リンパ腫患者の早期予後用のバイオマーカーとしてのＡＰＲＩＬに対する抗体
本発明は、ＡＰＲＩＬ（ＴＡＬＬ−２としても公知である増殖誘導ＴＮＦリガンド）に対して向けられた抗体、特にモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２と、モノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２を産生するハイブリドーマ細胞と、メンブランに固着されたＡＰＲＩＬに対する抗体とＡｐｒｉｌｙ−２の組み合わせの、高いリスクの患者（＞６０歳および国際予後指標 ＞２）の、Ｂ細胞リンパ腫の治療に対する耐性の診断およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の臨床的進行の予後への使用と、に関する。抗体の調製に有用であるＳｔａｌｋと呼ばれるアミノ酸配列ＧＴＧＧＰＳＱＮＧＥＧＹＰが記載されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＡＰＲＩＬ（ＴＡＬＬ−２としても公知である）に対して向けられた抗体と、ＡＰＲＩＬに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞と、高いリスクを有する患者の、Ｂ細胞リンパ腫病原力の診断およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の臨床的進行の予後におけるこのような抗体の使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＡＰＲＩＬ（ＴＡＬＬ−２としても公知である増殖誘導ＴＮＦリガンド）およびＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ、ＴＡＬＬ−１としても公知である）は、密接に関連したＴＮＦスーパーファミリーのリガンドである。これらは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの２種の受容体を共有するが、ＢＡＦＦは、第３の受容体ＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＲ３としても公知である）に結合している（カールド，Ｓ．Ｌ．（Ｋａｌｌｅｄ，Ｓ．Ｌ．）、アンブロース，Ｃ．（Ａｍｂｒｏｓｅ，Ｃ．）およびシュー，Ｙ．Ｍ．（Ｈｓｕ，Ｙ．Ｍ．）、「Ｃｕｒｒ Ｄｉｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ」８、２０６〜４２ページ、２００５年）。ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡは、体液性免疫応答におけるこれらの２種のＴＮＦ−リガンドの役割に従って主にＢ細胞で発現される。ＢＡＦＦ／ＢＡＦＦ−Ｒ経路は、末梢Ｂ細胞の成熟に重要であり、およびＢ細胞に同時刺激を与えると共にｌｇスイッチを誘導することにより体液性応答にも関与する。ＡＰＲＩＬはＢ細胞の発達には明らかな役割を有していないが、ＢＡＦＦと同様に、体液性応答に関与している（カスティギリ，Ｅ．（Ｃａｓｔｉｇｌｉ，Ｅ．）ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」１０１、３９０３〜８ページ、２００４年）。ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ経路の調節不全は、数々の自己免疫疾患に付随している（マッケイＦ．（Ｍａｃｋａｙ，Ｆ．）、シエッロ，Ｆ．（Ｓｉｅｒｒｏ，Ｆ．）、グレイ，Ｓ．Ｔ．（Ｇｒｅｙ，Ｓ．Ｔ．）およびゴードン，Ｔ．Ｐ．（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔ．Ｐ．）、「Ｃｕｒｒ Ｄｉｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ」８、２４３〜６５ページ、２００５年）。
【０００３】
自己免疫性病理学における役割に追加して、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦは、腫瘍の発達に関係している（マッケイＦ．（Ｍａｃｋａｙ，Ｆ．）およびタンギーＳ．Ｇ．（Ｔａｎｇｙｅ，Ｓ．Ｇ．）、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ」４、３４７〜５４ページ、２００４年）。動物モデルにおいては、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦ過剰発現は、Ｂ細胞腫瘍症の進行を誘起する。これらの２種のＴＮＦリガンドのＢ細胞腫瘍への関与は、ヒト株細胞で実証されている。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）株細胞が、これらの２種のＴＮＦリガンドを異常に発現して、インビトロでの生存／増殖の利点をもたらしていると報告された。患者において、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの異常な発現は、上昇した血清濃度（ｓｅｒｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）によって確かめられた。
【０００４】
近年において、プロテオグリカンの硫酸グリコサミノグリカン側鎖へのＡＰＲＩＬの結合が実施された（インゴールド，Ｋ．（Ｉｎｇｏｌｄ，Ｋ．）ら、「Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ」２０１、１３７５〜８３ページ、２００５年）。対照的に、ＢＡＦＦはプロテオグリカンに結合せず、ＡＰＲＩＬ機能におけるプロテオグリカンの役割に対する疑問が提起されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、可溶性ＡＰＲＩＬに対して向けられたモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２、およびＡｐｒｉｌｙ−２を産生するハイブリドーマ細胞に関する。さらに、本発明は、モノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２と、メンブランに固着されたＡＰＲＩＬ断片に対して向けられたモノクローナルまたはポリクローナル抗体との組み合わせの、高いリスクを有する患者における、Ｂ細胞リンパ腫の治療に対する耐性の診断およびびまん性大細胞型Ｂ細胞（ＤＬＢＣＬ）リンパ腫の臨床的進行の予後における使用に関し、特に、Ａｐｒｉｌｙ−２およびＡＰＲＩＬのストーク（ｓｔａｌｋ）領域に対する１種の抗体の組み合わせの使用、および関連する診断方法およびこのような抗体を含有するキットに関する。さらに、本発明は、抗体を調製するために有用であるＡＰＲＩＬのストーク領域のアミノ酸配列に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、可溶性ＡＰＲＩＬに対して向けられたモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２、およびこのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に関する。
【０００７】
可溶性ＡＰＲＩＬに対して向けられたモノクローナル抗体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現により得られる組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）でマウスを免疫化することにより得られる。ハイブリドーマ細胞は、標準的な条件下で記載されるとおり調製される。可溶性ＡＰＲＩＬに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａｐｒｉｌｙ−２を産生するハイブリドーマ株細胞Ａｐｒｉｌｙ−２を８０μｇ／ｍｌの濃度で、パスツール研究所の国立培養微生物収集所（ＣＮＣＭ）、２５、Ｆ−７５７２４パリ（Ｐａｒｉｓ）ＣＥＤＥＸ１５、ドクトルルー通り（ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ）に、２００５年９月２３日に、番号ＣＮＣＭ Ｉ−３５００で寄託した。
【０００８】
モノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２は、分泌されたＡＰＲＩＬを局在化することが可能である。ストーク（Ｓｔａｌｋ）（ＧＴＧＧＰＳＱＮＧＥＧＹＰ、配列番号１）と呼ばれる定義されたＡＰＲＩＬ配列に対する二次抗体は、ＡＰＲＩＬをヒト組織のインビトロで産生する細胞の同定を高い信頼性で可能にする。この配列（配列番号１）もまた本発明の目的である。
【０００９】
これまで生成されたＡＰＲＩＬに対する抗体のいずれも、新たに合成されるＡＰＲＩＬが早期分裂してしまうので、ＡＰＲＩＬを産生する細胞を同定することができない。ＡＰＲＩＬ処理後の細胞と関連したままであるストークと呼ばれるＡＰＲＩＬの特定の断片のＡＰＲＩＬ産生細胞における安定性が重要である。実際、これが、ＡＰＲＩＬを産生する細胞において検出可能である主なＡＰＲＩＬ生成物である（図１ａ）。ヒトＡＰＲＩＬ（例えばポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１）の配列ＧＴＧＧＰＳＱＮＧＥＧＹＰ（配列番号１）に対して向けられたいずれの抗体もこの１５ｋＤａストーク断片を同定することが可能である。
【００１０】
このような抗体の組み合わせ、すなわちモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２およびストーク断片に対して向けられた任意の（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体では、ＡＰＲＩＬを容易に検出することが可能である。このような方法は、本発明のさらなる態様である。ＡＰＲＩＬは、ＤＬＢＣＬなどの高悪性度Ｂ細胞リンパ腫の約半分で強く発現されることが観察されている。他の半分は健常な組織と比していかなる発現上昇も示さなかった。強いＡＰＲＩＬ発現上昇を示すＤＬＢＣＬ病変において、詳細な分析により、ＡＰＲＩＬは主に浸潤性好中球により（まれに組織球により）産生され、その一方で分泌されたＡＰＲＩＬが腫瘍細胞に濃縮されることが明らかにされた。ＤＬＢＣＬ病変におけるＡＰＲＩＬの役割を、異なるレベルのＡＰＲＩＬ発現を有する患者の遡及試験で、インビボで試験した。腫瘤病変におけるＡＰＲＩＬの高発現と、臨床的リスクの高い患者における従来の治療に対する応答の欠如との間の強い相関関係がみられ、ヒトリンパ腫病原力（治療に対する耐性）におけるＡＰＲＩＬの役割を示していた。臨床的リスクの高い患者は、６０歳を超える患者および／または国際予後指標（ＩＰＩ）＞２を有する患者として定義される。国際予後指標（ＩＰＩ）は、リンパ腫病期をさらに明確にするために策定された。ＩＰＩは、ｉ）一般的健康状態（全身状態としても公知である）、ｉｉ）腫瘍侵襲の病期（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ病期分類）、ｉｉｉ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）という名の高血清酵素の存在または不存在（腫瘍サイズと相関する）、およびｉｖ）結節外部位の数などの４つの要素を考慮に入れて、疾病再発のリスクおよび全生存率を予測する。各病期は、１ポイントとして正のカウントがスコアされるとき；６０歳を超える年齢およびＩＰＩ＞２は、高いリスクの患者と関連している（ウィルダー，Ｒ．Ｂ．（Ｗｉｌｄｅｒ，Ｒ．Ｂ．）ら、「Ｃａｎｃｅｒ」、９４、３０８３〜３０８８ページ、２００２年）。
【００１１】
高悪性度Ｂ細胞リンパ腫におけるＡＰＲＩＬ発現上昇は腫瘍の治療に対する耐性を強化し、これが、臨床的リスクの高い患者についての治療失敗を説明する可能性が高い。記載の抗体、すなわちモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｉｙ−２と、ストークと呼ばれるＡＰＲＩＬ断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体との組み合わせは、患者腫瘍生検におけるＡＰＲＩＬ発現を評価する第１の好適なペアである。
【００１２】
上述の抗体ぺアは、疾病診断時に、現在の標準的な治療に対応できない重要なリスクを有する患者の免疫組織化学による容易な同定に有用である。このような早期の診断は、現在適用されているものより集中的な治療に適格である患者の認識を補助するであろう。費用の節約に追加して、このような早期の診断は、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、すなわちＢ細胞リンパ腫の高悪性形態の治療における成功率の向上を補助するであろう。本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の高悪性形態（治療に対する耐性）の診断方法に関し、ここで、Ｂ細胞リンパ腫生検標本が、モノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２の結合、およびＡＰＲＩＬのストーク断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の結合に対して分析され、２種の抗体が標本に結合している場合に高悪性形態と診断される。
【００１３】
腫瘍生検におけるＡＰＲＩＬ判定もまた、低悪性度リンパ腫、白血病および多発性骨髄腫などの他のＢ細胞腫瘍についての重要な予後値を有する。加えて、これは、癌腫およびメラノーマなどの固体腫瘍について有用である。
【００１４】
分泌された、メンブラン結合ＡＰＲＩＬを選択的に認識する抗体の同定
インサイチュＡＰＲＩＬ発現を試験するために、異なる特異性を有するＡＰＲＩＬ−特異的抗体が選択される。本発明のモノクローナル抗体、Ａｐｒｉｌｙ−２は、フューリン（ｆｕｒｉｎ）開裂に際して分泌されたＡＰＲＩＬのＣ−末端ＴＮＦ相同ドメインを認識する。ポリクローナルウサギ抗血清Ｓｔａｌｋ−１は、ＡＰＲＩＬ細胞外ドメインにおける膜−近位配列を認識する。本願明細書において以下ストークと呼ぶこのドメインは、フューリン開裂後も細胞膜に結合したままである。パラフィン中に固定および包理されたＡＰＲＩＬ−形質移入化細胞への選択的染色がこれらの抗体で得られ、免疫組織化学的使用についての特異性が示されている。
【００１５】
Ｓｔａｌｋ−１およびＡｐｒｉｌｙ−２は、免疫組織化学（ＩＨＣ）により陽性染色を生成する。結果が表１、２および３に集計されている。Ｓｔａｌｋ−１およびＡｐｒｉｌｙ−２により、腫瘍生検からの溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に検出されたタンパク質生成物を生化学的に特徴付けた。ウェスタンブロット分析は、Ａｐｒｉｌｙ−２が主な１８ｋＤａバンドを同定し、一方でＳｔａｌｋ−１はＩＨＣ陽性生検における１４ｋＤａバンドを検出することを示している（図１ａ）。このようなバンドはＩＨＣ陰性生検においては観察されなかった。Ａｐｒｉｌｙ−２により認識される１８ｋＤａバンドは、分泌されたＡＰＲＩＬのサイズと適合する。Ｓｔａｌｋ−１により認識される１４ｋＤａバンドは、開裂後のＡＰＲＩＬストーク領域の予想されたサイズと適合し、これはまた、ＤＣ溶解物における主たるバンドとして観察される（図１ａ、右パネル）。この後者の実験において、完全長ＡＰＲＩＬ（３２ｋＤａ）は著しくは検出されず、ＡＰＲＩＬのほとんどは合成後に急速に開裂され、分泌されることを示している。特異性が、競合実験において評価される。ウェスタンブロット分析前の、対応する抗体への可溶性ａｃｒｐＡＰＲｌＬまたはストークペプチドの追加は、１８ｋＤａおよび１４ｋＤａバンドの認識をそれぞれ無効にし（図１ｂ）、これらのタンパク質が関連するエピトープを発現していることを実証している。分析は開裂したＡＰＲＩＬのストークがＡＰＲＩＬ−産生細胞中に安定のままであることを示しており、Ｓｔａｌｋ−１を、ＡＰＲＩＬ−産生細胞を検出する役立つツールとしている。対照的に、Ａｐｒｉｌｙ−２は、分泌されたＡＰＲＩＬを検出する。
【００１６】
ＤＬＢＣＬ生検におけるＡＰＲＩＬの強い発現上昇
Ｓｔａｌｋ−１およびＡｐｒｉｌｙ−２を用いて、ＮＨＬおよび健常な扁桃腺対照のパラフィン包理化組織から調製した多発性腫瘍アレイを染色した。これらのうち、ＤＬＢＣＬ病変の５０％が、分泌されたＡＰＲＩＬ（Ａｐｒｉｌｙ−２染色）について強度に陽性であった。残りの症例は、細胞の局所的な染色のみを示した（表１）。対照的に、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、濾胞細胞（ＦＣＬ）、マントル細胞（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＧＺＬ）、ならびに結節性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）からの組織は局所的なＡｐｒｉｌｙ−２染色のみを有していた。扁桃腺などの非腫瘤性リンパ組織において、局所的なＡｐｒｉｌｙ−２染色が観察された。同一のＮＨＬアレイをＳｔａｌｋ−１で染色し、Ａｐｒｉｌｙ−２について陽性であった症例の９５％超がまた、Ｓｔａｌｋ−１で染色された（表１）。それ故、分泌されたＡＰＲＩＬの検出において、腫瘍病変におけるＡＰＲＩＬ−産生細胞の存在と相関する。総合すると、これは、ＡＰＲＩＬ発現は、ＤＬＢＣＬ病変の５０％において顕著に上昇したことを示す。
【００１７】
表１：ＡＰＲＩＬ発現は、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン様リンパ腫および多発性骨髄腫において強く上昇している
多発性Ｂ細胞リンパ腫アレイおよび健常な組織を、Ａｐｒｉｌｙ−２（２μｇ／ｍｌ）またはＳｔａｌｋ−１（５μｇ／ｍｌ）抗体で免疫染色した。強い染色（高）または局所的な（低／陰性）染色の複数の症例が示されている。
【００１８】
【表１】
【００１９】
ＡＰＲＩＬは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン様リンパ腫および多発性骨髄腫（表１）、さらに、いくつかの他の癌腫（表２）および皮膚癌（表３）において、発現上昇されている。
【００２０】
表２：ＡＰＲＩＬ発現は、種々の癌腫において強く上昇している
癌腫組織アレイおよび健常な組織を、Ａｐｒｉｌｙ−２（２μｇ／ｍｌ）またはＳｔａｌｋ−１（５μｇ／ｍｌ）抗体で免疫染色した。陽性染色（＋）が示されている。
【００２１】
【表２】
【００２２】
表３：ＡＰＲＩＬ発現は、種々の皮膚癌において強く上昇している
皮膚癌生検（基底細胞癌および転移性メラノーマ）および健常な組織を、Ａｐｒｉｌｙ−２（２μｇ／ｍｌ）またはＳｔａｌｋ−１（５μｇ／ｍｌ）抗体で免疫染色した。多数の陽性染色が、４種の基底細胞癌および８種の転移性メラノーマについて示されている。
【００２３】
【表３】
【００２４】
詳細な分析のために、Ａｐｒｉｌｙ−２およびＳｔａｌｋ−１染色を、ＤＬＢＣＬ病変からの切片全体で特徴付けた。Ａｐｒｉｌｙ−２は細胞を囲む斑状の染色を顕色化し、いくつかの細胞は腫瘍細胞に一致する形態学を有している。同様のパターンがまた、可溶性ＡＰＲＩＬ（Ａｐｒｉｌｙ−６およびＡｐｒｉｌｙ−８）に対する他の２種のモノクローナル抗体で観察された。対照的に、Ｓｔａｌｋ−１は、細胞染色を顕色化した。Ａｐｒｉｌｙ−２およびＳｔａｌｋ−１染色は、ａｃｒｐＡＰＲｌＬおよびストークペプチドと、それぞれ競合した。Ｓｔａｌｋ−１で染色された細胞は、いずれも腫瘍細胞に一致する形態学を有していなかった。ＤＬＢＣＬ患者の５０％における低または検出不可能なＡＰＲＩＬ発現は、Ｓｔａｌｋ−１およびＡｐｒｉｌｙ−２の両方についての全切片の染色で確認された。この実験は、腫瘤病変におけるＡＰＲＩＬのソースは腫瘍自体ではなく、むしろストローマであることを強く示唆している。一旦分泌されると、開裂したＡＰＲＩＬは、ＡＰＲＩＬ−産生細胞から解離するように考えられる。
【００２５】
腫瘍−浸潤性好中球はＡＰＲＩＬを産生する
ＡＰＲＩＬ−産生細胞をインサイチュで正確に同定した。Ｓｔａｌｋ−１での免疫ペルオキシダーゼ染色の高濃縮分析は、陽性細胞は、好中球の大きい特徴である三小葉核（ｔｒｉｌｏｂｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ）を有することを容易に示す。加えて、内皮の形態学を有する少数の陽性に標識化された細胞がまた、切片において観察される。好中球の同一性は、共に好中球についての一般的なマーカーである抗ＣＤ１５および抗エラスターゼでのＳｔａｌｋ−１染色を組み合わせることにより確認される。これらの切片において、ほとんどすべての抗ストーク陽性細胞はまた、好中球マーカーで染色される。ＡＰＲＩＬ産生好中球を病変中に局在化させた。Ｓｔａｌｋ−１染色をＣＤ２０染色と組み合わせ、Ｂ細胞リンパ腫マーカーとして用いた。ＡＰＲＩＬ−産生細胞は、腫瘍病巣に近接して位置されている。Ｓｔａｌｋ−１およびＣＤ２０染色の間に重複が見られないため、腫瘍細胞はＡＰＲＩＬを発現しない。併せると、これは、ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞により進入された組織を浸潤する好中球が、ＡＰＲＩＬの主な供給源であることを示している。
【００２６】
ＡＰＲＩＬを産生する好中球が炎症に必要とされる。
ＡＰＲＩＬ発現をさらに特徴付けるために、健常なボランティアからの好中球を試験した。健常なドナーから単離された末梢血好中球はＡＰＲＩＬ ｍＲＮＡを発現し、およびＳｔａｌｋ−１で染色される。対照的に、末梢好中球はＡｐｒｉｌｙ−２で染色されない。Ａｐｒｉｌｙ−２およびＳｔａｌｋ−１染色の間のこの矛盾は、完全長ＡＰＲＩＬで形質移入された２９３Ｔ細胞では観察されない。これは、形質移入された２９３Ｔ細胞とは対照的に、内在性の完全長または開裂ＡＰＲＩＬは好中球で検出されないことを裏付ける。非腫瘤の炎症組織を浸潤する好中球をまたテストした。好中球により高度に浸潤されるとして知られている急性虫垂炎は、Ｓｔａｌｋ−１で染色された大量の細胞を含有する。高倍率に濃縮すると、染色された細胞はＤＬＢＣＬ病変におけるＳｔａｌｋ−１陽性細胞と同一の形態学を有する。これは、成熟した循環好中球は恒常的にＡＰＲＩＬを発現し、およびＤＬＢＣＬ進行を含む炎症性反応におけるＡＰＲＩＬの産生は、漸増した好中球により保障されることを示している。
【００２７】
プロテオグリカンはＡＰＲＩＬの分泌を阻害する
ＡＰＲＩＬは細胞表面プロテオグリカンに相互作用することが既に示されている。プロテオグリカンへのＡＰＲＩＬの相互作用を、細胞を含まない（セルフリー）エライザ（ＥＬＩＳＡ）アッセイにおいて、捕獲のためにマウス肉腫由来の精製したヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を用い、および検出のためにＡｐｒｉｌｙ−９を用いて確認した。この場合、プロテオグリカン結合部位に欠く組み換え型ＡＰＲＩＬＨ９８ではない組み換え型ＡＰＲＩＬＡ８８が、被覆プロテオグリカンに結合する（図２ａ）。ｈｕＡＰＲＩＬと、マウスプロテオグリカンのヘパラン硫酸側鎖とのこの相互作用は、ＡＰＲＩＬは、何がタンパク質核であろうと、広い範囲のヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用しやすいことを示している。加えて、これは、他の細胞タンパク質のいずれも相互作用には必要とされないことを示す。プロテオグリカンの、ＡＰＲＩＬの分泌物への影響を評価した。プロテオグリカンを発現すると知られている２９３Ｔ細胞を、ＡＰＲＩＬＡ８８またはＡＰＲＩＬＨ９８をコードするプラスミドで形質移入した。図２ｂは、いくつかの２９３Ｔ−形質移入細胞が高レベルのＡＰＲＩＬＡ８８を保持し、一方で、ＡＰＲＩＬＨ９８では、僅かに中程度のレベルの細胞保持があったことを示す。細胞保持は、上澄中の分泌されたＡＰＲＩＬの定量化により確認される。ＡＰＲＩＬＨ９８で形質移入された２９３Ｔ細胞は、約２〜３μｇ／ｍｌの組み換え型タンパク質を分泌し、一方で、ＡＰＲＩＬＡ８８で達成された分泌物は十分の一であった（図２ｂ）。ＡＰＲＩＬを産生する好中球がプロテオグリカンを分泌するかをテストした。ＡＰＲＩＬＡ８８の細胞表面への結合がプロテオグリカン発現を評価する。図２ｃは、末梢好中球がＡＰＲＩＬに結合しないことを示す。対照的に、Ｌ３６３株細胞（シンデカン−１を発現する多発性骨髄腫細胞）はＡＰＲＩＬに結合し、この結合は、ヘパリンによって完全に阻害される。これは、末梢好中球は、ＡＰＲＩＬに結合することが可能である、検出可能ないずれのプロテオグリカンも欠いていることを示す。好中球によるＡＰＲＩＬ結合性プロテオグリカン発現の欠損は、ＡＰＲＩＬを分泌する完全な適格性を与える。
【００２８】
プロテオグリカンは、腫瘍病変におけるＤＬＢＣＬ細胞に近接して分泌されるＡＰＲＩＬを濃縮する
ＤＬＢＣＬ病変におけるプロテオグリカン発現を評価した。シンデカン−１は発現されない。対照的に、シンデカン−４の発現が分析した症例（ｎ＝６）の半分で観察される。分泌されたＡＰＲＩＬは、腫瘍病変におけるシンデカン−４発現部位に位置される。Ａｐｒｉｌｙ−２染色は、常に、シンデカン−４発現部位に完全な重複で位置され、ＡＰＲＩＬのシンデカン−４とのインサイチュでの密接な相互作用を強く示唆している。いくつかのシンデカン−４が遊離している事実は、ＡＰＲＩＬは飽和量で産生されていないこと、またはＡＰＲＩＬは腫瘍病変において消費され、一方でプロテオグリカンは消費されないことのいずれかを示している。シンデカン−４を発現する細胞を同定するために、ＣＤ２０およびシンデカン−４染色を組み合わせた。ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞は均質にシンデカン−４を発現する。シンデカン−４染色は、膜状のＣＤ２０染色と比して内環を構成し、おそらく、シンデカン−４の細胞内局在化を反映している。シンデカン−４発現はまた、腫瘍床の周囲の組織において観察され、いずれの腫瘍細胞に欠ける。Ａｐｒｉｌｙ−２染色をＣＤ２０染色と組み合わせた。分泌されたＡＰＲＩＬは、腫瘍に近接して濃縮され、いくつかは直接的に腫瘍細胞に結合し、およびいくつかは、非腫瘤性細胞に結合する。後者が、シンデカン−４を発現する非腫瘍細胞に最も相当する可能性がある。これらの細胞は、常に、主に腫瘍末梢に局在化され、腫瘍細胞により浸潤されていない組織切片からは存在していない。しかも、分泌されたＡＰＲＩＬは、腫瘍末梢で濃縮され、および腫瘍床の深部に存在していない。腫瘍細胞へのＡＰＲＩＬの結合は、高倍率の濃縮でＡｐｒｉｌｙ−２免疫ペルオキシダーゼ染色で確認することが可能である。総合すると、この分析は、ＡＰＲＩＬは、一旦好中球により分泌されると、腫瘍および組織プロテオグリカンに結合した腫瘍末梢で蓄積されることを示す。
【００２９】
ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞は、ＡＰＲＩＬについてのＢＣＭＡおよびプロテオグリカン共受容体を発現する
ＡＰＲＩＬ受容体発現を、ＤＬＢＣＬ病変において調べた。ホルムアルデヒド−固定化組織で内在性のＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを検出する抗体は、現在まで入手不可能である。従って、患者から樹立されたＤＬＢＬ株細胞を用いた。ＲＴ−ＰＣＲによるメッセンジャーＲＮＡ発現分析は、テストした株細胞のすべてでＢＣＭＡの発現を示し、一方で、ＳＵ−ＤＨＬ６の１種のみがＴＡＣＩ（図３ａ）を発現することを示す。このＲＴ−ＰＣＲ分析において、ＤＬＢＣＬ株細胞においてＡＰＲＩＬが発現しないことが確認される。抗ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡ ｍＡｂが用いられて、タンパク質発現が検出される。抗ＴＡＣＩ、およびＢＣＭＡ ｍＡｂの特異性は、形質移入化−２９３Ｔ細胞で確認される（図３ｂ）。ＴＡＣＩタンパク質発現はＳＵ−ＤＨＬ−６において検出され、一方で、ＯＣＩ−Ｌｙ７（図３ｃ）およびＳＵ−ＤＨＬ−４および−７においては見られない。抗ＴＡＣＩ１Ａ１ｍＡｂは、ＴＡＣＩの第２の富システインドメインに結合し、これらのＤＬＢＬ株細胞におけるＴＡＣＩタンパク質の不在を裏付ける。表面ＢＣＭＡの発現はＤＬＢＣＬでかろうじて検出可能であるが、細胞透過処理の後は顕著なＢＣＭＡ染色が常に見られる。ＡＰＲＩＬ結合を、プロテオグリカン−結合部位を含有するａｃｒｐＡＰＲｌＬで評価した。ａｃｒｐＡＰＲｌＬは、すべてのＤＬＢＣＬ株細胞に均質に結合する（図３ｃ）。しかしながら、ヘパリンでの阻害が評価されるとき、完全な阻害はＯＣＩ−Ｌｙ７で観察されるが、ＳＵ−ＤＨＬ６では阻害は見出されない。加えて、ＢＣＭＡ−ｌｇはＳＵ−ＤＨＬ６への結合を阻害するが、ＯＣＩ−Ｌｙ７への結合は阻害しない。これは、ＳＵ−ＤＨＬ６がＴＡＣＩをＡＰＲＩＬへの表面受容体としてプロテオグリカンなしで発現する一方で、ＯＣＩ−Ｌｙ７は表面プロテオグリカンをＴＡＣＩ無しで発現することを示す。ＢＣＭＡについて、発現は、ＤＬＢＣＬ系において、主な細胞内プールと共に均質に発現される。併せて、これは、ＤＬＢＣＬ系中のＡＰＲＩＬ−Ｒ発現における不均一性を示す。ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞の大部分はＢＣＭＡおよびプロテオグリカン共受容体を発現する。
【００３０】
ＤＬＢＣＬ患者の腫瘍病変における高ＡＰＲＩＬ発現は、生存率比の低下に関連している。
ＤＬＢＣＬにおけるＡＰＲＩＬの役割を、生検サンプルにおけるＡＰＲＩＬ発現について分析した２３３人の患者の遡及的な臨床的分析により評価した。データを入手してから、疾病病期、循環ＬＤＨのレベル、インサイチュ増殖指数、ＤＬＢＣＬタイプおよび年齢を先ず判定した。「高ＡＰＲＩＬ発現」および「低ＡＰＲＩＬ発現」の間に、病期、ＬＤＨレベル、腫瘍増殖指数、および年齢の観点で顕著な差異はなかった。加えて、ＡＰＲＩＬ発現の低および高レベルが胚中心および活性化された２種のＤＬＢＣＬサブタイプにおいて観察され、診断時での、ＡＰＲＩＬ発現のレベルと、および標準的な臨床的パラメータとの間の明白な相関がないことを示していた。ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロン）治療後の生存率比および再発までの時間を次いで分析した。ＡＰＲＩＬ発現について分析した２３３人の患者から、１００人が追跡可能な臨床的データを有していた。興味深いことに、高いリスクの患者（＞６０歳およびＩＰＩ＞２）については、治療への応答の不在により計測した生存率において非常に大きい低減（ｐ＝０．０００９）が「高ＡＰＲＩＬ発現体」群において見られた（図４ｂ）。しかも、患者の同一の固体群（＞６０歳／ＩＰＩ＞２および高ＡＰＲＩＬ）について、疾病を有さない期間は、ＡＰＲＩＬ低固体群（ｐ＝０．０２）についてのものよりはるかに短かった（図４ｂ）。これらの所見は、ＡＰＲＩＬは腫瘍を促進する役割をＤＬＢＣＬにおいて有することを強く示唆している。
【００３１】
実験結果の考察
ＡＰＲＩＬ発現上昇が、ＤＬＢＣＬ症例の約５０％で見られる。陽性サンプルにおけるＡＰＲＩＬの主なソースは好中球である。腫瘍細胞によるＡＰＲＩＬ発現についてのエビデンスは見出されなかった。腫瘍細胞によるＡＰＲＩＬ産生は、もし生じていても、腫瘍−浸潤性好中球と比して、インサイチュできわめて低い。ＤＬＢＣＬ細胞によるＡＰＲＩＬの低産生は、ＡＰＲＩＬが外因的に追加されたときのこれらのＤＬＢＣＬ株細胞で観察された生存率効果をきわめてよく説明することが可能であるため、株細胞で得られた結果と矛盾するものではない。腫瘍−浸潤性好中球によるＡＰＲＩＬのインサイチュ発現は、骨髄系列の細胞に限定されたインビトロ発現と一貫する。しかしながら、これは、ＡＰＲＩＬが好中球によって選択的にインサイチュで産生され、およびＤＬＢＣＬを浸潤する単球／マクロファージなどの骨髄系列の他の細胞によっては産生されないことを示す。Ｂ細胞リンパ腫におけるＡＰＲＩＬのこの宿主由来産生は、このようなリンパ腫は、低悪性度リンパ腫として分類される他のＢ細胞リンパ腫／白血病（ＭＡＬＴ、ＣＬＬ、ＦＣＬ、ＭＣＬ、ＭＧＺＬ）と比して、高悪性度の、より明白な宿主細胞浸潤で進行すると分類されるため、ＤＬＢＣＬ病変における選択的発現上昇を説明すると考えられる。これらの後者のＢ細胞腫瘍において、ＡＰＲＩＬ発現レベルは、浸潤された非腫瘍性浸潤化扁桃腺において見出されるものに匹敵する。
【００３２】
分泌されたＡＰＲＩＬが、腫瘍細胞に結合していることを見出した。この局在化は、ＡＰＲＩＬに結合するＨＳＰＧによって補償された。場合により、腫瘍発現ＨＳＰＧをシンデカン−４として同定した。他のＤＬＢＣＬ症例において、シンデカン−４は発現されなかったが、観察したＡｐｒｉｌｙ−２染色は、他のＨＳＰＧとの関連を示している特徴的な終点と同等であった。断続的なＡＰＲＩＬ／ＨＳＰＧ染色は、リガンド結合で誘起されるプロテオグリカンクラスター形成をきわめて反映しやすい。腫瘍細胞によって浸潤された組織において、プロテオグリカンは、受容体発現腫瘍細胞に近接する浸潤性好中球により分泌されたこのリガンドを濃縮するために役立つ。このプロセスの効率を最大化するために、ＡＰＲＩＬ産生好中球はプロテオグリカンを含まない。プロテオグリカン共受容体官能性は、腫瘍細胞発現プロテオグリカンによりシスで、および腫瘍周囲の細胞に発現されたプロテオグリカンによりトランスで媒介できることが可能である。
【００３３】
Ｂ細胞におけるＡＰＲＩＬ同時刺激は、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、または両方の誘発により実施されることが可能である。ＴＡＣＩは、ＤＬＢＣＬ腫瘤の細胞で一定に発現されない。ＢＣＭＡは、テストされたＤＬＢＣＬ株細胞において均一に発現される。均一なＢＣＭＡ発現は、ＢＣＭＡがＡＰＲＩＬ共刺激性シグナルの伝達に役立つことを強く示唆している。ＢＣＭＡ染色は、無処置ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞では低いが、透過処理後では著しく増強され、ゴルジ装置に位置されたＢＣＭＡの細胞内プールの存在下では一定である。ＢＣＭＡに追加して、ＤＬＢＣＬ腫瘤の細胞はＡＰＲＩＬに結合するプロテオグリカンを発現する。低レベルのＢＣＭＡ発現は、ＡＰＲＩＬを細胞表面で濃縮するプロテオグリカンなどの共受容体についての依存性を示し得る。
【００３４】
Ｂ細胞腫瘍中のＡＰＲＩＬなどの高濃度のＢ細胞共刺激性分子は、腫瘍進行および病原力の増強を助力する連続的な生存率／増殖性シグナルをもたらす。低リスクの患者（＞６０歳およびＩＰＩ＜２）については、化学療法およびリツキシマブを組み合わせる治療で達成される現在の効力では、ＡＰＲＩＬについての役割の検出は明らかに不可能である。しかしながら、このような治療に対する応答に劣ると知られている高いリスクの患者（＞６０歳およびＩＰＩ＞２）については、腫瘍病変における高ＡＰＲＩＬ発現は、強く低減された生存率比と関連している。診断後のＤＬＢＣＬ株細胞および患者進化はＡＰＲＩＬに依存しているという事実は、腫瘍形成プロセスにおけるこの分子についての後形質転換の役割を示唆している。高いリスクの患者において、ＡＰＲＩＬは、従って、治療強度の調整における役立つ予後ツールであり、この群の患者におけるＡＰＲＩＬの高発現を伴う被験者に対する役立つ治療的な目標を表す。
【００３５】
Ｂ細胞リンパ腫の臨床的進行の予後
本願明細書中において上記に説明した実験の結果に基づいて、可溶性ＡＰＲＩＬ（病変において分泌されたＡＰＲＩＬの定量化）に対するモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２と、ＡＰＲＩＬを産生する細胞を同定する、メンブランに固着されたＡＰＲＩＬのストーク断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体と（配列番号１）の組み合わせが、Ｂ細胞リンパ腫病原力（治療に対する耐性）の診断において有用である。Ａｐｒｉｌｙ−２と、Ｓｔａｌｋ−１と呼ばれる、メンブランに固着されたＡＰＲＩＬに対するポリクローナル抗体との組み合わせの使用が特に好ましい。
【００３６】
特に、前述の抗体の組み合わせは、Ｂ細胞リンパ腫の病原力の予後診断するために、および可能性のある臨床的予後を予想するために用いられ得る。このような予後は、対応する治療的処置の考察に役立つ。高いリスクの患者（ＩＰＩ＞２）におけるＢ細胞リンパ腫の予後におけるこのような方法が特に有用である。
【００３７】
Ｂ細胞リンパ腫の診断における有用なキット。
本発明は、さらに、モノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２およびメンブランに固着されたＡＰＲＩＬのストーク断片、例えばＳｔａｌｋ−１に対する１種のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含むキットに関する。キットは、他のＢ細胞リンパ腫バイオマーカーに向けられた抗体をさらに含有し得、さらに、標準的な器具、溶液および診断上のテストを実施するため使用説明書、ＡＰＲＩＬまたはＡＰＲＩＬ断片および基準としての対照ペプチド等を含有し得る。ポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１およびモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２を含む対応するキットが好ましい。
【実施例】
【００３８】
実施例
抗原調製
組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）を細菌中で産生した。ＡＰＲＩＬ発現ベクターで形質転換した細胞を、８ｍｌのＬブロス（ＬＢ）とＡＫ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ＋カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）との中に播種し、一晩、３７℃で増殖させた。８ｍｌの一晩培養物は４００ｍｌのＬＢ＋ＡＫ中に希釈され、３７℃で増殖される。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が０．５ｍＭの最終濃度で添加され、および細胞が３７℃で６時間増殖される。細菌が回収され、ペレットがリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁され、およびフレンチプレス中に溶解される。細胞溶解物が２ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に移され、１３０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離される。組み換え型ヒトＡＰＲＩＬを封入体中に含有するペレットが、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）サンプル緩衝剤中に再懸濁され、超音波処理され、還元され、およびＳＤＳゲル上に充填される。組み換え型ヒトＡＰＲＩＬに対応するバンドが、電気泳動で溶出される（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）。
【００３９】
免疫化
３匹のマウスに、各々ＰＢＳおよびフロイント完全アジュバント中に希釈した１５０μｇの組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）を注射した。１４日後、マウスをフロイント完全アジュバント中の同量の抗原で追加免疫した。２８日後、マウスを組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）に対するこれらの免疫応答を評価するために出血させ、エライザ（ＥＬＩＳＡ）を、異なる希釈度の血清で実施した。陽性の血清を有するマウスを、４５日後に、ＰＢＳ中の組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）で再度追加免疫した。３日後、脾臓を回収した。
【００４０】
細胞融合、スクリーニングおよびサブクローニング
脾臓を、無菌ガラス−ガラスホモジナイザーにおいて、１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中にホウケイ酸乳棒を用いて６〜８回のストロークで均質化した。懸濁液を、５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブに移し、細胞を３００×ｇで、１０分間、室温で遠心沈殿した。細胞を、１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁させ、形質細胞を計数した。１０〜２０×１０７個の脾臓細胞および１０〜２０×１０６個の骨髄腫細胞クローン（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８またはＮＳＩ）（比１０／１）を融合のために混合し、およびスピンさせた。０．５ｍｌの予熱したＰＥＧ１５００を、ペレットに管壁を伝わせて滴下させ、およびチューブを、各分で穏やかに攪拌しながら、３分間、３７℃で維持した。５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（３７℃で予熱した）を、管壁を伝わせて１０分間（０．５ｍｌ／分）かけて添加し、続いて、１分間、３７℃でインキュベートした。５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地を、再度、５〜６分間かけて添加した。細胞を１０分間、３００×ｇで、室温で遠心分離することによりペレット化し、６ｍｌの完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁させ、１時間、３７℃で、ＣＯ２インキュベータ中にインキュベートした。細胞融合懸濁液を、６×９６−ウェルプレート中のマウスマクロファージ（支持細胞層）上に穏やかに塗布した（１００μｌ／ウェル）。融合の２４時間後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン）を含有する選択培地（ＲＰＭＩ−１６４０）を細胞に添加した。９６−ウェルプレートからの上澄を、エライザ（ＥＬＩＳＡ）により抗体分泌物についてテストした。エライザ（ＥＬＩＳＡ）による集密的な、陽性クローンを、細胞をマクロファージ支持細胞層と１×ＨＡＴとを含有する２４−ウェルプレートに移すことにより増幅した。陽性クローンを、限界希釈により２回サブクローン化に供し、エライザ（ＥＬＩＳＡ）により抗体分泌物についてスクリーンした。エライザ（ＥＬＩＳＡ）による集密的な、陽性サブクローンを、細胞をマクロファージ支持細胞層と１×ＨＡＴとを含有する２４−ウェルプレートに移すことにより増幅した。最終的なサブクローンを、マクロファージおよびＨＡＴ補充無しで徐々に培地に順応させた。最後に、順応したときに、最終ハイブリドーマを樹立した。
【００４１】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生および精製
ハイブリドーマ細胞は、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中に増幅され、無菌ＰＢＳで２回洗浄され、および１０００００細胞／ｍｌでＯｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ血清を含まない培地（スイス、バーゼルのギブコＢＲＬライフテクノロジー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に再懸濁される。Ｔ１７５フラスコまたはローラボトルが、それぞれ、１００ｍｌおよび８００ｍｌ細胞懸濁液で播種される。細胞は、１０〜１４日間増殖される。上澄がろ過され、および４℃または−２０℃で、アジ化ナトリウムと共にまたはなしで保存される。精製はジャンボセップ（Ｊｕｍｂｏｓｅｐ）（商標）（米国ニューヨーク州イーストヒルの、ポール社（ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ，ＵＳＡ））システムを用いて行われる。ハイブリドーマ上澄が無菌ＰＢＳで広範に洗浄され、スピンカラムを用いて濃縮される。
【００４２】
細胞および試薬
ＲＰＭＩ、１０％プールヒト血清（米国ミズーリ州セントルイスのシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））中で増殖したＯＣＩ−Ｌｙ７を除き、すべての株細胞をＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ中で増殖させた。患者から樹立したＤＬＢＣＬ株細胞ＳＵ−ＤＨＬ４、ＳＵ−ＤＨＬ６、ＳＵ−ＤＨＬ７およびＯＣＩ−Ｌｙ７は、Ａ．ビストナー博士（Ｄｒ Ａ．Ｗｉｅｓｔｎｅｒ）（米国メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ））により提供された。Ｌ３６３は、ＭＭ患者から樹立された株細胞であり、トーマスマッテス博士（Ｄｒ Ｔｈｏｍａｓ Ｍａｔｔｈｅｓ）（スイスジュネーブ（Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））により提供された。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ中で増殖させた。樹状細胞を、記述のとおり、ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−４で処理した末梢単球から得た（ユアール，Ｂ．（Ｈｕａｒｄ，Ｂ．）ら、「Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ」１６、４６７〜７５ページ、２００４年）。多形核細胞（ＰＭＮ）および末梢血白血球（ＰＢＬ）を健常なドナーから単離した。血液を、クエン酸ナトリウム（３．８％）から回収した。赤血球を、ＰＢＳデキストランＴ５００（スイスオッテルフィンゲンのアマシャムバイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））での沈降により除去した。浮いている細胞を、遠心分離によりフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（アマシャムバイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））の層上に分離した。ペレット化した細胞は９５％を超えるＣＤ１５＋細胞を含有するＰＭＮであった。浮いている細胞はＰＢＬであった。ＰＭＮの活性化を防ぐために、すべての分離ステップは４℃で、５μｇ／ｍｌポリミキシンＢの存在下に実施した。ヘパリン（リケミン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ）、５０００ｉ．ｕ．／ｍｌ）はロシュファーマ（Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ）（スイスライナッハ（Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））製であった。以下の抗体、抗ＴＡＣＩ（クローン１Ａ１）、抗ＢＣＭＡ（クローンＶｉｃｋｙ１、ラットｌｇＧ２ａ）、ＡＰＲＩＬの細胞外部分（８８〜２３３）に対するマウス中に形成される抗ＡＰＲＩＬ（クローンＡｐｒｉｌｙ−１、−５、および−８、すべてのｌｇＧ１）、およびＳｔａｌｋ−１とも呼ばれるポリクローナル抗体ＥＤ（ＡＰＲＩＬペプチドＧＴＧＧＰＳＱＮＧＥＧＹＰに対するウサギポリクローナル抗体、配列番号１）は、アポーテック社（Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）（スイスエパリンゲス（Ｅｐａｌｉｎｇｅｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））から入手した。ＡＣＲＰ３０（１６〜１０８）に融合された組み換え型ＡＰＲＩＬ（８８〜２３３）、本願明細書中以下ａｃｒｐＡＰＲｌＬと呼ぶＭｅｇａＡＰＲＩＬおよびその対照、本願明細書中以下ａｃｒｐＣＴＲＬと呼ぶ無頭ＡＣＲＰ３０、およびＢＣＭＡ（２−５４）−ｌｇもまた、アポーテック（Ａｐｏｔｅｃｈ）製であった。ウサギ血清抗シンデカン１、抗シンデカン４は、サンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（米国カリフォルニア州サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ））製であった。抗ＣＤ１５（クローンＣ３Ｄ−１、ｌｇＭ）、抗エラスターゼ（クローンＮＰ５７、ｌｇＧ１）、および抗ＣＤ２０（クローンＬ２６、ｌｇＧ２ａ）は、ダコ（ＤＡＫＯ）（スイスザグ（Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））製であった。
【００４３】
発現構築物および産生
Ｆｌａｇ−リガンドに対する発現ベクターは既に記載されている（ホラー，Ｎ．（Ｈｏｌｌｅｒ，Ｎ．）ら、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」２３、１４２８〜４０ページ、２００３年）。ＨｕＡＰＲＩＬＡ８８（８８−２３３）、ｈｕＡＰＲＩＬＨ９８（９８−２３３）は、２９３Ｔ細胞中に、Ｏｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ血清を含まない培地で産生した（スイスバーゼルのギブコＢＲＬライフテクノロジー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））。上澄を、セントリコン遠心フィルタデバイス（カットオフ１０ｋＤａ）（米国マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ））で、使用前に１０倍に濃縮した。Ｏｐｔｉ ＭＥＭ上澄中のリガンド濃度を、検出抗体としてのＡｐｒｉｌｙ−１および標準として精製したａｃｒｐＡＰＲｌＬでのウェスタンブロット分析により定量化した。
【００４４】
フローサイトメトリ
抗体染色について、細胞をＰＢＳ中に洗浄し、３０分間、４℃で、一次抗体と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、セカンダリアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８−接合ヤギ抗マウス血清（米国オレゴン州のユージーンのモレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ））と共に、さらに３０分間、４℃でインキュベートした。ファクスキャン（ＦＡＣＳＣＡＮ）およびセルクエスト（Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ）（米国カリフォルニア州サンノゼのベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））を用いて、分析前に細胞をＰＢＳ中で１回洗浄した。リガンド染色を、抗Ｆｌａｇ、５μｇ／ｍｌ（ｌｇＧ１、クローンＭ２、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を二次試薬として用いたこと以外は同様に実施し、染色を、フィコエリトリン−接合ヤギ−抗マウスｌｇＧ１（米国ペンシルベニア州ウェストグローブのジャックソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ））での追加のステップで顕色化した。全染色のために、既に記載されているとおり、細胞を、ＰＢＳ、１％ホルムアルデヒド、１％サポニンで固定／透過処理した（ユアール，Ｂ．（Ｈｕａｒｄ，Ｂ．）およびカールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｌ．）、「Ｎａｔｕｒｅ」４０３、３２５〜８ページ、２０００年）。
【００４５】
エライザ（ＥＬＩＳＡ）
ＡＰＲｌＬ／プロテオグリカン相互作用について、マイクロプレートを、一晩、４℃で、１μｇ／ｍｌの精製ヘパラン硫酸プロテオグリカン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））でコートした。プレートを、ＰＢＳ、０．０５％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５％スクロースで、１時間、室温（ＲＴ）でブロックし、ＰＢＳ中に希釈した可溶性ＡＰＲＩＬ、ＢＳＡ０．１％と共に、４時間、ＲＴでインキュベートした。検出はＡｐｒｉｌｙ−９（１μｇ／ｍｌ）で行い、続いて、西洋ワサビペルオキダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗マウスｌｇＧ血清（ジャックソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））により行った。テトラメチルベンジジン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をＨＲＰの基質として用いた。ＰＢＳ、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０での２回の洗浄を各ステップの間に実施した。細胞上澄中のＡＰＲＩＬの定量化のために、マイクロプレートを、一晩、４℃で、１μｇ／ｍｌのＢＣＭＡ−ｌｇでコートした。プレートを、上述のとおり、細胞上澄での２時間のインキュベーションの前にブロックした。標準はａｃｒｐＡＰＲｌＬ（アポーテック（Ａｐｏｔｅｃｈ））であった。検出をＡｐｒｉｌｙ−５（１μｇ／ｍｌ）で実施し、洗浄および顕色化を上記のとおり実施した。
【００４６】
遺伝子発現分析：
細胞からＴＲＩｚｏｌ試薬（スイスバーゼルのギブコＢＲＬライフテクノロジー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を用いて調製した全ＲＮＡ（２５ｎｇ）を、１ステップＲＴ−ＰＣＲキット（スイスのキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製の１ステップＲＴ−ＰＣＲキット）を用いて逆転写し、および増幅した。この試験で用いたすべてのプライマーはゲノムＤＮＡ上のイントロン配列にかかっていた。ｈＴＡＣＩについては５’−ｃｔｇｇｇｔａｃｃｔｇｃａｔｇｔｃｃｔｇ−３’（配列番号２）および５’−ａｇａｃｔｔｇｇｃｃｇｇａｃｔｔｔｇａｃ−３’（配列番号３）を、ｈＢＣＭＡについては５’−ｇｇｇｃａｇｔｇｃｔｃｃｃａａａａｔ−３’（配列番号４）および５’−ｔｃｇｔｔｔｔｃｇｔｇｇｔｇａｃａａｇａ−３’（配列番号５）を、およびｈＡＰＲＩＬについては５’−ａｔｇｃｃａｇｃｃｔｃａｔｃｔｃｃｔｔｔ−３’（配列番号６）および５’−ｔｃｃｔｇｇａｔｔｃｇｇａｃａｃｃａｔａ−３’（配列番号７）を、それぞれ、前および逆方向プライマーとして用いた。対照作用プライマーは前方５’−ｔｔａａｃｇａｇａａｇｃｔｇｔｇｃｔａｃｇｔｃ−３’（配列番号８）および逆５’−ａｔａｇｔｃｃｔｇｃｔｔｇｃｔｔｇｃｔｇａｔｃｃａｃ−３’（配列番号９）であった。変性を９４℃で１分間、アニーリングを５５℃で１分間、および伸長を７２℃で１分間実施し、４０サイクルを非定量的試験について適用した。増幅したｍＲＮＡを、アガロースゲル上に可視化し、臭化エチジウム染色した。単位複製配列特異性を、各プライマーぺアについて３種の選択した酵素で制限分析により確認した。
【００４７】
免疫組織化学
生検試料を、改訂欧州米国リンパ腫（ＲＥＡＬ）分類に準拠して分類した。組織マイクロアレイを、（コノネン，Ｊ．（Ｋｏｎｏｎｅｎ，Ｊ．）ら、「Ｎａｔ Ｍｅｄ」４、８４４〜７ページ、１９９８年）に既に記載のとおり構成した。パラフィン−包理化ブロック（ドナーブロック）で形態学的に典型的な領域を注意して選択した後、１．６ｍｍのコア組織生検をパンチ採取し、第２のパラフィン−包理化ブロック（収納ブロック）に移した。腫瘍不均一性および組織損失を克服するために、各腫瘍の異なる領域から３つのコア生検を実施した。脱パラフィンの後、切片を１０分間、メタノールと０．６％過酸化水素との中で、ＲＴでインキュベートし、続いてＰＢＳ溶液で洗浄した。スライドを０．０１Ｍクエン酸緩衝剤ｐＨ６．０中で、３分間煮沸した。抗体でのインキュベーションを１時間かけてＲＴで行った。免疫ペルオキシダーゼ染色については、第２の試薬は、ＨＲＰに接合したヤギｌｇ抗ウサギまたは抗マウスｌｇＧ（ジャックソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））であり、続いて、ストレプトＡＢコンプレックス（ｓｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘ）／ＨＲＰ（ダコ（Ｄａｋｏ））および３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ））であった。２色免疫蛍光染色については、ＦＩＴＣまたはフィコエリトリンに接合したアイソタイプ−特異的ヤギ抗マウス血清（ジャックソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））およびアレクサ（Ａｌｅｘａ）−４８８に接合したヤギｌｇ抗ウサギｌｇＧ（オランダレイデンのモレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いた。イメージを、光または蛍光顕微鏡下にアクシオフォト（Ａｘｉｏｐｈｏｔ）１（独国オベルコーエンのカールザイス社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））で可視化し、アクシオカム（ａｘｉｏｃａｍ）（カールザイス社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ））カラーＣＣＤカメラで撮影し、およびアクシオビジョン（ａｘｉｏＶｉｓｉｏｎ）（商標）ソフトウェア（カールザイス社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ））がインストールされたペンティアムＩＩＩ（Ｐｅｎｔｉｕｍ Ｉｌｌ）コンピュータで処理した。細胞染色について、細胞をマウスの腸管に注入した。注入された腸管をパラフィン中に固定および包理した。得られたブロックを、次いで、免疫染色のために基準組織として処理した。
【００４８】
患者経過観察および統計学的分析
ＤＬＢＣＬと診断されたすべての患者を見て、それらの標本をジュネーブ大学病院（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびバーゼル大学病院（Ｂａｓｅｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で採取した。これらの患者からの臨床的データの、遡及研究を実施した。プロジェクトは、ジュネーブ大学病院倫理委員会（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によってレビューされ承認された。病期、乳酸塩脱水素酵素レベル、ＤＬＢＣＬサブタイプおよび年齢は、チャートレビューにより得た。生検の日のインサイチュＡＰＲＩＬ発現は上記のとおり記録した。生存率は、生検の日からリンパ腫による死亡の日までで計測した。共羅患率が患者の除外をもたらした。最後の経過観察日に生存していた患者については評価を打ち切った（曲線上のチェックマーク）。カプランマイヤー全生存率曲線を、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（グラフパッドソフトウェア社（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗｅａｒ ｉｎｃ．）で実施した。群間での比較は対数ランク統計学的テストに基づいていた。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
図面の簡単な説明
【図１】分泌されたＡＰＲＩＬおよびＡＰＲＩＬを産生する細胞を同定する抗ＡＰＲＩＬ抗体の特徴付け（ａ）ＩＨＣ−陽性および陰性ＤＬＢＣＬ組織サンプルからの抽出物（２０μｇ）を、Ａｐｒｉｌｙ−２（２μｇ／ｍｌ）およびＳｔａｌｋ−１（５μｇ／ｍｌ）でウェスタンブロット法により分析した。分泌されたＡＰＲＩＬに関連する１８ｋＤａのバンドがＡｐｒｉｌｙ−２で明らかにされ（左パネル）、一方で、Ｓｔａｌｋ−１が１４ｋＤａのバンドを同定する（中央パネル）。同様の１４ｋＤａ反応性を、Ｓｔａｌｋ−１でＤＣ溶解物（２０μｇ）上に観察した（右パネル）。反応性は、３つのＩＨＣ−陽性および２つのＩＨＣ−陰性腫瘍溶解物を表す。（ｂ）ウェスタンブロット特異性を阻止実験で確認した。Ａｐｒｉｌｙ−２を、１０μｇ／ｍｌのａｃｒｐＡＰＲｌＬ（ＡＣＲＰ３０［１６−１０８］に融合したＡＰＲＩＬ［８８−２３３］）またはａｃｒｐＣＴＲＬでプレインキュベートした。Ｓｔａｌｋ−１を、ウェスタンブロット分析の前に、１０μｇ／ｍｌのストークペプチドまたは無関係のペプチドとプレインキュベートした。
【図２】細胞プロテオグリカンがＡＰＲＩＬ分泌を阻害する（ａ）マウス肉腫（１μｇ／ｍｌ）からの被覆ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）への三量体ＡＰＲＩＬＡ８８およびＡＰＲＩＬＨ９８の結合を、エライザ（ＥＬＩＳＡ）においてＡｐｒｉｌｙ−９（１μｇ／ｍｌ）で明らかにした。（ｂ）２９３Ｔ細胞を、ＡＰＲＩＬＡ８８またはＡＰＲＩＬＨ９８をコードするプラスミドで形質移入した。３日後に細胞を回収し、固定／透過処理し、およびＡｐｒｉｌｙ−１で染色した。蛍光をフローサイトメトリにより分析した。上澄を回収し、サンドイッチエライザ（ＥＬＩＳＡ）において、捕獲としてＢＣＭＡ−ｌｇで定量化し、および検出としてＡｐｒｉｌｙ−５で定量化した。（ｃ）ａｃｒｐＡＰＲＩＬＡ８８の結合を健常なドナーから単離したＰＭＮで評価し、フローサイトメトリにより分析した。Ａｃｒｐ３０を陰性対照（ＣＴＲＬ）として用いた。ａｃｒｐＡＰＲｌＬＡ８８の、ヘパリン［Ｈ］（１／１００）の存在下または非存在下でのＬ３６３への結合が陽性対照として示される。Ａｐｒｉｌｙ−１、Ａｐｒｉｌｙ−５およびＡｐｒｉｌｙ−９は、Ａｐｒｉｌｙ−２に関連する可溶性ＡＰＲＩＬに対するモノクローナル抗体である。
【図３】ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞は、ＢＣＭＡおよびプロテオグリカン共受容体を発現する（ａ）ＤＬＢＣＬ系におけるＴＡＣＩ、ＢＣＭＡおよびＡＰＲＩＬｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した（４０サイクル）。陽性対照（＋）は、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡについては末梢ＣＤ１９＋Ｂ細胞であり、ＡＰＲＩＬについてはＤＣであった。Ｈ２Ｏを陰性対照として用いた。（ｂ）抗ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）の特異性が、形質移入された２９３Ｔ細胞で示されている。（ｃ）ＤＬＢＣＬ系でのＡＰＲＩＬ−Ｒ発現のフローサイトメトリ分析を、示した試薬で実施した。無処置細胞での表面発現が示されている。ＢＣＭＡについては、細胞透過処理後の総発現もまた示されている。対照染色（ｌｇＧ１アイソタイプ対照）が点線で示されている。 ａｃｒｐＡＰＲｌＬの結合で得られたデータが太線で示され、およびヘパリン［Ｈ］（１／１００）またはＢＣＭＡ−ｌｇ（５０μｇ／ｍｌ）（細線）でプレインキュベートされた場合に細線で示される。対照染色（ａｃｒｐＣＴＲＬ）は点線で示されている。ＳＵ−ＤＨＬ−４および−７が、ＯＣＩ−Ｌｙ７への同等の染色を有していた。
【図４】ＤＬＢＣＬ患者における高ＡＰＲＩＬ発現は、生存率の低下と関連しているＡＰＲＩＬ発現に応じて層別化した患者において生存率を遡及的に調べた。（ａ）すべての患者。点線：低ＡＰＲＩＬ、普通線：高ＡＰＲＩＬ。Ｓ＝全生存率、月（ｍ）での時間（Ｔ）。（ｂ）＞６０歳およびＩＰＩ＞２の高いリスクの患者。点線：低ＡＰＲＩＬ、普通線：高ＡＰＲＩＬ。Ｓ＝全生存率、ＤｆＳ＝無病生存率、月（ｍ）での時間（Ｔ）。
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＡＰＲＩＬ（ＴＡＬＬ−２としても公知である）に対して向けられた抗体と、ＡＰＲＩＬに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞と、高いリスクを有する患者の、Ｂ細胞リンパ腫病原力の診断およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の臨床的進行の予後におけるこのような抗体の使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＡＰＲＩＬ（ＴＡＬＬ−２としても公知である増殖誘導ＴＮＦリガンド）およびＢＡＦＦ（ＢＬｙｓ、ＴＡＬＬ−１としても公知である）は、密接に関連したＴＮＦスーパーファミリーのリガンドである。これらは、ＢＣＭＡおよびＴＡＣＩの２種の受容体を共有するが、ＢＡＦＦは、第３の受容体ＢＡＦＦ−Ｒ（ＢＲ３としても公知である）に結合している（カールド，Ｓ．Ｌ．（Ｋａｌｌｅｄ，Ｓ．Ｌ．）、アンブロース，Ｃ．（Ａｍｂｒｏｓｅ，Ｃ．）およびシュー，Ｙ．Ｍ．（Ｈｓｕ，Ｙ．Ｍ．）、「Ｃｕｒｒ Ｄｉｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ」８、２０６〜４２ページ、２００５年）。ＢＡＦＦ−Ｒ、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡは、体液性免疫応答におけるこれらの２種のＴＮＦ−リガンドの役割に従って主にＢ細胞で発現される。ＢＡＦＦ／ＢＡＦＦ−Ｒ経路は、末梢Ｂ細胞の成熟に重要であり、およびＢ細胞に同時刺激を与えると共にｌｇスイッチを誘導することにより体液性応答にも関与する。ＡＰＲＩＬはＢ細胞の発達には明らかな役割を有していないが、ＢＡＦＦと同様に、体液性応答に関与している（カスティギリ，Ｅ．（Ｃａｓｔｉｇｌｉ，Ｅ．）ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」１０１、３９０３〜８ページ、２００４年）。ＢＡＦＦ／ＡＰＲＩＬ経路の調節不全は、数々の自己免疫疾患に付随している（マッケイＦ．（Ｍａｃｋａｙ，Ｆ．）、シエッロ，Ｆ．（Ｓｉｅｒｒｏ，Ｆ．）、グレイ，Ｓ．Ｔ．（Ｇｒｅｙ，Ｓ．Ｔ．）およびゴードン，Ｔ．Ｐ．（Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔ．Ｐ．）、「Ｃｕｒｒ Ｄｉｒ Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ」８、２４３〜６５ページ、２００５年）。
【０００３】
自己免疫性病理学における役割に追加して、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦは、腫瘍の発達に関係している（マッケイＦ．（Ｍａｃｋａｙ，Ｆ．）およびタンギーＳ．Ｇ．（Ｔａｎｇｙｅ，Ｓ．Ｇ．）、「Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ」４、３４７〜５４ページ、２００４年）。動物モデルにおいては、ＡＰＲＩＬおよびＢＡＦＦ過剰発現は、Ｂ細胞腫瘍症の進行を誘起する。これらの２種のＴＮＦリガンドのＢ細胞腫瘍への関与は、ヒト株細胞で実証されている。非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）株細胞が、これらの２種のＴＮＦリガンドを異常に発現して、インビトロでの生存／増殖の利点をもたらしていると報告された。患者において、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの異常な発現は、上昇した血清濃度（ｓｅｒｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）によって確かめられた。
【０００４】
近年において、プロテオグリカンの硫酸グリコサミノグリカン側鎖へのＡＰＲＩＬの結合が実施された（インゴールド，Ｋ．（Ｉｎｇｏｌｄ，Ｋ．）ら、「Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ」２０１、１３７５〜８３ページ、２００５年）。対照的に、ＢＡＦＦはプロテオグリカンに結合せず、ＡＰＲＩＬ機能におけるプロテオグリカンの役割に対する疑問が提起されている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
本発明は、可溶性ＡＰＲＩＬに対して向けられたモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２、およびＡｐｒｉｌｙ−２を産生するハイブリドーマ細胞に関する。さらに、本発明は、モノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２と、メンブランに固着されたＡＰＲＩＬ断片に対して向けられたモノクローナルまたはポリクローナル抗体との組み合わせの、高いリスクを有する患者における、Ｂ細胞リンパ腫の治療に対する耐性の診断およびびまん性大細胞型Ｂ細胞（ＤＬＢＣＬ）リンパ腫の臨床的進行の予後における使用に関し、特に、Ａｐｒｉｌｙ−２およびＡＰＲＩＬのストーク（ｓｔａｌｋ）領域に対する１種の抗体の組み合わせの使用、および関連する診断方法およびこのような抗体を含有するキットに関する。さらに、本発明は、抗体を調製するために有用であるＡＰＲＩＬのストーク領域のアミノ酸配列に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、可溶性ＡＰＲＩＬに対して向けられたモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２、およびこのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞に関する。
【０００７】
可溶性ＡＰＲＩＬに対して向けられたモノクローナル抗体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における発現により得られる組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）でマウスを免疫化することにより得られる。ハイブリドーマ細胞は、標準的な条件下で記載されるとおり調製される。可溶性ＡＰＲＩＬに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）Ａｐｒｉｌｙ−２を産生するハイブリドーマ株細胞Ａｐｒｉｌｙ−２を８０μｇ／ｍｌの濃度で、パスツール研究所の国立培養微生物収集所（ＣＮＣＭ）、２５、Ｆ−７５７２４パリ（Ｐａｒｉｓ）ＣＥＤＥＸ１５、ドクトルルー通り（ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ）に、２００５年９月２３日に、番号ＣＮＣＭ Ｉ−３５００で寄託した。
【０００８】
モノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２は、分泌されたＡＰＲＩＬを局在化することが可能である。ストーク（Ｓｔａｌｋ）（ＧＴＧＧＰＳＱＮＧＥＧＹＰ、配列番号１）と呼ばれる定義されたＡＰＲＩＬ配列に対する二次抗体は、ＡＰＲＩＬをヒト組織のインビトロで産生する細胞の同定を高い信頼性で可能にする。この配列（配列番号１）もまた本発明の目的である。
【０００９】
これまで生成されたＡＰＲＩＬに対する抗体のいずれも、新たに合成されるＡＰＲＩＬが早期分裂してしまうので、ＡＰＲＩＬを産生する細胞を同定することができない。ＡＰＲＩＬ処理後の細胞と関連したままであるストークと呼ばれるＡＰＲＩＬの特定の断片のＡＰＲＩＬ産生細胞における安定性が重要である。実際、これが、ＡＰＲＩＬを産生する細胞において検出可能である主なＡＰＲＩＬ生成物である（図１ａ）。ヒトＡＰＲＩＬ（例えばポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１）の配列ＧＴＧＧＰＳＱＮＧＥＧＹＰ（配列番号１）に対して向けられたいずれの抗体もこの１５ｋＤａストーク断片を同定することが可能である。
【００１０】
このような抗体の組み合わせ、すなわちモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２およびストーク断片に対して向けられた任意の（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体では、ＡＰＲＩＬを容易に検出することが可能である。このような方法は、本発明のさらなる態様である。ＡＰＲＩＬは、ＤＬＢＣＬなどの高悪性度Ｂ細胞リンパ腫の約半分で強く発現されることが観察されている。他の半分は健常な組織と比していかなる発現上昇も示さなかった。強いＡＰＲＩＬ発現上昇を示すＤＬＢＣＬ病変において、詳細な分析により、ＡＰＲＩＬは主に浸潤性好中球により（まれに組織球により）産生され、その一方で分泌されたＡＰＲＩＬが腫瘍細胞に濃縮されることが明らかにされた。ＤＬＢＣＬ病変におけるＡＰＲＩＬの役割を、異なるレベルのＡＰＲＩＬ発現を有する患者の遡及試験で、インビボで試験した。腫瘤病変におけるＡＰＲＩＬの高発現と、臨床的リスクの高い患者における従来の治療に対する応答の欠如との間の強い相関関係がみられ、ヒトリンパ腫病原力（治療に対する耐性）におけるＡＰＲＩＬの役割を示していた。臨床的リスクの高い患者は、６０歳を超える患者および／または国際予後指標（ＩＰＩ）＞２を有する患者として定義される。国際予後指標（ＩＰＩ）は、リンパ腫病期をさらに明確にするために策定された。ＩＰＩは、ｉ）一般的健康状態（全身状態としても公知である）、ｉｉ）腫瘍侵襲の病期（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ病期分類）、ｉｉｉ）乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）という名の高血清酵素の存在または不存在（腫瘍サイズと相関する）、およびｉｖ）結節外部位の数などの４つの要素を考慮に入れて、疾病再発のリスクおよび全生存率を予測する。各病期は、１ポイントとして正のカウントがスコアされるとき；６０歳を超える年齢およびＩＰＩ＞２は、高いリスクの患者と関連している（ウィルダー，Ｒ．Ｂ．（Ｗｉｌｄｅｒ，Ｒ．Ｂ．）ら、「Ｃａｎｃｅｒ」、９４、３０８３〜３０８８ページ、２００２年）。
【００１１】
高悪性度Ｂ細胞リンパ腫におけるＡＰＲＩＬ発現上昇は腫瘍の治療に対する耐性を強化し、これが、臨床的リスクの高い患者についての治療失敗を説明する可能性が高い。記載の抗体、すなわちモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｉｙ−２と、ストークと呼ばれるＡＰＲＩＬ断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体との組み合わせは、患者腫瘍生検におけるＡＰＲＩＬ発現を評価する第１の好適なペアである。
【００１２】
上述の抗体ぺアは、疾病診断時に、現在の標準的な治療に対応できない重要なリスクを有する患者の免疫組織化学による容易な同定に有用である。このような早期の診断は、現在適用されているものより集中的な治療に適格である患者の認識を補助するであろう。費用の節約に追加して、このような早期の診断は、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、すなわちＢ細胞リンパ腫の高悪性形態の治療における成功率の向上を補助するであろう。本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の高悪性形態（治療に対する耐性）の診断方法に関し、ここで、Ｂ細胞リンパ腫生検標本が、モノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２の結合、およびＡＰＲＩＬのストーク断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の結合に対して分析され、２種の抗体が標本に結合している場合に高悪性形態と診断される。
【００１３】
腫瘍生検におけるＡＰＲＩＬ判定もまた、低悪性度リンパ腫、白血病および多発性骨髄腫などの他のＢ細胞腫瘍についての重要な予後値を有する。加えて、これは、癌腫およびメラノーマなどの固体腫瘍について有用である。
【００１４】
分泌された、メンブラン結合ＡＰＲＩＬを選択的に認識する抗体の同定
インサイチュＡＰＲＩＬ発現を試験するために、異なる特異性を有するＡＰＲＩＬ−特異的抗体が選択される。本発明のモノクローナル抗体、Ａｐｒｉｌｙ−２は、フューリン（ｆｕｒｉｎ）開裂に際して分泌されたＡＰＲＩＬのＣ−末端ＴＮＦ相同ドメインを認識する。ポリクローナルウサギ抗血清Ｓｔａｌｋ−１は、ＡＰＲＩＬ細胞外ドメインにおける膜−近位配列を認識する。本願明細書において以下ストークと呼ぶこのドメインは、フューリン開裂後も細胞膜に結合したままである。パラフィン中に固定および包理されたＡＰＲＩＬ−形質移入化細胞への選択的染色がこれらの抗体で得られ、免疫組織化学的使用についての特異性が示されている。
【００１５】
Ｓｔａｌｋ−１およびＡｐｒｉｌｙ−２は、免疫組織化学（ＩＨＣ）により陽性染色を生成する。結果が表１、２および３に集計されている。Ｓｔａｌｋ−１およびＡｐｒｉｌｙ−２により、腫瘍生検からの溶解物（ｌｙｓａｔｅ）中に検出されたタンパク質生成物を生化学的に特徴付けた。ウェスタンブロット分析は、Ａｐｒｉｌｙ−２が主な１８ｋＤａバンドを同定し、一方でＳｔａｌｋ−１はＩＨＣ陽性生検における１４ｋＤａバンドを検出することを示している（図１ａ）。このようなバンドはＩＨＣ陰性生検においては観察されなかった。Ａｐｒｉｌｙ−２により認識される１８ｋＤａバンドは、分泌されたＡＰＲＩＬのサイズと適合する。Ｓｔａｌｋ−１により認識される１４ｋＤａバンドは、開裂後のＡＰＲＩＬストーク領域の予想されたサイズと適合し、これはまた、ＤＣ溶解物における主たるバンドとして観察される（図１ａ、右パネル）。この後者の実験において、完全長ＡＰＲＩＬ（３２ｋＤａ）は著しくは検出されず、ＡＰＲＩＬのほとんどは合成後に急速に開裂され、分泌されることを示している。特異性が、競合実験において評価される。ウェスタンブロット分析前の、対応する抗体への可溶性ａｃｒｐＡＰＲｌＬまたはストークペプチドの追加は、１８ｋＤａおよび１４ｋＤａバンドの認識をそれぞれ無効にし（図１ｂ）、これらのタンパク質が関連するエピトープを発現していることを実証している。分析は開裂したＡＰＲＩＬのストークがＡＰＲＩＬ−産生細胞中に安定のままであることを示しており、Ｓｔａｌｋ−１を、ＡＰＲＩＬ−産生細胞を検出する役立つツールとしている。対照的に、Ａｐｒｉｌｙ−２は、分泌されたＡＰＲＩＬを検出する。
【００１６】
ＤＬＢＣＬ生検におけるＡＰＲＩＬの強い発現上昇
Ｓｔａｌｋ−１およびＡｐｒｉｌｙ−２を用いて、ＮＨＬおよび健常な扁桃腺対照のパラフィン包理化組織から調製した多発性腫瘍アレイを染色した。これらのうち、ＤＬＢＣＬ病変の５０％が、分泌されたＡＰＲＩＬ（Ａｐｒｉｌｙ−２染色）について強度に陽性であった。残りの症例は、細胞の局所的な染色のみを示した（表１）。対照的に、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、濾胞細胞（ＦＣＬ）、マントル細胞（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫（ＭＧＺＬ）、ならびに結節性慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）からの組織は局所的なＡｐｒｉｌｙ−２染色のみを有していた。扁桃腺などの非腫瘤性リンパ組織において、局所的なＡｐｒｉｌｙ−２染色が観察された。同一のＮＨＬアレイをＳｔａｌｋ−１で染色し、Ａｐｒｉｌｙ−２について陽性であった症例の９５％超がまた、Ｓｔａｌｋ−１で染色された（表１）。それ故、分泌されたＡＰＲＩＬの検出において、腫瘍病変におけるＡＰＲＩＬ−産生細胞の存在と相関する。総合すると、これは、ＡＰＲＩＬ発現は、ＤＬＢＣＬ病変の５０％において顕著に上昇したことを示す。
【００１７】
表１：ＡＰＲＩＬ発現は、高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン様リンパ腫および多発性骨髄腫において強く上昇している
多発性Ｂ細胞リンパ腫アレイおよび健常な組織を、Ａｐｒｉｌｙ−２（２μｇ／ｍｌ）またはＳｔａｌｋ−１（５μｇ／ｍｌ）抗体で免疫染色した。強い染色（高）または局所的な（低／陰性）染色の複数の症例が示されている。
【００１８】
【表１】
【００１９】
ＡＰＲＩＬは、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ホジキン様リンパ腫および多発性骨髄腫（表１）、さらに、いくつかの他の癌腫（表２）および皮膚癌（表３）において、発現上昇されている。
【００２０】
表２：ＡＰＲＩＬ発現は、種々の癌腫において強く上昇している
癌腫組織アレイおよび健常な組織を、Ａｐｒｉｌｙ−２（２μｇ／ｍｌ）またはＳｔａｌｋ−１（５μｇ／ｍｌ）抗体で免疫染色した。陽性染色（＋）が示されている。
【００２１】
【表２】
【００２２】
表３：ＡＰＲＩＬ発現は、種々の皮膚癌において強く上昇している
皮膚癌生検（基底細胞癌および転移性メラノーマ）および健常な組織を、Ａｐｒｉｌｙ−２（２μｇ／ｍｌ）またはＳｔａｌｋ−１（５μｇ／ｍｌ）抗体で免疫染色した。多数の陽性染色が、４種の基底細胞癌および８種の転移性メラノーマについて示されている。
【００２３】
【表３】
【００２４】
詳細な分析のために、Ａｐｒｉｌｙ−２およびＳｔａｌｋ−１染色を、ＤＬＢＣＬ病変からの切片全体で特徴付けた。Ａｐｒｉｌｙ−２は細胞を囲む斑状の染色を顕色化し、いくつかの細胞は腫瘍細胞に一致する形態学を有している。同様のパターンがまた、可溶性ＡＰＲＩＬ（Ａｐｒｉｌｙ−６およびＡｐｒｉｌｙ−８）に対する他の２種のモノクローナル抗体で観察された。対照的に、Ｓｔａｌｋ−１は、細胞染色を顕色化した。Ａｐｒｉｌｙ−２およびＳｔａｌｋ−１染色は、ａｃｒｐＡＰＲｌＬおよびストークペプチドと、それぞれ競合した。Ｓｔａｌｋ−１で染色された細胞は、いずれも腫瘍細胞に一致する形態学を有していなかった。ＤＬＢＣＬ患者の５０％における低または検出不可能なＡＰＲＩＬ発現は、Ｓｔａｌｋ−１およびＡｐｒｉｌｙ−２の両方についての全切片の染色で確認された。この実験は、腫瘤病変におけるＡＰＲＩＬのソースは腫瘍自体ではなく、むしろストローマであることを強く示唆している。一旦分泌されると、開裂したＡＰＲＩＬは、ＡＰＲＩＬ−産生細胞から解離するように考えられる。
【００２５】
腫瘍−浸潤性好中球はＡＰＲＩＬを産生する
ＡＰＲＩＬ−産生細胞をインサイチュで正確に同定した。Ｓｔａｌｋ−１での免疫ペルオキシダーゼ染色の高濃縮分析は、陽性細胞は、好中球の大きい特徴である三小葉核（ｔｒｉｌｏｂｕｌａｒ ｎｕｃｌｅｕｓ）を有することを容易に示す。加えて、内皮の形態学を有する少数の陽性に標識化された細胞がまた、切片において観察される。好中球の同一性は、共に好中球についての一般的なマーカーである抗ＣＤ１５および抗エラスターゼでのＳｔａｌｋ−１染色を組み合わせることにより確認される。これらの切片において、ほとんどすべての抗ストーク陽性細胞はまた、好中球マーカーで染色される。ＡＰＲＩＬ産生好中球を病変中に局在化させた。Ｓｔａｌｋ−１染色をＣＤ２０染色と組み合わせ、Ｂ細胞リンパ腫マーカーとして用いた。ＡＰＲＩＬ−産生細胞は、腫瘍病巣に近接して位置されている。Ｓｔａｌｋ−１およびＣＤ２０染色の間に重複が見られないため、腫瘍細胞はＡＰＲＩＬを発現しない。併せると、これは、ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞により進入された組織を浸潤する好中球が、ＡＰＲＩＬの主な供給源であることを示している。
【００２６】
ＡＰＲＩＬを産生する好中球が炎症に必要とされる。
ＡＰＲＩＬ発現をさらに特徴付けるために、健常なボランティアからの好中球を試験した。健常なドナーから単離された末梢血好中球はＡＰＲＩＬ ｍＲＮＡを発現し、およびＳｔａｌｋ−１で染色される。対照的に、末梢好中球はＡｐｒｉｌｙ−２で染色されない。Ａｐｒｉｌｙ−２およびＳｔａｌｋ−１染色の間のこの矛盾は、完全長ＡＰＲＩＬで形質移入された２９３Ｔ細胞では観察されない。これは、形質移入された２９３Ｔ細胞とは対照的に、内在性の完全長または開裂ＡＰＲＩＬは好中球で検出されないことを裏付ける。非腫瘤の炎症組織を浸潤する好中球をまたテストした。好中球により高度に浸潤されるとして知られている急性虫垂炎は、Ｓｔａｌｋ−１で染色された大量の細胞を含有する。高倍率に濃縮すると、染色された細胞はＤＬＢＣＬ病変におけるＳｔａｌｋ−１陽性細胞と同一の形態学を有する。これは、成熟した循環好中球は恒常的にＡＰＲＩＬを発現し、およびＤＬＢＣＬ進行を含む炎症性反応におけるＡＰＲＩＬの産生は、漸増した好中球により保障されることを示している。
【００２７】
プロテオグリカンはＡＰＲＩＬの分泌を阻害する
ＡＰＲＩＬは細胞表面プロテオグリカンに相互作用することが既に示されている。プロテオグリカンへのＡＰＲＩＬの相互作用を、細胞を含まない（セルフリー）エライザ（ＥＬＩＳＡ）アッセイにおいて、捕獲のためにマウス肉腫由来の精製したヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）を用い、および検出のためにＡｐｒｉｌｙ−９を用いて確認した。この場合、プロテオグリカン結合部位に欠く組み換え型ＡＰＲＩＬＨ９８ではない組み換え型ＡＰＲＩＬＡ８８が、被覆プロテオグリカンに結合する（図２ａ）。ｈｕＡＰＲＩＬと、マウスプロテオグリカンのヘパラン硫酸側鎖とのこの相互作用は、ＡＰＲＩＬは、何がタンパク質核であろうと、広い範囲のヘパラン硫酸プロテオグリカンと相互作用しやすいことを示している。加えて、これは、他の細胞タンパク質のいずれも相互作用には必要とされないことを示す。プロテオグリカンの、ＡＰＲＩＬの分泌物への影響を評価した。プロテオグリカンを発現すると知られている２９３Ｔ細胞を、ＡＰＲＩＬＡ８８またはＡＰＲＩＬＨ９８をコードするプラスミドで形質移入した。図２ｂは、いくつかの２９３Ｔ−形質移入細胞が高レベルのＡＰＲＩＬＡ８８を保持し、一方で、ＡＰＲＩＬＨ９８では、僅かに中程度のレベルの細胞保持があったことを示す。細胞保持は、上澄中の分泌されたＡＰＲＩＬの定量化により確認される。ＡＰＲＩＬＨ９８で形質移入された２９３Ｔ細胞は、約２〜３μｇ／ｍｌの組み換え型タンパク質を分泌し、一方で、ＡＰＲＩＬＡ８８で達成された分泌物は十分の一であった（図２ｂ）。ＡＰＲＩＬを産生する好中球がプロテオグリカンを分泌するかをテストした。ＡＰＲＩＬＡ８８の細胞表面への結合がプロテオグリカン発現を評価する。図２ｃは、末梢好中球がＡＰＲＩＬに結合しないことを示す。対照的に、Ｌ３６３株細胞（シンデカン−１を発現する多発性骨髄腫細胞）はＡＰＲＩＬに結合し、この結合は、ヘパリンによって完全に阻害される。これは、末梢好中球は、ＡＰＲＩＬに結合することが可能である、検出可能ないずれのプロテオグリカンも欠いていることを示す。好中球によるＡＰＲＩＬ結合性プロテオグリカン発現の欠損は、ＡＰＲＩＬを分泌する完全な適格性を与える。
【００２８】
プロテオグリカンは、腫瘍病変におけるＤＬＢＣＬ細胞に近接して分泌されるＡＰＲＩＬを濃縮する
ＤＬＢＣＬ病変におけるプロテオグリカン発現を評価した。シンデカン−１は発現されない。対照的に、シンデカン−４の発現が分析した症例（ｎ＝６）の半分で観察される。分泌されたＡＰＲＩＬは、腫瘍病変におけるシンデカン−４発現部位に位置される。Ａｐｒｉｌｙ−２染色は、常に、シンデカン−４発現部位に完全な重複で位置され、ＡＰＲＩＬのシンデカン−４とのインサイチュでの密接な相互作用を強く示唆している。いくつかのシンデカン−４が遊離している事実は、ＡＰＲＩＬは飽和量で産生されていないこと、またはＡＰＲＩＬは腫瘍病変において消費され、一方でプロテオグリカンは消費されないことのいずれかを示している。シンデカン−４を発現する細胞を同定するために、ＣＤ２０およびシンデカン−４染色を組み合わせた。ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞は均質にシンデカン−４を発現する。シンデカン−４染色は、膜状のＣＤ２０染色と比して内環を構成し、おそらく、シンデカン−４の細胞内局在化を反映している。シンデカン−４発現はまた、腫瘍床の周囲の組織において観察され、いずれの腫瘍細胞に欠ける。Ａｐｒｉｌｙ−２染色をＣＤ２０染色と組み合わせた。分泌されたＡＰＲＩＬは、腫瘍に近接して濃縮され、いくつかは直接的に腫瘍細胞に結合し、およびいくつかは、非腫瘤性細胞に結合する。後者が、シンデカン−４を発現する非腫瘍細胞に最も相当する可能性がある。これらの細胞は、常に、主に腫瘍末梢に局在化され、腫瘍細胞により浸潤されていない組織切片からは存在していない。しかも、分泌されたＡＰＲＩＬは、腫瘍末梢で濃縮され、および腫瘍床の深部に存在していない。腫瘍細胞へのＡＰＲＩＬの結合は、高倍率の濃縮でＡｐｒｉｌｙ−２免疫ペルオキシダーゼ染色で確認することが可能である。総合すると、この分析は、ＡＰＲＩＬは、一旦好中球により分泌されると、腫瘍および組織プロテオグリカンに結合した腫瘍末梢で蓄積されることを示す。
【００２９】
ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞は、ＡＰＲＩＬについてのＢＣＭＡおよびプロテオグリカン共受容体を発現する
ＡＰＲＩＬ受容体発現を、ＤＬＢＣＬ病変において調べた。ホルムアルデヒド−固定化組織で内在性のＢＣＭＡまたはＴＡＣＩを検出する抗体は、現在まで入手不可能である。従って、患者から樹立されたＤＬＢＬ株細胞を用いた。ＲＴ−ＰＣＲによるメッセンジャーＲＮＡ発現分析は、テストした株細胞のすべてでＢＣＭＡの発現を示し、一方で、ＳＵ−ＤＨＬ６の１種のみがＴＡＣＩ（図３ａ）を発現することを示す。このＲＴ−ＰＣＲ分析において、ＤＬＢＣＬ株細胞においてＡＰＲＩＬが発現しないことが確認される。抗ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡ ｍＡｂが用いられて、タンパク質発現が検出される。抗ＴＡＣＩ、およびＢＣＭＡ ｍＡｂの特異性は、形質移入化−２９３Ｔ細胞で確認される（図３ｂ）。ＴＡＣＩタンパク質発現はＳＵ−ＤＨＬ−６において検出され、一方で、ＯＣＩ−Ｌｙ７（図３ｃ）およびＳＵ−ＤＨＬ−４および−７においては見られない。抗ＴＡＣＩ１Ａ１ｍＡｂは、ＴＡＣＩの第２の富システインドメインに結合し、これらのＤＬＢＬ株細胞におけるＴＡＣＩタンパク質の不在を裏付ける。表面ＢＣＭＡの発現はＤＬＢＣＬでかろうじて検出可能であるが、細胞透過処理の後は顕著なＢＣＭＡ染色が常に見られる。ＡＰＲＩＬ結合を、プロテオグリカン−結合部位を含有するａｃｒｐＡＰＲｌＬで評価した。ａｃｒｐＡＰＲｌＬは、すべてのＤＬＢＣＬ株細胞に均質に結合する（図３ｃ）。しかしながら、ヘパリンでの阻害が評価されるとき、完全な阻害はＯＣＩ−Ｌｙ７で観察されるが、ＳＵ−ＤＨＬ６では阻害は見出されない。加えて、ＢＣＭＡ−ｌｇはＳＵ−ＤＨＬ６への結合を阻害するが、ＯＣＩ−Ｌｙ７への結合は阻害しない。これは、ＳＵ−ＤＨＬ６がＴＡＣＩをＡＰＲＩＬへの表面受容体としてプロテオグリカンなしで発現する一方で、ＯＣＩ−Ｌｙ７は表面プロテオグリカンをＴＡＣＩ無しで発現することを示す。ＢＣＭＡについて、発現は、ＤＬＢＣＬ系において、主な細胞内プールと共に均質に発現される。併せて、これは、ＤＬＢＣＬ系中のＡＰＲＩＬ−Ｒ発現における不均一性を示す。ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞の大部分はＢＣＭＡおよびプロテオグリカン共受容体を発現する。
【００３０】
ＤＬＢＣＬ患者の腫瘍病変における高ＡＰＲＩＬ発現は、生存率比の低下に関連している。
ＤＬＢＣＬにおけるＡＰＲＩＬの役割を、生検サンプルにおけるＡＰＲＩＬ発現について分析した２３３人の患者の遡及的な臨床的分析により評価した。データを入手してから、疾病病期、循環ＬＤＨのレベル、インサイチュ増殖指数、ＤＬＢＣＬタイプおよび年齢を先ず判定した。「高ＡＰＲＩＬ発現」および「低ＡＰＲＩＬ発現」の間に、病期、ＬＤＨレベル、腫瘍増殖指数、および年齢の観点で顕著な差異はなかった。加えて、ＡＰＲＩＬ発現の低および高レベルが胚中心および活性化された２種のＤＬＢＣＬサブタイプにおいて観察され、診断時での、ＡＰＲＩＬ発現のレベルと、および標準的な臨床的パラメータとの間の明白な相関がないことを示していた。ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロン）治療後の生存率比および再発までの時間を次いで分析した。ＡＰＲＩＬ発現について分析した２３３人の患者から、１００人が追跡可能な臨床的データを有していた。興味深いことに、高いリスクの患者（＞６０歳およびＩＰＩ＞２）については、治療への応答の不在により計測した生存率において非常に大きい低減（ｐ＝０．０００９）が「高ＡＰＲＩＬ発現体」群において見られた（図４ｂ）。しかも、患者の同一の固体群（＞６０歳／ＩＰＩ＞２および高ＡＰＲＩＬ）について、疾病を有さない期間は、ＡＰＲＩＬ低固体群（ｐ＝０．０２）についてのものよりはるかに短かった（図４ｂ）。これらの所見は、ＡＰＲＩＬは腫瘍を促進する役割をＤＬＢＣＬにおいて有することを強く示唆している。
【００３１】
実験結果の考察
ＡＰＲＩＬ発現上昇が、ＤＬＢＣＬ症例の約５０％で見られる。陽性サンプルにおけるＡＰＲＩＬの主なソースは好中球である。腫瘍細胞によるＡＰＲＩＬ発現についてのエビデンスは見出されなかった。腫瘍細胞によるＡＰＲＩＬ産生は、もし生じていても、腫瘍−浸潤性好中球と比して、インサイチュできわめて低い。ＤＬＢＣＬ細胞によるＡＰＲＩＬの低産生は、ＡＰＲＩＬが外因的に追加されたときのこれらのＤＬＢＣＬ株細胞で観察された生存率効果をきわめてよく説明することが可能であるため、株細胞で得られた結果と矛盾するものではない。腫瘍−浸潤性好中球によるＡＰＲＩＬのインサイチュ発現は、骨髄系列の細胞に限定されたインビトロ発現と一貫する。しかしながら、これは、ＡＰＲＩＬが好中球によって選択的にインサイチュで産生され、およびＤＬＢＣＬを浸潤する単球／マクロファージなどの骨髄系列の他の細胞によっては産生されないことを示す。Ｂ細胞リンパ腫におけるＡＰＲＩＬのこの宿主由来産生は、このようなリンパ腫は、低悪性度リンパ腫として分類される他のＢ細胞リンパ腫／白血病（ＭＡＬＴ、ＣＬＬ、ＦＣＬ、ＭＣＬ、ＭＧＺＬ）と比して、高悪性度の、より明白な宿主細胞浸潤で進行すると分類されるため、ＤＬＢＣＬ病変における選択的発現上昇を説明すると考えられる。これらの後者のＢ細胞腫瘍において、ＡＰＲＩＬ発現レベルは、浸潤された非腫瘍性浸潤化扁桃腺において見出されるものに匹敵する。
【００３２】
分泌されたＡＰＲＩＬが、腫瘍細胞に結合していることを見出した。この局在化は、ＡＰＲＩＬに結合するＨＳＰＧによって補償された。場合により、腫瘍発現ＨＳＰＧをシンデカン−４として同定した。他のＤＬＢＣＬ症例において、シンデカン−４は発現されなかったが、観察したＡｐｒｉｌｙ−２染色は、他のＨＳＰＧとの関連を示している特徴的な終点と同等であった。断続的なＡＰＲＩＬ／ＨＳＰＧ染色は、リガンド結合で誘起されるプロテオグリカンクラスター形成をきわめて反映しやすい。腫瘍細胞によって浸潤された組織において、プロテオグリカンは、受容体発現腫瘍細胞に近接する浸潤性好中球により分泌されたこのリガンドを濃縮するために役立つ。このプロセスの効率を最大化するために、ＡＰＲＩＬ産生好中球はプロテオグリカンを含まない。プロテオグリカン共受容体官能性は、腫瘍細胞発現プロテオグリカンによりシスで、および腫瘍周囲の細胞に発現されたプロテオグリカンによりトランスで媒介できることが可能である。
【００３３】
Ｂ細胞におけるＡＰＲＩＬ同時刺激は、ＢＣＭＡ、ＴＡＣＩ、または両方の誘発により実施されることが可能である。ＴＡＣＩは、ＤＬＢＣＬ腫瘤の細胞で一定に発現されない。ＢＣＭＡは、テストされたＤＬＢＣＬ株細胞において均一に発現される。均一なＢＣＭＡ発現は、ＢＣＭＡがＡＰＲＩＬ共刺激性シグナルの伝達に役立つことを強く示唆している。ＢＣＭＡ染色は、無処置ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞では低いが、透過処理後では著しく増強され、ゴルジ装置に位置されたＢＣＭＡの細胞内プールの存在下では一定である。ＢＣＭＡに追加して、ＤＬＢＣＬ腫瘤の細胞はＡＰＲＩＬに結合するプロテオグリカンを発現する。低レベルのＢＣＭＡ発現は、ＡＰＲＩＬを細胞表面で濃縮するプロテオグリカンなどの共受容体についての依存性を示し得る。
【００３４】
Ｂ細胞腫瘍中のＡＰＲＩＬなどの高濃度のＢ細胞共刺激性分子は、腫瘍進行および病原力の増強を助力する連続的な生存率／増殖性シグナルをもたらす。低リスクの患者（＞６０歳およびＩＰＩ＜２）については、化学療法およびリツキシマブを組み合わせる治療で達成される現在の効力では、ＡＰＲＩＬについての役割の検出は明らかに不可能である。しかしながら、このような治療に対する応答に劣ると知られている高いリスクの患者（＞６０歳およびＩＰＩ＞２）については、腫瘍病変における高ＡＰＲＩＬ発現は、強く低減された生存率比と関連している。診断後のＤＬＢＣＬ株細胞および患者進化はＡＰＲＩＬに依存しているという事実は、腫瘍形成プロセスにおけるこの分子についての後形質転換の役割を示唆している。高いリスクの患者において、ＡＰＲＩＬは、従って、治療強度の調整における役立つ予後ツールであり、この群の患者におけるＡＰＲＩＬの高発現を伴う被験者に対する役立つ治療的な目標を表す。
【００３５】
Ｂ細胞リンパ腫の臨床的進行の予後
本願明細書中において上記に説明した実験の結果に基づいて、可溶性ＡＰＲＩＬ（病変において分泌されたＡＰＲＩＬの定量化）に対するモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２と、ＡＰＲＩＬを産生する細胞を同定する、メンブランに固着されたＡＰＲＩＬのストーク断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体と（配列番号１）の組み合わせが、Ｂ細胞リンパ腫病原力（治療に対する耐性）の診断において有用である。Ａｐｒｉｌｙ−２と、Ｓｔａｌｋ−１と呼ばれる、メンブランに固着されたＡＰＲＩＬに対するポリクローナル抗体との組み合わせの使用が特に好ましい。
【００３６】
特に、前述の抗体の組み合わせは、Ｂ細胞リンパ腫の病原力の予後診断するために、および可能性のある臨床的予後を予想するために用いられ得る。このような予後は、対応する治療的処置の考察に役立つ。高いリスクの患者（ＩＰＩ＞２）におけるＢ細胞リンパ腫の予後におけるこのような方法が特に有用である。
【００３７】
Ｂ細胞リンパ腫の診断における有用なキット。
本発明は、さらに、モノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２およびメンブランに固着されたＡＰＲＩＬのストーク断片、例えばＳｔａｌｋ−１に対する１種のポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含むキットに関する。キットは、他のＢ細胞リンパ腫バイオマーカーに向けられた抗体をさらに含有し得、さらに、標準的な器具、溶液および診断上のテストを実施するため使用説明書、ＡＰＲＩＬまたはＡＰＲＩＬ断片および基準としての対照ペプチド等を含有し得る。ポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１およびモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２を含む対応するキットが好ましい。
【実施例】
【００３８】
実施例
抗原調製
組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）を細菌中で産生した。ＡＰＲＩＬ発現ベクターで形質転換した細胞を、８ｍｌのＬブロス（ＬＢ）とＡＫ（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ＋カナマイシン５０μｇ／ｍｌ）との中に播種し、一晩、３７℃で増殖させた。８ｍｌの一晩培養物は４００ｍｌのＬＢ＋ＡＫ中に希釈され、３７℃で増殖される。イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）が０．５ｍＭの最終濃度で添加され、および細胞が３７℃で６時間増殖される。細菌が回収され、ペレットがリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁され、およびフレンチプレス中に溶解される。細胞溶解物が２ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）管に移され、１３０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心分離される。組み換え型ヒトＡＰＲＩＬを封入体中に含有するペレットが、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）サンプル緩衝剤中に再懸濁され、超音波処理され、還元され、およびＳＤＳゲル上に充填される。組み換え型ヒトＡＰＲＩＬに対応するバンドが、電気泳動で溶出される（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅｄ）。
【００３９】
免疫化
３匹のマウスに、各々ＰＢＳおよびフロイント完全アジュバント中に希釈した１５０μｇの組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）を注射した。１４日後、マウスをフロイント完全アジュバント中の同量の抗原で追加免疫した。２８日後、マウスを組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）に対するこれらの免疫応答を評価するために出血させ、エライザ（ＥＬＩＳＡ）を、異なる希釈度の血清で実施した。陽性の血清を有するマウスを、４５日後に、ＰＢＳ中の組み換え型ヒトＡＰＲＩＬ（９２〜２３３）で再度追加免疫した。３日後、脾臓を回収した。
【００４０】
細胞融合、スクリーニングおよびサブクローニング
脾臓を、無菌ガラス−ガラスホモジナイザーにおいて、１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中にホウケイ酸乳棒を用いて６〜８回のストロークで均質化した。懸濁液を、５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブに移し、細胞を３００×ｇで、１０分間、室温で遠心沈殿した。細胞を、１０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁させ、形質細胞を計数した。１０〜２０×１０７個の脾臓細胞および１０〜２０×１０６個の骨髄腫細胞クローン（Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８またはＮＳＩ）（比１０／１）を融合のために混合し、およびスピンさせた。０．５ｍｌの予熱したＰＥＧ１５００を、ペレットに管壁を伝わせて滴下させ、およびチューブを、各分で穏やかに攪拌しながら、３分間、３７℃で維持した。５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地（３７℃で予熱した）を、管壁を伝わせて１０分間（０．５ｍｌ／分）かけて添加し、続いて、１分間、３７℃でインキュベートした。５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０培地を、再度、５〜６分間かけて添加した。細胞を１０分間、３００×ｇで、室温で遠心分離することによりペレット化し、６ｍｌの完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中に再懸濁させ、１時間、３７℃で、ＣＯ２インキュベータ中にインキュベートした。細胞融合懸濁液を、６×９６−ウェルプレート中のマウスマクロファージ（支持細胞層）上に穏やかに塗布した（１００μｌ／ウェル）。融合の２４時間後、ＨＡＴ（ヒポキサンチン／アミノプテリン／チミジン）を含有する選択培地（ＲＰＭＩ−１６４０）を細胞に添加した。９６−ウェルプレートからの上澄を、エライザ（ＥＬＩＳＡ）により抗体分泌物についてテストした。エライザ（ＥＬＩＳＡ）による集密的な、陽性クローンを、細胞をマクロファージ支持細胞層と１×ＨＡＴとを含有する２４−ウェルプレートに移すことにより増幅した。陽性クローンを、限界希釈により２回サブクローン化に供し、エライザ（ＥＬＩＳＡ）により抗体分泌物についてスクリーンした。エライザ（ＥＬＩＳＡ）による集密的な、陽性サブクローンを、細胞をマクロファージ支持細胞層と１×ＨＡＴとを含有する２４−ウェルプレートに移すことにより増幅した。最終的なサブクローンを、マクロファージおよびＨＡＴ補充無しで徐々に培地に順応させた。最後に、順応したときに、最終ハイブリドーマを樹立した。
【００４１】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の産生および精製
ハイブリドーマ細胞は、完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中に増幅され、無菌ＰＢＳで２回洗浄され、および１０００００細胞／ｍｌでＯｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ血清を含まない培地（スイス、バーゼルのギブコＢＲＬライフテクノロジー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中に再懸濁される。Ｔ１７５フラスコまたはローラボトルが、それぞれ、１００ｍｌおよび８００ｍｌ細胞懸濁液で播種される。細胞は、１０〜１４日間増殖される。上澄がろ過され、および４℃または−２０℃で、アジ化ナトリウムと共にまたはなしで保存される。精製はジャンボセップ（Ｊｕｍｂｏｓｅｐ）（商標）（米国ニューヨーク州イーストヒルの、ポール社（ＰＡＬＬ Ｃｏｒｐ．，Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ，ＵＳＡ））システムを用いて行われる。ハイブリドーマ上澄が無菌ＰＢＳで広範に洗浄され、スピンカラムを用いて濃縮される。
【００４２】
細胞および試薬
ＲＰＭＩ、１０％プールヒト血清（米国ミズーリ州セントルイスのシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ））中で増殖したＯＣＩ−Ｌｙ７を除き、すべての株細胞をＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳ中で増殖させた。患者から樹立したＤＬＢＣＬ株細胞ＳＵ−ＤＨＬ４、ＳＵ−ＤＨＬ６、ＳＵ−ＤＨＬ７およびＯＣＩ−Ｌｙ７は、Ａ．ビストナー博士（Ｄｒ Ａ．Ｗｉｅｓｔｎｅｒ）（米国メリーランド州ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ））により提供された。Ｌ３６３は、ＭＭ患者から樹立された株細胞であり、トーマスマッテス博士（Ｄｒ Ｔｈｏｍａｓ Ｍａｔｔｈｅｓ）（スイスジュネーブ（Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））により提供された。ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ中で増殖させた。樹状細胞を、記述のとおり、ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−４で処理した末梢単球から得た（ユアール，Ｂ．（Ｈｕａｒｄ，Ｂ．）ら、「Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ」１６、４６７〜７５ページ、２００４年）。多形核細胞（ＰＭＮ）および末梢血白血球（ＰＢＬ）を健常なドナーから単離した。血液を、クエン酸ナトリウム（３．８％）から回収した。赤血球を、ＰＢＳデキストランＴ５００（スイスオッテルフィンゲンのアマシャムバイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｏｔｅｌｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））での沈降により除去した。浮いている細胞を、遠心分離によりフィコールパック（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ）（アマシャムバイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））の層上に分離した。ペレット化した細胞は９５％を超えるＣＤ１５＋細胞を含有するＰＭＮであった。浮いている細胞はＰＢＬであった。ＰＭＮの活性化を防ぐために、すべての分離ステップは４℃で、５μｇ／ｍｌポリミキシンＢの存在下に実施した。ヘパリン（リケミン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ）、５０００ｉ．ｕ．／ｍｌ）はロシュファーマ（Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ）（スイスライナッハ（Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））製であった。以下の抗体、抗ＴＡＣＩ（クローン１Ａ１）、抗ＢＣＭＡ（クローンＶｉｃｋｙ１、ラットｌｇＧ２ａ）、ＡＰＲＩＬの細胞外部分（８８〜２３３）に対するマウス中に形成される抗ＡＰＲＩＬ（クローンＡｐｒｉｌｙ−１、−５、および−８、すべてのｌｇＧ１）、およびＳｔａｌｋ−１とも呼ばれるポリクローナル抗体ＥＤ（ＡＰＲＩＬペプチドＧＴＧＧＰＳＱＮＧＥＧＹＰに対するウサギポリクローナル抗体、配列番号１）は、アポーテック社（Ａｐｏｔｅｃｈ Ｃｏｒｐ．）（スイスエパリンゲス（Ｅｐａｌｉｎｇｅｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））から入手した。ＡＣＲＰ３０（１６〜１０８）に融合された組み換え型ＡＰＲＩＬ（８８〜２３３）、本願明細書中以下ａｃｒｐＡＰＲｌＬと呼ぶＭｅｇａＡＰＲＩＬおよびその対照、本願明細書中以下ａｃｒｐＣＴＲＬと呼ぶ無頭ＡＣＲＰ３０、およびＢＣＭＡ（２−５４）−ｌｇもまた、アポーテック（Ａｐｏｔｅｃｈ）製であった。ウサギ血清抗シンデカン１、抗シンデカン４は、サンタクルーズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（米国カリフォルニア州サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ））製であった。抗ＣＤ１５（クローンＣ３Ｄ−１、ｌｇＭ）、抗エラスターゼ（クローンＮＰ５７、ｌｇＧ１）、および抗ＣＤ２０（クローンＬ２６、ｌｇＧ２ａ）は、ダコ（ＤＡＫＯ）（スイスザグ（Ｚｕｇ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））製であった。
【００４３】
発現構築物および産生
Ｆｌａｇ−リガンドに対する発現ベクターは既に記載されている（ホラー，Ｎ．（Ｈｏｌｌｅｒ，Ｎ．）ら、「Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ」２３、１４２８〜４０ページ、２００３年）。ＨｕＡＰＲＩＬＡ８８（８８−２３３）、ｈｕＡＰＲＩＬＨ９８（９８−２３３）は、２９３Ｔ細胞中に、Ｏｐｔｉ ＭＥＭ Ｉ血清を含まない培地で産生した（スイスバーゼルのギブコＢＲＬライフテクノロジー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））。上澄を、セントリコン遠心フィルタデバイス（カットオフ１０ｋＤａ）（米国マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ））で、使用前に１０倍に濃縮した。Ｏｐｔｉ ＭＥＭ上澄中のリガンド濃度を、検出抗体としてのＡｐｒｉｌｙ−１および標準として精製したａｃｒｐＡＰＲｌＬでのウェスタンブロット分析により定量化した。
【００４４】
フローサイトメトリ
抗体染色について、細胞をＰＢＳ中に洗浄し、３０分間、４℃で、一次抗体と共にインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で１回洗浄し、セカンダリアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８−接合ヤギ抗マウス血清（米国オレゴン州のユージーンのモレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ））と共に、さらに３０分間、４℃でインキュベートした。ファクスキャン（ＦＡＣＳＣＡＮ）およびセルクエスト（Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ）（米国カリフォルニア州サンノゼのベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ））を用いて、分析前に細胞をＰＢＳ中で１回洗浄した。リガンド染色を、抗Ｆｌａｇ、５μｇ／ｍｌ（ｌｇＧ１、クローンＭ２、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を二次試薬として用いたこと以外は同様に実施し、染色を、フィコエリトリン−接合ヤギ−抗マウスｌｇＧ１（米国ペンシルベニア州ウェストグローブのジャックソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ，ＵＳＡ））での追加のステップで顕色化した。全染色のために、既に記載されているとおり、細胞を、ＰＢＳ、１％ホルムアルデヒド、１％サポニンで固定／透過処理した（ユアール，Ｂ．（Ｈｕａｒｄ，Ｂ．）およびカールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｌ．）、「Ｎａｔｕｒｅ」４０３、３２５〜８ページ、２０００年）。
【００４５】
エライザ（ＥＬＩＳＡ）
ＡＰＲｌＬ／プロテオグリカン相互作用について、マイクロプレートを、一晩、４℃で、１μｇ／ｍｌの精製ヘパラン硫酸プロテオグリカン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））でコートした。プレートを、ＰＢＳ、０．０５％ＮａＮ３、１％ＢＳＡ、５％スクロースで、１時間、室温（ＲＴ）でブロックし、ＰＢＳ中に希釈した可溶性ＡＰＲＩＬ、ＢＳＡ０．１％と共に、４時間、ＲＴでインキュベートした。検出はＡｐｒｉｌｙ−９（１μｇ／ｍｌ）で行い、続いて、西洋ワサビペルオキダーゼ（ＨＲＰ）接合ヤギ抗マウスｌｇＧ血清（ジャックソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））により行った。テトラメチルベンジジン（シグマ（Ｓｉｇｍａ））をＨＲＰの基質として用いた。ＰＢＳ、０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０での２回の洗浄を各ステップの間に実施した。細胞上澄中のＡＰＲＩＬの定量化のために、マイクロプレートを、一晩、４℃で、１μｇ／ｍｌのＢＣＭＡ−ｌｇでコートした。プレートを、上述のとおり、細胞上澄での２時間のインキュベーションの前にブロックした。標準はａｃｒｐＡＰＲｌＬ（アポーテック（Ａｐｏｔｅｃｈ））であった。検出をＡｐｒｉｌｙ−５（１μｇ／ｍｌ）で実施し、洗浄および顕色化を上記のとおり実施した。
【００４６】
遺伝子発現分析：
細胞からＴＲＩｚｏｌ試薬（スイスバーゼルのギブコＢＲＬライフテクノロジー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））を用いて調製した全ＲＮＡ（２５ｎｇ）を、１ステップＲＴ−ＰＣＲキット（スイスのキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）製の１ステップＲＴ−ＰＣＲキット）を用いて逆転写し、および増幅した。この試験で用いたすべてのプライマーはゲノムＤＮＡ上のイントロン配列にかかっていた。ｈＴＡＣＩについては５’−ｃｔｇｇｇｔａｃｃｔｇｃａｔｇｔｃｃｔｇ−３’（配列番号２）および５’−ａｇａｃｔｔｇｇｃｃｇｇａｃｔｔｔｇａｃ−３’（配列番号３）を、ｈＢＣＭＡについては５’−ｇｇｇｃａｇｔｇｃｔｃｃｃａａａａｔ−３’（配列番号４）および５’−ｔｃｇｔｔｔｔｃｇｔｇｇｔｇａｃａａｇａ−３’（配列番号５）を、およびｈＡＰＲＩＬについては５’−ａｔｇｃｃａｇｃｃｔｃａｔｃｔｃｃｔｔｔ−３’（配列番号６）および５’−ｔｃｃｔｇｇａｔｔｃｇｇａｃａｃｃａｔａ−３’（配列番号７）を、それぞれ、前および逆方向プライマーとして用いた。対照作用プライマーは前方５’−ｔｔａａｃｇａｇａａｇｃｔｇｔｇｃｔａｃｇｔｃ−３’（配列番号８）および逆５’−ａｔａｇｔｃｃｔｇｃｔｔｇｃｔｔｇｃｔｇａｔｃｃａｃ−３’（配列番号９）であった。変性を９４℃で１分間、アニーリングを５５℃で１分間、および伸長を７２℃で１分間実施し、４０サイクルを非定量的試験について適用した。増幅したｍＲＮＡを、アガロースゲル上に可視化し、臭化エチジウム染色した。単位複製配列特異性を、各プライマーぺアについて３種の選択した酵素で制限分析により確認した。
【００４７】
免疫組織化学
生検試料を、改訂欧州米国リンパ腫（ＲＥＡＬ）分類に準拠して分類した。組織マイクロアレイを、（コノネン，Ｊ．（Ｋｏｎｏｎｅｎ，Ｊ．）ら、「Ｎａｔ Ｍｅｄ」４、８４４〜７ページ、１９９８年）に既に記載のとおり構成した。パラフィン−包理化ブロック（ドナーブロック）で形態学的に典型的な領域を注意して選択した後、１．６ｍｍのコア組織生検をパンチ採取し、第２のパラフィン−包理化ブロック（収納ブロック）に移した。腫瘍不均一性および組織損失を克服するために、各腫瘍の異なる領域から３つのコア生検を実施した。脱パラフィンの後、切片を１０分間、メタノールと０．６％過酸化水素との中で、ＲＴでインキュベートし、続いてＰＢＳ溶液で洗浄した。スライドを０．０１Ｍクエン酸緩衝剤ｐＨ６．０中で、３分間煮沸した。抗体でのインキュベーションを１時間かけてＲＴで行った。免疫ペルオキシダーゼ染色については、第２の試薬は、ＨＲＰに接合したヤギｌｇ抗ウサギまたは抗マウスｌｇＧ（ジャックソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））であり、続いて、ストレプトＡＢコンプレックス（ｓｔｒｅｐｔＡＢＣｏｍｐｌｅｘ）／ＨＲＰ（ダコ（Ｄａｋｏ））および３−アミノ−９−エチルカルバゾール基質（シグマ（Ｓｉｇｍａ））であった。２色免疫蛍光染色については、ＦＩＴＣまたはフィコエリトリンに接合したアイソタイプ−特異的ヤギ抗マウス血清（ジャックソンイムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ ｌｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ））およびアレクサ（Ａｌｅｘａ）−４８８に接合したヤギｌｇ抗ウサギｌｇＧ（オランダレイデンのモレキュラープローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いた。イメージを、光または蛍光顕微鏡下にアクシオフォト（Ａｘｉｏｐｈｏｔ）１（独国オベルコーエンのカールザイス社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））で可視化し、アクシオカム（ａｘｉｏｃａｍ）（カールザイス社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ））カラーＣＣＤカメラで撮影し、およびアクシオビジョン（ａｘｉｏＶｉｓｉｏｎ）（商標）ソフトウェア（カールザイス社（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ））がインストールされたペンティアムＩＩＩ（Ｐｅｎｔｉｕｍ Ｉｌｌ）コンピュータで処理した。細胞染色について、細胞をマウスの腸管に注入した。注入された腸管をパラフィン中に固定および包理した。得られたブロックを、次いで、免疫染色のために基準組織として処理した。
【００４８】
患者経過観察および統計学的分析
ＤＬＢＣＬと診断されたすべての患者を見て、それらの標本をジュネーブ大学病院（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）およびバーゼル大学病院（Ｂａｓｅｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で採取した。これらの患者からの臨床的データの、遡及研究を実施した。プロジェクトは、ジュネーブ大学病院倫理委員会（Ｇｅｎｅｖａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によってレビューされ承認された。病期、乳酸塩脱水素酵素レベル、ＤＬＢＣＬサブタイプおよび年齢は、チャートレビューにより得た。生検の日のインサイチュＡＰＲＩＬ発現は上記のとおり記録した。生存率は、生検の日からリンパ腫による死亡の日までで計測した。共羅患率が患者の除外をもたらした。最後の経過観察日に生存していた患者については評価を打ち切った（曲線上のチェックマーク）。カプランマイヤー全生存率曲線を、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェア（グラフパッドソフトウェア社（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗｅａｒ ｉｎｃ．）で実施した。群間での比較は対数ランク統計学的テストに基づいていた。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
図面の簡単な説明
【図１】分泌されたＡＰＲＩＬおよびＡＰＲＩＬを産生する細胞を同定する抗ＡＰＲＩＬ抗体の特徴付け（ａ）ＩＨＣ−陽性および陰性ＤＬＢＣＬ組織サンプルからの抽出物（２０μｇ）を、Ａｐｒｉｌｙ−２（２μｇ／ｍｌ）およびＳｔａｌｋ−１（５μｇ／ｍｌ）でウェスタンブロット法により分析した。分泌されたＡＰＲＩＬに関連する１８ｋＤａのバンドがＡｐｒｉｌｙ−２で明らかにされ（左パネル）、一方で、Ｓｔａｌｋ−１が１４ｋＤａのバンドを同定する（中央パネル）。同様の１４ｋＤａ反応性を、Ｓｔａｌｋ−１でＤＣ溶解物（２０μｇ）上に観察した（右パネル）。反応性は、３つのＩＨＣ−陽性および２つのＩＨＣ−陰性腫瘍溶解物を表す。（ｂ）ウェスタンブロット特異性を阻止実験で確認した。Ａｐｒｉｌｙ−２を、１０μｇ／ｍｌのａｃｒｐＡＰＲｌＬ（ＡＣＲＰ３０［１６−１０８］に融合したＡＰＲＩＬ［８８−２３３］）またはａｃｒｐＣＴＲＬでプレインキュベートした。Ｓｔａｌｋ−１を、ウェスタンブロット分析の前に、１０μｇ／ｍｌのストークペプチドまたは無関係のペプチドとプレインキュベートした。
【図２】細胞プロテオグリカンがＡＰＲＩＬ分泌を阻害する（ａ）マウス肉腫（１μｇ／ｍｌ）からの被覆ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）への三量体ＡＰＲＩＬＡ８８およびＡＰＲＩＬＨ９８の結合を、エライザ（ＥＬＩＳＡ）においてＡｐｒｉｌｙ−９（１μｇ／ｍｌ）で明らかにした。（ｂ）２９３Ｔ細胞を、ＡＰＲＩＬＡ８８またはＡＰＲＩＬＨ９８をコードするプラスミドで形質移入した。３日後に細胞を回収し、固定／透過処理し、およびＡｐｒｉｌｙ−１で染色した。蛍光をフローサイトメトリにより分析した。上澄を回収し、サンドイッチエライザ（ＥＬＩＳＡ）において、捕獲としてＢＣＭＡ−ｌｇで定量化し、および検出としてＡｐｒｉｌｙ−５で定量化した。（ｃ）ａｃｒｐＡＰＲＩＬＡ８８の結合を健常なドナーから単離したＰＭＮで評価し、フローサイトメトリにより分析した。Ａｃｒｐ３０を陰性対照（ＣＴＲＬ）として用いた。ａｃｒｐＡＰＲｌＬＡ８８の、ヘパリン［Ｈ］（１／１００）の存在下または非存在下でのＬ３６３への結合が陽性対照として示される。Ａｐｒｉｌｙ−１、Ａｐｒｉｌｙ−５およびＡｐｒｉｌｙ−９は、Ａｐｒｉｌｙ−２に関連する可溶性ＡＰＲＩＬに対するモノクローナル抗体である。
【図３】ＤＬＢＣＬ腫瘍細胞は、ＢＣＭＡおよびプロテオグリカン共受容体を発現する（ａ）ＤＬＢＣＬ系におけるＴＡＣＩ、ＢＣＭＡおよびＡＰＲＩＬｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲにより分析した（４０サイクル）。陽性対照（＋）は、ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡについては末梢ＣＤ１９＋Ｂ細胞であり、ＡＰＲＩＬについてはＤＣであった。Ｈ２Ｏを陰性対照として用いた。（ｂ）抗ＴＡＣＩおよびＢＣＭＡ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）の特異性が、形質移入された２９３Ｔ細胞で示されている。（ｃ）ＤＬＢＣＬ系でのＡＰＲＩＬ−Ｒ発現のフローサイトメトリ分析を、示した試薬で実施した。無処置細胞での表面発現が示されている。ＢＣＭＡについては、細胞透過処理後の総発現もまた示されている。対照染色（ｌｇＧ１アイソタイプ対照）が点線で示されている。 ａｃｒｐＡＰＲｌＬの結合で得られたデータが太線で示され、およびヘパリン［Ｈ］（１／１００）またはＢＣＭＡ−ｌｇ（５０μｇ／ｍｌ）（細線）でプレインキュベートされた場合に細線で示される。対照染色（ａｃｒｐＣＴＲＬ）は点線で示されている。ＳＵ−ＤＨＬ−４および−７が、ＯＣＩ−Ｌｙ７への同等の染色を有していた。
【図４】ＤＬＢＣＬ患者における高ＡＰＲＩＬ発現は、生存率の低下と関連しているＡＰＲＩＬ発現に応じて層別化した患者において生存率を遡及的に調べた。（ａ）すべての患者。点線：低ＡＰＲＩＬ、普通線：高ＡＰＲＩＬ。Ｓ＝全生存率、月（ｍ）での時間（Ｔ）。（ｂ）＞６０歳およびＩＰＩ＞２の高いリスクの患者。点線：低ＡＰＲＩＬ、普通線：高ＡＰＲＩＬ。Ｓ＝全生存率、ＤｆＳ＝無病生存率、月（ｍ）での時間（Ｔ）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性ＡＰＲＩＬに対して向けられるモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２。
【請求項２】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３５００で寄託されたモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２と、ＡＰＲＩＬのストーク断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体との組み合わせの、高いリスクを有する患者の、Ｂ細胞リンパ腫病原力の診断およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の臨床的進行の予後における使用。
【請求項４】
国際予後指標 ＞２を有する患者におけるＢ細胞リンパ腫の臨床的進行の予後における、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
６０歳を超える患者におけるＢ細胞リンパ腫の臨床的進行の予後における、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
ポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１およびモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２の組み合わせの、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
Ｂ細胞リンパ腫生検標本が、請求項１に記載のモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２の結合、およびＡＰＲＩＬのストーク（ｓｔａｌｋ）断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の結合について分析され、およびこれらの２種の抗体が標本に結合している場合に高悪性形態と診断されるＢ細胞リンパ腫の高悪性形態の診断方法。
【請求項８】
ＡＰＲＩＬのストーク断片に対する抗体がポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アミノ酸配列ＧＴＧＧＰＳＱＮＧＥＧＹＰ（配列番号１）。
【請求項１０】
請求項１に記載のモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２およびＡＰＲＩＬのストーク断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含むキット。
【請求項１１】
ポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１およびモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１】
可溶性ＡＰＲＩＬに対して向けられるモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２。
【請求項２】
ＣＮＣＭに番号Ｉ−３５００で寄託されたモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２を産生するハイブリドーマ細胞。
【請求項３】
請求項１に記載のモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２と、ＡＰＲＩＬのストーク断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体との組み合わせの、高いリスクを有する患者の、Ｂ細胞リンパ腫病原力の診断およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫の臨床的進行の予後における使用。
【請求項４】
国際予後指標 ＞２を有する患者におけるＢ細胞リンパ腫の臨床的進行の予後における、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
６０歳を超える患者におけるＢ細胞リンパ腫の臨床的進行の予後における、請求項３に記載の使用。
【請求項６】
ポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１およびモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２の組み合わせの、請求項３に記載の使用。
【請求項７】
Ｂ細胞リンパ腫生検標本が、請求項１に記載のモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２の結合、およびＡＰＲＩＬのストーク（ｓｔａｌｋ）断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体の結合について分析され、およびこれらの２種の抗体が標本に結合している場合に高悪性形態と診断されるＢ細胞リンパ腫の高悪性形態の診断方法。
【請求項８】
ＡＰＲＩＬのストーク断片に対する抗体がポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
アミノ酸配列ＧＴＧＧＰＳＱＮＧＥＧＹＰ（配列番号１）。
【請求項１０】
請求項１に記載のモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２およびＡＰＲＩＬのストーク断片に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体を含むキット。
【請求項１１】
ポリクローナル抗体Ｓｔａｌｋ−１およびモノクローナル抗体Ａｐｒｉｌｙ−２を含む、請求項１０に記載のキット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２００９−５０９９４８（Ｐ２００９−５０９９４８Ａ）
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３１７０８（Ｐ２００８−５３１７０８）
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６６２５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９４８９
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ペンティアム
２．ＰＥＮＴＩＵＭ
【出願人】（５０８０９００３３）アポテック コーポレーション (1)
【出願人】（５０３４６９３８２）ユニバーシティ オブ ジュネーブ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１２日（２００９．３．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月２２日（２００６．９．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６６６２５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０３９４８９
【国際公開日】平成１９年４月１２日（２００７．４．１２）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ペンティアム
２．ＰＥＮＴＩＵＭ
【出願人】（５０８０９００３３）アポテック コーポレーション (1)
【出願人】（５０３４６９３８２）ユニバーシティ オブ ジュネーブ (2)
【Ｆターム（参考）】
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