドを発現する生物体を用いればよいといえる。
【０１８７】
つまり、本発明の目的は、本発明に係るポリペプチドによってリグナン配糖体の組成が改変された生物体に基づくリグナン配糖体生産方法を提供することにあるのであって、上記生物体として動物、植物または種々の細胞を用いる生産方法も本発明の技術的範囲に属することに留意しなければならない。
【０１８８】
（Ｅ）食品および工業製品
本発明は、上述のリグナン配糖体生産方法により得られたリグナン配糖体を用いて製造される食品および工業製品を提供する。本項で記載する食品は、上述した形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根であっても、上述した形質転換植物体から抽出されたリグナン配糖体を用いて製造された食品（例えば、ゴマ、レンギョウまたはアマ、あるいはこれらの加工食品）であってもよい。本発明に係る食品または工業製品は、所望する量のリグナン（特に、ピノレジノール、セサミノール、またはピペリトール）を含有することができる。
【０１８９】
例えば、上述のようにリグナン配糖体の含量が増加した本発明に係る形質転換植物から抽出されたリグナン配糖体抽出液は、リグナン配糖体の含量が高い食品として提供される。また、抽出したリグナン配糖体に限らず、上記形質転換植物体の種子、果実、切穂、塊茎、および／または塊根等もまた、リグナン配糖体を多く含む食品として提供される。リグナン配糖体組成を改変する対象は特に限定されるものではなく、植物以外にも動物、細菌、または酵母等のあらゆる生物を対象とすることが可能である。
【０１９０】
また、リグナンおよびリグナン配糖体の独特な物性に基づいて、本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、工業製品（例えば、フィルム、生分解性プラスティック、機能性繊維、潤滑油、または洗剤のような工業製品）の原料に利用され得る。
【０１９１】
本明細書において、ゴマのリグナン配糖化ポリペプチドを一例として記載されているが、本発明は、ゴマ由来のポリペプチドまたはポリヌクレオチドにのみ限定されるべきではなく、リグナン配糖化活性を有する全てのポリペプチド、およびその利用に関するものであることが、当業者には明白である。リグナン配糖化酵素は、植物、動物または微生物のいずれ由来でもよく、リグナン配糖化酵素活性を有していればリグナン量を制御することができる。さらに本発明は、リグナン配糖化酵素をコードするポリヌクレオチドを導入することによって作製されたリグナン量が調節された植物、その子孫またはこれらの組織に関し、その形態は切り花であってもよい。本発明に係るリグナン配糖化ポリペプチドを用いれば、リグナン配糖体の生成を促進または抑制することができる。また、慣用的な手法を用いれば、植物に上記ポリヌクレオチドを導入して当該ポリヌクレオチドを構成的あるいは組織特異的に発現させて、目的のポリペプチドの発現を増加させること、ならびに、アンチセンス法、同時サプレッション法およびＲＮＡｉ法などを用いることによって目的のポリペプチドの発現を抑制することができるということを、当業者は容易に理解する。
【０１９２】
本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、これに限定されるべきではない。
【実施例】
【０１９３】
実施例において用いる分子生物学的手法は、他で詳述しない限り、ＰＣＴ／ＪＰ０３／１０５００（発明の名称：転移酵素遺伝子）またはＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｕｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法に従った。
【０１９４】
〔実施例１：ゴマｃＤＮＡライブラリーの作製〕
ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造業者が推奨する方法に従って使用して、ゴマの種子から総ＲＮＡを抽出した。続いて、オリゴテックス−ＭＡＧｍＲＮＡ精製キット（ＴａＫａＲａ）を使用して、ポリＡ（＋）ＲＮＡ５μｇを得た。ＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔａｎｄＺＡＰＥｘｐｒｅｓｓｃＤＮＡＧｉｇａｐａｃｋ３ＧｏｌｄＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を製造業者の推奨する方法に従って使用して、このポリＡ（＋）ＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作製した。作製したライブラリーは１×１０⁷ｐｆｕ／ｍｌであった。
【０１９５】
〔実施例２：ハイブリダイゼーションプローブの作製〕
植物は、基質および転移する糖の種類に対応する種々の糖転移酵素を有しており、そのうちの多くの糖転移酵素は１つのファミリータイプに属する。このタイプに属する糖転移酵素は、Ｃ末端部分に［Ｆ／Ｖ／Ａ］−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ］−［Ｔ／Ｓ］−［Ｈ／Ｑ］−［Ｓ／Ｇ／Ａ／Ｃ］−ＧＸＸ−［Ｓ／Ｔ／Ｇ］−ＸＸ−［Ｄ／Ｅ］−ＸＸＸＸＸＸＰ−［Ｌ／Ｉ／Ｖ／Ｍ／Ｆ／Ａ］−ＸＸ−Ｐ−［Ｌ／Ｍ／Ｖ／Ｆ／Ｉ／Ｑ］−ＸＸ−［Ｄ／Ｅ］−Ｑというコンセンサス配列を有する（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，７２５５（１９９７）を参照のこと）。
【０１９６】
異なる５種の植物由来の糖転移酵素遺伝子（ＧＴ）におけるコンセンサス配列をＰＣＲ増幅して得た。具体的には、アサガオ由来のＵＤＰ−グルコース：アントシアニジン３−グルコシド糖転移酵素（３ＧＧＴ）、ペチュニア由来３ＧＴ、バーベナ由来５ＧＴ、コガネバナＧＴ、およびリンドウ由来のＵＤＰ−グルコース：アントシアニン３’−糖転移酵素（３’ＧＴ）のコンセンサス配列を、以下の５組のプライマー（配列番号１１〜２０）を用いてＲＴ−ＰＣＲによって下述するように取得した。
（アサガオ３ＧＧＴ）
５’−ｇａａａｔｇｇｔｃｇｇａｔｔｇｇｃｔｇｇｇ−３’（配列番号１１）
５’−ａｃｃｔｃｃａｃｃｃｃａａｃｔｔｔｃａｇｇ−３’（配列番号１２）
（ペチュニア３ＧＴ）
５’−ｇａｔｇｃａｔａａｔｔｔｇｇｃｔａｇａａａａｇｃ−３’（配列番号１３）
５’−ｃｃａａｔｔｔｇｃｃａａａｃａｃｔｔｔｃｃ−３’（配列番号１４）
（バーベナ５ＧＴ）
５’−ｔｇｃｃｔｃｇａａｔｇｇｔｔｇａｇｃａｃｇ−３’（配列番号１５）
５’−ｃｔｃｔｃａｃｔｃｔｃａｃａｃｃｃｇ−３’（配列番号１６）
（コガネバナＧＴ）
５’−ｃａｃｇａａｔｇｃｔｔａｇｃａｔｇｇｃｔｃ−３’（配列番号１７）
５’−ｃｔｔａｔｔｇｃｃｃａｃｔｇａａａｃｃｃｃ−３’（配列番号１８）
（リンドウ３’ＧＴ）
５’−ｔｇｔｃｔｇａａｔｔｇｇｃｔｔｇａｔｔｃｃ−３’（配列番号１９）
５’−ａａｃｃｃａｃａｇａａａｃｃｃｃｔｇｔｔｃ−３’（配列番号２０）。
【０１９７】
ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、上記の各種植物から総ＲＮＡを抽出した後、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TM Ｆｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造業者が推奨する条件に従って使用して、総ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応液（５０μｌ）は、各ｃＤＮＡ１μｌ、１×Ｔａｑｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、プライマー（配列番号１１〜２０）各０．４ｐｍｏｌ／μｌ、ｒＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ２．５Ｕからなる。ＰＣＲ反応を以下のように行った：９４℃で５分間反応させた後、９４℃で１分間、５３℃で１分間、７２℃で２分間の反応を２８サイクル。
【０１９８】
非ラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ社）を、製造者が推奨するＰＣＲ条件に従って使用して、ＲＴ−ＰＣＲによって得られたフラグメントにＤＩＧ標識を導入した。このＤＩＧ標識化フラグメントを、ハイブリダイゼーション用プローブとして以下の実験に用いた。
【０１９９】
〔実施例３：ゴマ由来糖転移酵素群のスクリーニング〕
非ラジオアイソトープＤＩＧ−核酸検出システム（ロシュ・ダイアグノスティックス）を製造者の推奨する方法に従って使用して、実施例１で得たｃＤＮＡライブラリーを、実施例２で得たプローブを用いてスクリーニングした。
【０２００】
ハイブリダイゼーション緩衝液（５×ＳＳＣ、３０％ホルムアミド、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１％ＳＤＳ、２％ブロッキング試薬（ロシュ社）、０．１％ラウロイルサルコシン、８０ｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）を用いて３７℃で２時間プレハイブリダイゼーションを行った後、実施例２で得たプローブを添加して、さらに一晩インキュベートした。メンブレンを、１％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣ洗浄液中にて５５℃で３０分間洗浄した。約３×１０⁵ｐｆｕのプラークをスクリーニングして、約５００個の陽性クローンを得た。
【０２０１】
ｃＤＮＡライブラリー合成キットを製造業者が推奨する方法に従って使用して、上記５００個のクローンをｐＢＫ−ＣＭＶプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に挿入した。Ｍ１３ＲＶおよびＭ１３Ｍ４（−２０）のプライマー対を用いて、挿入物の部分ＤＮＡ配列を決定した。得られたＤＮＡ配列に基づいて得た推定のアミノ酸配列を用いてデータベース検索を行い、１８種類のゴマ由来糖転移酵素（ＳｉＧＴ）の部分配列を得た。ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒｍｏｄｅｌ３１００（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマーウォーキング法によって得られた１８種類のｃＤＮＡの塩基配列を決定した。
【０２０２】
得られたＳｉＧＴ遺伝子の部分配列をＢｌａｓｔｘ解析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）にかけて、糖転移酵素と相同性があることを確認した。Ｂｌａｓｔｘ解析の条件は以下のとおりである。
プログラム：Ｂｌａｓｔｘｖｅｒ．２．２．９、データベース：ｎｒ、遺伝コード：ｓｔａｎｄａｒｄ（１）、フィルタ：ＬＯＷｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ、Ｅｘｐｅｃｔ：１０、Ｗｏｒｄｓｉｚｅ：３、マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２、ＧａｐＣｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ１。
【０２０３】
〔実施例４：ゴマ由来糖転移酵素群の発現解析〕
得られた各ＳｉＧＴがどの時期においてどの器官に発現しているかを確認するために、得られたＳｉＧＴの部分配列に基づいて設計したプライマーを用いて逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。
【０２０４】
ＲＮｅａｓｙＰｌａｎｔＭｉｎｉＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ゴマ植物の各器官（葉、茎、鞘、種子（成長ステージ：若い順に１〜４）、および発芽種子（図１Ａ））から総ＲＮＡを抽出した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ^TM Ｆｉｒｓｔ−ＳｔｒａｎｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｆｏｒＲＴ−ＰＣＲ（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）を製造業者が推奨する条件に従って使用して、総ＲＮＡ１μｇからｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ反応液（２５μｌ）は、ｃＤＮＡ１μｌ、１×Ｅｘ−Ｔａｑｂｕｆｆｅｒ（ＴａｋａＲａ）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、Ｅｘ−Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．２５Ｕからなる。９４℃で５分間の後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行ってＰＣＲ増幅した後、７２℃で７分間保持した。ＳｉＧＴ遺伝子の発現量と内在性遺伝子の発現量とを比較するために、内部標準となる遺伝子のＰＣＲ反応を同時に行った。具体的には、Ｓｉ１８ＳｒＲＮＡ−Ｆプライマー（配列番号５７）およびＳｉ１８ＳｒＲＮＡ−Ｒプライマ−（配列番号５８）を用いてゴマの１８ＳｒｉｂｏｓｏｍａｌＲＮＡ遺伝子（アクセッション番号：ＡＦ１６９８５３）のＰＣＲ反応を行った。また、ＰＣＲ反応のポジティブコントロールとなる遺伝子のＰＣＲ反応を同時に行った。具体的には、ＳｉＰ１８９−Ｂａｍ−ＦＷプライマー（配列番号５９）およびＳｉＰ１８９−Ｘｈｏ−ＲＶプライマ−（配列番号６０）を用いてゴマのセサミン合成酵素遺伝子であるＳｉＰ１８９のＰＣＲ反応を行った。
【０２０５】
以下のプライマーをＳｉＧＴ増幅用に用いた（配列番号２１〜５６）。
ＳｉＧＴ１−ＦＷ：５’−ｔａｇａｔｇａａｔｔｔｇｔｃｇｇａａａｇａ−３’（配列番号２１）
ＳｉＧＴ１−ＲＶ：５’−ｔａｔａａｔｇｔｔａｃａａａａｔｃａａｃｔ−３’（配列番号２２）
ＳｉＧＴ２−ＦＷ２：５’−ｇｇｃａｇａｇｔｔｔｔｃｔａｔｇｇｇｔｔｇｔ−３’（配列番号２３）
ＳｉＧＴ２−ＲＶ：５’−ａｔａｇｃａｇｔｇｇｇｇｃｔａｇａａａｇａ−３’（配列番号２４）
ＳｉＧＴ３−ＦＷ：５’−ｃｃｔｇｔａａｃｔａｇａａｔｇｇｃｇｔｃａａｔ−３’（配列番号２５）
ＳｉＧＴ３−ＲＶ：５’−ｔｔｔｇａｃａａａａｃｃａａａａｃｃａｃａｃｔｔ−３’（配列番号２６）
ＳｉＧＴ４−ＦＷ２：５’−ｔｔｔａｇｃｔｃｇｔｔｔｔｃｔｃｃｔｃｔｃａｔｔ−３’（配列番号２７）
ＳｉＧＴ４−ＲＶ：５’−ｃｔａｃａｔｇｔｔａｔｔａｃａｔｃｔａｃａｇａａ−３’（配列番号２８）
ＳｉＧＴ５−ＦＷ２：５’−ｃａｔｃｔｃａａｔｃｃａｔａａｔｇｃａｇａ−３’（配列番号２９）
ＳｉＧＴ５−ＲＶ：５’−ａａｃａａｇａａｃｔｃａｃｔｔｇａａｇａｔａａｔ−３’（配列番号３０）
ＳｉＧＴ６−ＦＷ：５’−ｇｃｃａｔｔｇａｃａｇｇｔａｔｇａｇｔｔａ−３’（配列番号３１）
ＳｉＧＴ６−ＲＶ：５’−ｇａｔｃｔａａｔｇｔｔｔａｃａｔａｇｔａｔｃｃｔ−３’（配列番号３２）
ＳｉＧＴ７−ＦＷ２：５’−ｃａｔｃａｃｃｃａｃｔｔｃａｔｔｔｃｃａａ−３’（配列番号３３）
ＳｉＧＴ７−ＲＶ：５’−ａｔｔａｔｔａｔｔａｔｔｔｔｔｃａａｔａａｔｔａ−３’（配列番号３４）
ＳｉＧＴ８−ＦＷ２：５’−ｔｔｔａｔｃｃｔｇｔｇｇｇｇｃｃａａｔａｃｔｔ−３’（配列番号３５）
ＳｉＧＴ８−ＲＶ：５’−ｔｃｔｔｇｃｃａｔｔｃａｃａｔｔｃａｇａｔｔｇａ−３’（配列番号３６）
ＳｉＧＴ９−ＦＷ２：５’−ａｃａａｃｔａａｇｃａｔａａｇｔｃａｃｔｔａａａ−３’（配列番号３７）
ＳｉＧＴ９−ＲＶ：５’−ｇｃｃｔｔｃｔｔｃｇｃｔｔｇｇｔｃａｇａｔ−３’（配列番号３８）
ＳｉＧＴ１０−ＦＷ２：５’−ｇａａｇｃｃｇｃｃａｇｇｔａｔｔｔｇｃｔｔ−３’（配列番号３９）
ＳｉＧＴ１０−ＲＶ：５’−ａｃａａｇａｔａａａａｃａｔａａｔｃｃｔａ−３’（配列番号４０）
ＳｉＧＴ１１−ＦＷ２：５’−ｔｔｔｃｃａｇｃｔｃａａｇｇｃｃａｔａｔｔａａｔ−３’（配列番号４１）
ＳｉＧＴ１１−ＲＶ：５’−ｔａｃａａａｃｇａｃａｃａｇａｇａａａｔａｇｇａ−３’（配列番号４２）
ＳｉＧＴ１２−ＦＷ２：５’−ａａｇｔａｃａａｇｔｇｇａｔｇｇａｔａｔａ−３’（配列番号４３）
ＳｉＧＴ１２−ＲＶ：５’−ａｃｇｇｃｔｔａｔｔｃｃａａｃｔａｔｃｔａａｃａ−３’（配列番号４４）
ＳｉＧＴ１３−ＦＷ２：５’−ａｇｇｔｔｔｔｇａｇａａｃｔｇｇａｇｔｔｔ−３’（配列番号４５）
ＳｉＧＴ１３−ＲＶ：５’−ｔａａｔａａａｇｃｔｇｇａａａｃｔｔｃａｃｃａａ−３’（配列番号４６）
ＳｉＧＴ１４−ＦＷ２：５’−ｃｔａｇｔｇｇａｇｃｔａｇｇａａａａｃｔｃａｔ−３’（配列番号４７）
ＳｉＧＴ１４−ＲＶ：５’−ａｇａｔｔａａｇｃａｃｇｔｔｔｃｃａｃａａ−３’（配列番号４８）
ＳｉＧＴ１５−ＦＷ：５’−ｔｇａｔｃａａｇｔｔｇｃｃｇｔｇｇｔａａｔ−３’（配列番号４９）
ＳｉＧＴ１５−ＲＶ：５’−ａａｃｇｔａｃａａｇａａｇｔａｔａｔａｔｔ−３’（配列番号５０）
ＳｉＧＴ１６−ＦＷ２：５’−ｔｔｔｃｔｔｃｃｇａｔｇａｔａｇｃｔｃａｔ−３’（配列番号５１）
ＳｉＧＴ１６−ＲＶ：５’−ｇｔｃａａｃｔｔａｔｃｔｇｇａａｇａｔｃａ−３’（配列番号５２）
ＳｉＧＴ１７−ＦＷ２：５’−ａｃｇｇｇａａｔｃａｇｇｔｃｔｔｇａｃａｔ−３’（配列番号５３）
ＳｉＧＴ１７−ＲＶ：５’−ｇａｔｇａｔｔｇａｔｃａａｃａｇｔｇｃａｔｃｔｔ−３’（配列番号５４）
ＳｉＧＴ１８−ＦＷ：５’−ｃｃａｔｃｇｇａａｔｔａｃｃａｔｃｔｇａａ−３’（配列番号５５）
ＳｉＧＴ１８−ＲＶ：５’−ａｔａａｔｃａａａｇｇｔｃｔｃｔｇｃａａａ−３’（配列番号５６）
Ｓｉ１８ＳｒＲＮＡ−ＦＷ：５’−ｔａｔｇｃｔｔｇｔｃｔｃａａａｇａｔｔａａ−３’（配列番号５７）
Ｓｉ１８ＳｒＲＮＡ-ＲＶ：５’−ａａｃａｔｃｔａａｇｇｇｃａｔｃａｃａｇａ−３’（配列番号５８）
ＳｉＰ１８９−Ｂａｍ−ＦＷ：５’−ｇｇａｔｃｃｔｔｔｔｃａｇｃｃａａｃａｔｇｇａａｇｃｔｇａａ−３’（配列番号５９）
ＳｉＰ１８９−Ｘｈｏ−ＲＶ：５’−ｃｔｃｇａｇａａａａａｇａｇｃａｔｃａｔｔｔａａｔｃａｔａｃａｃｔ−３’（配列番号６０）。
【０２０６】
上記のＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析の結果、１８種のＳｉＧＴ遺伝子のうち、５種のＳｉＧＴ（ＳｉＧＴ１、ＳｉＧＴ３、ＳｉＧＴ５、ＳｉＧＴ８およびＳｉＧＴ１０）が、種子および発芽種子において強い発現を示した（図１Ｂ）。これらの発現パターンは、リグナン配糖体の蓄積パターンと相反しない。
【０２０７】
〔実施例５：ゴマ糖転移酵素遺伝子の完全長ＯＲＦのクローニング〕
ＳｉＧＴ３を除く４種のＳｉＧＴは、ライブラリーのスクリーニングによって得られたクローンが推定ＯＲＦの５’領域を含んでいなかったため、５’ＲａｐｉｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃＤＮＡＥｎｄ（以下、５’ＲＡＣＥ）法を使用して、それぞれのＳｉＧＴ遺伝子の５’領域を増幅した。具体的には、ＧｅｎｅＲａｃｅｒｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を製造業者の推奨する方法に従って使用して、以下のプライマー（配列番号６１〜６８）を用いて、ＳｉＧＴ１、ＳｉＧＴ５，ＳｉＧＴ８、およびＳｉＧＴ１０のｃＤＮＡ各々の５’領域を増幅した。
ＧＲ−ＳｉＧＴ１−ＲＶ：５’−ｇｇｇａａａｔｇｃｃｃａｔｔｃｔｃｔｃｔｃａｇａａｇｇｔ−３’（配列番号６１）
ＧＲ−ＳｉＧＴ１−Ｎｅｓｔ−ＲＶ：５’−ｇｔａａｇｃｔａｇａｇｔａａａａａｃｃａａ−３’（配列番号６２）
ＧＲ−ＳｉＧＴ５−ＲＶ：５’−ｇｃｃｃａｇｇｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｃｃａｃｃａｃｔｃｔｃｔ−３’（配列番号６３）
ＧＲ−ＳｉＧＴ５−Ｎｅｓｔ−ＲＶ：５’−ａａｔｃｔｇｃａｇｇｔａｔｔｇｔａｔａａａｔｃｔ−３’（配列番号６４）
ＧＲ−ＳｉＧＴ８−ＲＶ：５’−ｃｃａｃａｇｃａａｔｃｔｃｃｔｔｃａｃｃｔｇａｔｃｃｃｃｔｔｃｃａ−３’（配列番号６５）
ＧＲ−ＳｉＧＴ８−Ｎｅｓｔ−ＲＶ：５’−ｃａａａｇｃａａａｇａａａｃａｃｔａｃａｇａａｇａａｔ−３’（配列番号６６）
ＧＲ−ＳｉＧＴ１０−ＲＶ：５’−ｃｃｔｃｃｇｃｔｔｃｃｃａａｃｃｔｃａａｃｃｇｃｃｃａｇｔａ−３’（配列番号６７）
ＧＲ−ＳｉＧＴ１０−Ｎｅｓｔ−ＲＶ：５’−ａｃｇｔａｔｃｇｇｃａａｔｔａｔａａａａｔｔａａ−３’（配列番号６８）。
【０２０８】
５’ＲＡＣＥ法によって得られた増幅断片の塩基配列を、プライマーウォーキング法によって決定し、各ＳｉＧＴの完全長オープンリーディングフレームを含む配列情報を得た（配列番号１〜１０）。各ＳｉＧＴの塩基配列およびアミノ酸配列を、配列番号１および２（ＳｉＧＴ８）、配列番号３および４（ＳｉＧＴ１０）、配列番号５および６（ＳｉＧＴ１）、配列番号７および８（ＳｉＧＴ３）、ならびに配列番号９および１０（ＳｉＧＴ５）に示す。
【０２０９】
得られたＳｉＧＴ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ配列をＢｌａｓｔｘ解析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）によって相同性を有する既知タンパク質を検索した。Ｂｌａｓｔｘ解析の条件は以下のとおりである。
プログラム：Ｂｌａｓｔｘｖｅｒ．２．２．９、データベース：ｎｒ、遺伝コード：ｓｔａｎｄａｒｄ（１）、フィルタ：ＬＯＷｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ、Ｅｘｐｅｃｔ：１０、Ｗｏｒｄｓｉｚｅ：３、マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２、ＧａｐＣｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ１。
【０２１０】
Ｂｌａｓｔｘ解析の結果、ＳｉＧＴ１は、シロイヌナズナ配糖化酵素（Ａｔ２ｇ３６９７０）と４７％の配列同一性を示し、ＳｉＧＴ３は、シロイヌナズナ配糖化酵素（Ａｔ２ｇ３６７８０）と５４％の配列同一性を示し、ＳｉＧＴ５は、インゲンマメ配糖化酵素（ＡＡＭ０９５１６）と５０％の配列同一性を示し、ＳｉＧＴ８は、タバコ配糖化酵素（ＢＡＢ６０７２０）と５６％の配列同一性を示し、ＳｉＧＴ１０は、シロイヌナズナ配糖化酵素（Ａｔ２ｇ３０１５０）と４９％の配列同一性を示した。このように、ＳｉＧＴと既知の配糖化酵素との配列同一性はいずれも低かった。従って、得られたＳｉＧＴ遺伝子群の機能を推定することはできなかった。すなわち、得られたＳｉＧＴ遺伝子群は、これまでに単離されていないリグナン配糖化酵素である可能性が非常に高い。
【０２１１】
〔実施例６：大腸菌発現ベクター構築〕
ＳｉＧＴ１に対して配列番号６９および７０、ＳｉＧＴ３に対して配列番号７１および７２、ＳｉＧＴ５に対して配列番号７３および７４、ＳｉＧＴ８に対して配列番号７５および７６、およびＳｉＧＴ１０に対して配列番号７７および７８のプライマー対を使用して、各ＳｉＧＴのｃＤＮＡの開始メチオニンコドン（ＡＴＧ）の上流にＮｃｏＩ部位を、終始コドンの下流にＫｐｎＩ部位を有するフラグメントをＰＣＲ増幅した。
【０２１２】
ＰＣＲ反応液（２５μｌ）は、テンプレートとしてのゴマ種子ｃＤＮＡ、各プライマー０．２ｐｍｏｌ／μｌ、１×ＫＯＤｐｌｕｓｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭＭｇＳＯ₄、１ＵＫＯＤｐｌｕｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる。９４℃で５分間反応させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間の反応を３０サイクル行ってＰＣＲ増幅した後、７２℃で３分間保持した。得られた各ＰＣＲ産物を、製造者が推奨する方法に従ってｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマルチクローニング部位に挿入して、ＳｉＧＴ１／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（ｐＳＰＢ２６３０と称する）、ＳｉＧＴ３／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（ｐＳＰＢ２６４３と称する）、ＳｉＧＴ５／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（ｐＳＰＢ２６４４と称する）、ＳｉＧＴ８／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（ｐＳＰＢ２６３１と称する）、およびＳｉＧＴ１０／ｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（ｐＳＰＢ２６３３と称する）を得た。ＰＣＲに用いたプライマーを以下に示す（配列番号６９〜７８）。
ＮｃｏＩ−ＳｉＧＴ１−ＦＷ２：５’−ａａａｃａｇｃａａａｃａｇａａａｃｃａｔｇｇｃｃｇａｇｔｇｔ−３’（配列番号６９）
ＢｇｌＫｐｎＩ−ＳｉＧＴ１−ＲＶ：５’−ｔｔｔｇｇｔａｃｃａｇａｔｃｔｔｔｔｇｃａｇｃｔａｇｔｃａａｃｔａｔｔａｔｔｔａａｔａｃｔｔｇｔａｇｔ−３’（配列番号７０）
ＮｃｏＩ−ＳｉＧＴ３−ＦＷ：５’−ａａａａｃｃａｔｇｇｃｇｔｃａａｔｇｇｃｃａｔｃｃａａｇａａｃａａ−３’（配列番号７１）
ＫｐｎＩＢｇｌ−ＳｉＧＴ３−ＲＶ：５’−ａａａａｇａｔｃｔｇｇｔａｃｃｔｃａｇｔｇｇａｃｃａｔｇａｃａａｃａｔｃａｇａａｔｔｔｔｃａｔ−３’（配列番号７２）
ＮｃｏＩ−ＳｉＧＴ５−ＦＷ：５’−ａａａａｃｃａｔｇｇｇｃａｇｃｔｔｇａｇｃａａｔｃａａｃａｇａ−３’（配列番号７３）
ＫｐｎＩ−ＳｉＧＴ５−ＲＶ：５’−ａａａｇｇｔａｃｃｃｔａｔｃｔｔａｔｔａｔａｔｇｇｇｃａａｃａａａｇｇａａｔ−３’（配列番号７４）
ＮｃｏＩ−ＳｉＧＴ８−ＦＷ：５’−ａａａａｃｃａｔｇｇｃｇｇｃｇｇａｃｃａａａａａｔｔａａ−３’（配列番号７５）
ＫｐｎＩ−ＳｉＧＴ８−ＲＶ：５’−ａａａｇｇｔａｃｃｔｃａａｇａａａｔｇｔｔａｔｔｃａｃｇａｃａｔｔ−３’（配列番号７６）
ＮｃｏＩ−ＳｉＧＴ１０−ＦＷ：５’−ａａａａｃｃａｔｇｇｃｇｃｃｇｇｃｇｇｃｇａｇａａｃｃｇａｃｃｃａａｔｃａｔ−３’（配列番号７７）
ＫｐｎＩ−ＳｉＧＴ１０−ＲＶ：５’−ｔｔｔｇｇｔａｃｃｔｃａｇｃｔａａａｃｇａｔｇｃａａｔａｔｃａｔｃｇａｇｇａａ−３’（配列番号７８）。
【０２１３】
ｐＳＰＢ２６３０、ｐＳＰＢ２６４３、ｐＳＰＢ２６４４、ｐＳＰＢ２６３１、およびｐＳＰＢ２６３３に含まれるＳｉＧＴ塩基配列を解析して、正しくＰＣＲが行われたことを確認した。これらのプラスミドをＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで消化して得た完全長ＳｉＧＴを含む約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、大腸菌発現ベクターであるｐＱＥ６１ベクター（ＱＩＡＧＥＮ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩサイトに挿入して、ＳｉＧＴ１／ｐＱＥ６１（ｐＳＰＢ２６３７と称する）、ＳｉＧＴ３／ｐＱＥ６１（ｐＳＰＢ２６４２と称する）、ＳｉＧＴ５／ｐＱＥ６１（ｐＳＰＢ２６４５と称する）、ＳｉＧＴ８／ｐＱＥ６１（ｐＳＰＢ２６３９と称する）、およびＳｉＧＴ１０／ｐＱＥ６１（ｐＳＰＢ２６４０と称する）を得た。
【０２１４】
〔実施例７：組換えタンパク質の調製〕
実施例６で作製した大腸菌発現ベクターｐＳＰＢ２６３７、ｐＳＰＢ２６４２、ｐＳＰＢ２６４５、ｐＳＰＢ２６３９、およびｐＳＰＢ２６４０で、大腸菌株ＪＭ１０９（ＴＯＹＯＢＯ）を形質転換し、最終濃度２０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地中にて３７℃で一晩前培養した。前培養液の一部をアンピシリン５０μｇ／ｍｌ、カザミノ酸０．５％を含むＭ９培地（１０ｍｌ）に添加して、Ａ₆₀₀＝０．６〜１．０に達するまで振盪培養した。Ｍ９培地の組成は以下の通りである。１×Ｍ９塩、１ｍＭＭｇＳＯ₄、０．２％グルコース、０．００１％塩酸チアミンを含む。１０×Ｍ９培地の組成は以下の通りである。Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ３０ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄ １５ｇ、ＮａＣｌ２．５ｇ、およびＮＨ₄Ｃｌ５ｇを含む５００ｍｌ水溶液。次いで、培養液に最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を加え、さらに３０℃で一晩振盪培養した後、３０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離を行って集菌した。菌体を１０ｍｌの緩衝液（３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭＮａＣｌ）に懸濁した後に超音波処理を行って大腸菌を破砕し、次いで、１５，０００ｒｐｍにて４℃で１０分間遠心分離を行い、得られた上清を粗酵素液として以下の活性測定に用いた。
【０２１５】
〔実施例８：ゴマリグナン配糖化酵素による生成物のＨＰＬＣ分析〕
ピノレジノールまたはセサミノールを少量のＤＭＳＯに溶解した後に７０％エタノールに溶解して基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ）を調製した。この基質溶液１０μｌ、大腸菌で発現させた５種類のＳｉＧＴの上記粗酵素液２００μｌおよび２０ｍＭＵＤＰ−グルコース２．５μｌを反応チューブ中で混合した後、３０℃で１時間反応させた。ピノレジノールおよびセサミノールは、例えば、公知の方法（日本農芸化学会誌６７：１６９３（１９９３））に従ってゴマから抽出および精製して得ることができる。
【０２１６】
０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）を含む１００％アセトニトリル（２５０μｌ）を反応チューブに添加することによって、酵素反応を停止させた。反応チューブをボルテックスミキサーで激しく攪拌した後、１５，０００ｒｐｍにて４℃で５分間遠心分離し、得られた上清をフィルター（ポアサイズ０．４５ｍｍ、４ｍｍＭｉｌｌｅｘ−ＬＨ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて清浄化した後、液体高速クロマトグラフィー（以下ＨＰＬＣ）を用いてこの上清を分析した。リグナンおよびその配糖体の分析条件は以下の通りである。
【０２１７】
Ｃ−３０カラム（野村化学Ｃ３０−ＵＧ−５、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いて液体クロマトグラフィー（Ｌｃ−２０１０ｃ（島津製作所））を行った。移動相には、Ａ液として、０．１％ＴＦＡ、Ｂ液として、０．１％ＴＦＡを含む９０％アセトニトリルを用いた。Ａ液６０％：Ｂ液４０％の混合液を用いてカラムを平衡化した（２０分間）後、直線濃度勾配（Ａ液６０％：Ｂ液３５％→Ａ液１０％：Ｂ液９０％）を用いて１５分間にわたって溶出（流速０．６ｍｌ／分）し、Ａ液１０％：Ｂ液９０％を用いて１０分間溶出した。２８７ｎｍの吸収を測定して、サンプル中に含有される化合物を検出した。化合物の各ピークを、ＳＰＤ−１０ＡＶ（島津製作所）を用いて１９０ｎｍ〜４００ｎｍのスペクトルを測定し、リグナンに特徴的な２つの吸収極大（２３０ｎｍおよび２８０ｎｍ）を有する物質を探索した。この条件下で、ピノレジノール標準品は約８．４分、ピペリトール標準品は約１２．８分、セサミノール標準品は約１３．８分に検出される（図２および図３）。
【０２１８】
ＳｉＧＴ８組換えタンパク質とピノレジノールとの反応液中において、リグナンのスペクトル（保持時間約４．０分）を有するピークＡが新たに得られた（図２Ｂ）。また、ＳｉＧＴ８組換えタンパク質とセサミノールとの反応液中において、リグナンのスペクトル（保持時間約８．２分）を有するピークＢが新たに得られた（図２Ｇ）。
【０２１９】
ＳｉＧＴ１０組換えタンパク質とピノレジノールとの反応液中において、新たな生成物は認められなかった（図２Ｃ）。ＳｉＧＴ１０組換えタンパク質とセサミノールとの反応液中において、リグナンのスペクトル（保持時間８．２分）を有するピークＣが新たに得られた（図２Ｈ）。
【０２２０】
さらに、ＳｉＧＴ８組換えタンパク質とピペリトールとの反応液中において、リグナンのスペクトル（保持時間約７．４分）を有するピークＤが新たに得られた（図３Ａ）。
【０２２１】
ピークＡからＤとして示される生成物は、酵素反応液からＵＤＰ−グルコースを除くと生成されなかった（図２および図３）。このことから、これらの生成物は、基質として加えたリグナンの配糖体であることが強く示された。すなわち、ピークＡはピノレジノール配糖体、ピークＢおよびピークＣはセサミノール配糖体である。また、ピークＤについてはピペリトール配糖体と考えられるが、これは現在までに報告のない新規なリグナン配糖体である。
【０２２２】
〔実施例９：ゴマリグナン配糖化酵素による生成物のＬＣ−ＭＳおよびＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳによる分析〕
ＬＣ−ＭＳ分析によって、実施例８において生成したリグナン配糖体の分子量を決定した（液体クロマトグラフィー（ＬＣ）：Ｗａｔｅｒｓ２７９５（ウォーターズ社）、質量分析器：ＱＵＡＴＲＯｍｉｃｒｏ（マイクロマス社））。ダイアイオンＨＰ−２０樹脂（三菱化学）を１ｍｌ充填したカラムを５０％アセトン５ｍｌで洗浄した後、水１０ｍｌを用いて平衡化した。実施例８において生成したリグナン配糖体を含む酵素反応液をカラムにロードし、５ｍｌの水を用いて不純物を洗浄した後、８０％アセトン２ｍｌを用いて溶出した。エバポレーターを用いて溶出液を乾固させた後、１％ギ酸を含む９０％アセトニトリル（１００μｌ）中に溶解させてＬＣ−ＭＳ分析試料とした。ＬＣ条件を以下に示す。
【０２２３】
ＤｅｖｅｌｏｓｉｌＣ３０−ＵＧ−３カラム（野村化学、３．０×１５０ｍｍ）を用い、移動相は、Ａ液として水を、Ｂ液として１００％アセトニトリルを、Ｃ液として１％ギ酸を、Ｄ液として１００ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液を用いた。１０分間にわたる直線濃度勾配（Ａ液６０％：Ｂ液３０％：Ｃ液５％：Ｄ液５％→Ａ液１０％：Ｂ液８０％：Ｃ液５％：Ｄ液５％）を用いて溶出し、その後、Ａ液１０％：Ｂ液８０％：Ｃ液５％：Ｄ液５％を用いて５分間溶出した（流速：常時０．２ｍｌ／分）。アンモニウム付加イオンとしてシグナルを検出した。
【０２２４】
この条件下で、ピークＡは約６．１分、ピークＢは約９．６分、ピークＤは約８．８分に検出される。イオンモードＥＳ＋、Ｃｏｎｅｖｏｌｔａｇｅ１７Ｖ、Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ２ＶのＭＳ条件を用いて、３００〜６００（ｍ／ｚ，１８分）の範囲でＭＳスキャンし、２１０〜４００ｎｍ（１８分）の範囲のＰＤＡを測定した。
【０２２５】
上記条件下でのＬＣ−ＭＳ分析の結果、ピークＡはアンモニウムイオン付加分子量５３８（ｍ／ｚ）、ピークＢはアンモニウムイオン付加分子量５５０（ｍ／ｚ）、ピークＤはアンモニウムイオン付加分子量５３６（ｍ／ｚ）であった（図４Ｄ、図４Ｈおよび図４Ｌ）。従って、これらのピークは、それぞれピノレジノール（アンモニウムイオン付加分子量３７６）のモノグルコシド、セサミノール（アンモニウムイオン付加分子量３８８）のモノグルコシド、およびピペリトール（アンモニウムイオン付加分子量３７４）のモノグルコシドであると同定した。
【０２２６】
さらに、ピークＡおよびピークＢについて、ＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。ＥＳＩプローブを用いるＱ−ＴＯＦ（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）をＣｏｎｅｖｏｌｔａｇｅ１７ＶにてＣｏｌｌｉｓｉｏｎを１０ｅＶ、１５ｅＶ、２０ｅＶの順に漸増させて、ＰＯＳＩＴＩＶＥモードで使用して、ＭＳを測定した。その結果、ピークＡについて、２３５（ｍ／ｚ）、２０５（ｍ／ｚ）、および１７５（ｍ／ｚ）の分子量を有するフラグメントを同定した。このことから、ピークＡがピノレジノール骨格であることを確認した。ピークＢについて、３５３（ｍ／Ｚ）、２３３（ｍ／ｚ）、２０３（ｍ／ｚ）、１８５（ｍ／ｚ）、および１３５（ｍ／ｚ）の分子量を有するフラグメントを同定した。このことから、ピークＢがセサミノール骨格であることを確認した。
【０２２７】
以上の結果から、ゴマ由来ＳｉＧＴ８遺伝子はピノレジノール、セサミノールおよびピペリトールに対して糖を転移する活性を有するリグナン配糖化酵素をコードしていることが示された。また、ＳｉＧＴ１０遺伝子はセサミノールに対して糖を転移する活性を有するリグナン配糖化酵素をコードしていることが示された。
【０２２８】
〔実施例１０：ゴマリグナン配糖化酵素遺伝子の構造解析〕
ゴマゲノム内におけるＳｉＧＴ８遺伝子およびＳｉＧＴ１０遺伝子のコピー数を明らかにするために、ゲノミックサザン解析を実施した。
【０２２９】
ＮｕｃｌｅｏｎＰｈｙｔｏｐｕｒｅｆｏｒＰｌａｎｔＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（アマシャム社）を製造業者が推奨する方法に従って用いて、Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍ（真瀬金品種）の葉からゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡ２０μｇを、ＥｃｏＲＶ、ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ、ＫｐｎＩまたはＳｐｅＩで消化した後、アガロースゲルを用いた電気泳動にて分離した。このアガロースゲルを０．２５ＭＨＣｌを用いて１５分間加水分解した後、１．５ＭＮａＣｌ／０．５ＭＮａＯＨの溶液を用いて変性させ（３０分間）、１．５ＭＮａＣｌを含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加することによって変性溶液で中和した（２０分間）。次いで、アガロースゲル内のゲノムＤＮＡを、２０×ＳＳＣ溶液中にてメンブレン（Ｈｙｂｒｉｂｏｎｄ−Ｎ、アマシャム社）に転写した。メンブレンに転写したゲノムＤＮＡをＵＶ照射によりメンブレンに結合させ、７％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、２％ブロッキング試薬、０．１％ラウロイルサルコシン、５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）からなるハイブリダイゼーション緩衝液（高ＳＤＳ緩衝液：ロシュ社）を用いて、４２℃で１時間プレハイブリダイゼーションを行った。
【０２３０】
ｐＳＰＢ２６３１またはｐＳＰＢ２６３３をテンプレートとして、それぞれ配列番号７５（ＮｃｏＩ−ＳｉＧＴ８−ＦＷ）および配列番号７６（ＫｐｎＩ−ＳｉＧＴ８−ＲＶ）、または配列番号７７（ＮｃｏＩ−ＳｉＧＴ１０−ＦＷ）および配列番号７８（ＫｐｎＩ−ＳｉＧＴ１０−ＲＶ）のプライマー対を用いるＰＣＲによって、ＤＩＧ標識化ハイブリダイゼーションプローブを作製した。ＰＣＲ反応液は、上記のＳｉＧＴ８またはＳｉＧＴ１０を含むプラスミド１ｎｇ、１×ＰＣＲ緩衝液（タカラバイオ社）、２．５ｍＭＤＩＧ−ｄＮＴＰｍｉｘｔｕｒｅ（ＰＣＲＤＩＧｌａｂｅｌｉｎｇＭｉｘ、ロシュ社）、０．２ｐｍｏｌの各プライマー、１ＵｒＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）からなる。ＰＣＲ反応を、９５℃で３０秒間、５３℃で３０秒間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行った。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラム−Ｆｉｎｅ（ベーリンガー社）を用いて精製したＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションプローブとして用いた。このプローブを熱変性した後、プレハイブリダイゼーション液に１５μｌ添加して、４２℃で一晩インキュベートした。
【０２３１】
ハイブリダイゼーション後、高ストリンジェントな条件（０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含む溶液を用いて６５℃で３０分間を２回）によってメンブレンを洗浄した。ＤＩＧラベリング＆デテクションキット（ロシュ社）を製造業者の指示書に従って用いて、ハイブリダイゼーションシグナルを検出した。
【０２３２】
サザン解析の結果、ＳｉＧＴ８の他にＳｉＧＴ８と極めて相同性の高いＳｉＧＴ遺伝子が少なくとも１つゴマゲノム内にコードされていることが示された（図５）。一方、ＳｉＧＴ１０はゴマゲノム中に単一遺伝子として存在することが示された（図５）。
【０２３３】
〔実施例１１：アフリカゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍｒａｄｉａｔｕｍ）からのＳｉＧＴ８ホモログの単離〕
多種にわたってＳｉＧＴ８遺伝子産物の機能が保存されていることを明らかにするために、栽培ゴマ品種であるＳｅｓａｍｕｍｉｎｄｉｃｕｍとは細胞遺伝学的に異なるアフリカゴマ（Ｓｅｓａｍｕｍｒａｄｉａｔｕｍ）から、ＳｉＧＴ８のカウンターパート遺伝子（ＳｒＳｉＧＴ８）を単離することを試みた。
【０２３４】
Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍはアフリカに現存するゴマ植物であり、細胞遺伝学解析によれば染色体数は２ｎ＝６４とされており、栽培ゴマ品種であるＳ．ｉｎｄｉｃｕｍ（２ｎ＝２６）とは遺伝的に異なる系統である（参考文献、並木満夫、小林貞作「ゴマの科学」朝倉書店）。しかし、Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍ種子においてもリグナン含量に関する解析が報告されており、セサミンが蓄積していることが明らかとなっている（参考文献、Ｂｅｄｉｇｉａｎ，Ｄ．ら、ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＳｙｓｔｅｍａｔｉｃｓａｎｄＥｃｏｌｏｇｙ１３：１３３−１３９（１９８５））。従って、Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍのゲノム中にはＳ．ｉｎｄｉｃｕｍのＳｉＧＴ８に対応する遺伝子が含まれていることが期待される。
【０２３５】
実施例４と同様に、Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍ種子のｃＤＮＡを合成した。ＳｉＧＴ８−ＢａｍＨＩ−ＦＷ（配列番号７９）およびＳｉＧＴ８−ＫｐｎＩ−ＲＶ（配列番号８０）のプライマー対を用いて、このｃＤＮＡ１μｌをテンプレートとしてＰＣＲを行った。
【０２３６】
ＰＣＲ反応液は、ｃＤＮＡ１μｌ、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、１×ＫＯＤｐｌｕｓｂｕｆｆｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１ｍＭＭｇＳＯ₄、１ＵＫＯＤｐｌｕｓｐｏｌｙｍｅｒａｓｅからなる。ＰＣＲ反応を以下のように行った：９４℃で５分間の後、９４℃で１分間、５０℃で１分間、７２℃で２分間の反応を３０サイクル行い、最後に７２℃で３分間保持した。得られた約１．４ｋｂのＰＣＲ産物を、製造者が推奨する方法に従ってｐＣＲ２Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）のマルチクローニングサイトに挿入し、ＳｒＳｉＧＴ８／ｐＣＲ２Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（ｐＳＰＢ２６５６）を得た。
ＳｉＧＴ８−ＢａｍＨＩ−ＦＷ：５’−ｔｔｔｇｇａｔｃｃａｔｇｔｃｇｇｃｇｇａｃｃａａａａａｔｔａａｃｃａ−３’（配列番号７９）
ＳｉＧＴ８−ＫｐｎＩ−ＲＶ：５’−ｔｔｔｇｇｔａｃｃｔｃａａｇａａａｔｇｔｔａｔｔｃａｃｇａｃａｔｔｃｔ−３’（配列番号８０）。
【０２３７】
プライマーウォーキング法によって、ｐＳＰＢ２６５６に含まれるＳｒＳｉＧＴ８の塩基配列（およびアミノ酸配列）を決定した（配列番号８１および８２）。ＳｒＳｉＧＴ８遺伝子は、ＳｉＧＴ８遺伝子に対して核酸配列で９２％、アミノ酸配列で９１％の配列同一性を示した。配列同一性について、ＣｌｕｓｔａｌＷａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（ＭａｃＶｅｃｔｏｒｖｅｒ．７．２．２（Ｓｙｍａｎｔｅｃｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））をデフォルト設定で使用した。
【０２３８】
完全長ＳｒＳｉＧＴ８を含む約１．４ｋｂのＤＮＡ断片をｐＳＰＢ２６５６からＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩで切り出して、大腸菌発現ベクターであるｐＱＥ３０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ社）のＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ部位に連結して、ＳｒＳｉＧＴ８／ｐＱＥ３０（ｐＳＰＢ２６５７）を得た。このｐＳＰ２６５７は、６つのヒスチジン残基からなるＨｉｓタグをＳｒＳｉＧＴ８のＮ末端に融合した組換えタンパク質（Ｈｉｓ−ＳｒＳｉＧＴ８）を発現する。
【０２３９】
ｐＳＰＢ２６５７を用いて形質転換した大腸菌を実施例７と同様に培養して、組換えタンパク質を発現させた。以下、断らない限り、全て氷上または４℃で実験を行った。
【０２４０】
菌体１ｇあたり５ｍｌの破砕緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３０ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１００μＭＡＰＳＭＦ）に溶解した後、超音波によって菌体を破砕し、４０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離によって得られた上清を粗酵素液として回収した。
【０２４１】
次いで、Ｈｉｓ−ＳｒＳｉＧＴ８組換えタンパク質をＮｉカラムを用いて精製した。キレーティングセファロースＦＦ樹脂（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をカラムに充填し、樹脂と等量の０．１ＭＮｉＳＯ₄を樹脂に添加した。続いて、樹脂の５倍容の水、次いで、樹脂の３倍容の２０％エタノールを用いてこのカラムを洗浄した。
【０２４２】
次いで、このカラムを樹脂の５倍容の破砕緩衝液を用いて平衡化し、上記租酵素液５ｍＬを破砕緩衝液で１０倍希釈したサンプルをカラムにロードした。サンプルが重力によって自然落下した後に、樹脂の５倍容の破砕緩衝液で３回洗浄し、引き続き、５ｍｌの溶出緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、５００ｍＭイミダゾール、５００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１００μＭＡＰＳＭＦ）を用いて溶出した。
【０２４３】
溶出液１０μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、約６０ｋＤａのサイズにＨｉｓ−ＳｒＳｉＧＴ８組換えタンパク質が発現していることを確認した（図６Ａ）。
【０２４４】
次いで、Ｈｉｓ−ＳｒＳｉＧＴ８組換えタンパク質をほぼ単一のバンドとして含む溶出画分をセルロースチューブ（ＤＩＡＬＹＳＩＳＴＵＢＩＮＧ，ＳＩＧＭＡ社）に充填し、透析緩衝液（３０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、３０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭ β−メルカプトエタノール、１００μＭＡＰＳＭＦ）中で一晩透析した。
【０２４５】
透析したサンプル３００μｌに基質溶液（１ｍｇ／ｍｌ）２０μｌおよび２０ｍＭＵＤＰ−ｇｌｕｃｏｓｅ３μｌを添加して、３０℃で１時間反応させた。反応物を実施例８と同様の方法で生成物分析を行った。
【０２４６】
ＨＰＬＣ分析の結果、ＳｒＳｉＧＴ８組換えタンパク質とピノレジノールとの反応液中において新たなリグナンのスペクトルを持つピークは得られなかった。しかしながら、ＳｒＳｉＧＴ８組換えタンパク質とピペリトールとの反応液中において新たに保持時間約７．４分のリグナンのスペクトルを持つピークＥが得られた（図６Ｃ）。さらにＳｉＧＴ８組換えタンパク質とセサミノールとの反応液中において新たに保持時間約８．２分のリグナンのスペクトルを持つピークＦが得られた（図６Ｄ）。ピークＥとＦで示されるこれらの生成物は酵素反応液からＵＤＰ−グルコースを除くと生成されないため（図６Ｇおよび図６Ｈ）、基質として加えたリグナンの配糖体であることが強く示された。ピークＥは実施例８で示されたピペリトール配糖体であるピークＤと保持時間が一致するため、ピペリトールのモノグルコシドであることが示された。一方、ピークＦは実施例８のピークＢおよびＣと保持時間が一致するため、セサミノールのモノグルコシドであることが示された。
【０２４７】
以上の結果から、アフリカゴマから単離されたＳｒＳｉＧＴ８は、リグナンに対して糖を転移する活性を有することが明らかとなった。
【０２４８】
〔実施例１２：ＳｉＧＴ８およびＳｉＧＴ１０の発現調節領域の同定〕
ＳｉＧＴ８遺伝子およびＳｉＧＴ１０遺伝子の発現調節機構を調べるために、これらの遺伝子のゲノミッククローンを単離した。
【０２４９】
配列番号７５に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号７６に示される塩基配列からなるプライマーによって増幅されるＳｉＧＴ８遺伝子のＯＲＦ領域約１．４ｋｂ（ＳｉＧＴ８プローブ）、または、配列番号７７に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号７８に示される塩基配列からなるプライマーによって増幅されるＳｉＧＴ１０遺伝子のＯＲＦ領域約１．４ｋｂ（ＳｉＧＴ１０プローブ）をプローブに用いて、栽培ゴマ（Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍ）由来のゲノムＤＮＡライブラリー（約２５万ｐｆｕ）をスクリーニングした。ゴマゲノムライブラリーを、λＢｌｕｅＳＴＡＲ^TM Ｖｅｃｔｏｒｓｙｓｔｅｍ（ＮＯＶＡＧＥＮ社）を用いて栽培ゴマ（Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍ）ゲノムＤＮＡから作製した。
【０２５０】
まず、ゴマゲノムＤＮＡ２００μｇを、断片サイズが約２０ｋｂになるように制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて部分消化し、引き続き１０℃にて１０〜４０％ショ糖密度勾配遠心分離を２５０００ｒｐｍで２４時間行った（ＳＷ２８ローター、Ｂｅｃｋｍａｎ社）。遠心分離したサンプルを、ＡＵＴＯＭＡＴＩＣＬＩＱＵＩＤＣＨＡＲＧＥＲ（Ａｄｖａｎｔｅｃ社）とＭｉｃｒｏＴｕｂｅＰｕｍｐ（ＥＹＥＬＡ社）を用いて、１ｍｌずつ分画した。パルスフィールド電気泳動によって、分画したサンプルの断片サイズを確認した。パルスフィールド電気泳動を、１％ＡｇａｒｏｓｅＮＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、０．５×ＴＢＥからなるゲルを用いて、１２０°／１秒−１秒で６Ｖ／ｃｍの条件で０．５×ＴＢＥ緩衝液内にて行った（ＣＨＥＦＭＡＰＰＥＲ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）。約２０ｋｂの平均断片サイズを含む画分を用いて、製造業者の推奨する方法に従って、ゲノムライブラリーを作製した。作製したライブラリーは、１．５×１０⁶ｐｆｕ／５００μｌの力価を有した。
【０２５１】
二次スクリーニング後、ＳｉＧＴ８プローブおよびＳｉＧＴ１０プローブによってそれぞれ５個ずつの陽性クローンを得た。次いで、これらの陽性クローンに対して、配列番号７６に示される塩基配列からなるプライマーまたは配列番号７８に示される塩基配列からなるプライマーとファージアームプライマーであるＳＴＡＲ−ＬＦ１（配列番号８３）およびＳＴＡＲ−ＬＲ１（配列番号８４）を用いてＰＣＲを行い、ＳｉＧＴ８遺伝子またはＳｉＧＴ１０遺伝子の位置関係を決定した。
ＳＴＡＲ−ＬＦ１：５’−ａｃｇａａｇｔｔａｔｇｃｇｇｃｃａａｔｔａａｃｃｃ−３’（配列番号８３）
ＳＴＡＲ−ＬＲ１：５’−ｃｃａｃｃｔｇａｃｇｔｃｇｃｇｇｃｃｔａａｔａｃｇ−３’（配列番号８４）。
【０２５２】
その結果、ＳｉＧＴ８陽性クローンｇＳｉＧＴ８＃１３が、約１ｋｂの５’遺伝子発現調節領域を含むことが示唆された。一方、ＳｉＧＴ１０陽性クローンｇＳｉＧＴ１０＃３７が約１．５ｋｂの５’遺伝子発現調節領域を含むことが示唆された。
【０２５３】
次いで、ｇＳｉＧＴ８＃１３またはｇＳｉＧＴ１０＃３７のファージをテンプレートとして、Ｔ７プライマー（配列番号８５）、および配列番号７６に示される塩基配列からなるプライマーまたは配列番号７８に示される塩基配列からなるプライマーの組み合わせを用いるＬＡ−ＰＣＲによって挿入断片を増幅した。ファージ液は、１μｌの１×ＬＡ−ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（ＴａｋａＲａ）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、２．５ｍＭＭｇＣｌ₂、プライマー各０．２ｐｍｏｌ／μｌ、ＬＡ−Ｔａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ１．２５Ｕからなる。９４℃で５分間反応させた後、９４℃で１分間、５３℃で１分間、７２℃で４分間の反応を３２サイクル行い、最後に７２℃で７分間維持した。
Ｔ７：５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇ−３’（配列番号８５）。
【０２５４】
得られたフラグメントを電気泳動した結果、それぞれ約２．４ｋｂおよび３．０ｋｂに増幅断片が得られたため、これらのフラグメントを製造業者が推奨する方法に従ってｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯｖｅｃｔｏｒ（インヴィトロジェン社）のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＳＰＢ２６５９およびｐＳＰＢ２６６０を得た。
【０２５５】
ｐＳＰＢ２６５９に挿入した断片の全塩基配列をプライマーウォーキング法によって決定し、ＳｉＧＴ８遺伝子の５’側発現調節領域を含むと思われる塩基配列を得た。
ｇＳｉＧＴ８＃１３：
ＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴＴＣＡＡＡＧＧＡＣＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＣＣＧＣＡＴＣＣＧＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＴＴＡＴＡＣＣＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＧＡＧＧＡＴＣＧＧＧＴＴＣＣＡＣＡＡＡＴＡＣＴＡＴＣＣＡＡＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＣＴＡＣＡＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＣＣＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＡＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＡＴＧＴＣＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＡＴＡＧＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＣＡＣＴＣＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＡＧＧＣＧＴＣＧＡＣＧＴＴＴＡＴＴＧＴＴＣＴＡＧＧＡＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＡＡＡＡＡＧＡＣＡＣＴＡＧＴＴＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＴＧＧＴＡＧＡＴＴＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＡＡＧＡＴＴＣＴＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＧＧＡＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＡＴＴＴＧＧＧＡＴＴＴＴＡＴＡＴＧＴＴＧＧＴＴＡＴＴＴＡＡＡＣＴＧＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＴＴＣＡＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＡＡＴＴＧＧＡＴＴＧＣＡＴＡＴＡＧＧＴＣＴＧＡＴＣＡＡＣＡＴＧＴＴＴＴＧＴＣＧＧＡＡＡＡＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＣＣＣＡＡＴＣＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＴＧＧＣＣＣＡＧＣＴＴＴＣＧＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＣＧＴＣＡＧＣＴＣＧＣＡＧＴＴＧＡＡＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＣＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＡＴＧＴＣＡＴＴＴＣＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＧＣＡＡＴＴＡＡＡＣＣＡＴＣＴＣＡＡＡＴＧＣＡＴＡＧＣＡＴＴＡＣＡＣＧＣＣＴＧＣＧＴＡＴＧＴＧＴＡＴＧＴＣＴＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＡＣＴＣＴＴＧＴＧＴＣＡＴＡＴＣＧＴＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＣ（配列番号８６）。このＳｉＧＴ８遺伝子の５’側上流に位置する発現調節エレメントを同定するために、配列番号８６に記載の配列に対して、ＰＬＡＣＥ解析を行った（ HYPERLINK "http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/" ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ＰＬＡＣＥ／）。ＰＬＡＣＥ解析の結果、ＳｉＧＴ８プロモーター内に存在する特定の転写因子ファミリーの結合部位および特定のシグナルに応答する発現調節エレメントが多数同定され、これらの発現調節エレメントがＳｉＧＴ８遺伝子の発現に影響を与えていることが示唆された（図７）。
【０２５６】
ｐＳＰＢ２６６０に挿入した断片の全塩基配列をプライマーウォーキング法によって決定し、ＳｉＧＴ１０遺伝子の５’側発現調節領域を含むと思われる塩基配列を得た。
ｇＳｉＧＴ１０＃３７：
ＡＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＡＴＣＴＡＴＡＧＧＴＡＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＣＡＴＡＡＡＡＣＴＴＧＴＧＴＡＡＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＣＧＴＧＴＡＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＡＧＴＴＴＡＧＡＧＧＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＧＴＣＣＴＡＴＴＴＡＧＧＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＧＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＡＡＣＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＴＡＧＣＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＣＣＧＡＴＴＴＣＣＴＡＧＣＴＴＣＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＣＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＡＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＧＡＧＣＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＧＧＣＴＡＧＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣＧＡＴＴＴＴＣＧＡＴＡＣＧＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＴＡＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＣＣＧＧＣＧＴＡＣＡＧＣＣＣＴＡＣＡＴＴＴＣＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＧＡＴＣＧＡＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＧＡＧＣＴＴＡＧＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＣＣＴＡＴＣＣＡＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＣＣＴＡＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＣＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＴＴＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＡＣＣＴＣＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＧＣＡＴＡＡＡＣＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＴＡＡＡＧＧＴＴＡＣＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣＧＴＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＣ（配列番号８７）。
【０２５７】
さらに、このＳｉＧＴ１０遺伝子の５’側上流に位置する発現調節エレメントを同定するために、配列番号８７の塩基配列に基づいて、５’側上流方向へ伸長するｇＳｉＧＴ−ｓｅｑ−ＲＶ４プライマー（配列番号８８）を設計し、このプライマーとＴ７プライマー（配列番号８５）とを用いてＳｉＧＴ１０のゲノミックスクリーニングによって得た５つの陽性クローンをテンプレートにしてＬＡ−ＰＣＲを行った。ＬＡ−ＰＣＲ条件は先述と同様である。
ｇＳｉＧＴ−ｓｅｑ−ＲＶ４：５’−ｇａａｇａｃｔｔｃｇｃｔｔａｇｇｇｔｔｇｃｔａａ−３’（配列番号８８）。
【０２５８】
得られたフラグメントを電気泳動した結果、ｇＳｉＧＴ１０＃４３クローンをテンプレートにした場合に約２．０ｋｂに増幅断片が得られたため、これを製造業者が推奨する方法に従ってｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ＸＬｖｅｃｔｏｒ（インヴィトロジェン社）のマルチクローニングサイトに挿入し、ｐＳＰＢ２６６２を得た。
【０２５９】
ｐＳＰＢ２６６２に挿入した断片の全塩基配列をプライマーウォーキング法によって決定し、先に同定していた断片（配列番号８７）とつなぎ合わせ、ＳｉＧＴ１０遺伝子の５’側発現調節領域を含むと思われる塩基配列を得た。
ｇＳｉＧＴ１０＃４３：
ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＧＧＡＣＣＧＣＧＧＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＧＡＴＡＧＧＧＧＣＡＡＴＴＴＴＡＴＣＴＡＴＡＣＡＡＡＧＡＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＣＧＣＡＴＧＴＧＣＡＧＴＧＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＧＡＧＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＣＡＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴＧＴＣＴＧＴＣＴＴＧＡＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＡＣＡＡＧＴＡＡＧＴＡＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡＣＡＡＣＡＣＡＡＡＧＧＴＡＡＴＡＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＣＡＴＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＡＧＡＣＡＡＡＡＴＣＧＧＡＧＡＡＡＧＧＴＴＡＧＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＡＣＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴＡＡＴＣＧＧＡＴＴＡＧＡＣＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＣＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＡＴＧＴＣＴＴＧＡＡＴＴＴＧＧＡＣＣＡＴＣＴＴＡＣＣＡＧＡＣＡＴＡＡＡＴＣＧＧＡＴＴＴＧＴＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＴＡＣＴＴＴＴＣＧＡＡＴＴＣＴＧＴＧＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＴＣＡＡＡＣＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＧＴＡＣＡＣＴＡＡＴＡＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＧＡＣＧＴＡＣＴＡＴＡＡＡＡＴＧＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴＡＴＡＴＴＴＣＴＴＡＡＡＡＴＴＴＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＡＴＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＴＧＣＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＴＡＧＣＧＴＴＣＣＧＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＡＴＧＴＡＡＡＧＴＧＴＣＡＡＧＴＣＣＣＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＡＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＡＴＣＴＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＣＣＴＡＣＴＴＧＣＴＡＣＴＡＴＴＧＴＧＡＴＴＡＴＡＴＡＣＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＡＴＴＴＡＴＧＧＡＴＡＡＴＴＴＡＣＡＴＡＴＡＣＴＴＴＴＡＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＴＣＴＡＡＣＴＴＡＴＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＴＡＡＡＣＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＣＴＣＴＴＧＣＡＧＴＣＴＴＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣＡＴＴＡＴＴＡＧＴＴＣＧＧＴＣＡＡＴＡＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＴＡＧＡＣＡＧＴＧＴＣＡＡＴＴＴＧＧＡＴＴＧＴＴＴＧＴＴＡＴＡＡＡＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＴＧＡＴＴＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＡＴＧＴＴＣＴＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＴＧＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＣＡＡＡＴＴＴＡＴＣＴＡＴＡＧＧＴＡＴＡＧＧＡＴＴＧＴＴＡＴＡＴＡＴＴＡＴＴＣＡＴＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＧＴＣＡＴＧＴＡＡＴＣＡＡＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＴＣＡＡＣＡＴＡＡＡＡＣＴＴＧＴＧＴＡＡＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＣＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＧＣＧＴＧＴＡＴＡＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＡＣＴＡＴＴＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＴＧＡＴＣＣＣＡＴＴＴＴＡＣＴＴＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＡＡＴＴＡＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣＣＣＡＡＴＡＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣＣＴＣＴＣＡＣＡＡＡＴＡＴＧＡＡＡＴＡＧＡＴＡＧＴＴＴＡＧＡＧＧＴＡＧＴＴＴＡＡＡＧＣＡＧＣＡＴＡＡＡＧＴＡＧＡＡＡＧＣＣＧＴＣＣＴＡＴＴＴＡＧＧＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＡＡＧＧＡＡＧＧＧＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴＡＣＧＴＣＡＧＴＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＧＡＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＧＴＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＣＡＡＡＧＡＧＣＴＣＡＣＣＴＡＡＣＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＡＴＧＴＡＡＧＴＣＣＡＡＴＣＡＡＴＣＡＧＴＡＧＣＧＧＴＡＧＡＡＴＡＧＴＣＣＧＡＴＴＴＣＣＴＡＧＣＴＴＣＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＴＣＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＣＡＡＴＧＡＣＣＣＴＡＡＧＣＧＣＴＡＡＡＡＴＣＡＡＣＣＣＴＴＧＴＡＡＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＣＴＴＡＧＡＧＣＡＧＴＡＡＴＡＡＧＧＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＣＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＡＴＣＧＧＣＴＡＧＧＣＴＧＡＧＴＴＴＧＡＡＡＧＴＴＧＣＧＡＴＴＴＴＣＧＡＴＡＣＧＴＴＴＴＴＣＣＴＴＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＴＣＣＣＴＧＴＡＧＡＴＡＧＡＧＡＴＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＴＧＧＣＣＣＧＧＣＧＴＡＣＡＧＣＣＣＴＡＣＡＴＴＴＣＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＡＧＡＴＣＧＡＧＧＣＧＴＣＧＡＡＧＣＧＡＧＣＴＴＡＧＣＡＡＣＣＣＴＡＡＧＣＧＡＡＧＴＣＴＴＣＣＣＣＴＡＴＣＣＡＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＡＴＣＣＴＡＴＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＡＣＡＴＴＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＴＣＧＴＡＣＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＡＡＣＴＣＴＡＡＡＴＴＧＴＡＡＴＴＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＴＴＴＴＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＣＡＣＣＴＣＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＡＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＡＴＴＧＣＡＴＡＡＡＣＡＡＣＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＡＧＴＡＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＣＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＴＧＣＡＡＣＧＡＣＣＡＣＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＡＴＣＡＡＴＡＴＴＡＡＡＧＴＧＣＴＡＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＧＴＡＧＴＧＧＡＧＴＴＧＴＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＣＡＡＡＣＴＧＴＡＴＡＡＡＴＡＡＡＧＧＴＴＡＣＧＴＧＴＴＧＣＴＡＣＧＴＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＴＴＣＡＣ（配列番号８９）。
【０２６０】
先述のＳｉＧＴ８遺伝子と同様に、配列番号８９に記載の配列に対して、ＰＬＡＣＥ解析を行った。ＰＬＡＣＥ解析の結果、ＳｉＧＴ１０プロモーター内に存在する特定の転写因子ファミリー結合部位および特定のシグナルに応答する発現調節エレメントが多数同定され、これらがＳｉＧＴ１０遺伝子の発現に影響を与えていることが示唆された（図８）。
【０２６１】
ｐＳＰＢ２６６０の挿入断片にはＳｉＧＴ１０の完全長ＯＲＦが含まれている。塩基配列決定によって、ＳｉＧＴ１０は開始コドンから３’側下流４９７ｂｐ地点に５２５ｂｐのイントロンが１つ存在することが明らかになった。ｐＳＰＢ２６５９に挿入された断片にはＳｉＧＴ８の完全長ＯＲＦが含まれているが、塩基配列決定によってイントロンは同定されなかった。
【０２６２】
以上の結果から、ＳｉＧＴ８遺伝子およびＳｉＧＴ１０遺伝子はともにリグナンに糖を転移する活性を有する酵素をコードするが、ＣｌｕｓｔａｌＷａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラムでアライメントした結果（ＭａｃＶｅｃｔｏｒｖｅｒ．７．２．２、Ｓｙｍａｎｔｅｃｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、両遺伝子のＯＲＦにおける配列同一性は、ＤＮＡレベルで４２％、アミノ酸レベルで２２％と低く、さらにイントロンの挿入の有無による遺伝子構造も異なっていた。言い換えれば、リグナンに糖を転移する活性を有する酵素において、遺伝子の配列同一性および遺伝子構造の保存性は必ずしも酵素の機能と一致しないことを示す。具体的には、ＳｉＧＴ８遺伝子の配列情報を用いてアフリカゴマからそのカウンターパート遺伝子であるＳｒＳｉＧＴ８遺伝子をクローニングすることは可能であるが、ＳｒＳｉＧＴ１０遺伝子を単離することは極めて困難であると容易に推測される。したがって、本発明は、配列相同性が低い２つのリグナン糖転移酵素遺伝子を本明細書において初めて明示することにより、ゴマにおいて少なくとも２種類以上のリグナン糖転移酵素が機能していることを初めて明らかにした。
【０２６３】
〔実施例１３：アフリカゴマＳｅｓａｍｕｍａｌａｔｕｍからのＳｉＧＴ８様遺伝子の単離〕
Ｓ．ａｌａｔｕｍは，形態学的にも栽培種Ｓ．ｉｎｄｉｃｕｍとは大きく異なるアフリカゴマ野生種である（並木ら、ゴマの科学、朝倉書店）。染色体数はＳ．ｉｎｄｉｃｕｍと同じ２ｎ＝２６であるが、その地理的にはアフリカのナイジェリア、スーダンおよびモザンビークで確認されている。
【０２６４】
実施例４と同様の方法を用いて、Ｓ．ａｌａｔｕｍからのＳｉＧＴ８のカウンターパート遺伝子（ＳａＳｉＧＴ８）の単離を行った。実施例4と同様の方法でＳ．ａｌａｔｕｍ種子からｃＤＮＡを調製し、実施例１１と同様にＰＣＲを行って、１．４ｋｂの増幅断片を得た。この増幅断片を実施例１１と同様の方法に従って、ｐＣＲ−ＴＯＰＯ−ｂｌｕｎｔ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングし、ｐＳＰＢ２６９７を得た。ｐＳＰＢ２６９７に挿入された１．４ｋｂの塩基配列をプライマーウォーキングにより決定した。配列番号９０にＳａＳｉＧＴ８の塩基配列を示し、配列番号９１にＳａＳｉＧＴ８のアミノ酸配列を示す。
ＳａＳｉＧＴ８：
（塩基配列）
ＡＴＧＴＣＧＧＣＧＧＡＣＣＡＡＡＡＡＴＴＡＡＣＣＡＧＣＣＴＡＧＴＣＴＴＣＧＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＡＴＡＡＴＧＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＧＣＧＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＣＣＧＡＣＡＧＡＧＡＣＧＡＡＣＧＣＣＴＣＴＣＧＡＴＣＡＣＡＧＴＣＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＡＧＣＴＡＣＣＡＡＴＴＧＡＴＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＴＴＣＴＴＡＣＡＣＴＡＡＧＡＡＣＴＣＧＣＣＴＧＡＣＧＣＣＣＧＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＣＣＧＡＡＧＡＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＴＴＴＡＣＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＡＴＣＴＴＣＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＣＧＡＴＡＣＡＴＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＣＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＴＴＡＴＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＴＧＣＡＧＧＡＴＴＴＧＴＡＡＴＣＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＴＴＧＡＴＧＴＣＧＣＣＡＡＣＧＡＧＣＴＴＧＧＡＧＴＣＣＣＧＡＣＴＴＡＣＡＴＧＴＴＣＴＴＣＡＧＴＴＣＧＧＧＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＣＧＧＧＣＴＣＡＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＴＣＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＡＡＴＧＴＧＧＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＧＡＴＡＴＣＡＡＴＡＣＣＣＡＣＡＴＡＣＧＴＴＡＡＣＣＣＣＧＴＴＣＣＴＧＴＴＧＣＧＧＴＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＴＴＴＣＣＴＴＧＡＣＴＴＴＧＣＣＡＡＡＡＧＧＴＴＴＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＡＡＧＧＧＡＴＴＡＴＴＧＴＧＡＡＣＡＣＡＴＴＣＣＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＡＡＣＣＣＡＣＣＡＧＡＴＴＡＧＧＴＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＴＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＴＣＣＣＡＣＣＡＧＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＡＴＡＣＴＴＣＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＡＡＡＡＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＧＣＡＣＧＣＧＧＡＡＡＴＣＡＴＧＡＧＧＴＧＧＣＴＣＧＡＣＡＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＴＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＴＴＧＧＴＡＣＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＴＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＴＣＡＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＡＴＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＡＧＴＧＧＡＣＡＴＣＧＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＣＣＣＴＧＡＧＧＡＡＧＣＣＧＣＣＴＣＣＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＧＴＴＧＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＧＡＡＧＡＡＧＴＴＴＴＡＣＣＡＧＡＡＧＧＧＴＴＣＣＴＧＧＧＡＣＧＡＡＣＴＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＧＴＡＡＡＧＴＴＡＴＣＧＧＡＴＧＧＧＣＧＣＣＴＣＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＧＣＧＧＴＧＧＧＡＧＧＡＴＴＴＧＴＧＴＣＧＣＡＣＴＧＴＧＧＧＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＡＧＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＧＧＣＣＧＴＧＴＧＧＣＣＧＴＴＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＡＴＧＣＡＴＴＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＡＡＴＧＧＣＡＧＴＴＧＡＧＡＴＴＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＡＴＡＡＧＡＡＡＡＡＴＧＣＴＡＡＣＧＴＧＡＴＴＧＴＧＧＧＣＡＣＡＧＡＧＡＣＧＡＴＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＡＴＣＡＧＡＣＡＧＣＴＡＡＴＧＧＡＣＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＡＡＡＴＴＣＧＧＧＴＴＡＡＧＧＴＧＡＧＡＧＣＡＴＴＧＡＡＡＧＡＡＡＡＧＡＧＣＡＧＡＡＴＧＧＣＣＣＴＡＡＴＧＧＡＡＧＧＡＧＧＧＴＣＴＴＣＧＴＡＣＡＡＴＴＡＣＴＴＧＡＡＡＣＧＴＴＴＣＧＴＣＧＡＧＡＡＴＧＴＣＧＴＧＡＡＴＡＡＣＡＴＴＴＣＴＴＧＡ（配列番号９０）。
（アミノ酸配列（ＳａＳｉＧＴ８））
ＭＳＡＤＱＫＬＴＳＬＶＦＶＰＦＰＩＭＳＨＬＡＴＡＶＫＴＡＫＬＬＡＤＲＤＥＲＬＳＩＴＶＬＶＭＫＬＰＩＤＴＬＩＳＳＹＴＫＮＳＰＤＡＲＶＫＶＶＱＬＰＥＤＥＰＴＦＴＫＬＭＫＳＳＫＮＦＦＦＲＹＩＥＳＱＫＧＴＶＲＤＡＶＡＥＩＭＫＳＳＲＳＣＲＬＡＧＦＶＩＤＭＦＣＴＴＭＩＤＶＡＮＥＬＧＶＰＴＹＭＦＦＳＳＧＳＡＴＬＧＬＭＦＨＬＱＳＬＲＤＤＮＮＶＤＶＭＥＹＫＮＳＤＡＡＩＳＩＰＴＹＶＮＰＶＰＶＡＶＷＰＳＱＶＦＥＥＤＳＧＦＬＤＦＡＫＲＦＲＥＴＫＧＩＩＶＮＴＦＬＥＦＥＴＨＱＩＲＳＬＳＤＤＫＫＩＰＰＶＹＰＶＧＰＩＬＱＡＤＥＮＫＩＥＱＥＫＥＫＨＡＥＩＭＲＷＬＤＫＱＰＤＳＳＶＶＦＬＣＦＧＴＨＧＣＬＥＧＤＱＶＫＥＩＡＶＡＬＥＮＳＧＨＲＦＬＷＳＬＲＫＰＰＰＫＥＫＶＥＦＰＧＥＹＥＮＳＥＥＶＬＰＥＧＦＬＧＲＴＴＤＭＧＫＶＩＧＷＡＰＱＭＡＶＬＳＨＰＡＶＧＧＦＶＳＨＣＧＷＮＳＶＬＥＳＶＷＣＧＶＰＭＡＶＷＰＬＳＡＥＱＱＡＮＡＦＬＬＶＫＥＦＥＭＡＶＥＩＫＭＤＹＫＫＮＡＮＶＩＶＧＴＥＴＩＥＥＡＩＲＱＬＭＤＰＥＮＥＩＲＶＫＶＲＡＬＫＥＫＳＲＭＡＬＭＥＧＧＳＳＹＮＹＬＫＲＦＶＥＮＶＶＮＮＩＳ（配列番号９１）。
【０２６５】
得られたＳａＳｉＧＴ８は、アミノ酸レベルでＳ．ｉｎｄｉｃｕｍ由来のＳｉＧＴ８に対して９８％、Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍ由来のＳｒＳｉＧＴ８に対して９２％の配列同一性を示した。この高い配列同一性に加え、ＳａＳｉＧＴ８が種子で発現していることからＳａＳｉＧＴ８はリグナン配糖化活性を保有することが期待されたので、次に組換えＳａＳｉＧＴ８タンパク質の活性の有無を解析した。
【０２６６】
ＳａＳｉＧＴ８のＯＲＦを含む断片をｐＳＰＢ２６９７からＢａｍＨＩとＫｐｎＩで切り出して大腸菌発現ベクターｐＱＥ３０のＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩサイトへ挿入し、発現ベクターｐＳＰＢ２６９８を得た。実施例１１と同様の方法で組換えＳａＳｉＧＴ８タンパク質（ＳａＬＧＴ１）を発現させ、当該タンパク質がリグナン配糖化活性を有することを確認した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＳａＳｉＧＴ８遺伝子を発現する形質転換大腸菌の破砕上清において組換えＳａＳｉＧＴ８タンパク質（約６０ｋＤａ）の存在を確認した（図９）。
【０２６７】
ＨＰＬＣ分析の結果（図１０）、ＳａＳｉＧＴ８組換えタンパク質はＳｉＧＴ８組換えタンパク質と同様にピノレジノール、ピペリトール、およびセサミノールとの反応液中において、保持時間約４分、７．４分、および８．２分を示すそれぞれのモノグルコシドを生成した。
【０２６８】
以上の結果から、ＳａＳｉＧＴ８は、ＳｉＧＴ８同様にリグナン配糖化酵素をコードすることが示された。Ｓ．ｒａｄｉａｔｕｍおよびＳ．ａｌａｔｕｍからＳｉＧＴ８と高い配列同一性を示すＳｒＳｉＧＴ８およびＳａＳｉＧＴ８遺伝子が進化の過程で機能的に保存されていることが示された。
【０２６９】
本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能である。すなわち、請求項に示した範囲で適宜変更した技術的手段を組合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【産業上の利用可能性】
【０２７０】
以上のように、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、リグナン配糖体の生産に有用である。また、本発明に係るポリヌクレオチドを発現可能に導入した形質転換体または細胞は、食品分野、各種工業分野において、リグナン配糖体、またはこれを用いる製品を生産する上で、極めて有用である。上記形質転換体が植物体である場合、植物体自体を食品として用いることができるので農業分野等において非常に有用である。
【０２７１】
さらに、本発明に係るポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、本発明者らが見出した他の酵素（ピペリトールおよびセサミンを合成する酵素であるＳｉＰ１８９）と組合わせることによって、ゴマに限ることなく、特定のリグナン分子種の生産系の確立が可能となり、その結果、特定のリグナンおよびリグナン配糖体の生産量を拡大することができる。従って、本発明は、農業、食品産業、医薬品産業およびこれらの関連産業にわたる広範な利用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０２７２】
【図１】図１Ａは、ゴマの鞘（図中ａ上段）および種子（図中ａ下段）（成長ステージ：若い順に１〜４）、および発芽種子（図中ｂ）を示す写真である。図１Ｂは、図１Ａに示したゴマの葉、花、茎、鞘または種子から抽出した総ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現解析の結果を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＳｉＧＴ組換えタンパク質作製用の空ベクターのみを導入した細胞におけるピノレジノールの配糖化活性を示す図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＳｉＧＴタンパク質（ＳｉＧＴ８）のピノレジノールの配糖化活性を示す図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＳｉＧＴタンパク質（ＳｉＧＴ１０）のピノレジノールの配糖化活性を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、酵素反応液からＵＤＰ−グルコースを除いた場合のＳｉＧＴタンパク質（ＳｉＧＴ８）のピノレジノールの配糖化活性を示す図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、種々のリグナン標準品のピークを示す図である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＳｉＧＴ組換えタンパク質作製用の空ベクターのみを導入した細胞におけるセサミノールの配糖化活性を示す図である。
【図２Ｇ】図２Ｇは、ＳｉＧＴタンパク質（ＳｉＧＴ８）のセサミノールの配糖化活性を示す図である。
【図２Ｈ】図２Ｈは、ＳｉＧＴタンパク質（ＳｉＧＴ１０）のセサミノールの配糖化活性を示す図である。
【図２Ｉ】図２Ｉは、酵素反応液からＵＤＰ−グルコースを除いた場合のＳｉＧＴタンパク質（ＳｉＧＴ８）のセサミノールの配糖化活性を示す図である。
【図２Ｊ】図２Ｊは、酵素反応液からＵＤＰ−グルコースを除いた場合のＳｉＧＴタンパク質（ＳｉＧＴ１０）のセサミノールの配糖化活性を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＳｉＧＴタンパク質（ＳｉＧＴ８）のピペリトールの配糖化活性を示す図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、酵素反応液からＵＤＰ−グルコースを除いた場合のＳｉＧＴタンパク質（ＳｉＧＴ８）のピペリトールの配糖化活性を示す図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、種々のリグナン標準品のピークを示す図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ピノレジノールのＬＣ−ＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ピノレジノールのＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＳｉＧＴ８タンパク質によるピノレジノール配糖化反応の生成物のＬＣ−ＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ＳｉＧＴ８タンパク質によるピノレジノール配糖化反応の生成物のＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｅ】図４Ｅは、セサミノールのＬＣ−ＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｆ】図４Ｆは、セサミノールのＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｇ】図４Ｇは、ＳｉＧＴ８タンパク質によるセサミノール配糖化反応の生成物のＬＣ−ＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｈ】図４Ｈは、ＳｉＧＴ８タンパク質によるセサミノール配糖化反応の生成物のＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｉ】図４Ｉは、ピペリトールのＬＣ−ＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｊ】図４Ｊは、ピペリトールのＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｋ】図４Ｋは、ＳｉＧＴ８タンパク質によるピペリトール配糖化反応の生成物のＬＣ−ＭＳ解析を示す図である。
【図４Ｌ】図４Ｌは、ＳｉＧＴ８タンパク質によるピペリトール配糖化反応の生成物のＭＳ解析を示す図である。
【図５】図５は、リグナン配糖化酵素遺伝子のサザン解析の結果を示す図である。
【図６Ａ】図６Ａは、アフリカゴマ由来ＳｒＳｉＧＴ８組換えタンパク質の発現確認を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真である。
【図６Ｂ】図６Ｂは、アフリカゴマ由来ＳｒＳｉＧＴ８のピノレジノール配糖化活性を測定した結果を示す図である。
【図６Ｃ】図６Ｃは、アフリカゴマ由来ＳｒＳｉＧＴ８のピペリトール配糖化活性を測定した結果を示す図である。
【図６Ｄ】図６Ｄは、アフリカゴマ由来ＳｒＳｉＧＴ８のセサミノール配糖化活性を測定した結果を示す図である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、種々のリグナン標準品のピークを示す図である。
【図６Ｆ】図６Ｆは、酵素反応液からＵＤＰ−グルコースを除いた場合のアフリカゴマ由来ＳｒＳｉＧＴ８のピノレジノール配糖化活性を測定した結果を示す図である。
【図６Ｇ】図６Ｇは、酵素反応液からＵＤＰ−グルコースを除いた場合のアフリカゴマ由来ＳｒＳｉＧＴ８のピペリトール配糖化活性を測定した結果を示す図である。
【図６Ｈ】図６Ｈは、酵素反応液からＵＤＰ−グルコースを除いた場合のアフリカゴマ由来ＳｒＳｉＧＴ８のセサミノール配糖化活性を測定した結果を示す図である。
【図７Ａ】図７Ａは、ＳｉＧＴ８遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、図７Ａの続きであり、ＳｉＧＴ８遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、図７Ｂの続きであり、ＳｉＧＴ８遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図７Ｄ】図７Ｄは、図７Ｃの続きであり、ＳｉＧＴ８遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図７Ｅ】図７Ｅは、図７Ａ〜Ｄに示す調節エレメントを表す図である。
【図８Ａ】図８Ａは、ＳｉＧＴ１０遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図８Ａの続きであり、ＳｉＧＴ１０遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図８Ｂの続きであり、ＳｉＧＴ１０遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、図８Ｃの続きであり、ＳｉＧＴ１０遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図８Ｅ】図８Ｅは、図８Ｄの続きであり、ＳｉＧＴ１０遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図８Ｆ】図８Ｆは、図８Ｅの続きであり、ＳｉＧＴ１０遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図８Ｇ】図８Ｇは、図８Ｆの続きであり、ＳｉＧＴ１０遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図８Ｈ】図８Ｈは、図８Ｇの続きであり、ＳｉＧＴ１０遺伝子の発現調節エレメント解析の結果を示す図である。
【図９】図９は、組換えＳａＳｉＧＴ８タンパク質（ＳａＬＧＴ１）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後ＣＢＢ染色したゲルを示す写真である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＳａＳｉＧＴ８タ組換えンパク質（ＳａＬＧＴ１）作製用の空ベクターのみを導入した細胞、および発現ベクターを導入した細胞におけるピノレジノールの配糖化活性を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ＳａＳｉＧＴ８タ組換えンパク質（ＳａＬＧＴ１）作製用の空ベクターのみを導入した細胞、および発現ベクターを導入した細胞におけるピペリトールの配糖化活性を示す図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ＳａＳｉＧＴ８タ組換えンパク質（ＳａＬＧＴ１）作製用の空ベクターのみを導入した細胞、および発現ベクターを導入した細胞におけるセサミノールの配糖化活性を示す図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、ＳａＳｉＧＴ８タ組換えンパク質（ＳａＬＧＴ１）作製用の空ベクターのみを導入した細胞、および発現ベクターを導入した細胞におけるセサモリノールの配糖化活性を示す図である。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、種々のリグナン標準品のピークを示す図である。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグナン配糖化活性を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
リグナン配糖化活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２、４、８２もしくは９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列；または
（ｂ）配列番号２、４、８２もしくは９１のいずれか１つに示されるアミノ酸配列において、１個もしくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、もしくは付加されたアミノ酸配列、
からなることを特徴とするポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドをコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
【請求項４】
リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードしかつ下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列において、１個もしくは数個の塩基が欠失、挿入、置換、もしくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項５】
リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードしかつ下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項６】
リグナン配糖化活性を有するポリペプチドをコードしかつ下記の（ａ）または（ｂ）のいずれかであることを特徴とするポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または
（ｂ）配列番号１、３、８１もしくは９０のいずれか１つに示される塩基配列と少なくとも８０％同一である塩基配列からなるポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドのフラグメントまたはその相補配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１または２に記載のポリペプチドの発現を抑制することを特徴とする請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを用いることを特徴とするポリペプチドの生産方法。
【請求項１１】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドが導入されていることを特徴とする形質転換体。
【請求項１２】
リグナンおよびリグナン配糖体の含有比が改変されていることを特徴とする請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
生物もしくはその子孫、またはこれら由来の組織であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の形質転換体。
【請求項１４】
上記生物が植物であることを特徴とする請求項１３に記載の形質転換体。
【請求項１５】
上記植物がゴマ、レンギョウまたはアマであることを特徴とする請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とするポリペプチドを生産するための方法。
【請求項１７】
請求項１１〜１５のいずれか１項に記載の形質転換体を用いることを特徴とするリグナン配糖体の生産方法。
【請求項１８】
上記リグナン配糖体のアグリコンが、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることを特徴とする請求項１７に記載のリグナン配糖体の生産方法。
【請求項１９】
請求項９に記載のベクターを含有することを特徴とする細胞。
【請求項２０】
ゴマ、レンギョウまたはアマの細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の細胞を用いることを特徴とするポリペプチドを生産するための方法。
【請求項２２】
請求項１９または２０に記載の細胞を用いることを特徴とするリグナン配糖体の生産方法。
【請求項２３】
上記リグナン配糖体のアグリコンが、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることを特徴とする請求項２２に記載のリグナン配糖体の生産方法。
【請求項２４】
請求項１または２に記載のポリペプチドを用いることを特徴とするリグナン配糖体の生産方法。
【請求項２５】
上記リグナン配糖体のアグリコンが、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることを特徴とする請求項２４に記載のリグナン配糖体の生産方法。
【請求項２６】
請求項１７、２２または２４のいずれか１項に記載の生産方法により得られたリグナン配糖体を含有することを特徴とする食品または工業製品。
【請求項２７】
上記リグナン配糖体のアグリコンが、ピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることを特徴とする請求項２６に記載の食品または工業製品。
【請求項２８】
請求項３〜６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを、リグナンを産生する生物に導入する工程を包含することを特徴とする生物中のリグナン配糖体の含有量を増加させる方法。
【請求項２９】
上記リグナンを産生する生物がゴマ、レンギョウまたはアマであることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
上記リグナンがピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることを特徴とする請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項８に記載のオリゴヌクレオチドを、リグナンを産生する生物に導入する工程を包含することを特徴とする生物中のリグナン配糖体の含有量を減少させる方法。
【請求項３２】
上記リグナンを産生する生物がゴマ、レンギョウまたはアマであることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
上記リグナンがピペリトール、セサミノールまたはピノレジノールであることを特徴とする請求項３１または３２に記載の方法。

【図１】