リコンビナーゼポリメラーゼ増幅
本開示において、リコンビナーゼおよび関連するタンパク質の特性を利用し、ＤＮＡポリメラーゼ反応の配列特異的なプライミングを可能にする単鎖相同性ＤＮＡを有する二本鎖ＤＮＡ侵入する、標的ＤＮＡのリコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）に関連する新規な方法を記載する。開示する方法は、熱サイクリングまたは好熱性酵素を必要とせず、したがって、他の増幅方法よりも容易で手ごろな実施および携帯性を提供するという利点を有する。さらに、ＲＰＡ反応のリアルタイムモニタリングを可能にする条件、光を用いてＲＰＡ反応を調節する方法、あるいは、増幅種の性質をゲル電気泳動の必要なく測定する方法、ＲＰＡ反応におけるシグナル対ノイズ比を改善および最適化する方法、オリゴヌクレオチドプライマー機能を最適化する方法、キャリーオーバー混入物を防除する方法、ならびに配列特異的第３の「特異性」プローブを用いる方法を開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１および第２のＤＮＡ鎖を含む二本鎖標的核酸分子のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）溶液中で、ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子を第１の核酸プライマーおよび第２の核酸プライマーと接触させ、第１の核タンパク質プライマーおよび第２の核タンパク質プライマーを形成する工程であって、該核酸プライマーは単鎖領域をその３’末端に含む、工程；
（ｂ）該第１の核タンパク質プライマーおよび該第２の核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸分子と接触させ、それにより：
（１）該第１の鎖の第１の部分における第１の二本鎖構造、および
（２）該第２の鎖の第２の部分における第２の二本鎖構造
を、該第１の核タンパク質プライマーの３’末端および該第２の核タンパク質プライマーの３’末端が、同じ二本鎖鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるように形成する工程；
（ｃ）該第１の核タンパク質プライマーの３’末端および第２の核タンパク質プライマーの３’末端を、ｄＮＴＰおよび鎖置換特性を有する１種類以上のＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、第１および第２の二本鎖核酸生成物と、核酸生成物の第１および第２の被置換鎖とを生成する工程；ならびに
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）を、所望の増幅度に達するまで反復する工程
を含み、ここで、
該核酸生成物は、工程（ｄ）において二本鎖標的配列としての機能を果たし得る；
該溶液は、さらにｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、工程（ａ）で該第１のプライマーおよび該第２のプライマーを飽和させるのに充分なの濃度で含む；
該溶液は、さらにリコンビナーゼ負荷因子ｕｖｓＹを、０．２〜８マイクロモル濃度で含み；
該溶液は、さらにクラウディング剤を１％〜１２％の濃度で含む；
該１種類以上のＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性を欠くものである；
該溶液が、ｕｖｓＸ負荷ＤＮＡフィラメントの分解および合成を補助するのに充分な加水分解性ヌクレオシド三リン酸をさらに含む；ならびに
該反応は、２０℃〜５０℃の温度で行なわれる、
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２】
前記核酸生成物の第１および第２の被置換鎖が、前記第１または第２の核タンパク質プライマーとの同時のリコンビナーゼポリメラーゼ反応によって二本鎖ＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸の第１および第２の被置換鎖が、
（ａ）前記第１または第２のプライマーを該被置換鎖に接触させること；および
（ｂ）前記第１または第２のプライマーを、前記１種類以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより伸長させること
によって二本鎖ＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記接触工程によりＤＮＡ二本鎖ハイブリッドが生成される、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２の被置換鎖が、互いに少なくとも部分的に相補的であり、ハイブリダイズして二本鎖または部分的に二本鎖の核酸を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記部分的に二本鎖核酸が、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰによって完全に二本鎖の核酸に変換される、請求項６に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸の第１および第２の被置換鎖が、自己プライミングヘアピン構造を形成し得る２つの核酸領域をその３’末端に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸プライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ主鎖核酸、ホスホロチオレート主鎖核酸、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が、短いタグ配列をＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が、酸性残基のＣ末端欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が、約０．２μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約４μＭ、約４μＭ〜約６μＭ、および約６μＭ〜約１２μＭからなる群より選択される濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液が、単鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リゾルベース、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、ＤｎａＸクランプ負荷体、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼ、スライディングクランプ、大腸菌β−二量体スライディングクランプ、真核生物のＰＣＮＡスライディングクランプ、Ｔ４スライディングクランプｇｐ４５、大腸菌ＳＳＢタンパク質、ｇｐ３２タンパク質、Ｎ末端にさらなるアミノ酸を有するｇｐ３２、Ｃ末端にさらなるアミノ酸を有するｇｐ３２、リシン３の置換を有し、リシンでないアミノ酸を有するｇｐ３２、およびアルギニン４の置換を有し、アルギニンでないアミノ酸を有するｇｐ３２、ならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される１種類以上のアクセサリー因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該さらなるアミノ酸がポリヒスタグを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記誘導体が、ｇｐ３２（Ｎ）、ｇｐ３２（Ｃ）、ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔ、ｇｐ３２Ｋ３Ａ、ｇｐ３２Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２Ｒ４Ｔおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記単鎖安定化因子が約１μＭ〜２０μＭの濃度で存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｔ４ ｇｐ３２が１μＭ〜３０μＭの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、フィコール、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ化合物ならびに誘導体およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリエチレングリコールが、反応物の重量または容量の１〜１２％である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｕｖｓＹが、さらにポリヒスタグをＮ末端またはＣ末端に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶液が、ＡＴＰ、ＡＴＰアナログ、ＡＴＰ−γ−Ｓならびにその誘導体および組合せからなる群より選択されるリコンビナーゼ因子の補因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が、ＡＤＰをＡＴＰに変換するためのＡＴＰ再生系、ＡＤＰをＡＭＰから再生させるための系、ピロホスファターゼまたはそれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＴＰ再生系が、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼ、ＡＤＰ−β−Ｓ、ならびにそれらの組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該１種類以上のＤＮＡポリメラーゼが、原核生物のポリメラーゼ、真核生物のポリメラーゼおよびファージにコードされたポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記原核生物のポリメラーゼが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ポリメラーゼＩラージフラグメント、φ−２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｏｌ Ｉラージフラグメント、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＶおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１種類以上のＤＮＡポリメラーゼのうち少なくとも１種類が、短いタグ配列をＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１種類の核酸プライマーが、その３’末端の２つの塩基間に非リン酸結合を含み、３’→５’ヌクレアーゼ活性に抵抗性であるか、またはその３’最後の塩基もしくは３’の最後から２番目の塩基または両方の少なくとも１種類のロックされた核酸に対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
標的核酸分子が、スーパーコイル核酸、２つの末端を有して該末端の両方が非標的核酸分子に連結されている線状核酸、２つの末端を有して該末端の一方が非標的核酸分子に連結されている線状核酸、線状核酸、ポリメラーゼによって二本鎖核酸に変換される単鎖核酸、および加熱または化学的処理の作用によって変性される二本鎖核酸、からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１または第２の核酸プライマーが、少なくとも２０残基長または少なくとも３０残基長である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の核酸プライマーおよび前記第２の核酸プライマーが、それらの３’末端に関して同じ二本鎖鋳型核酸分子上で互いに向かって配向され、該３’末端が、工程（ｂ）の後０〜１０塩基、工程（ｂ）の後１０〜３０塩基、工程（ｂ）の後３０〜１００塩基、工程（ｂ）の後１００塩基超、および工程（ｂ）の後１，０００，０００塩基超からなる群より選択される間隔分離れている、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
短く３’がブロックされたオリゴヌクレオチドの存在下で行なわれ、前記第１または第２の核酸プライマーの３’領域に相補的な配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記短いオリゴヌクレオチドが、前記第１または第２の核酸プライマーに、共有結合性リンカーによって、該核酸プライマーの５’末端と該短いオリゴヌクレオチドの３’または５’末端の間に固定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１種類の核酸プライマーが、前記標的核酸分子には相補的でないが、該プライマーの３’領域には相補的である短い５’領域を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
２０℃〜４０℃の間、または２０℃〜３０℃の間で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記鋳型核酸の温度誘導性融解なしで実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１および第２の核タンパク質プライマーが、各々、前記標的核酸分子の濃度よりも少なくとも１０００倍大きいモル濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１種類の核酸プライマーが、該核酸プライマーの５’末端に、前記標的核酸分子に相補的でない１個以上の塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的核酸分子に相補的でない１個以上の塩基が、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該少なくとも１種類の核酸プライマーが、部分的に単鎖および部分的に二本鎖であり、該プライマーが特異的３’プライマー配列を有する長い方の侵入性鎖、および該長い方の侵入性鎖の５’末端に相補的な短い方の非侵入性鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の核酸プライマーが第１の侵入性鎖および第１の非侵入性鎖を含み、前記第２の核酸プライマーが第２の侵入性鎖および第２の非侵入性鎖を含み、該第１および第２の非侵入性鎖が互いに相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記侵入性鎖、前記非侵入性鎖または両方が、検出可能な部分で標識されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記侵入性鎖および前記非侵入性鎖の両方を標識し、該侵入性鎖および該非侵入性鎖の分離を検出する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出可能な部分が、蛍光色素、酵素、蛍光消光剤、酵素阻害剤、放射性標識、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記侵入性鎖および前記非侵入性鎖の両方が標識され、ここで、該侵入性鎖が、第１の蛍光色素または第１の酵素で標識され、該非侵入性鎖が、第２の蛍光色素、第２の酵素、蛍光消光剤または酵素阻害剤で標識される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記侵入性鎖および前記非侵入性鎖の両方が標識され、ここで、該非侵入性鎖が、第１の蛍光色素または第１の酵素で標識され、該侵入性鎖が、第２の蛍光色素、第２の酵素、蛍光消光剤または酵素阻害剤で標識される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
核酸プライマーの一方または両方が単鎖プライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸プライマーが、蛍光色素、酵素、蛍光消光剤、酵素阻害剤、放射性標識およびそれらの組合せからなる群より選択される検出可能な部分で標識されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が温度感受性であり、該温度感受性ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が、許容温度で鎖侵入活性を有するが、非許容温度では鎖侵入活性を有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的核酸が、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍からなる群より選択されるの量に増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記工程（ｂ）および（ｃ）が、少なくとも１回または少なくとも５回反復される、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的核酸分子が、遺伝的疾患と関連する少なくとも１つの特異的変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的核酸分子が、病原性生物、癌遺伝子、活性化された癌遺伝子、または抑制された癌遺伝子内に含有されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１種類のプライマーが、遺伝的疾患と関連する配列、病原性生物内の核酸配列、癌遺伝子、活性化された癌遺伝子、または抑制された癌遺伝子に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
（ａ）請求項１に記載の前記リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法を用い、第１および第２のプライマーを用いてＤＮＡの一領域を増幅し、第１の増幅産物を生成させる工程；
（ｂ）第３および第４のプライマーを用い、請求項１に記載の該リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法を用いて前記増幅産物を増幅し、第２の増幅産物を生成させる工程、ここで、該第２の増幅産物が該第１の増幅産物内に含有されたより短い配列である、
を含む、ネステッドリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項５４】
前記第１のプライマー、前記第２のプライマー、前記第３のプライマーおよび前記第４のプライマーが、各々異なる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの一方が、前記第３および第４のプライマーの一方と同一である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
第１および第２のＤＮＡ鎖を含む標的核酸分子のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）溶液中で、ｕｖｓＸリコンビナーゼタンパク質を核酸プライマーと接触させ、単鎖領域をその３’末端に含む核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）該核タンパク質プライマーを前記標的核酸分子と接触させ、それにより、二本鎖構造を、前記標的核酸分子の一部分に形成させる工程；
（ｃ）該核タンパク質プライマーの３’末端を、ｄＮＴＰおよび鎖置換特性を有する１種類以上のポリメラーゼにより伸長させ、二本鎖核酸生成物と核酸生成物の被置換鎖とを生成させる工程；および
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）を、所望の増幅度に達するまで反復する工程；
を含み、ここで、
該核酸生成物は、工程（ｄ）において二本鎖標的配列としての機能を果たし得る；
該溶液は、さらにｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、工程（ａ）で核タンパク質プライマーを飽和させるのに充分な濃度で含む；
該溶液は、さらにリコンビナーゼ負荷因子ｕｖｓＹを、０．２〜８マイクロモルの濃度で含む；
該溶液は、さらにクラウディング剤を１％〜１２％の濃度で含む；
該１種類以上のポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性を欠くものである；
該溶液が、ｕｖｓＸ負荷ＤＮＡフィラメントの分解および合成を補助するのに充分な加水分解性ヌクレオシド三リン酸をさらに含む；および
該ｄＮＴＰの一部が、連鎖停止ｄＮＴＰを含む；
該ｄＮＴＰの少なくとも一部が、検出可能なマーカーで標識されている、
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項５７】
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅により増幅された核酸生成物の有無を試料中において検出する方法であって、
（ａ）溶液中で、Ｔ４ リコンビナーゼ因子を第１および第２の核酸プライマーと接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーを形成する工程、ここで、該核酸プライマーが、単鎖領域をその３’に含み、該第１の核酸プライマーが、第１の結合対の第１の構成員で標識され、前記第２の核酸プライマーが、第２の結合対の第１の構成員で標識されている工程；
（ｂ）該第１および第２の核タンパク質プライマーを試料と接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーと増幅産物との複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を、該第１の結合対の第２の構成員で被覆された第１の移動性固相支持体、および該第２の結合対の第２の構成員で被覆された第２の移動相固体支持体に接触させる工程；
（ｄ）該第１の移動相固体支持体が、該第２の移動相固体支持体と同時局在しているか否かを調べ、該増幅により増幅された核酸生成物の存在を測定する工程；
を含み、ここで、
リコンビナーゼ負荷因子Ｔ４ ｕｖｓＹが、反応物中に０．２〜８マイクロモルの濃度で含まれる；
クラウディング剤が１％〜１２％の濃度で含まれる；
加水分解性ヌクレオシド三リン酸がリコンビナーゼ活性を補助するために用いられ、その結果、ｕｖｓＸ負荷ＤＮＡフィラメントが効率的な分解および合成を行なうことができる、
方法。
【請求項５８】
前記第１の核酸プライマーが前記増幅産物の生成に用いるプライマーと同じ核酸配列を有するか、または前記第２の核酸プライマーが該増幅産物の生成に用いるプライマーと同じ核酸配列を有するか、またはその両方である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１または第２のプライマーが、前記リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応による前記標的の増幅後に、前記リコンビナーゼにより媒介される三重らせんの形成によって該標的ＤＮＡと会合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）溶液中で、ｕｖｓＸおよびｒｅｃＡからなる群より選択されるリコンビナーゼ因子を、第１および第２の核酸プライマーと接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）該第１および第２の核タンパク質プライマーを、該二本鎖標的核酸分子と接触させ、それにより、第１の二本鎖構造を該標的核酸分子の第１の部分に、および第２の二本鎖構造を該標的核酸分子の第２の部分に、該第１の核酸プライマーおよび該第２の核酸プライマーの３’末端が、該鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるように形成する；
（ｃ）該標的核酸分子を、プライモソーム合成タンパク質およびクランプ負荷体／ポリメラーゼホロ酵素複合体と接触させ、複製フォークを該標的核酸分子の前記第１の部分に、および第２の複製フォークを該標的核酸分子の前記第２の部分に形成させる工程；
（ｄ）該標的分子を、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩコア、ＤＮＡポリメラーゼＩ、プライマーゼ、ヘリカーゼ、およびリガーゼと接触させ、リーディング鎖／ラギング鎖連結型ＤＮＡ合成および各複製フォークの互いへの移動を可能にする工程；および
（ｅ）（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を、所望の増幅度に達するまで反復する工程；
を含み、ここで、
ｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、工程（ａ）で該第１および第２の核酸プライマーを溶液中で飽和させるのに少なくとも充分な濃度で含まれる；
リコンビナーゼ負荷因子ｕｖｓＹまたは大腸菌ｒｅｃＯおよびｒｅｃＲ遺伝子産物が、反応物中に、０．２〜８マイクロモルの濃度で含まれる；
クラウディング剤が少なくとも１％〜１２％の濃度で含まれる；
加水分解性ヌクレオシド三リン酸がリコンビナーゼ活性を補助するために用いられ、その結果、リコンビナーゼ負荷ＤＮＡフィラメントが効率的な分解および合成を行なうことができる、
二本鎖標的分子のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項６１】
ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、またはそれらの組合せの存在下で行なわれる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記プライモソーム合成タンパク質が、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＣ、ＤｎａＢ、ＤｎａＧ、Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記クランプ負荷体がＤｎａＸクランプ負荷体複合体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素が大腸菌ポリメラーゼＩＩＩである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＤＮＡポリメラーゼＩが大腸菌ポリメラーゼＩである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記プライマーゼが大腸菌ＤｎａＧ プライマーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記ヘリカーゼが大腸菌ＤｎａＢヘリカーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
（ａ）以下の試薬
（１）少なくとも１種類のリコンビナーゼ；
（２）少なくとも１種類の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；
（３）少なくとも１種類のＤＮＡポリメラーゼ；
（４）ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物
（５）クラウディング剤；
（６）バッファー；
（７）還元剤；
（８）ＡＴＰまたは加水分解性ＡＴＰアナログ；
（９）少なくとも１種類のリコンビナーゼ負荷タンパク質；
（１０）第１のプライマー、および任意選択で第２のプライマー；および
（１１）標的核酸分子
を溶液中で合わせる工程；ならびに
（ｂ）該溶液を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項６９】
前記リコンビナーゼが、ｕｖｓＸ、ｒｅｃＡならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記リコンビナーゼが、短いタグ配列をＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記リコンビナーゼが、酸性残基のＣ末端欠失を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記リコンビナーゼが、約０．２μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約４μＭ、約４μＭ〜約６μＭ、約６μＭ〜約１２μＭ、および約０．２μＭ〜約１２μＭからなる群より選択されるの濃度で存在する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、ｇｐ３２、ならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記ｇｐ３２誘導体が、ｇｐ３２（Ｎ）、ｇｐ３２（Ｃ）、ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔ、ｇｐ３２Ｋ３Ａ、ｇｐ３２Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２Ｒ４Ｔおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、１μＭ〜３０μＭの濃度で存在する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが真核生物のポリメラーゼまたは原核生物のポリメラーゼである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
前記真核生物のポリメラーゼが、ｐｏｌ−α、ｐｏｌ−β、ｐｏｌ−δ、ｐｏｌ−εならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記原核生物のポリメラーゼが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片、バクテリオファージＴ４ ｇｐ４３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ポリメラーゼＩラージフラグメント、φ−２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ Ｐｏｌ Ｉ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＶならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、短いタグ配列をＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、１０，０００単位／ｍｌ〜１６単位／ｍｌまたは５０００単位／ｍｌ〜５００単位／ｍｌの濃度である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記１種類以上のＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１種類のＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８２】
前記１種類以上のＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換特性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８３】
前記ｄＮＴＰが１ｍＭ〜４０μＭの濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８４】
前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、デキストラン、フィコールまたはそれらの組合せである、請求項６８に記載の方法。
【請求項８５】
前記ポリエチレングリコールが、反応物の重量または容量の１〜１２％である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ポリエチレングリコールが、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ混合物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記バッファーが、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、Ｔｒｉｓ−酢酸塩バッファー、またはそれらの組合せである、請求項６８に記載の方法。
【請求項８８】
前記バッファーが、１０〜６０ｍＭの濃度および６．５〜９．０のｐＨである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記還元剤がＤＴＴである、請求項６８に記載の方法。
【請求項９０】
前記還元剤が１〜１０ｍＭの濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＡＴＰまたはＡＴＰアナログが、ＡＴＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ、ＡＴＰ−β−ＳおよびｄｄＡＴＰからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＡＴＰまたはＡＴＰアナログが１〜１０ｍＭの濃度である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記リコンビナーゼ負荷タンパク質が、Ｔ４ｕｖｓＹ、大腸菌ｒｅｃＯ、大腸菌ｒｅｃＲならびにそれらの誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項９４】
前記リコンビナーゼ負荷タンパク質が、さらにポリヒスタグを、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９５】
前記リコンビナーゼ負荷タンパク質が０．２〜８μＭの濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９６】
第１または第２のプライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ主鎖核酸、ホスホロチオレート主鎖核酸またはそれらの組合せを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９７】
前記第１または第２のプライマーが１００ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９８】
前記第１または第２のプライマーが、その３’末端の２つの塩基間に非リン酸結合を含み、３’→５’ヌクレアーゼ活性に対して抵抗性である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９９】
前記第１または第２のプライマーが少なくとも１種類のロックされた核酸を、その３’の最後の塩基または３’の最後から２番目の塩基に含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１００】
前記第１または第２のプライマーが少なくとも２０塩基長である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第１または第２のプライマーが少なくとも３０塩基長である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第１または第２のプライマーが、その５’末端に、標的核酸分子に相補的でない１個以上の塩基をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記１個以上の塩基が制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１または第２のプライマーが部分的に二本鎖であり、単鎖領域をその３’末端に有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０５】
少なくとも１種類のプライマーが検出可能な標識で標識されている、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０６】
前記検出可能な標識が、蛍光色素、酵素、蛍光消光剤、酵素阻害剤、放射性標識およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記標的核酸分子が、スーパーコイル核酸、２つの末端を有して該末端の両方が非標的核酸分子に連結されている線状核酸、２つの末端を有して該末端の一方が非標的核酸分子に連結されている線状核酸、線状核酸、およびポリメラーゼによって二本鎖核酸に変換されるか、または加熱または化学的処理の作用によって変性される二本鎖核酸に変換される単鎖核酸分子、からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０８】
前記標的核酸が、１０００コピー未満／ｍｌまたは１〜１０コピー／反応の濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０９】
前記インキュベーションが５分間〜１６時間である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記インキュベーションが１５分間〜３時間である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記インキュベーションが３０分間〜２時間である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記インキュベーションが、所望の増幅度に達するまで行なわれる、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記所望の増幅度が、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１００，０００倍および少なくとも１００００００倍からなる群より選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記インキュベーションが、２０℃〜５０℃、２０℃〜４０℃の間、または２０℃〜３０℃の間で行なわれる、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１５】
前記鋳型核酸の温度誘導性融解なしで行なわれる、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１６】
工程（ａ）が、アクセサリー因子をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１７】
前記アクセサリー因子が、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リゾルベースおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記アクセサリー因子が、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、ＤｎａＸクランプ負荷体、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼ、スライディングクランプ、β−クランプ、ＤｎａＸクランプ負荷体およびポリメラーゼコア複合体からなるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体からなる群より選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記スライディングクランプが、大腸菌β−二量体スライディングクランプ、真核生物のＰＣＮＡスライディングクランプ、またはＴ４スライディングクランプｇｐ４５およびそれらの組合せである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
工程（ａ）が、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメント安定化因子をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記安定化因子が、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＦおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記安定化剤が０．０１μＭ〜２０μＭの濃度である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記溶液が、ＡＤＰをＡＴＰに変換するためのＡＴＰ再生系、ＡＤＰをＡＭＰから再生させるための系、ピロリン酸塩をリン酸塩に変換するための系、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ＡＴＰ再生系が、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
１種類以上の試薬を前記工程（ａ）の前にフリーズドライさせ、該試薬が、リコンビナーゼ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰもしくはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物、還元剤、ＡＴＰもしくはＡＴＰアナログ、リコンビナーゼ負荷タンパク質、クラウディング剤、バッファー、塩、ＤＴＴ、および第１のプライマー、ならびに任意選択で第２のプライマー、またはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項１２６】
（ａ）以下の試薬
（１）０．２〜１２μＭの濃度のｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）１〜３０μＭの濃度のｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；
（３）５０〜５０００単位／ｍｌの濃度のＢｓｕポリメラーゼ；
（４）１〜５００μＭの濃度のｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物；
（５）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール；
（６）２５ｍＭ〜６０ｍＭのの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（７）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＤＴＴ；
（８）１．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度のＡＴＰ；
（９）０．２μＭ〜８μＭの濃度のｕｖｓＹ；
（１０）第１のプライマー、および任意選択で第２のプライマー、ここで、該プライマーは１０ｎＭ〜１μＭの濃度である；ならびに
（１１）少なくとも１つのコピーの標的核酸分子
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１２７】
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌ ｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）６００ｎｇ／μｌ ｇｐ３２；
（３）２０ｎｇ／μｌ Ｂｓｕポリメラーゼ；
（４）２００μＭ ｄＮＴＰ；
（５）１ｍＭ ＤＴＴ
（６）３ｍＭ ＡＴＰまたは加水分解性ＡＴＰアナログ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌ ｕｖｓ Ｙ
（８）３００ｎＭの第１のプライマーおよび３００ｎＭの第２のプライマー；
（９）１００ｍＭ酢酸カリウム
（１０）８〜１６ｍＭ酢酸マグネシウム
（１１）２５ｍＭクレアチンリン酸
（１２）１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール；
（３）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１２８】
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌ ｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）３００〜１０００ｎｇ／μｌ ｇｐ３２；
（３）１０〜５０ｎｇ／μｌ ＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）５０〜５００μＭ ｄＮＴＰ；
（５）０．１〜１０ｍＭ ＤＴＴ
（６）３ｍＭ ＡＴＰまたは加水分解性ＡＴＰアナログ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌ ｕｖｓＹ
（８）５０〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０〜１０００ｎＭの第２のプライマー；
（９）４０〜１６０ｍＭ酢酸カリウム
（１０）５〜２０ｍＭ酢酸マグネシウム
（１１）１０〜４０ｍＭクレアチンリン酸
（１２）５０〜２００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール；
（３）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程．
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１２９】
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌ ｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）３００〜１０００ｎｇ／μｌ ｇｐ３２；
（３）１０〜５０ｎｇ／μｌ ＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）５０〜５００μＭ ｄＮＴＰ；
（５）０．１〜１０ｍＭ ＤＴＴ
（６）３ｍＭ ＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌ ｕｖｓＹ
（８）５０〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０〜１０００ｎＭの第２のプライマー；
（９）４０〜１６０ｍＭ酢酸カリウム
（１０）５〜２０ｍＭ酢酸マグネシウム
（１１）１０〜４０ｍＭクレアチンリン酸
（１２）５０〜２００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
（１３）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１３０】
フリーズドライする前に、トレハロースを前記試薬に添加する、請求項１２７、１２８または１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記トレハロースを前記試薬に、１０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度で添加する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１および第２の核酸プライマーと接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）第１および第２の核タンパク質プライマーを二本鎖標的配列と接触させ、それにより、該第１の核酸プライマーおよび該第２の核酸プライマーの３’末端が同じ鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるように、該第１の鎖の第１の部分に第１の二本鎖構造を形成し、該第２の鎖の第２の部分に二本鎖構造を形成する工程；
（ｃ）該第１および第２の核タンパク質プライマーの３’末端を、１種類以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて伸長させ、第１および第２の二本鎖核酸と核酸の第１および第２の被置換鎖とを生成させる工程；
（ｄ）（ｂ）と（ｃ）の反復により所望の増幅度に達するまで反応を継続させる工程
を含み、ここで、
生成された二本鎖核酸が、二本鎖標的配列としての機能を果たし得る、
第１および第２のＤＮＡ鎖を含む二本鎖標的配列のＤＮＡを増幅するＲＰＡ法。
【請求項１３３】
前記第１または第２の核酸プライマーが、非特異的増幅反応を減少する最適鎖交換に必要とされる長さより短い長さを有する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記第１または第２の核酸プライマーが２５〜２９残基長または１６〜２４残基長である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
工程（ｂ）の前に、折り返しプライミングを低減させるため、または核タンパク質組換え／伸長速度を調節するための、さらなる核酸配列を前記標的核酸の少なくとも１つの末端にライゲートする工程をさらに含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３６】
前記第１または第２の核酸プライマーが１種類以上の改変糖残基を含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３７】
前記改変糖残基が、ロックされた核酸、リボース、２’−Ｏ−メチルリボース、非環式糖残基およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記改変糖残基がプライマーの最も３’側の位置に存在する、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
前記方法の実施中の全ＤＮＡ濃度をセンサーでモニタリングする工程をさらに含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１４０】
前記センサーが、蛍光測定によってＤＮＡ濃度検出するか、ＳＹＢＲ金またはＳＹＢＲ緑由来の蛍光を検出するか、配列特異的にＤＮＡ濃度を検出するか、またはそれらの組合せである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
該センサーが、反応物中の単鎖標的へのハイブリダイゼーションによって機能を果たす、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
前記ハイブリダーゼーションが、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質またはリコンビナーゼなどの融解／アニーリング因子によって助長される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記センサーが、二本鎖ＤＮＡ標的に対するリコンビナーゼ媒介性標的化によって機能を果たす、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４４】
前記センサーが、標的ＤＮＡ内の標的部位に隣接してハイブリダイズした場合のみ特異的蛍光共鳴エネルギー移動を受ける２つ以上の蛍光標識された配列特異的オリゴヌクレオチドを含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４５】
前記センサー内に存在するフルオロフォアが、ともに該センサーに結合された消光剤から、該センサーがその標的部位に結合された場合のみ機能を果たすヌクレアーゼの作用によって分離される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ヌクレアーゼが二本鎖ヌクレアーゼである、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記二本鎖ヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼである、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記ＲＰＡ法が、１種類以上のケージ化物質の光誘発性光脱保護によって開始または制御される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１４９】
前記ケージ化物質がケージ化ＡＴＰまたはケージ化オリゴヌクレオチドである、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記プライマー、ＡＴＰまたはヌクレオチドの１種類以上がケージ化分子であり、工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）が、非ケージ化分子を生成する該ケージ化分子の光媒介性光脱保護によって制御または開始される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
前記非ケージ化分子の濃度をモニタリングする、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５２】
前記非ケージ化分子がＲＰＡの１回以上のサイクルで消費され、それにより、さらなる非ケージ化分子が生成されるまで前記ＲＰＡ反応を停止させる、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ケージ化分子が、ケージ化ＡＴＰ、ケージ化ｄＡＴＰ、およびケージ化ＵＴＰからなる群より選択される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５４】
前記プライマー、ＡＴＰまたはＮＴＰの１種類以上が、工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の１サイクルのみを支持し得る濃度であり、さらなる工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、新たな量の前記プライマー、ＡＴＰまたはＮＴＰの１種類以上の添加によって開始される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１５５】
前記新たな量の前記プライマー、ＡＴＰまたはＮＴＰの１種類以上が、工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の１サイクルのみを支持し得る濃度で供給される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記新たな量の前記プライマー、ＡＴＰまたはＮＴＰの１種類以上が、酵素性の系の作用によって供給される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ＲＰＡ法が、反応物中に蓄積されるＡＤＰを、リコンビナーゼ活性を調節しない化合物へのその直接変換によって除去する酵素；反応物中に蓄積されるＡＤＰを、ＡＤＰ、ＡＴＰまたは同等物でない化合物へのその直接変換によって除去する酵素系；すべてのＡＤＰをＡＴＰに変換し、前記反応物中のＡＤＰ濃度を低下させる酵素系；前記方法においてＡＴＰを低減させ、工程（ｂ）および（ｃ）後にＲＰＡ反応を停止させる酵素系であって、さらなる工程（ｂ）および（ｃ）がＡＴＰの添加によって開始される系、からなる群より選択される酵素系の存在下で行なわれる、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ＡＴＰの添加がケージ化ＡＴＰの脱ケージ化によって行なわれる、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記ケージ化ＡＴＰが光励起によって脱ケージ化される、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記光励起が、１０μＭ〜３０μＭ ＡＴＰ、３０μＭ〜６０μＭ ＡＴＰ、６０μＭ〜９０μＭ ＡＴＰ、９０μＭ〜２００μＭ ＡＴＰ、２００μＭ〜５００μＭ ＡＴＰまたは５００μＭ〜３０００μＭ ＡＴＰの有効な濃度増加をもたらす、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記反応物中のＡＴＰ濃度をセンサーによってモニタリングする、請求項１３２または１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ＡＴＰセンサーがルシフェラーゼおよびルシフェリンを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記プライマーが、リコンビナーゼ相互作用を改善するために高いシトシン含量を含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記シトシン含量が該プライマーの塩基の７５％より多い、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
鋳型核酸およびＲＰＡ産物の移動を制限するゲルマトリックス内で行なわれる、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ゲルマトリックスがポロニーゲルマトリックスである、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
（ａ）請求項１３２に記載のＲＰＡ反応を、前記工程（ａ）において第１のアウタープライマー対および第２のインナープライマー対の存在下で行なう工程
を含み、ここで、
該第１のアウタープライマー対が、工程（ｂ）の後、該アウタープライマー対の３’末端が同じ鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるような核酸配列を含む；
該第２のインナープライマー対が、工程（ｂ）の後、該インナープライマー対の３’末端が同じ鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるような核酸配列を含む、
さらに、ここで、該第２のインナープライマー対が標的核酸と、該第１のアウタープライマー対のハイブリダーゼーション位置の内である位置でハイブリダイズする、
ネステッドＲＰＡ法。
【請求項１６８】
前記第１のアウタープライマー対が、前記インナープライマー対と比べて、長さまたは組成のため、より迅速な増幅反応速度論を支持する、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記第１のアウタープライマー対が前記第２のインナープライマー対の濃度より低い濃度である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７０】
少なくとも１種類のプライマーが、固定化されているかまたは固定化可能であり、少なくとも１種類の他のプライマーが、標識されたプライマーであり、前記第２のプライマーへの前記第１のプライマーのハイブリダーゼーションを工程（ｄ）の後に測定する、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７１】
前記固定化可能なプライマーおよび前記標識されたプライマーが、前記ＲＰＡ反応における唯一のプライマーである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
固定化可能なプライマーが、ＲＰＡ反応において２種類以上の他のプライマーによって生成されたＤＮＡ内の特有配列とハイブリダイズする、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記固定化可能なプライマーが、非分枝の移動可能な二本鎖の形成によって安定な生成物捕捉を可能にするバックファイヤープライマーである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
標識されたプライマーが、非分枝の移動可能な二本鎖の形成によって安定な生成物捕捉を可能にするバックファイヤープライマーである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７５】
ｄＵＴＰの存在下で、ｄＵＴＰがＲＰＡ産物内に組み込まれるように行なわれ、前記ＲＰＡ産物がｄＵＴＰ脱グリコシル化酵素に対して感受性である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７６】
プライマーの蛍光をモニタリングすることにより前記ＲＰＡ反応をモニターする工程をさらに含み、ここで、前記プライマーの１つが、フルオロフォアと、１０〜１２残基以下の間隔分離れている消光剤とからなる二重標識オリゴヌクレオチドプローブであり、該消光剤は、プライマーがハイブリダイズされていない状態場合、ハイブリダイズされた状態よりもより効率的である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７７】
プライマーの蛍光をモニターすることにより前記ＲＰＡ反応をモニターする工程をさらに含み、ここで、前記プライマーの１つが、フルオロフォアと、１０〜１２残基以下の間隔分離れている消光剤とからなる二重標識オリゴヌクレオチドプローブであり、ヌクレアーゼ活性がプローブと標的間の二本鎖ハイブリッドに対して優先的に作用し、最終的に消光剤とフルオロフォア間の会合の低下がもたらされる結果として、蛍光が増加する、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７８】
該プライマーの１つ以上が、最初に３’−ブロックされており、かつテトラヒドロフラニル残基を含有し、大腸菌Ｎｆｏタンパク質または機能的同等物を前記ＲＰＡ法において存在させ、ブロックされたオリゴヌクレオチドが、標的ＤＮＡと二本鎖ハイブリッドを形成し、続いてＮｆｏタンパク質または機能的ホモログによってプロセッシングされ、ポリメラーゼが、Ｎｆｏ切断によって生成したプローブの遊離３’末端を伸長させる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記ブロックされたプライマーが、テトラヒドロフラニル残基、フルオロフォア、および消光性副溝結合色素を含有し、その結果、二本鎖ハイブリッドが形成されると、消光が、フルオロフォア由来の蛍光発光の増大がＤＮＡ増幅の結果として増加するような副溝結合色素の吸収特性の変化によって減少する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記リコンビナーゼが、Ｔ４ファージＵｖｓＸ、大腸菌ＲｅｃＡ、または真核生物のＲａｄ５１からなる群より選択される、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１８１】
前記ＲＰＡがクラウディング剤の存在下で行なわれる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１８２】
分子クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、フィコール、デキストラン、およびポリビニルピロリドンからなる群より選択される、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記ＲＰＡが再負荷促進剤の存在下で行なわれる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１８４】
再負荷促進剤が、Ｔ４ ＵｖｓＹ、大腸菌ＲｅｃＯ、大腸菌ＲｅｃＲ、ならびにそれらの組合せおよびホモログからなる群より選択される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
ＤＮＡリガーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよび塩基特異的損傷塩基特異的ヌクレアーゼからなる群より選択される酵素の存在下で行なわれる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼがヒトＦＥＮｌまたはその同等物である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記エンドヌクレアーゼがらせん変形認識エンドヌクレアーゼまたは塩基特異的損傷塩基特異的ヌクレアーゼである、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８８】
前記らせん変形認識エンドヌクレアーゼがＳｌヌクレアーゼである、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記塩基特異的損傷塩基特異的ヌクレアーゼが、大腸菌Ｆｐｇタンパク質、大腸菌Ｎｔｈ、および大腸菌Ｎｆｏからなる群より選択される、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１９０】
少なくとも１種類の前記プライマーが、プライマーにおいてリコンビナーゼの最適シードおよびフェーズ決定特性を可能にするさらなる核酸配列を含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１９１】
さらなるＤＮＡ配列が、７０％より多いピリミジンまたは７５％より多いシトシン残基を含む、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
標的ＤＮＡ配列が、複製反応中、部分的または完全に二本鎖であり、その結果、固有の鎖置換活性を有するポリメラーゼが必要とされる；
少なくとも１つのポリメラーゼが有意な鎖置換活性を有する；
単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が存在する；
クラウディング剤が、１重量％／容量以上、反応物中に存在する；および
約３０℃〜約３９℃の温度で行なわれる、
請求項１６７に記載の方法
【請求項１９３】
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１の核酸プライマーと接触させ、第１の核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）リコンビナーゼ因子を含有しない第２の核酸プライマーを提供する工程；
（ｃ）第１の核タンパク質プライマーを前記二本鎖標的配列に接触させ、それにより、前記第１の鎖の第１の部分に第１の二本鎖構造を形成させる工程；
（ｄ）前記第１の核タンパク質プライマーの３’末端を１種類以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより伸長させ、二本鎖核酸および核酸の第１の被置換鎖を生成させる工程；
（ｅ）前記第２の核酸プライマーを前記核酸の第１の被置換鎖にハイブリダイズさせて前記第２の核酸プライマーの３’末端を１種類以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより伸長し、二本鎖核酸を生成させる工程；
（ｆ）（ｃ）および（ｅ）の反復により所望の増幅度に達するまで反応を継続させる工程
を含み、ここで、
前記工程（ｃ）〜（ｅ）が、同時にまたは順次行なわれ、生成された二本鎖核酸が、二本鎖標的配列としての機能を果たし得る、
第１および第２のＤＮＡ鎖を含む二本鎖標的配列のＤＮＡを増幅するＲＰＡ法。
【請求項１９４】
前記第２のプライマーが、リコンビナーゼ機能および前記標的核酸に対する実質的なリコンビナーゼ媒介性配列標的化の関与には短すぎるが、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応には充分な長さである、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記第２のプライマーが、実質的なリコンビナーゼ媒介性配列標的化の関与について抑制される、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９６】
前記第２のプライマーが１種類以上の修飾ヌクレオチドを含み、実質的なリコンビナーゼ媒介性配列標的化の関与について抑制される、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９７】
修飾ヌクレオチドがロックされた核酸糖を含む、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
（ｉ）試料ＤＮＡと１種類以上のプローブとハイブリダイズさせ、リコンビナーゼを含む反応物中に１個以上のハイブリッド領域を形成させる工程、ここで、前記１種類以上のプローブが、前記試料ＤＮＡにおいて生じ得る配列バリアントに対応し、試料またはプローブのいずれかが二本鎖である；
（ｉｉ）不完全なハイブリッドの不安定化領域を増強する工程；
（ｉｉｉ）プローブと試料間で形成された完全なハイブリッドを、最初にプローブまたは試料核酸のいずれかに存在する標識の有無を検出することにより検出する工程
を含む、多型性ＤＮＡ試料の解析方法。
【請求項１９９】
前記増強する工程が酵素により行なわれる、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
酵素がリコンビナーゼである、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記リコンビナーゼがＴ４ ｕｖｓＸタンパク質である、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記方法が、Ｔ４ ｇｐ３２タンパク質、Ｔ４ｕｖｓＹタンパク質、ＡＴＰ、クラウディング剤からなる群より選択されるさらなる成分の存在下で行なわれる、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０３】
前記クラウディング剤が、ポリ塩化ビニル、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール混合物、フィコール、ポリデキストラン、ウシ血清アルブミン、およびポリビニルピロリドンからなる群より選択される、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記ポリエチレングリコール混合物が、１５，０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールを含む、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
ＡＴＰ再生系をさらに含む、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０６】
不完全なハイブリッドの不安定化助長するためにヘリカーゼを含める、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０７】
前記ヘリカーゼが、大腸菌ＰｒｉＡ、大腸菌ＤｎａＢヘリカーゼ、大腸菌ＲｕｖＡＢヘリカーゼ、Ｔ４ファージｇｐ４１、Ｔ４ファージｄｄａヘリカーゼを含む群に属する、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
前記ヘリカーゼが、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用などのプローブと表面間の安定な非共有結合性相互作用を物理的に破壊する、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０９】
内部に誤対合形成領域があるＤＮＡ鋳型、または内部にバブルがあるＤＮＡ鋳型に対して作用するヌクレアーゼを含める、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記ヌクレアーゼが、Ｓｌヌクレアーゼ、Ｐｌヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ、ＣｅｌＩヌクレアーゼを含む群に属する、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
ニックまたは小ギャップから合成を開始できるＤＮＡポリメラーゼを反応物中に含めて増幅ＤＮＡ試料を作製する、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１２】
反応の開始時、増幅ＤＮＡ試料が本質的に有意に単鎖であり、プローブが本質的に主に二本鎖または単鎖である、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
増幅された試料ＤＮＡまたはプローブ核酸が、標識を一方または両方の鎖の一方の末端に含む、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１４】
前記標識が、蛍光基、量子ドット、消光剤、常磁性粒子、酵素性部分からなる群より選択される、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１５】
前記酵素性部分が、酵素または無機系触媒である、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記標識が、別の分子、特に、例えば抗体と既知抗原と高親和性の非共有相互作用を形成できる存在物である、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１７】
前記プローブおよび前記試料核酸の両方が標識を含む、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１８】
前記標識が、フルオロフォアおよび／または消光剤からなる、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
（ａ）光検出センサーを含む反応チャンバ；および
（ｂ）温度を３３〜３９℃に維持するための非サイクル式温度制御手段
を備えるＲＰＡ反応を行なうための装置。
【請求項２２０】
前記光検出センサーが蛍光検出センサーである、請求項２１９に記載の装置。
【請求項２２１】
前記光検出センサーによる光測定を行なうために前記反応チャンバを照射するための１個以上の発光ダイオードをさらに備える、請求項２１９に記載の装置。
【請求項２２２】
前記センサーがピンダイオードまたはピンダイオードのアレイを備える、請求項２１９に記載の装置。
【請求項１】
第１および第２のＤＮＡ鎖を含む二本鎖標的核酸分子のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）溶液中で、ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子を第１の核酸プライマーおよび第２の核酸プライマーと接触させ、第１の核タンパク質プライマーおよび第２の核タンパク質プライマーを形成する工程であって、該核酸プライマーは単鎖領域をその３’末端に含む、工程；
（ｂ）該第１の核タンパク質プライマーおよび該第２の核タンパク質プライマーを該二本鎖標的核酸分子と接触させ、それにより：
（１）該第１の鎖の第１の部分における第１の二本鎖構造、および
（２）該第２の鎖の第２の部分における第２の二本鎖構造
を、該第１の核タンパク質プライマーの３’末端および該第２の核タンパク質プライマーの３’末端が、同じ二本鎖鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるように形成する工程；
（ｃ）該第１の核タンパク質プライマーの３’末端および第２の核タンパク質プライマーの３’末端を、ｄＮＴＰおよび鎖置換特性を有する１種類以上のＤＮＡポリメラーゼを用いて伸長させ、第１および第２の二本鎖核酸生成物と、核酸生成物の第１および第２の被置換鎖とを生成する工程；ならびに
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）を、所望の増幅度に達するまで反復する工程
を含み、ここで、
該核酸生成物は、工程（ｄ）において二本鎖標的配列としての機能を果たし得る；
該溶液は、さらにｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、工程（ａ）で該第１のプライマーおよび該第２のプライマーを飽和させるのに充分なの濃度で含む；
該溶液は、さらにリコンビナーゼ負荷因子ｕｖｓＹを、０．２〜８マイクロモル濃度で含み；
該溶液は、さらにクラウディング剤を１％〜１２％の濃度で含む；
該１種類以上のＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性を欠くものである；
該溶液が、ｕｖｓＸ負荷ＤＮＡフィラメントの分解および合成を補助するのに充分な加水分解性ヌクレオシド三リン酸をさらに含む；ならびに
該反応は、２０℃〜５０℃の温度で行なわれる、
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項２】
前記核酸生成物の第１および第２の被置換鎖が、前記第１または第２の核タンパク質プライマーとの同時のリコンビナーゼポリメラーゼ反応によって二本鎖ＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸の第１および第２の被置換鎖が、
（ａ）前記第１または第２のプライマーを該被置換鎖に接触させること；および
（ｂ）前記第１または第２のプライマーを、前記１種類以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより伸長させること
によって二本鎖ＤＮＡに変換される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記接触工程によりＤＮＡ二本鎖ハイブリッドが生成される、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２の被置換鎖が、互いに少なくとも部分的に相補的であり、ハイブリダイズして二本鎖または部分的に二本鎖の核酸を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記部分的に二本鎖核酸が、ポリメラーゼおよびｄＮＴＰによって完全に二本鎖の核酸に変換される、請求項６に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸の第１および第２の被置換鎖が、自己プライミングヘアピン構造を形成し得る２つの核酸領域をその３’末端に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸プライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ主鎖核酸、ホスホロチオレート主鎖核酸、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が、短いタグ配列をＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が、酸性残基のＣ末端欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が、約０．２μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約４μＭ、約４μＭ〜約６μＭ、および約６μＭ〜約１２μＭからなる群より選択される濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液が、単鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リゾルベース、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、ＤｎａＸクランプ負荷体、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼ、スライディングクランプ、大腸菌β−二量体スライディングクランプ、真核生物のＰＣＮＡスライディングクランプ、Ｔ４スライディングクランプｇｐ４５、大腸菌ＳＳＢタンパク質、ｇｐ３２タンパク質、Ｎ末端にさらなるアミノ酸を有するｇｐ３２、Ｃ末端にさらなるアミノ酸を有するｇｐ３２、リシン３の置換を有し、リシンでないアミノ酸を有するｇｐ３２、およびアルギニン４の置換を有し、アルギニンでないアミノ酸を有するｇｐ３２、ならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される１種類以上のアクセサリー因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該さらなるアミノ酸がポリヒスタグを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記誘導体が、ｇｐ３２（Ｎ）、ｇｐ３２（Ｃ）、ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔ、ｇｐ３２Ｋ３Ａ、ｇｐ３２Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２Ｒ４Ｔおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記単鎖安定化因子が約１μＭ〜２０μＭの濃度で存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｔ４ ｇｐ３２が１μＭ〜３０μＭの濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、デキストラン、フィコール、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ化合物ならびに誘導体およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリエチレングリコールが、反応物の重量または容量の１〜１２％である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ｕｖｓＹが、さらにポリヒスタグをＮ末端またはＣ末端に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記溶液が、ＡＴＰ、ＡＴＰアナログ、ＡＴＰ−γ−Ｓならびにその誘導体および組合せからなる群より選択されるリコンビナーゼ因子の補因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記溶液が、ＡＤＰをＡＴＰに変換するためのＡＴＰ再生系、ＡＤＰをＡＭＰから再生させるための系、ピロホスファターゼまたはそれらの組合せをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＴＰ再生系が、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼ、ＡＤＰ−β−Ｓ、ならびにそれらの組合せを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該１種類以上のＤＮＡポリメラーゼが、原核生物のポリメラーゼ、真核生物のポリメラーゼおよびファージにコードされたポリメラーゼからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記原核生物のポリメラーゼが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ポリメラーゼＩラージフラグメント、φ−２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｐｏｌ Ｉラージフラグメント、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＶおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１種類以上のＤＮＡポリメラーゼのうち少なくとも１種類が、短いタグ配列をＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１種類の核酸プライマーが、その３’末端の２つの塩基間に非リン酸結合を含み、３’→５’ヌクレアーゼ活性に抵抗性であるか、またはその３’最後の塩基もしくは３’の最後から２番目の塩基または両方の少なくとも１種類のロックされた核酸に対して抵抗性である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
標的核酸分子が、スーパーコイル核酸、２つの末端を有して該末端の両方が非標的核酸分子に連結されている線状核酸、２つの末端を有して該末端の一方が非標的核酸分子に連結されている線状核酸、線状核酸、ポリメラーゼによって二本鎖核酸に変換される単鎖核酸、および加熱または化学的処理の作用によって変性される二本鎖核酸、からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１または第２の核酸プライマーが、少なくとも２０残基長または少なくとも３０残基長である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１の核酸プライマーおよび前記第２の核酸プライマーが、それらの３’末端に関して同じ二本鎖鋳型核酸分子上で互いに向かって配向され、該３’末端が、工程（ｂ）の後０〜１０塩基、工程（ｂ）の後１０〜３０塩基、工程（ｂ）の後３０〜１００塩基、工程（ｂ）の後１００塩基超、および工程（ｂ）の後１，０００，０００塩基超からなる群より選択される間隔分離れている、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
短く３’がブロックされたオリゴヌクレオチドの存在下で行なわれ、前記第１または第２の核酸プライマーの３’領域に相補的な配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記短いオリゴヌクレオチドが、前記第１または第２の核酸プライマーに、共有結合性リンカーによって、該核酸プライマーの５’末端と該短いオリゴヌクレオチドの３’または５’末端の間に固定される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
少なくとも１種類の核酸プライマーが、前記標的核酸分子には相補的でないが、該プライマーの３’領域には相補的である短い５’領域を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
２０℃〜４０℃の間、または２０℃〜３０℃の間で実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記鋳型核酸の温度誘導性融解なしで実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
前記第１および第２の核タンパク質プライマーが、各々、前記標的核酸分子の濃度よりも少なくとも１０００倍大きいモル濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１種類の核酸プライマーが、該核酸プライマーの５’末端に、前記標的核酸分子に相補的でない１個以上の塩基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記標的核酸分子に相補的でない１個以上の塩基が、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
該少なくとも１種類の核酸プライマーが、部分的に単鎖および部分的に二本鎖であり、該プライマーが特異的３’プライマー配列を有する長い方の侵入性鎖、および該長い方の侵入性鎖の５’末端に相補的な短い方の非侵入性鎖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の核酸プライマーが第１の侵入性鎖および第１の非侵入性鎖を含み、前記第２の核酸プライマーが第２の侵入性鎖および第２の非侵入性鎖を含み、該第１および第２の非侵入性鎖が互いに相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記侵入性鎖、前記非侵入性鎖または両方が、検出可能な部分で標識されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記侵入性鎖および前記非侵入性鎖の両方を標識し、該侵入性鎖および該非侵入性鎖の分離を検出する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記検出可能な部分が、蛍光色素、酵素、蛍光消光剤、酵素阻害剤、放射性標識、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記侵入性鎖および前記非侵入性鎖の両方が標識され、ここで、該侵入性鎖が、第１の蛍光色素または第１の酵素で標識され、該非侵入性鎖が、第２の蛍光色素、第２の酵素、蛍光消光剤または酵素阻害剤で標識される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記侵入性鎖および前記非侵入性鎖の両方が標識され、ここで、該非侵入性鎖が、第１の蛍光色素または第１の酵素で標識され、該侵入性鎖が、第２の蛍光色素、第２の酵素、蛍光消光剤または酵素阻害剤で標識される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
核酸プライマーの一方または両方が単鎖プライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記核酸プライマーが、蛍光色素、酵素、蛍光消光剤、酵素阻害剤、放射性標識およびそれらの組合せからなる群より選択される検出可能な部分で標識されている、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が温度感受性であり、該温度感受性ｕｖｓＸリコンビナーゼ因子が、許容温度で鎖侵入活性を有するが、非許容温度では鎖侵入活性を有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的核酸が、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１，０００，０００倍からなる群より選択されるの量に増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記工程（ｂ）および（ｃ）が、少なくとも１回または少なくとも５回反復される、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的核酸分子が、遺伝的疾患と関連する少なくとも１つの特異的変異を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的核酸分子が、病原性生物、癌遺伝子、活性化された癌遺伝子、または抑制された癌遺伝子内に含有されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１種類のプライマーが、遺伝的疾患と関連する配列、病原性生物内の核酸配列、癌遺伝子、活性化された癌遺伝子、または抑制された癌遺伝子に相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
（ａ）請求項１に記載の前記リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法を用い、第１および第２のプライマーを用いてＤＮＡの一領域を増幅し、第１の増幅産物を生成させる工程；
（ｂ）第３および第４のプライマーを用い、請求項１に記載の該リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法を用いて前記増幅産物を増幅し、第２の増幅産物を生成させる工程、ここで、該第２の増幅産物が該第１の増幅産物内に含有されたより短い配列である、
を含む、ネステッドリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項５４】
前記第１のプライマー、前記第２のプライマー、前記第３のプライマーおよび前記第４のプライマーが、各々異なる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１のプライマーおよび前記第２のプライマーの一方が、前記第３および第４のプライマーの一方と同一である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
第１および第２のＤＮＡ鎖を含む標的核酸分子のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、
（ａ）溶液中で、ｕｖｓＸリコンビナーゼタンパク質を核酸プライマーと接触させ、単鎖領域をその３’末端に含む核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）該核タンパク質プライマーを前記標的核酸分子と接触させ、それにより、二本鎖構造を、前記標的核酸分子の一部分に形成させる工程；
（ｃ）該核タンパク質プライマーの３’末端を、ｄＮＴＰおよび鎖置換特性を有する１種類以上のポリメラーゼにより伸長させ、二本鎖核酸生成物と核酸生成物の被置換鎖とを生成させる工程；および
（ｄ）（ｂ）および（ｃ）を、所望の増幅度に達するまで反復する工程；
を含み、ここで、
該核酸生成物は、工程（ｄ）において二本鎖標的配列としての機能を果たし得る；
該溶液は、さらにｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質を、工程（ａ）で核タンパク質プライマーを飽和させるのに充分な濃度で含む；
該溶液は、さらにリコンビナーゼ負荷因子ｕｖｓＹを、０．２〜８マイクロモルの濃度で含む；
該溶液は、さらにクラウディング剤を１％〜１２％の濃度で含む；
該１種類以上のポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠き、ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ活性を欠くものである；
該溶液が、ｕｖｓＸ負荷ＤＮＡフィラメントの分解および合成を補助するのに充分な加水分解性ヌクレオシド三リン酸をさらに含む；および
該ｄＮＴＰの一部が、連鎖停止ｄＮＴＰを含む；
該ｄＮＴＰの少なくとも一部が、検出可能なマーカーで標識されている、
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項５７】
リコンビナーゼポリメラーゼ増幅により増幅された核酸生成物の有無を試料中において検出する方法であって、
（ａ）溶液中で、Ｔ４ リコンビナーゼ因子を第１および第２の核酸プライマーと接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーを形成する工程、ここで、該核酸プライマーが、単鎖領域をその３’に含み、該第１の核酸プライマーが、第１の結合対の第１の構成員で標識され、前記第２の核酸プライマーが、第２の結合対の第１の構成員で標識されている工程；
（ｂ）該第１および第２の核タンパク質プライマーを試料と接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーと増幅産物との複合体を形成する工程；
（ｃ）該複合体を、該第１の結合対の第２の構成員で被覆された第１の移動性固相支持体、および該第２の結合対の第２の構成員で被覆された第２の移動相固体支持体に接触させる工程；
（ｄ）該第１の移動相固体支持体が、該第２の移動相固体支持体と同時局在しているか否かを調べ、該増幅により増幅された核酸生成物の存在を測定する工程；
を含み、ここで、
リコンビナーゼ負荷因子Ｔ４ ｕｖｓＹが、反応物中に０．２〜８マイクロモルの濃度で含まれる；
クラウディング剤が１％〜１２％の濃度で含まれる；
加水分解性ヌクレオシド三リン酸がリコンビナーゼ活性を補助するために用いられ、その結果、ｕｖｓＸ負荷ＤＮＡフィラメントが効率的な分解および合成を行なうことができる、
方法。
【請求項５８】
前記第１の核酸プライマーが前記増幅産物の生成に用いるプライマーと同じ核酸配列を有するか、または前記第２の核酸プライマーが該増幅産物の生成に用いるプライマーと同じ核酸配列を有するか、またはその両方である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記第１または第２のプライマーが、前記リコンビナーゼポリメラーゼ増幅反応による前記標的の増幅後に、前記リコンビナーゼにより媒介される三重らせんの形成によって該標的ＤＮＡと会合する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
（ａ）溶液中で、ｕｖｓＸおよびｒｅｃＡからなる群より選択されるリコンビナーゼ因子を、第１および第２の核酸プライマーと接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）該第１および第２の核タンパク質プライマーを、該二本鎖標的核酸分子と接触させ、それにより、第１の二本鎖構造を該標的核酸分子の第１の部分に、および第２の二本鎖構造を該標的核酸分子の第２の部分に、該第１の核酸プライマーおよび該第２の核酸プライマーの３’末端が、該鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるように形成する；
（ｃ）該標的核酸分子を、プライモソーム合成タンパク質およびクランプ負荷体／ポリメラーゼホロ酵素複合体と接触させ、複製フォークを該標的核酸分子の前記第１の部分に、および第２の複製フォークを該標的核酸分子の前記第２の部分に形成させる工程；
（ｄ）該標的分子を、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩコア、ＤＮＡポリメラーゼＩ、プライマーゼ、ヘリカーゼ、およびリガーゼと接触させ、リーディング鎖／ラギング鎖連結型ＤＮＡ合成および各複製フォークの互いへの移動を可能にする工程；および
（ｅ）（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）を、所望の増幅度に達するまで反復する工程；
を含み、ここで、
ｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、工程（ａ）で該第１および第２の核酸プライマーを溶液中で飽和させるのに少なくとも充分な濃度で含まれる；
リコンビナーゼ負荷因子ｕｖｓＹまたは大腸菌ｒｅｃＯおよびｒｅｃＲ遺伝子産物が、反応物中に、０．２〜８マイクロモルの濃度で含まれる；
クラウディング剤が少なくとも１％〜１２％の濃度で含まれる；
加水分解性ヌクレオシド三リン酸がリコンビナーゼ活性を補助するために用いられ、その結果、リコンビナーゼ負荷ＤＮＡフィラメントが効率的な分解および合成を行なうことができる、
二本鎖標的分子のＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項６１】
ｄＮＴＰ、ｒＮＴＰ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、またはそれらの組合せの存在下で行なわれる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記プライモソーム合成タンパク質が、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＣ、ＤｎａＢ、ＤｎａＧ、Ｐｏｌ ＩＩＩホロ酵素、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記クランプ負荷体がＤｎａＸクランプ負荷体複合体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素が大腸菌ポリメラーゼＩＩＩである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＤＮＡポリメラーゼＩが大腸菌ポリメラーゼＩである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６６】
前記プライマーゼが大腸菌ＤｎａＧ プライマーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６７】
前記ヘリカーゼが大腸菌ＤｎａＢヘリカーゼである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
（ａ）以下の試薬
（１）少なくとも１種類のリコンビナーゼ；
（２）少なくとも１種類の単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；
（３）少なくとも１種類のＤＮＡポリメラーゼ；
（４）ｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物
（５）クラウディング剤；
（６）バッファー；
（７）還元剤；
（８）ＡＴＰまたは加水分解性ＡＴＰアナログ；
（９）少なくとも１種類のリコンビナーゼ負荷タンパク質；
（１０）第１のプライマー、および任意選択で第２のプライマー；および
（１１）標的核酸分子
を溶液中で合わせる工程；ならびに
（ｂ）該溶液を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項６９】
前記リコンビナーゼが、ｕｖｓＸ、ｒｅｃＡならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記リコンビナーゼが、短いタグ配列をＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記リコンビナーゼが、酸性残基のＣ末端欠失を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記リコンビナーゼが、約０．２μＭ〜約１μＭ、約１μＭ〜約４μＭ、約４μＭ〜約６μＭ、約６μＭ〜約１２μＭ、および約０．２μＭ〜約１２μＭからなる群より選択されるの濃度で存在する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、ｇｐ３２、ならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記ｇｐ３２誘導体が、ｇｐ３２（Ｎ）、ｇｐ３２（Ｃ）、ｇｐ３２（Ｃ）Ｋ３Ａ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２（Ｃ）Ｒ４Ｔ、ｇｐ３２Ｋ３Ａ、ｇｐ３２Ｒ４Ｑ、ｇｐ３２Ｒ４Ｔおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が、１μＭ〜３０μＭの濃度で存在する、請求項６８に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＤＮＡポリメラーゼが真核生物のポリメラーゼまたは原核生物のポリメラーゼである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７７】
前記真核生物のポリメラーゼが、ｐｏｌ−α、ｐｏｌ−β、ｐｏｌ−δ、ｐｏｌ−εならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記原核生物のポリメラーゼが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩクレノウ断片、バクテリオファージＴ４ ｇｐ４３ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ポリメラーゼＩラージフラグメント、φ−２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｕ Ｐｏｌ Ｉ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＶ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＶならびにその誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、短いタグ配列をＮ末端またはＣ末端に含む融合タンパク質である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、１０，０００単位／ｍｌ〜１６単位／ｍｌまたは５０００単位／ｍｌ〜５００単位／ｍｌの濃度である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記１種類以上のＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く少なくとも１種類のＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８２】
前記１種類以上のＤＮＡポリメラーゼが、鎖置換特性を有するＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項８３】
前記ｄＮＴＰが１ｍＭ〜４０μＭの濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８４】
前記クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、デキストラン、フィコールまたはそれらの組合せである、請求項６８に記載の方法。
【請求項８５】
前記ポリエチレングリコールが、反応物の重量または容量の１〜１２％である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記ポリエチレングリコールが、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００、１５，０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧ混合物、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記バッファーが、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、Ｔｒｉｓ−酢酸塩バッファー、またはそれらの組合せである、請求項６８に記載の方法。
【請求項８８】
前記バッファーが、１０〜６０ｍＭの濃度および６．５〜９．０のｐＨである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記還元剤がＤＴＴである、請求項６８に記載の方法。
【請求項９０】
前記還元剤が１〜１０ｍＭの濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９１】
前記ＡＴＰまたはＡＴＰアナログが、ＡＴＰ、ＡＴＰ−γ−Ｓ、ＡＴＰ−β−ＳおよびｄｄＡＴＰからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項９２】
前記ＡＴＰまたはＡＴＰアナログが１〜１０ｍＭの濃度である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記リコンビナーゼ負荷タンパク質が、Ｔ４ｕｖｓＹ、大腸菌ｒｅｃＯ、大腸菌ｒｅｃＲならびにそれらの誘導体および組合せからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項９４】
前記リコンビナーゼ負荷タンパク質が、さらにポリヒスタグを、Ｎ末端、Ｃ末端、またはＮ末端とＣ末端の両方に含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９５】
前記リコンビナーゼ負荷タンパク質が０．２〜８μＭの濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９６】
第１または第２のプライマーが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルホリノ主鎖核酸、ホスホロチオレート主鎖核酸またはそれらの組合せを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項９７】
前記第１または第２のプライマーが１００ｎＭ〜１０００ｎＭの濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９８】
前記第１または第２のプライマーが、その３’末端の２つの塩基間に非リン酸結合を含み、３’→５’ヌクレアーゼ活性に対して抵抗性である、請求項６８に記載の方法。
【請求項９９】
前記第１または第２のプライマーが少なくとも１種類のロックされた核酸を、その３’の最後の塩基または３’の最後から２番目の塩基に含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１００】
前記第１または第２のプライマーが少なくとも２０塩基長である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第１または第２のプライマーが少なくとも３０塩基長である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記第１または第２のプライマーが、その５’末端に、標的核酸分子に相補的でない１個以上の塩基をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０３】
前記１個以上の塩基が制限エンドヌクレアーゼ認識部位の配列を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記第１または第２のプライマーが部分的に二本鎖であり、単鎖領域をその３’末端に有する、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０５】
少なくとも１種類のプライマーが検出可能な標識で標識されている、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０６】
前記検出可能な標識が、蛍光色素、酵素、蛍光消光剤、酵素阻害剤、放射性標識およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記標的核酸分子が、スーパーコイル核酸、２つの末端を有して該末端の両方が非標的核酸分子に連結されている線状核酸、２つの末端を有して該末端の一方が非標的核酸分子に連結されている線状核酸、線状核酸、およびポリメラーゼによって二本鎖核酸に変換されるか、または加熱または化学的処理の作用によって変性される二本鎖核酸に変換される単鎖核酸分子、からなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０８】
前記標的核酸が、１０００コピー未満／ｍｌまたは１〜１０コピー／反応の濃度である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１０９】
前記インキュベーションが５分間〜１６時間である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記インキュベーションが１５分間〜３時間である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１１】
前記インキュベーションが３０分間〜２時間である、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１２】
前記インキュベーションが、所望の増幅度に達するまで行なわれる、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１３】
前記所望の増幅度が、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１０，０００倍、少なくとも１００，０００倍および少なくとも１００００００倍からなる群より選択される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記インキュベーションが、２０℃〜５０℃、２０℃〜４０℃の間、または２０℃〜３０℃の間で行なわれる、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１５】
前記鋳型核酸の温度誘導性融解なしで行なわれる、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１６】
工程（ａ）が、アクセサリー因子をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１１７】
前記アクセサリー因子が、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、リゾルベースおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記アクセサリー因子が、ＲｕｖＡ、ＲｕｖＢ、ＲｕｖＣ、ＲｅｃＧ、ＰｒｉＡ、ＰｒｉＢ、ＰｒｉＣ、ＤｎａＴ、ＤｎａＢ、ＤｎａＣ、ＤｎａＧ、ＤｎａＸクランプ負荷体、ポリメラーゼコア複合体、ＤＮＡリガーゼ、スライディングクランプ、β−クランプ、ＤｎａＸクランプ負荷体およびポリメラーゼコア複合体からなるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素複合体からなる群より選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
前記スライディングクランプが、大腸菌β−二量体スライディングクランプ、真核生物のＰＣＮＡスライディングクランプ、またはＴ４スライディングクランプｇｐ４５およびそれらの組合せである、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
工程（ａ）が、ＲｅｃＡ／ｓｓＤＮＡ核タンパク質フィラメント安定化因子をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記安定化因子が、ＲｅｃＲ、ＲｅｃＯ、ＲｅｃＦおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記安定化剤が０．０１μＭ〜２０μＭの濃度である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２３】
前記溶液が、ＡＤＰをＡＴＰに変換するためのＡＴＰ再生系、ＡＤＰをＡＭＰから再生させるための系、ピロリン酸塩をリン酸塩に変換するための系、またはそれらの組合せをさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項１２４】
前記ＡＴＰ再生系が、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
１種類以上の試薬を前記工程（ａ）の前にフリーズドライさせ、該試薬が、リコンビナーゼ、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰもしくはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物、還元剤、ＡＴＰもしくはＡＴＰアナログ、リコンビナーゼ負荷タンパク質、クラウディング剤、バッファー、塩、ＤＴＴ、および第１のプライマー、ならびに任意選択で第２のプライマー、またはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項１２６】
（ａ）以下の試薬
（１）０．２〜１２μＭの濃度のｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）１〜３０μＭの濃度のｇｐ３２単鎖ＤＮＡ結合タンパク質；
（３）５０〜５０００単位／ｍｌの濃度のＢｓｕポリメラーゼ；
（４）１〜５００μＭの濃度のｄＮＴＰまたはｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物；
（５）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール；
（６）２５ｍＭ〜６０ｍＭのの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（７）１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＤＴＴ；
（８）１．５ｍＭ〜５ｍＭの濃度のＡＴＰ；
（９）０．２μＭ〜８μＭの濃度のｕｖｓＹ；
（１０）第１のプライマー、および任意選択で第２のプライマー、ここで、該プライマーは１０ｎＭ〜１μＭの濃度である；ならびに
（１１）少なくとも１つのコピーの標的核酸分子
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１２７】
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌ ｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）６００ｎｇ／μｌ ｇｐ３２；
（３）２０ｎｇ／μｌ Ｂｓｕポリメラーゼ；
（４）２００μＭ ｄＮＴＰ；
（５）１ｍＭ ＤＴＴ
（６）３ｍＭ ＡＴＰまたは加水分解性ＡＴＰアナログ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌ ｕｖｓ Ｙ
（８）３００ｎＭの第１のプライマーおよび３００ｎＭの第２のプライマー；
（９）１００ｍＭ酢酸カリウム
（１０）８〜１６ｍＭ酢酸マグネシウム
（１１）２５ｍＭクレアチンリン酸
（１２）１００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール；
（３）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１２８】
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌ ｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）３００〜１０００ｎｇ／μｌ ｇｐ３２；
（３）１０〜５０ｎｇ／μｌ ＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）５０〜５００μＭ ｄＮＴＰ；
（５）０．１〜１０ｍＭ ＤＴＴ
（６）３ｍＭ ＡＴＰまたは加水分解性ＡＴＰアナログ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌ ｕｖｓＹ
（８）５０〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０〜１０００ｎＭの第２のプライマー；
（９）４０〜１６０ｍＭ酢酸カリウム
（１０）５〜２０ｍＭ酢酸マグネシウム
（１１）１０〜４０ｍＭクレアチンリン酸
（１２）５０〜２００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール；
（３）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程．
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１２９】
（ａ）以下の試薬
（１）１００〜２００ｎｇ／μｌ ｕｖｓＸリコンビナーゼ；
（２）３００〜１０００ｎｇ／μｌ ｇｐ３２；
（３）１０〜５０ｎｇ／μｌ ＢｓｕポリメラーゼまたはＴ４ポリメラーゼ；
（４）５０〜５００μＭ ｄＮＴＰ；
（５）０．１〜１０ｍＭ ＤＴＴ
（６）３ｍＭ ＡＴＰまたはＡＴＰアナログ；
（７）１６ｎｇ／μｌ〜６０ｎｇ／μｌ ｕｖｓＹ
（８）５０〜１０００ｎＭの第１のプライマーおよび５０〜１０００ｎＭの第２のプライマー；
（９）４０〜１６０ｍＭ酢酸カリウム
（１０）５〜２０ｍＭ酢酸マグネシウム
（１１）１０〜４０ｍＭクレアチンリン酸
（１２）５０〜２００ｎｇ／μｌクレアチンキナーゼ
（１３）１％〜１２％（重量または容量基準）の濃度のポリエチレングリコール
を反応物中で合わせる工程；
（ｂ）該工程（ａ）の試薬を凍結乾燥して凍結乾燥試薬を形成する工程；
（ｃ）該凍結乾燥試薬を
（１）１ｍＭ〜６０ｍＭの濃度のＴｒｉｓ−酢酸バッファー；
（２）標的核酸
により再構成する工程；
（ｄ）該反応物を所望の増幅度に達するまでインキュベートする工程
を含む、ＤＮＡを増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
【請求項１３０】
フリーズドライする前に、トレハロースを前記試薬に添加する、請求項１２７、１２８または１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記トレハロースを前記試薬に、１０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度で添加する、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１および第２の核酸プライマーと接触させ、第１および第２の核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）第１および第２の核タンパク質プライマーを二本鎖標的配列と接触させ、それにより、該第１の核酸プライマーおよび該第２の核酸プライマーの３’末端が同じ鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるように、該第１の鎖の第１の部分に第１の二本鎖構造を形成し、該第２の鎖の第２の部分に二本鎖構造を形成する工程；
（ｃ）該第１および第２の核タンパク質プライマーの３’末端を、１種類以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて伸長させ、第１および第２の二本鎖核酸と核酸の第１および第２の被置換鎖とを生成させる工程；
（ｄ）（ｂ）と（ｃ）の反復により所望の増幅度に達するまで反応を継続させる工程
を含み、ここで、
生成された二本鎖核酸が、二本鎖標的配列としての機能を果たし得る、
第１および第２のＤＮＡ鎖を含む二本鎖標的配列のＤＮＡを増幅するＲＰＡ法。
【請求項１３３】
前記第１または第２の核酸プライマーが、非特異的増幅反応を減少する最適鎖交換に必要とされる長さより短い長さを有する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記第１または第２の核酸プライマーが２５〜２９残基長または１６〜２４残基長である、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
工程（ｂ）の前に、折り返しプライミングを低減させるため、または核タンパク質組換え／伸長速度を調節するための、さらなる核酸配列を前記標的核酸の少なくとも１つの末端にライゲートする工程をさらに含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３６】
前記第１または第２の核酸プライマーが１種類以上の改変糖残基を含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３７】
前記改変糖残基が、ロックされた核酸、リボース、２’−Ｏ−メチルリボース、非環式糖残基およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記改変糖残基がプライマーの最も３’側の位置に存在する、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
前記方法の実施中の全ＤＮＡ濃度をセンサーでモニタリングする工程をさらに含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１４０】
前記センサーが、蛍光測定によってＤＮＡ濃度検出するか、ＳＹＢＲ金またはＳＹＢＲ緑由来の蛍光を検出するか、配列特異的にＤＮＡ濃度を検出するか、またはそれらの組合せである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
該センサーが、反応物中の単鎖標的へのハイブリダイゼーションによって機能を果たす、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
前記ハイブリダーゼーションが、単鎖ＤＮＡ結合タンパク質またはリコンビナーゼなどの融解／アニーリング因子によって助長される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記センサーが、二本鎖ＤＮＡ標的に対するリコンビナーゼ媒介性標的化によって機能を果たす、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４４】
前記センサーが、標的ＤＮＡ内の標的部位に隣接してハイブリダイズした場合のみ特異的蛍光共鳴エネルギー移動を受ける２つ以上の蛍光標識された配列特異的オリゴヌクレオチドを含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４５】
前記センサー内に存在するフルオロフォアが、ともに該センサーに結合された消光剤から、該センサーがその標的部位に結合された場合のみ機能を果たすヌクレアーゼの作用によって分離される、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ヌクレアーゼが二本鎖ヌクレアーゼである、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
前記二本鎖ヌクレアーゼが制限エンドヌクレアーゼである、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
前記ＲＰＡ法が、１種類以上のケージ化物質の光誘発性光脱保護によって開始または制御される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１４９】
前記ケージ化物質がケージ化ＡＴＰまたはケージ化オリゴヌクレオチドである、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記プライマー、ＡＴＰまたはヌクレオチドの１種類以上がケージ化分子であり、工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）が、非ケージ化分子を生成する該ケージ化分子の光媒介性光脱保護によって制御または開始される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
前記非ケージ化分子の濃度をモニタリングする、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５２】
前記非ケージ化分子がＲＰＡの１回以上のサイクルで消費され、それにより、さらなる非ケージ化分子が生成されるまで前記ＲＰＡ反応を停止させる、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ケージ化分子が、ケージ化ＡＴＰ、ケージ化ｄＡＴＰ、およびケージ化ＵＴＰからなる群より選択される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５４】
前記プライマー、ＡＴＰまたはＮＴＰの１種類以上が、工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の１サイクルのみを支持し得る濃度であり、さらなる工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）が、新たな量の前記プライマー、ＡＴＰまたはＮＴＰの１種類以上の添加によって開始される、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１５５】
前記新たな量の前記プライマー、ＡＴＰまたはＮＴＰの１種類以上が、工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の１サイクルのみを支持し得る濃度で供給される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記新たな量の前記プライマー、ＡＴＰまたはＮＴＰの１種類以上が、酵素性の系の作用によって供給される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
前記ＲＰＡ法が、反応物中に蓄積されるＡＤＰを、リコンビナーゼ活性を調節しない化合物へのその直接変換によって除去する酵素；反応物中に蓄積されるＡＤＰを、ＡＤＰ、ＡＴＰまたは同等物でない化合物へのその直接変換によって除去する酵素系；すべてのＡＤＰをＡＴＰに変換し、前記反応物中のＡＤＰ濃度を低下させる酵素系；前記方法においてＡＴＰを低減させ、工程（ｂ）および（ｃ）後にＲＰＡ反応を停止させる酵素系であって、さらなる工程（ｂ）および（ｃ）がＡＴＰの添加によって開始される系、からなる群より選択される酵素系の存在下で行なわれる、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１５８】
前記ＡＴＰの添加がケージ化ＡＴＰの脱ケージ化によって行なわれる、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記ケージ化ＡＴＰが光励起によって脱ケージ化される、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
前記光励起が、１０μＭ〜３０μＭ ＡＴＰ、３０μＭ〜６０μＭ ＡＴＰ、６０μＭ〜９０μＭ ＡＴＰ、９０μＭ〜２００μＭ ＡＴＰ、２００μＭ〜５００μＭ ＡＴＰまたは５００μＭ〜３０００μＭ ＡＴＰの有効な濃度増加をもたらす、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
前記反応物中のＡＴＰ濃度をセンサーによってモニタリングする、請求項１３２または１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
前記ＡＴＰセンサーがルシフェラーゼおよびルシフェリンを含む、請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
前記プライマーが、リコンビナーゼ相互作用を改善するために高いシトシン含量を含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１６４】
前記シトシン含量が該プライマーの塩基の７５％より多い、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
鋳型核酸およびＲＰＡ産物の移動を制限するゲルマトリックス内で行なわれる、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１６６】
前記ゲルマトリックスがポロニーゲルマトリックスである、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
（ａ）請求項１３２に記載のＲＰＡ反応を、前記工程（ａ）において第１のアウタープライマー対および第２のインナープライマー対の存在下で行なう工程
を含み、ここで、
該第１のアウタープライマー対が、工程（ｂ）の後、該アウタープライマー対の３’末端が同じ鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるような核酸配列を含む；
該第２のインナープライマー対が、工程（ｂ）の後、該インナープライマー対の３’末端が同じ鋳型核酸分子上で互いに向かって配向されるような核酸配列を含む、
さらに、ここで、該第２のインナープライマー対が標的核酸と、該第１のアウタープライマー対のハイブリダーゼーション位置の内である位置でハイブリダイズする、
ネステッドＲＰＡ法。
【請求項１６８】
前記第１のアウタープライマー対が、前記インナープライマー対と比べて、長さまたは組成のため、より迅速な増幅反応速度論を支持する、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
前記第１のアウタープライマー対が前記第２のインナープライマー対の濃度より低い濃度である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７０】
少なくとも１種類のプライマーが、固定化されているかまたは固定化可能であり、少なくとも１種類の他のプライマーが、標識されたプライマーであり、前記第２のプライマーへの前記第１のプライマーのハイブリダーゼーションを工程（ｄ）の後に測定する、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７１】
前記固定化可能なプライマーおよび前記標識されたプライマーが、前記ＲＰＡ反応における唯一のプライマーである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
固定化可能なプライマーが、ＲＰＡ反応において２種類以上の他のプライマーによって生成されたＤＮＡ内の特有配列とハイブリダイズする、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記固定化可能なプライマーが、非分枝の移動可能な二本鎖の形成によって安定な生成物捕捉を可能にするバックファイヤープライマーである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
標識されたプライマーが、非分枝の移動可能な二本鎖の形成によって安定な生成物捕捉を可能にするバックファイヤープライマーである、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７５】
ｄＵＴＰの存在下で、ｄＵＴＰがＲＰＡ産物内に組み込まれるように行なわれ、前記ＲＰＡ産物がｄＵＴＰ脱グリコシル化酵素に対して感受性である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７６】
プライマーの蛍光をモニタリングすることにより前記ＲＰＡ反応をモニターする工程をさらに含み、ここで、前記プライマーの１つが、フルオロフォアと、１０〜１２残基以下の間隔分離れている消光剤とからなる二重標識オリゴヌクレオチドプローブであり、該消光剤は、プライマーがハイブリダイズされていない状態場合、ハイブリダイズされた状態よりもより効率的である、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７７】
プライマーの蛍光をモニターすることにより前記ＲＰＡ反応をモニターする工程をさらに含み、ここで、前記プライマーの１つが、フルオロフォアと、１０〜１２残基以下の間隔分離れている消光剤とからなる二重標識オリゴヌクレオチドプローブであり、ヌクレアーゼ活性がプローブと標的間の二本鎖ハイブリッドに対して優先的に作用し、最終的に消光剤とフルオロフォア間の会合の低下がもたらされる結果として、蛍光が増加する、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７８】
該プライマーの１つ以上が、最初に３’−ブロックされており、かつテトラヒドロフラニル残基を含有し、大腸菌Ｎｆｏタンパク質または機能的同等物を前記ＲＰＡ法において存在させ、ブロックされたオリゴヌクレオチドが、標的ＤＮＡと二本鎖ハイブリッドを形成し、続いてＮｆｏタンパク質または機能的ホモログによってプロセッシングされ、ポリメラーゼが、Ｎｆｏ切断によって生成したプローブの遊離３’末端を伸長させる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記ブロックされたプライマーが、テトラヒドロフラニル残基、フルオロフォア、および消光性副溝結合色素を含有し、その結果、二本鎖ハイブリッドが形成されると、消光が、フルオロフォア由来の蛍光発光の増大がＤＮＡ増幅の結果として増加するような副溝結合色素の吸収特性の変化によって減少する、請求項１７８に記載の方法。
【請求項１８０】
前記リコンビナーゼが、Ｔ４ファージＵｖｓＸ、大腸菌ＲｅｃＡ、または真核生物のＲａｄ５１からなる群より選択される、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１８１】
前記ＲＰＡがクラウディング剤の存在下で行なわれる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１８２】
分子クラウディング剤が、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、フィコール、デキストラン、およびポリビニルピロリドンからなる群より選択される、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
前記ＲＰＡが再負荷促進剤の存在下で行なわれる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１８４】
再負荷促進剤が、Ｔ４ ＵｖｓＹ、大腸菌ＲｅｃＯ、大腸菌ＲｅｃＲ、ならびにそれらの組合せおよびホモログからなる群より選択される、請求項１８３に記載の方法。
【請求項１８５】
ＤＮＡリガーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼ、５’−３’エキソヌクレアーゼ、３’−５’エキソヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼおよび塩基特異的損傷塩基特異的ヌクレアーゼからなる群より選択される酵素の存在下で行なわれる、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１８６】
前記ＦＬＡＰエンドヌクレアーゼがヒトＦＥＮｌまたはその同等物である、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８７】
前記エンドヌクレアーゼがらせん変形認識エンドヌクレアーゼまたは塩基特異的損傷塩基特異的ヌクレアーゼである、請求項１８５に記載の方法。
【請求項１８８】
前記らせん変形認識エンドヌクレアーゼがＳｌヌクレアーゼである、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１８９】
前記塩基特異的損傷塩基特異的ヌクレアーゼが、大腸菌Ｆｐｇタンパク質、大腸菌Ｎｔｈ、および大腸菌Ｎｆｏからなる群より選択される、請求項１８７に記載の方法。
【請求項１９０】
少なくとも１種類の前記プライマーが、プライマーにおいてリコンビナーゼの最適シードおよびフェーズ決定特性を可能にするさらなる核酸配列を含む、請求項１６７に記載の方法。
【請求項１９１】
さらなるＤＮＡ配列が、７０％より多いピリミジンまたは７５％より多いシトシン残基を含む、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
標的ＤＮＡ配列が、複製反応中、部分的または完全に二本鎖であり、その結果、固有の鎖置換活性を有するポリメラーゼが必要とされる；
少なくとも１つのポリメラーゼが有意な鎖置換活性を有する；
単鎖ＤＮＡ結合タンパク質が存在する；
クラウディング剤が、１重量％／容量以上、反応物中に存在する；および
約３０℃〜約３９℃の温度で行なわれる、
請求項１６７に記載の方法
【請求項１９３】
（ａ）リコンビナーゼ因子を第１の核酸プライマーと接触させ、第１の核タンパク質プライマーを形成する工程；
（ｂ）リコンビナーゼ因子を含有しない第２の核酸プライマーを提供する工程；
（ｃ）第１の核タンパク質プライマーを前記二本鎖標的配列に接触させ、それにより、前記第１の鎖の第１の部分に第１の二本鎖構造を形成させる工程；
（ｄ）前記第１の核タンパク質プライマーの３’末端を１種類以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより伸長させ、二本鎖核酸および核酸の第１の被置換鎖を生成させる工程；
（ｅ）前記第２の核酸プライマーを前記核酸の第１の被置換鎖にハイブリダイズさせて前記第２の核酸プライマーの３’末端を１種類以上のポリメラーゼおよびｄＮＴＰにより伸長し、二本鎖核酸を生成させる工程；
（ｆ）（ｃ）および（ｅ）の反復により所望の増幅度に達するまで反応を継続させる工程
を含み、ここで、
前記工程（ｃ）〜（ｅ）が、同時にまたは順次行なわれ、生成された二本鎖核酸が、二本鎖標的配列としての機能を果たし得る、
第１および第２のＤＮＡ鎖を含む二本鎖標的配列のＤＮＡを増幅するＲＰＡ法。
【請求項１９４】
前記第２のプライマーが、リコンビナーゼ機能および前記標的核酸に対する実質的なリコンビナーゼ媒介性配列標的化の関与には短すぎるが、ハイブリダイゼーションおよび伸長反応には充分な長さである、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９５】
前記第２のプライマーが、実質的なリコンビナーゼ媒介性配列標的化の関与について抑制される、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９６】
前記第２のプライマーが１種類以上の修飾ヌクレオチドを含み、実質的なリコンビナーゼ媒介性配列標的化の関与について抑制される、請求項１９３に記載の方法。
【請求項１９７】
修飾ヌクレオチドがロックされた核酸糖を含む、請求項１９６に記載の方法。
【請求項１９８】
（ｉ）試料ＤＮＡと１種類以上のプローブとハイブリダイズさせ、リコンビナーゼを含む反応物中に１個以上のハイブリッド領域を形成させる工程、ここで、前記１種類以上のプローブが、前記試料ＤＮＡにおいて生じ得る配列バリアントに対応し、試料またはプローブのいずれかが二本鎖である；
（ｉｉ）不完全なハイブリッドの不安定化領域を増強する工程；
（ｉｉｉ）プローブと試料間で形成された完全なハイブリッドを、最初にプローブまたは試料核酸のいずれかに存在する標識の有無を検出することにより検出する工程
を含む、多型性ＤＮＡ試料の解析方法。
【請求項１９９】
前記増強する工程が酵素により行なわれる、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２００】
酵素がリコンビナーゼである、請求項１９９に記載の方法。
【請求項２０１】
前記リコンビナーゼがＴ４ ｕｖｓＸタンパク質である、請求項２００に記載の方法。
【請求項２０２】
前記方法が、Ｔ４ ｇｐ３２タンパク質、Ｔ４ｕｖｓＹタンパク質、ＡＴＰ、クラウディング剤からなる群より選択されるさらなる成分の存在下で行なわれる、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０３】
前記クラウディング剤が、ポリ塩化ビニル、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール混合物、フィコール、ポリデキストラン、ウシ血清アルブミン、およびポリビニルピロリドンからなる群より選択される、請求項２０２に記載の方法。
【請求項２０４】
前記ポリエチレングリコール混合物が、１５，０００〜２０，０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールを含む、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０５】
ＡＴＰ再生系をさらに含む、請求項２０３に記載の方法。
【請求項２０６】
不完全なハイブリッドの不安定化助長するためにヘリカーゼを含める、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２０７】
前記ヘリカーゼが、大腸菌ＰｒｉＡ、大腸菌ＤｎａＢヘリカーゼ、大腸菌ＲｕｖＡＢヘリカーゼ、Ｔ４ファージｇｐ４１、Ｔ４ファージｄｄａヘリカーゼを含む群に属する、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０８】
前記ヘリカーゼが、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用などのプローブと表面間の安定な非共有結合性相互作用を物理的に破壊する、請求項２０６に記載の方法。
【請求項２０９】
内部に誤対合形成領域があるＤＮＡ鋳型、または内部にバブルがあるＤＮＡ鋳型に対して作用するヌクレアーゼを含める、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１０】
前記ヌクレアーゼが、Ｓｌヌクレアーゼ、Ｐｌヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼ、ＣｅｌＩヌクレアーゼを含む群に属する、請求項２０９に記載の方法。
【請求項２１１】
ニックまたは小ギャップから合成を開始できるＤＮＡポリメラーゼを反応物中に含めて増幅ＤＮＡ試料を作製する、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１２】
反応の開始時、増幅ＤＮＡ試料が本質的に有意に単鎖であり、プローブが本質的に主に二本鎖または単鎖である、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１３】
増幅された試料ＤＮＡまたはプローブ核酸が、標識を一方または両方の鎖の一方の末端に含む、請求項２１１に記載の方法。
【請求項２１４】
前記標識が、蛍光基、量子ドット、消光剤、常磁性粒子、酵素性部分からなる群より選択される、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１５】
前記酵素性部分が、酵素または無機系触媒である、請求項２１４に記載の方法。
【請求項２１６】
前記標識が、別の分子、特に、例えば抗体と既知抗原と高親和性の非共有相互作用を形成できる存在物である、請求項２１３に記載の方法。
【請求項２１７】
前記プローブおよび前記試料核酸の両方が標識を含む、請求項１９８に記載の方法。
【請求項２１８】
前記標識が、フルオロフォアおよび／または消光剤からなる、請求項２１７に記載の方法。
【請求項２１９】
（ａ）光検出センサーを含む反応チャンバ；および
（ｂ）温度を３３〜３９℃に維持するための非サイクル式温度制御手段
を備えるＲＰＡ反応を行なうための装置。
【請求項２２０】
前記光検出センサーが蛍光検出センサーである、請求項２１９に記載の装置。
【請求項２２１】
前記光検出センサーによる光測定を行なうために前記反応チャンバを照射するための１個以上の発光ダイオードをさらに備える、請求項２１９に記載の装置。
【請求項２２２】
前記センサーがピンダイオードまたはピンダイオードのアレイを備える、請求項２１９に記載の装置。
【図１】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図３Ｃ】
【図３Ｄ】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５２】
【図５３】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６０】
【図６１】
【図６２】
【図６３】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
【図６７】
【図６８】
【図６９】
【図７０】
【図７１】
【図７２】
【図７３】
【図７４】
【図７５】
【図７６】
【公表番号】特表２００８−５００８３１（Ｐ２００８−５００８３１Ａ）
【公表日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５１４２０１（Ｐ２００７−５１４２０１）
【出願日】平成１７年４月１１日（２００５．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１５６０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８８５３
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０６３９９０８８）エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年４月１１日（２００５．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００５／００１５６０
【国際公開番号】ＷＯ２００５／１１８８５３
【国際公開日】平成１７年１２月１５日（２００５．１２．１５）
【出願人】（５０６３９９０８８）エーエスエム サイエンティフィック， インコーポレイテッド (6)
【Ｆターム（参考）】
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