リポソーム及び造影剤
【課題】（１）生体に対する毒性が低く、（２）内包率が高く、（３）全身血管及び肝臓の造影に優れ、（４）かつ、膵臓の造影にも優れ、（５）さらに２４時間以内に体外に大部分が排泄される安全性を有する、造影剤用化合物を封入したリポソーム、及び該リポソームを含有する造影剤を提供することである。
【解決手段】糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームであって、造影剤用化合物を封入したことを特徴とするリポソーム。
【解決手段】糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームであって、造影剤用化合物を封入したことを特徴とするリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームであって、造影剤用化合物を封入したリポソーム及びそれを含有する造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、薬剤キャリアとして注目されているリポソームの表面に、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームが研究されている。該リポソームは各種組織の細胞表面上に存在する各種のレクチン（糖鎖認識たんぱく質）に対して特異的な結合活性を有し、各種薬剤、遺伝子の生体内輸送において有用な製剤であることが知られている（例えば特許文献１参照）。しかしながら、該リポソームに造影剤化合物、特に非イオン性ヨード造影剤化合物を内包した例は知られておらず、その体内動態についても研究された例は知られていない。一方、ヨード原子を含有する造影剤単体は、汎用的には低分子量の有機ヨード剤として提供され、水に溶けるため、尿路撮影、血管造影、ＣＴの造影のように、通常、静脈血管内投与で用いられる。ヨード造影剤は、投与されて数分間は血管内に滞留するが、急速に全身に分布し、通常は腎臓で排泄されて尿中に出る。現在使用されている低分子量・水溶性のヨード造影剤は血管から臓器や組織への移行が早く、血管の中でも特に静脈を明確に造影することが困難であった。
【０００３】
血中滞留性を上げるために、今から２０年程前、ヨード化けし油をレシチンで分散したオイルエマルジョンタイプの造影剤がいくつか検討された（例えば、非特許文献１参照）。これらは目論見通り血中滞留性が向上し、全身血管の造影能力が格段に向上したが、発熱、悪心、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用を引き起こす問題が解決できず、実用化に至っていない。
【０００４】
一方、近年、特定臓器の癌疾患の造影が強く求められている。しかしながら、上述の造影剤には臓器特異的な集積性がないため要望を満たすことが困難である。糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームは、表面の親水化度の調整や表面糖鎖及び、リンカー蛋白質の構造最適化により体内各組織、がん細胞等への指向性、移行量を制御することが可能であることが知られている（例えば特許文献１、２参照）。しかしながら、膵臓への臓器特異性を十分に発現できないという欠点を有していた。現在、膵臓疾患、特に膵臓の転移性癌は早期発見が難しく、死亡率の高い疾患として知られており新規な造影剤の開発が切望されている。
【特許文献１】特許第３８８２０３４号公報
【特許文献２】国際公開第０５／０１１６３２号パンフレット
【非特許文献１】Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２１６，１５４−１６２，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、（１）生体に対する毒性が低く、（２）内包率が高く、（３）全身血管及び肝臓の造影に優れ、（４）かつ、膵臓の造影にも優れ、（５）さらに２４時間以内に体外に大部分が排泄される安全性を有する、造影剤用化合物を封入したリポソーム、及び該リポソームを含有する造影剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の上記課題は、以下の構成により達成される。
【０００７】
１．糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームであって、造影剤用化合物を封入したことを特徴とするリポソーム。
【０００８】
２．前記造影剤用化合物が非イオン性ヨード造影剤化合物であることを特徴とする前記１に記載のリポソーム。
【０００９】
３．前記リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンであることを特徴とする前記１または２に記載のリポソーム。
【００１０】
４．前記１〜３のいずれか１項に記載のリポソームを含有することを特徴とする造影剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、（１）生体に対する毒性が低く、（２）内包率が高く、（３）全身血管及び肝臓の造影に優れ、（４）かつ、膵臓の造影にも優れ、（５）さらに２４時間以内に体外に大部分が排泄される安全性を有する造影剤用化合物を含有したリポソーム、リ及び該リポソームを含有する造影剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、本発明の造影剤用化合物を含有する特定構造のリポソームは、（１）生体に対する毒性が低く、（２）内包率が高く、（３）全身血管及び肝臓の造影に優れ、（４）かつ、膵臓の造影にも優れ、（５）さらに２４時間以内に体外に大部分が排泄される安全性を有する造影剤を含有するリポソームであり、これを含む造影剤は優れた造影剤であることを見出した。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
《糖鎖がリンカーたんぱく質を介してリポソーム膜に結合したリポソーム》
リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層及び内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。
【００１５】
（糖鎖）
本発明におけるリポソームは、糖鎖により修飾されたものである。なお、これらの糖鎖中の糖として具体的には、単糖、二糖、三糖、多糖の全てのアルドペントース、アルドヘキソースを表すが、好ましくはアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、ギュロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、エリトロース、トレオース、セロビオース、フコース、マルトース、イソマルトース、ラクトースまたはマルトリオロース、アルファ−１，２−マンノビオース二糖、アルファ１，３マンノビオース二糖、アルファ１，４マンノビオース二糖、アルファ−１，６−マンノビオース二糖、アルファ−１，３−アルファ−１，６−マンノトリオース三糖、オリゴマンノース３五糖、オリゴマンノース４ｂ六糖、オリゴマンノース５七糖、オリゴマンノース６八糖、オリゴマンノース７九糖、オリゴマンノース８十糖、オリゴマンノース９十一糖、３′−シアリルラクトース三糖、６′−シアリルラクトース三糖、３′−シアリルラクトサミン三糖、６′−シアリルラクトサミン三糖、ルイスＸ型三糖、シアリルルイスＸ型四糖、ラクトース二糖、２′−フコシルラクトース三糖、ジフコシルラクトース四糖及び３−フコシルラクトース三糖を表す。
【００１６】
本発明においては、これら糖鎖はリンカー蛋白質を介してリポソーム表面に結合している。この場合のリポソームの構造をこれら糖鎖の化学構造とともに図１〜２３に示す。なお、これらの図は模式図であり、糖鎖−リンカー蛋白質は、実際にはリポソーム表面に多数結合している。
【００１７】
（リンカー蛋白質）
リンカー蛋白質としては、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンが好ましい。
【００１８】
本発明のリポソームの脂質膜の成分として、一般にリン脂質が好ましく使用される。本発明に用いられるリン脂質は通常公知のもので制限はない。ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン等のリン脂質である。卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するリン脂質、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、または合成加工品等、限定されることなく用いられる。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されることはなく、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよい。
【００１９】
具体的な中性リン脂質の例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルエノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
【００２０】
（造影剤用化合物）
本発明に用いられる造影剤用化合物は、従来公知のものであれば制限はなく、具体的にはＭＲＩ造影剤用化合物、ヨード造影剤用化合物が好ましく用いられる。ＭＲＩ造影剤用化合物としては、好ましくはＤＴＰＡ誘導体が挙げられ、Ｇｄ（III）−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸のガドリニウム（III）錯体）が好ましい、さらに欧州特許ＥＰ００７１５６４号公報、及び特表平１０−５１１９３４号公報が記載する金属錯体が重要である。ヨード化合物が本発明の化合物としてより好ましく、さらに非イオン性ヨード化合物が特に好ましく、水溶性であることが好ましく、具体的にはヨウ化フェニル基、例えば２，４，６−トリヨードフェニル基を少なくとも１個有する非イオン性ヨード化合物が好適である。好ましい非イオン性ヨード化合物として、具体的にはイオヘキソール、イオペントール、イオジキサノール、イオプロミド、イオトロラン、イオメプロール、Ｎ，Ｎ′−ビス〔２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エチル〕−５−〔（２−ヒドロキシ−１−オキソプピル）−アミノ〕−２，４，６−トリヨード−１，３−ベンゼン−ジカルボキシアミド（イオパミドール）；メトリザミド等が挙げられる。
【００２１】
非イオン性ヨード化合物は、これらの例示に限定されるものではない。また、非イオン性ヨード化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお、本明細書において、化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物等も含めて言及することがある。特に好適なヨード系化合物として、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないイオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノール等が挙げられる。イオトラン、イオジキサノールといった二量体非イオン性ヨード化合物では、ヨウ素担持効率が高く、同一ヨード濃度の造影剤を調製しても全体のモル数が低いために浸透圧を低下させる利点がある。
【００２２】
造影剤用化合物のリポソームへの封入濃度は、該化合物の性質、意図する製剤の投与経路及び臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。リポソーム内に封入された造影剤用化合物の量は、典型的には添加された全造影剤用化合物の５〜４０質量％、好ましくは５〜３５質量％、より好ましくは１０〜２５質量％である。この内包率は、リポソーム粒子の細密充填の限界を下回るために、リポソームにおける造影物質の保持安定性は損なわれない。本発明のリポソームの構成成分は上記に限定されず、他の成分を加えることができる。その例としては、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２２３，４２（１９８７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５，６９４９（１９８８）等に記載のモノシアルガングリオキシドＧＭ１誘導体、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２１４５（１９８９）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１４８，７７（１９９２）等に記載のグルクロン酸誘導体、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０２９，９１（１９９０）；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２６８，２３５（１９９０）等に記載のポリエチレングリコール誘導体が挙げられるが、これに限られるものではない。
【００２３】
《リポソームの形成方法》
本発明のリポソームは、当業者が利用可能ないかなる方法で形成してもよい。形成法の例としては、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９，４６７（１９８０）、“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｏｓｔｒｏ編、ＭＡＲＣＥＬＬ ＤＥＫＫＥＲ、ＩＮＣ．）等に記載されている。具体例としては、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、カルシウム融合法、凍結融解法、逆相蒸発法等が挙げられるが、これに限られるものではない。リポソームの構造は特に限定されず、ユニラメラまたはマルチラメラ等のいずれの形態でもよい。また、リポソームの内部に適宜の化合物の１種または２種以上を配合することも可能である。
【００２４】
本発明に用いられるリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。本発明のリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。とりわけ、フォスファチジルエタノールアミン類の配合は親水性化反応部位として、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類の配合はリンカー蛋白質の結合部位として必須のものである。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製する。続いて、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。
【００２５】
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作製する方法（特開２００１−３０２６８６号）等も用いることが可能ではあるが、本発明においては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３′−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質に２価試薬を結合させ、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、該２価試薬の一方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを結合せしめる。
【００２６】
本発明における、糖鎖によるリポソームの修飾手段について具体的に述べると、例えば、糖鎖はリンカー蛋白質を介してリポソーム結合させるが、リンカー蛋白質をリポソームに結合する手段としては、まず、リポソームを、ＮａＩＯ4、Ｐｂ（Ｏ2ＣＣＨ3）4、ＮａＢｉＯ3等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、ＮａＢＨ3ＣＮ、ＮａＢＨ4等の試薬を用いて、リンカー蛋白質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカー蛋白も、親水性化するのが好ましく、これにはリンカー蛋白質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３′−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをリポソーム上のリンカー蛋白質と結合させればよい。
【００２７】
具体的に述べると、まず、リンカー蛋白質の全てのアミノ基に架橋用２価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋２価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。
【００２８】
次に、このようにして得られる糖鎖結合リポソーム膜面上蛋白質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の２価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上蛋白質に結合している２価試薬の未反応末端とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの結合反応を行い、リポソーム表面を親水性化することにより、本発明のリポソームを得ることができる。
【００２９】
次いで、糖鎖を、上記リポソーム上のリンカー蛋白質と結合させる。例えば、まず、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、ＮＨ4ＨＣＯ3、ＮＨ2ＣＯＯＮＨ4等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３′−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカー蛋白質と、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、図１〜２３に示されるようなリポソームを得る。
【００３０】
次にリポソーム粒子のサイズ及びその分布について詳述する。「中心粒径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒子径を指している。なお、粒子径または粒径は、粒子の直径を意味する。粒径の調整は、処方またはプロセス条件で行うことができる。例えば、上記の超臨界の圧力を大きくすると形成されるリポソーム粒径は小さくなる。リポソームの粒子径の分布をより狭い範囲に揃えるには、作製されるリポソームの懸濁液を一定サイズの孔径を有する濾過膜、好ましくはポリカーボネート膜等に強制的に透過させてもよい。この場合、濾過膜として０．０５〜０．４μｍ、好ましくは０．１〜０．４μｍ、さらに好ましくは０．１５〜０．２μｍの孔径のフィルターを装着した静圧式押出し装置に通すことにより、リポソーム多重層膜の脂質膜枚数を減らすとともに、中心粒径として１００〜３００ｎｍの最適寸法を有する均一なリポソームを効率よく調製することができる。
【００３１】
具体的には、各種の静圧式押出し装置、例えば「エクストルーダー」（商品名、日油リポソーム製）等を使用して、フィルターを強制的に透過させる。フィルターは、ポリカーボネート系、セルロース系等のタイプを適宜使用することができる。このような「押出し」操作工程を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム分散液の交換、濾過滅菌も併せて可能になるという利点もある。
【００３２】
引き続きリポソーム分散液を、遠心分離、ゲル濾過等の方法により未保持の薬剤を除去して精製したり、濃縮、希釈、凍結乾燥等の操作を任意に行ってもよい。本発明の造影剤入りリポソームの中心粒径は、通常５０〜３００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍ、より好ましくは５０〜１３０ｎｍである。糖鎖を結合させた場合の糖鎖の結合密度は、リポソームに結合させるリンカー蛋白質１分子当り１〜６０個、好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個である。また、リポソーム１粒子当りは、リンカー蛋白質を用いる場合は、１〜３００００個、好ましくは１〜２００００個、さらに好ましくは１〜１００００個、あるいは１００〜３００００個、好ましくは１００〜２００００個、さらに好ましくは１００〜１００００個、あるいは５００〜３００００個、好ましくは５００〜２００００個、さらに好ましくは５００〜１００００個である。リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り１〜５００００個、好ましくは１〜３０００００個、さらに好ましくは１〜１０００００個以上の糖鎖を結合させることができる。
【００３３】
造影剤用化合物のリポソーム内部への封入は、周知の方法を用いればよく、例えば、造影剤用化合物の含有溶液とフォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類及びコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。
【００３４】
《造影剤》
次に、本発明のリポソームを含有する造影剤について詳述する。
【００３５】
注射のために製剤化された本発明の造影剤は、迅速で簡便な注射を可能にするよう適度な粘度のみを有するべきである。粘度は、１０．２０×１０-4ｋｇｆ・ｓ／ｍ2（１０ｍＰａ・ｓ、１０ｃＰ）未満、好ましくは５．１０×１０-4ｋｇｆ・ｓ／ｍ2（５ｍＰａ・ｓ、５ｃＰ）未満、より好ましくは２．０４×１０-4ｋｇｆ・ｓ／ｍ2（２ｍＰａ・ｓ、２ｃＰ）未満である。
【００３６】
また、注射のために製剤化された本発明の造影剤は過度の浸透圧を有するべきではない。なぜなら、これは毒性を増加させ得るからである。浸透圧は、３０００ミリオスモル／ｋｇ未満、好ましくは２５００ミリオスモル／ｋｇ未満、最も好ましくは９００ミリオスモル／ｋｇ未満である。
【００３７】
本発明の造影剤は、無機または有機の酸及び塩基から誘導される塩を含有することができる。塩の具体例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム、マグネシウム及び亜鉛塩）、有機塩基を有する塩（例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）、及びアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン）を有する塩等を包含する。
【００３８】
また、塩基性窒素含有基は、低級アルキルハライド（例えば、メチル、エチル、プロピル及びブチルクロライド、ブロマイド及びヨージド）、ジアルキル硫酸（例えば、ジメチル、ジエチル、ジブチル及びジアミル硫酸）、長鎖ハライド（例えば、デシル、ラウリル、ミリスチル及びステアリルクロライド、ブロマイド及びヨージド）、アラルキルハライド（例えば、ベンジル及びフェネチルブロマイド）ならびにその他のような薬剤で４級化され得る。それによって、水溶性または油溶性あるいは水分散性または油分散性の生成物が得られる。本発明の好ましい塩は、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、カルシウム及びナトリウム塩である。
【００３９】
本発明の造影剤は、任意のキャリア、アジュバントもしくはビヒクルを含有することができる。本発明の造影剤に使用され得るキャリア、アジュバント及びビヒクルは、イオン交換物質、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝性物質（例えば、ホスフェート）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及びラノリンを包含するが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明の造影剤は、注射可能な無菌の調合薬の形態（例えば、注射可能な無菌の水性または油性の懸濁液）であり得る。この懸濁液は、当該分野で公知の技術に従い、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を用いて製剤され得る。注射可能な無菌の調合薬はまた、無毒性の非経口で受容可能な希釈剤または溶媒中における、無菌の注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として）であってもよい。用いられ得る受容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンガー溶液及び等張食塩水である。さらに、従来では、無菌の不揮発油が溶媒または懸濁媒体として使用される。この目的のために、合成のモノ−またはジ−グリセリドを含む任意の刺激のない不揮発油が使用され得る。脂肪酸（例えば、オレイン酸及びそのグリセリド誘導体）は、天然の薬学的に受容可能なオイル（例えば、オリーブオイルまたはヒマシ油）と同様に、注射可能物の調製、特にこれらのポリオキシエチル化した変形物において有用である。これらのオイル溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（例えば、Ｐｈ．Ｈｅｌｖまたは類似のアルコール）を含み得る。
【００４１】
本発明の造影剤は、経口投与、非経口投与、吸入スプレーによる投与、局所投与、直腸投与、鼻腔投与、頬投与、膣投与または従来の無毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント及びビヒクルを含有する投薬製剤中に埋め込まれたリザーバを介して投与され得る。本明細書に使用されるように用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、くも膜下、肝臓内、病変内及び頭蓋内注射または点滴技術を含む。
【００４２】
経口投与される場合、本発明の薬学的組成物は任意の経口的に受容可能な投薬形態（カプセル、錠剤、水性の懸濁液または溶液が挙げられるが、これらに限定されない）で投与され得る。錠剤を経口使用する場合、一般的に使用されるキャリアには、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。代表的には、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた添加される。カプセル形態の経口投与に対して、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用に水性懸濁液を必要とする場合、活性成分は乳化剤及び懸濁剤と配合される。所望の場合、特定の甘味料、香味料または着色料もまた添加してもよい。あるいは、直腸投与のために座薬形態で投与される場合には、本発明の造影剤は、室温で固体であるが直腸温で液体である適切な非刺激性の賦形剤とを混合して調製され得、その結果直腸内で溶け薬剤を放出する。このような物質として、ココアバター、ビーズワックス及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【００４３】
また、前述のように、特に、処置標的が局所施用によって容易に接近可能な領域または器官（目、皮膚または下部腸道（ｌｏｗｅｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ）を含む）を含む場合に、本発明の造影剤は局所投与され得る。適切な局所製剤は、これらの各領域または器官用に容易に調製される。
【００４４】
下部腸道に対する局所施用は、直腸用座薬製剤または適切な浣腸製剤でなされ得る。局所−経皮性パッチもまた使用してよい。局所施用に対して、本発明の造影剤は、１つ以上のキャリア中に懸濁または溶解される活性成分を含有する、適切な軟膏に製剤され得る。本発明の造影剤の局所投与のためのキャリアは、鉱油、液体ペトロラタム、白色ペトロラタム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水を包含するが、それらに限定されない。あるいは、本発明の造影剤は、１つ以上のキャリア中に懸濁または溶解された活性成分を含有する、適切なローションまたはクリームに製剤されてもよい。適切なキャリアは、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水を包含するが、それらに限定されない。
【００４５】
眼使用に対して、本発明の造影剤は防腐剤（例えば、ベンジルアルコニウムクロライド）を含有してもしなくてもよい。ｐＨ調節された等張の無菌生理食塩水中に微小化された懸濁液として、または好ましくはｐＨ調節された等張の無菌生理食塩水中の溶液として製剤され得る。あるいは、眼使用に対して本発明の造影剤は、ペトロラタムのような軟膏に製剤され得る。
【００４６】
鼻腔エーロゾルまたは吸入による投与に対して、本発明の造影剤は、製薬的製剤の分野で周知の技術に従って調製され、そしてベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、生体利用性を増大させる吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用し、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【００４７】
投薬は、診断用画像化機器の感度、ならびに造影剤の組成に依存する。しかし、任意の特定の患者に対する特定の投薬処方もまた、種々の因子（年齢、体重、健康状態、性別、治療食、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ及び処置する内科医の判断を含む）に依存することが理解されるべきである。
【００４８】
本発明では造影剤の適切な投薬の投与に続いて、ＭＲＩ画像化またはＸ線画像化が行われる。ＭＲＩ画像化は、パルス系列（反転回復（ＩＲ）；スピンエコー（ＳＥ）；エコー断層（ＥＰＩ）；飛行時間（ＴＯＦ）；ターボフラッシュ；グラディエントエコー（ＧＥ））及び画像化パラメーターの値（エコー時間（ＴＥ）；反転時間（ＴＩ）；繰り返し時間（ＴＲ）；フリップ角等）の選択は、要求される診断情報に支配される。一般的には、Ｔ１−加重された画像を得ることが望まれる場合、ＴＥはＴ１−加重を最大とするために３０ミリ秒未満（または最小値）であるべきである。逆に、Ｔ２の測定が所望される場合、ＴＥは競合するＴ１効果を最小にするために３０ミリ秒より大きくあるべきである。ＴＩ及びＴＲは、Ｔ１−及びＴ２−加重された画像の両方に対して、ほぼ同じに保たれる；一般的に、ＴＩ及びＴＲは、それぞれ、約５〜１０００ミリ秒及び２〜１０００ミリ秒のオーダーである。
【００４９】
Ｘ線画像化は、従来公知の方法による脳血管撮影、選択的血管撮影、四肢血管撮影、ディジタルＸ線撮影法による静脈性血管撮影、コンピューター断層撮影における造影、静脈性尿路撮影等による画像化であることが好ましい。本発明の造影剤は全身血管、及び肝臓、特に膵臓の造影に優れているので選択的血管撮影、コンピューター断層撮影における腹部造影が最適な撮像方法である。
【実施例】
【００５０】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５１】
実施例１ 造影剤化合物封入リポソームの調製
造影剤化合物封入前のリポソームは、既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合の合計脂質量４５．６ｍｇにコール酸ナトリウムを４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜（造影剤化合物封入前のリポソーム）を得た。得られた脂質膜に非イオン性ヨード化合物を含有する造影剤溶液（日局イオパミドール溶液３０６．２ｍｇ／ｍｌ（ヨード含有量１５０ｍｇ／ｍｌ）、トロメタモールを１ｍｇ／ｍｌ、エデト酸カルシウム２ナトリウム（ＥＤＴＡＮａ2−Ｃａ）０．１ｍｇ／ｍｌを含有し、適量の塩酸及び水酸化ナトリウムでｐＨを７前後に調整）５ｍｌを注入した。次に超音波照射（Ｂｒａｎｓｏｎ社製、Ｎｏ．３５４２プローブ型発振器、０．１ｍＷ）を氷冷下５分実施することにより、非イオン性ヨード化合を含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を６０℃まで加熱し、アドバンテック社製のセルロース系フィルター、１．０μｍで加圧濾過した。得られた試料をスペクトラプロ社製、バイオテックＲＣ透析チューブに封入し、多量の生理食塩水（９．０×１０-1質量％、１０００ｇ）中に浸して透析を行い、リポソーム内に取り込めなかった非イオン性ヨード化合物等を除去した、均一リポソーム（平均粒径１００ｎｍ）１０ｍｌを調製した。
【００５２】
実施例２ リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
実施例１で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ、溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、さらに７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ４ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。
【００５３】
実施例３ リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、実施例２で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ3ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リポソーム液を得た。
【００５４】
実施例４ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，２マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，２マンノビオース二糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，２マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，２マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，２マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図１で示されるアルファ１，２マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ２）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５５】
実施例５ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，３マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，３マンノビオース二糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，３マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，３マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，３マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図２で示されるアルファ１，３マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ３）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５６】
実施例６ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，４マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，４マンノビオース二糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，４マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，４マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，４マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図３で示されるアルファ１，４マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ４）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５７】
実施例７ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，６マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，６マンノビオース二糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，６マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，６マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，６マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図４で示されるアルファ１，６マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ６）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５８】
実施例８ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖の結合
アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖の結合を行った。その結果、図５で示されるアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ３６）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５９】
実施例９ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース３五糖鎖の結合
オリゴマンノース３五糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース３五糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース３五糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース３五糖鎖の結合を行った。その結果、図６で示されるオリゴマンノース３五糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ３）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６０】
実施例１０ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース４ｂ六糖鎖の結合
オリゴマンノース４ｂ六糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース４ｂ六糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース４ｂ六糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース４ｂ六糖鎖の結合を行った。その結果、図７で示されるオリゴマンノース４ｂ六糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ４ｂ）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６１】
実施例１１ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース５七糖鎖の結合
オリゴマンノース５七糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース５七糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース５七糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース５七糖鎖の結合を行った。その結果、図８で示されるオリゴマンノース５七糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ５）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６２】
実施例１２ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノースオリゴマンノース６八糖鎖の結合
オリゴマンノース６八糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース６八糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース６八糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース６八糖鎖の結合を行った。その結果、図９で示されるオリゴマンノース６八糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ６）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６３】
実施例１３ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース７九糖鎖の結合
オリゴマンノース７九糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース７九糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース７九糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース７九糖鎖の結合を行った。その結果、図１０で示されるオリゴマンノース７九糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ７）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６４】
実施例１４ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース８十鎖の結合
オリゴマンノース８十糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース８十糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース８十糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース８十糖鎖の結合を行った。その結果、図１１で示されるオリゴマンノース８十糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ８）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６５】
実施例１５ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース９十一糖鎖の結合
オリゴマンノース９十一糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース９十一糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース９十一糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース９十一糖鎖の結合を行った。その結果、図１２で示されるオリゴマンノース９十一糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ９）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６６】
実施例１６ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への３′−シアリルラクトース三糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
３′−シアリルラクトース三糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、または、２）２００μｇ、または、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して３′−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の３′−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに３′−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１３で示される３′−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）３ＳＬ−１、２）３ＳＬ−２、３）３ＳＬ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６７】
実施例１７ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への６′−シアリルラクトース三糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
６′−シアリルラクトース三糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、または、２）２００μｇ、または、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して６′−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の６′−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに６′−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１４で示される６′−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）６ＳＬ−１、２）６ＳＬ−２、３）６ＳＬ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６８】
実施例１８ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への３′−シアリルラクトサミン糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
３′−シアリルラクトサミン糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、または、２）２００μｇ、または、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して３′−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の３′−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに３′−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１５で示される３′−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）３ＳＬＮ−１、２）３ＳＬＮ−２、３）３ＳＬＮ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６９】
実施例１９ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への６′−シアリルラクトサミン糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
６′−シアリルラクトサミン糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、または、２）２００μｇ、または、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して６′−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の６′−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに６′−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１６で示される６′−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）６ＳＬＮ−１、２）６ＳＬＮ−２、３）６ＳＬＮ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００７０】
実施例２０ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理
実施例４〜１９の手段により調製された各２４種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のＨＳＡ蛋白質表面の親水性化処理を行った。２４種の糖鎖結合リポソーム２ｍｌに、別々に、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎ１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間、その後７℃で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された２４種類の糖鎖結合リポソーム複合体（略称：Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ａ３６、Ｍａｎ３、Ｍａｎ４ｂ、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、Ｍａｎ９、３ＳＬ−１、３ＳＬ−２、３ＳＬ−３、６Ｓ−１、６ＳＬ−２、６ＳＬ−３、３ＳＬＮ−１、３ＳＬＮ−２、３ＳＬＮ−３、６ＳＬＮ−１、６ＳＬＮ−２、６ＳＬＮ−３）各２ｍｌ得た。これを表１に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】
表１から分かるように、本発明のリポソームは良好な平均粒径を示した。
【００７３】
実施例２１
ヨード化合物の内包率の測定
表１記載の試料を等張の食塩水で透析し、透析終了後にエタノールを添加してリポソームを破壊し、吸光度の測定によりリポソーム内のヨード化合物量を求めた。試料中の全ヨード化合物量に対する比率を内包率（質量％）として表した。
【００７４】
結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
【００７６】
表２から分かるように、本発明のコレステロール誘導体を用いたリポソームは良好な内包率を示した。
【００７７】
実施例２２
実施例２０で作製した、リポソームを含有する造影剤及び生理食塩水を用い、体重３０ｇのマウス一匹当たり３ｍｌ注入で、ヨウ素量が２５００ｍｇＩ／ｋｇの投与量となる造影剤を調製した。
【００７８】
実施例２３
急性毒性試験
上記造影剤をｄｄｙマウスの尾静脈より投与することにより、投与後２４時間以内に死亡したマウスの数をカウントした。検体数を２０として得られた結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
【００８０】
表３に示すように、本発明の造影剤は生体に対する毒性が低いことが分かる。
【００８１】
実施例２４
実施例２０で作製した、リポソームを含有する造影剤及び生理食塩水を用い、体重３０ｇのマウス一匹当たり０．３ｍｌ注入で、ヨウ素量が２５０ｍｇＩ／ｋｇの投与量となる造影剤を調製した。
【００８２】
実施例２５
組織内分布の評価
この造影剤をｄｄｙマウスの尾静脈より投与することにより組織内分布を評価した。投入後、５分、３０分、２時間、２４時間の肝臓、膵臓及び血液内のヨウ素の濃度を、誘導結合プラズマ発光分析装置（Ｕｒｔｉｍａ−２、ＪｙｏｂｉｎＹｖｏｎ社製）にて測定した。検体数を２０として得られた結果の平均値を表４に示す。なお、投与後２４時間以内に死亡したり、重篤な障害が生じる検体はなかった。
【００８３】
【表４】
【００８４】
表４より、本発明の造影剤は全身血管及び肝臓の造影に優れ、かつ膵臓の造影にも優れ、さらに２４時間以内に体外に大部分が排泄される安全性を有することが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】アルファ１，２マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２】アルファ１，３マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図３】アルファ１，４マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図４】アルファ１，６マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図５】アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図６】オリゴマンノース３五糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図７】は、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図８】オリゴマンノース５七糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図９】オリゴマンノース６八糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１０】オリゴマンノース７九糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１１】オリゴマンノース８十糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１２】オリゴマンノース９十一糖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１３】３′−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１４】６′−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１５】３′−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１６】６′−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１７】ルイスＸ型三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１８】シアリルルイスＸ型四糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１９】ラクトース二糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２０】２′−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２１】ジフコシルラクトース四糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２２】３−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２３】１−マンノース鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームであって、造影剤用化合物を封入したリポソーム及びそれを含有する造影剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、薬剤キャリアとして注目されているリポソームの表面に、糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームが研究されている。該リポソームは各種組織の細胞表面上に存在する各種のレクチン（糖鎖認識たんぱく質）に対して特異的な結合活性を有し、各種薬剤、遺伝子の生体内輸送において有用な製剤であることが知られている（例えば特許文献１参照）。しかしながら、該リポソームに造影剤化合物、特に非イオン性ヨード造影剤化合物を内包した例は知られておらず、その体内動態についても研究された例は知られていない。一方、ヨード原子を含有する造影剤単体は、汎用的には低分子量の有機ヨード剤として提供され、水に溶けるため、尿路撮影、血管造影、ＣＴの造影のように、通常、静脈血管内投与で用いられる。ヨード造影剤は、投与されて数分間は血管内に滞留するが、急速に全身に分布し、通常は腎臓で排泄されて尿中に出る。現在使用されている低分子量・水溶性のヨード造影剤は血管から臓器や組織への移行が早く、血管の中でも特に静脈を明確に造影することが困難であった。
【０００３】
血中滞留性を上げるために、今から２０年程前、ヨード化けし油をレシチンで分散したオイルエマルジョンタイプの造影剤がいくつか検討された（例えば、非特許文献１参照）。これらは目論見通り血中滞留性が向上し、全身血管の造影能力が格段に向上したが、発熱、悪心、アナフィラキシーショック等の重篤な副作用を引き起こす問題が解決できず、実用化に至っていない。
【０００４】
一方、近年、特定臓器の癌疾患の造影が強く求められている。しかしながら、上述の造影剤には臓器特異的な集積性がないため要望を満たすことが困難である。糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームは、表面の親水化度の調整や表面糖鎖及び、リンカー蛋白質の構造最適化により体内各組織、がん細胞等への指向性、移行量を制御することが可能であることが知られている（例えば特許文献１、２参照）。しかしながら、膵臓への臓器特異性を十分に発現できないという欠点を有していた。現在、膵臓疾患、特に膵臓の転移性癌は早期発見が難しく、死亡率の高い疾患として知られており新規な造影剤の開発が切望されている。
【特許文献１】特許第３８８２０３４号公報
【特許文献２】国際公開第０５／０１１６３２号パンフレット
【非特許文献１】Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，２１６，１５４−１６２，２０００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、（１）生体に対する毒性が低く、（２）内包率が高く、（３）全身血管及び肝臓の造影に優れ、（４）かつ、膵臓の造影にも優れ、（５）さらに２４時間以内に体外に大部分が排泄される安全性を有する、造影剤用化合物を封入したリポソーム、及び該リポソームを含有する造影剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の上記課題は、以下の構成により達成される。
【０００７】
１．糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームであって、造影剤用化合物を封入したことを特徴とするリポソーム。
【０００８】
２．前記造影剤用化合物が非イオン性ヨード造影剤化合物であることを特徴とする前記１に記載のリポソーム。
【０００９】
３．前記リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンであることを特徴とする前記１または２に記載のリポソーム。
【００１０】
４．前記１〜３のいずれか１項に記載のリポソームを含有することを特徴とする造影剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、（１）生体に対する毒性が低く、（２）内包率が高く、（３）全身血管及び肝臓の造影に優れ、（４）かつ、膵臓の造影にも優れ、（５）さらに２４時間以内に体外に大部分が排泄される安全性を有する造影剤用化合物を含有したリポソーム、リ及び該リポソームを含有する造影剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、本発明の造影剤用化合物を含有する特定構造のリポソームは、（１）生体に対する毒性が低く、（２）内包率が高く、（３）全身血管及び肝臓の造影に優れ、（４）かつ、膵臓の造影にも優れ、（５）さらに２４時間以内に体外に大部分が排泄される安全性を有する造影剤を含有するリポソームであり、これを含む造影剤は優れた造影剤であることを見出した。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
《糖鎖がリンカーたんぱく質を介してリポソーム膜に結合したリポソーム》
リポソームとは、通常、膜状に集合した脂質層及び内部の水層から構成される閉鎖小胞を意味する。
【００１５】
（糖鎖）
本発明におけるリポソームは、糖鎖により修飾されたものである。なお、これらの糖鎖中の糖として具体的には、単糖、二糖、三糖、多糖の全てのアルドペントース、アルドヘキソースを表すが、好ましくはアロース、アルトロース、グルコース、マンノース、ギュロース、イドース、ガラクトース、タロース、リボース、アラビノース、キシロース、リキソース、エリトロース、トレオース、セロビオース、フコース、マルトース、イソマルトース、ラクトースまたはマルトリオロース、アルファ−１，２−マンノビオース二糖、アルファ１，３マンノビオース二糖、アルファ１，４マンノビオース二糖、アルファ−１，６−マンノビオース二糖、アルファ−１，３−アルファ−１，６−マンノトリオース三糖、オリゴマンノース３五糖、オリゴマンノース４ｂ六糖、オリゴマンノース５七糖、オリゴマンノース６八糖、オリゴマンノース７九糖、オリゴマンノース８十糖、オリゴマンノース９十一糖、３′−シアリルラクトース三糖、６′−シアリルラクトース三糖、３′−シアリルラクトサミン三糖、６′−シアリルラクトサミン三糖、ルイスＸ型三糖、シアリルルイスＸ型四糖、ラクトース二糖、２′−フコシルラクトース三糖、ジフコシルラクトース四糖及び３−フコシルラクトース三糖を表す。
【００１６】
本発明においては、これら糖鎖はリンカー蛋白質を介してリポソーム表面に結合している。この場合のリポソームの構造をこれら糖鎖の化学構造とともに図１〜２３に示す。なお、これらの図は模式図であり、糖鎖−リンカー蛋白質は、実際にはリポソーム表面に多数結合している。
【００１７】
（リンカー蛋白質）
リンカー蛋白質としては、例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）等の動物の血清アルブミンが挙げられるが、特にヒト血清アルブミンが好ましい。
【００１８】
本発明のリポソームの脂質膜の成分として、一般にリン脂質が好ましく使用される。本発明に用いられるリン脂質は通常公知のもので制限はない。ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン等のリン脂質である。卵黄、大豆その他の動植物材料に由来するリン脂質、それらの水素添加物、水酸化物の誘導体といった半合成のリン脂質、または合成加工品等、限定されることなく用いられる。リン脂質の構成脂肪酸も特に限定されることはなく、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸のどちらでもよい。
【００１９】
具体的な中性リン脂質の例として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストリルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルエノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン等が挙げられる。
【００２０】
（造影剤用化合物）
本発明に用いられる造影剤用化合物は、従来公知のものであれば制限はなく、具体的にはＭＲＩ造影剤用化合物、ヨード造影剤用化合物が好ましく用いられる。ＭＲＩ造影剤用化合物としては、好ましくはＤＴＰＡ誘導体が挙げられ、Ｇｄ（III）−ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミンペンタ酢酸のガドリニウム（III）錯体）が好ましい、さらに欧州特許ＥＰ００７１５６４号公報、及び特表平１０−５１１９３４号公報が記載する金属錯体が重要である。ヨード化合物が本発明の化合物としてより好ましく、さらに非イオン性ヨード化合物が特に好ましく、水溶性であることが好ましく、具体的にはヨウ化フェニル基、例えば２，４，６−トリヨードフェニル基を少なくとも１個有する非イオン性ヨード化合物が好適である。好ましい非イオン性ヨード化合物として、具体的にはイオヘキソール、イオペントール、イオジキサノール、イオプロミド、イオトロラン、イオメプロール、Ｎ，Ｎ′−ビス〔２−ヒドロキシ−１−（ヒドロキシメチル）−エチル〕−５−〔（２−ヒドロキシ−１−オキソプピル）−アミノ〕−２，４，６−トリヨード−１，３−ベンゼン−ジカルボキシアミド（イオパミドール）；メトリザミド等が挙げられる。
【００２１】
非イオン性ヨード化合物は、これらの例示に限定されるものではない。また、非イオン性ヨード化合物は単独で用いてもよく、あるいは２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお、本明細書において、化合物は遊離形態の他に、その塩、水和物等も含めて言及することがある。特に好適なヨード系化合物として、高度に親水性であり、かつ高濃度でも浸透圧が高くならないイオメプロール、イオパミドール、イオトロラン、イオジキサノール等が挙げられる。イオトラン、イオジキサノールといった二量体非イオン性ヨード化合物では、ヨウ素担持効率が高く、同一ヨード濃度の造影剤を調製しても全体のモル数が低いために浸透圧を低下させる利点がある。
【００２２】
造影剤用化合物のリポソームへの封入濃度は、該化合物の性質、意図する製剤の投与経路及び臨床上の指標といった要因に基づき任意に設定することができる。リポソーム内に封入された造影剤用化合物の量は、典型的には添加された全造影剤用化合物の５〜４０質量％、好ましくは５〜３５質量％、より好ましくは１０〜２５質量％である。この内包率は、リポソーム粒子の細密充填の限界を下回るために、リポソームにおける造影物質の保持安定性は損なわれない。本発明のリポソームの構成成分は上記に限定されず、他の成分を加えることができる。その例としては、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２２３，４２（１９８７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５，６９４９（１９８８）等に記載のモノシアルガングリオキシドＧＭ１誘導体、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，２１４５（１９８９）；Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１４８，７７（１９９２）等に記載のグルクロン酸誘導体、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０２９，９１（１９９０）；ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，２６８，２３５（１９９０）等に記載のポリエチレングリコール誘導体が挙げられるが、これに限られるものではない。
【００２３】
《リポソームの形成方法》
本発明のリポソームは、当業者が利用可能ないかなる方法で形成してもよい。形成法の例としては、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９，４６７（１９８０）、“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｏｓｔｒｏ編、ＭＡＲＣＥＬＬ ＤＥＫＫＥＲ、ＩＮＣ．）等に記載されている。具体例としては、超音波処理法、エタノール注入法、フレンチプレス法、エーテル注入法、コール酸法、カルシウム融合法、凍結融解法、逆相蒸発法等が挙げられるが、これに限られるものではない。リポソームの構造は特に限定されず、ユニラメラまたはマルチラメラ等のいずれの形態でもよい。また、リポソームの内部に適宜の化合物の１種または２種以上を配合することも可能である。
【００２４】
本発明に用いられるリポソームは、通常のものでも使用できるが、その表面は親水性化されていることが望ましい。本発明のリポソーム自体の製法について、具体的に述べると、例えば、まず、フォスファチジルコリン類、コレステロール、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類を配合成分とする脂質と界面活性剤コール酸ナトリウムとの混合ミセルを調製する。とりわけ、フォスファチジルエタノールアミン類の配合は親水性化反応部位として、ガングリオシド類または糖脂質類またはフォスファチジルグリセロール類の配合はリンカー蛋白質の結合部位として必須のものである。そして、これにより得られる混合ミセルの限外濾過を行うことによりリポソームを作製する。続いて、リポソーム膜の脂質フォスファチジルエタノールアミン上に架橋用の２価試薬とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとを用いてリポソーム表面を親水性化する。
【００２５】
リポソームの親水性化は、従来公知の方法、例えば、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、無水マレイン酸共重合体等を共有結合により結合させたリン脂質を用いてリポソームを作製する方法（特開２００１−３０２６８６号）等も用いることが可能ではあるが、本発明においては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化することが特に好ましい。トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを用いてリポソーム表面を親水性化するには、例えばジミリストイルフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質を用いて、常法により得たリポソーム溶液にビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３′−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬加えて反応させることにより、リポソーム膜上のジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン等の脂質に２価試薬を結合させ、次いでトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを、該２価試薬の一方の結合手と反応させることにより、リポソーム表面にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを結合せしめる。
【００２６】
本発明における、糖鎖によるリポソームの修飾手段について具体的に述べると、例えば、糖鎖はリンカー蛋白質を介してリポソーム結合させるが、リンカー蛋白質をリポソームに結合する手段としては、まず、リポソームを、ＮａＩＯ4、Ｐｂ（Ｏ2ＣＣＨ3）4、ＮａＢｉＯ3等の酸化剤で処理して、リポソーム膜面に存在するガングリオシドを酸化し、次いで、ＮａＢＨ3ＣＮ、ＮａＢＨ4等の試薬を用いて、リンカー蛋白質とリポソーム膜面上のガングリオシドを、還元的アミノ化反応により結合させる。このリンカー蛋白も、親水性化するのが好ましく、これにはリンカー蛋白質にヒドロキシ基を有する化合物を結合させるが、例えば、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３′−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンをリポソーム上のリンカー蛋白質と結合させればよい。
【００２７】
具体的に述べると、まず、リンカー蛋白質の全てのアミノ基に架橋用２価試薬の一端を結合する。そして、各種糖鎖の還元末端をグリコシルアミノ化反応して得られる糖鎖グリコシルアミン化合物を調製し、この糖鎖のアミノ基とリポソーム上の上記で結合された架橋２価試薬の一部分の他の未反応末端とを結合する。
【００２８】
次に、このようにして得られる糖鎖結合リポソーム膜面上蛋白質の表面に糖鎖が結合していない未反応で残っている大部分の２価試薬未反応末端を用いて親水性化処理を行う。つまり、このリポソーム上蛋白質に結合している２価試薬の未反応末端とトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとの結合反応を行い、リポソーム表面を親水性化することにより、本発明のリポソームを得ることができる。
【００２９】
次いで、糖鎖を、上記リポソーム上のリンカー蛋白質と結合させる。例えば、まず、糖鎖を構成する糖類の還元末端を、ＮＨ4ＨＣＯ3、ＮＨ2ＣＯＯＮＨ4等のアンモニウム塩を用いてグリコシルアミノ化し、次いで、ビススルフォスクシニミヂルスベラート、ジスクシニミヂルグルタレート、ジチオビススクシニミヂルプロピオネート、ジスクシニミヂルスベラート、３，３′−ジチオビススルフォスクシニミヂルプロピオネート、エチレングリコールビススクシニミヂルスクシネート、エチレングリコールビススルフォスクシニミヂルスクシネート等の２価試薬を用いて、リポソーム膜面上に結合したリンカー蛋白質と、上記グリコシルアミノ化された糖類とを結合させ、図１〜２３に示されるようなリポソームを得る。
【００３０】
次にリポソーム粒子のサイズ及びその分布について詳述する。「中心粒径」とは、粒子分布で最も出現頻度の高い粒子径を指している。なお、粒子径または粒径は、粒子の直径を意味する。粒径の調整は、処方またはプロセス条件で行うことができる。例えば、上記の超臨界の圧力を大きくすると形成されるリポソーム粒径は小さくなる。リポソームの粒子径の分布をより狭い範囲に揃えるには、作製されるリポソームの懸濁液を一定サイズの孔径を有する濾過膜、好ましくはポリカーボネート膜等に強制的に透過させてもよい。この場合、濾過膜として０．０５〜０．４μｍ、好ましくは０．１〜０．４μｍ、さらに好ましくは０．１５〜０．２μｍの孔径のフィルターを装着した静圧式押出し装置に通すことにより、リポソーム多重層膜の脂質膜枚数を減らすとともに、中心粒径として１００〜３００ｎｍの最適寸法を有する均一なリポソームを効率よく調製することができる。
【００３１】
具体的には、各種の静圧式押出し装置、例えば「エクストルーダー」（商品名、日油リポソーム製）等を使用して、フィルターを強制的に透過させる。フィルターは、ポリカーボネート系、セルロース系等のタイプを適宜使用することができる。このような「押出し」操作工程を取り入れることにより、上記サイジングに加えて、リポソーム分散液の交換、濾過滅菌も併せて可能になるという利点もある。
【００３２】
引き続きリポソーム分散液を、遠心分離、ゲル濾過等の方法により未保持の薬剤を除去して精製したり、濃縮、希釈、凍結乾燥等の操作を任意に行ってもよい。本発明の造影剤入りリポソームの中心粒径は、通常５０〜３００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍ、より好ましくは５０〜１３０ｎｍである。糖鎖を結合させた場合の糖鎖の結合密度は、リポソームに結合させるリンカー蛋白質１分子当り１〜６０個、好ましくは１〜４０個、さらに好ましくは１〜２０個である。また、リポソーム１粒子当りは、リンカー蛋白質を用いる場合は、１〜３００００個、好ましくは１〜２００００個、さらに好ましくは１〜１００００個、あるいは１００〜３００００個、好ましくは１００〜２００００個、さらに好ましくは１００〜１００００個、あるいは５００〜３００００個、好ましくは５００〜２００００個、さらに好ましくは５００〜１００００個である。リンカー蛋白質を用いない場合は、リポソーム１粒子当り１〜５００００個、好ましくは１〜３０００００個、さらに好ましくは１〜１０００００個以上の糖鎖を結合させることができる。
【００３３】
造影剤用化合物のリポソーム内部への封入は、周知の方法を用いればよく、例えば、造影剤用化合物の含有溶液とフォスファチジルコリン類、フォスファチジルエタノールアミン類、フォスファチジン酸類もしくは長鎖アルキルリン酸塩類、ガングリオシド類、糖脂質類もしくはフォスファチジルグリセロール類及びコレステロール類を含む脂質を用いてリポソームを形成することにより、薬剤等はリポソーム内に封入される。
【００３４】
《造影剤》
次に、本発明のリポソームを含有する造影剤について詳述する。
【００３５】
注射のために製剤化された本発明の造影剤は、迅速で簡便な注射を可能にするよう適度な粘度のみを有するべきである。粘度は、１０．２０×１０-4ｋｇｆ・ｓ／ｍ2（１０ｍＰａ・ｓ、１０ｃＰ）未満、好ましくは５．１０×１０-4ｋｇｆ・ｓ／ｍ2（５ｍＰａ・ｓ、５ｃＰ）未満、より好ましくは２．０４×１０-4ｋｇｆ・ｓ／ｍ2（２ｍＰａ・ｓ、２ｃＰ）未満である。
【００３６】
また、注射のために製剤化された本発明の造影剤は過度の浸透圧を有するべきではない。なぜなら、これは毒性を増加させ得るからである。浸透圧は、３０００ミリオスモル／ｋｇ未満、好ましくは２５００ミリオスモル／ｋｇ未満、最も好ましくは９００ミリオスモル／ｋｇ未満である。
【００３７】
本発明の造影剤は、無機または有機の酸及び塩基から誘導される塩を含有することができる。塩の具体例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモエート、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩、アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム及びカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム、マグネシウム及び亜鉛塩）、有機塩基を有する塩（例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）、及びアミノ酸（例えば、アルギニン、リジン）を有する塩等を包含する。
【００３８】
また、塩基性窒素含有基は、低級アルキルハライド（例えば、メチル、エチル、プロピル及びブチルクロライド、ブロマイド及びヨージド）、ジアルキル硫酸（例えば、ジメチル、ジエチル、ジブチル及びジアミル硫酸）、長鎖ハライド（例えば、デシル、ラウリル、ミリスチル及びステアリルクロライド、ブロマイド及びヨージド）、アラルキルハライド（例えば、ベンジル及びフェネチルブロマイド）ならびにその他のような薬剤で４級化され得る。それによって、水溶性または油溶性あるいは水分散性または油分散性の生成物が得られる。本発明の好ましい塩は、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、カルシウム及びナトリウム塩である。
【００３９】
本発明の造影剤は、任意のキャリア、アジュバントもしくはビヒクルを含有することができる。本発明の造影剤に使用され得るキャリア、アジュバント及びビヒクルは、イオン交換物質、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清蛋白質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝性物質（例えば、ホスフェート）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール及びラノリンを包含するが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明の造影剤は、注射可能な無菌の調合薬の形態（例えば、注射可能な無菌の水性または油性の懸濁液）であり得る。この懸濁液は、当該分野で公知の技術に従い、適切な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤を用いて製剤され得る。注射可能な無菌の調合薬はまた、無毒性の非経口で受容可能な希釈剤または溶媒中における、無菌の注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として）であってもよい。用いられ得る受容可能なビヒクル及び溶媒は、水、リンガー溶液及び等張食塩水である。さらに、従来では、無菌の不揮発油が溶媒または懸濁媒体として使用される。この目的のために、合成のモノ−またはジ−グリセリドを含む任意の刺激のない不揮発油が使用され得る。脂肪酸（例えば、オレイン酸及びそのグリセリド誘導体）は、天然の薬学的に受容可能なオイル（例えば、オリーブオイルまたはヒマシ油）と同様に、注射可能物の調製、特にこれらのポリオキシエチル化した変形物において有用である。これらのオイル溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコールの希釈剤または分散剤（例えば、Ｐｈ．Ｈｅｌｖまたは類似のアルコール）を含み得る。
【００４１】
本発明の造影剤は、経口投与、非経口投与、吸入スプレーによる投与、局所投与、直腸投与、鼻腔投与、頬投与、膣投与または従来の無毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバント及びビヒクルを含有する投薬製剤中に埋め込まれたリザーバを介して投与され得る。本明細書に使用されるように用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、くも膜下、肝臓内、病変内及び頭蓋内注射または点滴技術を含む。
【００４２】
経口投与される場合、本発明の薬学的組成物は任意の経口的に受容可能な投薬形態（カプセル、錠剤、水性の懸濁液または溶液が挙げられるが、これらに限定されない）で投与され得る。錠剤を経口使用する場合、一般的に使用されるキャリアには、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。代表的には、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた添加される。カプセル形態の経口投与に対して、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用に水性懸濁液を必要とする場合、活性成分は乳化剤及び懸濁剤と配合される。所望の場合、特定の甘味料、香味料または着色料もまた添加してもよい。あるいは、直腸投与のために座薬形態で投与される場合には、本発明の造影剤は、室温で固体であるが直腸温で液体である適切な非刺激性の賦形剤とを混合して調製され得、その結果直腸内で溶け薬剤を放出する。このような物質として、ココアバター、ビーズワックス及びポリエチレングリコールが挙げられる。
【００４３】
また、前述のように、特に、処置標的が局所施用によって容易に接近可能な領域または器官（目、皮膚または下部腸道（ｌｏｗｅｒ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｃｔ）を含む）を含む場合に、本発明の造影剤は局所投与され得る。適切な局所製剤は、これらの各領域または器官用に容易に調製される。
【００４４】
下部腸道に対する局所施用は、直腸用座薬製剤または適切な浣腸製剤でなされ得る。局所−経皮性パッチもまた使用してよい。局所施用に対して、本発明の造影剤は、１つ以上のキャリア中に懸濁または溶解される活性成分を含有する、適切な軟膏に製剤され得る。本発明の造影剤の局所投与のためのキャリアは、鉱油、液体ペトロラタム、白色ペトロラタム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水を包含するが、それらに限定されない。あるいは、本発明の造影剤は、１つ以上のキャリア中に懸濁または溶解された活性成分を含有する、適切なローションまたはクリームに製剤されてもよい。適切なキャリアは、鉱油、ソルビタンモノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水を包含するが、それらに限定されない。
【００４５】
眼使用に対して、本発明の造影剤は防腐剤（例えば、ベンジルアルコニウムクロライド）を含有してもしなくてもよい。ｐＨ調節された等張の無菌生理食塩水中に微小化された懸濁液として、または好ましくはｐＨ調節された等張の無菌生理食塩水中の溶液として製剤され得る。あるいは、眼使用に対して本発明の造影剤は、ペトロラタムのような軟膏に製剤され得る。
【００４６】
鼻腔エーロゾルまたは吸入による投与に対して、本発明の造影剤は、製薬的製剤の分野で周知の技術に従って調製され、そしてベンジルアルコールもしくは他の適切な防腐剤、生体利用性を増大させる吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／または他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を使用し、生理食塩水中の溶液として調製され得る。
【００４７】
投薬は、診断用画像化機器の感度、ならびに造影剤の組成に依存する。しかし、任意の特定の患者に対する特定の投薬処方もまた、種々の因子（年齢、体重、健康状態、性別、治療食、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ及び処置する内科医の判断を含む）に依存することが理解されるべきである。
【００４８】
本発明では造影剤の適切な投薬の投与に続いて、ＭＲＩ画像化またはＸ線画像化が行われる。ＭＲＩ画像化は、パルス系列（反転回復（ＩＲ）；スピンエコー（ＳＥ）；エコー断層（ＥＰＩ）；飛行時間（ＴＯＦ）；ターボフラッシュ；グラディエントエコー（ＧＥ））及び画像化パラメーターの値（エコー時間（ＴＥ）；反転時間（ＴＩ）；繰り返し時間（ＴＲ）；フリップ角等）の選択は、要求される診断情報に支配される。一般的には、Ｔ１−加重された画像を得ることが望まれる場合、ＴＥはＴ１−加重を最大とするために３０ミリ秒未満（または最小値）であるべきである。逆に、Ｔ２の測定が所望される場合、ＴＥは競合するＴ１効果を最小にするために３０ミリ秒より大きくあるべきである。ＴＩ及びＴＲは、Ｔ１−及びＴ２−加重された画像の両方に対して、ほぼ同じに保たれる；一般的に、ＴＩ及びＴＲは、それぞれ、約５〜１０００ミリ秒及び２〜１０００ミリ秒のオーダーである。
【００４９】
Ｘ線画像化は、従来公知の方法による脳血管撮影、選択的血管撮影、四肢血管撮影、ディジタルＸ線撮影法による静脈性血管撮影、コンピューター断層撮影における造影、静脈性尿路撮影等による画像化であることが好ましい。本発明の造影剤は全身血管、及び肝臓、特に膵臓の造影に優れているので選択的血管撮影、コンピューター断層撮影における腹部造影が最適な撮像方法である。
【実施例】
【００５０】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【００５１】
実施例１ 造影剤化合物封入リポソームの調製
造影剤化合物封入前のリポソームは、既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４２，５６−６５）により、改良型コール酸透析法を用いて調製した。すなわち、ジパルミトイルフォスファチジルコリン、コレステロール、ジセチルフォスフェート、ガングリオシド及びジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンをモル比でそれぞれ３５：４０：５：１５：５の割合の合計脂質量４５．６ｍｇにコール酸ナトリウムを４６．９ｍｇ添加し、クロロホルム／メタノール溶液３ｍｌに溶解した。この溶液を蒸発させ、沈殿物を真空中で乾燥させることによって脂質膜（造影剤化合物封入前のリポソーム）を得た。得られた脂質膜に非イオン性ヨード化合物を含有する造影剤溶液（日局イオパミドール溶液３０６．２ｍｇ／ｍｌ（ヨード含有量１５０ｍｇ／ｍｌ）、トロメタモールを１ｍｇ／ｍｌ、エデト酸カルシウム２ナトリウム（ＥＤＴＡＮａ2−Ｃａ）０．１ｍｇ／ｍｌを含有し、適量の塩酸及び水酸化ナトリウムでｐＨを７前後に調整）５ｍｌを注入した。次に超音波照射（Ｂｒａｎｓｏｎ社製、Ｎｏ．３５４２プローブ型発振器、０．１ｍＷ）を氷冷下５分実施することにより、非イオン性ヨード化合を含有するリポソームの分散液を得た。得られた分散液を６０℃まで加熱し、アドバンテック社製のセルロース系フィルター、１．０μｍで加圧濾過した。得られた試料をスペクトラプロ社製、バイオテックＲＣ透析チューブに封入し、多量の生理食塩水（９．０×１０-1質量％、１０００ｇ）中に浸して透析を行い、リポソーム内に取り込めなかった非イオン性ヨード化合物等を除去した、均一リポソーム（平均粒径１００ｎｍ）１０ｍｌを調製した。
【００５２】
実施例２ リポソーム脂質膜面上の親水性化処理
実施例１で調製したリポソーム溶液１０ｍｌをＸＭ３００膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ．，ＵＳＡ）とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた限外濾過にかけ、溶液のｐＨを８．５にした。次に、架橋試薬ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＢＳ３；Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）１０ｍｌを加え、２５℃で２時間攪拌した。その後、さらに７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミンとＢＳ３との化学結合反応を完結した。そして、このリポソーム液をＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過にかけた。次に、ＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）１ｍｌに溶かしたｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ ４ｍｇをリポソーム液１０ｍｌに加えて、２５℃で２時間攪拌後、７℃で一晩攪拌してリポソーム膜上の脂質に結合したＢＳ３とｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅとの化学結合反応を完結した。これにより、リポソーム膜の脂質ジパルミトイルフォスファチジルエタノールアミン上にｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅの水酸基が配位して水和親水性化された。
【００５３】
実施例３ リポソーム膜面上へのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の結合
既報の手法（Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｎ．，Ｋｏｄａｍａ，Ｍ．ａｎｄ Ｇａｂｉｕｓ，Ｈ．−Ｊ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４２，５６−６５）により、カップリング反応法を用いて行った。すなわち、この反応は２段階化学反応で行い、まずはじめに、実施例２で得られた１０ｍｌのリポソーム膜面上に存在するガングリオシドを１ｍｌのＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ８．４）に溶かしたメタ過ヨウ素酸ナトリウム４３ｍｇを加えて室温で２時間攪拌して過ヨウ素酸酸化した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ８．０）で限外濾過することにより酸化されたリポソーム１０ｍｌを得た。このリポソーム液に、２０ｍｇのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を加えて２５℃で２時間攪拌し、次にＰＢＳ（ｐＨ８．０）に２Ｍ ＮａＢＨ3ＣＮ １００μｌを加えて１０℃で一晩攪拌してリポソーム上のガングリオシドとＨＳＡとのカップリング反応でＨＳＡを結合した。そして、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過をした後、ＨＳＡ結合リポソーム液を得た。
【００５４】
実施例４ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，２マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，２マンノビオース二糖鎖（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，２マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，２マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，２マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図１で示されるアルファ１，２マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ２）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５５】
実施例５ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，３マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，３マンノビオース二糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，３マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，３マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，３マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図２で示されるアルファ１，３マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ３）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５６】
実施例６ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，４マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，４マンノビオース二糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，４マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，４マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，４マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図３で示されるアルファ１，４マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ４）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５７】
実施例７ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，６マンノビオース二糖鎖の結合
アルファ１，６マンノビオース二糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，６マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，６マンノビオース二糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，６マンノビオース二糖鎖の結合を行った。その結果、図４で示されるアルファ１，６マンノビオース二糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ６）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５８】
実施例８ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖の結合
アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖の結合を行った。その結果、図５で示されるアルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ａ３６）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００５９】
実施例９ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース３五糖鎖の結合
オリゴマンノース３五糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース３五糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース３五糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース３五糖鎖の結合を行った。その結果、図６で示されるオリゴマンノース３五糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ３）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６０】
実施例１０ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース４ｂ六糖鎖の結合
オリゴマンノース４ｂ六糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース４ｂ六糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース４ｂ六糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース４ｂ六糖鎖の結合を行った。その結果、図７で示されるオリゴマンノース４ｂ六糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ４ｂ）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６１】
実施例１１ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース５七糖鎖の結合
オリゴマンノース５七糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース５七糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース５七糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース５七糖鎖の結合を行った。その結果、図８で示されるオリゴマンノース５七糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ５）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６２】
実施例１２ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノースオリゴマンノース６八糖鎖の結合
オリゴマンノース６八糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース６八糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース６八糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース６八糖鎖の結合を行った。その結果、図９で示されるオリゴマンノース６八糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ６）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６３】
実施例１３ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース７九糖鎖の結合
オリゴマンノース７九糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース７九糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース７九糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース７九糖鎖の結合を行った。その結果、図１０で示されるオリゴマンノース７九糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ７）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６４】
実施例１４ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース８十鎖の結合
オリゴマンノース８十糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース８十糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース８十糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース８十糖鎖の結合を行った。その結果、図１１で示されるオリゴマンノース８十糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ８）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６５】
実施例１５ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上へのオリゴマンノース９十一糖鎖の結合
オリゴマンノース９十一糖鎖（ＣａｌｂｉｏｃｈｅｍＣｏ．，ＵＳＡ）５０μｇを０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結してオリゴマンノース９十一糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記のオリゴマンノース９十一糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰにオリゴマンノース９十一糖鎖の結合を行った。その結果、図１２で示されるオリゴマンノース９十一糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：Ｍａｎ９）２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６６】
実施例１６ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への３′−シアリルラクトース三糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
３′−シアリルラクトース三糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、または、２）２００μｇ、または、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して３′−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の３′−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに３′−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１３で示される３′−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）３ＳＬ−１、２）３ＳＬ−２、３）３ＳＬ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６７】
実施例１７ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への６′−シアリルラクトース三糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
６′−シアリルラクトース三糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、または、２）２００μｇ、または、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して６′−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の６′−シアリルラクトース三糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに６′−シアリルラクトース三糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１４で示される６′−シアリルラクトース三糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）６ＳＬ−１、２）６ＳＬ−２、３）６ＳＬ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６８】
実施例１８ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への３′−シアリルラクトサミン糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
３′−シアリルラクトサミン糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、または、２）２００μｇ、または、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して３′−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の３′−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに３′−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１５で示される３′−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）３ＳＬＮ−１、２）３ＳＬＮ−２、３）３ＳＬＮ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００６９】
実施例１９ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上への６′−シアリルラクトサミン糖鎖の結合（糖鎖結合量が異なるもの３種類）
６′−シアリルラクトサミン糖鎖（Ｗａｋｏ Ｐｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｊａｐａｎ）（１）５０μｇ、または、２）２００μｇ、または、３）１ｍｇ）を０．２５ｇのＮＨ4ＨＣＯ3を溶かした０．５ｍｌ水溶液に加え、３７℃で３日間攪拌した後、０．４５μｍのフィルターで濾過して糖鎖の還元末端のアミノ化反応を完結して６′−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを得た。次に、実施例３で得たリポソーム液の一部分１ｍｌに架橋試薬３，３′−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ（ＤＴＳＳＰ；ＰｉｅｒｃｅＣｏ．，ＵＳＡ）１ｍｇを加えて２５℃で２時間、続いて７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＣＢＳ緩衝液（ｐＨ８．５）で限外濾過してＤＴＳＳＰがリポソーム上のＨＳＡに結合したリポソーム１ｍｌを得た。次に、このリポソーム液に上記の６′−シアリルラクトサミン糖鎖のグリコシルアミン化合物５０μｇを加えて、２５℃で２時間攪拌し、その後７℃で一晩攪拌し、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過してリポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン上のＤＴＳＳＰに６′−シアリルラクトサミン糖鎖の結合を行った。その結果、糖鎖結合量が異なるもの３種類の図１６で示される６′−シアリルラクトサミン糖鎖とヒト血清アルブミンとリポソームとが結合したリポソーム（略称：１）６ＳＬＮ−１、２）６ＳＬＮ−２、３）６ＳＬＮ−３）各２ｍｌ（総脂質量２ｍｇ、総蛋白量２００μｇ、平均粒径１００ｎｍ）が得られた。
【００７０】
実施例２０ リポソーム膜面結合ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）上の親水性化処理
実施例４〜１９の手段により調製された各２４種類の糖鎖が結合したリポソームについて、それぞれ別々に以下の手順によりリポソーム上のＨＳＡ蛋白質表面の親水性化処理を行った。２４種の糖鎖結合リポソーム２ｍｌに、別々に、ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎ１３ｍｇを加えて、２５℃で２時間、その後７℃で一晩攪拌した後、ＸＭ３００膜とＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で限外濾過し未反応物を除去して、最終産物である親水性化処理された２４種類の糖鎖結合リポソーム複合体（略称：Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ６、Ａ３６、Ｍａｎ３、Ｍａｎ４ｂ、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、Ｍａｎ９、３ＳＬ−１、３ＳＬ−２、３ＳＬ−３、６Ｓ−１、６ＳＬ−２、６ＳＬ−３、３ＳＬＮ−１、３ＳＬＮ−２、３ＳＬＮ−３、６ＳＬＮ−１、６ＳＬＮ−２、６ＳＬＮ−３）各２ｍｌ得た。これを表１に示す。
【００７１】
【表１】
【００７２】
表１から分かるように、本発明のリポソームは良好な平均粒径を示した。
【００７３】
実施例２１
ヨード化合物の内包率の測定
表１記載の試料を等張の食塩水で透析し、透析終了後にエタノールを添加してリポソームを破壊し、吸光度の測定によりリポソーム内のヨード化合物量を求めた。試料中の全ヨード化合物量に対する比率を内包率（質量％）として表した。
【００７４】
結果を表２に示す。
【００７５】
【表２】
【００７６】
表２から分かるように、本発明のコレステロール誘導体を用いたリポソームは良好な内包率を示した。
【００７７】
実施例２２
実施例２０で作製した、リポソームを含有する造影剤及び生理食塩水を用い、体重３０ｇのマウス一匹当たり３ｍｌ注入で、ヨウ素量が２５００ｍｇＩ／ｋｇの投与量となる造影剤を調製した。
【００７８】
実施例２３
急性毒性試験
上記造影剤をｄｄｙマウスの尾静脈より投与することにより、投与後２４時間以内に死亡したマウスの数をカウントした。検体数を２０として得られた結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
【００８０】
表３に示すように、本発明の造影剤は生体に対する毒性が低いことが分かる。
【００８１】
実施例２４
実施例２０で作製した、リポソームを含有する造影剤及び生理食塩水を用い、体重３０ｇのマウス一匹当たり０．３ｍｌ注入で、ヨウ素量が２５０ｍｇＩ／ｋｇの投与量となる造影剤を調製した。
【００８２】
実施例２５
組織内分布の評価
この造影剤をｄｄｙマウスの尾静脈より投与することにより組織内分布を評価した。投入後、５分、３０分、２時間、２４時間の肝臓、膵臓及び血液内のヨウ素の濃度を、誘導結合プラズマ発光分析装置（Ｕｒｔｉｍａ−２、ＪｙｏｂｉｎＹｖｏｎ社製）にて測定した。検体数を２０として得られた結果の平均値を表４に示す。なお、投与後２４時間以内に死亡したり、重篤な障害が生じる検体はなかった。
【００８３】
【表４】
【００８４】
表４より、本発明の造影剤は全身血管及び肝臓の造影に優れ、かつ膵臓の造影にも優れ、さらに２４時間以内に体外に大部分が排泄される安全性を有することが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】アルファ１，２マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２】アルファ１，３マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図３】アルファ１，４マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図４】アルファ１，６マンノビオース二糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図５】アルファ１，３アルファ１，６マンノトリオース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図６】オリゴマンノース３五糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図７】は、オリゴマンノース４ｂ六糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図８】オリゴマンノース５七糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図９】オリゴマンノース６八糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１０】オリゴマンノース７九糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１１】オリゴマンノース８十糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１２】オリゴマンノース９十一糖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１３】３′−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１４】６′−シアリルラクトース三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１５】３′−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１６】６′−シアリルラクトサミン三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１７】ルイスＸ型三糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１８】シアリルルイスＸ型四糖鎖を結合したリポソームの構造例を示す模式図である。
【図１９】ラクトース二糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２０】２′−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２１】ジフコシルラクトース四糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２２】３−フコシルラクトース三糖鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【図２３】１−マンノース鎖により修飾されたリポソームの構造例を示す模式図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームであって、造影剤用化合物を封入したことを特徴とするリポソーム。
【請求項２】
前記造影剤用化合物が非イオン性ヨード造影剤化合物であることを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のリポソームを含有することを特徴とする造影剤。
【請求項１】
糖鎖がリンカー蛋白質を介してリポソーム膜に結合したリポソームであって、造影剤用化合物を封入したことを特徴とするリポソーム。
【請求項２】
前記造影剤用化合物が非イオン性ヨード造影剤化合物であることを特徴とする請求項１に記載のリポソーム。
【請求項３】
前記リンカー蛋白質がヒト血清アルブミンであることを特徴とする請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のリポソームを含有することを特徴とする造影剤。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公開番号】特開２００９−５１７８２（Ｐ２００９−５１７８２Ａ）
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２２０８０３（Ｐ２００７−２２０８０３）
【出願日】平成１９年８月２８日（２００７．８．２８）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年８月２８日（２００７．８．２８）
【出願人】（０００００１２７０）コニカミノルタホールディングス株式会社 (4,463)
【Ｆターム（参考）】
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