リグノセルロース分解性酵素の活性を促進するための方法
本発明により、リグノセルロースを加水分解するための方法が提供される。これはリグノセルロースを一つ以上の化学処理に接触させる手順から成る。また、リグノセルロース質原料を前処理するための方法も提供され、これは一つ以上の化学薬剤を原料に接触させる手順から成る。また、植物材料から酵素あるいは医薬品、機能性食品等の物質を遊離させるための方法も提供される。これらの方法は従来の方法と比べて効率性が高く、より経済的で毒性が少ない。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
植物物質由来の遊離糖類及び遊離オリゴ糖の生成を向上させる方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
植物バイオマスは糖類から構成され、地球上で最大の再生可能炭水化物源となっている。しかしながらその糖類は複合高分子に組み込まれているため、この莫大な資源は十分活用されていない。この複合高分子はしばしば集合的にリグノセルロースと呼ばれる。植物バイオマスを分解して生成される糖類は、発酵して化学品、樹脂、並びに石油の代替品としてのエタノールを含む燃料となる、豊富で経済的競争力のある発酵原料を提供することができると考えられる。
【０００３】
米国におけるエタノールの商業生産は現在乾式製粉工場で行われており、トウモロコシ粒をエタノールに転換している。しかしトウモロコシ粒は高価で家畜餌等他の高価値な用途があり、また果糖を豊富に含むコーンシロップが含まれている（Ｗｙｍａｎ，ｅｄ． （１９９９） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｈｔａｎｏｌ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐ．１）。少ない費用で商業的大規模生産が可能な、エタノール生産のための別の供給源が望まれていれる。
【０００４】
廉価且つ豊富であり競合的市場のないトウモロコシ葉茎等、リグノセルロース質物質はエタノールの生産のために穀類よりも望ましいものであると考えられる。制限となる要因は糖重合体の複雑な組成にある。トウモロコシ粒の澱粉は高度に分枝した酵素で分解されやすい水溶性の重合体である。反対に、トウモロコシ葉茎等のリグノセルロース質物質を構成する炭水化物はこれよりも分解されにくい。これらの炭水化物は一般的に、植物細胞壁並びに木質組織の構造成分を形成するセルロース、ヘミセルロース及びグルカンを包含する複合高分子として存在する。澱粉並びにセルロースは共にグルコースの重合体である。
【０００５】
リグノセルロース中の糖類を遊離させる従来の手法には多くの手順が含まれる。その手順の中で鍵となるは激しい条件での前処理である。現在の産業的前処理の目的は、真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ の発酵に由来するセルラーゼ混合物等のセルロース加水分解酵素とセルロースとの接触性を向上させることにある。現在の前処理方法には、高温高圧下且つ強酸あるいは強塩基中で、トウモロコシ葉茎等のリグノセルロース質物質を部分加水分解する手順が含まれる。当該化学的前処理によってヘミセルロースあるいはリグノセルロースのリグニン成分、あるいはその両方が分解されてセルロースが露出するが、酢酸並びにフルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール等の不要な副産物も生じる。続いて行う、酵素を用いた、あるいは同時糖化発酵（ＳＳＦ）と呼ばれる共発酵処理によるセルロース分解を可能にするために、さらに手順を加えてこれらの副産物を除去しなければならない。
【０００６】
化学的前処理に必要とされる激しい条件には高価な反応容器が必要であり、エネルギーを集約的に使用する。化学処理は既知のセルロース酵素に適合しない温度とｐＨ（例えば１２気圧１６０℃及び０．２％硫酸）で行われ、発酵の前に除去しなければならない化合物が生じることから、この手順はセルロース分解とは別の反応容器で行わねばならず、またセルロース分解の前に行わなくてはならない。つまり、よりセルロース分解工程に適合し、有害廃棄物を出さず、またより少ないエネルギーしか必要としない新しい方法が望まれていると思われる。さらに、酵素反応がセルロース分解に用いられる条件と同様の条件で行われることで、同時処理方法の開発がもたらされると考えられる。この同時処理方法においては、ヘミセルロース及びセルロースの分解を同じ反応容器で行う、もしくは現在の前処理工程をセルロース分解とその後の工程と分離しなければならない方法論に従って分離することをしない。加えて、毒性物質を生じることなくリグノセルロース中の糖類を遊離させる手順は、リグノセルロース質物質中に存在するタンパク質、アミノ酸、脂質等の栄養素へ利用可能性が増加するため、さらなる利益を提供することができる可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の理由からリグノセルロースを糖類に変換して発酵原料とするための、効率的な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概要
激しい前処理の必要がなく、効率性が向上するリグノセルロースを加水分解するための方法が提供される。これらの方法には、軽度あるいは中程度の条件でリグノセルロースを化学処理して処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースの一成分を加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順が含まれる。この化学処理には、酵素処理と併用して糖類を遊離させる作用を持つ一つ以上の化学薬剤とリグノセルロースを接触させる手順を含む。
【０００９】
また、リグノセルロース質物質を前処理する方法も提供され、これには軽度あるいは中程度の条件でリグノセルロース質物質を一つ以上の化学薬剤と接触させて処理済リグノセルロースを生成する手順から成る。一部の実施例においては、この処理済リグノセルロースをさらにリグノセルロースを加水分解できる一つ以上の酵素で処理することができる。
【００１０】
また、リグノセルロース質物質から物質を遊離させる手法も含まれる。これらの手法は、軽度あるいは中程度の条件でリグノセルロース質物質を化学処理する手順から成る。一部の実施例では、化学処理に続いてリグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素を加えることができる。本発明の方法によってリグノセルロース質物質を処理することによって、酵素並びに医薬品、機能性食品を分離することができる。一部の実施例では、リグノセルロース質物質は、遊離する物質を含有するよう工学処理されている。
【００１１】
上記の手法で使用する化学薬剤には酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基あるいはこれらから成るあらゆる組み合わせが含まれる。
【００１２】
また、リグノセルロースを加水分解する手法で、リグノセルロースを酸化剤と接触させて処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順から成るものが提供される。
【００１３】
さらにリグノセルロースを加水分解する手法で、リグノセルロースを約９．０から約１４．０のｐＨで塩基と接触させて処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順から成るものも提供される。
【００１４】
本発明の方法で使用される酵素はリグノセルロースのあらゆる成分と反応することが可能であり、これらにはセルラーゼ並びにキシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼが含まれるがこれらに限定されない。酵素は化学処理前あるいは化学処理後、もしくは化学処理と同時に加えることができる。さら、酵素反応の前もしくは酵素反応と協調して行われる二つ以上の化学処理を含む手法と、これに加えて二つ以上の酵素処理を含む手法も提供される。複数回の化学処理並びに酵素添加が含まれ、任意の順序の任意の回数の処理から成る。あらゆる処理の前あるいは処理中もしくは処理後に、リグノセルロースに一つ以上の物理的処理を行うことができる、あるいは金属イオンもしくはオゾン、紫外線を接触させることができる。
【００１５】
さらに本発明の方法は、一つ以上の発酵生物体を添加する手順を含むことができ、その結果一つ以上の発酵産物が生成される。当該産物には乳酸並びに燃料、有機酸、産業用酵素、医薬品、アミノ酸が含まれるがこれらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
詳細
本発明は、リグノセルロースの加水分解及びリグノセルロースからの糖類生成のための数種類の方法に向けられており、これらの方法は従来記述されている処理法あるいは前処理法と比べて、より経済性に優れより効率的で且つ毒性が低い。一手法では、軽度あるいは中程度の処理温度あるいは圧力、ｐＨ、もしくはこれらの組み合わせでリグノセルロースを化学処理して処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順を含む。
【００１７】
また、軽度あるいは中程度の条件下で一つ以上の化学薬剤と接触させる手順から成る、リグノセルロース質物質の前処理方法も提供される。この処理済リグノセルロース質物質はさらに、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素による処理を受けることができる。
【００１８】
さらに、リグノセルロース質物質中の物質を遊離させるための方法も提供され、これは軽度あるいは中程度の条件下でリグノセルロース質物質を一つ以上の化学薬剤と接触させて処理済リグノセルロース物質を生成する手順から成る。この処理済リグノセルロース物質はさらにリグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させることができる。
【００１９】
一部の実施例において植物材料は、リグノセルロースを加水分解できる一つ以上の酵素を発現するよう遺伝子工学的に加工された植物から成る。別の実施例では、植物材料を化学処理の前に、酵素の発現が可能な条件下で培養することができる。酵素の発現によって、化学処理の前にリグノセルロースを加水分解することもできる。さらに、これに引き続いて一つ以上の酵素処理を行うこともできる。植物材料から遊離することのでる物質には、酵素並びに医薬品、機能性食品が含まれるがこれらに限定されない。さらに植物材料は、これらの物質が発現するよう遺伝子工学的に加工されることも、加工されない場合もある。
【００２０】
上記のいずれの手法においても、化学薬剤は酸化剤あるいは変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、もしくはこれらの組み合わせであることができる。
【００２１】
加えて、あらゆる処理条件の下で一つ以上の酸化剤を接触させて処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順を含む、リグノセルロースを加水分解するための方法が提供される。酸化剤は次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過酸化水素、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン塩、オスミウム酸、クロム酸、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、あるいは酸素ラジカルを生じさせることのできる化合物であることができる。
【００２２】
さらに、リグノセルロースを約９．０から約１４．０のｐＨで塩基と接触させて処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順を含む、リグノセルロースを加水分解するための方法が提供される。この方法にはあらゆる範囲の温度あるいは圧力から成る処理条件が含まれる。本手法に加えて酸化剤を使用する手法には、軽度あるいは中程度の処理条件を取り入れることができると認知されている。
【００２３】
酵素あるいは酵素群は、化学溶液の添加と同時に、あるいは添加前もしくは添加後に加えることができると認知されている。同時に添加する場合、化学薬剤あるいは化学薬剤の組み合わせは、この処理法で使用するために選択された酵素の作用を阻害しないものとなる。化学溶液で処理した後に酵素を加える場合、酵素を加える前に条件（温度並びにｐＨ等）を変えることができる。一実施例では、酵素を加える前に、その酵素あるいは酵素群に最適となるようｐＨを調整する。別の実施例では、酵素を加える前に、その酵素あるいは酵素群に最適となるよう温度を調整する。引き続いてあるいは同時に酵素を添加する手順と併用して、あるいは併用せずに、複数回の化学処理を行うことが可能である。加えて、複数回酵素を添加することも含まれる。
【００２４】
「処理済リグノセルロース」あるいは「処理済リグノセルロース質物質」あるいは「処理済材料」は「処理工程」あるいは「処理」の間に、ある種の化学処理あるいは物理的処理によって、少なくともその一部分が加水分解されたリグノセルロースと定義される。典型的には、一つ以上のポリマー成分が処理の間に加水分解され、そのために他の成分がその先の処理をより受けやすくなる。別の方法として、処理後により加水分解されやすくなるよう、処理工程によって加水分解することなくリグノセルロースの構造を改変することができる。糖類の一部あるいは全部を遊離させるよう、リグノセルロースを前もって処理しておくこともできる。
【００２５】
「軽度の処理」あるいは「軽度の条件」によって、約２０℃から約８０℃の温度で２気圧未満、ｐＨは約５．０から約８．０の間であることが意味される。「中程度の処理」あるいは「中程度の条件」によって、以下の条件の内の少なくとも一つが意味される。：約１０℃から約９０℃の温度、約２気圧以下、約４．０から約１０．０の間のｐＨ。処理が中程度の条件下で行われる場合、この３つのパラメーターのうち２つは中程度として揚げられた範囲を外れることが有りうる。例えば、温度が約１０℃から約９０℃である場合、ｐＨ並びに圧力は制限されない場合もある。ｐＨが約４．０から約１０．０の間である場合、温度及び圧力は制限されない場合もある。圧力が約２気圧である場合、ｐＨ並びに温度は制限されない場合もある。
【００２６】
「化学薬剤」あるいは「化学溶液」によって、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基あるいはこれらから成るあらゆる組み合わせが意味される。「酸化剤」によって、分子の酸化レベルを上昇させることのできる物質が意味される。酸化剤は他の分子から電子を受け取り、その過程で還元されることによって作用する。酸化剤には過酸化水素並びに尿素過酸化水素塩、過酸化ベンゾイル、超酸化物類、超酸化カリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、ペルオキシ酸、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マグネシウム塩、オスミウム酸、クロム酸、ドデシルベンゼンスルホン酸塩が含まれるがこれらに限定されない。酸化剤には含過酸化物構造体に加え、酸素ラジカルを生成することのできる化合物が含まれる。「含過酸化物構造体」によって二価イオン−Ｏ−Ｏ−を含有する化合物が意味される。
【００２７】
「変性剤」によって、タンパク質あるいは炭水化物、核酸の構造を崩壊させる化合物が意味される。変性剤には水素結合崩壊剤が含まれる。「水素結合崩壊剤（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）」もしくは「水素結合解離剤（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）」によって、水素結合を解離させる、あるいは（且つ）水素結合の形成を抑制する、あるいは（且つ）解離後の再形成を抑制すると知られている薬剤あるいは薬剤群が意味される。水素結合崩壊剤には尿素、グアニジニウム、塩素等のカオトロピック剤並びに、Ｎ−メチルモルホリン‐Ｎ−オキシド等のアミン酸化物が含まれるがこれらに限定されない。
【００２８】
「界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）」によって、ミセラを形成して油分を可溶化することのできる化合物が意味される。界面活性剤にはアニオン、カチオン、中性界面活性剤が含まれ、これにはノニデット（Ｎ）Ｐ４０並びにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スルホベタイン、ｎ−オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、トリトンＸ−１００、ツイン２０が含まれるがこれらに限定されない。「表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）」はこの定義に含まれる。「表面活性剤」によって水の表面張力を低下させることのできる化合物が意味される。
【００２９】
「有機溶媒」によって、含炭素化合物がその最大部分を構成する溶液が意味される。有機溶媒にはジメチルホルムアミド並びにジメチルスルホキシド、メタノールが含まれるがこれらに限定されない。
【００３０】
「塩基」によって、電子もしくは水素イオンを供与する、あるいは陽子を受容する化学種が意味される。塩基には炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化セシウム、水酸化ルビジウム、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化第二スズ、並びに水酸化物イオンが含まれるがこれらに限定されない。
【００３１】
酵素添加あるいはさらなる化学処理の前に、処理済リグノセルロース中の化学薬剤及び化学薬剤群を除去するあるいは稀釈することもできる。この操作によって、酵素の活性もしくは引き続いて行う微生物の増殖に最適な状態とすることを助ける。別の方法として、より多量の一つ以上の酵素と接触させる前に、少量の一つ以上の酵素を処理済リグノセルロースに加えてインキュベートすることもできる。化学薬剤は、より多量の一つ以上の酵素を添加する前に除去するあるいは稀釈することができる。こうした除去あるいは稀釈は、当分野にて周知されているあらゆる方法によって行うことができ、これには洗浄並びに重力流動、圧力、濾過が含まれるがこれらに限定されない。処理済リグノセルロースから除去される化学薬剤あるいは化学薬剤群は引き続いて行う一つ以上のインキュベーションで再使用することもできる（この明細において「リサイクル薬剤」と定義される。）。
【００３２】
さらに本手法は、全体をあるいは一部分を、一回あるいは複数回行うことができる。即ち、化学溶液もしくは個々の化学薬剤を用いて一回あるいは複数回の反応を遂行させ、次いで一つ以上の酵素処理反応を行うことができる。化学薬剤あるいは化学溶液は一回にまとめて加える、あるいは少量ずつ連続的に加えることができる。さらに、必要に応じて全手順を一回以上繰り返すこともできる。即ち、化学薬剤もしくは酵素を用いた処理を一回以上追加することが含まれる。
【００３３】
この手法によって、加水分解された糖類等（加水分解物）の可溶性物質と不溶性物質とが生成される。その過程で、もしくは当該処理に続いて、例えばバッチ法あるいは連続法、フィードバッチ法によって、可溶性物質を含む液体を分離することができる。この可溶性物質から糖類を分離することができ、さらに濃縮あるいは精製することもできる。加えて、可溶性物質と残余固形物とを包含する処理済リグノセルロースを使用前に加工することができる。この可溶性物質もしくは不溶性物質を、例えば水あるいは発酵培養液を用いて分離するあるいは稀釈することが可能であり、あるいはその物質のｐＨを改変することができる。この分離もしくは稀釈は、当分野で周知されているあらゆる方法によって行うことができ、これには洗浄並びに重力流動、圧力、濾過が含まれるがこれらに限定されない。この物質は、例えばろ過によって、滅菌することもできる。
【００３４】
また、本発明の方法と併用して、研磨並びに煮沸、凍結、製粉、真空浸透、その他の物理的処理を用いることができる。製粉等の物理的処理によって、バッチ反応器にてより高濃度のリグノセルロースを使用することができる。「より高濃度」によって、最大約２０％もしくは最大約２５％、最大約３０％、最大約３５％、最大約４０％、最大約４５％、最大約５０％のリグノセルロースが意味される。化学処理及び（もしくは）物理処理は、本発明の処理方法に関して同時にあるいは順次行うことができる。リグノセルロースはまた、金属イオン並びに紫外線、オゾン、その他に接触させることができる。物質によっては、これらの処理によって水酸基の形成が誘導されて化学処理の効果が上昇する場合がある。本発明の方法はあらゆる適切な容器内で遂行することができ、これにはバットあるいは市販の容器、バイオリアクター、バッチ反応器、発酵タンク・容器が含まれる。本発明の処理過程において、反応混合物を撹拌混合することもできる。
【００３５】
本発明の方法によって、バイオマスの単糖類並びにオリゴサッカライドへの変換効率が向上する。バイオマスが効率的に変換されることによって、後に有用な発酵ベース生成物に転換することができる糖類生成の費用が減少することとなる。「発酵ベース生成物」によって、化学変換あるいは発酵によって産生された生成物が意味される。当該生成物には特殊化学薬品並びに化学原料、樹脂、溶剤、燃料が含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法によって作ることのできる生成品の詳細には、生物燃料（エタノールを含む。）、乳酸、樹脂、特殊化学品、クエン酸並びにコハク酸、マレイン酸を含む有機酸、溶剤、動物飼料補助剤、医薬品、ビタミン、リジン並びにメチオニン、トリプトファン、スレオニン、アスパラギン酸等のアミノ酸、プロテアーゼ並びにセルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、酸化還元酵素、転移酵素等の産業用酵素、化学原料が含まれるがこれらに限定されない。また本発明の方法は、微生物発酵による発酵のための原料を生成するのに有用である。一実施例では、本手法はさらに一回以上の発酵微生物を添加する手順から成る。「発酵微生物」によって、酵母を含め、細菌並びに真菌等発酵能力のある生物体が意味される。当該原料は栄養価が付加され、遊離糖類が提供する栄養価を上回る。
【００３６】
また本発明の方法は、リグノセルロース質物質を加工するための手法の開発あるいは改良に有用である。本方法は粘度等含リグノセルロース物質の取り扱い特性の改変あるいは改良に加えて、原料の容積並びに粒子サイズを減少させるのに有用であり、これは糖類を遊離する、あるいは原料として利用する、もしくはさらに別の方法で使用するためのリグノセルロースを調製するのに役立つ。さらに本発明の方法は、廃棄物の容積を減らす目的で使用することができ、リグノセルロース性廃棄物が発生する産業工程から生じる廃棄物の性状を改良する目的で使用することができる。特に本方法は水分含量を減らす、且つ（あるいは）乾燥度あるいは栄養価、組成を改良するのに有用となる。
【００３７】
一実施例では、化学処理によってリグノセルロース質原料に存在する生物性汚染物の数が減少する。これは原料を滅菌した結果である可能性がある（実験の項の例９を参照。）。
【００３８】
処理条件
酵素は、バイオリアクターを用いてバイオマスを変換させるために一般に利用されている極端な高温あるいは酸処理を含まない、軽度あるいは中程度の条件下で基質と反応させる。例えば酵素は低度から中程度のイオン強度且つｐＨが中性である緩衝液中で、約２０℃から約８０℃でインキュベートされ、望ましくは約３０℃から約６５℃、より望ましくは約３７℃から約４５℃、さらに望ましくは約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃でインキュベートすることができる。驚くべきことに、この化学処理によって十分な量の糖類を遊離あるいは解離させることができる。「十分な」量によって、利用可能な糖類が少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、及びそれ以上であることが意味される。
【００３９】
化学処理の温度は、約１０℃から約１００℃もしくはそれ以上、あるいは約１０℃から約９０℃、約２０℃から約８０℃、約３０℃から約７０℃、約４０℃から約６０℃、約３７℃から約５０℃、望ましくは約３７℃から約１００℃、より望ましくは約５０℃から約９０℃、最も望ましいのは約９０℃未満あるいは約８０℃未満、あるいは約８０℃の範囲であることができる。本発明の方法は多様な温度で実施することができるが、使用する酵素に最適な温度、あるいは使用する酵素に最適と予測される温度で処理を行うことが望ましい。最適温度に関するデータが不足している場合は、最初５０℃で処理を行い、次により高い温度もしくはより低い温度で処理を行うこともできる。この試験の分析結果の結果を比較することで、試験された酵素に最適となるよう方法を改良することが可能となる。処理混合物のｐＨは約２．０から約１４．０までの範囲となることができるが、薬剤が酸化剤あるいは変性剤、界面活性剤、有機溶媒で有る場合、望ましいｐＨは約３．０から約７．０であり、より望ましくは約３．０から約６．０であり、さらに望ましくは約３．０あるいは約５．０、約３．５、約３．０、約４．０、約４．５、約５．０である。薬剤が塩基である場合、望ましいｐＨは約９．０から約１４．０であり、より望ましくは約ｐＨ１０．０から約ｐＨ１３．０、さらに望ましくは約ｐＨ１１．０から約ｐＨ１２．５、最も望ましいのは約ｐＨ１２．０である。ここでもｐＨは酵素活性が最大となるように調整し、酵素あるいは酵素混合物を添加する際に、あるいは酵素を添加する前にｐＨを調整することができる。
【００４０】
薬剤の最終濃度は約０．１％から約１０％の範囲となることができ、望ましくは約０．３％から約８％、より望ましくは約０．３％から約５．０％、あるいは約０．４％から約３．０％であり、さらに望ましくは約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％である。リグノセルロースの濃度は約１％から約６０％となることができ、望ましくは約１０％から約４０％、より望ましくは約２０％、約２５％、約３０％、約３５％である。少なくとも約８時間から少なくとも約４８時間等、処理反応は数分から数時間となることが有り得、より望ましくは少なくとも約１２時間から少なくとも約３６時間、少なくとも約１６時間から少なくとも約２４時間、少なくとも約２０時間、より望ましくは少なくとも約１０時間、最も望ましいのは少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、少なくとも約２．０時間、少なくとも約３時間である。反応は約０気圧から約２気圧で起こることが有り得る。最適な反応条件（化学薬剤の最適量並びに基質量、インキュベーションの最適時間、最適温度、最適温度・ｐＨ・緩衝液・圧力）を決定するために、分析要素を付加する前後の様々な時点で混合物の一定分割量を取り出し、参考のためこの明細に添付してあるＵ．Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６０／４３２，７５０に記載されている変法ＤＮＳ分析法によって、糖類の遊離を測定することができる。
【００４１】
一実施例において本発明の方法には、約０℃から約１００℃の温度且つ約２気圧未満、約２．０から約１４．０のｐＨでリグノセルロースを化学処理する手順が含まれる。別の実施例では、これらの条件の内少なくとも一つはリグノセルロースを加水分解するのに十分な条件である。さらに他の実施例においては、これらの条件の内少なくとも二つはリグノセルロースを加水分解するのに十分な条件である。
【００４２】
本発明の一側面においては、リグノセルロース質物質あるいは植物バイオマスは、エタノールもしくは他の有用な製品を生産するために、分解されて単糖類並びにオリゴサッカライドに変換される。バイオマスから遊離された糖類は転換されて有用な発酵産物となることができる。有用な発酵産物にはアミノ酸あるいはビタミン、医薬品、動物飼料補助剤、特殊化学品、化学原料、樹脂もしくは他の有機ポリマー、乳酸、燃料エタノールを含むエタノール等が含まれるがこれらに限定されない。
【００４３】
従来の方法とは異なり、炭水化物重合体とリグニンとの複合混合物、あるいはリグノセルロースそのものを、バイオマス変換酵素が加水分解する基質として使用することができる。これらの複合体基質中の糖類及びオリゴサッカライドの遊離状態を測定するための、特別な分析法が開発されている。このアッセイでは、トウモロコシ葉茎並びにおが屑、木片屑その他を含む、あらゆるリグノセルロース物質複合体を用いることができる。本アッセイでは、トウモロコシ茎葉等のリグノセルロース質物質を、様々な回数、酵素と共にインキュベートし、遊離された還元糖を、Ｕ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６０／４３２，７５０に記載されているジニトロサリシリック酸アッセイ法を用いて測定する。還元糖を検出することのできるもの等、様々なアッセイ法をさらに用いて、化学処理の結果可溶化された単糖類あるいはオリゴサッカライドを定量するが可能である。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によって、単糖類及びオリゴ糖類を定性的且つ定量的に分析することができる。
【００４４】
本発明の方法はまた、発酵用の原料を生成するのに有用である。当該原料はタンパク質並びにアミノ酸、リグニン（炭素源）、脂質、ミネラル（鉄を含む）が可溶化されているため、遊離糖類によって提供される栄養価を超える栄養価を有する。リグノセルロース質物質から原料を生成するための他の方法と比較して、本手法は発酵前に可溶性成分の除去をほとんどあるいは全く必要としない。本方法で生成された原料を、酵母を含め、細菌並びに真菌等の微生物の発酵に使用することもできる。
【００４５】
また、本発明の方法はリグノセルロース物質を加工するための方法を開発するあるいは改良するのに有用である。即ち、これらの方法によって構成成分が改変されたリグノセルロースストリーム並びに粘度の低いリグノセルロースストリーム、容積の小さいリグノセルロースストリーム、さらに水分量もしくは保水量の少ないリグノセルロースストリームを作ることができる。さらに本手法は、農業廃棄物など加水分解されにくいリグノセルロースストリーム中の糖類の回収に適している。この回収によって糖類は原料供給ストリームに再統合され、廃棄物ストリームはさらに減少すると考えられる。加えて、本手法によって農業廃棄物ストリームの還元糖含量が減少すると考えられ、反芻動物の食事に取り入れる繊維状成分としてより適切なものとなると思われる。
【００４６】
酸化剤
酸化剤の相対的強度（例えばｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｐｈｙｓｉｃｓ．ｐｈｙ−ａｓｔｒ．ｇｓｕ．ｅｄｕ／ｈｂａｓｅ／ｃｈｅｍｉｃａｌ／ｃ１を参照する。）は、標準電極電位から推定することができる（例えばｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｐｈｙｓｉｃｓ．ｐｈｙ−ａｓｔｒ．ｇｓｕ．ｅｄｕ／ｈｂａｓｅ／ｃｈｅｎｉｃａｌ／ｃ１を参照する。）最も強い酸化剤が標準電極表に示されている（例えばｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｐｈｙｓｉｃｓ．ｐｈｙ−ａｓｔｒ．ｇｓｕ．ｅｄｕ／ｈｂａｓｅ／ｔａｂｌｅｓ／ｃ１を参照する。）。酸化剤の表の一部には、臭素酸塩並びに塩酸、亜塩素酸、塩素化イソシアヌール酸塩、クロム酸塩、二クロム酸塩、フッ素・塩素・臭素を含むハロゲン、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、硝酸、硝酸塩、亜硝酸塩、酸素、過ホウ酸塩、過塩酸塩、過塩酸、過ヨウ素酸塩、過マンガン酸塩、過酸化水素・ヒドロペルオキシド・ケトン過酸化物・有機過酸化物・無機過酸化物を含む過酸化物、ペルオキソ酸、過硫酸塩が含まれる。
【００４７】
製紙工業で使用される酸化・漂白剤には、塩素・塩素化化合物、塩素、塩化ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム、その他の次亜塩素酸塩、クロロイドシアヌレート、様々な塩素化合物、１，３‐ジクロロ‐５，５‐ジメチルヒダントイン（ＤＣＤＭＨ）、酸素・酸化化合物、過酸化水素、オゾン、過ホウ酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、有機過酸化物、過酸化ベンゼン、他の有機過酸化物、無機過酸化物、過酸化ナトリウム、過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過炭酸ナトリウム、その他の酸化化物、過酢酸及び過酸化１硫酸、金属酸素酸、硝酸及び亜硝酸が含まれる。
【００４８】
過酸化水素
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、過酸化イオン（Ｏ２２−）のプロトン付加形態である。これは酸化工程によって合成され、最大７０％の濃度の水稀釈物として市販の物を購入することができる。さらに、過酸化水素は酸素の１電子減少形態（Ｏ２−）から自然発生的に、あるいは酵素スーパーオキシドジスムターゼを使用して合成することができる。
【００４９】
過酸化水素は強力な酸化剤である。適切な刺激物がある状態でＨ２Ｏ２が還元されて水酸基（ＨＯ）となることができることは当分野において周知のことである。こうした刺激物には金属陽イオン（Ｆｅ２＋等）並びに紫外線、オゾンが含まれる。水酸基は非常に強力な酸化剤である。
【００５０】
リグノセルロースを加水分解することのできる酵素のサイズは大きく、植物の細胞壁を通過することができない。一方過酸化水素は通過できるほど小さい。自然環境で過酸化水素（並びに水酸基）は、過酸化水素処理後に観察される植物バイオマスの分解に寄与している可能性もある（例えばＸｕ ａｎｄ Ｇｏｏｄｅｌｌ （２００１） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ８７：４３−５７； Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｅｙ （１９９７） Ｉｎｔ． Ｂｉｏｃｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｂｉｏｄｅｇｒｅｄａｔｉｏｎ ３９： １１３−１２４を参照する。）。過酸化水素が関係する他のリグノセルロース処理はアルカリ性あるいは高温あるいはその両方の条件下で行われている（例えばＫｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ５７／５８：１４７−１５６； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９１−９３：８１−９４； Ｄｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１）； Ｌｅａｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ５９：３３４−３４７を参照する。）
過酸化水素に加えて、様々な化学現象を通じて他の化合物が水酸基を生じさせることができることは一般に周知されている。一例は次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）であり、これはスーパーオキシド基（Ｏ２−）あるいは鉄（ＩＩ）イオン（Ｆｅ２＋）等の電子供与体と反応することによって水酸基を作ることができる。
【００５１】
水酸基は酸化力特性を持つ酸素ラジカル化合物の一例である。酸素ラジカルを持ち同様の特性を有する他の化合物は当分野において周知されている。これらの化合物にはこのスーパーオキシド基（Ｏ２−）、一重項酸素（１Ｏ２）、一酸化窒素（ＮＯ）、ペルオキシル基類（ＲＯＯ）、アルコキシル基類（ＬＯ）が含まれる。これらの化合物の内一つ以上は、本発明の工程に利用できると考えられる。
【００５２】
酵素命名と適用
ＩＵＢＭＢ（国際生化学・分子生物学連合）が推奨する命名法が、増補１（１９９３）、増補２（１９９４）増補３（１９９５）、増補４（１９９７）、増補５（各々Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９４） ２２３：１−５並びにＥｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９５） ２３２：１−６； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９６） ２３７：１−５； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９７） ２５０：１−６； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９９） ２６４：６１０−６５０）と供に、Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２［Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＩＳＢＮ ０−１２−２２７１６４−５（ハードカバー）、０−１２−２２７１６５−３（ペーパーバック）］にて公開されている。ＩＵＢＭＢが推奨する分類法は、当分野において認知され追随されている。一般的には、当分野において酵素はＩＵＢＭＢ酵素分類法あるいはＥＣナンバーで照会される。グループごとに掲載されている酵素は頻繁に更新され、ＩＵＢＭＢはこれを書籍並びにインターネットで公開している。
【００５３】
ＩＵＢＭＢ分類法に基づく酵素命名に関する別の資料はＥＮＺＹＭＥデータベースにおいて見ることができる。ＥＮＺＹＭＥは酵素の命名に関係する情報の集積場となっている。基本的に国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名委員会による推奨に基づいており、分類された各種酵素にＥＣ（酵素委員会； Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）ナンバーが付けられ、記載されている（Ｂａｉｒｏｃｈ （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：３０４−３０５）。ＥＮＺＹＭＥデータベースには以下の入力項目について記載されている。：ＥＣナンバー、推奨名称、別名（存在する場合）、触媒活性、補酵素（存在する場合）、その酵素に対応するＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質シーケンスへのポインター（存在する場合）、その酵素の欠損に関係するヒト疾患についてのポインター（存在する場合）。
【００５４】
「セルラーゼ」には、セルロースあるいはセルロース分解物からできる生成物を基質として認識して加水分解することのできる内部加水分解酵素と末端加水分解酵素の双方が含まれる。セルラーゼにはエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルコシダーゼから成る混合物、あるいはこれらの酵素の内の任意の一つを含み、他の活性を合わせ持つ場合もある。セルロース加水分解活性を示す微生物は異なる基質特異性を持つ酵素類を大量に産生するものが多い。このため、実際には数種類の酵素がその活性に寄与している場合でも、セルロースを分解すると同定された株はセルラーゼを持つと記載されることがある。例えば、市販されている製剤である「セルラーゼ」は、エンドグルカナーゼ並びにエキソグルカナーゼ、グルコシダーゼ活性等いくつかの酵素の混合物であることが多い。
【００５５】
このように、「セルラーゼ」には当該酵素の混合物が含まれ、さらにセルロースを加水分解することのできる市販製剤に加え、セルロース加水分解活性を呈するもしくはセロトリオース、セロバイオース等のセルロース分解物に作用する培養液上清あるいは細胞抽出液が含むまれる。
【００５６】
「エンドグルカナーゼ」あるいは「１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ」、「β−１，４エンドセルラーゼ」、「エンドセルラーゼ」、「セルラーゼ」ＥＣ３．２．１．４．には、β−１，４結合によって結合したグルコース重合体を切断する酵素が含まれる。これらの酵素が作用する基質にはセルロース並びに、カルボキシメチルセルロース、ＲＢＢセルロース等の修飾セルロースが含まれる。
【００５７】
「セロビオヒドロラーゼ」あるいは「１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ」、「セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ」、「セロビオシダーゼ」には、セルロース並びにセロテトラオースの１，４−β−Ｄ−グルコシド結合を加水分解し、高分子鎖の非還元末端からセロビオースを遊離させる酵素が含まれる。グループＥＣ３．２．１．９１の酵素にこれらの酵素が含まれる。
【００５８】
「β−グルコシダーゼ」あるいは「グルコシダーゼ」、「β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ」「セロビアーゼ」ＥＣ３．２．１．２１には、触媒作用による産生物としてグルコース分子を遊離させる酵素が含まれる。これらの酵素は、セロビオース（β−１．４結合グルコース二量体）あるいはセロトリオース（β−１．４結合グルコース三量体）等のグルコース重合体を基質として認識する。典型的には、これらは非還元β−Ｄ−グルコース末端を加水分解し、β−Ｄ−グルコースを遊離させる。
【００５９】
表１ セルラーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
【表１】
「キシラナーゼ」には、キシランあるいはキシラン分解生成物を基質として認識することのできる、末端加水分解酵素と内部加水分解酵素の双方が含まれる。ヘテロキシランがヘミセルロースの主要成分となっている単子葉植物では、エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）とベータ−Ｄ−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）を組み合わせて使用してキシランをキシロースに分解する場合がある。また別の脱分枝酵素は、キシラン構造体中の分枝部分に存在する他の糖成分（アラビノース、ガラクトース、マンノース）を加水分解することができる。また別の酵素はヘミセルロース性糖類（特にアラビノース）とリグニンとの間に形成される結合を加水分解することができる。
【００６１】
「エンドキシラナーゼ」あるいは「１，４−β−エンドキシラナーゼ」、「１，４−β−Ｄ−キシランキシラノヒドロラーゼ」（ＥＣ３．２．１．８）には、β−１，４−結合によって結合されたキシロース重合体を加水分解する酵素が含まれる。エンドキシラナーゼを使用してリグノセルロースのヘミセルロース成分に加えて精製キシラン物質も加水分解することができる。
【００６２】
「エキソキシラナーゼ」あるいは「β−キシロシダーゼ」、「キシラン１，４−β−キシロシダーゼ」、「１，４−β−Ｄ−キシランキシロヒドロラーゼ」、「キシロビアーゼ」「エキソ−１，４−β−キシロシダーゼ」（ＥＣ３．２．１．３７）には、キシラン重合体の非還元末端から連続的にＤ−キシロース基を加水分解する酵素が含まれる。
【００６３】
「アラビノキシラナーゼ」あるいは「グルクロノアラビノキシランエンド１，４−β−キシラナーゼ」、「フェラクサンエンドキシラナーゼ」には、一部のキシラン物質中のβ−１，４キシロシル結合を加水分解する酵素が含まれる。
【００６４】
表２ キシラナーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
【表２】
「リグニナーゼ」には、リグニン重合体構造を加水分解する、あるいは分解することができる酵素が含まれる。リグニンを分解することのできる酵素には、リグニンペルオキシダーゼ並びにマンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、フェルロイルエステラーゼ、及び当分野において、リグニン重合体を脱重合する、もしくは分解することが判明したと記載されているその他酵素が含まれる。また、ヘミセルロース性糖類（特にアラビノース）とリグニンとの間の結合を加水分解することのできる酵素も含まれる。
【００６６】
表３ リグニナーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
【表３】
「アミラーゼ」あるいは「アルファグルコシダーゼ」には、オリゴサッカライド並びにポリサッカライド中の１，４−アルファ‐グルコシド結合を加水分解する酵素が含まれる。以下のＥＣリストに基づき多数のアミラーゼについてその特性が記載されている。
【００６８】
表４ アミラーゼには以下の分類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
【表４】
「プロテアーゼ」にはペプチド結合を加水分解する酵素（ペプチダーゼ）が含まれ、さらにペプチドと糖類等（グリコペプチダーゼ）他の部分との間の結合を加水分解する酵素が含まれる。多数のプロテアーゼの特性がＥＣ３．４に従って記載されており、参考のためこれを添付する。プロテアーゼの具体的な種類には ペプシン、パパイン等のシステインプロテアーゼ、キモトリプシンを含むセリンプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、金属末端ペプチダーゼが含まれる。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質情報データベース（スイス・ジュネーブのＳｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （ＳＩＢ）及び英国ＨｉｎｘｔｏｎのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＥＢＩ）によって運営されている。）はプロテアーゼあるいはペプチダーゼを以下の種類に分類している。
セリンタイプペプチダーゼ
族 代表的な酵素
Ｓ１ キモトリプシン、トリプシン
Ｓ２ アルファ−リチックエンドペプチダーゼ
Ｓ２ グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｖ８）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
Ｓ２ プロテアーゼＤｏ（ｈｔｒＡ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
Ｓ３ トガビリン
Ｓ５ リシルエンドペプチダーゼ
Ｓ６ ＩｇＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ
Ｓ７ フラビビリン
Ｓ２９ Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３エンドペプチダーゼ
Ｓ３０ タバコエッチウイルス３５ｋＤａエンドペプチダーゼ
Ｓ３１ ウシ下痢ウイルスｐ８０エンドペプチダーゼ
Ｓ３２ ウマ動脈炎ウイルス推定エンドペプチダーゼ
Ｓ３５ リンゴ幹溝形成ウイルスセリンエンドペプチダーゼ
Ｓ４３ ポリンＤ２
Ｓ４５ ペニシリンアミドヒドロラーゼ
Ｓ８ サブチラーゼ
Ｓ８ サブチリシン
Ｓ８ ケクスシン
Ｓ８ トリペプチジルペプチダーゼＩＩ
Ｓ５３ スードモナペプシン
Ｓ９ プロリルオリゴペプチダーゼ
Ｓ９ ジペプチジルペプチダーゼＩＶ
Ｓ９ アシルアミノアシルペプチダーゼ
Ｓ１０ カルボキシペプチダーゼＣ
Ｓ１５ ラクトコッカスＸ−Ｐｒｏジペプチジルペプチダーゼ
Ｓ２８ リソゾーマルプロＸカルボキシペプチダーゼ
Ｓ３３ プロリルアミノペプチダーゼ
Ｓ１１ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａペプチダーゼ族１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄａｃＡ）
Ｓ１２ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａペプチダーゼ族２（Ｓｔｒｅｐｔ．Ｒ６１）
Ｓ１３ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａペプチダーゼ族３（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄａｃＢ）
Ｓ２４ ＬｅｘＡリプレッサー
Ｓ２６ 細菌性リーダーペプチダーゼＩ
Ｓ２７ 真核生物シグナルペプチダーゼ
Ｓ２１ アセンブリン（ヘルペスウイルスペプチダーゼ）
Ｓ１４ ＣｌｐＰエンドペプチダーゼ（Ｃｌｐ）
Ｓ４９ エンドペプチダーゼＩＶ（ｓｐｐＡ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｓ４１ Ｔａｉｌ特異的プロテアーゼ（ｐｒｃ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｓ５１ ジペプチダーゼＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｓ１６ エンドペプチダーゼＬａ（Ｌｏｎ）
Ｓ１９ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓエンドペプチダーゼ
Ｓ５４ ロンボイド（Ｒｏｍｂｏｉｄ）
スレオニンタイプペプチダーゼ
Ｔ１ 多触媒性エンドペプチダーゼ（プロテオソーム）
システインタイプペプチダーゼ
族 代表的な酵素
Ｃ１ パパイン
Ｃ２ カルパイン
Ｃ１０ ストレプトパイン
Ｃ３ ピコルナイン
Ｃ４ ポチウイルスＮＩ−ａ（４９ ｋＤａ）エンドペプチダーゼ
Ｃ５ アデノウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ１８ Ｃ型肝炎ウイルスエンドペプチダーゼ２
Ｃ２４ ＲＨＤＶ／ＦＣプロテアーゼＰ３Ｃ
Ｃ６ ポチウイルスヘルパーコンポーネント（ＨＣ）プロテアーゼ
Ｃ７ クリ胴枯れ病ウイルスｐ２９エンドペプチダーゼ
Ｃ８ クリ胴枯れ病ウイルスｐ４８エンドペプチダーゼ
Ｃ９ トガウイルスｎｓＰ２エンドペプチダーゼ
Ｃ１１ クロストリプシン
Ｃ１２ ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ族１
Ｃ１３ ヘモグロビナーゼ
Ｃ１４ カスパーゼ（ＩＣＥ）
Ｃ１５ ピログルタミルペプチダーゼＩ
Ｃ１６ マウス肝炎ウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ１９ ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ族２
Ｃ２１ カブ黄斑モザイクウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ２５ ギンギパインＲ
Ｃ２６ ガンマグルタミルヒドロラーゼ
Ｃ３７ サウサンプトンウイルスペプチダーゼ
Ｃ４０ ジペプチジルペプチダーゼＶＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｃ４８ ＳＵＭＯプロテアーゼ
Ｃ５２ ＣＡＡＸプレニルプロテアーゼ２
アスパラギン酸タイプペプチダーゼ
族 代表的な酵素
Ａ１ ペプシン
Ａ２ レトロペプシン
Ａ３ カリフラワーモザイクウイルスペプチダーゼ
Ａ９ スプマレトロウイルスエンドペプチダーゼ
Ａ１１ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａトランスポゾンコピアエンドペプチダーゼ
Ａ６ ノダウイルスエンドペプチダーゼ
Ａ８ 細菌性リーダーペプチダーゼＩＩ
Ａ２４ タイプＩＶプレピリンリーダーペプチダーゼ
Ａ２６ オンプチン（Ｏｍｐｔｉｎ）
Ａ４ サイタリドペプシン（Ｓｃｙｔａｌｉｄｏｐｅｐｓｉｎ）
Ａ５ サーモプシン
金属ペプチダーゼ
族 代表的な酵素
Ｍ１ 膜アラニンアミノペプチダーゼ
Ｍ２ ペプチジルジペプチダーゼＡ
Ｍ３ チメットオリゴペプチダーゼ
Ｍ４ サーモリシン
Ｍ５ マイコリシン
Ｍ６ 免疫阻害因子Ａ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｍ７ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ小型中性プロテアーゼ
Ｍ８ リーシュマノリシン（Ｌｅｉｓｈｍａｎｏｌｙｓｉｎ）
Ｍ９ 細菌性コラゲナーゼ
Ｍ１０ マトリキシン
Ｍ１０ セラリシン
Ｍ１０ フラジリシン（Ｆｒａｇｉｌｙｓｉｎ）
Ｍ１１ オートリシン（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）
Ｍ１２ アスタシン
Ｍ１２ レプロリシン
Ｍ１３ ネプリリシン
Ｍ２６ ＩｇＡ特異的金属エンドペプチダーゼ
Ｍ２７ テントキシシリン（Ｔｅｎｔｏｘｉｌｙｓｉｎ）
Ｍ３０ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ中性プロテアーゼ
Ｍ３２ カルボキシペプチダーゼＴａｑ
Ｍ３４ 炭素菌致死因子
Ｍ３５ デューテロリシン
Ｍ３６ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓエラスチン溶解金属エンドペプチダーゼ
Ｍ３７ リソスタフィン
Ｍ４１ 細胞分裂タンパク質ｆｔｓＨ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｍ４６ 妊娠関連プラズマタンパク質Ａ
Ｍ４８ ＣＡＡＸプレニルプロテアーゼ
Ｍ４９ ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ
その他モチーフＨＥＸＸＨを持たないもの
Ｍ１４ カルボキシペプチダーゼＡ
Ｍ１４ カルボキシペプチダーゼＨ
Ｍ１５ 亜鉛Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ
Ｍ４５ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａジペプチダーゼ
Ｍ１６ ピトリリシン
Ｍ１６ ミトコンドリアプロセッシングペプチダーゼ
Ｍ４４ ワクシニアウイルス型金属エンドペプチダーゼ
Ｍ１７ ロイシンアミノペプチダーゼ
Ｍ２４ １型メチオニルアミノペプチダーゼ
Ｍ２４ Ｘ−Ｐｒｏジペプチダーゼ
Ｍ２４ ２型メチオニルアミノペプチダーゼ
Ｍ１８ 酵母アミノペプチダーゼＩ
Ｍ２０ グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ
Ｍ２０ Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ
Ｍ２５ Ｘ−Ｈｉｓジペプチダーゼ
Ｍ２８ Ｖｉｂｒｏロイシンアミノペプチダーゼ
Ｍ２８ アミノペプチダーゼＹ
Ｍ２８ アミノペプチダーゼｉａｐ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｍ４０ サルホロバスカルボキシペプチダーゼ
Ｍ４２ グルタミルアミノペプチダーゼ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）
Ｍ３８ Ｅ．ｃｏｌｉベータアスパルチルペプチダーゼ
Ｍ２２ Ｏ−シアログリコプロテインエンドペプチダーゼ
Ｍ５２ 加水分解酵素突然変異ペプチド
Ｍ５０ ＳＲＥＢＰサイト２プロテアーゼ
Ｍ５０ 胞子形成因子ＩＶＢ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
Ｍ１９ 膜ジペプチダーゼ
Ｍ２３ ベータ溶解エンドペプチダーゼ
Ｍ２９ 好熱性細菌アミノペプチダーゼ
触媒機構が不明のペプチダーゼ
Ｕ３ 胞子エンドペプチダーゼｇｐｒ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｕ４ 胞子形成シグマＥ因子プロセッシングペプチダーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｕ６ ムレインエンドペプチダーゼ（ｍｅｐＡ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｕ８ バクテリオファージムレインエンドペプチダーゼ
Ｕ９ プロヘッドエンドペプチダーゼ（Ｔ４ファージ）
Ｕ２２ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａトランスポゾン２９７エンドペプチダーゼ
Ｕ２４ トウモロコシトランスポゾンｂｓ１エンドペプチダーゼ
Ｕ２６ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ
Ｕ２９ 脳脊髄炎ウイルスエンドペプチダーゼ２Ａ
Ｕ３０ ツユクサ黄斑ウイルスプロテイナーゼ
Ｕ３１ ヒトコロナウイルスプロテアーゼ
Ｕ３２ ポルフィロモナスコラゲナーゼ
Ｕ３３ イネｔｕｎｇｒｏ桿状ウイルスエンドペプチダーゼ
Ｕ３４ ラクトコッカスジペプチダーゼＡ
「リパーゼ」には、ホスホグリセリド（ｐｈｏｓｐｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、リポタンパク質、ジアシルグリセロール、その他を含む、脂質並びに脂肪酸、アシルグリセライドを加水分解する酵素が含まれる。植物では、脂質は水分減少及び病原菌感染を制限するための構造的成分として利用されている。こうした脂質には、脂肪酸から派生したワックスに加えクチン並びにスベリンが含まれる。ＥＣリストに従って、多数のリパーゼの特性が記載されている。
【００７０】
表５ リパーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
【表５】
「グルクロニダーゼ」にはベータグルクロニシドを加水分解してアルコールを生成する反応を触媒する酵素が含まれる。以下のＥＣリストに従って多数のグルクロニダーの特性が記載されている。
【００７２】
表６ グルクロニダーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
【表６】
酵素組成
「リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素」あるいは「一つ以上の酵素」とは、「処理反応」後にバイオマス中の糖類の遊離を増進するあるいは上昇させるあらゆる酵素もしくは酵素混合物と定義される。これには、反応の際にバイオマスに接触させると次の酵素の活性を上昇させる酵素を含むことができる。「酵素」を用いた処理を「酵素処理」と呼ぶ。関係する活性を持つ酵素には、セルラーゼ並びにキシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、グルクロニダーゼが含まれるがこれらに限定されない。これらの酵素の内多数のものはＥＣ３．２．１族の典型的酵素であり、即ち、この族内の他の酵素は本発明に利用できる可能性がある。２つ以上の酵素を組み合わせて「酵素混合物」を作り、処理の過程においてリグノセルロースを加水分解することもできる。酵素混合物は以下から入手した酵素から構成することができる。（１）商業的供給者、（２）酵素を発現するクローニングした遺伝子、（３）原材料自体を含むブロスに加え、半固相あるいは固相培地由来のブロスを含めた、ブロス複合物（例えば培地中で微生物株が増殖してできたもので、その株は倍地中にタンパク質並びに酵素を分泌している。）。（４）（３）と同様に増殖した微生物株の細胞溶解物、（５）リグノセルロースを加水分解することのできる酵素を発現する植物材料。
【００７４】
あらゆる組み合わせの酵素を使用することができると認知されている。酵素は単独であるいは、少なくともセルラーゼ、少なくともキシラナーゼ、少なくともリグニナーゼ、少なくともアミラーゼ、少なくともプロテアーゼ、少なくてもリパーゼ、少なくともグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ、少なくともセルラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ、少なくともキシラナーゼ及びアミラーゼ、少なくともキシラナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリパーゼ、少なくともキシラナーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともリグニナーゼ及びアミラーゼ、少なくともリグニナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともリグニナーゼ及びリパーゼ、少なくともリグニナーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラーゼ及びリグニナーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ、少なくともリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキリラナーゼ及びリグニナーゼ及びグルクロニナーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びリパーゼ及グルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼその他の混合物として使用することができる。上記の通り、補助混合物はこれらの酵素族の各々、あるいは一酵素族の内の数種類（２つ以上のキシラナーゼ等）、あるいはこれらの酵素族内の酵素のあらゆる組み合わせ（プロテアーゼとエキソセルラーゼとエンドキシラナーゼ、あるいはリグニナーゼとエンドキシラナーゼとリパーゼ等）から成ることができると理解されている。
【００７５】
酵素は化学処理と同時に、あるいは化学処理の後で、基質あるいはバイオマスと反応させることもできる。同様に複数の酵素を使用する場合、酵素は同時にあるいは順次加えることができる。酵素は、粗製酵素混合物あるいは準精製酵素混合物、精製酵素混合物として加えることができる。酵素基質混合物の温度およびｐＨは、酵素結合体の活性が上昇するように変えることができる。ここでは酵素を混合物として議論してきたが、温度、ｐＨ及びあその他条件を酵素活性が上昇するように変更して、酵素を順次加えることもできる。別の方法として、酵素混合物に合う最適ｐＨ及び最適温度を決定することもできる。
【００７６】
酵素は軽度の条件下で基質と反応させる。「軽度の条件」によって、現在バイオリアクターを用いたバイオマス変換のために利用されている極端な温度、あるいは極端な酸処理を含まない条件が意味される。例えば酵素は約３５℃から約６５℃にて、ｐＨが中性の低イオン強度から中イオン強度の緩衝液中でインキュベートすることができる。「中イオン強度」によって、緩衝液のイオン濃度がどの一イオン成分についても約２００ミリモル（ｍＭ）以下であることが意味される。このような条件下で酵素混合物をインキュベーションすることによって、リグノセルロース中の糖が十分量遊離させる。十分量あるいは有意パーセンテージによって、利用可能な糖の少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％並びにそれ以上が意味される。
【００７７】
酵素の適用
本発明を実践する際に使用する酵素あるいは酵素群は、微生物もしくは酵母、真菌、細菌、植物によって体外産生させ、単離してリグノセルロース質原料に加えることができる。別の方法として、酵素を産生する生物体を原料に加えることもできる。本手法では、酵素を産生する植物をリグノセルロース質原料として使用して、リグノセルロース質原料に加えることができる。また、同時糖化発酵によって発酵生成物を産生する発酵生物内で酵素を作り出すこともできる。
【００７８】
セルロース並びにヘミセルロースを分解する酵素は自然界に広く存在し、これによってセルロース並びにヘミセルロースを産生する生物は、毎年産生される４００億トン以上のセルロースバイオマスを分解することができる。セルロース分解の工程は化学過程であり、三種類もの異なる活性をこれに含むことができる。：１）エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、内部からセルロース重合体を切断する。２）セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、重合体の非還元末端にてセルロース重合体を攻撃する。３）ベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）、二量体であるセロビオースを切断してグルコース単量体とする。また他の小分子セロデキストリンを切断してグルコース単量体とする。こうした活性を伴ってセルロースはグルコースに変換される。
【００７９】
同様に、ヘミセルロースを酵素によって単糖類並びにオリゴサッカライドに変換することができる。単子葉植物では、ヘテロシキランがヘミセルロースの主要成分となっており、エンド−１，４−ベータ−キシラーゼ（ＥＣ３．２．１．８）とベータ−Ｄ−キシロシダーゼを組み合わせて使用し、ヘミセルロースを分解してキシロースとすることができる。ベータグルカン混合物はベータ（１，３），（１，４）グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．７３）で加水分解される。
【００８０】
バイオマス変換に影響する酵素は、広範囲の生物にて自然界で産生される。一般的な供給源は、セルロース並びにキシラーゼに対応するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、及びリグニナーゼに対応する白腐れ真菌を含む微生物である。セルラーゼ並びにセロビオヒドロラーゼ、グルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、リグニナーゼを産生する生物は多数あると記載されている。しかしながら、これらの酵素のうち大部分のものは植物バイオマス、特にトウモロコシ茎葉を分解する能力については試験されていない。即ち、本発明の方法は、トウモロコシ茎葉並びにその他のリグノセルロース質物質を加水分解する際の、酵素使用法の試験に使用することができる。
【００８１】
前に記載したように、酵素あるいは酵素組み合わせを、細菌もしくは酵母、真菌、植物内で発現させることができる。酵素発現のための方法は当分野にて周知されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ： ５，５６３，０５５； ４，９４５，０５０； ５，８８６，２４４； ５，７３６，３６９； ５，９８１，８３５並びに当分野において周知されている他のものを参照する。参考のためこれら全てをこの明細に添付する。
【００８２】
本発明の一側面では、酵素は形質転換植物にて産生される。即ち、リグノセルロースから成る植物材料は、リグノセルロースを加水分解できる一つ以上の酵素を前もって包含することができる。化学薬剤を添加する前に、酵素がリグノセルロースを加水分解できるような条件下でそのリグノセルロースをインキュベートすることもできる。さらにリグノセルロースは、化学薬剤を添加する前あるいはあらゆる酵素処理の前に、ｐＨの改変あるいは洗浄等の処理を受けることもできる。本手法では、植物はバイオマスを単糖類あるいはオリゴサッカライドに変換するのに必要な、あるいはこれに寄与する酵素を発現する。植物が生長する間、当該酵素あるいは酵素組み合わせは植物の加水分解を防ぐために封鎖あるいは不活性化されている。複数の酵素が共同的活性を呈する場合には、リグノセルロース質原料となる植物内で一つあるいは複数の酵素が産生され、別の酵素が細菌もしくは酵母、真菌、別の植物内で産生され、次にこの異なる酵素源同士が原料と共に混合されて最終的な酵素協働混合物となる場合もある。
【００８３】
バイオマス基質定義
「基質」あるいは「リグノセルロース」、「バイオマス」によって、セルロース及びヘミセルロース、リグニン、タンパク質、灰、澱粉並びに糖類等の炭水化物を含有する物質が意味される。構成成分の単糖類には、グルコース並びにキシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースが含まれる。「バイオマス」にはバージンバイオマス且つ（あるいは）農業バイオマス並びに産業有機物、建築解体残骸、自治体固形ゴミ、紙ゴミ、庭ゴミ等の廃棄物系バイオマスが含まれる。バイオマスの一般的な形態には木、並びに低木及び草、小麦、麦わら、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシ皮、粒から伸びる繊維を含めたトウモロコシ粒、トウモロコシ等を製粉することによって生成される製品及びその副産物（湿式製粉並びに乾式製粉を含む。）、加えて自治体固形ゴミ、紙ゴミ、庭ゴミが含まれる。「混合バイオマス」はバージンバイオマスと使用済みバイオマスとのあらゆる混合物あるいは配合物であり、望ましくは重量にして５〜９５％の使用済みバイオマスを有する。「農業バイオマス」には枝並びに潅木、籐類、トウモロコシ及びトウモロコシ皮、エネルギー作物、森林、果実、花、穀類、草、草本作物、葉、樹皮、針状葉、丸太、根、苗、短期輪作木質作物、低木、スイッチグラス、木、野菜、ブドウ木、硬質・軟質木材（有害物質を有する木材を含まない。）が含まれる。さらに、農業バイオマスには耕作並びに森林作業を含む農業作業によって生じる有機性廃棄物が含まれ、特に森林木性廃棄物が含まれる。農業バイオマスは任意の前記単独物あるいはあらゆる組み合わせのこれらの混合物であることができる。
【００８４】
トウモロコシ並びに穀類、果実、野菜等、澱粉もしくは糖、タンパク質に富むバイオマスは、通常食物として消費される。反対に、セルロース並びにヘミセルロース、リグニンに富むバイオマスは消化されにくく、主に木製品並びに紙製品、燃料として利用され、典型的には廃棄される。一般に、基質となるのはリグノセルロース含量が高いものであり、トウモロコシ茎葉並びにトウモロコシ繊維、ディスティラーの乾燥粒、稲わら、灰、サトウキビバガス、小麦、オート麦、大麦麦芽並びにその他農業バイオマス、スイッチグラス、森林廃棄物、ポプラ木材片、マツ木材片、おが屑、庭ゴミ、その他が含まれる。また、基質のあらゆる組み合わせが含まれる。
【００８５】
バイオマスは農地から集められたものとして使用される場合も、例えば製粉、粉挽き、細断等、加工される場合もありうる。さらにバイオマスを使用前に、例えば加熱あるいは乾燥、冷凍、サイロへの貯蔵（高湿度状態である期間貯蔵すること。）等、化学的もしくは物理的手段によって処理することもできる。当該処理には俵・覆いのない窪地での貯蔵に加え、微生物数あるいは微生物量、ｐＨ、水分量等の性状を改変するために作製された反応器での貯蔵が含まれる。
【００８６】
表７ 一般にバイオマスと呼ばれる物質の例
【００８７】
【表７】
「遊離する」あるいは「加水分解」によって、リグノセルロース質基質複合体あるいはバイオマスの、単糖類あるいはオリゴサッカライドへの転換が意味される。
【００８８】
「転換」には、バイオマスあるいは配合バイオマス、あるいはその両方からエタノールもしくはエタノールと副産物とを産生する、あらゆる生物学的、あるいは（且つ）化学的、あるいは（且つ）生化学的活性が含まれる。当該転換には、当該バイオマスあるいは配合バイオマス、あるいはその両方の、加水分解並びに発酵、同時糖化発酵（ＳＳＦ）が含まれる。望ましくは転換にはこの明細で定義される発酵原料及び加水分解材料の使用が含まれる。
【００８９】
「トウモロコシ茎葉」にはトウモロコシ植物体の収穫によって生じる農業残余物が含まれる。茎葉はトウモロコシ耕地からトウモロコシ粒を収穫することによって生じ、典型的にはコンバイン収穫機によって生じる。トウモロコシ茎葉には、トウモロコシの茎並びに殻、根、トウモロコシ粒、土等のその他物質が多様な割合で含まれる。
【００９０】
「トウモロコシ繊維」はトウモロコシ粒の一部分であり、典型的には湿式製粉あるいは他のトウモロコシ粒加工によって生じる。トウモロコシ繊維部分は収穫された粒の繊維部分であり、澱粉及び油が抽出された後に残るものである。トウモロコシ繊維は典型的にはヘミセルロース及びセルロース、残余澱粉、タンパク質、リグニンが含まれる。
【００９１】
「エタノール」にはエチルアルコールあるいはエチルアルコールと水との混合物が含まれる。
【００９２】
「発酵産物」にはエタノール並びに乳酸、クエン酸、ブタノール、イソプロパノール、加えてこれらの誘導体が含まれる。
【００９３】
「ディスティラーの乾燥粒」はトウモロコシの澱粉分画がエタノール発酵のために分離された後の乾燥残余物である。この物質は典型的には繊維及び残余澱粉、タンパク質、油が含まれる。
【００９４】
「サトウキビバガス」は、サトウキビ加工によるリグノセルロース性生成物である。バガスは典型的には約６５％の炭水化物をセルロースあるいはヘミセルロースの形で含有する。
【００９５】
「麦芽」リグノセルロースは、醸造業が糖源として用いる大麦麦芽を意味する。生成される使用済み「麦芽」は、セルロース及び繊維、タンパク質を豊富に含む。
【実施例】
【００９６】
以下の実施例は説明のために提供するものであり、制限のためのものではない。
【００９７】
実験
実施例１ グルコース及びキシロース標準曲線
グルコース及びキシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノースの標準品を、０％〜０．１２％の範囲の濃度で調製した。変法ジニトロサリシリック酸法（ＤＮＳ）によって５４０ ｎｍで検出される吸光変化を得た。各糖標準物に対する線状曲線一致分析によって、各糖単量体に対するＤＮＳ定量法が正確な検出法であることが証明される（デーダは示していない。）。
【００９８】
実施例２ 過酸化水素処理後にセルロース処理を行うと単糖類が遊離する。
【００９９】
１０ ｍＬの水中で（ｐＨ ５．０に調整）、過酸化水素（２００ ｍＭ）を２．０ ｇの茎葉と反応させた。コントロール茎葉は処理を行わなかった。８０℃で２４時間インキュベーションした後、各試料の還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した（例１）。次にＴ． ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ（２５ ｍｇ）由来のセルラーゼを双方の試料に加え、６５℃で２４時間インキュベーションを行った。ＤＮＳ分析によって還元糖を測定した。結果を表８に示す。過酸化水素処理によって酵素単独での処理よりも多くの糖が酵素処理後に遊離された。
【０１００】
表８ トウモロコシ茎葉から可溶化された還元糖
【０１０１】
【表８】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による次の分析のために部分試料を分離し、１：２５０に水で稀釈して０．４５μｍのフィルターを使用して濾過した。次に、陰イオン交換ＨＰＬＣカラムを使用して可溶化した糖を塩基性ｐＨで分離した。検出には電気化学検出器を使用し、パルス電流測定モードで実行した。外来の糖標準物（グルコース、キシロース）を使用してグルコース及びキシロースのピークを同定した。Ｈ２Ｏ２とセルラーゼによる処理後に茎葉から可溶化された糖類のクロマトグラムを図１に示す。
【０１０２】
実施例３ 過酸化水素処理によってトウモロコシ茎葉の酵素加水分解が増進する。
【０１０３】
過酸化水素（最終濃度０〜６０ ｍＭ）を酢酸ナトリウム緩衝液（１２５ ｍＭ，ｐＨ ５．０）中で０．２ ｇの茎葉と反応させ、撹拌しながら５０℃でインキュベートした。２４時間後、還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した。次にＴｒｉｇｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ１０ユニットとＴｒｉｇｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ由来のキシラナーゼ１０ユニットを加え、５０℃で２４時間インキュベーションを続けた。各試料からさらに部分試料を分離し、還元糖を定量した。過酸化水素及び酵素処理後の還元糖含量を図２に示す。過酸化水素濃度を上昇させると遊離する還元糖量が増加した。
【０１０４】
実施例４ 処理後２４時間以内に過酸化水素は分解する。
【０１０５】
過酸化水素（０．１３％）を酢酸ナトリウム緩衝液（１２５ ｍＭ，ｐＨ ５．０）中で、５０℃で撹拌しながら０．２ ｇの茎葉と反応させた。過酸化水素は以下のように検出した（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ （１９８６） Ａｐｐ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２：８８０−８８５）。各試料からの複数の部分試料（１００μＬ）を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、４９μＬの０．０６％フェノールレッド及び１μＬの１．５ ｍｇ／ｍＬホースラディッシュペルオキシダーゼと混合して５分間インキュベートした。次に試料を７５μＬの４Ｎ ＮａＯＨと混合して６１０ ｎｍで定量し、過酸化水素標準物と比較した。０から２４時間の時点における過酸化水素と還元糖（ＤＮＳ分析）を測定した。これらのデータを図３に示している。茎葉を加えないコントロール試料ではＤＮＳ分析及び過酸化物分析シグナル各々に変化はなかった（データは示していない。）２４時間までに、過酸化水素濃度は０となった（図３）。これらの結果は処理の後に残る化学残留物が最小であることを示している。
【０１０６】
実施例５ 多数のリグノセルロース物質から糖を遊離する。
【０１０７】
トウモロコシ茎葉もしくはトウモロコシ繊維、ディスティラーの乾燥粒、大麦麦芽、サトウキビバガスから構成される１グラムのリグノセルロース物質を１０ ｍＬの水中で過酸化水素（１００ ｍＭ）と混合し、８０℃で２４時間インキュベートした。未処理反応物には過酸化水素を加えていない。インキュベーションの最後に、１００ ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ ５．０）を加えてｐＨを調整し、２５ ｍｇのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉセルラーゼを加えてその溶液を６５℃で２４時間インキュベートした。未処理反応物にはセルラーゼを加えていない。加水分解物の還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した。これらの実験の結果を表９に示す。これらの結果は、この処理によって多数のリグノセルロース質物質から糖類を遊離することができることを示している。
【０１０８】
表９ リグノセルロース物質からの糖遊離
【０１０９】
【表９】
実施例６ トウモロコシ茎葉から発酵原料を生成する。
【０１１０】
トウモロコシ茎葉（２．０ ｇ）を１０ ｍＬの水中で過酸化水素（０．１％）と混合した。８０℃で２４時間インキュベートした後、ｐＨを５．０に調整してＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼを５０ ｍｇ加え、６５℃で２４時間インキュベートした。次に加水分解物の還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した。次に、加水分解物をｐＨ ７．０に調整し、濾過滅菌して最終濃度５％の糖を産生するよう、炭素を含まない最小増殖培地（Ｍ６３）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１）に加えた。コントロール増殖培地は糖を含まない培地に５％の糖を加えて調製した。細菌細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を各培地に加えて振盪しながら３７℃でインキュベートし、各培地の６００ ｎｍの吸光度を測定することによって４８時間、細菌の増殖をモニターした。４８時間時点でのこれらのデータを表１０に示す。本方法で得られた加水分解物によってＥ． ｃｏｌｉは高濃度に増殖した。結果は、この方法から生成された加水分解物によって、グルコースの場合よりもより多量の細菌増殖が可能となること示している。加水分解物は稀釈しない状態であってもＥ． ｃｏｌｉに有害なものではなかった。
【０１１１】
表１０ トウモロコシ茎葉加水分解物による発酵増殖
【０１１２】
【表１０】
実施例７ 加水分解物は細菌の増殖を促す発酵原料である。
【０１１３】
過酸化水素とセルラーゼとの処理（例６に記載）によって生成された加水分解物を、最終糖濃度０．０％から１．０％の糖類を産生するよう、炭素を含まない最小増殖培地（Ｍ６３）に稀釈した。コントロール培地は同じ最終糖濃度のグルコース及びキシロース（割合は６３：３７）を加えて調製した。細菌細胞（Ｅｓｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１ ＭＲＦ’）を各培地に加えて振盪しながら３７℃で培養し、４８時間時点での増殖を６００ ｎｍの吸光度によって定量した。細菌の増殖性はグルコース及びキシロースを加えて調製したコントロール培地よりも、加水分解物培地の方が高かった（図４を参照）。
【０１１４】
実施例８ 界面活性剤処理によって、過酸化水素処理後にセルラーゼを処理するトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１１５】
トウモロコシ茎葉（２．０ ｇ）を１０ ｍＬの水中で過酸化水素（１％）と混合した。８０℃で２４時間インキュベートした後、ｐＨを５．０に調整した。これにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ５０ ｍｇをトリトンＸ−１００（２％ ｖ／ｖ）と供に加えた。別に、トウモロコシ茎葉（２．０ ｇ）を１０ ｍＬの水中で過酸化水素（１％）と混合して８０℃で２４時間インキュベートした後、ｐＨを５．０に調整した。これにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ５０ ｍｇをツイン２０（３％ ｖ／ｖ）と供に加えた。界面活性剤を加えないコントロール（セルラーゼのみ）を双方の実験ともインキュベートした。反応物は４０℃で９６時間インキュベートした。ＤＮＳ分析を用いて還元糖含量を測定した。この分析の結果は、ツイン２０とトリトンＸ−１００の双方ともトウモロコシ茎葉からの糖の遊離を促進することを示している。データを表１１にまとめた。
【０１１６】
表１１ 茎葉加水分解に対する界面活性剤の影響
【０１１７】
【表１１】
実施例９ 酸化剤がリグノセルロース質物質を滅菌する。
【０１１８】
トウモロコシ茎葉（１ ｇ）を１０ ｍＬの滅菌水に懸濁して一方をオートクレーブ処理し、もう一方はオートクレーブ処理をしなかった。予期したとおり、オートクレーブによって実質的に全ての微生物が死に、１ ｍｌ当たり１００コロニー形成ユニット以下となった。反対に、オートクレーブ処理しなかった試料には１ ｍＬ当たり〜２０、０００コロニー形成ユニットが含まれていた。オートクレーブ処理しなかった試料は０．１％の過酸化水素を５０℃で２４時間処理した。当分野で周知されているように連続稀釈を行い、栄養ブロスプレートに接種した。プレートを３０℃で２４時間培養し、その後コロニー形成ユニットを計数した。未処理のコントロールと比較して、過酸化水素処理によって実質的に微生物含量が減ることが認められた（表１２）。
【０１１９】
表１２ トウモロコシ茎葉の微生物含量に対する過酸化水素の影響
【０１２０】
【表１２】
実施例１０ バイオマスを次亜塩素酸ナトリウムで処理することによって、トウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１２１】
トウモロコシ茎葉（０．２ ｇ）を９ ｍＬの滅菌水（ｐＨ ５．２）と１ ｍＬの次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素１０〜１３％、Ｓｉｇｍａ）とに懸濁した。この前処理は８０℃で３００ ｒｐｍの振盪培養器内で２４時間行った。前処理の後ｐＨを５．２〜５．４に調整し、試料にスペザイムＣＰ（Ｓｐｅｚｙｍｅ ＣＰ；０．３ ｍＬ）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え４０℃、３００ ｒｐｍで２４時間インキュベートした。２４時間後に上清部分試料を回収し、還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した（λｍａｘ＝５４０ ｎｍ）。全ての試料を二通りにして操作した。次亜塩素酸ナトリウム処理によって、トウモロコシ茎葉の有意な量の加水分解物が産生した（表１３）。１０％次亜塩素酸ナトリウムとスペザイムとの処理によっては、スペザイム単独での処理よりも多量の茎葉加水分解物が生じた。
【０１２２】
表１３ 茎葉加水分解に対する次亜塩素酸ナトリウムの影響
【０１２３】
【表１３】
ＨＰＬＣによって糖類のさらに詳細な定量を行った。処理済物質のＨＰＬＣクロマトグラム分析によって１０％ＮａＯＣｌ（２４時間）を用いた前処理、次いで０．３ ｍＬのスペザイム（２４時間）を使用した後に生成された糖類を同定する。注入前に試料を１：５０に稀釈した。グルコース及びアラビノース、ガラクトース、マンノースを含むピーク（６．３分）はキシロースを含むピーク（６．８分）と分かれていた。可溶化された有効糖類のパーセンテージを、各ピーク面積を統合することによって算出した（表１４）。このように、次亜塩素酸ナトリウムで処理することによって、糖類がリグノセルロースから高い割合で遊離した。
【０１２４】
表１４ 次亜塩素酸ナトリウム及びスペザイムでの処理後に生成された糖
【０１２５】
【表１４】
実施例１１ 非常に低い濃度のセルラーゼで、有意な量のトウモロコシ茎葉加水分解物が得られる。
【０１２６】
ＮａＯＣｌで前処理した茎葉試料の一方を０．３ ｍＬのスペザイム、もう一方を０．０３ ｍＬスペザイムと反応させた。０．３ ｍＬスペザイムを加えた試料では全糖類の８４％が加水分解され、０．０３ ｍＬスペザイムを加えた試料では７９％が加水分解された。ＮａＯＣｌを加えずに０．３ ｍＬのスペザイムを加えたコントロール試料では４２％が加水分解された（表１５を参照。）。
【０１２７】
本実験はＮａＯＣｌ保存液の１０％溶液で前処理し、その後セルラーゼ（本件ではスペザイム）処理することによって、リグノセルロースが有意な量加水分解されて糖となることを示している。
【０１２８】
表１５ 次亜塩素酸ナトリウム前処理後、低量の酵素が加水分解に与える影響。
【０１２９】
【表１５】
実施例１２ 次亜塩素酸カルシウム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１３０】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を次亜塩素酸カルシウム（有効塩素１％）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調製してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で２４時間インキュベートした。糖の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。次亜塩素酸カルシウム処理は、スペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表１６）。
【０１３１】
表１６ 茎葉加水分解に対する次亜塩素酸カルシウムの影響
【０１３２】
【表１６】
実施例１３ 尿素過酸化水素塩はトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１３３】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を５％尿素過酸化水素塩（ＣＡＳ＃１２４−４３−６）に、８０℃で２４時間接触させた。この茎葉を洗浄して化学薬剤を稀釈し、ｐＨを調整してｐＨ５．２とした。さらに０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物を４０℃で４８時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。尿素過酸化水素塩処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表１７）。
【０１３４】
表１７ 茎葉加水分解に対する尿素過酸化水素塩の影響
【０１３５】
【表１７】
実施例１４ Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシドはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１３６】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を７５％のＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（ＮＭＭＯ）（ＣＡＳ＃７５２９−２２−８）に、８０℃で２４時間接触させた。次にこのＮＭＭＯを稀釈し、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で４８時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。ＮＭＭＯ処理はスペザイム単独での処理によって遊離される量を超えて糖を遊離させることが認められた（表１８）。
【０１３７】
表１８ 茎葉加水分解に対するＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシドの影響
【０１３８】
【表１８】
実施例１５ 過炭酸ナトリウムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１３９】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を２．５％の過炭酸ナトリウム（ＣＡＳ＃１５６３０−８９−４）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で２４時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。過炭酸ナトリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表１９）。
【０１４０】
表１９ 茎葉加水分解に対する過炭酸ナトリウムの影響
【０１４１】
【表１９】
実施例１６ 過硫酸カリウムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１４２】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を１％の過硫酸カリウム（ＣＡＳ＃７７２７−２１−１）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で２４時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。過硫酸カリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２０）。
【０１４３】
表２０ 茎葉加水分解に対する過硫酸カリウムの影響
【０１４４】
【表２０】
実施例１７ ペルオキシ酢酸処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１４５】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）をペルオキシ酢酸（最終濃度１％）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。ペルオキシ酢酸処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２１）。
【０１４６】
表２１ 茎葉加水分解に対するペルオキシ酢酸の影響
【０１４７】
【表２１】
実施例１８ 超酸化カリウム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１４８】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を超酸化カリウム（最終濃度０．５％）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。超酸化カリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２２）。
【０１４９】
表２２ 茎葉加水分解に対する超酸化カリウムの影響
【０１５０】
【表２２】
実施例１９ 炭酸ナトリウム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１５１】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を炭酸ナトリウム（最終濃度０．６７％）に接触させてｐＨ１０．０の混合物を作り、これを８０℃で２４時間インキュベートした。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。炭酸ナトリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２３）。
【０１５２】
表２３ 茎葉加水分解に対する炭酸ナトリウムの影響
【０１５３】
【表２３】
実施例２０ 水酸化カリウム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１５４】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を水酸化カリウム（最終濃度７５ ｍＭ）に接触させてｐＨ１２．３の混合物を作り、８０℃で２４時間インキュベートした。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。水酸化カリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２４）。
【０１５５】
表２４ 茎葉加水分解に対する水酸化カリウムの影響
【０１５６】
【表２４】
実施例２１ 過炭酸ナトリウム処理によってトウモロコシ繊維及びディスティラーの乾燥粒、サトウキビバガス、使用済み大麦麦芽の加水分解が増進する。
【０１５７】
トウモロコシ繊維及びディスティラーの乾燥粒、サトウキビバガス、使用済み大麦麦芽（１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を、それぞれ過炭酸ナトリウム（最終濃度１．０％）に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。過炭酸ナトリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２５）。
【０１５８】
表２５ 様々なバイオマス原料に対する過炭酸ナトリウム処理の影響
【０１５９】
【表２５】
実施例２２ リサイクル過炭酸ナトリウムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１６０】
トウモロコシ茎葉（２００ ｍＬの最終反応物中に２０ｇ）を過炭酸ナトリウム（最終濃度５．０％）に８０℃で２４時間接触させた。上清を除去し、糖類の有無をＤＮＳ分析によって測定した。糖濃度は１％未満であった。この上清（１０ ｍＬ）に新たなトウモロコシ茎葉（１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を８０℃で２４時間接触させた。別の反応として、新たに準備した過炭酸ナトリウム（最終濃度５．０％）に新たなトウモロコシ茎葉（１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を８０℃で２４時間接触させた。各試料のｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。リサイクル過炭酸ナトリウム溶液処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２６）。
【０１６１】
表２６ リサイクル過炭酸ナトリウムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１６２】
【表２６】
実施例２３ 複合処理によって、リグノセルロースからさらに糖が遊離する。
【０１６３】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を０．２％の過酸化水素に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で７２時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定し、各試料を洗浄して可溶性糖類を除去した。次に、過酸化水素（０．２％）もしくは尿素過酸化水素塩（５％）、次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）、次亜塩素酸カルシウム（有効塩素１％）、ＮＭＭＯ（７５％）を各試料に加え、８０℃で２４時間インキュベートした。化学薬剤を加えないコントロールも調製した。化学薬剤の稀釈（ＮＭＭＯ）もしくはｐＨ５．２となるようｐＨの調整のみ（過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム、尿素過酸化水素塩、薬剤無し）を行った後、０．３ ｍＬのスペザイムを加えて反応物を４０℃で７２時間インキュベートした。二次スペザイム処理は、これに先立って二次化学処理を行う場合に、糖の遊離を増進することが認められた（表２７）。
【０１６４】
表２７ 茎葉の加水分解に対する複合処理の効果
【０１６５】
【表２７】
実施例２４ 過酸化水素処理によって乳酸産生を支持するリグノセルロース及び加水分解物が生じる。
【０１６６】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉）を０．２％の過酸化水素に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で７２時間インキュベートした。加水分解物から残余固形物を分離し、洗浄して水中に懸濁し、乳酸産生細菌を含むと周知されている市販のサイレージ用接種物（Ｂｉｏｔａｌ Ｓｉｌａｇｅ ＩＩ Ｉｎｏｃｕｌａｎｔ，Ｂｉｏｔａｌ Ｉｎｃ．）を０．０１ ｇ加えた。３７℃で２４時間発酵を行い、細菌の増殖を顕微鏡的に確認した。同様に、その後の各処理で生じた加水分解物を調整してｐＨ ７．０とし、濾過滅菌して炭素を含まない最小塩培地（強化最小培地（ＥＭＭ））に混合した。ＥＭＭにはＡ溶液（９００ ｍｌ中：２ ｇ ＮａＮＯ３，１．０ ｍｌ ０．８ Ｍ ＭｇＳＯ４，１．０ ｍｌ ０．１ Ｍ ＣａＣｌ２，１．０ ｍｌ 微量元素溶液（１０００倍容液１００ ｍｌ中：０．１ ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ ｍｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，１．０ ｍｇ Ｈ３ＢＯ３， １．０ ｍｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，７．０ ｍｇ Ｚｎ ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．０ ｍｇ ＭｏＯ３，４．０ ｇ ＫＣｌ））とＢ溶液 （１００ ｍｌ中：０．２１ ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．０９ ｇ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ ７．０）とが含まれ、Ａ６００＝０．５までＭＲＳブロスにて増殖させたＢｉｏｔａｌ社の接種物を２回洗浄して１：１０００に稀釈し、接種した。培養後、乳酸を酵素的に変換させてピルビン酸を産生させてから（Ｄｉｆｆｃｈａｍｂ社）ブロス発酵物（茎葉残余物及び茎葉加水分解物）の発酵物液体中のＮＡＤＨ（３４０ ｎｍ）産生を測定した（表２８）。この結果から、トウモロコシ茎葉と生成された加水分解物の両方とも乳酸菌の増殖を支持することができ、乳酸産生を支持することができる。
【０１６７】
表２８ トウモロコシ茎葉を過酸化水素処理した後の乳酸産生
【０１６８】
【表２８】
実施例２５ トウモロコシ繊維を過酸化水素処理すると、乳酸産生を支持する加水分解物と残余固形物が生じる。
【０１６９】
リグノセルロース（トウモロコシ繊維）を０．２％過酸化水素に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で４８時間インキュベートした。残余固形物（０．２ ｇ）を加水分解物から分離して洗浄し、水に懸濁して乳酸産生細菌が含まれることが周知されている市販のサイレージ用接種物（Ｂｉｏｔａｌ Ｓｉｌａｇｅ ＩＩ Ｉｎｏｃｕｌａｎｔ，Ｂｉｏｔａｌ Ｉｎｃ．）を０．０１ 加えた。３７℃で２４時間発酵させ、細菌の増殖を顕微鏡的に確認した。処理後に生成された加水分解物をｐＨ７．０に調整し、濾過滅菌して炭素を含まない最小塩培地（ＥＭＭ）と混合した。さらにこれにＡ６００＝０．５までＭＲＳブロスにて増殖させたＢｉｏｔａｌ社の接種菌培養物を洗浄して１：１０００に稀釈し、接種した。この発酵は３７℃で６４時間行った。培養後、乳酸を酵素変換してピルビン酸を産生させてから双方の発酵物（茎葉残余固形物及び茎葉加水分解物）の発酵物液体中のＮＡＤＨ（３４０ ｎｍ）産生を分析した（Ｄｉｆｆｃｈａｍｂ）（表２９）。これにより、トウモロコシ繊維残余固形物及び生成された加水分解物の双方とも乳酸菌の増殖を支持することができ、乳酸産生を支持することができる。
【０１７０】
表２９ トウモロコシ繊維を過酸化水素処理した後の乳酸産生
【０１７１】
【表２９】
実施例２６ 酸化剤処理によって乳酸産生を支持する加水分解物が生じる。
【０１７２】
トウモロコシ茎葉を８０℃で２４時間、過酸化水素（０．２％）で処理し、ｐＨ ５．２に調製してさらに０．３ ｍＬのスペザイムを４０℃で１４４時間処理した。次にこの茎葉をすすぎ、滅菌して１グラムを尿素過酸化水素塩（５％）に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ ５．２とした後、４０℃で４８時間、０．３ ｍＬのスペザイムを添加した。同様に、１．５ ｇの新鮮トウモロコシ茎葉を次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）に８０℃で２４時間接触させ、ｐＨ ５．２に調製してさらに０℃で４８時間、０．３ ｍＬのスペザイム ＣＰを添加した。次に双方の加水分解物をｐＨ ７．０に調製し、濾過滅菌して全糖類濃度０．２％で炭素を含まない最小塩培地（ＥＭＭ）と混合した。混合乳酸接種菌調製物（Ｂｉｏｔａｌ Ｓｉｌａｇｅ Ｉｎｏｃｕｌａｎｔ ＩＩ，Ｂｉｏｔａｌ Ｉｎｃ．）を含むＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ）中の種培養物をＡ６００＝０．５まで増殖させ、２回洗浄して１：１０００に稀釈しし、各培地に加えて３７℃で６４時間培養した。培養後、乳酸を酵素変換してピルビン酸を産生させてから双方の発酵物（尿素過酸化水素塩処理及び次亜塩素酸ナトリウム処理）の発酵物液体中のＮＡＤＨ（３４０ ｎｍ）産生を分析した（Ｄｉｆｆｃｈａｍｂ）（表３０）。これにより、リグノセルロース質物質を酸化剤で処理して出来る加水分解物を乳酸産生細菌は利用することができ、これを乳酸産生に利用することができる。
【０１７３】
表３０ 酸化剤処理後の乳酸産生
【０１７４】
【表３０】
実施例２７ 化学処理によってできる加水分解物は微生物の増殖を支持する。
【０１７５】
数種類のトウモロコシ茎葉を化学処理を用いて調製し、１０ ｍＬの反応物とした。
スペザイムのみ：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）をｐＨ ５．２、４０℃で４８時間処理した。
【０１７６】
過酸化水素：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に０．２％過酸化水素を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１７７】
次亜塩素酸ナトリウム：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰで処理した（４０℃で４８時間）。
【０１７８】
次亜塩素酸ナトリウム且つ稀釈：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）を処理し（８０℃で２４時間）、洗浄して化学薬剤を稀釈し、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１７９】
尿素過酸化水素塩：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に０．２％過酸化水素を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。次にこれを１０％尿素過酸化水素塩で処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８０】
過炭酸ナトリウム：０．２ ｇのトウモロコシ茎葉に２．５％の過炭酸ナトリウムを処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８１】
過硫酸カリウム：０．２ ｇのトウモロコシ茎葉に１．０％の過硫酸カリウムを処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８２】
硝酸：０．２ ｇのトウモロコシ茎葉に１．０％の硝酸を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８３】
加えて、過酸化水素を使用してトウモロコシ繊維加水分解物を調製した。：２ ｇのトウモロコシ繊維に０．２％の過酸化水素を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８４】
スペザイム処理後、各加水分解物を調整してｐＨ ７．０とし、濾過滅菌して次に最終糖類濃度０．２％の炭素を含まない最小塩培地（ＥＭＭ）に加えた。糖類を含まない陰性コントロールも調製した。各加水分解物に代表的細菌株（ＡＴＸ３６６１）を接種し、３７℃で１４時間（糖類無し、次亜塩素酸ナトリウム且つ稀釈、尿素過酸化水素塩、過炭酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過酸化水素）あるいは４０時間（過酸化水素）あるいは４８時間（スペザイムのみ、次亜塩素酸ナトリウム）培養した。各培養物の増殖を６００ ｎｍの吸光度によって測定した（表３１）。各実験における糖類を含まないコントロールの吸光度（６００ ｎｍ）は０．００５未満であった。
【０１８５】
これにより、様々な化学薬剤でリグノセルロース質物質を処理してできる加水分解物は細菌の増殖を支持する。
【０１８６】
表３１ 軽度の化学処理後の細菌増殖
【０１８７】
【表３１】
実施例２８ トウモロコシ茎葉加水分解物は細菌増殖のための成分を提供する。
【０１８８】
ＡＴＸ３６６１は、最小培地（ＥＭＭ）でグルコースあるいはグルコース・キシロース混合物を添加しても増殖することのないＢａｃｉｌｌｕｓ株である。即ち、ＡＲＸ３６６１はこの培地中で増殖するためにグルコースとキシロース以外の別の栄養素を必要とする。
【０１８９】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉）を過酸化水素（０．２％）もしくは次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）と接触させ、８０℃で２４時間インキュベートした。ｐＨを調製してｐＨ ５．２として０．３ ｍｌのスペザイムＰＣ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物を４０℃で１４４時間（次亜塩素酸ナトリウム）もしくは４８時間（過酸化水素）インキュベートした。化学処理を行わないトウモロコシ茎葉試料を実験に含め、スペザイムを４０℃で２４時間処理した。スペザイム処理後に生成した加水分解物を調整してｐＨ ７．０とし、濾過滅菌して全糖類濃度０．２０％（過酸化水素）もしくは０．１５％（次亜塩素酸ナトリウム、スペザイムのみ）の炭素を含まない最小塩培地と混合した。加水分解物の代わりにグルコース（０．０９５％）及びキシロース（０．０５５％）を加えたコントロール培地（「グルコース・キシロース」）と加水分解物を加えないコントロール培地（「糖類無し」）とを準備した。次に、各培地に代表的な細菌株（ＡＴＸ３６６１）を接種し、３７℃で４８時間（次亜塩素酸ナトリウム、スペザイムのみ、糖類無し、グルコース・キシロース）もしくは４０時間（過酸化水素）培養した。各培養物の増殖を６００ ｎｍの吸光度によって検出した（表３２）。予期した通り、ＡＴＸ３６６１はグルコースとキシロースを添加したＥＭＭでは増殖しなかった。驚くべきことに、ＡＴＸ３６６１は加水分解物を添加した場合に増殖を示した。このことから、加水分解物は純粋な糖が支持しない細菌株の増殖を支持する。
【０１９０】
表３２ 細菌増殖に対する加水分解物の影響
【０１９１】
【表３２】
実施例２９ 過酸化水素処理並びに過炭酸ナトリウム処理は紙の加水分解を増進する。
【０１９２】
多用途コピー用紙（０．２ ｇ Ｑｕｉｌｌ，＃７−２０２２２）と細断し（平均粒子サイズ＝５ ｍｍ）、容量１０ ｍＬの過酸化水素（最終濃度０．３％）あるいは過炭酸ナトリウム（最終濃度１．０％）に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調製してｐＨ ５．２として０．３ ｍｌのスペザイムＰＣ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物と４０℃で９６時間インキュベートした。糖類の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。過酸化水素処理はスペザイム単独での処理よりも糖類の遊離を増進することが認められた（表３３）。
【０１９３】
表３３ 紙加水分解に対する過酸化水素並びに過炭酸ナトリウムの影響
【０１９４】
【表３３】
実施例３０ 前処理の過程で過炭酸ナトリウム並びに超酸化カリウムはトウモロコシ茎葉のタンパク質を可溶化する。
【０１９５】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、最終反応物１０ ｍＬ中に０．２ ｇ）を過炭酸ナトリウム（最終濃度１．０％）もしくは超酸化カリウム（最終濃度０．５％）に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調製してｐＨ ５．２とし、上清を可溶化タンパク質の有無について試験した（バイオ・ラッドタンパク質分析）。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して定量のための標準曲線を作成した。過炭酸ナトリウムもしくは超酸化カリウム処理はトウモロコシ茎葉中のタンパク質を可溶化することが認められた（表３４）。
【０１９６】
表３４ 過炭酸ナトリウムもしくは超酸化カリウムの前処理後に可溶化タンパク質が産生する。
【０１９７】
【表３４】
実施例３１ ｐＨ ５での次亜塩素酸ナトリウイム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１９８】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、最終反応物１０ ｍＬ中に０．２ ｇ）に次亜塩素酸ナトリウイム（有効塩素１％、最終濃度）を８０℃で２４時間接触させた。２００ ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液で緩衝して一定のｐＨ、ｐＨ ５に保った。緩衝液のみの陰性コントロールも処理した。０．０３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。糖の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。ｐＨ ５での次亜塩素酸ナトリウイム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進すると認められた（表３５）。
【０１９９】
表３５ ｐＨ ５．０に緩衝された次亜塩素酸ナトリウイムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０２００】
【表３５】
実施例３２ 酢酸及び硫酸存在下で、ペルオキシ酢酸処理はトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０２０１】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、最終反応物１０ ｍＬ中に０．２ ｇ）にペルオキシ酢酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、最終濃度２．０％）を接触させた。この化学薬剤は酢酸及び硫酸も含有していることから、酢酸（最終濃度２．６％）及び硫酸（最終濃度０．０６％）の混合物をコントロールとして使用した。反応物は８０℃で２４時間インキュベートした。次に両反応物に０．０３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え４０℃で２４時間インキュベートした。糖の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。ペルオキシ酢酸は茎葉から糖を遊離させることが認められた（表３６）。
【０２０２】
表３６ ペルオキシ酢酸の前処理はトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０２０３】
【表３６】
実施例３３ 過炭酸ナトリウム並びに次亜塩素酸ナトリウム、ペルオキシ酢酸による前処理によって、低濃度の酵素での加水分解が可能となる。
【０２０４】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、最終反応物１０ ｍＬ中に０．２ ｇ）に、過炭酸ナトリウム（最終濃度１．０％）もしくは次亜塩素酸ナトリウム（遊離塩素１．０％、最終濃度）、ペルオキシ酢酸（最終濃度２．０％）を８０℃で２４時間接触させた。０．０３ ｍＬもしくは０．０１２ ｍＬ、０００６ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物を４０℃で１２０時間インキュベートした。糖類の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。過炭酸ナトリウム並びに次亜塩素酸ナトリウム、ペルオキシ酢酸での前処理によって、使用する酵素が低濃度であっても加水分解が可能となった（表３７）。
【０２０５】
表３７ 過炭酸ナトリウム並びに次亜塩素酸ナトリウム、ペルオキシ酢酸による前処理によって、低濃度の酵素での加水分解が可能となる。
【０２０６】
【表３７】
結論
上記に示した結果は、本発明の方法がリグノセルロース分解に有用な多数の利点を提供することを立証している。これらの利点には以下が含まれる：（１）簡単な手順で反応物を使用することができる、（２）当該工程で使用する酵素の量を減らすことができる、（３）高い濃度の糖溶液を生成して利用することができる、（４）毒性生成物が生じないため、処理した生成物はさらに加工する必要がなく、発酵に直接使用することができる。また、これらの利点から経済的利益が導かれる。
【０２０７】
この明細書で記載されている全ての出版物及び特許出願は、本発明が属する分野の技術者の標準的技術を示している。全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物あるいは特許出願が具体的且つ個別に参考のため添付されていると示してあるものと同範囲に、参考のためこの明細に添付する。
【０２０８】
前記発明は、明確な理解という目的のための説明及び例示のためにいくらか詳細に記載されているが、一定の変更並びに改変を附属する請求項の範囲内で実施することが可能なことは明白であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】図１は、Ｈ２Ｏ２及びセルラーゼ処理をして、トウモロコシ葉茎から可溶化した糖類（ブドウ糖とキシロース）のクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、様々な濃度の過酸化水素のみによる処理あるいは酵素を併用した処理の後に、トウモロコシ葉茎から遊離された還元糖の量（ＤＮＳ法によって測定。）を示す。
【図３】図３は、処理後２４時間目の、残留する過酸化水素のパーセンテージと合わせて同時点での還元糖の量を示す。
【図４】図４は、６００ ｎｍにおける吸光度から測定された微生物の増殖量を、培地中の糖（トウモロコシ葉茎の糖類もしくはブドウ糖とキシロース）のパーセンテージと比較して示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
植物物質由来の遊離糖類及び遊離オリゴ糖の生成を向上させる方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
植物バイオマスは糖類から構成され、地球上で最大の再生可能炭水化物源となっている。しかしながらその糖類は複合高分子に組み込まれているため、この莫大な資源は十分活用されていない。この複合高分子はしばしば集合的にリグノセルロースと呼ばれる。植物バイオマスを分解して生成される糖類は、発酵して化学品、樹脂、並びに石油の代替品としてのエタノールを含む燃料となる、豊富で経済的競争力のある発酵原料を提供することができると考えられる。
【０００３】
米国におけるエタノールの商業生産は現在乾式製粉工場で行われており、トウモロコシ粒をエタノールに転換している。しかしトウモロコシ粒は高価で家畜餌等他の高価値な用途があり、また果糖を豊富に含むコーンシロップが含まれている（Ｗｙｍａｎ，ｅｄ． （１９９９） Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｂｉｏｅｈｔａｎｏｌ： Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ． Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，ｐ．１）。少ない費用で商業的大規模生産が可能な、エタノール生産のための別の供給源が望まれていれる。
【０００４】
廉価且つ豊富であり競合的市場のないトウモロコシ葉茎等、リグノセルロース質物質はエタノールの生産のために穀類よりも望ましいものであると考えられる。制限となる要因は糖重合体の複雑な組成にある。トウモロコシ粒の澱粉は高度に分枝した酵素で分解されやすい水溶性の重合体である。反対に、トウモロコシ葉茎等のリグノセルロース質物質を構成する炭水化物はこれよりも分解されにくい。これらの炭水化物は一般的に、植物細胞壁並びに木質組織の構造成分を形成するセルロース、ヘミセルロース及びグルカンを包含する複合高分子として存在する。澱粉並びにセルロースは共にグルコースの重合体である。
【０００５】
リグノセルロース中の糖類を遊離させる従来の手法には多くの手順が含まれる。その手順の中で鍵となるは激しい条件での前処理である。現在の産業的前処理の目的は、真菌Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ の発酵に由来するセルラーゼ混合物等のセルロース加水分解酵素とセルロースとの接触性を向上させることにある。現在の前処理方法には、高温高圧下且つ強酸あるいは強塩基中で、トウモロコシ葉茎等のリグノセルロース質物質を部分加水分解する手順が含まれる。当該化学的前処理によってヘミセルロースあるいはリグノセルロースのリグニン成分、あるいはその両方が分解されてセルロースが露出するが、酢酸並びにフルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール等の不要な副産物も生じる。続いて行う、酵素を用いた、あるいは同時糖化発酵（ＳＳＦ）と呼ばれる共発酵処理によるセルロース分解を可能にするために、さらに手順を加えてこれらの副産物を除去しなければならない。
【０００６】
化学的前処理に必要とされる激しい条件には高価な反応容器が必要であり、エネルギーを集約的に使用する。化学処理は既知のセルロース酵素に適合しない温度とｐＨ（例えば１２気圧１６０℃及び０．２％硫酸）で行われ、発酵の前に除去しなければならない化合物が生じることから、この手順はセルロース分解とは別の反応容器で行わねばならず、またセルロース分解の前に行わなくてはならない。つまり、よりセルロース分解工程に適合し、有害廃棄物を出さず、またより少ないエネルギーしか必要としない新しい方法が望まれていると思われる。さらに、酵素反応がセルロース分解に用いられる条件と同様の条件で行われることで、同時処理方法の開発がもたらされると考えられる。この同時処理方法においては、ヘミセルロース及びセルロースの分解を同じ反応容器で行う、もしくは現在の前処理工程をセルロース分解とその後の工程と分離しなければならない方法論に従って分離することをしない。加えて、毒性物質を生じることなくリグノセルロース中の糖類を遊離させる手順は、リグノセルロース質物質中に存在するタンパク質、アミノ酸、脂質等の栄養素へ利用可能性が増加するため、さらなる利益を提供することができる可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の理由からリグノセルロースを糖類に変換して発酵原料とするための、効率的な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の概要
激しい前処理の必要がなく、効率性が向上するリグノセルロースを加水分解するための方法が提供される。これらの方法には、軽度あるいは中程度の条件でリグノセルロースを化学処理して処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースの一成分を加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順が含まれる。この化学処理には、酵素処理と併用して糖類を遊離させる作用を持つ一つ以上の化学薬剤とリグノセルロースを接触させる手順を含む。
【０００９】
また、リグノセルロース質物質を前処理する方法も提供され、これには軽度あるいは中程度の条件でリグノセルロース質物質を一つ以上の化学薬剤と接触させて処理済リグノセルロースを生成する手順から成る。一部の実施例においては、この処理済リグノセルロースをさらにリグノセルロースを加水分解できる一つ以上の酵素で処理することができる。
【００１０】
また、リグノセルロース質物質から物質を遊離させる手法も含まれる。これらの手法は、軽度あるいは中程度の条件でリグノセルロース質物質を化学処理する手順から成る。一部の実施例では、化学処理に続いてリグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素を加えることができる。本発明の方法によってリグノセルロース質物質を処理することによって、酵素並びに医薬品、機能性食品を分離することができる。一部の実施例では、リグノセルロース質物質は、遊離する物質を含有するよう工学処理されている。
【００１１】
上記の手法で使用する化学薬剤には酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基あるいはこれらから成るあらゆる組み合わせが含まれる。
【００１２】
また、リグノセルロースを加水分解する手法で、リグノセルロースを酸化剤と接触させて処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順から成るものが提供される。
【００１３】
さらにリグノセルロースを加水分解する手法で、リグノセルロースを約９．０から約１４．０のｐＨで塩基と接触させて処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順から成るものも提供される。
【００１４】
本発明の方法で使用される酵素はリグノセルロースのあらゆる成分と反応することが可能であり、これらにはセルラーゼ並びにキシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼが含まれるがこれらに限定されない。酵素は化学処理前あるいは化学処理後、もしくは化学処理と同時に加えることができる。さら、酵素反応の前もしくは酵素反応と協調して行われる二つ以上の化学処理を含む手法と、これに加えて二つ以上の酵素処理を含む手法も提供される。複数回の化学処理並びに酵素添加が含まれ、任意の順序の任意の回数の処理から成る。あらゆる処理の前あるいは処理中もしくは処理後に、リグノセルロースに一つ以上の物理的処理を行うことができる、あるいは金属イオンもしくはオゾン、紫外線を接触させることができる。
【００１５】
さらに本発明の方法は、一つ以上の発酵生物体を添加する手順を含むことができ、その結果一つ以上の発酵産物が生成される。当該産物には乳酸並びに燃料、有機酸、産業用酵素、医薬品、アミノ酸が含まれるがこれらに限定されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
詳細
本発明は、リグノセルロースの加水分解及びリグノセルロースからの糖類生成のための数種類の方法に向けられており、これらの方法は従来記述されている処理法あるいは前処理法と比べて、より経済性に優れより効率的で且つ毒性が低い。一手法では、軽度あるいは中程度の処理温度あるいは圧力、ｐＨ、もしくはこれらの組み合わせでリグノセルロースを化学処理して処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順を含む。
【００１７】
また、軽度あるいは中程度の条件下で一つ以上の化学薬剤と接触させる手順から成る、リグノセルロース質物質の前処理方法も提供される。この処理済リグノセルロース質物質はさらに、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素による処理を受けることができる。
【００１８】
さらに、リグノセルロース質物質中の物質を遊離させるための方法も提供され、これは軽度あるいは中程度の条件下でリグノセルロース質物質を一つ以上の化学薬剤と接触させて処理済リグノセルロース物質を生成する手順から成る。この処理済リグノセルロース物質はさらにリグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させることができる。
【００１９】
一部の実施例において植物材料は、リグノセルロースを加水分解できる一つ以上の酵素を発現するよう遺伝子工学的に加工された植物から成る。別の実施例では、植物材料を化学処理の前に、酵素の発現が可能な条件下で培養することができる。酵素の発現によって、化学処理の前にリグノセルロースを加水分解することもできる。さらに、これに引き続いて一つ以上の酵素処理を行うこともできる。植物材料から遊離することのでる物質には、酵素並びに医薬品、機能性食品が含まれるがこれらに限定されない。さらに植物材料は、これらの物質が発現するよう遺伝子工学的に加工されることも、加工されない場合もある。
【００２０】
上記のいずれの手法においても、化学薬剤は酸化剤あるいは変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、もしくはこれらの組み合わせであることができる。
【００２１】
加えて、あらゆる処理条件の下で一つ以上の酸化剤を接触させて処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順を含む、リグノセルロースを加水分解するための方法が提供される。酸化剤は次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過酸化水素、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン塩、オスミウム酸、クロム酸、ドデシルベンゼンスルホン酸塩、あるいは酸素ラジカルを生じさせることのできる化合物であることができる。
【００２２】
さらに、リグノセルロースを約９．０から約１４．０のｐＨで塩基と接触させて処理済リグノセルロースを生成し、この処理済リグノセルロースを、リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素と接触させる手順を含む、リグノセルロースを加水分解するための方法が提供される。この方法にはあらゆる範囲の温度あるいは圧力から成る処理条件が含まれる。本手法に加えて酸化剤を使用する手法には、軽度あるいは中程度の処理条件を取り入れることができると認知されている。
【００２３】
酵素あるいは酵素群は、化学溶液の添加と同時に、あるいは添加前もしくは添加後に加えることができると認知されている。同時に添加する場合、化学薬剤あるいは化学薬剤の組み合わせは、この処理法で使用するために選択された酵素の作用を阻害しないものとなる。化学溶液で処理した後に酵素を加える場合、酵素を加える前に条件（温度並びにｐＨ等）を変えることができる。一実施例では、酵素を加える前に、その酵素あるいは酵素群に最適となるようｐＨを調整する。別の実施例では、酵素を加える前に、その酵素あるいは酵素群に最適となるよう温度を調整する。引き続いてあるいは同時に酵素を添加する手順と併用して、あるいは併用せずに、複数回の化学処理を行うことが可能である。加えて、複数回酵素を添加することも含まれる。
【００２４】
「処理済リグノセルロース」あるいは「処理済リグノセルロース質物質」あるいは「処理済材料」は「処理工程」あるいは「処理」の間に、ある種の化学処理あるいは物理的処理によって、少なくともその一部分が加水分解されたリグノセルロースと定義される。典型的には、一つ以上のポリマー成分が処理の間に加水分解され、そのために他の成分がその先の処理をより受けやすくなる。別の方法として、処理後により加水分解されやすくなるよう、処理工程によって加水分解することなくリグノセルロースの構造を改変することができる。糖類の一部あるいは全部を遊離させるよう、リグノセルロースを前もって処理しておくこともできる。
【００２５】
「軽度の処理」あるいは「軽度の条件」によって、約２０℃から約８０℃の温度で２気圧未満、ｐＨは約５．０から約８．０の間であることが意味される。「中程度の処理」あるいは「中程度の条件」によって、以下の条件の内の少なくとも一つが意味される。：約１０℃から約９０℃の温度、約２気圧以下、約４．０から約１０．０の間のｐＨ。処理が中程度の条件下で行われる場合、この３つのパラメーターのうち２つは中程度として揚げられた範囲を外れることが有りうる。例えば、温度が約１０℃から約９０℃である場合、ｐＨ並びに圧力は制限されない場合もある。ｐＨが約４．０から約１０．０の間である場合、温度及び圧力は制限されない場合もある。圧力が約２気圧である場合、ｐＨ並びに温度は制限されない場合もある。
【００２６】
「化学薬剤」あるいは「化学溶液」によって、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基あるいはこれらから成るあらゆる組み合わせが意味される。「酸化剤」によって、分子の酸化レベルを上昇させることのできる物質が意味される。酸化剤は他の分子から電子を受け取り、その過程で還元されることによって作用する。酸化剤には過酸化水素並びに尿素過酸化水素塩、過酸化ベンゾイル、超酸化物類、超酸化カリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、ペルオキシ酸、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マグネシウム塩、オスミウム酸、クロム酸、ドデシルベンゼンスルホン酸塩が含まれるがこれらに限定されない。酸化剤には含過酸化物構造体に加え、酸素ラジカルを生成することのできる化合物が含まれる。「含過酸化物構造体」によって二価イオン−Ｏ−Ｏ−を含有する化合物が意味される。
【００２７】
「変性剤」によって、タンパク質あるいは炭水化物、核酸の構造を崩壊させる化合物が意味される。変性剤には水素結合崩壊剤が含まれる。「水素結合崩壊剤（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）」もしくは「水素結合解離剤（ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）」によって、水素結合を解離させる、あるいは（且つ）水素結合の形成を抑制する、あるいは（且つ）解離後の再形成を抑制すると知られている薬剤あるいは薬剤群が意味される。水素結合崩壊剤には尿素、グアニジニウム、塩素等のカオトロピック剤並びに、Ｎ−メチルモルホリン‐Ｎ−オキシド等のアミン酸化物が含まれるがこれらに限定されない。
【００２８】
「界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）」によって、ミセラを形成して油分を可溶化することのできる化合物が意味される。界面活性剤にはアニオン、カチオン、中性界面活性剤が含まれ、これにはノニデット（Ｎ）Ｐ４０並びにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、スルホベタイン、ｎ−オクチルグルコシド、デオキシコール酸塩、トリトンＸ−１００、ツイン２０が含まれるがこれらに限定されない。「表面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）」はこの定義に含まれる。「表面活性剤」によって水の表面張力を低下させることのできる化合物が意味される。
【００２９】
「有機溶媒」によって、含炭素化合物がその最大部分を構成する溶液が意味される。有機溶媒にはジメチルホルムアミド並びにジメチルスルホキシド、メタノールが含まれるがこれらに限定されない。
【００３０】
「塩基」によって、電子もしくは水素イオンを供与する、あるいは陽子を受容する化学種が意味される。塩基には炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化セシウム、水酸化ルビジウム、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化第二スズ、並びに水酸化物イオンが含まれるがこれらに限定されない。
【００３１】
酵素添加あるいはさらなる化学処理の前に、処理済リグノセルロース中の化学薬剤及び化学薬剤群を除去するあるいは稀釈することもできる。この操作によって、酵素の活性もしくは引き続いて行う微生物の増殖に最適な状態とすることを助ける。別の方法として、より多量の一つ以上の酵素と接触させる前に、少量の一つ以上の酵素を処理済リグノセルロースに加えてインキュベートすることもできる。化学薬剤は、より多量の一つ以上の酵素を添加する前に除去するあるいは稀釈することができる。こうした除去あるいは稀釈は、当分野にて周知されているあらゆる方法によって行うことができ、これには洗浄並びに重力流動、圧力、濾過が含まれるがこれらに限定されない。処理済リグノセルロースから除去される化学薬剤あるいは化学薬剤群は引き続いて行う一つ以上のインキュベーションで再使用することもできる（この明細において「リサイクル薬剤」と定義される。）。
【００３２】
さらに本手法は、全体をあるいは一部分を、一回あるいは複数回行うことができる。即ち、化学溶液もしくは個々の化学薬剤を用いて一回あるいは複数回の反応を遂行させ、次いで一つ以上の酵素処理反応を行うことができる。化学薬剤あるいは化学溶液は一回にまとめて加える、あるいは少量ずつ連続的に加えることができる。さらに、必要に応じて全手順を一回以上繰り返すこともできる。即ち、化学薬剤もしくは酵素を用いた処理を一回以上追加することが含まれる。
【００３３】
この手法によって、加水分解された糖類等（加水分解物）の可溶性物質と不溶性物質とが生成される。その過程で、もしくは当該処理に続いて、例えばバッチ法あるいは連続法、フィードバッチ法によって、可溶性物質を含む液体を分離することができる。この可溶性物質から糖類を分離することができ、さらに濃縮あるいは精製することもできる。加えて、可溶性物質と残余固形物とを包含する処理済リグノセルロースを使用前に加工することができる。この可溶性物質もしくは不溶性物質を、例えば水あるいは発酵培養液を用いて分離するあるいは稀釈することが可能であり、あるいはその物質のｐＨを改変することができる。この分離もしくは稀釈は、当分野で周知されているあらゆる方法によって行うことができ、これには洗浄並びに重力流動、圧力、濾過が含まれるがこれらに限定されない。この物質は、例えばろ過によって、滅菌することもできる。
【００３４】
また、本発明の方法と併用して、研磨並びに煮沸、凍結、製粉、真空浸透、その他の物理的処理を用いることができる。製粉等の物理的処理によって、バッチ反応器にてより高濃度のリグノセルロースを使用することができる。「より高濃度」によって、最大約２０％もしくは最大約２５％、最大約３０％、最大約３５％、最大約４０％、最大約４５％、最大約５０％のリグノセルロースが意味される。化学処理及び（もしくは）物理処理は、本発明の処理方法に関して同時にあるいは順次行うことができる。リグノセルロースはまた、金属イオン並びに紫外線、オゾン、その他に接触させることができる。物質によっては、これらの処理によって水酸基の形成が誘導されて化学処理の効果が上昇する場合がある。本発明の方法はあらゆる適切な容器内で遂行することができ、これにはバットあるいは市販の容器、バイオリアクター、バッチ反応器、発酵タンク・容器が含まれる。本発明の処理過程において、反応混合物を撹拌混合することもできる。
【００３５】
本発明の方法によって、バイオマスの単糖類並びにオリゴサッカライドへの変換効率が向上する。バイオマスが効率的に変換されることによって、後に有用な発酵ベース生成物に転換することができる糖類生成の費用が減少することとなる。「発酵ベース生成物」によって、化学変換あるいは発酵によって産生された生成物が意味される。当該生成物には特殊化学薬品並びに化学原料、樹脂、溶剤、燃料が含まれるがこれらに限定されない。本発明の方法によって作ることのできる生成品の詳細には、生物燃料（エタノールを含む。）、乳酸、樹脂、特殊化学品、クエン酸並びにコハク酸、マレイン酸を含む有機酸、溶剤、動物飼料補助剤、医薬品、ビタミン、リジン並びにメチオニン、トリプトファン、スレオニン、アスパラギン酸等のアミノ酸、プロテアーゼ並びにセルラーゼ、アミラーゼ、グルカナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リアーゼ、酸化還元酵素、転移酵素等の産業用酵素、化学原料が含まれるがこれらに限定されない。また本発明の方法は、微生物発酵による発酵のための原料を生成するのに有用である。一実施例では、本手法はさらに一回以上の発酵微生物を添加する手順から成る。「発酵微生物」によって、酵母を含め、細菌並びに真菌等発酵能力のある生物体が意味される。当該原料は栄養価が付加され、遊離糖類が提供する栄養価を上回る。
【００３６】
また本発明の方法は、リグノセルロース質物質を加工するための手法の開発あるいは改良に有用である。本方法は粘度等含リグノセルロース物質の取り扱い特性の改変あるいは改良に加えて、原料の容積並びに粒子サイズを減少させるのに有用であり、これは糖類を遊離する、あるいは原料として利用する、もしくはさらに別の方法で使用するためのリグノセルロースを調製するのに役立つ。さらに本発明の方法は、廃棄物の容積を減らす目的で使用することができ、リグノセルロース性廃棄物が発生する産業工程から生じる廃棄物の性状を改良する目的で使用することができる。特に本方法は水分含量を減らす、且つ（あるいは）乾燥度あるいは栄養価、組成を改良するのに有用となる。
【００３７】
一実施例では、化学処理によってリグノセルロース質原料に存在する生物性汚染物の数が減少する。これは原料を滅菌した結果である可能性がある（実験の項の例９を参照。）。
【００３８】
処理条件
酵素は、バイオリアクターを用いてバイオマスを変換させるために一般に利用されている極端な高温あるいは酸処理を含まない、軽度あるいは中程度の条件下で基質と反応させる。例えば酵素は低度から中程度のイオン強度且つｐＨが中性である緩衝液中で、約２０℃から約８０℃でインキュベートされ、望ましくは約３０℃から約６５℃、より望ましくは約３７℃から約４５℃、さらに望ましくは約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃でインキュベートすることができる。驚くべきことに、この化学処理によって十分な量の糖類を遊離あるいは解離させることができる。「十分な」量によって、利用可能な糖類が少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、及びそれ以上であることが意味される。
【００３９】
化学処理の温度は、約１０℃から約１００℃もしくはそれ以上、あるいは約１０℃から約９０℃、約２０℃から約８０℃、約３０℃から約７０℃、約４０℃から約６０℃、約３７℃から約５０℃、望ましくは約３７℃から約１００℃、より望ましくは約５０℃から約９０℃、最も望ましいのは約９０℃未満あるいは約８０℃未満、あるいは約８０℃の範囲であることができる。本発明の方法は多様な温度で実施することができるが、使用する酵素に最適な温度、あるいは使用する酵素に最適と予測される温度で処理を行うことが望ましい。最適温度に関するデータが不足している場合は、最初５０℃で処理を行い、次により高い温度もしくはより低い温度で処理を行うこともできる。この試験の分析結果の結果を比較することで、試験された酵素に最適となるよう方法を改良することが可能となる。処理混合物のｐＨは約２．０から約１４．０までの範囲となることができるが、薬剤が酸化剤あるいは変性剤、界面活性剤、有機溶媒で有る場合、望ましいｐＨは約３．０から約７．０であり、より望ましくは約３．０から約６．０であり、さらに望ましくは約３．０あるいは約５．０、約３．５、約３．０、約４．０、約４．５、約５．０である。薬剤が塩基である場合、望ましいｐＨは約９．０から約１４．０であり、より望ましくは約ｐＨ１０．０から約ｐＨ１３．０、さらに望ましくは約ｐＨ１１．０から約ｐＨ１２．５、最も望ましいのは約ｐＨ１２．０である。ここでもｐＨは酵素活性が最大となるように調整し、酵素あるいは酵素混合物を添加する際に、あるいは酵素を添加する前にｐＨを調整することができる。
【００４０】
薬剤の最終濃度は約０．１％から約１０％の範囲となることができ、望ましくは約０．３％から約８％、より望ましくは約０．３％から約５．０％、あるいは約０．４％から約３．０％であり、さらに望ましくは約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％である。リグノセルロースの濃度は約１％から約６０％となることができ、望ましくは約１０％から約４０％、より望ましくは約２０％、約２５％、約３０％、約３５％である。少なくとも約８時間から少なくとも約４８時間等、処理反応は数分から数時間となることが有り得、より望ましくは少なくとも約１２時間から少なくとも約３６時間、少なくとも約１６時間から少なくとも約２４時間、少なくとも約２０時間、より望ましくは少なくとも約１０時間、最も望ましいのは少なくとも約１０分、少なくとも約２０分、少なくとも約３０分、少なくとも約１時間、少なくとも約１．５時間、少なくとも約２．０時間、少なくとも約３時間である。反応は約０気圧から約２気圧で起こることが有り得る。最適な反応条件（化学薬剤の最適量並びに基質量、インキュベーションの最適時間、最適温度、最適温度・ｐＨ・緩衝液・圧力）を決定するために、分析要素を付加する前後の様々な時点で混合物の一定分割量を取り出し、参考のためこの明細に添付してあるＵ．Ｓ． Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６０／４３２，７５０に記載されている変法ＤＮＳ分析法によって、糖類の遊離を測定することができる。
【００４１】
一実施例において本発明の方法には、約０℃から約１００℃の温度且つ約２気圧未満、約２．０から約１４．０のｐＨでリグノセルロースを化学処理する手順が含まれる。別の実施例では、これらの条件の内少なくとも一つはリグノセルロースを加水分解するのに十分な条件である。さらに他の実施例においては、これらの条件の内少なくとも二つはリグノセルロースを加水分解するのに十分な条件である。
【００４２】
本発明の一側面においては、リグノセルロース質物質あるいは植物バイオマスは、エタノールもしくは他の有用な製品を生産するために、分解されて単糖類並びにオリゴサッカライドに変換される。バイオマスから遊離された糖類は転換されて有用な発酵産物となることができる。有用な発酵産物にはアミノ酸あるいはビタミン、医薬品、動物飼料補助剤、特殊化学品、化学原料、樹脂もしくは他の有機ポリマー、乳酸、燃料エタノールを含むエタノール等が含まれるがこれらに限定されない。
【００４３】
従来の方法とは異なり、炭水化物重合体とリグニンとの複合混合物、あるいはリグノセルロースそのものを、バイオマス変換酵素が加水分解する基質として使用することができる。これらの複合体基質中の糖類及びオリゴサッカライドの遊離状態を測定するための、特別な分析法が開発されている。このアッセイでは、トウモロコシ葉茎並びにおが屑、木片屑その他を含む、あらゆるリグノセルロース物質複合体を用いることができる。本アッセイでは、トウモロコシ茎葉等のリグノセルロース質物質を、様々な回数、酵素と共にインキュベートし、遊離された還元糖を、Ｕ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ６０／４３２，７５０に記載されているジニトロサリシリック酸アッセイ法を用いて測定する。還元糖を検出することのできるもの等、様々なアッセイ法をさらに用いて、化学処理の結果可溶化された単糖類あるいはオリゴサッカライドを定量するが可能である。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法によって、単糖類及びオリゴ糖類を定性的且つ定量的に分析することができる。
【００４４】
本発明の方法はまた、発酵用の原料を生成するのに有用である。当該原料はタンパク質並びにアミノ酸、リグニン（炭素源）、脂質、ミネラル（鉄を含む）が可溶化されているため、遊離糖類によって提供される栄養価を超える栄養価を有する。リグノセルロース質物質から原料を生成するための他の方法と比較して、本手法は発酵前に可溶性成分の除去をほとんどあるいは全く必要としない。本方法で生成された原料を、酵母を含め、細菌並びに真菌等の微生物の発酵に使用することもできる。
【００４５】
また、本発明の方法はリグノセルロース物質を加工するための方法を開発するあるいは改良するのに有用である。即ち、これらの方法によって構成成分が改変されたリグノセルロースストリーム並びに粘度の低いリグノセルロースストリーム、容積の小さいリグノセルロースストリーム、さらに水分量もしくは保水量の少ないリグノセルロースストリームを作ることができる。さらに本手法は、農業廃棄物など加水分解されにくいリグノセルロースストリーム中の糖類の回収に適している。この回収によって糖類は原料供給ストリームに再統合され、廃棄物ストリームはさらに減少すると考えられる。加えて、本手法によって農業廃棄物ストリームの還元糖含量が減少すると考えられ、反芻動物の食事に取り入れる繊維状成分としてより適切なものとなると思われる。
【００４６】
酸化剤
酸化剤の相対的強度（例えばｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｐｈｙｓｉｃｓ．ｐｈｙ−ａｓｔｒ．ｇｓｕ．ｅｄｕ／ｈｂａｓｅ／ｃｈｅｍｉｃａｌ／ｃ１を参照する。）は、標準電極電位から推定することができる（例えばｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｐｈｙｓｉｃｓ．ｐｈｙ−ａｓｔｒ．ｇｓｕ．ｅｄｕ／ｈｂａｓｅ／ｃｈｅｎｉｃａｌ／ｃ１を参照する。）最も強い酸化剤が標準電極表に示されている（例えばｈｔｔｐ：／／ｈｙｐｅｒｐｈｙｓｉｃｓ．ｐｈｙ−ａｓｔｒ．ｇｓｕ．ｅｄｕ／ｈｂａｓｅ／ｔａｂｌｅｓ／ｃ１を参照する。）。酸化剤の表の一部には、臭素酸塩並びに塩酸、亜塩素酸、塩素化イソシアヌール酸塩、クロム酸塩、二クロム酸塩、フッ素・塩素・臭素を含むハロゲン、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、硝酸、硝酸塩、亜硝酸塩、酸素、過ホウ酸塩、過塩酸塩、過塩酸、過ヨウ素酸塩、過マンガン酸塩、過酸化水素・ヒドロペルオキシド・ケトン過酸化物・有機過酸化物・無機過酸化物を含む過酸化物、ペルオキソ酸、過硫酸塩が含まれる。
【００４７】
製紙工業で使用される酸化・漂白剤には、塩素・塩素化化合物、塩素、塩化ナトリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム、その他の次亜塩素酸塩、クロロイドシアヌレート、様々な塩素化合物、１，３‐ジクロロ‐５，５‐ジメチルヒダントイン（ＤＣＤＭＨ）、酸素・酸化化合物、過酸化水素、オゾン、過ホウ酸ナトリウム、過マンガン酸カリウム、有機過酸化物、過酸化ベンゼン、他の有機過酸化物、無機過酸化物、過酸化ナトリウム、過酸化カルシウム、過酸化マグネシウム、過炭酸ナトリウム、その他の酸化化物、過酢酸及び過酸化１硫酸、金属酸素酸、硝酸及び亜硝酸が含まれる。
【００４８】
過酸化水素
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、過酸化イオン（Ｏ２２−）のプロトン付加形態である。これは酸化工程によって合成され、最大７０％の濃度の水稀釈物として市販の物を購入することができる。さらに、過酸化水素は酸素の１電子減少形態（Ｏ２−）から自然発生的に、あるいは酵素スーパーオキシドジスムターゼを使用して合成することができる。
【００４９】
過酸化水素は強力な酸化剤である。適切な刺激物がある状態でＨ２Ｏ２が還元されて水酸基（ＨＯ）となることができることは当分野において周知のことである。こうした刺激物には金属陽イオン（Ｆｅ２＋等）並びに紫外線、オゾンが含まれる。水酸基は非常に強力な酸化剤である。
【００５０】
リグノセルロースを加水分解することのできる酵素のサイズは大きく、植物の細胞壁を通過することができない。一方過酸化水素は通過できるほど小さい。自然環境で過酸化水素（並びに水酸基）は、過酸化水素処理後に観察される植物バイオマスの分解に寄与している可能性もある（例えばＸｕ ａｎｄ Ｇｏｏｄｅｌｌ （２００１） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ８７：４３−５７； Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｈｉｇｈｌｅｙ （１９９７） Ｉｎｔ． Ｂｉｏｃｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ Ｂｉｏｄｅｇｒｅｄａｔｉｏｎ ３９： １１３−１２４を参照する。）。過酸化水素が関係する他のリグノセルロース処理はアルカリ性あるいは高温あるいはその両方の条件下で行われている（例えばＫｉｍ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ５７／５８：１４７−１５６； Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９１−９３：８１−９４； Ｄｏｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００１）； Ｌｅａｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ５９：３３４−３４７を参照する。）
過酸化水素に加えて、様々な化学現象を通じて他の化合物が水酸基を生じさせることができることは一般に周知されている。一例は次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）であり、これはスーパーオキシド基（Ｏ２−）あるいは鉄（ＩＩ）イオン（Ｆｅ２＋）等の電子供与体と反応することによって水酸基を作ることができる。
【００５１】
水酸基は酸化力特性を持つ酸素ラジカル化合物の一例である。酸素ラジカルを持ち同様の特性を有する他の化合物は当分野において周知されている。これらの化合物にはこのスーパーオキシド基（Ｏ２−）、一重項酸素（１Ｏ２）、一酸化窒素（ＮＯ）、ペルオキシル基類（ＲＯＯ）、アルコキシル基類（ＬＯ）が含まれる。これらの化合物の内一つ以上は、本発明の工程に利用できると考えられる。
【００５２】
酵素命名と適用
ＩＵＢＭＢ（国際生化学・分子生物学連合）が推奨する命名法が、増補１（１９９３）、増補２（１９９４）増補３（１９９５）、増補４（１９９７）、増補５（各々Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９４） ２２３：１−５並びにＥｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９５） ２３２：１−６； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９６） ２３７：１−５； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９７） ２５０：１−６； Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９９９） ２６４：６１０−６５０）と供に、Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ １９９２［Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＩＳＢＮ ０−１２−２２７１６４−５（ハードカバー）、０−１２−２２７１６５−３（ペーパーバック）］にて公開されている。ＩＵＢＭＢが推奨する分類法は、当分野において認知され追随されている。一般的には、当分野において酵素はＩＵＢＭＢ酵素分類法あるいはＥＣナンバーで照会される。グループごとに掲載されている酵素は頻繁に更新され、ＩＵＢＭＢはこれを書籍並びにインターネットで公開している。
【００５３】
ＩＵＢＭＢ分類法に基づく酵素命名に関する別の資料はＥＮＺＹＭＥデータベースにおいて見ることができる。ＥＮＺＹＭＥは酵素の命名に関係する情報の集積場となっている。基本的に国際生化学・分子生物学連合（ＩＵＢＭＢ）の命名委員会による推奨に基づいており、分類された各種酵素にＥＣ（酵素委員会； Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）ナンバーが付けられ、記載されている（Ｂａｉｒｏｃｈ （２０００） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２８：３０４−３０５）。ＥＮＺＹＭＥデータベースには以下の入力項目について記載されている。：ＥＣナンバー、推奨名称、別名（存在する場合）、触媒活性、補酵素（存在する場合）、その酵素に対応するＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質シーケンスへのポインター（存在する場合）、その酵素の欠損に関係するヒト疾患についてのポインター（存在する場合）。
【００５４】
「セルラーゼ」には、セルロースあるいはセルロース分解物からできる生成物を基質として認識して加水分解することのできる内部加水分解酵素と末端加水分解酵素の双方が含まれる。セルラーゼにはエンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、グルコシダーゼから成る混合物、あるいはこれらの酵素の内の任意の一つを含み、他の活性を合わせ持つ場合もある。セルロース加水分解活性を示す微生物は異なる基質特異性を持つ酵素類を大量に産生するものが多い。このため、実際には数種類の酵素がその活性に寄与している場合でも、セルロースを分解すると同定された株はセルラーゼを持つと記載されることがある。例えば、市販されている製剤である「セルラーゼ」は、エンドグルカナーゼ並びにエキソグルカナーゼ、グルコシダーゼ活性等いくつかの酵素の混合物であることが多い。
【００５５】
このように、「セルラーゼ」には当該酵素の混合物が含まれ、さらにセルロースを加水分解することのできる市販製剤に加え、セルロース加水分解活性を呈するもしくはセロトリオース、セロバイオース等のセルロース分解物に作用する培養液上清あるいは細胞抽出液が含むまれる。
【００５６】
「エンドグルカナーゼ」あるいは「１，４−β−Ｄ−グルカン４−グルカノヒドロラーゼ」、「β−１，４エンドセルラーゼ」、「エンドセルラーゼ」、「セルラーゼ」ＥＣ３．２．１．４．には、β−１，４結合によって結合したグルコース重合体を切断する酵素が含まれる。これらの酵素が作用する基質にはセルロース並びに、カルボキシメチルセルロース、ＲＢＢセルロース等の修飾セルロースが含まれる。
【００５７】
「セロビオヒドロラーゼ」あるいは「１，４−β−Ｄ−グルカンセロビオヒドロラーゼ」、「セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ」、「セロビオシダーゼ」には、セルロース並びにセロテトラオースの１，４−β−Ｄ−グルコシド結合を加水分解し、高分子鎖の非還元末端からセロビオースを遊離させる酵素が含まれる。グループＥＣ３．２．１．９１の酵素にこれらの酵素が含まれる。
【００５８】
「β−グルコシダーゼ」あるいは「グルコシダーゼ」、「β−Ｄ−グルコシドグルコヒドロラーゼ」「セロビアーゼ」ＥＣ３．２．１．２１には、触媒作用による産生物としてグルコース分子を遊離させる酵素が含まれる。これらの酵素は、セロビオース（β−１．４結合グルコース二量体）あるいはセロトリオース（β−１．４結合グルコース三量体）等のグルコース重合体を基質として認識する。典型的には、これらは非還元β−Ｄ−グルコース末端を加水分解し、β−Ｄ−グルコースを遊離させる。
【００５９】
表１ セルラーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
【表１】
「キシラナーゼ」には、キシランあるいはキシラン分解生成物を基質として認識することのできる、末端加水分解酵素と内部加水分解酵素の双方が含まれる。ヘテロキシランがヘミセルロースの主要成分となっている単子葉植物では、エンド−１，４−ベータ−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）とベータ−Ｄ−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）を組み合わせて使用してキシランをキシロースに分解する場合がある。また別の脱分枝酵素は、キシラン構造体中の分枝部分に存在する他の糖成分（アラビノース、ガラクトース、マンノース）を加水分解することができる。また別の酵素はヘミセルロース性糖類（特にアラビノース）とリグニンとの間に形成される結合を加水分解することができる。
【００６１】
「エンドキシラナーゼ」あるいは「１，４−β−エンドキシラナーゼ」、「１，４−β−Ｄ−キシランキシラノヒドロラーゼ」（ＥＣ３．２．１．８）には、β−１，４−結合によって結合されたキシロース重合体を加水分解する酵素が含まれる。エンドキシラナーゼを使用してリグノセルロースのヘミセルロース成分に加えて精製キシラン物質も加水分解することができる。
【００６２】
「エキソキシラナーゼ」あるいは「β−キシロシダーゼ」、「キシラン１，４−β−キシロシダーゼ」、「１，４−β−Ｄ−キシランキシロヒドロラーゼ」、「キシロビアーゼ」「エキソ−１，４−β−キシロシダーゼ」（ＥＣ３．２．１．３７）には、キシラン重合体の非還元末端から連続的にＤ−キシロース基を加水分解する酵素が含まれる。
【００６３】
「アラビノキシラナーゼ」あるいは「グルクロノアラビノキシランエンド１，４−β−キシラナーゼ」、「フェラクサンエンドキシラナーゼ」には、一部のキシラン物質中のβ−１，４キシロシル結合を加水分解する酵素が含まれる。
【００６４】
表２ キシラナーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
【表２】
「リグニナーゼ」には、リグニン重合体構造を加水分解する、あるいは分解することができる酵素が含まれる。リグニンを分解することのできる酵素には、リグニンペルオキシダーゼ並びにマンガンペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、フェルロイルエステラーゼ、及び当分野において、リグニン重合体を脱重合する、もしくは分解することが判明したと記載されているその他酵素が含まれる。また、ヘミセルロース性糖類（特にアラビノース）とリグニンとの間の結合を加水分解することのできる酵素も含まれる。
【００６６】
表３ リグニナーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
【表３】
「アミラーゼ」あるいは「アルファグルコシダーゼ」には、オリゴサッカライド並びにポリサッカライド中の１，４−アルファ‐グルコシド結合を加水分解する酵素が含まれる。以下のＥＣリストに基づき多数のアミラーゼについてその特性が記載されている。
【００６８】
表４ アミラーゼには以下の分類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
【表４】
「プロテアーゼ」にはペプチド結合を加水分解する酵素（ペプチダーゼ）が含まれ、さらにペプチドと糖類等（グリコペプチダーゼ）他の部分との間の結合を加水分解する酵素が含まれる。多数のプロテアーゼの特性がＥＣ３．４に従って記載されており、参考のためこれを添付する。プロテアーゼの具体的な種類には ペプシン、パパイン等のシステインプロテアーゼ、キモトリプシンを含むセリンプロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、金属末端ペプチダーゼが含まれる。ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質情報データベース（スイス・ジュネーブのＳｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ （ＳＩＢ）及び英国ＨｉｎｘｔｏｎのＥｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （ＥＢＩ）によって運営されている。）はプロテアーゼあるいはペプチダーゼを以下の種類に分類している。
セリンタイプペプチダーゼ
族 代表的な酵素
Ｓ１ キモトリプシン、トリプシン
Ｓ２ アルファ−リチックエンドペプチダーゼ
Ｓ２ グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｖ８）（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）
Ｓ２ プロテアーゼＤｏ（ｈｔｒＡ）（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）
Ｓ３ トガビリン
Ｓ５ リシルエンドペプチダーゼ
Ｓ６ ＩｇＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ
Ｓ７ フラビビリン
Ｓ２９ Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３エンドペプチダーゼ
Ｓ３０ タバコエッチウイルス３５ｋＤａエンドペプチダーゼ
Ｓ３１ ウシ下痢ウイルスｐ８０エンドペプチダーゼ
Ｓ３２ ウマ動脈炎ウイルス推定エンドペプチダーゼ
Ｓ３５ リンゴ幹溝形成ウイルスセリンエンドペプチダーゼ
Ｓ４３ ポリンＤ２
Ｓ４５ ペニシリンアミドヒドロラーゼ
Ｓ８ サブチラーゼ
Ｓ８ サブチリシン
Ｓ８ ケクスシン
Ｓ８ トリペプチジルペプチダーゼＩＩ
Ｓ５３ スードモナペプシン
Ｓ９ プロリルオリゴペプチダーゼ
Ｓ９ ジペプチジルペプチダーゼＩＶ
Ｓ９ アシルアミノアシルペプチダーゼ
Ｓ１０ カルボキシペプチダーゼＣ
Ｓ１５ ラクトコッカスＸ−Ｐｒｏジペプチジルペプチダーゼ
Ｓ２８ リソゾーマルプロＸカルボキシペプチダーゼ
Ｓ３３ プロリルアミノペプチダーゼ
Ｓ１１ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａペプチダーゼ族１（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄａｃＡ）
Ｓ１２ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａペプチダーゼ族２（Ｓｔｒｅｐｔ．Ｒ６１）
Ｓ１３ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａペプチダーゼ族３（Ｅ．ｃｏｌｉ ｄａｃＢ）
Ｓ２４ ＬｅｘＡリプレッサー
Ｓ２６ 細菌性リーダーペプチダーゼＩ
Ｓ２７ 真核生物シグナルペプチダーゼ
Ｓ２１ アセンブリン（ヘルペスウイルスペプチダーゼ）
Ｓ１４ ＣｌｐＰエンドペプチダーゼ（Ｃｌｐ）
Ｓ４９ エンドペプチダーゼＩＶ（ｓｐｐＡ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｓ４１ Ｔａｉｌ特異的プロテアーゼ（ｐｒｃ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｓ５１ ジペプチダーゼＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｓ１６ エンドペプチダーゼＬａ（Ｌｏｎ）
Ｓ１９ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓエンドペプチダーゼ
Ｓ５４ ロンボイド（Ｒｏｍｂｏｉｄ）
スレオニンタイプペプチダーゼ
Ｔ１ 多触媒性エンドペプチダーゼ（プロテオソーム）
システインタイプペプチダーゼ
族 代表的な酵素
Ｃ１ パパイン
Ｃ２ カルパイン
Ｃ１０ ストレプトパイン
Ｃ３ ピコルナイン
Ｃ４ ポチウイルスＮＩ−ａ（４９ ｋＤａ）エンドペプチダーゼ
Ｃ５ アデノウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ１８ Ｃ型肝炎ウイルスエンドペプチダーゼ２
Ｃ２４ ＲＨＤＶ／ＦＣプロテアーゼＰ３Ｃ
Ｃ６ ポチウイルスヘルパーコンポーネント（ＨＣ）プロテアーゼ
Ｃ７ クリ胴枯れ病ウイルスｐ２９エンドペプチダーゼ
Ｃ８ クリ胴枯れ病ウイルスｐ４８エンドペプチダーゼ
Ｃ９ トガウイルスｎｓＰ２エンドペプチダーゼ
Ｃ１１ クロストリプシン
Ｃ１２ ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ族１
Ｃ１３ ヘモグロビナーゼ
Ｃ１４ カスパーゼ（ＩＣＥ）
Ｃ１５ ピログルタミルペプチダーゼＩ
Ｃ１６ マウス肝炎ウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ１９ ユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ族２
Ｃ２１ カブ黄斑モザイクウイルスエンドペプチダーゼ
Ｃ２５ ギンギパインＲ
Ｃ２６ ガンマグルタミルヒドロラーゼ
Ｃ３７ サウサンプトンウイルスペプチダーゼ
Ｃ４０ ジペプチジルペプチダーゼＶＩ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｃ４８ ＳＵＭＯプロテアーゼ
Ｃ５２ ＣＡＡＸプレニルプロテアーゼ２
アスパラギン酸タイプペプチダーゼ
族 代表的な酵素
Ａ１ ペプシン
Ａ２ レトロペプシン
Ａ３ カリフラワーモザイクウイルスペプチダーゼ
Ａ９ スプマレトロウイルスエンドペプチダーゼ
Ａ１１ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａトランスポゾンコピアエンドペプチダーゼ
Ａ６ ノダウイルスエンドペプチダーゼ
Ａ８ 細菌性リーダーペプチダーゼＩＩ
Ａ２４ タイプＩＶプレピリンリーダーペプチダーゼ
Ａ２６ オンプチン（Ｏｍｐｔｉｎ）
Ａ４ サイタリドペプシン（Ｓｃｙｔａｌｉｄｏｐｅｐｓｉｎ）
Ａ５ サーモプシン
金属ペプチダーゼ
族 代表的な酵素
Ｍ１ 膜アラニンアミノペプチダーゼ
Ｍ２ ペプチジルジペプチダーゼＡ
Ｍ３ チメットオリゴペプチダーゼ
Ｍ４ サーモリシン
Ｍ５ マイコリシン
Ｍ６ 免疫阻害因子Ａ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｍ７ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ小型中性プロテアーゼ
Ｍ８ リーシュマノリシン（Ｌｅｉｓｈｍａｎｏｌｙｓｉｎ）
Ｍ９ 細菌性コラゲナーゼ
Ｍ１０ マトリキシン
Ｍ１０ セラリシン
Ｍ１０ フラジリシン（Ｆｒａｇｉｌｙｓｉｎ）
Ｍ１１ オートリシン（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ）
Ｍ１２ アスタシン
Ｍ１２ レプロリシン
Ｍ１３ ネプリリシン
Ｍ２６ ＩｇＡ特異的金属エンドペプチダーゼ
Ｍ２７ テントキシシリン（Ｔｅｎｔｏｘｉｌｙｓｉｎ）
Ｍ３０ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ中性プロテアーゼ
Ｍ３２ カルボキシペプチダーゼＴａｑ
Ｍ３４ 炭素菌致死因子
Ｍ３５ デューテロリシン
Ｍ３６ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓエラスチン溶解金属エンドペプチダーゼ
Ｍ３７ リソスタフィン
Ｍ４１ 細胞分裂タンパク質ｆｔｓＨ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｍ４６ 妊娠関連プラズマタンパク質Ａ
Ｍ４８ ＣＡＡＸプレニルプロテアーゼ
Ｍ４９ ジペプチジルペプチダーゼＩＩＩ
その他モチーフＨＥＸＸＨを持たないもの
Ｍ１４ カルボキシペプチダーゼＡ
Ｍ１４ カルボキシペプチダーゼＨ
Ｍ１５ 亜鉛Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ
Ｍ４５ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａジペプチダーゼ
Ｍ１６ ピトリリシン
Ｍ１６ ミトコンドリアプロセッシングペプチダーゼ
Ｍ４４ ワクシニアウイルス型金属エンドペプチダーゼ
Ｍ１７ ロイシンアミノペプチダーゼ
Ｍ２４ １型メチオニルアミノペプチダーゼ
Ｍ２４ Ｘ−Ｐｒｏジペプチダーゼ
Ｍ２４ ２型メチオニルアミノペプチダーゼ
Ｍ１８ 酵母アミノペプチダーゼＩ
Ｍ２０ グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ
Ｍ２０ Ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ
Ｍ２５ Ｘ−Ｈｉｓジペプチダーゼ
Ｍ２８ Ｖｉｂｒｏロイシンアミノペプチダーゼ
Ｍ２８ アミノペプチダーゼＹ
Ｍ２８ アミノペプチダーゼｉａｐ（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｍ４０ サルホロバスカルボキシペプチダーゼ
Ｍ４２ グルタミルアミノペプチダーゼ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）
Ｍ３８ Ｅ．ｃｏｌｉベータアスパルチルペプチダーゼ
Ｍ２２ Ｏ−シアログリコプロテインエンドペプチダーゼ
Ｍ５２ 加水分解酵素突然変異ペプチド
Ｍ５０ ＳＲＥＢＰサイト２プロテアーゼ
Ｍ５０ 胞子形成因子ＩＶＢ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
Ｍ１９ 膜ジペプチダーゼ
Ｍ２３ ベータ溶解エンドペプチダーゼ
Ｍ２９ 好熱性細菌アミノペプチダーゼ
触媒機構が不明のペプチダーゼ
Ｕ３ 胞子エンドペプチダーゼｇｐｒ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｕ４ 胞子形成シグマＥ因子プロセッシングペプチダーゼ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）
Ｕ６ ムレインエンドペプチダーゼ（ｍｅｐＡ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）
Ｕ８ バクテリオファージムレインエンドペプチダーゼ
Ｕ９ プロヘッドエンドペプチダーゼ（Ｔ４ファージ）
Ｕ２２ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａトランスポゾン２９７エンドペプチダーゼ
Ｕ２４ トウモロコシトランスポゾンｂｓ１エンドペプチダーゼ
Ｕ２６ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ
Ｕ２９ 脳脊髄炎ウイルスエンドペプチダーゼ２Ａ
Ｕ３０ ツユクサ黄斑ウイルスプロテイナーゼ
Ｕ３１ ヒトコロナウイルスプロテアーゼ
Ｕ３２ ポルフィロモナスコラゲナーゼ
Ｕ３３ イネｔｕｎｇｒｏ桿状ウイルスエンドペプチダーゼ
Ｕ３４ ラクトコッカスジペプチダーゼＡ
「リパーゼ」には、ホスホグリセリド（ｐｈｏｓｐｏｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）、リポタンパク質、ジアシルグリセロール、その他を含む、脂質並びに脂肪酸、アシルグリセライドを加水分解する酵素が含まれる。植物では、脂質は水分減少及び病原菌感染を制限するための構造的成分として利用されている。こうした脂質には、脂肪酸から派生したワックスに加えクチン並びにスベリンが含まれる。ＥＣリストに従って、多数のリパーゼの特性が記載されている。
【００７０】
表５ リパーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００７１】
【表５】
「グルクロニダーゼ」にはベータグルクロニシドを加水分解してアルコールを生成する反応を触媒する酵素が含まれる。以下のＥＣリストに従って多数のグルクロニダーの特性が記載されている。
【００７２】
表６ グルクロニダーゼには以下の種類の酵素が含まれるが、これらに限定されない。
【００７３】
【表６】
酵素組成
「リグノセルロースを加水分解することのできる一つ以上の酵素」あるいは「一つ以上の酵素」とは、「処理反応」後にバイオマス中の糖類の遊離を増進するあるいは上昇させるあらゆる酵素もしくは酵素混合物と定義される。これには、反応の際にバイオマスに接触させると次の酵素の活性を上昇させる酵素を含むことができる。「酵素」を用いた処理を「酵素処理」と呼ぶ。関係する活性を持つ酵素には、セルラーゼ並びにキシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、グルクロニダーゼが含まれるがこれらに限定されない。これらの酵素の内多数のものはＥＣ３．２．１族の典型的酵素であり、即ち、この族内の他の酵素は本発明に利用できる可能性がある。２つ以上の酵素を組み合わせて「酵素混合物」を作り、処理の過程においてリグノセルロースを加水分解することもできる。酵素混合物は以下から入手した酵素から構成することができる。（１）商業的供給者、（２）酵素を発現するクローニングした遺伝子、（３）原材料自体を含むブロスに加え、半固相あるいは固相培地由来のブロスを含めた、ブロス複合物（例えば培地中で微生物株が増殖してできたもので、その株は倍地中にタンパク質並びに酵素を分泌している。）。（４）（３）と同様に増殖した微生物株の細胞溶解物、（５）リグノセルロースを加水分解することのできる酵素を発現する植物材料。
【００７４】
あらゆる組み合わせの酵素を使用することができると認知されている。酵素は単独であるいは、少なくともセルラーゼ、少なくともキシラナーゼ、少なくともリグニナーゼ、少なくともアミラーゼ、少なくともプロテアーゼ、少なくてもリパーゼ、少なくともグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ、少なくともセルラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ、少なくともキシラナーゼ及びアミラーゼ、少なくともキシラナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリパーゼ、少なくともキシラナーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともリグニナーゼ及びアミラーゼ、少なくともリグニナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともリグニナーゼ及びリパーゼ、少なくともリグニナーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラーゼ及びリグニナーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ、少なくともリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキリラナーゼ及びリグニナーゼ及びグルクロニナーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びリパーゼ及グルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼ、少なくともセルラーゼ及びキシラナーゼ及びリグニナーゼ及びアミラーゼ及びプロテアーゼ及びリパーゼ及びグルクロニダーゼその他の混合物として使用することができる。上記の通り、補助混合物はこれらの酵素族の各々、あるいは一酵素族の内の数種類（２つ以上のキシラナーゼ等）、あるいはこれらの酵素族内の酵素のあらゆる組み合わせ（プロテアーゼとエキソセルラーゼとエンドキシラナーゼ、あるいはリグニナーゼとエンドキシラナーゼとリパーゼ等）から成ることができると理解されている。
【００７５】
酵素は化学処理と同時に、あるいは化学処理の後で、基質あるいはバイオマスと反応させることもできる。同様に複数の酵素を使用する場合、酵素は同時にあるいは順次加えることができる。酵素は、粗製酵素混合物あるいは準精製酵素混合物、精製酵素混合物として加えることができる。酵素基質混合物の温度およびｐＨは、酵素結合体の活性が上昇するように変えることができる。ここでは酵素を混合物として議論してきたが、温度、ｐＨ及びあその他条件を酵素活性が上昇するように変更して、酵素を順次加えることもできる。別の方法として、酵素混合物に合う最適ｐＨ及び最適温度を決定することもできる。
【００７６】
酵素は軽度の条件下で基質と反応させる。「軽度の条件」によって、現在バイオリアクターを用いたバイオマス変換のために利用されている極端な温度、あるいは極端な酸処理を含まない条件が意味される。例えば酵素は約３５℃から約６５℃にて、ｐＨが中性の低イオン強度から中イオン強度の緩衝液中でインキュベートすることができる。「中イオン強度」によって、緩衝液のイオン濃度がどの一イオン成分についても約２００ミリモル（ｍＭ）以下であることが意味される。このような条件下で酵素混合物をインキュベーションすることによって、リグノセルロース中の糖が十分量遊離させる。十分量あるいは有意パーセンテージによって、利用可能な糖の少なくとも約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％並びにそれ以上が意味される。
【００７７】
酵素の適用
本発明を実践する際に使用する酵素あるいは酵素群は、微生物もしくは酵母、真菌、細菌、植物によって体外産生させ、単離してリグノセルロース質原料に加えることができる。別の方法として、酵素を産生する生物体を原料に加えることもできる。本手法では、酵素を産生する植物をリグノセルロース質原料として使用して、リグノセルロース質原料に加えることができる。また、同時糖化発酵によって発酵生成物を産生する発酵生物内で酵素を作り出すこともできる。
【００７８】
セルロース並びにヘミセルロースを分解する酵素は自然界に広く存在し、これによってセルロース並びにヘミセルロースを産生する生物は、毎年産生される４００億トン以上のセルロースバイオマスを分解することができる。セルロース分解の工程は化学過程であり、三種類もの異なる活性をこれに含むことができる。：１）エンドグルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、内部からセルロース重合体を切断する。２）セロビオヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）、重合体の非還元末端にてセルロース重合体を攻撃する。３）ベータ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）、二量体であるセロビオースを切断してグルコース単量体とする。また他の小分子セロデキストリンを切断してグルコース単量体とする。こうした活性を伴ってセルロースはグルコースに変換される。
【００７９】
同様に、ヘミセルロースを酵素によって単糖類並びにオリゴサッカライドに変換することができる。単子葉植物では、ヘテロシキランがヘミセルロースの主要成分となっており、エンド−１，４−ベータ−キシラーゼ（ＥＣ３．２．１．８）とベータ−Ｄ−キシロシダーゼを組み合わせて使用し、ヘミセルロースを分解してキシロースとすることができる。ベータグルカン混合物はベータ（１，３），（１，４）グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．７３）で加水分解される。
【００８０】
バイオマス変換に影響する酵素は、広範囲の生物にて自然界で産生される。一般的な供給源は、セルロース並びにキシラーゼに対応するＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属並びにＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属、及びリグニナーゼに対応する白腐れ真菌を含む微生物である。セルラーゼ並びにセロビオヒドロラーゼ、グルコシダーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、リグニナーゼを産生する生物は多数あると記載されている。しかしながら、これらの酵素のうち大部分のものは植物バイオマス、特にトウモロコシ茎葉を分解する能力については試験されていない。即ち、本発明の方法は、トウモロコシ茎葉並びにその他のリグノセルロース質物質を加水分解する際の、酵素使用法の試験に使用することができる。
【００８１】
前に記載したように、酵素あるいは酵素組み合わせを、細菌もしくは酵母、真菌、植物内で発現させることができる。酵素発現のための方法は当分野にて周知されている。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ： ５，５６３，０５５； ４，９４５，０５０； ５，８８６，２４４； ５，７３６，３６９； ５，９８１，８３５並びに当分野において周知されている他のものを参照する。参考のためこれら全てをこの明細に添付する。
【００８２】
本発明の一側面では、酵素は形質転換植物にて産生される。即ち、リグノセルロースから成る植物材料は、リグノセルロースを加水分解できる一つ以上の酵素を前もって包含することができる。化学薬剤を添加する前に、酵素がリグノセルロースを加水分解できるような条件下でそのリグノセルロースをインキュベートすることもできる。さらにリグノセルロースは、化学薬剤を添加する前あるいはあらゆる酵素処理の前に、ｐＨの改変あるいは洗浄等の処理を受けることもできる。本手法では、植物はバイオマスを単糖類あるいはオリゴサッカライドに変換するのに必要な、あるいはこれに寄与する酵素を発現する。植物が生長する間、当該酵素あるいは酵素組み合わせは植物の加水分解を防ぐために封鎖あるいは不活性化されている。複数の酵素が共同的活性を呈する場合には、リグノセルロース質原料となる植物内で一つあるいは複数の酵素が産生され、別の酵素が細菌もしくは酵母、真菌、別の植物内で産生され、次にこの異なる酵素源同士が原料と共に混合されて最終的な酵素協働混合物となる場合もある。
【００８３】
バイオマス基質定義
「基質」あるいは「リグノセルロース」、「バイオマス」によって、セルロース及びヘミセルロース、リグニン、タンパク質、灰、澱粉並びに糖類等の炭水化物を含有する物質が意味される。構成成分の単糖類には、グルコース並びにキシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトースが含まれる。「バイオマス」にはバージンバイオマス且つ（あるいは）農業バイオマス並びに産業有機物、建築解体残骸、自治体固形ゴミ、紙ゴミ、庭ゴミ等の廃棄物系バイオマスが含まれる。バイオマスの一般的な形態には木、並びに低木及び草、小麦、麦わら、サトウキビバガス、トウモロコシ、トウモロコシ皮、粒から伸びる繊維を含めたトウモロコシ粒、トウモロコシ等を製粉することによって生成される製品及びその副産物（湿式製粉並びに乾式製粉を含む。）、加えて自治体固形ゴミ、紙ゴミ、庭ゴミが含まれる。「混合バイオマス」はバージンバイオマスと使用済みバイオマスとのあらゆる混合物あるいは配合物であり、望ましくは重量にして５〜９５％の使用済みバイオマスを有する。「農業バイオマス」には枝並びに潅木、籐類、トウモロコシ及びトウモロコシ皮、エネルギー作物、森林、果実、花、穀類、草、草本作物、葉、樹皮、針状葉、丸太、根、苗、短期輪作木質作物、低木、スイッチグラス、木、野菜、ブドウ木、硬質・軟質木材（有害物質を有する木材を含まない。）が含まれる。さらに、農業バイオマスには耕作並びに森林作業を含む農業作業によって生じる有機性廃棄物が含まれ、特に森林木性廃棄物が含まれる。農業バイオマスは任意の前記単独物あるいはあらゆる組み合わせのこれらの混合物であることができる。
【００８４】
トウモロコシ並びに穀類、果実、野菜等、澱粉もしくは糖、タンパク質に富むバイオマスは、通常食物として消費される。反対に、セルロース並びにヘミセルロース、リグニンに富むバイオマスは消化されにくく、主に木製品並びに紙製品、燃料として利用され、典型的には廃棄される。一般に、基質となるのはリグノセルロース含量が高いものであり、トウモロコシ茎葉並びにトウモロコシ繊維、ディスティラーの乾燥粒、稲わら、灰、サトウキビバガス、小麦、オート麦、大麦麦芽並びにその他農業バイオマス、スイッチグラス、森林廃棄物、ポプラ木材片、マツ木材片、おが屑、庭ゴミ、その他が含まれる。また、基質のあらゆる組み合わせが含まれる。
【００８５】
バイオマスは農地から集められたものとして使用される場合も、例えば製粉、粉挽き、細断等、加工される場合もありうる。さらにバイオマスを使用前に、例えば加熱あるいは乾燥、冷凍、サイロへの貯蔵（高湿度状態である期間貯蔵すること。）等、化学的もしくは物理的手段によって処理することもできる。当該処理には俵・覆いのない窪地での貯蔵に加え、微生物数あるいは微生物量、ｐＨ、水分量等の性状を改変するために作製された反応器での貯蔵が含まれる。
【００８６】
表７ 一般にバイオマスと呼ばれる物質の例
【００８７】
【表７】
「遊離する」あるいは「加水分解」によって、リグノセルロース質基質複合体あるいはバイオマスの、単糖類あるいはオリゴサッカライドへの転換が意味される。
【００８８】
「転換」には、バイオマスあるいは配合バイオマス、あるいはその両方からエタノールもしくはエタノールと副産物とを産生する、あらゆる生物学的、あるいは（且つ）化学的、あるいは（且つ）生化学的活性が含まれる。当該転換には、当該バイオマスあるいは配合バイオマス、あるいはその両方の、加水分解並びに発酵、同時糖化発酵（ＳＳＦ）が含まれる。望ましくは転換にはこの明細で定義される発酵原料及び加水分解材料の使用が含まれる。
【００８９】
「トウモロコシ茎葉」にはトウモロコシ植物体の収穫によって生じる農業残余物が含まれる。茎葉はトウモロコシ耕地からトウモロコシ粒を収穫することによって生じ、典型的にはコンバイン収穫機によって生じる。トウモロコシ茎葉には、トウモロコシの茎並びに殻、根、トウモロコシ粒、土等のその他物質が多様な割合で含まれる。
【００９０】
「トウモロコシ繊維」はトウモロコシ粒の一部分であり、典型的には湿式製粉あるいは他のトウモロコシ粒加工によって生じる。トウモロコシ繊維部分は収穫された粒の繊維部分であり、澱粉及び油が抽出された後に残るものである。トウモロコシ繊維は典型的にはヘミセルロース及びセルロース、残余澱粉、タンパク質、リグニンが含まれる。
【００９１】
「エタノール」にはエチルアルコールあるいはエチルアルコールと水との混合物が含まれる。
【００９２】
「発酵産物」にはエタノール並びに乳酸、クエン酸、ブタノール、イソプロパノール、加えてこれらの誘導体が含まれる。
【００９３】
「ディスティラーの乾燥粒」はトウモロコシの澱粉分画がエタノール発酵のために分離された後の乾燥残余物である。この物質は典型的には繊維及び残余澱粉、タンパク質、油が含まれる。
【００９４】
「サトウキビバガス」は、サトウキビ加工によるリグノセルロース性生成物である。バガスは典型的には約６５％の炭水化物をセルロースあるいはヘミセルロースの形で含有する。
【００９５】
「麦芽」リグノセルロースは、醸造業が糖源として用いる大麦麦芽を意味する。生成される使用済み「麦芽」は、セルロース及び繊維、タンパク質を豊富に含む。
【実施例】
【００９６】
以下の実施例は説明のために提供するものであり、制限のためのものではない。
【００９７】
実験
実施例１ グルコース及びキシロース標準曲線
グルコース及びキシロース、アラビノース、ガラクトース、マンノースの標準品を、０％〜０．１２％の範囲の濃度で調製した。変法ジニトロサリシリック酸法（ＤＮＳ）によって５４０ ｎｍで検出される吸光変化を得た。各糖標準物に対する線状曲線一致分析によって、各糖単量体に対するＤＮＳ定量法が正確な検出法であることが証明される（デーダは示していない。）。
【００９８】
実施例２ 過酸化水素処理後にセルロース処理を行うと単糖類が遊離する。
【００９９】
１０ ｍＬの水中で（ｐＨ ５．０に調整）、過酸化水素（２００ ｍＭ）を２．０ ｇの茎葉と反応させた。コントロール茎葉は処理を行わなかった。８０℃で２４時間インキュベーションした後、各試料の還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した（例１）。次にＴ． ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ（２５ ｍｇ）由来のセルラーゼを双方の試料に加え、６５℃で２４時間インキュベーションを行った。ＤＮＳ分析によって還元糖を測定した。結果を表８に示す。過酸化水素処理によって酵素単独での処理よりも多くの糖が酵素処理後に遊離された。
【０１００】
表８ トウモロコシ茎葉から可溶化された還元糖
【０１０１】
【表８】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による次の分析のために部分試料を分離し、１：２５０に水で稀釈して０．４５μｍのフィルターを使用して濾過した。次に、陰イオン交換ＨＰＬＣカラムを使用して可溶化した糖を塩基性ｐＨで分離した。検出には電気化学検出器を使用し、パルス電流測定モードで実行した。外来の糖標準物（グルコース、キシロース）を使用してグルコース及びキシロースのピークを同定した。Ｈ２Ｏ２とセルラーゼによる処理後に茎葉から可溶化された糖類のクロマトグラムを図１に示す。
【０１０２】
実施例３ 過酸化水素処理によってトウモロコシ茎葉の酵素加水分解が増進する。
【０１０３】
過酸化水素（最終濃度０〜６０ ｍＭ）を酢酸ナトリウム緩衝液（１２５ ｍＭ，ｐＨ ５．０）中で０．２ ｇの茎葉と反応させ、撹拌しながら５０℃でインキュベートした。２４時間後、還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した。次にＴｒｉｇｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ１０ユニットとＴｒｉｇｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ由来のキシラナーゼ１０ユニットを加え、５０℃で２４時間インキュベーションを続けた。各試料からさらに部分試料を分離し、還元糖を定量した。過酸化水素及び酵素処理後の還元糖含量を図２に示す。過酸化水素濃度を上昇させると遊離する還元糖量が増加した。
【０１０４】
実施例４ 処理後２４時間以内に過酸化水素は分解する。
【０１０５】
過酸化水素（０．１３％）を酢酸ナトリウム緩衝液（１２５ ｍＭ，ｐＨ ５．０）中で、５０℃で撹拌しながら０．２ ｇの茎葉と反応させた。過酸化水素は以下のように検出した（Ｋｏｔｔｅｒｍａｎ （１９８６） Ａｐｐ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２：８８０−８８５）。各試料からの複数の部分試料（１００μＬ）を９６ウェルマイクロタイタープレートに移し、４９μＬの０．０６％フェノールレッド及び１μＬの１．５ ｍｇ／ｍＬホースラディッシュペルオキシダーゼと混合して５分間インキュベートした。次に試料を７５μＬの４Ｎ ＮａＯＨと混合して６１０ ｎｍで定量し、過酸化水素標準物と比較した。０から２４時間の時点における過酸化水素と還元糖（ＤＮＳ分析）を測定した。これらのデータを図３に示している。茎葉を加えないコントロール試料ではＤＮＳ分析及び過酸化物分析シグナル各々に変化はなかった（データは示していない。）２４時間までに、過酸化水素濃度は０となった（図３）。これらの結果は処理の後に残る化学残留物が最小であることを示している。
【０１０６】
実施例５ 多数のリグノセルロース物質から糖を遊離する。
【０１０７】
トウモロコシ茎葉もしくはトウモロコシ繊維、ディスティラーの乾燥粒、大麦麦芽、サトウキビバガスから構成される１グラムのリグノセルロース物質を１０ ｍＬの水中で過酸化水素（１００ ｍＭ）と混合し、８０℃で２４時間インキュベートした。未処理反応物には過酸化水素を加えていない。インキュベーションの最後に、１００ ｍＭのＮａＯＡｃ緩衝液（ｐＨ ５．０）を加えてｐＨを調整し、２５ ｍｇのＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉセルラーゼを加えてその溶液を６５℃で２４時間インキュベートした。未処理反応物にはセルラーゼを加えていない。加水分解物の還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した。これらの実験の結果を表９に示す。これらの結果は、この処理によって多数のリグノセルロース質物質から糖類を遊離することができることを示している。
【０１０８】
表９ リグノセルロース物質からの糖遊離
【０１０９】
【表９】
実施例６ トウモロコシ茎葉から発酵原料を生成する。
【０１１０】
トウモロコシ茎葉（２．０ ｇ）を１０ ｍＬの水中で過酸化水素（０．１％）と混合した。８０℃で２４時間インキュベートした後、ｐＨを５．０に調整してＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼを５０ ｍｇ加え、６５℃で２４時間インキュベートした。次に加水分解物の還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した。次に、加水分解物をｐＨ ７．０に調整し、濾過滅菌して最終濃度５％の糖を産生するよう、炭素を含まない最小増殖培地（Ｍ６３）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１）に加えた。コントロール増殖培地は糖を含まない培地に５％の糖を加えて調製した。細菌細胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を各培地に加えて振盪しながら３７℃でインキュベートし、各培地の６００ ｎｍの吸光度を測定することによって４８時間、細菌の増殖をモニターした。４８時間時点でのこれらのデータを表１０に示す。本方法で得られた加水分解物によってＥ． ｃｏｌｉは高濃度に増殖した。結果は、この方法から生成された加水分解物によって、グルコースの場合よりもより多量の細菌増殖が可能となること示している。加水分解物は稀釈しない状態であってもＥ． ｃｏｌｉに有害なものではなかった。
【０１１１】
表１０ トウモロコシ茎葉加水分解物による発酵増殖
【０１１２】
【表１０】
実施例７ 加水分解物は細菌の増殖を促す発酵原料である。
【０１１３】
過酸化水素とセルラーゼとの処理（例６に記載）によって生成された加水分解物を、最終糖濃度０．０％から１．０％の糖類を産生するよう、炭素を含まない最小増殖培地（Ｍ６３）に稀釈した。コントロール培地は同じ最終糖濃度のグルコース及びキシロース（割合は６３：３７）を加えて調製した。細菌細胞（Ｅｓｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１ ＭＲＦ’）を各培地に加えて振盪しながら３７℃で培養し、４８時間時点での増殖を６００ ｎｍの吸光度によって定量した。細菌の増殖性はグルコース及びキシロースを加えて調製したコントロール培地よりも、加水分解物培地の方が高かった（図４を参照）。
【０１１４】
実施例８ 界面活性剤処理によって、過酸化水素処理後にセルラーゼを処理するトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１１５】
トウモロコシ茎葉（２．０ ｇ）を１０ ｍＬの水中で過酸化水素（１％）と混合した。８０℃で２４時間インキュベートした後、ｐＨを５．０に調整した。これにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ５０ ｍｇをトリトンＸ−１００（２％ ｖ／ｖ）と供に加えた。別に、トウモロコシ茎葉（２．０ ｇ）を１０ ｍＬの水中で過酸化水素（１％）と混合して８０℃で２４時間インキュベートした後、ｐＨを５．０に調整した。これにＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ由来のセルラーゼ５０ ｍｇをツイン２０（３％ ｖ／ｖ）と供に加えた。界面活性剤を加えないコントロール（セルラーゼのみ）を双方の実験ともインキュベートした。反応物は４０℃で９６時間インキュベートした。ＤＮＳ分析を用いて還元糖含量を測定した。この分析の結果は、ツイン２０とトリトンＸ−１００の双方ともトウモロコシ茎葉からの糖の遊離を促進することを示している。データを表１１にまとめた。
【０１１６】
表１１ 茎葉加水分解に対する界面活性剤の影響
【０１１７】
【表１１】
実施例９ 酸化剤がリグノセルロース質物質を滅菌する。
【０１１８】
トウモロコシ茎葉（１ ｇ）を１０ ｍＬの滅菌水に懸濁して一方をオートクレーブ処理し、もう一方はオートクレーブ処理をしなかった。予期したとおり、オートクレーブによって実質的に全ての微生物が死に、１ ｍｌ当たり１００コロニー形成ユニット以下となった。反対に、オートクレーブ処理しなかった試料には１ ｍＬ当たり〜２０、０００コロニー形成ユニットが含まれていた。オートクレーブ処理しなかった試料は０．１％の過酸化水素を５０℃で２４時間処理した。当分野で周知されているように連続稀釈を行い、栄養ブロスプレートに接種した。プレートを３０℃で２４時間培養し、その後コロニー形成ユニットを計数した。未処理のコントロールと比較して、過酸化水素処理によって実質的に微生物含量が減ることが認められた（表１２）。
【０１１９】
表１２ トウモロコシ茎葉の微生物含量に対する過酸化水素の影響
【０１２０】
【表１２】
実施例１０ バイオマスを次亜塩素酸ナトリウムで処理することによって、トウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１２１】
トウモロコシ茎葉（０．２ ｇ）を９ ｍＬの滅菌水（ｐＨ ５．２）と１ ｍＬの次亜塩素酸ナトリウム溶液（有効塩素１０〜１３％、Ｓｉｇｍａ）とに懸濁した。この前処理は８０℃で３００ ｒｐｍの振盪培養器内で２４時間行った。前処理の後ｐＨを５．２〜５．４に調整し、試料にスペザイムＣＰ（Ｓｐｅｚｙｍｅ ＣＰ；０．３ ｍＬ）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え４０℃、３００ ｒｐｍで２４時間インキュベートした。２４時間後に上清部分試料を回収し、還元糖含量をＤＮＳ分析によって測定した（λｍａｘ＝５４０ ｎｍ）。全ての試料を二通りにして操作した。次亜塩素酸ナトリウム処理によって、トウモロコシ茎葉の有意な量の加水分解物が産生した（表１３）。１０％次亜塩素酸ナトリウムとスペザイムとの処理によっては、スペザイム単独での処理よりも多量の茎葉加水分解物が生じた。
【０１２２】
表１３ 茎葉加水分解に対する次亜塩素酸ナトリウムの影響
【０１２３】
【表１３】
ＨＰＬＣによって糖類のさらに詳細な定量を行った。処理済物質のＨＰＬＣクロマトグラム分析によって１０％ＮａＯＣｌ（２４時間）を用いた前処理、次いで０．３ ｍＬのスペザイム（２４時間）を使用した後に生成された糖類を同定する。注入前に試料を１：５０に稀釈した。グルコース及びアラビノース、ガラクトース、マンノースを含むピーク（６．３分）はキシロースを含むピーク（６．８分）と分かれていた。可溶化された有効糖類のパーセンテージを、各ピーク面積を統合することによって算出した（表１４）。このように、次亜塩素酸ナトリウムで処理することによって、糖類がリグノセルロースから高い割合で遊離した。
【０１２４】
表１４ 次亜塩素酸ナトリウム及びスペザイムでの処理後に生成された糖
【０１２５】
【表１４】
実施例１１ 非常に低い濃度のセルラーゼで、有意な量のトウモロコシ茎葉加水分解物が得られる。
【０１２６】
ＮａＯＣｌで前処理した茎葉試料の一方を０．３ ｍＬのスペザイム、もう一方を０．０３ ｍＬスペザイムと反応させた。０．３ ｍＬスペザイムを加えた試料では全糖類の８４％が加水分解され、０．０３ ｍＬスペザイムを加えた試料では７９％が加水分解された。ＮａＯＣｌを加えずに０．３ ｍＬのスペザイムを加えたコントロール試料では４２％が加水分解された（表１５を参照。）。
【０１２７】
本実験はＮａＯＣｌ保存液の１０％溶液で前処理し、その後セルラーゼ（本件ではスペザイム）処理することによって、リグノセルロースが有意な量加水分解されて糖となることを示している。
【０１２８】
表１５ 次亜塩素酸ナトリウム前処理後、低量の酵素が加水分解に与える影響。
【０１２９】
【表１５】
実施例１２ 次亜塩素酸カルシウム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１３０】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を次亜塩素酸カルシウム（有効塩素１％）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調製してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で２４時間インキュベートした。糖の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。次亜塩素酸カルシウム処理は、スペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表１６）。
【０１３１】
表１６ 茎葉加水分解に対する次亜塩素酸カルシウムの影響
【０１３２】
【表１６】
実施例１３ 尿素過酸化水素塩はトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１３３】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を５％尿素過酸化水素塩（ＣＡＳ＃１２４−４３−６）に、８０℃で２４時間接触させた。この茎葉を洗浄して化学薬剤を稀釈し、ｐＨを調整してｐＨ５．２とした。さらに０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物を４０℃で４８時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。尿素過酸化水素塩処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表１７）。
【０１３４】
表１７ 茎葉加水分解に対する尿素過酸化水素塩の影響
【０１３５】
【表１７】
実施例１４ Ｎ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシドはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１３６】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を７５％のＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシド（ＮＭＭＯ）（ＣＡＳ＃７５２９−２２−８）に、８０℃で２４時間接触させた。次にこのＮＭＭＯを稀釈し、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で４８時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。ＮＭＭＯ処理はスペザイム単独での処理によって遊離される量を超えて糖を遊離させることが認められた（表１８）。
【０１３７】
表１８ 茎葉加水分解に対するＮ−メチルモルホリン−Ｎ−オキシドの影響
【０１３８】
【表１８】
実施例１５ 過炭酸ナトリウムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１３９】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を２．５％の過炭酸ナトリウム（ＣＡＳ＃１５６３０−８９−４）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で２４時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。過炭酸ナトリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表１９）。
【０１４０】
表１９ 茎葉加水分解に対する過炭酸ナトリウムの影響
【０１４１】
【表１９】
実施例１６ 過硫酸カリウムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１４２】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を１％の過硫酸カリウム（ＣＡＳ＃７７２７−２１−１）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で２４時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。過硫酸カリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２０）。
【０１４３】
表２０ 茎葉加水分解に対する過硫酸カリウムの影響
【０１４４】
【表２０】
実施例１７ ペルオキシ酢酸処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１４５】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）をペルオキシ酢酸（最終濃度１％）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。ペルオキシ酢酸処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２１）。
【０１４６】
表２１ 茎葉加水分解に対するペルオキシ酢酸の影響
【０１４７】
【表２１】
実施例１８ 超酸化カリウム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１４８】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を超酸化カリウム（最終濃度０．５％）に、８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。超酸化カリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２２）。
【０１４９】
表２２ 茎葉加水分解に対する超酸化カリウムの影響
【０１５０】
【表２２】
実施例１９ 炭酸ナトリウム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１５１】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を炭酸ナトリウム（最終濃度０．６７％）に接触させてｐＨ１０．０の混合物を作り、これを８０℃で２４時間インキュベートした。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。炭酸ナトリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２３）。
【０１５２】
表２３ 茎葉加水分解に対する炭酸ナトリウムの影響
【０１５３】
【表２３】
実施例２０ 水酸化カリウム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１５４】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を水酸化カリウム（最終濃度７５ ｍＭ）に接触させてｐＨ１２．３の混合物を作り、８０℃で２４時間インキュベートした。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。水酸化カリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２４）。
【０１５５】
表２４ 茎葉加水分解に対する水酸化カリウムの影響
【０１５６】
【表２４】
実施例２１ 過炭酸ナトリウム処理によってトウモロコシ繊維及びディスティラーの乾燥粒、サトウキビバガス、使用済み大麦麦芽の加水分解が増進する。
【０１５７】
トウモロコシ繊維及びディスティラーの乾燥粒、サトウキビバガス、使用済み大麦麦芽（１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を、それぞれ過炭酸ナトリウム（最終濃度１．０％）に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析及びＨＰＬＣによって測定した。過炭酸ナトリウム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２５）。
【０１５８】
表２５ 様々なバイオマス原料に対する過炭酸ナトリウム処理の影響
【０１５９】
【表２５】
実施例２２ リサイクル過炭酸ナトリウムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１６０】
トウモロコシ茎葉（２００ ｍＬの最終反応物中に２０ｇ）を過炭酸ナトリウム（最終濃度５．０％）に８０℃で２４時間接触させた。上清を除去し、糖類の有無をＤＮＳ分析によって測定した。糖濃度は１％未満であった。この上清（１０ ｍＬ）に新たなトウモロコシ茎葉（１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を８０℃で２４時間接触させた。別の反応として、新たに準備した過炭酸ナトリウム（最終濃度５．０％）に新たなトウモロコシ茎葉（１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を８０℃で２４時間接触させた。各試料のｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定した。リサイクル過炭酸ナトリウム溶液処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進することが認められた（表２６）。
【０１６１】
表２６ リサイクル過炭酸ナトリウムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０１６２】
【表２６】
実施例２３ 複合処理によって、リグノセルロースからさらに糖が遊離する。
【０１６３】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、１０ ｍＬの最終反応物中に０．２ ｇ）を０．２％の過酸化水素に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で７２時間インキュベートした。遊離した糖をＤＮＳ分析によって測定し、各試料を洗浄して可溶性糖類を除去した。次に、過酸化水素（０．２％）もしくは尿素過酸化水素塩（５％）、次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）、次亜塩素酸カルシウム（有効塩素１％）、ＮＭＭＯ（７５％）を各試料に加え、８０℃で２４時間インキュベートした。化学薬剤を加えないコントロールも調製した。化学薬剤の稀釈（ＮＭＭＯ）もしくはｐＨ５．２となるようｐＨの調整のみ（過酸化水素、次亜塩素酸ナトリウム、次亜塩素酸カルシウム、尿素過酸化水素塩、薬剤無し）を行った後、０．３ ｍＬのスペザイムを加えて反応物を４０℃で７２時間インキュベートした。二次スペザイム処理は、これに先立って二次化学処理を行う場合に、糖の遊離を増進することが認められた（表２７）。
【０１６４】
表２７ 茎葉の加水分解に対する複合処理の効果
【０１６５】
【表２７】
実施例２４ 過酸化水素処理によって乳酸産生を支持するリグノセルロース及び加水分解物が生じる。
【０１６６】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉）を０．２％の過酸化水素に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で７２時間インキュベートした。加水分解物から残余固形物を分離し、洗浄して水中に懸濁し、乳酸産生細菌を含むと周知されている市販のサイレージ用接種物（Ｂｉｏｔａｌ Ｓｉｌａｇｅ ＩＩ Ｉｎｏｃｕｌａｎｔ，Ｂｉｏｔａｌ Ｉｎｃ．）を０．０１ ｇ加えた。３７℃で２４時間発酵を行い、細菌の増殖を顕微鏡的に確認した。同様に、その後の各処理で生じた加水分解物を調整してｐＨ ７．０とし、濾過滅菌して炭素を含まない最小塩培地（強化最小培地（ＥＭＭ））に混合した。ＥＭＭにはＡ溶液（９００ ｍｌ中：２ ｇ ＮａＮＯ３，１．０ ｍｌ ０．８ Ｍ ＭｇＳＯ４，１．０ ｍｌ ０．１ Ｍ ＣａＣｌ２，１．０ ｍｌ 微量元素溶液（１０００倍容液１００ ｍｌ中：０．１ ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，０．５ ｍｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，１．０ ｍｇ Ｈ３ＢＯ３， １．０ ｍｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，７．０ ｍｇ Ｚｎ ＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，１．０ ｍｇ ＭｏＯ３，４．０ ｇ ＫＣｌ））とＢ溶液 （１００ ｍｌ中：０．２１ ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４，０．０９ ｇ ＮａＨ２ＰＯ４，ｐＨ ７．０）とが含まれ、Ａ６００＝０．５までＭＲＳブロスにて増殖させたＢｉｏｔａｌ社の接種物を２回洗浄して１：１０００に稀釈し、接種した。培養後、乳酸を酵素的に変換させてピルビン酸を産生させてから（Ｄｉｆｆｃｈａｍｂ社）ブロス発酵物（茎葉残余物及び茎葉加水分解物）の発酵物液体中のＮＡＤＨ（３４０ ｎｍ）産生を測定した（表２８）。この結果から、トウモロコシ茎葉と生成された加水分解物の両方とも乳酸菌の増殖を支持することができ、乳酸産生を支持することができる。
【０１６７】
表２８ トウモロコシ茎葉を過酸化水素処理した後の乳酸産生
【０１６８】
【表２８】
実施例２５ トウモロコシ繊維を過酸化水素処理すると、乳酸産生を支持する加水分解物と残余固形物が生じる。
【０１６９】
リグノセルロース（トウモロコシ繊維）を０．２％過酸化水素に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ５．２とし、０．３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加えて反応物を４０℃で４８時間インキュベートした。残余固形物（０．２ ｇ）を加水分解物から分離して洗浄し、水に懸濁して乳酸産生細菌が含まれることが周知されている市販のサイレージ用接種物（Ｂｉｏｔａｌ Ｓｉｌａｇｅ ＩＩ Ｉｎｏｃｕｌａｎｔ，Ｂｉｏｔａｌ Ｉｎｃ．）を０．０１ 加えた。３７℃で２４時間発酵させ、細菌の増殖を顕微鏡的に確認した。処理後に生成された加水分解物をｐＨ７．０に調整し、濾過滅菌して炭素を含まない最小塩培地（ＥＭＭ）と混合した。さらにこれにＡ６００＝０．５までＭＲＳブロスにて増殖させたＢｉｏｔａｌ社の接種菌培養物を洗浄して１：１０００に稀釈し、接種した。この発酵は３７℃で６４時間行った。培養後、乳酸を酵素変換してピルビン酸を産生させてから双方の発酵物（茎葉残余固形物及び茎葉加水分解物）の発酵物液体中のＮＡＤＨ（３４０ ｎｍ）産生を分析した（Ｄｉｆｆｃｈａｍｂ）（表２９）。これにより、トウモロコシ繊維残余固形物及び生成された加水分解物の双方とも乳酸菌の増殖を支持することができ、乳酸産生を支持することができる。
【０１７０】
表２９ トウモロコシ繊維を過酸化水素処理した後の乳酸産生
【０１７１】
【表２９】
実施例２６ 酸化剤処理によって乳酸産生を支持する加水分解物が生じる。
【０１７２】
トウモロコシ茎葉を８０℃で２４時間、過酸化水素（０．２％）で処理し、ｐＨ ５．２に調製してさらに０．３ ｍＬのスペザイムを４０℃で１４４時間処理した。次にこの茎葉をすすぎ、滅菌して１グラムを尿素過酸化水素塩（５％）に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調整してｐＨ ５．２とした後、４０℃で４８時間、０．３ ｍＬのスペザイムを添加した。同様に、１．５ ｇの新鮮トウモロコシ茎葉を次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）に８０℃で２４時間接触させ、ｐＨ ５．２に調製してさらに０℃で４８時間、０．３ ｍＬのスペザイム ＣＰを添加した。次に双方の加水分解物をｐＨ ７．０に調製し、濾過滅菌して全糖類濃度０．２％で炭素を含まない最小塩培地（ＥＭＭ）と混合した。混合乳酸接種菌調製物（Ｂｉｏｔａｌ Ｓｉｌａｇｅ Ｉｎｏｃｕｌａｎｔ ＩＩ，Ｂｉｏｔａｌ Ｉｎｃ．）を含むＭＲＳブロス（Ｄｉｆｃｏ）中の種培養物をＡ６００＝０．５まで増殖させ、２回洗浄して１：１０００に稀釈しし、各培地に加えて３７℃で６４時間培養した。培養後、乳酸を酵素変換してピルビン酸を産生させてから双方の発酵物（尿素過酸化水素塩処理及び次亜塩素酸ナトリウム処理）の発酵物液体中のＮＡＤＨ（３４０ ｎｍ）産生を分析した（Ｄｉｆｆｃｈａｍｂ）（表３０）。これにより、リグノセルロース質物質を酸化剤で処理して出来る加水分解物を乳酸産生細菌は利用することができ、これを乳酸産生に利用することができる。
【０１７３】
表３０ 酸化剤処理後の乳酸産生
【０１７４】
【表３０】
実施例２７ 化学処理によってできる加水分解物は微生物の増殖を支持する。
【０１７５】
数種類のトウモロコシ茎葉を化学処理を用いて調製し、１０ ｍＬの反応物とした。
スペザイムのみ：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）をｐＨ ５．２、４０℃で４８時間処理した。
【０１７６】
過酸化水素：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に０．２％過酸化水素を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１７７】
次亜塩素酸ナトリウム：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰで処理した（４０℃で４８時間）。
【０１７８】
次亜塩素酸ナトリウム且つ稀釈：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）を処理し（８０℃で２４時間）、洗浄して化学薬剤を稀釈し、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１７９】
尿素過酸化水素塩：１．５ ｇのトウモロコシ茎葉に０．２％過酸化水素を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。次にこれを１０％尿素過酸化水素塩で処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８０】
過炭酸ナトリウム：０．２ ｇのトウモロコシ茎葉に２．５％の過炭酸ナトリウムを処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８１】
過硫酸カリウム：０．２ ｇのトウモロコシ茎葉に１．０％の過硫酸カリウムを処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８２】
硝酸：０．２ ｇのトウモロコシ茎葉に１．０％の硝酸を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８３】
加えて、過酸化水素を使用してトウモロコシ繊維加水分解物を調製した。：２ ｇのトウモロコシ繊維に０．２％の過酸化水素を処理し（８０℃で２４時間）、ｐＨ ５．２に調整して次に０．３ ｍＬ スペザイム ＣＰを処理した（４０℃で４８時間）。
【０１８４】
スペザイム処理後、各加水分解物を調整してｐＨ ７．０とし、濾過滅菌して次に最終糖類濃度０．２％の炭素を含まない最小塩培地（ＥＭＭ）に加えた。糖類を含まない陰性コントロールも調製した。各加水分解物に代表的細菌株（ＡＴＸ３６６１）を接種し、３７℃で１４時間（糖類無し、次亜塩素酸ナトリウム且つ稀釈、尿素過酸化水素塩、過炭酸ナトリウム、過硫酸カリウム、過酸化水素）あるいは４０時間（過酸化水素）あるいは４８時間（スペザイムのみ、次亜塩素酸ナトリウム）培養した。各培養物の増殖を６００ ｎｍの吸光度によって測定した（表３１）。各実験における糖類を含まないコントロールの吸光度（６００ ｎｍ）は０．００５未満であった。
【０１８５】
これにより、様々な化学薬剤でリグノセルロース質物質を処理してできる加水分解物は細菌の増殖を支持する。
【０１８６】
表３１ 軽度の化学処理後の細菌増殖
【０１８７】
【表３１】
実施例２８ トウモロコシ茎葉加水分解物は細菌増殖のための成分を提供する。
【０１８８】
ＡＴＸ３６６１は、最小培地（ＥＭＭ）でグルコースあるいはグルコース・キシロース混合物を添加しても増殖することのないＢａｃｉｌｌｕｓ株である。即ち、ＡＲＸ３６６１はこの培地中で増殖するためにグルコースとキシロース以外の別の栄養素を必要とする。
【０１８９】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉）を過酸化水素（０．２％）もしくは次亜塩素酸ナトリウム（有効塩素１％）と接触させ、８０℃で２４時間インキュベートした。ｐＨを調製してｐＨ ５．２として０．３ ｍｌのスペザイムＰＣ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物を４０℃で１４４時間（次亜塩素酸ナトリウム）もしくは４８時間（過酸化水素）インキュベートした。化学処理を行わないトウモロコシ茎葉試料を実験に含め、スペザイムを４０℃で２４時間処理した。スペザイム処理後に生成した加水分解物を調整してｐＨ ７．０とし、濾過滅菌して全糖類濃度０．２０％（過酸化水素）もしくは０．１５％（次亜塩素酸ナトリウム、スペザイムのみ）の炭素を含まない最小塩培地と混合した。加水分解物の代わりにグルコース（０．０９５％）及びキシロース（０．０５５％）を加えたコントロール培地（「グルコース・キシロース」）と加水分解物を加えないコントロール培地（「糖類無し」）とを準備した。次に、各培地に代表的な細菌株（ＡＴＸ３６６１）を接種し、３７℃で４８時間（次亜塩素酸ナトリウム、スペザイムのみ、糖類無し、グルコース・キシロース）もしくは４０時間（過酸化水素）培養した。各培養物の増殖を６００ ｎｍの吸光度によって検出した（表３２）。予期した通り、ＡＴＸ３６６１はグルコースとキシロースを添加したＥＭＭでは増殖しなかった。驚くべきことに、ＡＴＸ３６６１は加水分解物を添加した場合に増殖を示した。このことから、加水分解物は純粋な糖が支持しない細菌株の増殖を支持する。
【０１９０】
表３２ 細菌増殖に対する加水分解物の影響
【０１９１】
【表３２】
実施例２９ 過酸化水素処理並びに過炭酸ナトリウム処理は紙の加水分解を増進する。
【０１９２】
多用途コピー用紙（０．２ ｇ Ｑｕｉｌｌ，＃７−２０２２２）と細断し（平均粒子サイズ＝５ ｍｍ）、容量１０ ｍＬの過酸化水素（最終濃度０．３％）あるいは過炭酸ナトリウム（最終濃度１．０％）に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調製してｐＨ ５．２として０．３ ｍｌのスペザイムＰＣ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物と４０℃で９６時間インキュベートした。糖類の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。過酸化水素処理はスペザイム単独での処理よりも糖類の遊離を増進することが認められた（表３３）。
【０１９３】
表３３ 紙加水分解に対する過酸化水素並びに過炭酸ナトリウムの影響
【０１９４】
【表３３】
実施例３０ 前処理の過程で過炭酸ナトリウム並びに超酸化カリウムはトウモロコシ茎葉のタンパク質を可溶化する。
【０１９５】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、最終反応物１０ ｍＬ中に０．２ ｇ）を過炭酸ナトリウム（最終濃度１．０％）もしくは超酸化カリウム（最終濃度０．５％）に８０℃で２４時間接触させた。ｐＨを調製してｐＨ ５．２とし、上清を可溶化タンパク質の有無について試験した（バイオ・ラッドタンパク質分析）。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用して定量のための標準曲線を作成した。過炭酸ナトリウムもしくは超酸化カリウム処理はトウモロコシ茎葉中のタンパク質を可溶化することが認められた（表３４）。
【０１９６】
表３４ 過炭酸ナトリウムもしくは超酸化カリウムの前処理後に可溶化タンパク質が産生する。
【０１９７】
【表３４】
実施例３１ ｐＨ ５での次亜塩素酸ナトリウイム処理によってトウモロコシ茎葉の加水分解が増進する。
【０１９８】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、最終反応物１０ ｍＬ中に０．２ ｇ）に次亜塩素酸ナトリウイム（有効塩素１％、最終濃度）を８０℃で２４時間接触させた。２００ ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液で緩衝して一定のｐＨ、ｐＨ ５に保った。緩衝液のみの陰性コントロールも処理した。０．０３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物を４０℃で９６時間インキュベートした。糖の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。ｐＨ ５での次亜塩素酸ナトリウイム処理はスペザイム単独での処理よりも糖の遊離を増進すると認められた（表３５）。
【０１９９】
表３５ ｐＨ ５．０に緩衝された次亜塩素酸ナトリウイムはトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０２００】
【表３５】
実施例３２ 酢酸及び硫酸存在下で、ペルオキシ酢酸処理はトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０２０１】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、最終反応物１０ ｍＬ中に０．２ ｇ）にペルオキシ酢酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、最終濃度２．０％）を接触させた。この化学薬剤は酢酸及び硫酸も含有していることから、酢酸（最終濃度２．６％）及び硫酸（最終濃度０．０６％）の混合物をコントロールとして使用した。反応物は８０℃で２４時間インキュベートした。次に両反応物に０．０３ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え４０℃で２４時間インキュベートした。糖の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。ペルオキシ酢酸は茎葉から糖を遊離させることが認められた（表３６）。
【０２０２】
表３６ ペルオキシ酢酸の前処理はトウモロコシ茎葉の加水分解を増進する。
【０２０３】
【表３６】
実施例３３ 過炭酸ナトリウム並びに次亜塩素酸ナトリウム、ペルオキシ酢酸による前処理によって、低濃度の酵素での加水分解が可能となる。
【０２０４】
リグノセルロース（トウモロコシ茎葉、最終反応物１０ ｍＬ中に０．２ ｇ）に、過炭酸ナトリウム（最終濃度１．０％）もしくは次亜塩素酸ナトリウム（遊離塩素１．０％、最終濃度）、ペルオキシ酢酸（最終濃度２．０％）を８０℃で２４時間接触させた。０．０３ ｍＬもしくは０．０１２ ｍＬ、０００６ ｍＬのスペザイムＣＰ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）を加え、反応物を４０℃で１２０時間インキュベートした。糖類の遊離をＤＮＳ分析によって測定した。過炭酸ナトリウム並びに次亜塩素酸ナトリウム、ペルオキシ酢酸での前処理によって、使用する酵素が低濃度であっても加水分解が可能となった（表３７）。
【０２０５】
表３７ 過炭酸ナトリウム並びに次亜塩素酸ナトリウム、ペルオキシ酢酸による前処理によって、低濃度の酵素での加水分解が可能となる。
【０２０６】
【表３７】
結論
上記に示した結果は、本発明の方法がリグノセルロース分解に有用な多数の利点を提供することを立証している。これらの利点には以下が含まれる：（１）簡単な手順で反応物を使用することができる、（２）当該工程で使用する酵素の量を減らすことができる、（３）高い濃度の糖溶液を生成して利用することができる、（４）毒性生成物が生じないため、処理した生成物はさらに加工する必要がなく、発酵に直接使用することができる。また、これらの利点から経済的利益が導かれる。
【０２０７】
この明細書で記載されている全ての出版物及び特許出願は、本発明が属する分野の技術者の標準的技術を示している。全ての出版物及び特許出願は、個々の出版物あるいは特許出願が具体的且つ個別に参考のため添付されていると示してあるものと同範囲に、参考のためこの明細に添付する。
【０２０８】
前記発明は、明確な理解という目的のための説明及び例示のためにいくらか詳細に記載されているが、一定の変更並びに改変を附属する請求項の範囲内で実施することが可能なことは明白であるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２０９】
【図１】図１は、Ｈ２Ｏ２及びセルラーゼ処理をして、トウモロコシ葉茎から可溶化した糖類（ブドウ糖とキシロース）のクロマトグラムを示す。
【図２】図２は、様々な濃度の過酸化水素のみによる処理あるいは酵素を併用した処理の後に、トウモロコシ葉茎から遊離された還元糖の量（ＤＮＳ法によって測定。）を示す。
【図３】図３は、処理後２４時間目の、残留する過酸化水素のパーセンテージと合わせて同時点での還元糖の量を示す。
【図４】図４は、６００ ｎｍにおける吸光度から測定された微生物の増殖量を、培地中の糖（トウモロコシ葉茎の糖類もしくはブドウ糖とキシロース）のパーセンテージと比較して示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該化学物質が、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、およびこれらの組合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
からなる群より選択される少なくとも２つの条件を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、過酸化水素、尿素過酸化水素、過酸化ベンゾイル、スーパーオキシド、スーパーオキシドカリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過酸化物、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン酸塩、四酸化オスミウム、酸化クロム、およびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される酸化剤を含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、有機溶媒を含む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、変性剤を含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、界面活性剤を含む、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、塩基を含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記リグノセルロースを、粉砕、ミリング、煮沸、凍結、および減圧濾過からなる群より選択される少なくとも１つの物理的処理に供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、約８０℃の温度を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、約ｐＨ ５．０のｐＨを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記接触が、約２４時間にわたって生じる、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記酵素が、セルラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、およびグルクロニダーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、酵素の添加前に、前記温度が、該酵素にとって最適であるように調整される、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、酵素の添加前に、前記ｐＨが、該酵素にとって最適であるように調整される、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記酵素の添加前に、前記化学物質が、除去される、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、リサイクル化学物質を得るためのさらなる処理前に、前記処理したリグノセルロースから前記化学物質を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記リグノセルロースと、少なくとも１つの化学物質とを接触させる工程が、該リグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程と同時に生じる、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも１つの発酵生物の添加工程をさらに包含し、ここで、該方法が、少なくとも１つの発酵ベースの生成物の生産をもたらす、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記生成物が、乳酸、燃料、有機酸、産業的酵素、医薬品、およびアミノ酸からなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
リグノセルロース材料を前処理するための方法であって、中程度条件下で該材料と少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程を包含し、ここで、該化学物質が、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、およびこれらの組合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２２】
植物材料から物質を遊離するための方法であって、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
からなる群より選択される少なくとも１つの条件下で該植物材料と少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理した植物材料を産生する工程を包含し、ここで、該化学物質が、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、およびこれらの組合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記処理した植物材料と、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記植物材料が、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記植物材料が、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝学的に操作されている少なくとも１つの植物を含む、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記植物材料と前記化学物質とを接触させる前に、リグノセルロースを加水分解し得る前記酵素を発現可能な条件下で該植物材料をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記物質が、酵素、医薬品、および機能性食品からなる群より選択される、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記植物材料が、前記物質を発現するように遺伝学的に操作されている少なくとも１つの植物を含む、方法。
【請求項２９】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該化学物質が、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過酸化物、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン酸塩、四酸化オスミウム、酸化クロム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、および酸素ラジカルを産生し得る化合物からなる群より選択される酸化剤である、方法。
【請求項３０】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、約９．０〜約１４．０のｐＨで該リグノセルロースと塩基とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記塩基が、炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウムである、方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該化学物質が、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、およびこれらの組合わせからなる群より選択され、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、有機溶媒を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、変性剤を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、界面活性剤を含む、方法。
【請求項５】
リグノセルロース材料を前処理するための方法であって、中程度条件下で該材料と少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程を包含し、ここで、該化学物質が、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、およびこれらの組合わせからなる群より選択され、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
を含む、方法。
【請求項６】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該化学物質が、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン酸塩、四酸化オスミウム、酸化クロム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、尿素過酸化水素、過酸化ベンゾイル、スーパーオキシド、およびスーパーオキシドカリウムからなる群より選択される酸化剤である、方法。
【請求項７】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、約９．０〜約１４．０のｐＨで該リグノセルロースと塩基とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該塩基が、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化セシウム、水酸化ルビジウム、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化スズ（ＩＩ）、および水酸化鉄からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと酸化剤とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ ６．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項９】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと酸化剤とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約８０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１０】
リグノセルロース材料を前処理するための方法であって、中程度条件下で該材料と酸化剤とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ ６．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１１】
リグノセルロース材料を前処理するための方法であって、中程度条件下で該材料と酸化剤とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約８０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記酸化剤が、過酸化水素、尿素過酸化水素、過酸化ベンゾイル、スーパーオキシド、スーパーオキシドカリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過酸化物、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン酸塩、四酸化オスミウム、酸化クロム、およびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される、方法。
【請求項１３】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと、約ｐＨ ４．０と約ｐＨ ６．０との間のｐＨで酸素ラジカルを産生し得る化合物とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１４】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと、約８０℃の温度で酸素ラジカルを産生し得る化合物とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１５】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと、約４．０〜約１０．０のｐＨでペルオキシ酸とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１６】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと少なくとも１つの塩基とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ ８．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記リグノセルロースを、粉砕、ミリング、煮沸、凍結、および減圧濾過からなる群より選択される少なくとも１つの物理的処理に供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１〜８、１０、１３、１５、または１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、約８０℃の温度を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１〜６、８〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、約ｐＨ ５．０のｐＨを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記接触が、約２４時間にわたって生じる、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記酵素が、セルラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、およびグルクロニダーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、酵素の添加前に、前記温度が、該酵素にとって最適であるように調整される、方法。
【請求項２３】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記酵素の添加前に、前記ｐＨが、該酵素にとって最適であるように調整される、方法。
【請求項２４】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記酵素の添加前に、前記化学物質が、除去される、方法。
【請求項２５】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、リサイクル化学物質を得るためのさらなる処理前に、前記処理したリグノセルロースから前記化学物質を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記リグノセルロースと、少なくとも１つの化学物質とを接触させる工程が、該リグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程と同時に生じる、方法。
【請求項２７】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、少なくとも１つの発酵生物の添加工程をさらに包含し、ここで、該方法が、少なくとも１つの発酵ベースの生成物の生産をもたらす、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記生成物が、乳酸、燃料、有機酸、産業的酵素、医薬品、およびアミノ酸からなる群より選択される、方法。
【請求項２９】
トランスジェニック植物材料から物質を遊離するための方法であって、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
の条件下で該植物材料と少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理した植物材料を産生する工程を包含し、ここで、該化学物質が、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、およびこれらの組合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記処理した植物材料と、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記トランスジェニック植物材料が、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝学的に操作されている少なくとも１つの植物を含む、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記植物材料と前記化学物質とを接触させる前に、リグノセルロースを加水分解し得る前記酵素の発現が可能な条件下で該植物材料をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記物質が、酵素、医薬品、および機能性食品からなる群より選択される、方法。
【請求項１】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該化学物質が、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、およびこれらの組合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
からなる群より選択される少なくとも２つの条件を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、過酸化水素、尿素過酸化水素、過酸化ベンゾイル、スーパーオキシド、スーパーオキシドカリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過酸化物、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン酸塩、四酸化オスミウム、酸化クロム、およびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される酸化剤を含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、有機溶媒を含む、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、変性剤を含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、界面活性剤を含む、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、塩基を含む、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記リグノセルロースを、粉砕、ミリング、煮沸、凍結、および減圧濾過からなる群より選択される少なくとも１つの物理的処理に供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、約８０℃の温度を含む、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、約ｐＨ ５．０のｐＨを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記接触が、約２４時間にわたって生じる、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記酵素が、セルラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、およびグルクロニダーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、酵素の添加前に、前記温度が、該酵素にとって最適であるように調整される、方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法であって、ここで、酵素の添加前に、前記ｐＨが、該酵素にとって最適であるように調整される、方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記酵素の添加前に、前記化学物質が、除去される、方法。
【請求項１７】
請求項１に記載の方法であって、リサイクル化学物質を得るためのさらなる処理前に、前記処理したリグノセルロースから前記化学物質を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記リグノセルロースと、少なくとも１つの化学物質とを接触させる工程が、該リグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程と同時に生じる、方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、少なくとも１つの発酵生物の添加工程をさらに包含し、ここで、該方法が、少なくとも１つの発酵ベースの生成物の生産をもたらす、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、ここで、前記生成物が、乳酸、燃料、有機酸、産業的酵素、医薬品、およびアミノ酸からなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
リグノセルロース材料を前処理するための方法であって、中程度条件下で該材料と少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程を包含し、ここで、該化学物質が、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、およびこれらの組合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２２】
植物材料から物質を遊離するための方法であって、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
からなる群より選択される少なくとも１つの条件下で該植物材料と少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理した植物材料を産生する工程を包含し、ここで、該化学物質が、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、およびこれらの組合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記処理した植物材料と、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、ここで、前記植物材料が、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、ここで、前記植物材料が、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝学的に操作されている少なくとも１つの植物を含む、方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記植物材料と前記化学物質とを接触させる前に、リグノセルロースを加水分解し得る前記酵素を発現可能な条件下で該植物材料をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項２７】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記物質が、酵素、医薬品、および機能性食品からなる群より選択される、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記植物材料が、前記物質を発現するように遺伝学的に操作されている少なくとも１つの植物を含む、方法。
【請求項２９】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該化学物質が、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過酸化物、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン酸塩、四酸化オスミウム、酸化クロム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、および酸素ラジカルを産生し得る化合物からなる群より選択される酸化剤である、方法。
【請求項３０】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、約９．０〜約１４．０のｐＨで該リグノセルロースと塩基とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法であって、ここで、前記塩基が、炭酸ナトリウムまたは水酸化カリウムである、方法。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該化学物質が、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、およびこれらの組合わせからなる群より選択され、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
を含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、有機溶媒を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、変性剤を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、ここで、前記化学物質が、界面活性剤を含む、方法。
【請求項５】
リグノセルロース材料を前処理するための方法であって、中程度条件下で該材料と少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程を包含し、ここで、該化学物質が、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、およびこれらの組合わせからなる群より選択され、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
を含む、方法。
【請求項６】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該化学物質が、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン酸塩、四酸化オスミウム、酸化クロム、ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム、尿素過酸化水素、過酸化ベンゾイル、スーパーオキシド、およびスーパーオキシドカリウムからなる群より選択される酸化剤である、方法。
【請求項７】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、約９．０〜約１４．０のｐＨで該リグノセルロースと塩基とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該塩基が、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化セシウム、水酸化ルビジウム、水酸化バリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化スズ（ＩＩ）、および水酸化鉄からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと酸化剤とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ ６．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項９】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと酸化剤とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約８０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１０】
リグノセルロース材料を前処理するための方法であって、中程度条件下で該材料と酸化剤とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ ６．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１１】
リグノセルロース材料を前処理するための方法であって、中程度条件下で該材料と酸化剤とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約８０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１２】
請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記酸化剤が、過酸化水素、尿素過酸化水素、過酸化ベンゾイル、スーパーオキシド、スーパーオキシドカリウム、次亜塩素酸塩、次亜塩素酸、塩素、硝酸、過酸化物、ペルオキシ酢酸、過硫酸塩、過炭酸塩、過マンガン酸塩、四酸化オスミウム、酸化クロム、およびドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウムからなる群より選択される、方法。
【請求項１３】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと、約ｐＨ ４．０と約ｐＨ ６．０との間のｐＨで酸素ラジカルを産生し得る化合物とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１４】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと、約８０℃の温度で酸素ラジカルを産生し得る化合物とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１５】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、該リグノセルロースと、約４．０〜約１０．０のｐＨでペルオキシ酸とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含する、方法。
【請求項１６】
リグノセルロースを加水分解するための方法であって、中程度条件下で該リグノセルロースと少なくとも１つの塩基とを接触させて、処理したリグノセルロースを産生する工程、および該処理したリグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程を包含し、ここで、該中程度条件が、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ ８．０との間のｐＨ；
を含み、該方法が、強酸処理を包含しない、方法。
【請求項１７】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記リグノセルロースを、粉砕、ミリング、煮沸、凍結、および減圧濾過からなる群より選択される少なくとも１つの物理的処理に供する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
請求項１〜８、１０、１３、１５、または１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、約８０℃の温度を含む、方法。
【請求項１９】
請求項１〜６、８〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記中程度条件が、約ｐＨ ５．０のｐＨを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記接触が、約２４時間にわたって生じる、方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記酵素が、セルラーゼ、キシラナーゼ、リグニナーゼ、アミラーゼ、グルクロニダーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、およびグルクロニダーゼからなる群より選択される少なくとも１つの酵素を含む、方法。
【請求項２２】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、酵素の添加前に、前記温度が、該酵素にとって最適であるように調整される、方法。
【請求項２３】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記酵素の添加前に、前記ｐＨが、該酵素にとって最適であるように調整される、方法。
【請求項２４】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記酵素の添加前に、前記化学物質が、除去される、方法。
【請求項２５】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、リサイクル化学物質を得るためのさらなる処理前に、前記処理したリグノセルロースから前記化学物質を除去する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２６】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記リグノセルロースと、少なくとも１つの化学物質とを接触させる工程が、該リグノセルロースと、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程と同時に生じる、方法。
【請求項２７】
請求項１〜１１または１３〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、少なくとも１つの発酵生物の添加工程をさらに包含し、ここで、該方法が、少なくとも１つの発酵ベースの生成物の生産をもたらす、方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、ここで、前記生成物が、乳酸、燃料、有機酸、産業的酵素、医薬品、およびアミノ酸からなる群より選択される、方法。
【請求項２９】
トランスジェニック植物材料から物質を遊離するための方法であって、以下：
ａ）約１０℃〜約９０℃の温度；
ｂ）約２ａｔｍ未満の圧力；および
ｃ）約ｐＨ ４．０と約ｐＨ １０．０との間のｐＨ、
の条件下で該植物材料と少なくとも１つの化学物質とを接触させて、処理した植物材料を産生する工程を包含し、ここで、該化学物質が、酸化剤、変性剤、界面活性剤、有機溶媒、塩基、およびこれらの組合わせからなる群より選択される、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記処理した植物材料と、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素とを接触させる工程をさらに包含する、方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記トランスジェニック植物材料が、リグノセルロースを加水分解し得る少なくとも１つの酵素を発現するように遺伝学的に操作されている少なくとも１つの植物を含む、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、前記植物材料と前記化学物質とを接触させる前に、リグノセルロースを加水分解し得る前記酵素の発現が可能な条件下で該植物材料をインキュベートする工程を包含する、方法。
【請求項３３】
請求項２９に記載の方法であって、ここで、前記物質が、酵素、医薬品、および機能性食品からなる群より選択される、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００６−５１９６０６（Ｐ２００６−５１９６０６Ａ）
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０６９６２（Ｐ２００６−５０６９６２）
【出願日】平成１６年３月８日（２００４．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７０８６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１１８５
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５０４４０５５３４）アセニクス コーポレイション (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月８日（２００４．３．８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／００７０８６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０８１１８５
【国際公開日】平成１６年９月２３日（２００４．９．２３）
【出願人】（５０４４０５５３４）アセニクス コーポレイション (3)
【Ｆターム（参考）】
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