リポソームの連続大量製造方法およびその装置
【課題】抗原等を内包するリポソームを均質にかつ大量に製造する装置を提供する。
【解決手段】長尺エンドレスベルトを連続的に脂質溶液に通して引き上げ、脂質を減圧又は温風乾燥してベルト表面に薄膜として保持し、その後連続的に水又は緩衝液中に該長尺エンドレスベルトを通して水和させながらベルト上から脂質を超音波又はその他の機械的振動又は振動するブラシ等により掻き落とし水中にリポソームを連続形成させることを特徴とする装置。
【解決手段】長尺エンドレスベルトを連続的に脂質溶液に通して引き上げ、脂質を減圧又は温風乾燥してベルト表面に薄膜として保持し、その後連続的に水又は緩衝液中に該長尺エンドレスベルトを通して水和させながらベルト上から脂質を超音波又はその他の機械的振動又は振動するブラシ等により掻き落とし水中にリポソームを連続形成させることを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドレスベルト上に連続的に脂質薄膜を形成させることによるリポソームの連続的大量製造方法およびそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質の閉鎖小胞体であるリポソームは、生分解性、非毒性であり、薬物が相対的に不透過性の脂質２重膜に封入されていることより薬物輸送用の担体として利用されている。またリポソームを抗原キャリヤーとすることでアジュバント効果が期待できることよりワクチン製剤においてもしばしば利用されている。多層膜リポソームは、バンガム法、すなわちロータリーエバポレーターボルテクスィング法によって容易に得られる。すなわち脂質等のリポソーム膜構成成分を有機溶媒に溶解し、ロータリーエバポレーターなどによってガラス容器の有機溶媒を除去して容器の壁に薄膜を形成させる。次いで封入すべき材料を含む水溶液を加えて薄膜を膨潤させた後、容器を振盪する（図１参照）。しかし、この方法は、薄膜を形成させるガラス容器の大きさの制限から、一度に大量に製造することができず、また振盪の方法によって薬剤の封入効率及びリポソームの平均直径にバラツキが生じやすい欠点がある（非特許文献１を参照。）。
【０００３】
リポソームを大量に生成する方法や装置に関して、たとえば脂質及び水溶液を臨界又は超臨界の流体（二酸化炭素、亜酸化窒素、プロパン、エチレンなど）で混合する方法およびその装置（特許文献１〜２を参照。）や緩衝液の貯蔵器及有機脂質容器の貯蔵器から連続的に混合室へ供給し、混合室内で精製したリポソームを第三の貯蔵器へ導く方法と装置（特許文献３を参照。）などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平９−５０２６４４号公報
【特許文献２】特開２００５−１６２７０２号公報
【特許文献３】特表２００５−５３８９６７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】A. D. Bangham et.al. J. Mol. Biol., 13, 238(1965)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、比較的簡便な装置により、大量、かつ均一な粒径を有するリポソームの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、長尺エンドレスベルトを連続的に脂質溶液に通して引き上げ、脂質を減圧又は温風乾燥してベルト表面に薄膜として保持し、その後連続的に水又は緩衝液中に該長尺エンドレスベルトを通して水和させながらベルト上から脂質を超音波又はその他の機械的振動又は振動するブラシ等により掻き落とし水中にリポソームを連続形成させることにより上記課題を解決できることを見出した。
【０００８】
長尺エンドレスベルトとしては、十分な可撓性及び有機溶媒耐性を有する材質が望ましく、例えば、合成樹脂、ガラス繊維又は金属圧延物などが使用できる。エンドレスベルトの長さ及び幅は生産規模に応じて適宜選択できるが、長さ１〜２ｍ、幅５〜２０ｃｍの範囲が使いやすい。
【０００９】
脂質液浸漬ユニット３は内部にベルトを駆動するスプロケットローラが設置されこのローラー及び次のローラーでベルトに付着した過剰な脂質液を取り除くことによりバルト上に薄膜を形成する。エンドレスベルトの表面形状は平滑面であることを基本とするが、表面に多数の浅いくぼみを設けることにより表面積を広げたベルトも使用可能であり、特に多重膜リポソームの製造効率が良い。
【００１０】
脂質膜乾燥ユニット４はエンドレスベルトの入り口側と出口側がローラーでほぼ密閉された構造となっており、内部に窒素または空気の温風を送りながら真空ポンプで減圧することにより、効率的に溶媒を除去することが可能であり、除去された溶媒はこの後に設置した溶媒回収トラップによって冷却回収される。なお、脂質膜乾燥ユニットが一台では溶媒の除去が不十分な場合は同じユニットをもう一台設置することにより溶媒を完全に除去することが可能である。
【００１１】
膜構成脂質としては、卵黄レシチン、大豆レシチン、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンなどのリン脂質やそれらの水素添加飽和物、ショ糖脂肪酸エステル、トレハロース脂肪酸エステル、ラムノース脂肪酸エステルなどの糖脂肪酸エステルの１種または２種以上、または、これらの混合物を用いることができる。
【００１２】
膜構成成分としては、この他に膜安定化剤として、コレステロールなどのステロール類、荷電物質としてフォスファチジン酸、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド、ステアリルアミンなどが、また、酸化防止剤として、トコフェロールなどを加えてもよい。これらの膜構成物質の組成比率は、特に限定されないが、リン脂質１重量部に対しステロール類０〜０．５重量部、荷電物質０〜０．１重量部、酸化防止剤を０〜０．１重量部程度加えるのが好ましい。これらをメタノール、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサンエチルエーテル、クロロホルムなどの有機溶剤に溶解して用いる。
【００１３】
水溶液は、ベルト表面に乾固した膜構成脂質を水和して膨潤、分散させるもので、水単独、生理食塩水、各種緩衝液、または、糖類を溶解した水溶液などを用いることができる。さらに薬剤、タンパク質、ウイルス及びウイルス由来抗原、細菌及び細菌菌体由来物、高分子等の物質を溶解あるいは懸濁させることができる。
【００１４】
以下、本発明のリポソームの製造法を図２によって説明する。
装置は基本的にエンドレスベルト１を矢印方向に回転させるための駆動装置（スプロケットろーらー）２、エンドレスベルトを脂質液に浸漬する脂質液浸漬ユニット３、ベルト上の脂質液溶媒を除去するための脂質膜乾燥ユニット４、ベルト上の乾燥脂質膜を内包物質懸濁液等の水溶液と水和させるリポソーム調製ユニット５及びベルトに残存する水分を除去するためのベルト乾燥ユニット６からなる。リポソーム製造ユニット５はほぼ密閉された立方体であり内部にベルト膜面を殺菌するＵＶ殺菌ユニット７、内包物質懸濁液容器８、懸濁液に振動を与える超音波発生装置９、水切りゴム１０及びベルトの出入りのためのスリット１１，１２が配置されている。エンドレスベルト１は各ユニット間及び各ユニット内に適宜設置されたローラーガイド１３に誘導されて各ユニット間を循環する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のリポソーム製造装置は、均一なリポソームを連続して大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】バンガムボルテクスィング法によるリポソームの製造方法
【図２】水和及び混合に超音波発振器を使用したリポソーム製造装置
【図３】スクレパーを使用したリポソーム製造装置
【発明を実施するための形態】
【００１７】
実施例１
図２の装置において、４００ｍｇ／ｍｌの水添大豆レシチン、６６ｍｇ／ｍｌのコレステロール、30mg／ｍｌのフォスファチジルエタノールアミンの膜構成脂質を含有したクロロホルム溶剤１００ｍｌを、脂質液浸漬容器に収容し、ベルトの左右にスプロケット孔を設けた１０ｃｍ幅のPVDFエンドレスベルトを本発明のリポソーム製造装置に取り付け、毎秒２ｃｍの速度でベルトを送出した。続いて、薄膜状に脂質液を付着したPVDFベルトは連続的に送風乾燥ユニット４に送り込まれ、吸引減圧下で75度の弱温風を送って有機溶媒を完全に除去することにより混合脂質の乾燥薄膜を形成させた。ここで蒸発除去された有機溶媒は、ドライアイス冷却トラップに導入されて液体として回収した。乾燥ユニットで乾燥された脂質薄膜を保持したベルトはりん酸緩衝生理食塩液を入れたリポソーム形成ユニット５中に導入されて脂質が水和され、次いでリポソーム調製ユニットの下部に置いた超音波発生ユニットからの超音波振動によりベルト面より剥離させて水中にリポソームを形成させた。この方法で作成されたリポソームは約８０％が単層リポソームで約２０％が多重膜リポソームで、直径はほぼ100から150nmであることが電子顕微鏡観察及び粒子アナライザーによって確認されたがこの比率及びリポソームの大きさは、脂質濃度や超音波の出力によって調製することが可能であると考えられる。
【００１８】
実施例２
上記実施例１のリポソーム形成ユニットにニューカッスル病ウイルス石井株のホルマリン不活化抗原（不活化前HA価１：５１２）液を満たし、実施例一と同様にしてリポソームを形成させることにより、リポソームの内側と外側に抗原を配置したワクチン組成物を得た。このワクチン組成物を4週齢のSPF鶏10羽に点眼投与し、その3週後に血清及び喉頭拭い液中の抗体産生を確認した。その結果、血清抗体価は平均H I価で1：256前後の高い有効抗体価を示した。また喉頭拭い液中にも粘膜免疫に関与するIgAが産生されていることがELISAによって確認された。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドレスベルト上に連続的に脂質薄膜を形成させることによるリポソームの連続的大量製造方法およびそのための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質の閉鎖小胞体であるリポソームは、生分解性、非毒性であり、薬物が相対的に不透過性の脂質２重膜に封入されていることより薬物輸送用の担体として利用されている。またリポソームを抗原キャリヤーとすることでアジュバント効果が期待できることよりワクチン製剤においてもしばしば利用されている。多層膜リポソームは、バンガム法、すなわちロータリーエバポレーターボルテクスィング法によって容易に得られる。すなわち脂質等のリポソーム膜構成成分を有機溶媒に溶解し、ロータリーエバポレーターなどによってガラス容器の有機溶媒を除去して容器の壁に薄膜を形成させる。次いで封入すべき材料を含む水溶液を加えて薄膜を膨潤させた後、容器を振盪する（図１参照）。しかし、この方法は、薄膜を形成させるガラス容器の大きさの制限から、一度に大量に製造することができず、また振盪の方法によって薬剤の封入効率及びリポソームの平均直径にバラツキが生じやすい欠点がある（非特許文献１を参照。）。
【０００３】
リポソームを大量に生成する方法や装置に関して、たとえば脂質及び水溶液を臨界又は超臨界の流体（二酸化炭素、亜酸化窒素、プロパン、エチレンなど）で混合する方法およびその装置（特許文献１〜２を参照。）や緩衝液の貯蔵器及有機脂質容器の貯蔵器から連続的に混合室へ供給し、混合室内で精製したリポソームを第三の貯蔵器へ導く方法と装置（特許文献３を参照。）などがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平９−５０２６４４号公報
【特許文献２】特開２００５−１６２７０２号公報
【特許文献３】特表２００５−５３８９６７号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】A. D. Bangham et.al. J. Mol. Biol., 13, 238(1965)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、比較的簡便な装置により、大量、かつ均一な粒径を有するリポソームの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、長尺エンドレスベルトを連続的に脂質溶液に通して引き上げ、脂質を減圧又は温風乾燥してベルト表面に薄膜として保持し、その後連続的に水又は緩衝液中に該長尺エンドレスベルトを通して水和させながらベルト上から脂質を超音波又はその他の機械的振動又は振動するブラシ等により掻き落とし水中にリポソームを連続形成させることにより上記課題を解決できることを見出した。
【０００８】
長尺エンドレスベルトとしては、十分な可撓性及び有機溶媒耐性を有する材質が望ましく、例えば、合成樹脂、ガラス繊維又は金属圧延物などが使用できる。エンドレスベルトの長さ及び幅は生産規模に応じて適宜選択できるが、長さ１〜２ｍ、幅５〜２０ｃｍの範囲が使いやすい。
【０００９】
脂質液浸漬ユニット３は内部にベルトを駆動するスプロケットローラが設置されこのローラー及び次のローラーでベルトに付着した過剰な脂質液を取り除くことによりバルト上に薄膜を形成する。エンドレスベルトの表面形状は平滑面であることを基本とするが、表面に多数の浅いくぼみを設けることにより表面積を広げたベルトも使用可能であり、特に多重膜リポソームの製造効率が良い。
【００１０】
脂質膜乾燥ユニット４はエンドレスベルトの入り口側と出口側がローラーでほぼ密閉された構造となっており、内部に窒素または空気の温風を送りながら真空ポンプで減圧することにより、効率的に溶媒を除去することが可能であり、除去された溶媒はこの後に設置した溶媒回収トラップによって冷却回収される。なお、脂質膜乾燥ユニットが一台では溶媒の除去が不十分な場合は同じユニットをもう一台設置することにより溶媒を完全に除去することが可能である。
【００１１】
膜構成脂質としては、卵黄レシチン、大豆レシチン、フォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリンなどのリン脂質やそれらの水素添加飽和物、ショ糖脂肪酸エステル、トレハロース脂肪酸エステル、ラムノース脂肪酸エステルなどの糖脂肪酸エステルの１種または２種以上、または、これらの混合物を用いることができる。
【００１２】
膜構成成分としては、この他に膜安定化剤として、コレステロールなどのステロール類、荷電物質としてフォスファチジン酸、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド、ステアリルアミンなどが、また、酸化防止剤として、トコフェロールなどを加えてもよい。これらの膜構成物質の組成比率は、特に限定されないが、リン脂質１重量部に対しステロール類０〜０．５重量部、荷電物質０〜０．１重量部、酸化防止剤を０〜０．１重量部程度加えるのが好ましい。これらをメタノール、エタノール、アセトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジオキサンエチルエーテル、クロロホルムなどの有機溶剤に溶解して用いる。
【００１３】
水溶液は、ベルト表面に乾固した膜構成脂質を水和して膨潤、分散させるもので、水単独、生理食塩水、各種緩衝液、または、糖類を溶解した水溶液などを用いることができる。さらに薬剤、タンパク質、ウイルス及びウイルス由来抗原、細菌及び細菌菌体由来物、高分子等の物質を溶解あるいは懸濁させることができる。
【００１４】
以下、本発明のリポソームの製造法を図２によって説明する。
装置は基本的にエンドレスベルト１を矢印方向に回転させるための駆動装置（スプロケットろーらー）２、エンドレスベルトを脂質液に浸漬する脂質液浸漬ユニット３、ベルト上の脂質液溶媒を除去するための脂質膜乾燥ユニット４、ベルト上の乾燥脂質膜を内包物質懸濁液等の水溶液と水和させるリポソーム調製ユニット５及びベルトに残存する水分を除去するためのベルト乾燥ユニット６からなる。リポソーム製造ユニット５はほぼ密閉された立方体であり内部にベルト膜面を殺菌するＵＶ殺菌ユニット７、内包物質懸濁液容器８、懸濁液に振動を与える超音波発生装置９、水切りゴム１０及びベルトの出入りのためのスリット１１，１２が配置されている。エンドレスベルト１は各ユニット間及び各ユニット内に適宜設置されたローラーガイド１３に誘導されて各ユニット間を循環する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のリポソーム製造装置は、均一なリポソームを連続して大量に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】バンガムボルテクスィング法によるリポソームの製造方法
【図２】水和及び混合に超音波発振器を使用したリポソーム製造装置
【図３】スクレパーを使用したリポソーム製造装置
【発明を実施するための形態】
【００１７】
実施例１
図２の装置において、４００ｍｇ／ｍｌの水添大豆レシチン、６６ｍｇ／ｍｌのコレステロール、30mg／ｍｌのフォスファチジルエタノールアミンの膜構成脂質を含有したクロロホルム溶剤１００ｍｌを、脂質液浸漬容器に収容し、ベルトの左右にスプロケット孔を設けた１０ｃｍ幅のPVDFエンドレスベルトを本発明のリポソーム製造装置に取り付け、毎秒２ｃｍの速度でベルトを送出した。続いて、薄膜状に脂質液を付着したPVDFベルトは連続的に送風乾燥ユニット４に送り込まれ、吸引減圧下で75度の弱温風を送って有機溶媒を完全に除去することにより混合脂質の乾燥薄膜を形成させた。ここで蒸発除去された有機溶媒は、ドライアイス冷却トラップに導入されて液体として回収した。乾燥ユニットで乾燥された脂質薄膜を保持したベルトはりん酸緩衝生理食塩液を入れたリポソーム形成ユニット５中に導入されて脂質が水和され、次いでリポソーム調製ユニットの下部に置いた超音波発生ユニットからの超音波振動によりベルト面より剥離させて水中にリポソームを形成させた。この方法で作成されたリポソームは約８０％が単層リポソームで約２０％が多重膜リポソームで、直径はほぼ100から150nmであることが電子顕微鏡観察及び粒子アナライザーによって確認されたがこの比率及びリポソームの大きさは、脂質濃度や超音波の出力によって調製することが可能であると考えられる。
【００１８】
実施例２
上記実施例１のリポソーム形成ユニットにニューカッスル病ウイルス石井株のホルマリン不活化抗原（不活化前HA価１：５１２）液を満たし、実施例一と同様にしてリポソームを形成させることにより、リポソームの内側と外側に抗原を配置したワクチン組成物を得た。このワクチン組成物を4週齢のSPF鶏10羽に点眼投与し、その3週後に血清及び喉頭拭い液中の抗体産生を確認した。その結果、血清抗体価は平均H I価で1：256前後の高い有効抗体価を示した。また喉頭拭い液中にも粘膜免疫に関与するIgAが産生されていることがELISAによって確認された。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含むリポソームの製造方法。
１． エンドレスなベルトの表面に脂質溶液を供給する工程
２． 脂質溶液溶媒を除去し、ベルト表面に脂質の薄膜を形成する工程
３． ベルト上の脂質薄膜を水又は緩衝液に浸漬し、超音波又はその他の機械的振動を加えて脂質薄膜をベルトから剥離する工程
４． 脂質膜と緩衝液を混合しリポソームを形成する工程
５． ベルトを洗浄、乾燥する工程
【請求項２】
請求項１に記載の工程１〜５を繰り返し、リポソームを連続的に製造する方法。
【請求項３】
エンドレスベルトの材質が、有機溶媒耐性材質であり、合成樹脂、ガラス繊維又は金属圧延物から選択されることを特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項４】
エンドレスベルトの表面形状が平滑面であるか又は多数の浅いへこみを設けて表面積を広げた構造をもつことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項５】
エンドレスベルトを手動又は電動機により一定方向に回転させることにより各工程を連続的に処理する請求項１〜４のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の水又は緩衝液中に薬品類、タンパク質、ウイルス及びウイルス由来抗原、細菌及び細菌菌体由来物、高分子等の物質を溶解あるいは懸濁させることにより、これらを内包したリポソームを調製する請求項１〜５のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項７】
ベルト上に形成された薄膜脂質を水または緩衝液に浸漬し、超音波又は他の機械的振動によって脂質膜を剥離すると同時に水または緩衝液との水和、混合によるリポソームの形成を連続的に行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリポソーム製造方法。
【請求項８】
ベルト上に形成された乾燥脂質に水溶液又は懸濁液を直接添加して水和させた後、スクレパーにて内包物質を含む水溶液中へ掻き落とすことにより、薬品、高分子等を内包したリポソームを調製する請求項１〜６のいずれかに記載のリポソーム製造方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法を実施するための装置。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかまたは請求項８に記載の製造方法を実施するための装置。
【請求項１】
以下の工程を含むリポソームの製造方法。
１． エンドレスなベルトの表面に脂質溶液を供給する工程
２． 脂質溶液溶媒を除去し、ベルト表面に脂質の薄膜を形成する工程
３． ベルト上の脂質薄膜を水又は緩衝液に浸漬し、超音波又はその他の機械的振動を加えて脂質薄膜をベルトから剥離する工程
４． 脂質膜と緩衝液を混合しリポソームを形成する工程
５． ベルトを洗浄、乾燥する工程
【請求項２】
請求項１に記載の工程１〜５を繰り返し、リポソームを連続的に製造する方法。
【請求項３】
エンドレスベルトの材質が、有機溶媒耐性材質であり、合成樹脂、ガラス繊維又は金属圧延物から選択されることを特徴とする請求項１〜２のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項４】
エンドレスベルトの表面形状が平滑面であるか又は多数の浅いへこみを設けて表面積を広げた構造をもつことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項５】
エンドレスベルトを手動又は電動機により一定方向に回転させることにより各工程を連続的に処理する請求項１〜４のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項６】
請求項１に記載の水又は緩衝液中に薬品類、タンパク質、ウイルス及びウイルス由来抗原、細菌及び細菌菌体由来物、高分子等の物質を溶解あるいは懸濁させることにより、これらを内包したリポソームを調製する請求項１〜５のいずれかに記載のリポソームの製造方法。
【請求項７】
ベルト上に形成された薄膜脂質を水または緩衝液に浸漬し、超音波又は他の機械的振動によって脂質膜を剥離すると同時に水または緩衝液との水和、混合によるリポソームの形成を連続的に行うことを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載のリポソーム製造方法。
【請求項８】
ベルト上に形成された乾燥脂質に水溶液又は懸濁液を直接添加して水和させた後、スクレパーにて内包物質を含む水溶液中へ掻き落とすことにより、薬品、高分子等を内包したリポソームを調製する請求項１〜６のいずれかに記載のリポソーム製造方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法を実施するための装置。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれかまたは請求項８に記載の製造方法を実施するための装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２０１１−６２５８６（Ｐ２０１１−６２５８６Ａ）
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２１２８５１（Ｐ２００９−２１２８５１）
【出願日】平成２１年９月１５日（２００９．９．１５）
【出願人】（５９１１９３３７０）株式会社微生物化学研究所 (14)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年３月３１日（２０１１．３．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年９月１５日（２００９．９．１５）
【出願人】（５９１１９３３７０）株式会社微生物化学研究所 (14)
【Ｆターム（参考）】
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