ルシフェラーゼ
【課題】Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓの野生型ルシフェラーゼよりも高い熱安定性を具えたルシフェラーゼ活性保有タンパク質を提供する。また発現させるＤＮＡ、ベクター及び細胞並びに本タンパク質を用いる発光アッセイの実施のための試験キット及び試薬も提供する。
【解決手段】Ｐ． ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４位またはＬｕｃｉｏｌａ属ルシフェラーゼの３５６位に位置するグルタミン酸と同等のグルタミン酸を代替アミノ酸、特にリシンで置換する。さらに好ましくは、Ｐ． ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの２１５位またはＬｕｃｉｏｌａ属ルシフェラーゼの２１７位と同等の位置に第二の置換アミノ酸を有する。
【解決手段】Ｐ． ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４位またはＬｕｃｉｏｌａ属ルシフェラーゼの３５６位に位置するグルタミン酸と同等のグルタミン酸を代替アミノ酸、特にリシンで置換する。さらに好ましくは、Ｐ． ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの２１５位またはＬｕｃｉｏｌａ属ルシフェラーゼの２１７位と同等の位置に第二の置換アミノ酸を有する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェラーゼ活性を有する新規なタンパク質、及び該タンパク質の発現をコードするＤＮＡ及びベクターに係わる。本発明は特に、３０℃を越える温度下で熱安定性を有するルシフェラーゼを提供する。
【０００２】
ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋及び酸素分子の存在下にルシフェリンの酸化を触媒し、その結果光を発生させる。この反応の量子収率は約０．８８であり［ＤｅＬｕｃａ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９７８）並びにＳｅｌｉｇｅｒ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９６０）参照］、上記発光特性はＡＴＰレベルを測定する発光測定（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイで用いられている。
【０００３】
ルシフェラーゼはホタルまたはツチボタルといった昆虫の体から直接取得可能であり、あるいはまた該酵素をコードする組み換えＤＮＡ構築物を保有する微生物からの発現によって取得可能である。この酵素を取得できる、またはこの酵素をコードするＤＮＡを得ることができる四つの重要なホタル種は、日本のゲンジボタルＬｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びヘイケボタルＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ、東ヨーロッパのホタルＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、並びに北アメリカのホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）である。ツチボタルＬａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａもルシフェラーゼ供給源の一つであり、そのルシフェラーゼのアミノ酸配列はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのものに対して８４％の相同性を有する。
【０００４】
野生型ルシフェラーゼ及び組み換えルシフェラーゼの熱安定性は、これらのルシフェラーゼを３０℃を越える、特に３５℃より高い温度に曝露するとその活性がきわめて急激に失われるようなものである。このような不安定性は、上記酵素を高い周囲温度の下で使用もしくは貯蔵する場合、または加熱によって反応速度を高めなければならない場合当該酵素の欠点となる。日本ホタルのルシフェラーゼをその２１７位において突然変異させてトレオニン残基をイソロイシン残基によって置換すれば該ルシフェラーゼを熱失活に対して安定化できることが知られている（Ｋａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２， ｐｐ．１３７９５−１３７９９， １９９３）。上記のようにして、酵素の熱及びｐＨ安定性並びに比活性が高められた。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａの熱安定化は未だ報告されていない。
【０００５】
本発明者はここに、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ及びＬｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａのいずれもが保存する配列中に存在するグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）残基を代替アミノ酸、特にリシンまたはアルギニンで置換することによって、野生型ルシフェラーゼより高い熱安定性を有する新規なルシフェラーゼを提供する。上記グルタミン酸はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４位に見出されるもので、前記種及び他の種のルシフェラーゼ中に見出される保存アミノ酸配列ＴＰＥＧＤＤＫＰＧＡの３番目のアミノ酸である。
【０００６】
即ち、本発明はその第一の態様において、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質で、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのそのようなタンパク質に対して６０％を越えるアミノ酸配列相同性を有するタンパク質を提供し、このタンパク質はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５４またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５６に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする。
【０００７】
上記アミノ酸は天然アミノ酸であっても、また天然アミノ酸の修飾体や天然アミノ酸の類似体といったいわゆる非一般的アミノ酸であってもよい。グルタミン酸以外のアミノ酸の類似体とは、タンパク質への作用において元のアミノ酸と同等である化合物のことであると理解される。典型的な非一般的アミノ酸は、“ＵＳ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔｉｎ Ｍａｎｕａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｕｌｅｓ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｉｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｃａｓｅｓ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ／ｏｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｕｎｕｓｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ”に示されているものである。
【０００８】
好ましくは、本発明のタンパク質はアミノ酸配列ＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、この配列中のＸはグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする。更に好ましくは、本発明のタンパク質はアミノ酸配列ＴＰＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、その際Ｘは熱安定性の観点から、アスパラギン酸、プロリンまたはグリシン以外の任意のアミノ酸であることが好ましい。更に好ましくは、Ｘはトリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはアスパラギンであるが、リシンもしくはアルギニンまたはそのいずれかの類似体であれば最も好ましい。
【０００９】
上記保存ＴＰＸＧＤＤＫＰＡ領域中１個または２個のアミノ酸が相違するルシフェラーゼを有し得る種は幾つか存在するが、前記配列の３位のアミノ酸がグルタミン酸でないように改変されたルシフェラーゼに対応する活性タンパク質は総て本発明により提供されることは明らかである。
【００１０】
本発明の好ましい態様において、本発明のタンパク質は、Ｌｕｃｉｏｌａ属ホタルルシフェラーゼのアミノ酸２１７またはＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸２１５に対応する位置のアミノ酸が、ヨーロッパ特許出願公開第０５２４４４８号に開示されているような疎水性アミノ酸、好ましくはイソロイシン、ロイシンまたはバリンに変更されたアミノ酸を有する。このような変更を行なうと、３５４位の変更のみの場合よりも熱安定性が向上することが判明した。即ち、これら二つの変更は実質的に互いに独立で、しかも併用可能な効果を有する。
【００１１】
本発明は第二の態様において、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを提供し、また第三の態様では、本発明のタンパク質を発現し得るような形態を有する、ｌｕｃ遺伝子（ルシフェラーゼをコードする遺伝子）を含むベクター、特にプラスミドを提供する。上記のような形態とは、ベクターが本発明のタンパク質の発現を制御し得るＤＮＡ配列を、微生物宿主細胞への導入時に前記タンパク質が、必要であれば適当な誘導物質の添加により、必要に応じて容易に発現され得るように含む形態のことである。
【００１２】
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのｌｕｃ遺伝子はいずれも公知であり、かつ標準的な分子生物学的技術で単離可能である。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのｌｕｃ遺伝子はＰｒｏｍｅｇａから、プラスミドｐＧＥＭとして市販されている。即ち、本発明のＤＮＡの調製に用いる出発物質を得るのに好ましい方法及び供給源は、（ｉ）天然のホタルゲノムＤＮＡを用い、このＤＮＡから得たｌｕｃ遺伝子を、例えばＰＣＲを用いて増幅すること、（ｉｉ）ｐＧＥＭ、及び（ｉｉｉ）Ｋａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏのｐＧＬｆ３７プラスミドである。ルシフェラーゼ活性、即ちルシフェリンを酸化させて発光を実現する活性を有するタンパク質をコードする更に別の遺伝子も、本発明のＤＮＡを得、かつ遺伝子発現によって究極的に本発明のタンパク質を得るための出発物質の適当な供給源である。
【００１３】
本発明のＤＮＡを調製するべく野生型または他の種類のｌｕｃ遺伝子を操作する上で用いるのに適したベクターは、天然グルタミン酸の代替アミノ酸への改変が行なわれる一方で、ＤＮＡを内部に含み得る任意のベクターである。例えばヒドロキシルアミンなどの薬剤を用いて化学的に誘発される突然変異の場合、ベクターは特に重要でなく、突然変異誘発過程前後の遺伝子操作を容易にする適当なベクターは当業者であれば多数想起できよう。
【００１４】
ｌｕｃ遺伝子を前記グルタミン酸において特異的に突然変異させることが好ましく、即ち部位特異的突然変異誘発操作が必要となる。この操作はベクターにおいて最も容易に実施でき、当業者にも良く知られている。
【００１５】
野生型、及び公知のｌｕｃ遺伝子、並びに本発明のｌｕｃ遺伝子の発現に適したベクターには、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能）及びｐＴ７−７が含まれる。先の２種は、発現がイソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在によって誘発されることを可能にするラクトースリプレッサーの制御下にｔａｃプロモーターを有する。ｐＴ７−７はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターによる制御を可能にし、即ちＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを有する大腸菌細胞におけるきわめて高レベルの遺伝子発現の基礎となる。これらのベクターうちで、ｐＴ７−７ベクターにｌｕｃ遺伝子を挿入した場合に発現が最高となることが判明した。
【００１６】
ｐＫＫ２２３−３及びｐＤＲ５４０に挿入されたｌｕｃ遺伝子由来のルシフェラーゼの発現は野生型Ｎ末端配列ルシフェラーゼの発現をもたらし、一方ｐＴ７−７に挿入されたｌｕｃ遺伝子の発現は余分のＮ末端アミノ酸Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｉ−Ｑとの融合タンパク質の合成をもたらす。ｌｕｃ遺伝子を含有するベクター（構築物ｐＰＷ２０４、ｐＰＷ１１６及びｐＰＷ３０４と呼称する）それぞれにおけるｌｕｃ遺伝子のリボソーム結合部位及び開始コドンを、実施例の表１に示す。
【００１７】
本発明はその第三の態様において、本発明のタンパク質を発現させ得る細胞、該細胞を用いて本発明のタンパク質を製造する方法、並びに本発明のタンパク質を含む試験キット及び試薬を提供する。本発明はまた、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いてＡＴＰを測定する、当業者に良く知られたアッセイ方法であって、ルシフェラーゼが本発明のタンパク質であることを特徴とする方法も提供する。本発明のルシフェラーゼ調製物は３０〜７０℃、特に３７〜６０℃、更には４０〜５０℃において、野生型ルシフェラーゼ及び組み換え野生型ルシフェラーゼに比較してより熱安定性である。
【００１８】
本発明のタンパク質の発現には、細胞自身のＤＮＡ中にか、または細胞内に導入されたプラスミドなどのベクター中に存在するＤＮＡ配列を用いて異種タンパク質を発現させ得る任意の細胞を用い得る。このような細胞は典型的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞などの酵母細胞及び大腸菌細胞などの細菌細胞であるが、タンパク質発現という目的に適った宿主生物は当業者ならほかにも多数想起できよう。タンパク質が昆虫タンパク質であるので、昆虫細胞が好ましいともいえる。タンパク質は、天然ルシフェラーゼ及び公知の組み換えルシフェラーゼに類似の構造を有するタンパク質として発現されてもよく、または前記のようなタンパク質と、他のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、または他の化学実体、例えば先に触れたＭ−Ａ−Ｒ−Ｉ−Ｑ配列との融合体または結合体として発現されてもよい。
【００１９】
或る種の宿主は特定の優先コドンを持ち、例えば細菌は場合によっては酵母とは異なるコドンを用いるので、前記のような宿主に導入するＤＮＡは、所与のアミノ酸に関して当該宿主における発現をより好ましく実現する縮重コドンが得られるように改変すれば有利であり得ることは、当業者には明らかであろう。そのような縮重ＤＮＡは当然ながら、本発明のＤＮＡの範囲に含まれる。
【００２０】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は適当な宿主の一つで、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にその染色体に安定に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを有し、即ちこの宿主はｐＴ７−７由来の構築物と適合性である。ＢＬ２１のような大腸菌Ｂ株は、ｌｏｎプロテアーゼ及びｏｍｐＴ外膜プロテアーゼを欠く。これらの欠失は、大腸菌における外来タンパク質の発現及び蓄積を安定化する一助となり得る。先に述べた３種の発現構築物をそれぞれ保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の粗抽出物をアッセイしたところ、最高レベルのルシフェラーゼ発現は構築物ｐＰＷ３０４を保有する細胞において実現することが判明した（表２参照）。
【００２１】
本発明の突然変異タンパク質は熱安定性以外の利点も有する。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属３５４位／Ｌｕｃｉｏｌａ属３５６位のアミノ酸を突然変異させると、いずれのアミノ酸または類似体でグルタミン酸を置換するかに依存してルシフェリンの酸化の際に発せられる光の波長が変化することが判明した。即ち、本発明は、特異的結合物質のラベルとして用いるルシフェラーゼ、またはそのタンパク質産物が用いられるルシフェリン酸化の際に特定波長の光として自身の存在（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を報告し返すリポーター遺伝子も提供する。上記のような特性の獲得では、グリシン、プロリン及びアスパラギン酸などを用いる突然変異も利用できる。本発明のタンパク質はまた、その熱安定性が向上することから、後段に例示するように比較的高温、例えば３７℃以上の温度の下でも対応して向上した収率で製造可能であるという利点も有する。
【００２２】
本発明のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター及び細胞の一例を、次の非限定的実施例、添付図面、諸表及び配列表を参照しつつ以下に詳述する。別のタンパク質、タンパク質結合体、ＤＮＡ、ベクター及び細胞、並びにこれらのうちのいずれかを包含するアッセイ及び試験キットも、ここに説明するものに照らせば当業者には想起されよう。
【００２３】
図面の簡単な説明
図１は後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＫＫ２２３−３から得たプラスミドｐＰＷ２０４の制限酵素地図である。
【００２４】
図２は後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＤＲ５４０から得たプラスミドｐＰＷ１１６の制限酵素地図である。
【００２５】
図３は後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＴ７−７から得たプラスミドｐＰＷ３０４の制限酵素地図である。
【００２６】
図４はｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位を除去したｐＧＥＭ−ｌｕｃ由来のＢａｍＨ１／Ｓｓｔ１断片とから得たプラスミドｐＰＷ６０１ａの制限酵素地図である。
【００２７】
図５は実施例に後述するように所与の温度で２０分間インキュベートした組み換え及び野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）の熱失活のグラフである。
【００２８】
図６は異なる温度下で増殖させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＰＷ３０４の粗抽出物中のルシフェラーゼ活性のグラフである。
【００２９】
図７はｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１（グルタミン酸３５４がリシンで置換されるようにコードする本発明のプラスミド）に由来するルシフェラーゼ活性の熱失活のグラフである。
【００３０】
図８はＳｉｇｍａ野生型、ｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１組み換えルシフェラーゼの３７℃での経時失活のグラフである。
【００３１】
図９はＴａｂｏｒから得たｐＴ７−７の制限酵素地図である。
【００３２】
図１０は野生型の３５４位のグルタミン酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン、ヒスチジン、アスパラギン、メチオニン、アルギニン、リシン、セリン、トレオニン及びシステインでそれぞれ置換されたルシフェラーゼを発現する本発明のルシフェラーゼ発現大腸菌の粗細胞抽出物活性の、４０℃のＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液中での熱活失を示すグラフである。
【００３３】
図１１はＥ３５４Ｋリシン変更及びＡ２１５Ｌロイシン変更を有する精製二重突然変異ルシフェラーゼ活性のリン酸緩衝液中４７℃での熱失活を、単一突然変異体Ａ２１５Ｌ及びＥ３５４Ｋと比較して示すグラフである。
【００３４】
図１２は０．０２％アジドを加えたｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液中３７℃におけるリシンＥ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ、組み換え野生型ルシフェラーゼ及び天然ホタルルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の経時変化を示すグラフである。
【００３５】
図１３は組み換え野生型、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異体及びＥ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ二重突然変異体の３７℃でのルシフェラーゼ発現を、培養細胞密度の尺度としての光学密度の上昇をルシフェラーゼ活性に対してプロットすることによって示すグラフである。
【００３６】
図１４は１％ＢＳＡ及び０．０２％アジドを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌのＡ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の５時間にわたる経時変化を示すグラフである。
【００３７】
図１５は１％ＢＳＡ、０．０２％アジド、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＤＴＴを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌのＡ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の５時間にわたる経時変化を示すグラフである。
【００３８】
配列表：
本明細書本文の最後に添付した配列表に、次のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【００３９】
配列番号１には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型の１０６３〜１０６５位に位置するコドンを突然変異させた、本発明のルシフェラーゼをコードするＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。リシンを得るには１０６３位の塩基をＡに突然変異させる。
【００４０】
配列番号２には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型のアミノ酸３５４のグルタミン酸を別のアミノ酸に変更した本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００４１】
配列番号３には、実施例２においてｐＰＷ６０１をＳＤＭ突然変異させ、それによって３５４位にグルタミン酸に替えてリシンを得るのに用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【００４２】
配列番号４には、実施例５においてｐＰＷ６０１をＳＤＭ突然変異させ、それによって２１５位にロイシンを得るのに用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【００４３】
配列番号５には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型のアミノ酸３５４のグルタミン酸を他の任意のアミノ酸に変更し、かつアミノ酸２１５をロイシンに変更した本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【００４４】
実施例１：本発明のＤＮＡを含むプラスミドの作製
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍからプラスミドｐＫＫ２２３−３及びｐＤＲ５４０を得た。ｐＤＲ５４０はＰｈａｒｍａｃｉａからも入手可能である。
【００４５】
マサチューセッツ州、ボストン所在のＨａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、生物化学部のＳｔａｎ Ｔａｂｏｒから、プラスミドｐＴ７−７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第II巻，１６．２．１．章のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ参照）を得たが、該プラスミドは、（図８に示されているように）ｐＴ７−５のＰｖｕIIとＣｌａＩ部位の間に挿入されたＴ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７ ２２８５７〜２２９７２ｂｐ）のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターφ１０及び翻訳開始部位を含んでいる。（５′末端に充填後）融合タンパク質を作製するための単一制限部位は、フレーム０：ＥｃｏＲＩ；フレーム１：ＮｄｅＩ、ＳｍａＩ、ＣｌａＩ；フレーム２：ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ，ＨｉｎｄIIIである。元のポリリンカーのＳａｃＩ部位を欠失により除去し、追加のＸｂａＩ部位を開始コドンの上流に設ける。
【００４６】
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．からホタルルシフェラーゼ（カタログ番号 Ｌ９００９の結晶懸濁液から調製）、補酵素Ａ及びＡＴＰを得た。甲虫ルシフェリンカリウム塩はＰｒｏｍｅｇａから得た。細胞抽出物をＰｒｏｍｅｇａテクニカルブレティン １０１号に記載のように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の一部を細胞溶解試薬（２５ｍＭ トリス−リン酸、ｐＨ７．８、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール、１％ トリトン Ｘ−１００、２．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１．２５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）中で室温で１０分間溶解し、次いでアッセイに先立ち、氷上に保存した。
【００４７】
コロニーをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、次いで該フィルターを、０．５ｍＭ ルシフェリンを含有する１００ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０〔Ｗｏｏｄ ＆ ＤｅＬｕｃａ，（１９８７） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６１ ５０１−５０７ページ〕に浸して、該コロニーが発光する生物発光をモニターして、細胞系のルシフェラーゼ活性をアッセイした。１２５μｌのアッセイ緩衝液（２０ｍＭ トリシン、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ＤＴＴ、０．２７ｍＭ 補酵素Ａ、０．４７ｍＭ ルシフェリン、０．５３ｍＭ ＡＴＰ及び１〜２μｌの試料）を用い、２５℃で、ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイを実施した。アッセイカクテルの最終ｐＨは７．８であり、ＢｉｏＯｒｂｉｔ １２５０ルミノメーターを用いて光測定を行った。
【００４８】
ＤＮＡの非特異的化学突然変異体を作製するために、 Ｋｉｒｏｎｄｅら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９，４２１−４２６ページの方法に従って、０．１ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０中０．８Ｍ ヒドロキシルアミン、１ｍＭ ＥＤＴＡを用い、６５℃で２時間、ｌｕｃ遺伝子を含むプラスミドを処理した。突然変異を起こしたプラスミドをＧ６０ ＤＮＡグレードＮｉｃｋカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【００４９】
ルシフェラーゼ活性を有する粗細胞抽出物を種々の温度で２０分間インキュベートし、残留活性を測定して、熱失活実験を実施した。Ｓｉｇｍａから得た精製ルシフェラーゼを用いた実験では、失活に先立ち、酵素をＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液に希釈した。経時変化実験では、溶解緩衝液中５０μｌの粗細胞抽出物又はＳｉｇｍａルシフェラーゼを含むエッペンドルフ管を３７℃でインキュベートした。アッセイに先立ち、種々の時間に管を取り出し、氷上で冷却した。残留（又は残存）活性は初期の活性の百分率として表した。
【００５０】
各構築物、ｐＰＷ２０４、ｐＰＷ１１６及びｐＰＷ３０４からのルシフェラーゼの相対的発現レベルは、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）では０．１：０．５：１．０である。ＬＢ中３７℃でＯＤ ６００が０．３になるまで細胞を増殖させ、次いで、ＩＰＴＧにより誘発、４時間増殖を継続させた後、粗抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
表１：実施例１に用いた発現構築物のリボソーム結合部位（下線）及び開始コドン
【００５１】
【表１】
【００５２】
以下のプロトコルを用い、グルタミン酸を別のアミノ酸に変換するに必要な部位特異的突然変異誘発を実施した。グルタミン酸からリシンへの突然変異は単一ＡｖａＩ制限部位内に存在し、従って該部位を破壊するので、単一のオリゴヌクレオチドを突然変異誘発及び選択オリゴヌクレオチドとして用いることが可能である。
部位特異的突然変異誘発プロトコル：
選択したプラスミドをリシン用の選択／突然変異誘発オリゴヌクレオチド：５′−ＣＡＴＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＧＴＡＡＴＣＡＧ−３′〔下線を付したＴは不適正（ミスマッチ）塩基である〕で変性・アニーリングする。突然変異ＤＮＡ鎖を合成、連結し、一次制限部位全体をＡｖａＩで消化する。
【００５３】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ２−８９型を用い、細胞、この場合はＥ．ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１−１８突然変異Ｓ細胞への形質転換を実施した。収穫した細胞と、突然変異を起こしたプラスミド及び親プラスミドを含む精製混合プラスミドプールとを得、ＡｖａＩによる二次制限消化を実施して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞に形質転換した。これらの細胞を選択培地（ＬＢ寒天＋５０μｇ／ｍｌ アンピシリン）上に置き、クローンのプラスミドＤＮＡを精製し、ＡｖａＩ制限部位の欠損を分析してクローンのスクリーニングを行った。いずれの場合にも、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７，１５１３ページのアルカリ溶解法を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。厳密なプロトコルは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（ＵＳ）からカタログ番号 Ｋ１６００−１として販売されている、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＲＴＭ部位特異的突然変異誘発キット（バージョン２）に記載の通りであった。
【００５４】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位が破壊されたｐＧＥＭ−ｌｕｃからのＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩフラグメントとから誘導されたｐＰＷ１１６の変異体であるｐＰＷ６０１ａの制限地図を図４に示す。上記のように、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの指示に従って、挿入された野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓのｌｕｃ遺伝子を、発現されたタンパク質のアミノ酸配列が配列番号２に示されているように３５４位でリシンに改変されている配列番号１（１０６３−１０６５はＡＡＧである）に示されている配列に変換するように部位特異的突然変異誘発を実施した。
【００５５】
実施例２：ルシフェラーゼの熱安定性
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて上記のように作製されたベクター中の非改変及び改変（即ち、本発明の）ｌｕｃ遺伝子によって発現された種々のルシフェラーゼの熱安定性を測定し、結果を図５〜図８に示す。
【００５６】
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０％ 硫酸アンモニウム中、４３．５℃で５０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼ活性のｔ１／２（半減期）の比較は、以下のような時間で到達する残留５０％活性を示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
上記数値から明らかなように、３５４グルタミン酸をリシンで置換すると、ルシフェラーゼの熱安定性が少なくとも４３．５％まで増大することがわかる。
【００５９】
実施例３：ルシフェラーゼの熱安定性
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて実施例１に記載のものと類似の方法で作製したベクター中の本発明の他の３５４位突然変異に対応するＳＤＭ改変ｌｕｃ遺伝子により発現された多くのルシフェラーゼの熱安定性を測定し、結果を図１０にグラフで示す。
【００６０】
Ｐｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液中４０℃でｔ１／２の比較を行い、以下のようなｔ１／２（分）の結果を得た：
【００６１】
【表３】
実施例４：３７℃及び室温でのルシフェラーゼの安定性
ｐＰＷ６０１Ｋリシン突然変異ルシフェラーゼ（８６ｎｇ／ｍｌ）、組換え野生型ルシフェラーゼ（５５０ｎｇ／ｍｌ）及び天然型ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）（６２．５ｎｇ／ｍｌ）を、１％ ＢＳＡ、保存剤として０．０２％アジドを含むｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液中３７℃で４時間インキュベートした。残留活性を測定するために、Ｄ−ルシフェリン基質に１ｎｇのルシフェラーゼを加え、１分当たりの発光カウント数を記録した。
【００６２】
３７℃で２時間、室温で１０日間インキュベートした後の残留活性に関する結果を以下に示す。
【００６３】
３７℃で２時間後：
Ｅ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ 残留活性７０％
組換え野生型ルシフェラーゼ 残留活性１２％
Ｓｉｇｍａ天然ルシフェラーゼ 残留活性１８％
室温で１０日後：
Ｅ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ 残留活性８５％
組換え野生型ルシフェラーゼ 残留活性５９％
Ｓｉｇｍａ天然ルシフェラーゼ 残留活性７１％
実施例５：３５４Ｋ：２１５Ｌ二重突然変異体の作製及び安定性
実施例１に記載のように、ｐＰＷ６０１ａ Ｅ３５４Ｋを得、これを、配列番号４のオリゴヌクレオチド、５′−ＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧ−３′〔下線を付した塩基は突然変異を引き起こす不適正（ミスマッチ）塩基を表す〕を用いて突然変異を起こさせ、ｐＰＷ６０１ａ Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４リシン：２１５ロイシン二重突然変異体を作製した。熱失活媒体として１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０％硫酸アンモニウムを含むｐＨ７．８リン酸緩衝液を用い、実施例２から４に記載のようにして、実施例１に記載のものと類似の方法によりＥ．ｃｏｌｉ中で発現させて得られたルシフェラーゼのＤＮＡ配列決定及び熱安定性の測定によりこの突然変異体を確認した。
【００６４】
リン酸緩衝液中４３．５℃では、３２分間にわたる活性の損失は５％未満であったのに対し、４７℃では、ｔ１／２は約３８分であった。５０℃では、二重突然変異体は、１６分間のインキュベーション後に１５％の活性を保持している。この失活テストの結果を図１２にグラフで示す。
【００６５】
実施例６：ルシフェラーゼの精製
組換え野生型又は突然変異ルシフェラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中３０℃で増殖させ、初期対数増殖期の間にＩＰＴＧ（１ｍＭ）により誘発させた。中間の静止期に細胞を収穫し、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ジチオトレイトール、１．２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）に再懸濁した。ＭＳＥ ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０音波処理装置（振幅：１４μ）中で細胞を破壊し、細胞溶解物を３０，０００×ｇで３０分間遠心した。次いで、粗抽出物の上清を硫酸アンモニウムで分画し、３５〜５５％飽和の間に沈殿した画分が、ルシフェラーゼ活性を含むことが見いだされ、緩衝液Ａに溶解した。
【００６６】
０．５ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ）中で平衡にしたＰｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ１０カラムを用いて抽出物を脱塩し、脱塩抽出物をＰｈａｒｍａｃｉａ Ｍｏｎｏ Ｑ アニオン交換カラムにかけ、緩衝液Ｂ中０→５００ｍＭの直線勾配のＮａＣｌを用い流速４ｍｌ／分で２ｍｌの画分として溶離した。ルシフェラーゼ活性のピーク画分を捕集し、長期保存するために、０．５ｍＭ ＤＴＴ及び１２％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。
【００６７】
実施例７：精製ルシフェラーゼの熱失活
実施例６に記載のように、ルシフェラーゼの無細胞抽出物を含むエッペンドルフ管を準備した。精製したルシフェラーゼ調製物（５０μｇ／ｍｌ）を、１０％飽和硫酸アンモニウム、１ｍＭ ジチオトレイトール及び０．２％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８からなる熱安定性緩衝液中でインキュベートした。アッセイに先立ち、設定時間に管を取り出して氷／水浴中で冷却し、定量残留活性を初期活性の百分率として計算した。
【００６８】
４２〜５０℃の温度範囲にわたって熱安定性緩衝液中での失活の半減期を測定して、精製された組換え野生型及び熱安定性ルシフェラーゼのアウレニウスプロットを作成した。次いで、ｔ１／２（分）の自然対数値を１／Ｋに対してプロットした。等しい失活率に対して、 Ｅ３５４Ｋ突然変異体はこの範囲の温度で熱安定性を２℃上昇させるのに対し、Ａ２１５Ｌ突然変異体は５℃上昇させ、二重突然変異体Ｅ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌは６℃上昇させる。後者は、二重突然変異体の付加的性質を示している。
【００６９】
実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉにおいて野生型組換えルシフェラーゼに比べて増大した突然変異ルシフェラーゼの発現
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞におけるルシフェラーゼの発現を液状培地中３７℃での増殖中にモニターした。増殖中に、熱安定性突然変異体を発現する細胞は、組換え野生型酵素を発現する細胞に比べてより高い活性のルシフェラーゼを蓄積することが判明した。図１３は、組換え野生型、Ｅ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ二重突然変異体及びＥ３５４Ｋの培養物について、６００ｎｍで増大する光学密度に対してルシフェラーゼ活性をプロッティングした際の上記作用をグラフで示している。単一及び二重突然変異体の熱安定性が増大すると、培養温度３７℃でのルシフェラーゼの産生が増大し得ることがわかる。
【００７０】
実施例９：３７℃での突然変異ルシフェラーゼの安定性に対する緩衝液の作用
１％ ＢＳＡ及び０．０２％ アジドを含むＨＥＰＥＳ ｐＨ７．７５緩衝液中、Ａ２１５Ｌ、Ｅ３５４Ｋ、Ｅ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ、組換え野生型及びＳｉｇｍａルシフェラーゼそれぞれの１０ｎｇ／ｍｌ溶液を調製し、３７℃での熱安定性を、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＤＴＴを添加した同一組成物と比較した。結果を図１４及び図１５に示す。該結果は、Ａ２１５Ｌ及びＥ３５４Ｋの３７℃での相対安定性が緩衝液によって変化することを示している。
【００７１】
実施例１０：Ｄ−ルシフェリンの酸化により発光した光の波長に対するアミノ酸置換の影響
Ｄ−ルシフェリンを実施例３に記載の種々の本発明ルシフェラーゼで酸化したときに発光した光の波長を測定し、該波長がアミノ酸の突然変異によって変化することを知見した。発光した光の波長は、組換え野生型（Ｅ３５４）とＥ３５４Ｋとでは５ｎｍの変化があり、Ｅ３５４ＫとＥ３５４Ｉとでは約１５ｎｍの変化があった。
【００７２】
野生型組換えＥ．ｃｏｌｉ微生物はＤ−ルシフェリンの存在下に黄緑色の発光を示す。Ｄ−ルシフェリンを加えた場合の各突然変異Ｅ．ｃｏｌｉによる発光色は以下の通りであった：
【００７３】
【表４】
【００７４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＫＫ２２３−３から得たプラスミドｐＰＷ２０４の制限酵素地図である。
【図２】後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＤＲ５４０から得たプラスミドｐＰＷ１１６の制限酵素地図である。
【図３】後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＴ７−７から得たプラスミドｐＰＷ３０４の制限酵素地図である。
【図４】ｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位を除去したｐＧＥＭ−ｌｕｃ由来のＢａｍＨ１／Ｓｓｔ１断片とから得たプラスミドｐＰＷ６０１ａの制限酵素地図である。
【図５】実施例に後述するように所与の温度で２０分間インキュベートした組み換え及び野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）の熱失活のグラフである。
【図６】異なる温度下で増殖させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＰＷ３０４の粗抽出物中のルシフェラーゼ活性のグラフである。
【図７】ｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１（グルタミン酸３５４がリシンで置換されるようにコードする本発明のプラスミド）に由来するルシフェラーゼ活性の熱失活のグラフである。
【図８】Ｓｉｇｍａ野生型、ｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１組み換えルシフェラーゼの３７℃での経時失活のグラフである。
【図９】Ｔａｂｏｒから得たｐＴ７−７の制限酵素地図である。
【図１０】野生型の３５４位のグルタミン酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン、ヒスチジン、アスパラギン、メチオニン、アルギニン、リシン、セリン、トレオニン及びシステインでそれぞれ置換されたルシフェラーゼを発現する本発明のルシフェラーゼ発現大腸菌の粗細胞抽出物活性の、４０℃のＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液中での熱活失を示すグラフである。
【図１１】Ｅ３５４Ｋリシン変更及びＡ２１５Ｌロイシン変更を有する精製二重突然変異ルシフェラーゼ活性のリン酸緩衝液中４７℃での熱失活を、単一突然変異体Ａ２１５Ｌ及びＥ３５４Ｋと比較して示すグラフである。
【図１２】０．０２％アジドを加えたｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液中３７℃におけるリシンＥ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ、組み換え野生型ルシフェラーゼ及び天然ホタルルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の経時変化を示すグラフである。
【図１３】組み換え野生型、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異体及びＥ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ二重突然変異体の３７℃でのルシフェラーゼ発現を、培養細胞密度の尺度としての光学密度の上昇をルシフェラーゼ活性に対してプロットすることによって示すグラフである。
【図１４】１％ＢＳＡ及び０．０２％アジドを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌのＡ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の５時間にわたる経時変化を示すグラフである。
【図１５】１％ＢＳＡ、０．０２％アジド、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＤＴＴを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌのＡ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の５時間にわたる経時変化を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ルシフェラーゼ活性を有する新規なタンパク質、及び該タンパク質の発現をコードするＤＮＡ及びベクターに係わる。本発明は特に、３０℃を越える温度下で熱安定性を有するルシフェラーゼを提供する。
【０００２】
ホタルルシフェラーゼは、ＡＴＰ、Ｍｇ２＋及び酸素分子の存在下にルシフェリンの酸化を触媒し、その結果光を発生させる。この反応の量子収率は約０．８８であり［ＤｅＬｕｃａ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９７８）並びにＳｅｌｉｇｅｒ及びＭｃＥｌｒｏｙ（１９６０）参照］、上記発光特性はＡＴＰレベルを測定する発光測定（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｒｉｃ）アッセイで用いられている。
【０００３】
ルシフェラーゼはホタルまたはツチボタルといった昆虫の体から直接取得可能であり、あるいはまた該酵素をコードする組み換えＤＮＡ構築物を保有する微生物からの発現によって取得可能である。この酵素を取得できる、またはこの酵素をコードするＤＮＡを得ることができる四つの重要なホタル種は、日本のゲンジボタルＬｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びヘイケボタルＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ、東ヨーロッパのホタルＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、並びに北アメリカのホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ）である。ツチボタルＬａｍｐｙｒｉｓ ｎｏｃｔｉｌｕｃａもルシフェラーゼ供給源の一つであり、そのルシフェラーゼのアミノ酸配列はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのものに対して８４％の相同性を有する。
【０００４】
野生型ルシフェラーゼ及び組み換えルシフェラーゼの熱安定性は、これらのルシフェラーゼを３０℃を越える、特に３５℃より高い温度に曝露するとその活性がきわめて急激に失われるようなものである。このような不安定性は、上記酵素を高い周囲温度の下で使用もしくは貯蔵する場合、または加熱によって反応速度を高めなければならない場合当該酵素の欠点となる。日本ホタルのルシフェラーゼをその２１７位において突然変異させてトレオニン残基をイソロイシン残基によって置換すれば該ルシフェラーゼを熱失活に対して安定化できることが知られている（Ｋａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２， ｐｐ．１３７９５−１３７９９， １９９３）。上記のようにして、酵素の熱及びｐＨ安定性並びに比活性が高められた。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ及びＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａの熱安定化は未だ報告されていない。
【０００５】
本発明者はここに、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ及びＬｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａのいずれもが保存する配列中に存在するグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）残基を代替アミノ酸、特にリシンまたはアルギニンで置換することによって、野生型ルシフェラーゼより高い熱安定性を有する新規なルシフェラーゼを提供する。上記グルタミン酸はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４位に見出されるもので、前記種及び他の種のルシフェラーゼ中に見出される保存アミノ酸配列ＴＰＥＧＤＤＫＰＧＡの３番目のアミノ酸である。
【０００６】
即ち、本発明はその第一の態様において、ルシフェラーゼ活性を有するタンパク質で、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのそのようなタンパク質に対して６０％を越えるアミノ酸配列相同性を有するタンパク質を提供し、このタンパク質はＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５４またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５６に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする。
【０００７】
上記アミノ酸は天然アミノ酸であっても、また天然アミノ酸の修飾体や天然アミノ酸の類似体といったいわゆる非一般的アミノ酸であってもよい。グルタミン酸以外のアミノ酸の類似体とは、タンパク質への作用において元のアミノ酸と同等である化合物のことであると理解される。典型的な非一般的アミノ酸は、“ＵＳ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔｉｎ Ｍａｎｕａｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｒｕｌｅｓ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｉｎ Ｐａｔｅｎｔ Ｃａｓｅｓ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ／ｏｒ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ： ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｕｎｕｓｕａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ”に示されているものである。
【０００８】
好ましくは、本発明のタンパク質はアミノ酸配列ＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、この配列中のＸはグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とする。更に好ましくは、本発明のタンパク質はアミノ酸配列ＴＰＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、その際Ｘは熱安定性の観点から、アスパラギン酸、プロリンまたはグリシン以外の任意のアミノ酸であることが好ましい。更に好ましくは、Ｘはトリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシンまたはアスパラギンであるが、リシンもしくはアルギニンまたはそのいずれかの類似体であれば最も好ましい。
【０００９】
上記保存ＴＰＸＧＤＤＫＰＡ領域中１個または２個のアミノ酸が相違するルシフェラーゼを有し得る種は幾つか存在するが、前記配列の３位のアミノ酸がグルタミン酸でないように改変されたルシフェラーゼに対応する活性タンパク質は総て本発明により提供されることは明らかである。
【００１０】
本発明の好ましい態様において、本発明のタンパク質は、Ｌｕｃｉｏｌａ属ホタルルシフェラーゼのアミノ酸２１７またはＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼのアミノ酸２１５に対応する位置のアミノ酸が、ヨーロッパ特許出願公開第０５２４４４８号に開示されているような疎水性アミノ酸、好ましくはイソロイシン、ロイシンまたはバリンに変更されたアミノ酸を有する。このような変更を行なうと、３５４位の変更のみの場合よりも熱安定性が向上することが判明した。即ち、これら二つの変更は実質的に互いに独立で、しかも併用可能な効果を有する。
【００１１】
本発明は第二の態様において、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを提供し、また第三の態様では、本発明のタンパク質を発現し得るような形態を有する、ｌｕｃ遺伝子（ルシフェラーゼをコードする遺伝子）を含むベクター、特にプラスミドを提供する。上記のような形態とは、ベクターが本発明のタンパク質の発現を制御し得るＤＮＡ配列を、微生物宿主細胞への導入時に前記タンパク質が、必要であれば適当な誘導物質の添加により、必要に応じて容易に発現され得るように含む形態のことである。
【００１２】
Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓのｌｕｃ遺伝子はいずれも公知であり、かつ標準的な分子生物学的技術で単離可能である。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのｌｕｃ遺伝子はＰｒｏｍｅｇａから、プラスミドｐＧＥＭとして市販されている。即ち、本発明のＤＮＡの調製に用いる出発物質を得るのに好ましい方法及び供給源は、（ｉ）天然のホタルゲノムＤＮＡを用い、このＤＮＡから得たｌｕｃ遺伝子を、例えばＰＣＲを用いて増幅すること、（ｉｉ）ｐＧＥＭ、及び（ｉｉｉ）Ｋａｊｉｙａｍａ及びＮａｋａｎｏのｐＧＬｆ３７プラスミドである。ルシフェラーゼ活性、即ちルシフェリンを酸化させて発光を実現する活性を有するタンパク質をコードする更に別の遺伝子も、本発明のＤＮＡを得、かつ遺伝子発現によって究極的に本発明のタンパク質を得るための出発物質の適当な供給源である。
【００１３】
本発明のＤＮＡを調製するべく野生型または他の種類のｌｕｃ遺伝子を操作する上で用いるのに適したベクターは、天然グルタミン酸の代替アミノ酸への改変が行なわれる一方で、ＤＮＡを内部に含み得る任意のベクターである。例えばヒドロキシルアミンなどの薬剤を用いて化学的に誘発される突然変異の場合、ベクターは特に重要でなく、突然変異誘発過程前後の遺伝子操作を容易にする適当なベクターは当業者であれば多数想起できよう。
【００１４】
ｌｕｃ遺伝子を前記グルタミン酸において特異的に突然変異させることが好ましく、即ち部位特異的突然変異誘発操作が必要となる。この操作はベクターにおいて最も容易に実施でき、当業者にも良く知られている。
【００１５】
野生型、及び公知のｌｕｃ遺伝子、並びに本発明のｌｕｃ遺伝子の発現に適したベクターには、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能）及びｐＴ７−７が含まれる。先の２種は、発現がイソプロピル−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の存在によって誘発されることを可能にするラクトースリプレッサーの制御下にｔａｃプロモーターを有する。ｐＴ７−７はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターによる制御を可能にし、即ちＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを有する大腸菌細胞におけるきわめて高レベルの遺伝子発現の基礎となる。これらのベクターうちで、ｐＴ７−７ベクターにｌｕｃ遺伝子を挿入した場合に発現が最高となることが判明した。
【００１６】
ｐＫＫ２２３−３及びｐＤＲ５４０に挿入されたｌｕｃ遺伝子由来のルシフェラーゼの発現は野生型Ｎ末端配列ルシフェラーゼの発現をもたらし、一方ｐＴ７−７に挿入されたｌｕｃ遺伝子の発現は余分のＮ末端アミノ酸Ｍ−Ａ−Ｒ−Ｉ−Ｑとの融合タンパク質の合成をもたらす。ｌｕｃ遺伝子を含有するベクター（構築物ｐＰＷ２０４、ｐＰＷ１１６及びｐＰＷ３０４と呼称する）それぞれにおけるｌｕｃ遺伝子のリボソーム結合部位及び開始コドンを、実施例の表１に示す。
【００１７】
本発明はその第三の態様において、本発明のタンパク質を発現させ得る細胞、該細胞を用いて本発明のタンパク質を製造する方法、並びに本発明のタンパク質を含む試験キット及び試薬を提供する。本発明はまた、ルシフェリン／ルシフェラーゼ試薬を用いてＡＴＰを測定する、当業者に良く知られたアッセイ方法であって、ルシフェラーゼが本発明のタンパク質であることを特徴とする方法も提供する。本発明のルシフェラーゼ調製物は３０〜７０℃、特に３７〜６０℃、更には４０〜５０℃において、野生型ルシフェラーゼ及び組み換え野生型ルシフェラーゼに比較してより熱安定性である。
【００１８】
本発明のタンパク質の発現には、細胞自身のＤＮＡ中にか、または細胞内に導入されたプラスミドなどのベクター中に存在するＤＮＡ配列を用いて異種タンパク質を発現させ得る任意の細胞を用い得る。このような細胞は典型的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞などの酵母細胞及び大腸菌細胞などの細菌細胞であるが、タンパク質発現という目的に適った宿主生物は当業者ならほかにも多数想起できよう。タンパク質が昆虫タンパク質であるので、昆虫細胞が好ましいともいえる。タンパク質は、天然ルシフェラーゼ及び公知の組み換えルシフェラーゼに類似の構造を有するタンパク質として発現されてもよく、または前記のようなタンパク質と、他のアミノ酸、ペプチド、タンパク質、または他の化学実体、例えば先に触れたＭ−Ａ−Ｒ−Ｉ−Ｑ配列との融合体または結合体として発現されてもよい。
【００１９】
或る種の宿主は特定の優先コドンを持ち、例えば細菌は場合によっては酵母とは異なるコドンを用いるので、前記のような宿主に導入するＤＮＡは、所与のアミノ酸に関して当該宿主における発現をより好ましく実現する縮重コドンが得られるように改変すれば有利であり得ることは、当業者には明らかであろう。そのような縮重ＤＮＡは当然ながら、本発明のＤＮＡの範囲に含まれる。
【００２０】
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）は適当な宿主の一つで、誘導性ｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にその染色体に安定に組み込まれたＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを有し、即ちこの宿主はｐＴ７−７由来の構築物と適合性である。ＢＬ２１のような大腸菌Ｂ株は、ｌｏｎプロテアーゼ及びｏｍｐＴ外膜プロテアーゼを欠く。これらの欠失は、大腸菌における外来タンパク質の発現及び蓄積を安定化する一助となり得る。先に述べた３種の発現構築物をそれぞれ保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の粗抽出物をアッセイしたところ、最高レベルのルシフェラーゼ発現は構築物ｐＰＷ３０４を保有する細胞において実現することが判明した（表２参照）。
【００２１】
本発明の突然変異タンパク質は熱安定性以外の利点も有する。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属３５４位／Ｌｕｃｉｏｌａ属３５６位のアミノ酸を突然変異させると、いずれのアミノ酸または類似体でグルタミン酸を置換するかに依存してルシフェリンの酸化の際に発せられる光の波長が変化することが判明した。即ち、本発明は、特異的結合物質のラベルとして用いるルシフェラーゼ、またはそのタンパク質産物が用いられるルシフェリン酸化の際に特定波長の光として自身の存在（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を報告し返すリポーター遺伝子も提供する。上記のような特性の獲得では、グリシン、プロリン及びアスパラギン酸などを用いる突然変異も利用できる。本発明のタンパク質はまた、その熱安定性が向上することから、後段に例示するように比較的高温、例えば３７℃以上の温度の下でも対応して向上した収率で製造可能であるという利点も有する。
【００２２】
本発明のタンパク質、ＤＮＡ、ベクター及び細胞の一例を、次の非限定的実施例、添付図面、諸表及び配列表を参照しつつ以下に詳述する。別のタンパク質、タンパク質結合体、ＤＮＡ、ベクター及び細胞、並びにこれらのうちのいずれかを包含するアッセイ及び試験キットも、ここに説明するものに照らせば当業者には想起されよう。
【００２３】
図面の簡単な説明
図１は後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＫＫ２２３−３から得たプラスミドｐＰＷ２０４の制限酵素地図である。
【００２４】
図２は後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＤＲ５４０から得たプラスミドｐＰＷ１１６の制限酵素地図である。
【００２５】
図３は後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＴ７−７から得たプラスミドｐＰＷ３０４の制限酵素地図である。
【００２６】
図４はｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位を除去したｐＧＥＭ−ｌｕｃ由来のＢａｍＨ１／Ｓｓｔ１断片とから得たプラスミドｐＰＷ６０１ａの制限酵素地図である。
【００２７】
図５は実施例に後述するように所与の温度で２０分間インキュベートした組み換え及び野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）の熱失活のグラフである。
【００２８】
図６は異なる温度下で増殖させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＰＷ３０４の粗抽出物中のルシフェラーゼ活性のグラフである。
【００２９】
図７はｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１（グルタミン酸３５４がリシンで置換されるようにコードする本発明のプラスミド）に由来するルシフェラーゼ活性の熱失活のグラフである。
【００３０】
図８はＳｉｇｍａ野生型、ｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１組み換えルシフェラーゼの３７℃での経時失活のグラフである。
【００３１】
図９はＴａｂｏｒから得たｐＴ７−７の制限酵素地図である。
【００３２】
図１０は野生型の３５４位のグルタミン酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン、ヒスチジン、アスパラギン、メチオニン、アルギニン、リシン、セリン、トレオニン及びシステインでそれぞれ置換されたルシフェラーゼを発現する本発明のルシフェラーゼ発現大腸菌の粗細胞抽出物活性の、４０℃のＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液中での熱活失を示すグラフである。
【００３３】
図１１はＥ３５４Ｋリシン変更及びＡ２１５Ｌロイシン変更を有する精製二重突然変異ルシフェラーゼ活性のリン酸緩衝液中４７℃での熱失活を、単一突然変異体Ａ２１５Ｌ及びＥ３５４Ｋと比較して示すグラフである。
【００３４】
図１２は０．０２％アジドを加えたｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液中３７℃におけるリシンＥ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ、組み換え野生型ルシフェラーゼ及び天然ホタルルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の経時変化を示すグラフである。
【００３５】
図１３は組み換え野生型、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異体及びＥ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ二重突然変異体の３７℃でのルシフェラーゼ発現を、培養細胞密度の尺度としての光学密度の上昇をルシフェラーゼ活性に対してプロットすることによって示すグラフである。
【００３６】
図１４は１％ＢＳＡ及び０．０２％アジドを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌのＡ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の５時間にわたる経時変化を示すグラフである。
【００３７】
図１５は１％ＢＳＡ、０．０２％アジド、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＤＴＴを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌのＡ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の５時間にわたる経時変化を示すグラフである。
【００３８】
配列表：
本明細書本文の最後に添付した配列表に、次のＤＮＡ及びアミノ酸配列を示す。
【００３９】
配列番号１には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型の１０６３〜１０６５位に位置するコドンを突然変異させた、本発明のルシフェラーゼをコードするＤＮＡのＤＮＡ配列を示す。リシンを得るには１０６３位の塩基をＡに突然変異させる。
【００４０】
配列番号２には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型のアミノ酸３５４のグルタミン酸を別のアミノ酸に変更した本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【００４１】
配列番号３には、実施例２においてｐＰＷ６０１をＳＤＭ突然変異させ、それによって３５４位にグルタミン酸に替えてリシンを得るのに用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【００４２】
配列番号４には、実施例５においてｐＰＷ６０１をＳＤＭ突然変異させ、それによって２１５位にロイシンを得るのに用いたオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【００４３】
配列番号５には、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ野生型のアミノ酸３５４のグルタミン酸を他の任意のアミノ酸に変更し、かつアミノ酸２１５をロイシンに変更した本発明のタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【実施例】
【００４４】
実施例１：本発明のＤＮＡを含むプラスミドの作製
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍからプラスミドｐＫＫ２２３−３及びｐＤＲ５４０を得た。ｐＤＲ５４０はＰｈａｒｍａｃｉａからも入手可能である。
【００４５】
マサチューセッツ州、ボストン所在のＨａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ、生物化学部のＳｔａｎ Ｔａｂｏｒから、プラスミドｐＴ７−７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第II巻，１６．２．１．章のＣｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ参照）を得たが、該プラスミドは、（図８に示されているように）ｐＴ７−５のＰｖｕIIとＣｌａＩ部位の間に挿入されたＴ７遺伝子１０タンパク質（Ｔ７ ２２８５７〜２２９７２ｂｐ）のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターφ１０及び翻訳開始部位を含んでいる。（５′末端に充填後）融合タンパク質を作製するための単一制限部位は、フレーム０：ＥｃｏＲＩ；フレーム１：ＮｄｅＩ、ＳｍａＩ、ＣｌａＩ；フレーム２：ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩ，ＨｉｎｄIIIである。元のポリリンカーのＳａｃＩ部位を欠失により除去し、追加のＸｂａＩ部位を開始コドンの上流に設ける。
【００４６】
Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．からホタルルシフェラーゼ（カタログ番号 Ｌ９００９の結晶懸濁液から調製）、補酵素Ａ及びＡＴＰを得た。甲虫ルシフェリンカリウム塩はＰｒｏｍｅｇａから得た。細胞抽出物をＰｒｏｍｅｇａテクニカルブレティン １０１号に記載のように調製した。Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の一部を細胞溶解試薬（２５ｍＭ トリス−リン酸、ｐＨ７．８、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロール、１％ トリトン Ｘ−１００、２．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１．２５ｍｇ／ｍｌ リゾチーム）中で室温で１０分間溶解し、次いでアッセイに先立ち、氷上に保存した。
【００４７】
コロニーをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移し、次いで該フィルターを、０．５ｍＭ ルシフェリンを含有する１００ｍＭ クエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．０〔Ｗｏｏｄ ＆ ＤｅＬｕｃａ，（１９８７） Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １６１ ５０１−５０７ページ〕に浸して、該コロニーが発光する生物発光をモニターして、細胞系のルシフェラーゼ活性をアッセイした。１２５μｌのアッセイ緩衝液（２０ｍＭ トリシン、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、３３．３ｍＭ ＤＴＴ、０．２７ｍＭ 補酵素Ａ、０．４７ｍＭ ルシフェリン、０．５３ｍＭ ＡＴＰ及び１〜２μｌの試料）を用い、２５℃で、ｉｎ ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイを実施した。アッセイカクテルの最終ｐＨは７．８であり、ＢｉｏＯｒｂｉｔ １２５０ルミノメーターを用いて光測定を行った。
【００４８】
ＤＮＡの非特異的化学突然変異体を作製するために、 Ｋｉｒｏｎｄｅら（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９，４２１−４２６ページの方法に従って、０．１ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０中０．８Ｍ ヒドロキシルアミン、１ｍＭ ＥＤＴＡを用い、６５℃で２時間、ｌｕｃ遺伝子を含むプラスミドを処理した。突然変異を起こしたプラスミドをＧ６０ ＤＮＡグレードＮｉｃｋカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上で脱塩し、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【００４９】
ルシフェラーゼ活性を有する粗細胞抽出物を種々の温度で２０分間インキュベートし、残留活性を測定して、熱失活実験を実施した。Ｓｉｇｍａから得た精製ルシフェラーゼを用いた実験では、失活に先立ち、酵素をＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液に希釈した。経時変化実験では、溶解緩衝液中５０μｌの粗細胞抽出物又はＳｉｇｍａルシフェラーゼを含むエッペンドルフ管を３７℃でインキュベートした。アッセイに先立ち、種々の時間に管を取り出し、氷上で冷却した。残留（又は残存）活性は初期の活性の百分率として表した。
【００５０】
各構築物、ｐＰＷ２０４、ｐＰＷ１１６及びｐＰＷ３０４からのルシフェラーゼの相対的発現レベルは、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）では０．１：０．５：１．０である。ＬＢ中３７℃でＯＤ ６００が０．３になるまで細胞を増殖させ、次いで、ＩＰＴＧにより誘発、４時間増殖を継続させた後、粗抽出物を調製し、ルシフェラーゼ活性を測定した。
表１：実施例１に用いた発現構築物のリボソーム結合部位（下線）及び開始コドン
【００５１】
【表１】
【００５２】
以下のプロトコルを用い、グルタミン酸を別のアミノ酸に変換するに必要な部位特異的突然変異誘発を実施した。グルタミン酸からリシンへの突然変異は単一ＡｖａＩ制限部位内に存在し、従って該部位を破壊するので、単一のオリゴヌクレオチドを突然変異誘発及び選択オリゴヌクレオチドとして用いることが可能である。
部位特異的突然変異誘発プロトコル：
選択したプラスミドをリシン用の選択／突然変異誘発オリゴヌクレオチド：５′−ＣＡＴＣＣＣＣＣＴＴＧＧＧＴＧＴＡＡＴＣＡＧ−３′〔下線を付したＴは不適正（ミスマッチ）塩基である〕で変性・アニーリングする。突然変異ＤＮＡ鎖を合成、連結し、一次制限部位全体をＡｖａＩで消化する。
【００５３】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ２−８９型を用い、細胞、この場合はＥ．ｃｏｌｉ ＢＭＨ７１−１８突然変異Ｓ細胞への形質転換を実施した。収穫した細胞と、突然変異を起こしたプラスミド及び親プラスミドを含む精製混合プラスミドプールとを得、ＡｖａＩによる二次制限消化を実施して、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞に形質転換した。これらの細胞を選択培地（ＬＢ寒天＋５０μｇ／ｍｌ アンピシリン）上に置き、クローンのプラスミドＤＮＡを精製し、ＡｖａＩ制限部位の欠損を分析してクローンのスクリーニングを行った。いずれの場合にも、Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏｌｙ（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７，１５１３ページのアルカリ溶解法を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。厳密なプロトコルは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ（ＵＳ）からカタログ番号 Ｋ１６００−１として販売されている、ＴｒａｎｓｆｏｒｍｅｒＲＴＭ部位特異的突然変異誘発キット（バージョン２）に記載の通りであった。
【００５４】
Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位が破壊されたｐＧＥＭ−ｌｕｃからのＢａｍＨＩ／ＳｓｔＩフラグメントとから誘導されたｐＰＷ１１６の変異体であるｐＰＷ６０１ａの制限地図を図４に示す。上記のように、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの指示に従って、挿入された野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓのｌｕｃ遺伝子を、発現されたタンパク質のアミノ酸配列が配列番号２に示されているように３５４位でリシンに改変されている配列番号１（１０６３−１０６５はＡＡＧである）に示されている配列に変換するように部位特異的突然変異誘発を実施した。
【００５５】
実施例２：ルシフェラーゼの熱安定性
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて上記のように作製されたベクター中の非改変及び改変（即ち、本発明の）ｌｕｃ遺伝子によって発現された種々のルシフェラーゼの熱安定性を測定し、結果を図５〜図８に示す。
【００５６】
５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０％ 硫酸アンモニウム中、４３．５℃で５０μｇ／ｍｌのルシフェラーゼ活性のｔ１／２（半減期）の比較は、以下のような時間で到達する残留５０％活性を示す。
【００５７】
【表２】
【００５８】
上記数値から明らかなように、３５４グルタミン酸をリシンで置換すると、ルシフェラーゼの熱安定性が少なくとも４３．５％まで増大することがわかる。
【００５９】
実施例３：ルシフェラーゼの熱安定性
Ｅ．ｃｏｌｉにおいて実施例１に記載のものと類似の方法で作製したベクター中の本発明の他の３５４位突然変異に対応するＳＤＭ改変ｌｕｃ遺伝子により発現された多くのルシフェラーゼの熱安定性を測定し、結果を図１０にグラフで示す。
【００６０】
Ｐｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液中４０℃でｔ１／２の比較を行い、以下のようなｔ１／２（分）の結果を得た：
【００６１】
【表３】
実施例４：３７℃及び室温でのルシフェラーゼの安定性
ｐＰＷ６０１Ｋリシン突然変異ルシフェラーゼ（８６ｎｇ／ｍｌ）、組換え野生型ルシフェラーゼ（５５０ｎｇ／ｍｌ）及び天然型ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）（６２．５ｎｇ／ｍｌ）を、１％ ＢＳＡ、保存剤として０．０２％アジドを含むｐＨ７．７５ＨＥＰＥＳ緩衝液中３７℃で４時間インキュベートした。残留活性を測定するために、Ｄ−ルシフェリン基質に１ｎｇのルシフェラーゼを加え、１分当たりの発光カウント数を記録した。
【００６２】
３７℃で２時間、室温で１０日間インキュベートした後の残留活性に関する結果を以下に示す。
【００６３】
３７℃で２時間後：
Ｅ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ 残留活性７０％
組換え野生型ルシフェラーゼ 残留活性１２％
Ｓｉｇｍａ天然ルシフェラーゼ 残留活性１８％
室温で１０日後：
Ｅ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ 残留活性８５％
組換え野生型ルシフェラーゼ 残留活性５９％
Ｓｉｇｍａ天然ルシフェラーゼ 残留活性７１％
実施例５：３５４Ｋ：２１５Ｌ二重突然変異体の作製及び安定性
実施例１に記載のように、ｐＰＷ６０１ａ Ｅ３５４Ｋを得、これを、配列番号４のオリゴヌクレオチド、５′−ＧＡＡＴＣＴＧＡＣＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＣＴＡＴＧＣＧＧ−３′〔下線を付した塩基は突然変異を引き起こす不適正（ミスマッチ）塩基を表す〕を用いて突然変異を起こさせ、ｐＰＷ６０１ａ Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４リシン：２１５ロイシン二重突然変異体を作製した。熱失活媒体として１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、１ｍＭ ＤＴＴ及び１０％硫酸アンモニウムを含むｐＨ７．８リン酸緩衝液を用い、実施例２から４に記載のようにして、実施例１に記載のものと類似の方法によりＥ．ｃｏｌｉ中で発現させて得られたルシフェラーゼのＤＮＡ配列決定及び熱安定性の測定によりこの突然変異体を確認した。
【００６４】
リン酸緩衝液中４３．５℃では、３２分間にわたる活性の損失は５％未満であったのに対し、４７℃では、ｔ１／２は約３８分であった。５０℃では、二重突然変異体は、１６分間のインキュベーション後に１５％の活性を保持している。この失活テストの結果を図１２にグラフで示す。
【００６５】
実施例６：ルシフェラーゼの精製
組換え野生型又は突然変異ルシフェラーゼを発現するＥ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞を、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）中３０℃で増殖させ、初期対数増殖期の間にＩＰＴＧ（１ｍＭ）により誘発させた。中間の静止期に細胞を収穫し、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ジチオトレイトール、１．２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）に再懸濁した。ＭＳＥ ｓｏｎｉｐｒｅｐ １５０音波処理装置（振幅：１４μ）中で細胞を破壊し、細胞溶解物を３０，０００×ｇで３０分間遠心した。次いで、粗抽出物の上清を硫酸アンモニウムで分画し、３５〜５５％飽和の間に沈殿した画分が、ルシフェラーゼ活性を含むことが見いだされ、緩衝液Ａに溶解した。
【００６６】
０．５ｍＭ ＤＴＴを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０（緩衝液Ｂ）中で平衡にしたＰｈａｒｍａｃｉａ ＰＤ１０カラムを用いて抽出物を脱塩し、脱塩抽出物をＰｈａｒｍａｃｉａ Ｍｏｎｏ Ｑ アニオン交換カラムにかけ、緩衝液Ｂ中０→５００ｍＭの直線勾配のＮａＣｌを用い流速４ｍｌ／分で２ｍｌの画分として溶離した。ルシフェラーゼ活性のピーク画分を捕集し、長期保存するために、０．５ｍＭ ＤＴＴ及び１２％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２５ｍＭ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．５に溶解した。
【００６７】
実施例７：精製ルシフェラーゼの熱失活
実施例６に記載のように、ルシフェラーゼの無細胞抽出物を含むエッペンドルフ管を準備した。精製したルシフェラーゼ調製物（５０μｇ／ｍｌ）を、１０％飽和硫酸アンモニウム、１ｍＭ ジチオトレイトール及び０．２％ ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．８からなる熱安定性緩衝液中でインキュベートした。アッセイに先立ち、設定時間に管を取り出して氷／水浴中で冷却し、定量残留活性を初期活性の百分率として計算した。
【００６８】
４２〜５０℃の温度範囲にわたって熱安定性緩衝液中での失活の半減期を測定して、精製された組換え野生型及び熱安定性ルシフェラーゼのアウレニウスプロットを作成した。次いで、ｔ１／２（分）の自然対数値を１／Ｋに対してプロットした。等しい失活率に対して、 Ｅ３５４Ｋ突然変異体はこの範囲の温度で熱安定性を２℃上昇させるのに対し、Ａ２１５Ｌ突然変異体は５℃上昇させ、二重突然変異体Ｅ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌは６℃上昇させる。後者は、二重突然変異体の付加的性質を示している。
【００６９】
実施例８：Ｅ．ｃｏｌｉにおいて野生型組換えルシフェラーゼに比べて増大した突然変異ルシフェラーゼの発現
Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９細胞におけるルシフェラーゼの発現を液状培地中３７℃での増殖中にモニターした。増殖中に、熱安定性突然変異体を発現する細胞は、組換え野生型酵素を発現する細胞に比べてより高い活性のルシフェラーゼを蓄積することが判明した。図１３は、組換え野生型、Ｅ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ二重突然変異体及びＥ３５４Ｋの培養物について、６００ｎｍで増大する光学密度に対してルシフェラーゼ活性をプロッティングした際の上記作用をグラフで示している。単一及び二重突然変異体の熱安定性が増大すると、培養温度３７℃でのルシフェラーゼの産生が増大し得ることがわかる。
【００７０】
実施例９：３７℃での突然変異ルシフェラーゼの安定性に対する緩衝液の作用
１％ ＢＳＡ及び０．０２％ アジドを含むＨＥＰＥＳ ｐＨ７．７５緩衝液中、Ａ２１５Ｌ、Ｅ３５４Ｋ、Ｅ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ、組換え野生型及びＳｉｇｍａルシフェラーゼそれぞれの１０ｎｇ／ｍｌ溶液を調製し、３７℃での熱安定性を、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＤＴＴを添加した同一組成物と比較した。結果を図１４及び図１５に示す。該結果は、Ａ２１５Ｌ及びＥ３５４Ｋの３７℃での相対安定性が緩衝液によって変化することを示している。
【００７１】
実施例１０：Ｄ−ルシフェリンの酸化により発光した光の波長に対するアミノ酸置換の影響
Ｄ−ルシフェリンを実施例３に記載の種々の本発明ルシフェラーゼで酸化したときに発光した光の波長を測定し、該波長がアミノ酸の突然変異によって変化することを知見した。発光した光の波長は、組換え野生型（Ｅ３５４）とＥ３５４Ｋとでは５ｎｍの変化があり、Ｅ３５４ＫとＥ３５４Ｉとでは約１５ｎｍの変化があった。
【００７２】
野生型組換えＥ．ｃｏｌｉ微生物はＤ−ルシフェリンの存在下に黄緑色の発光を示す。Ｄ−ルシフェリンを加えた場合の各突然変異Ｅ．ｃｏｌｉによる発光色は以下の通りであった：
【００７３】
【表４】
【００７４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＫＫ２２３−３から得たプラスミドｐＰＷ２０４の制限酵素地図である。
【図２】後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＤＲ５４０から得たプラスミドｐＰＷ１１６の制限酵素地図である。
【図３】後述の実施例に記載するｌｕｃ遺伝子の挿入によってｐＴ７−７から得たプラスミドｐＰＷ３０４の制限酵素地図である。
【図４】ｐＤＲ５４０と、Ｘｈｏ部位を除去したｐＧＥＭ−ｌｕｃ由来のＢａｍＨ１／Ｓｓｔ１断片とから得たプラスミドｐＰＷ６０１ａの制限酵素地図である。
【図５】実施例に後述するように所与の温度で２０分間インキュベートした組み換え及び野生型Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属ルシフェラーゼ（Ｓｉｇｍａ）の熱失活のグラフである。
【図６】異なる温度下で増殖させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＰＷ３０４の粗抽出物中のルシフェラーゼ活性のグラフである。
【図７】ｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１（グルタミン酸３５４がリシンで置換されるようにコードする本発明のプラスミド）に由来するルシフェラーゼ活性の熱失活のグラフである。
【図８】Ｓｉｇｍａ野生型、ｐＰＷ３０４及びｐＰＷ３０４Ｍ−１組み換えルシフェラーゼの３７℃での経時失活のグラフである。
【図９】Ｔａｂｏｒから得たｐＴ７−７の制限酵素地図である。
【図１０】野生型の３５４位のグルタミン酸がアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、グルタミン、ヒスチジン、アスパラギン、メチオニン、アルギニン、リシン、セリン、トレオニン及びシステインでそれぞれ置換されたルシフェラーゼを発現する本発明のルシフェラーゼ発現大腸菌の粗細胞抽出物活性の、４０℃のＰｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液中での熱活失を示すグラフである。
【図１１】Ｅ３５４Ｋリシン変更及びＡ２１５Ｌロイシン変更を有する精製二重突然変異ルシフェラーゼ活性のリン酸緩衝液中４７℃での熱失活を、単一突然変異体Ａ２１５Ｌ及びＥ３５４Ｋと比較して示すグラフである。
【図１２】０．０２％アジドを加えたｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液中３７℃におけるリシンＥ３５４Ｋ突然変異ルシフェラーゼ、組み換え野生型ルシフェラーゼ及び天然ホタルルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の経時変化を示すグラフである。
【図１３】組み換え野生型、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異体及びＥ３５４Ｋ＋Ａ２１５Ｌ二重突然変異体の３７℃でのルシフェラーゼ発現を、培養細胞密度の尺度としての光学密度の上昇をルシフェラーゼ活性に対してプロットすることによって示すグラフである。
【図１４】１％ＢＳＡ及び０．０２％アジドを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌのＡ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の５時間にわたる経時変化を示すグラフである。
【図１５】１％ＢＳＡ、０．０２％アジド、２ｍＭ ＥＤＴＡ及び２ｍＭ ＤＴＴを含有するｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ中３７℃における、各１０ｎｇ／ｍｌのＡ２１５Ｌ単一突然変異、Ｅ３５４Ｋ単一突然変異、Ａ２１５Ｌ＋Ｅ３５４Ｋ二重突然変異、組み換え及びＳｉｇｍａ野生型ルシフェラーゼの初期活性残存率（％）の５時間にわたる経時変化を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼ活性を有し、かつＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼに対して６０％を越えるアミノ酸配列相同性を有するタンパク質であって、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５４またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５６に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
アミノ酸配列ＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、この配列中のＸはグルタミン酸以外のアミノ酸残基であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
アミノ酸配列ＴＰＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、この配列中のＸはグルタミン酸以外のアミノ酸残基であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
アミノ酸Ｘがグリシン、プロリンまたはアスパラギン酸でないことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
アミノ酸Ｘがトリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びアスパラギンのうちのいずれかであるか、またはこれらのアミノ酸のうちのいずれかの類似体または修飾体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
アミノ酸Ｘがリシン及びアルギニンのいずれか一方であるか、またはこれらのアミノ酸の類似体または修飾体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
配列番号２に示したアミノ酸配列を含み、前記配列中のＸａａは請求項５または６に記載のアミノ酸またはその類似体もしくは修飾体であるタンパク質。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号１に示したヌクレオチド配列を含み、前記配列の１０６３〜１０６５位の３個の塩基Ｎはグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンを構成することを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
前記コドンが請求項５または６に記載のアミノ酸、類似体または修飾体をコードすることを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするｌｕｃ遺伝子を含むベクター。
【請求項１２】
野生型または組み換えｌｕｃ遺伝子を含むベクターを、Ｐｈｏｔａｌｉｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４位のグルタミン酸またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５６位のグルタミン酸をコードするコドンを代替アミノ酸、該アミノ酸の類似体、または該アミノ酸の修飾体をコードするコドンに変更する部位特異的突然変異誘発によって処理することにより取得可能であることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
代替アミノ酸が請求項５または６に記載のアミノ酸、類似体または修飾体であることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
内部にｌｕｃ遺伝子が連結された、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０及びｐＴ７−７の中から選択されることを特徴とする請求項９から１３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれか１項に記載のＤＮＡまたはベクターを保有する、請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質を発現させ得る細胞。
【請求項１６】
大腸菌、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは昆虫細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ＡＴＰ測定によるアッセイを実施するための試験キットであって、発光試薬中に存在する請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質を含むことを特徴とするキット。
【請求項１８】
光を発生するルシフェリン及びルシフェラーゼを用いてＡＴＰを測定するアッセイ方法であって、前記光の量はＡＴＰの量に関連し、ルシフェラーゼが請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
アッセイを３０〜７０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アッセイを３７〜６０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
アッセイを４０〜５０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
熱安定化剤の不在下に室温で１０日間貯蔵後にそのルシフェラーゼ活性を８５％以上維持しているルシフェラーゼ調製物。
【請求項２３】
請求項１から７のいずれか１項または請求項２２に記載のルシフェラーゼの、特異的結合試薬のためのラベルとしての使用。
【請求項２４】
請求項１から７のいずれか１項に記載のルシフェラーゼで標識した特異的結合試薬を含むことを特徴とする試験キット。
【請求項２５】
細胞またはＤＮＡの同定のための、請求項８から１４のいずれか１項に記載のルシフェラーゼコーディングＤＮＡまたはベクターの使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼ調製物であって、熱安定化剤の不存在下で室温において１０日間貯蔵後にそのルシフェラーゼ活性を８５％以上保持しているルシフェラーゼ調製物。
【請求項２】
野生型ルシフェラーゼの変異型を含むルシフェラーゼ調製物であって、該調整物は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％アザイドを添加したｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液の存在中で、室温において１０日間貯蔵後に、そのルシフェラーゼ活性を８５％以上保持しているルシフェラーゼ調整物。
【請求項３】
野生型ルシフェラーゼの変異型を含むルシフェラーゼ調製物であって、該調整物は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％アザイドを添加したｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液の存在中で、３７℃において２時間貯蔵後に、そのルシフェラーゼ活性を７０％以上保持しているルシフェラーゼ調整物。
【請求項４】
熱安定性が改善されたルシフェラーゼを得る方法であって、野生型ルシフェラーゼを変異させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％アザイドを添加したｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液の存在中で、室温において１０日間貯蔵後に、そのルシフェラーゼ活性を８５％以上保持している変異体を選択することを含む方法。
【請求項５】
熱安定性が改善されたルシフェラーゼを得る方法であって、野生型ルシフェラーゼを変異させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％アザイドを添加したｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液の存在中で、３７℃において２時間貯蔵後に、そのルシフェラーゼ活性を７０％以上保持している変異体を選択することを含む方法。
【請求項６】
ＡＴＰの測定によるアッセイを実施するための試験キットであって、発光試薬中に請求項１から３のいずれか１項に記載のルシフェラーゼ調整物を含むことを特徴とするキット。
【請求項７】
光を発生するルシフェリン及びルシフェラーゼを用いてＡＴＰを測定するアッセイ方法であって、前記光の量はＡＴＰの量に関連し、ルシフェラーゼが請求項１から３のいずれか１項に記載のルシフェラーゼ調整物であることを特徴とするアッセイ方法。
【請求項８】
アッセイを３０〜７０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項７に記載のアッセイ方法。
【請求項９】
アッセイを３７〜６０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項７に記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
アッセイを４０〜５０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項７に記載のアッセイ方法。
【請求項１１】
特異的結合試薬のためのラベルとしての、請求項１から３のいずれかに記載のルシフェラーゼ調整物からのルシフェラーゼの使用。
【請求項１】
ルシフェラーゼ活性を有し、かつＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａまたはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓ由来のルシフェラーゼに対して６０％を越えるアミノ酸配列相同性を有するタンパク質であって、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５４またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａ及びＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの残基３５６に対応するアミノ酸残基がグルタミン酸以外のアミノ酸であることを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
アミノ酸配列ＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、この配列中のＸはグルタミン酸以外のアミノ酸残基であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
アミノ酸配列ＴＰＸＧＤＤＫＰＧＡを含み、この配列中のＸはグルタミン酸以外のアミノ酸残基であることを特徴とする請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
アミノ酸Ｘがグリシン、プロリンまたはアスパラギン酸でないことを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項５】
アミノ酸Ｘがトリプトファン、バリン、ロイシン、イソロイシン及びアスパラギンのうちのいずれかであるか、またはこれらのアミノ酸のうちのいずれかの類似体または修飾体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項６】
アミノ酸Ｘがリシン及びアルギニンのいずれか一方であるか、またはこれらのアミノ酸の類似体または修飾体であることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項７】
配列番号２に示したアミノ酸配列を含み、前記配列中のＸａａは請求項５または６に記載のアミノ酸またはその類似体もしくは修飾体であるタンパク質。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項９】
配列番号１に示したヌクレオチド配列を含み、前記配列の１０６３〜１０６５位の３個の塩基Ｎはグルタミン酸以外のアミノ酸をコードするコドンを構成することを特徴とする請求項８に記載のＤＮＡ。
【請求項１０】
前記コドンが請求項５または６に記載のアミノ酸、類似体または修飾体をコードすることを特徴とする請求項９に記載のＤＮＡ。
【請求項１１】
請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするｌｕｃ遺伝子を含むベクター。
【請求項１２】
野生型または組み換えｌｕｃ遺伝子を含むベクターを、Ｐｈｏｔａｌｉｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５４位のグルタミン酸またはＬｕｃｉｏｌａ ｍｉｎｇｒｅｌｉｃａ、Ｌｕｃｉｏｌａ ｃｒｕｃｉａｔａもしくはＬｕｃｉｏｌａ ｌａｔｅｒａｌｉｓルシフェラーゼの３５６位のグルタミン酸をコードするコドンを代替アミノ酸、該アミノ酸の類似体、または該アミノ酸の修飾体をコードするコドンに変更する部位特異的突然変異誘発によって処理することにより取得可能であることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
代替アミノ酸が請求項５または６に記載のアミノ酸、類似体または修飾体であることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
内部にｌｕｃ遺伝子が連結された、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０及びｐＴ７−７の中から選択されることを特徴とする請求項９から１３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項８から１４のいずれか１項に記載のＤＮＡまたはベクターを保有する、請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質を発現させ得る細胞。
【請求項１６】
大腸菌、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたは昆虫細胞であることを特徴とする請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
ＡＴＰ測定によるアッセイを実施するための試験キットであって、発光試薬中に存在する請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質を含むことを特徴とするキット。
【請求項１８】
光を発生するルシフェリン及びルシフェラーゼを用いてＡＴＰを測定するアッセイ方法であって、前記光の量はＡＴＰの量に関連し、ルシフェラーゼが請求項１から７のいずれか１項に記載のタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
アッセイを３０〜７０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アッセイを３７〜６０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
アッセイを４０〜５０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
熱安定化剤の不在下に室温で１０日間貯蔵後にそのルシフェラーゼ活性を８５％以上維持しているルシフェラーゼ調製物。
【請求項２３】
請求項１から７のいずれか１項または請求項２２に記載のルシフェラーゼの、特異的結合試薬のためのラベルとしての使用。
【請求項２４】
請求項１から７のいずれか１項に記載のルシフェラーゼで標識した特異的結合試薬を含むことを特徴とする試験キット。
【請求項２５】
細胞またはＤＮＡの同定のための、請求項８から１４のいずれか１項に記載のルシフェラーゼコーディングＤＮＡまたはベクターの使用。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼ調製物であって、熱安定化剤の不存在下で室温において１０日間貯蔵後にそのルシフェラーゼ活性を８５％以上保持しているルシフェラーゼ調製物。
【請求項２】
野生型ルシフェラーゼの変異型を含むルシフェラーゼ調製物であって、該調整物は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％アザイドを添加したｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液の存在中で、室温において１０日間貯蔵後に、そのルシフェラーゼ活性を８５％以上保持しているルシフェラーゼ調整物。
【請求項３】
野生型ルシフェラーゼの変異型を含むルシフェラーゼ調製物であって、該調整物は、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％アザイドを添加したｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液の存在中で、３７℃において２時間貯蔵後に、そのルシフェラーゼ活性を７０％以上保持しているルシフェラーゼ調整物。
【請求項４】
熱安定性が改善されたルシフェラーゼを得る方法であって、野生型ルシフェラーゼを変異させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％アザイドを添加したｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液の存在中で、室温において１０日間貯蔵後に、そのルシフェラーゼ活性を８５％以上保持している変異体を選択することを含む方法。
【請求項５】
熱安定性が改善されたルシフェラーゼを得る方法であって、野生型ルシフェラーゼを変異させ、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０２％アザイドを添加したｐＨ７．７５のＨＥＰＥＳ緩衝液を含む溶液の存在中で、３７℃において２時間貯蔵後に、そのルシフェラーゼ活性を７０％以上保持している変異体を選択することを含む方法。
【請求項６】
ＡＴＰの測定によるアッセイを実施するための試験キットであって、発光試薬中に請求項１から３のいずれか１項に記載のルシフェラーゼ調整物を含むことを特徴とするキット。
【請求項７】
光を発生するルシフェリン及びルシフェラーゼを用いてＡＴＰを測定するアッセイ方法であって、前記光の量はＡＴＰの量に関連し、ルシフェラーゼが請求項１から３のいずれか１項に記載のルシフェラーゼ調整物であることを特徴とするアッセイ方法。
【請求項８】
アッセイを３０〜７０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項７に記載のアッセイ方法。
【請求項９】
アッセイを３７〜６０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項７に記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
アッセイを４０〜５０℃の温度で行なうことを特徴とする請求項７に記載のアッセイ方法。
【請求項１１】
特異的結合試薬のためのラベルとしての、請求項１から３のいずれかに記載のルシフェラーゼ調整物からのルシフェラーゼの使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公開番号】特開２００６−２７１３９３（Ｐ２００６−２７１３９３Ａ）
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１６３３８８（Ｐ２００６−１６３３８８）
【出願日】平成１８年６月１３日（２００６．６．１３）
【分割の表示】特願平７−５２４４８６の分割
【原出願日】平成７年３月２２日（１９９５．３．２２）
【出願人】（３９００４０６０４）イギリス国 (58)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ ＯＦ ＳＴＡＴＥ ＦＯＲ ＤＥＦＥＮＣＥ ＩＮ ＨＥＲ ＢＲＩＴＡＮＮＩＣ ＭＡＪＥＳＴＹ’Ｓ ＧＯＶＥＲＮＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＥＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ ＯＦ ＧＲＥＡＴ ＢＲＩＴＡＩＮ ＡＮＤ ＮＯＲＴＨＥＲＮ ＩＲＥＬＡＮＤ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年１０月１２日（２００６．１０．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月１３日（２００６．６．１３）
【分割の表示】特願平７−５２４４８６の分割
【原出願日】平成７年３月２２日（１９９５．３．２２）
【出願人】（３９００４０６０４）イギリス国 (58)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＳＥＣＲＥＴＡＲＹ ＯＦ ＳＴＡＴＥ ＦＯＲ ＤＥＦＥＮＣＥ ＩＮ ＨＥＲ ＢＲＩＴＡＮＮＩＣ ＭＡＪＥＳＴＹ’Ｓ ＧＯＶＥＲＮＭＥＮＴ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＥＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ ＯＦ ＧＲＥＡＴ ＢＲＩＴＡＩＮ ＡＮＤ ＮＯＲＴＨＥＲＮ ＩＲＥＬＡＮＤ
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]