ロタキサン化合物、ロタキサン化合物が結合した固体基板及びこれを利用したバイオチップ
化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の内部空洞に化学式３の化合物が垂直に貫通した化学式１の化合物を提供する。さらに、前記化合物が結合した固体基板および前記固体基板を含むバイオチップを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の官能基を一定間隔で配列させたバイオチップのための固体基板、およびこれを利用したバイオチップに係り、さらに具体的には、ロタキサン化合物、ロタキサン化合物が結合した固体基板、および前記固体基板を用いたバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、固体基板に化合物を導入するためには、下記参考図１に示す方法が広く利用されている。この方法によると、一方の末端には、固体基板１との結合のための官能基２ａを有し、他方の末端には、固体基板１に導入しようとする化合物との結合のための官能基２ｃを有するシラン化合物またはチオール化合物からなる自己組織化薄膜が固体基板１の上に形成される。自己組織化薄膜の形成において、下記参考図１の参照番号２ｂで表される分子本体は、それらの間の分子間相互作用により形成される薄膜の密度を上昇させる役割を果たす。前記分子本体２ｂが最も簡単な分子構造である直鎖アルキル基である場合、形成される薄膜における分子間の間隔は、０．５ｎｍほどであると知られている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
ここで、１は固体基板、２ａは固体基板との結合のための官能基、２ｂは分子本体、２ｃは固体基板に固定しようとする化合物との結合のための官能基である。
【０００５】
公知のように、さらなる末端官能基が特定の固体基板上の薄膜として形成されるシラン化合物またはチオール化合物は、ＤＮＡおよび蛋白質を含む生体物質、高分子またはナノ粒子などの、単独で用いられた場合固体基板に固定しにくい化学種を、固体基板に容易に一様に固定させることができる。そのため、最近の多くの研究は、このようなシラン化合物またはチオール化合物を用いて、標的化合物の固体基板への固定化に着目している。
【０００６】
かような研究のうち、特に、ＤＮＡ及び蛋白質を含む生体物質の検出及び分析のためのバイオチップ技術は、短時間内に多数の生体物質の相互作用を検出できるため、活発に研究されている。この点で、高い感度および選択性を有するバイオチップを製造するための技術開発が、競争的に進められている。
【０００７】
バイオチップは、下記参考図２に表したように、シリコン基板またはガラス基板のような固体基板（支持層）、前記固体基板上に形成され、ＤＮＡまたは蛋白質と化学結合可能な官能基を末端に有する分子層（接合層）、及び分析しようとする標的物質と選択的に相互作用可能なＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）または蛋白質を含んだ生体物質層（検出層）を含む。かようなバイオチップは、一般的に参考図３の１のようなパターン形状に調製され、その後一連の過程７および８を経て分析しようとする物質を検出することは、当業者に周知である。
【０００８】
【化２】
【０００９】
【化３】
【００１０】
ここで、１は固体基板、２は接合層、３は検出層（ＤＮＡ一本鎖）、５はハイブリダイズしたＤＮＡ二本鎖、７は試料注入及びＤＮＡハイブリダイゼーション、８は検出である。
【００１１】
下記参考図４に表したように、固体基板に固定されたＤＮＡまたは蛋白質のような生体物質が、特定の標的物質と選択的に相互作用すると、当業者に周知のように、その構造や体積が、特に特定の三次元構造に変化する。特に、前記バイオチップの固体基板に固定された生体物質がＤＮＡである場合、検出層に固定されたＤＮＡ一本鎖の断面の最大径は、約１ｎｍ以下であるが、ＤＮＡ一本鎖が試料中に存在する標的ＤＮＡとハイブリダイズして二本鎖構造を形成すれば、二本鎖構造の断面の最大径は、約２．２ｎｍであり、ＤＮＡ一本鎖の断面の最大径よりも大きい。
【００１２】
【化４】
【００１３】
ここで、１は固体基板、２は接合層、３は検出層（ＤＮＡ一本鎖）、５はハイブリダイズしたＤＮＡ二本鎖、７は試料注入及びＤＮＡハイブリダイゼーションである。
【００１４】
現在用いられうるＤＮＡチップの調製技術は、前記検出層として用いられるＤＮＡ一本鎖間の間隔を標的ＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションで生じる大きさの変化を考慮して設定することに限界があった。もし、ＤＮＡ一本鎖が過密に配置されれば、固体基板に固定されているＤＮＡ一本鎖とのハイブリダイゼーションによる二本鎖構造の形成を難しくする立体障害のために、試料中に存在する標的ＤＮＡ鎖は検出層に入ることができない。一方、固体基板上のＤＮＡ一本鎖の間隔が過度にまばらであれば、ＤＮＡチップの感度が低下しうる。
【００１５】
ここまで、ＤＮＡチップを中心に説明したが、ＤＮＡチップ以外のバイオチップにおいても類似の問題が発生することがある。前記のような理由で、検出層を構成する生体物質の単一面積当たりの濃度を上昇させることだけでは、高い感度および選択性を有するバイオチップを調製することはできない。一定の感度および選択的な相互作用を確実にするために、検出層の前記生体物質の間隔を最適にする必要がある。
【００１６】
標的ＤＮＡ鎖と固体基板に固定されたＤＮＡ鎖との間のハイブリダイゼーションによって得られたＤＮＡ二本鎖は、固体基板に固定化されたＤＮＡ鎖に比べて、断面の直径が約２倍大きい。したがって、下記参考図５の（ａ）に表したように、ＤＮＡチップの固体基板にＤＮＡ鎖を過密に固定させれば、以後の標的ＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションの間に立体障害が発生し、それによってＤＮＡチップの効率が落ちる。従って、高い選択性と感度とを有したＤＮＡチップを調製するためには、下記参考図５の（ｂ）のように、固体基板にＤＮＡ鎖を固定して検出層を形成するときに、以後のハイブリダイゼーションで生じる構造または体積の変化を考慮し、ＤＮＡ鎖は、均等な狭い間隔を有さなければならない。
【００１７】
【化５】
【００１８】
ここで、１は固体基板、２は接合層、３は検出層（ＤＮＡ一本鎖）、５は標的ＤＮＡ鎖である。
【００１９】
上述のような、検出の間の、固体基板に固定された生体物質の構造的変化による立体障害の問題は、ＤＮＡチップだけでなく、固体基板に固定された蛋白質の大きさが標的分子（固体基板に固定された蛋白質に選択的に結合する対の分子）の大きさに比べて十分に大きくない蛋白質チップの場合にも起こりうる。例えば、アビジンのような巨大分子が、蛋白質チップで広く使われている固体基板上に固定されたビオチンのような小さな分子と結合する場合にも起こりうる。さらに、立体障害の問題は、ＤＮＡチップ及び蛋白質チップのようなバイオチップ以外にも、固体基板に固定された化学物質が標的物質と結合するあらゆるチップで起こりうる。
【００２０】
上述の問題点の最もよい解決は、固体基板上に形成される接合層の密度を適切に調節することである。それによって、前記接合層の上に形成される検出層中のＤＮＡまたは蛋白質の間隔が調節されうる。
【００２１】
一般に、接合層の密度は、接合層の材料の濃度及び結合層の形成時間を調節することにより、調節されうる。Ｔａｒｌｏｖらは、自己組織化薄膜（接合層に該当）物質の濃度を調節することによって化学種間の距離を変化させた研究を報告している（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，ｐ．９７８７）。しかし、かような方法では、均一な密度分布を有する接合層を形成できないため、接合層の上に形成されるＤＮＡ間の間隔を所望の値に制御することが難しい。最近、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓらは、Ｔａｒｌｏｖらの方法と同じ方法で化学種間の間隔を調節した後、ＤＮＡのハイブリダイゼーションの程度を測定する定量的な研究を報告した。しかし、上述の問題は残った（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４，ｐ．１４６０１）。
【００２２】
最近、Ｊｕｎ−Ｗｏｎ Ｐａｒｋらは、円錐状のデンドロン分子を用いた、検出層として用いられる化合物間の間隔を調節する方法を報告した（韓国特許公開第２００２−００１９３２５号公報、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９，２００３，ｐ．２３５７）。この方法によれば、アミノシランで修飾された固体基板を、それぞれ下端に１０個のカルボキシル基、および上端に１個のアミン基を有するデンドロン分子で処理すると、固体基板表面のアミン基とデンドロン分子の下端のカルボキシル基との間の水素結合が生じる。その結果、デンドロン分子が固体基板に固定され、デンドロン分子の上端に存在するアミン基は、デンドロン分子の断面の最大直径に相当する間隔で配置される。しかし、かようなデンドロン分子は、構造的にもろいために、例えば単結合の回転によるベンディング、または折れ曲がりのような構造的変形がおこりやすく、それによってアミン基間の間隔が減少しうる。さらに、デンドロン分子の重なりにより、アミン基間の間隔が減少しうる。従って、かような方法は、従来の方法の短所を完全に除去できない。また、該方法で用いられるデンドロン分子は、多数の官能基を有するために、ＤＮＡチップまたは蛋白質チップの性能を阻害する非特異的結合の可能性が増加しうる。
【発明の開示】
【００２３】
発明の詳細な説明
発明が解決しようとする課題
本発明は、接合層の中の構成分子が互いに所定の距離で離れて位置した、固体基板上に形成された接合層を形成するためのロタキサン化合物を提供する。
【００２４】
本発明はまた、前記ロタキサン化合物が結合した固体基板を提供する。
【００２５】
本発明はまた、それぞれ前記ロタキサン化合物が結合した固体基板を含む、遺伝子チップ及び蛋白質チップを提供する。
【００２６】
本発明はまた、前記ロタキサン化合物が結合した固体基板を含む生体分析用センサを提供する。
【００２７】
発明の開示
本発明の一実施形態によれば、下記化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の内部空洞に下記化学式３の化合物が垂直に貫通した下記化学式１のロタキサン化合物が提供される：
【００２８】
【化６】
【００２９】
前記化学式１で、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、飽和もしくは不飽和のＣ２〜Ｃ１０の直鎖アルキレン、エチレングリコールオリゴマー、１，４−置換ベンゼン、または１，４−置換ピリジンであり、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の酸素原子とのイオン−双極子相互作用のための正に荷電した官能基であり、Ｙ１は、遺伝子または蛋白質を含む生体物質との結合のための官能基であり、Ｙ２は、固体基板との結合のための官能基であり、
【００３０】
【化７】
【００３１】
前記化学式２で、ｎは、４ないし２０の整数であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有し、末端が不飽和結合であるアルケニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有するカルボキシアルキルスルフィニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するカルボキシアルキルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するアミノアルキルオキシ基、または置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するヒドロキシアルキルオキシ基であり、
【００３２】
【化８】
【００３３】
前記化学式３で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１及びＹ２は、前記化学式１で定義された通りである。
【００３４】
前記化学式１のロタキサン化合物で、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して２級アンモニウム、１，４−置換ピリジニウム、またはベンジルアンモニウムであり、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して１級アミン基、アミド基、アクリルアミン基、アルキルエステル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アルコキシシラン基、ハロゲン化アシル基、ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン基、シアン基、イソシアン基またはイソチオシアン基でありうる。
【００３５】
本発明の他の実施形態によれば、前記化学式１の化合物と共有結合または非共有結合を介して結合した固体基板が提供される。
【００３６】
前記化学式１の化合物は、０．０５ないし０．６個／ｎｍ２の密度で前記固体基板に結合されうる。
【００３７】
前記固体基板は、ガラス、シリコンウェーハ、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）ガラス、酸化アルミニウム基板、または二酸化チタン基板でありうる。
【００３８】
本発明の他の実施形態によれば、前記化学式１の化合物と結合した固体基板を含む遺伝子チップが提供される。
【００３９】
本発明の他の実施形態によれば、前記化学式１の化合物と結合した固体基板を含む蛋白質チップが提供される。
【００４０】
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記化学式１の化合物と結合した固体基板を含む生体物質分析用センサが提供される。
【００４１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４２】
本発明によれば、ロタキサン化合物は、バイオチップの固体基板上に形成される接合層の中で、分子を所定の間隔に分離するために用いられる。本明細書中、「ロタキサン化合物」の用語は、長鎖状化合物が丈夫な環状化合物であるククルビツリルを貫通した、連結化合物を意味する。かようなロタキサン化合物を接合層に導入すれば、隣接する鎖状化合物間の間隔がククルビツリルの直径以上に維持されうる。かような原理により、固体基板上にロタキサン化合物から構成された接合層を形成させれば、接合層を構成する分子が互いに所定の距離で離れて配置されうる。かような原理を図１に示す。
【００４３】
したがって、本発明は、下記化学式２のククルビツリルまたはその誘導体に下記化学式３の化合物が貫通した、下記化学式１のロタキサン化合物を提供する：
【００４４】
【化９】
【００４５】
前記化学式１で、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、飽和もしくは不飽和のＣ２〜Ｃ１０の直鎖アルキレン、エチレングリコールオリゴマー、１，４−置換ベンゼン、または１，４−置換ピリジンであり、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の酸素原子とのイオン−双極子相互作用のための正に荷電した官能基であり、Ｙ１は、遺伝子または蛋白質を含む生体物質との結合のための官能基であり、Ｙ２は、固体基板との結合のための官能基であり、
【００４６】
【化１０】
【００４７】
前記化学式２で、ｎは、４ないし２０の整数であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有し、末端が不飽和結合であるアルケニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有するカルボキシアルキルスルフィニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するカルボキシアルキルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するアミノアルキルオキシ基、または置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するヒドロキシアルキルオキシ基であり、
【００４８】
【化１１】
【００４９】
前記化学式３で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１及びＹ２は、前記化学式１で定義された通りである。
【００５０】
前記化学式２の化合物を合成原料として用いられるヒドロキシククルビツリルおよびその母体であるククルビツリルの例は、本出願人により出願された韓国特許出願第０２−６８３６２号、同第０２−３１８号、同０１−５７５７３号、同０１−３９７５６号、及び同００−３３０２６号にその構造式及び合成方法とともに開示されており、その全体が参照として本明細書中に含まれる。
【００５１】
前記化学式３の化合物は、化学式２のククルビツリル誘導体を貫通しうる。前記化学式３の化合物の一端は、固体基質に固定させるための官能基を、他端は、ＤＮＡまたは蛋白質を含む生体物質、あるいはセンサのための検出物質との結合のための官能基を有する。
【００５２】
前記化学式１のロタキサン化合物において、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して２級アンモニウム、１，４−置換ピリジニウム、またはベンジルアンモニウムであり、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して１級アミン基、アミド基、アクリルアミン基、アルキルエステル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アルコキシシラン基、ハロゲン化アシル基、ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン基、シアン基、イソシアン基またはイソチオシアン基でありうる。
【００５３】
前記化学式１のロタキサン化合物は、下記化学式５ないし化学式１３で表される化合物から選択されたものであることが望ましい：
【００５４】
【化１２】
【００５５】
【化１３】
【００５６】
【化１４】
【００５７】
【化１５】
【００５８】
【化１６】
【００５９】
【化１７】
【００６０】
【化１８】
【００６１】
【化１９】
【００６２】
【化２０】
【００６３】
前記化学式１のロタキサン化合物は、以下のように調製されうる。
【００６４】
当技術分野に公知されている一般的な有機合成方法で合成された化学式３の化合物と、本出願人が出願した韓国特許出願第０２−６８３６２号、同第０２−３１８号、同０１−５７５７３号、同０１−３９７５６号、または同００−３３０２６号に開示されている方法に基づき合成された化学式２の化合物とを、水、ジメチルホルムアミド、またはジメチルスルホキシドに溶解させて、化学式２の化合物と化学式３の化合物との自己組織化により化学式１の化合物が調製される。
【００６５】
前記化学式１のロタキサン化合物は、多様な末端官能基を有する修飾された固体基板に結合され、所望の固体基板が形成される。
【００６６】
前記化学式１の化合物は、０．０５ないし０．５個／ｎｍ２の密度で固体基板に結合されうる。前記固体基板は、ガラス、シリコンウェーハ、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）ガラス、酸化アルミニウム基板、または二酸化チタン基板でありうる。
【００６７】
前記化学式１のロタキサン化合物が結合した修飾された固体基板において、接合層を構成するロタキサン分子は、互いに所定の距離で離れて配置されうる。接合層の中での分子間の間隔は、前記化学式１の化合物を構成する化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の型によって決定される。
【００６８】
前記化学式１のロタキサン化合物が結合した固体基板は遺伝子チップの調製に用いられうる。
【００６９】
また、前記化学式１のロタキサン化合物が結合した固体基板は、蛋白質チップまたは生体物質分析用センサの調製に用いられうる。
【００７０】
化学式１のロタキサン化合物が結合した固体基板を利用して調製された遺伝子チップ、蛋白質チップ、及び生体物質分析用センサは、上にロタキサン分子が互いに所定の距離で離れて配置された接合層を有する。したがって、前記接合層の上に固定された遺伝子および蛋白質のような生体物質もまた規則的な間隔でありうる。また、前記バイオチップのための固体基板の接合層中の化学式１のロタキサン化合物は、生体物質と水素結合のような非特異的な結合を形成して接合層に固定化しうる官能基の数が少ないために、本発明の方法はより実用的になる。
【００７１】
発明の効果
上述のように、本発明のロタキサン化合物によって、固体基板に形成された接合層の中で、ロタキサン分子の一定の間隔が得られる。このため、高い感度および選択性を有するバイオチップを製造できる。
【００７２】
図面の簡単な説明
図１は、ククルビツリルまたはその誘導体の内部空洞に長鎖状化合物が垂直に貫通したロタキサン化合物から形成される接合層が結合した固体基板、および接合層を構成する分子間の間隔がククルビツリルまたはその誘導体の直径以上に対応する距離で互いに離れて配置される原理を図式的に表現した図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
以下、実施例を介して本発明をさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例により制限されるものではない。
【実施例】
【００７４】
実施例１：ロタキサン化合物の調製
下記化学式４のスペルミン四塩酸１８０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を水１０ｍｌに溶かし、ククルビト［６］ウリル（ＣＢ［６］）５００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をメンブランフィルタで濾過し、濾液にヘキサフルオロリン酸アンモニウム３４０ｍｇ（２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた沈殿をメンブランフィルタで濾過し、乾燥させて化学式５の化合物を得た。
【００７５】
【化２１】
【００７６】
【化２２】
【００７７】
実施例２：ロタキサン化合物の調製
化学式５の化合物１．０３ｇ（０．５８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５０ｍｌに溶かした。塩化アクリロイル３９５ｍｌ（４．６２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン３４８ｍｌ（２．３２ｍｍｏｌ）とを加え、撹拌した。反応が完了した後、塩化テトラブチルアンモニウムの飽和水溶液を加え、得られた沈殿をメンブランフィルタで濾過した後、乾燥させて化学式６の化合物を得た。
【００７８】
【化２３】
【００７９】
実施例３：固体基板の調製及び導入されたアミン基の密度測定
ピラニア溶液（硫酸：過酸化水素＝３：１混合物）でガラス基板を洗浄し、ガラス基板の表面にヒドロキシル基を導入し、その後窒素雰囲気下で１０ｍｌバイアルに入れた。次いで、（３−イソシアンプロピル）トリエトキシシランのトルエン溶液（１０ｍＭ）を入れ、常温で保管してシラン化を行った。
【００８０】
シラン化が完了した後、ガラス基板をトルエンで洗浄し、真空乾燥した。前記実施例１の化学式５の化合物のジメチルホルムアミド溶液とトリエチルアミン４当量とを加え、常温、窒素雰囲気下で撹拌した。その後、ガラス基板を無水ジメチルホルムアミドで洗浄し、エタノールアミンの無水ジメチルホルムアミド溶液に浸し、残っているイソシアンシランの反応性を除去し、希塩酸で洗浄して化学式１４の固体基板を得た：
【００８１】
【化２４】
【００８２】
実施例３のガラス基板上に存在するアミン基の密度は、９−アントラアルデヒドの蛍光を用いて測定した。このとき、９−アントラアルデヒドを用いた密度測定は、９−アントラアルデヒドの、化学式１のＣＢ［６］よりも小さいサイズに基づいている（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９，２００３，ｐ．２３５７）。
【００８３】
測定結果によると、実施例３のガラス基板の表面に存在するアミン基の表面密度は、０．１アミン／ｎｍ２と示された。
【００８４】
実施例４：固体基板の調製及び導入されたアミン基の密度測定
ピラニア溶液でガラス基板を洗浄し、ガラス基板の表面にヒドロキシル基を導入し、窒素雰囲気下で１０ｍｌバイアルに入れた。次いで、（３−アミノプロピル）トリエトキシシランのトルエン溶液（１０ｍＭ）を入れた後、常温で保管してシラン化を行った。
【００８５】
シラン化が完了した後、ガラス基板をトルエンで洗浄し、減圧下で１時間１２０℃に加熱した。前記ガラス基板を冷却し、１，４−ジイソチオシアン酸フェニルの無水ジメチルホルムアミド溶液に浸し、常温、窒素雰囲気下で撹拌した。
【００８６】
前記ガラス基板をきれいに洗浄し、前記実施例１の化学式５の化合物の無水ジメチルホルムアミド溶液とトリエチルアミン４当量とを加え、常温、窒素雰囲気下で撹拌した。その後、ガラス基板を無水ジメチルホルムアミドできれいに洗浄し、エタノールアミンの無水ジメチルホルムアミド溶液に浸し、残っているイソチオシアンシランの反応性を除去し、希塩酸で洗浄して下記化学式１５の固体基板を得た：
【００８７】
【化２５】
【００８８】
上述のように調製された前記化学式１５のガラス基板上に存在するアミン基密度を、前記実施例３と同様に測定した。
【００８９】
測定結果によると、前記化学式１５のガラス基板の表面に存在するアミン基の表面密度は、０．１アミン／ｎｍ２と示された。
【００９０】
実施例５：固体基板の調製及び導入されたアミン基の密度測定
ピラニア溶液でガラス基板を洗浄し、ガラス基板の表面にヒドロキシル基を導入し、その後、窒素雰囲気下で１０ｍｌバイアルに入れた。次いで、（３−チオールプロピル）トリエトキシシランのトルエン溶液（１０ｍＭ）を入れ、常温で保管してシラン化を行った。
【００９１】
シラン化が完了した後、ガラス基板をトルエンできれいに洗浄し、前記実施例２の化学式６の化合物の水溶液に加え、常温で撹拌した。ガラス基板を蒸溜水できれいに洗浄し、アクリロニトリルのジメチルホルムアミド溶液に浸して残った反応性を除去し、ジメチルホルムアミドとメタノールとで洗浄し、化学式１６の固体基板を得た：
【００９２】
【化２６】
【００９３】
前記化学式１６のガラス基板上に存在するアミン基の密度を、前記実施例３と同様に測定した。測定結果によると、前記化学式１６のガラス基板の表面に存在するアミン基の表面密度は、０．１アミン／ｎｍ２と示された。
【００９４】
密度の測定結果によれば、前記実施例３ないし実施例５で調製された固体基板上に存在するアミン基の密度は、アミノシランで修飾されたガラス基板に比べ、非常に低下していることが分かる。二本鎖ＤＮＡの直径が約２ｎｍであることを勘案すれば、ＤＮＡ１個当たり０．４個のアミンが対応するので、前記実施例３ないし実施例５のガラス基板は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションの際に立体障害を生じない。また、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓらが報告した方法によれば、固体基板上に存在するアミン基の密度が約０．０１アミン／ｎｍ２である。この点で、本発明の固体基板上のアミン基の密度は、従来の固体基板のものより１０倍高い。したがって、より高い検出感度が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ククルビツリルまたはその誘導体の内部空洞に長鎖状化合物が垂直に貫通したロタキサン化合物から形成される接合層が結合した固体基板、および接合層を構成する分子間の間隔がククルビツリルまたはその誘導体の直径以上に対応する距離で互いに離れて配置される原理を図式的に表現した図面である。
【符号の説明】
【００９６】
１ 固体基板、
２ 接合層、
３ 検出層、
４ ロタキサン化合物。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所定の官能基を一定間隔で配列させたバイオチップのための固体基板、およびこれを利用したバイオチップに係り、さらに具体的には、ロタキサン化合物、ロタキサン化合物が結合した固体基板、および前記固体基板を用いたバイオチップに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、固体基板に化合物を導入するためには、下記参考図１に示す方法が広く利用されている。この方法によると、一方の末端には、固体基板１との結合のための官能基２ａを有し、他方の末端には、固体基板１に導入しようとする化合物との結合のための官能基２ｃを有するシラン化合物またはチオール化合物からなる自己組織化薄膜が固体基板１の上に形成される。自己組織化薄膜の形成において、下記参考図１の参照番号２ｂで表される分子本体は、それらの間の分子間相互作用により形成される薄膜の密度を上昇させる役割を果たす。前記分子本体２ｂが最も簡単な分子構造である直鎖アルキル基である場合、形成される薄膜における分子間の間隔は、０．５ｎｍほどであると知られている。
【０００３】
【化１】
【０００４】
ここで、１は固体基板、２ａは固体基板との結合のための官能基、２ｂは分子本体、２ｃは固体基板に固定しようとする化合物との結合のための官能基である。
【０００５】
公知のように、さらなる末端官能基が特定の固体基板上の薄膜として形成されるシラン化合物またはチオール化合物は、ＤＮＡおよび蛋白質を含む生体物質、高分子またはナノ粒子などの、単独で用いられた場合固体基板に固定しにくい化学種を、固体基板に容易に一様に固定させることができる。そのため、最近の多くの研究は、このようなシラン化合物またはチオール化合物を用いて、標的化合物の固体基板への固定化に着目している。
【０００６】
かような研究のうち、特に、ＤＮＡ及び蛋白質を含む生体物質の検出及び分析のためのバイオチップ技術は、短時間内に多数の生体物質の相互作用を検出できるため、活発に研究されている。この点で、高い感度および選択性を有するバイオチップを製造するための技術開発が、競争的に進められている。
【０００７】
バイオチップは、下記参考図２に表したように、シリコン基板またはガラス基板のような固体基板（支持層）、前記固体基板上に形成され、ＤＮＡまたは蛋白質と化学結合可能な官能基を末端に有する分子層（接合層）、及び分析しようとする標的物質と選択的に相互作用可能なＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）または蛋白質を含んだ生体物質層（検出層）を含む。かようなバイオチップは、一般的に参考図３の１のようなパターン形状に調製され、その後一連の過程７および８を経て分析しようとする物質を検出することは、当業者に周知である。
【０００８】
【化２】
【０００９】
【化３】
【００１０】
ここで、１は固体基板、２は接合層、３は検出層（ＤＮＡ一本鎖）、５はハイブリダイズしたＤＮＡ二本鎖、７は試料注入及びＤＮＡハイブリダイゼーション、８は検出である。
【００１１】
下記参考図４に表したように、固体基板に固定されたＤＮＡまたは蛋白質のような生体物質が、特定の標的物質と選択的に相互作用すると、当業者に周知のように、その構造や体積が、特に特定の三次元構造に変化する。特に、前記バイオチップの固体基板に固定された生体物質がＤＮＡである場合、検出層に固定されたＤＮＡ一本鎖の断面の最大径は、約１ｎｍ以下であるが、ＤＮＡ一本鎖が試料中に存在する標的ＤＮＡとハイブリダイズして二本鎖構造を形成すれば、二本鎖構造の断面の最大径は、約２．２ｎｍであり、ＤＮＡ一本鎖の断面の最大径よりも大きい。
【００１２】
【化４】
【００１３】
ここで、１は固体基板、２は接合層、３は検出層（ＤＮＡ一本鎖）、５はハイブリダイズしたＤＮＡ二本鎖、７は試料注入及びＤＮＡハイブリダイゼーションである。
【００１４】
現在用いられうるＤＮＡチップの調製技術は、前記検出層として用いられるＤＮＡ一本鎖間の間隔を標的ＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションで生じる大きさの変化を考慮して設定することに限界があった。もし、ＤＮＡ一本鎖が過密に配置されれば、固体基板に固定されているＤＮＡ一本鎖とのハイブリダイゼーションによる二本鎖構造の形成を難しくする立体障害のために、試料中に存在する標的ＤＮＡ鎖は検出層に入ることができない。一方、固体基板上のＤＮＡ一本鎖の間隔が過度にまばらであれば、ＤＮＡチップの感度が低下しうる。
【００１５】
ここまで、ＤＮＡチップを中心に説明したが、ＤＮＡチップ以外のバイオチップにおいても類似の問題が発生することがある。前記のような理由で、検出層を構成する生体物質の単一面積当たりの濃度を上昇させることだけでは、高い感度および選択性を有するバイオチップを調製することはできない。一定の感度および選択的な相互作用を確実にするために、検出層の前記生体物質の間隔を最適にする必要がある。
【００１６】
標的ＤＮＡ鎖と固体基板に固定されたＤＮＡ鎖との間のハイブリダイゼーションによって得られたＤＮＡ二本鎖は、固体基板に固定化されたＤＮＡ鎖に比べて、断面の直径が約２倍大きい。したがって、下記参考図５の（ａ）に表したように、ＤＮＡチップの固体基板にＤＮＡ鎖を過密に固定させれば、以後の標的ＤＮＡ鎖とのハイブリダイゼーションの間に立体障害が発生し、それによってＤＮＡチップの効率が落ちる。従って、高い選択性と感度とを有したＤＮＡチップを調製するためには、下記参考図５の（ｂ）のように、固体基板にＤＮＡ鎖を固定して検出層を形成するときに、以後のハイブリダイゼーションで生じる構造または体積の変化を考慮し、ＤＮＡ鎖は、均等な狭い間隔を有さなければならない。
【００１７】
【化５】
【００１８】
ここで、１は固体基板、２は接合層、３は検出層（ＤＮＡ一本鎖）、５は標的ＤＮＡ鎖である。
【００１９】
上述のような、検出の間の、固体基板に固定された生体物質の構造的変化による立体障害の問題は、ＤＮＡチップだけでなく、固体基板に固定された蛋白質の大きさが標的分子（固体基板に固定された蛋白質に選択的に結合する対の分子）の大きさに比べて十分に大きくない蛋白質チップの場合にも起こりうる。例えば、アビジンのような巨大分子が、蛋白質チップで広く使われている固体基板上に固定されたビオチンのような小さな分子と結合する場合にも起こりうる。さらに、立体障害の問題は、ＤＮＡチップ及び蛋白質チップのようなバイオチップ以外にも、固体基板に固定された化学物質が標的物質と結合するあらゆるチップで起こりうる。
【００２０】
上述の問題点の最もよい解決は、固体基板上に形成される接合層の密度を適切に調節することである。それによって、前記接合層の上に形成される検出層中のＤＮＡまたは蛋白質の間隔が調節されうる。
【００２１】
一般に、接合層の密度は、接合層の材料の濃度及び結合層の形成時間を調節することにより、調節されうる。Ｔａｒｌｏｖらは、自己組織化薄膜（接合層に該当）物質の濃度を調節することによって化学種間の距離を変化させた研究を報告している（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，ｐ．９７８７）。しかし、かような方法では、均一な密度分布を有する接合層を形成できないため、接合層の上に形成されるＤＮＡ間の間隔を所望の値に制御することが難しい。最近、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓらは、Ｔａｒｌｏｖらの方法と同じ方法で化学種間の間隔を調節した後、ＤＮＡのハイブリダイゼーションの程度を測定する定量的な研究を報告した。しかし、上述の問題は残った（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４，ｐ．１４６０１）。
【００２２】
最近、Ｊｕｎ−Ｗｏｎ Ｐａｒｋらは、円錐状のデンドロン分子を用いた、検出層として用いられる化合物間の間隔を調節する方法を報告した（韓国特許公開第２００２−００１９３２５号公報、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １９，２００３，ｐ．２３５７）。この方法によれば、アミノシランで修飾された固体基板を、それぞれ下端に１０個のカルボキシル基、および上端に１個のアミン基を有するデンドロン分子で処理すると、固体基板表面のアミン基とデンドロン分子の下端のカルボキシル基との間の水素結合が生じる。その結果、デンドロン分子が固体基板に固定され、デンドロン分子の上端に存在するアミン基は、デンドロン分子の断面の最大直径に相当する間隔で配置される。しかし、かようなデンドロン分子は、構造的にもろいために、例えば単結合の回転によるベンディング、または折れ曲がりのような構造的変形がおこりやすく、それによってアミン基間の間隔が減少しうる。さらに、デンドロン分子の重なりにより、アミン基間の間隔が減少しうる。従って、かような方法は、従来の方法の短所を完全に除去できない。また、該方法で用いられるデンドロン分子は、多数の官能基を有するために、ＤＮＡチップまたは蛋白質チップの性能を阻害する非特異的結合の可能性が増加しうる。
【発明の開示】
【００２３】
発明の詳細な説明
発明が解決しようとする課題
本発明は、接合層の中の構成分子が互いに所定の距離で離れて位置した、固体基板上に形成された接合層を形成するためのロタキサン化合物を提供する。
【００２４】
本発明はまた、前記ロタキサン化合物が結合した固体基板を提供する。
【００２５】
本発明はまた、それぞれ前記ロタキサン化合物が結合した固体基板を含む、遺伝子チップ及び蛋白質チップを提供する。
【００２６】
本発明はまた、前記ロタキサン化合物が結合した固体基板を含む生体分析用センサを提供する。
【００２７】
発明の開示
本発明の一実施形態によれば、下記化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の内部空洞に下記化学式３の化合物が垂直に貫通した下記化学式１のロタキサン化合物が提供される：
【００２８】
【化６】
【００２９】
前記化学式１で、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、飽和もしくは不飽和のＣ２〜Ｃ１０の直鎖アルキレン、エチレングリコールオリゴマー、１，４−置換ベンゼン、または１，４−置換ピリジンであり、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の酸素原子とのイオン−双極子相互作用のための正に荷電した官能基であり、Ｙ１は、遺伝子または蛋白質を含む生体物質との結合のための官能基であり、Ｙ２は、固体基板との結合のための官能基であり、
【００３０】
【化７】
【００３１】
前記化学式２で、ｎは、４ないし２０の整数であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有し、末端が不飽和結合であるアルケニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有するカルボキシアルキルスルフィニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するカルボキシアルキルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するアミノアルキルオキシ基、または置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するヒドロキシアルキルオキシ基であり、
【００３２】
【化８】
【００３３】
前記化学式３で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１及びＹ２は、前記化学式１で定義された通りである。
【００３４】
前記化学式１のロタキサン化合物で、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して２級アンモニウム、１，４−置換ピリジニウム、またはベンジルアンモニウムであり、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して１級アミン基、アミド基、アクリルアミン基、アルキルエステル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アルコキシシラン基、ハロゲン化アシル基、ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン基、シアン基、イソシアン基またはイソチオシアン基でありうる。
【００３５】
本発明の他の実施形態によれば、前記化学式１の化合物と共有結合または非共有結合を介して結合した固体基板が提供される。
【００３６】
前記化学式１の化合物は、０．０５ないし０．６個／ｎｍ２の密度で前記固体基板に結合されうる。
【００３７】
前記固体基板は、ガラス、シリコンウェーハ、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）ガラス、酸化アルミニウム基板、または二酸化チタン基板でありうる。
【００３８】
本発明の他の実施形態によれば、前記化学式１の化合物と結合した固体基板を含む遺伝子チップが提供される。
【００３９】
本発明の他の実施形態によれば、前記化学式１の化合物と結合した固体基板を含む蛋白質チップが提供される。
【００４０】
本発明のさらに他の実施形態によれば、前記化学式１の化合物と結合した固体基板を含む生体物質分析用センサが提供される。
【００４１】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００４２】
本発明によれば、ロタキサン化合物は、バイオチップの固体基板上に形成される接合層の中で、分子を所定の間隔に分離するために用いられる。本明細書中、「ロタキサン化合物」の用語は、長鎖状化合物が丈夫な環状化合物であるククルビツリルを貫通した、連結化合物を意味する。かようなロタキサン化合物を接合層に導入すれば、隣接する鎖状化合物間の間隔がククルビツリルの直径以上に維持されうる。かような原理により、固体基板上にロタキサン化合物から構成された接合層を形成させれば、接合層を構成する分子が互いに所定の距離で離れて配置されうる。かような原理を図１に示す。
【００４３】
したがって、本発明は、下記化学式２のククルビツリルまたはその誘導体に下記化学式３の化合物が貫通した、下記化学式１のロタキサン化合物を提供する：
【００４４】
【化９】
【００４５】
前記化学式１で、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、飽和もしくは不飽和のＣ２〜Ｃ１０の直鎖アルキレン、エチレングリコールオリゴマー、１，４−置換ベンゼン、または１，４−置換ピリジンであり、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の酸素原子とのイオン−双極子相互作用のための正に荷電した官能基であり、Ｙ１は、遺伝子または蛋白質を含む生体物質との結合のための官能基であり、Ｙ２は、固体基板との結合のための官能基であり、
【００４６】
【化１０】
【００４７】
前記化学式２で、ｎは、４ないし２０の整数であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有し、末端が不飽和結合であるアルケニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有するカルボキシアルキルスルフィニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するカルボキシアルキルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するアミノアルキルオキシ基、または置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するヒドロキシアルキルオキシ基であり、
【００４８】
【化１１】
【００４９】
前記化学式３で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１及びＹ２は、前記化学式１で定義された通りである。
【００５０】
前記化学式２の化合物を合成原料として用いられるヒドロキシククルビツリルおよびその母体であるククルビツリルの例は、本出願人により出願された韓国特許出願第０２−６８３６２号、同第０２−３１８号、同０１−５７５７３号、同０１−３９７５６号、及び同００−３３０２６号にその構造式及び合成方法とともに開示されており、その全体が参照として本明細書中に含まれる。
【００５１】
前記化学式３の化合物は、化学式２のククルビツリル誘導体を貫通しうる。前記化学式３の化合物の一端は、固体基質に固定させるための官能基を、他端は、ＤＮＡまたは蛋白質を含む生体物質、あるいはセンサのための検出物質との結合のための官能基を有する。
【００５２】
前記化学式１のロタキサン化合物において、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して２級アンモニウム、１，４−置換ピリジニウム、またはベンジルアンモニウムであり、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して１級アミン基、アミド基、アクリルアミン基、アルキルエステル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アルコキシシラン基、ハロゲン化アシル基、ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン基、シアン基、イソシアン基またはイソチオシアン基でありうる。
【００５３】
前記化学式１のロタキサン化合物は、下記化学式５ないし化学式１３で表される化合物から選択されたものであることが望ましい：
【００５４】
【化１２】
【００５５】
【化１３】
【００５６】
【化１４】
【００５７】
【化１５】
【００５８】
【化１６】
【００５９】
【化１７】
【００６０】
【化１８】
【００６１】
【化１９】
【００６２】
【化２０】
【００６３】
前記化学式１のロタキサン化合物は、以下のように調製されうる。
【００６４】
当技術分野に公知されている一般的な有機合成方法で合成された化学式３の化合物と、本出願人が出願した韓国特許出願第０２−６８３６２号、同第０２−３１８号、同０１−５７５７３号、同０１−３９７５６号、または同００−３３０２６号に開示されている方法に基づき合成された化学式２の化合物とを、水、ジメチルホルムアミド、またはジメチルスルホキシドに溶解させて、化学式２の化合物と化学式３の化合物との自己組織化により化学式１の化合物が調製される。
【００６５】
前記化学式１のロタキサン化合物は、多様な末端官能基を有する修飾された固体基板に結合され、所望の固体基板が形成される。
【００６６】
前記化学式１の化合物は、０．０５ないし０．５個／ｎｍ２の密度で固体基板に結合されうる。前記固体基板は、ガラス、シリコンウェーハ、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）ガラス、酸化アルミニウム基板、または二酸化チタン基板でありうる。
【００６７】
前記化学式１のロタキサン化合物が結合した修飾された固体基板において、接合層を構成するロタキサン分子は、互いに所定の距離で離れて配置されうる。接合層の中での分子間の間隔は、前記化学式１の化合物を構成する化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の型によって決定される。
【００６８】
前記化学式１のロタキサン化合物が結合した固体基板は遺伝子チップの調製に用いられうる。
【００６９】
また、前記化学式１のロタキサン化合物が結合した固体基板は、蛋白質チップまたは生体物質分析用センサの調製に用いられうる。
【００７０】
化学式１のロタキサン化合物が結合した固体基板を利用して調製された遺伝子チップ、蛋白質チップ、及び生体物質分析用センサは、上にロタキサン分子が互いに所定の距離で離れて配置された接合層を有する。したがって、前記接合層の上に固定された遺伝子および蛋白質のような生体物質もまた規則的な間隔でありうる。また、前記バイオチップのための固体基板の接合層中の化学式１のロタキサン化合物は、生体物質と水素結合のような非特異的な結合を形成して接合層に固定化しうる官能基の数が少ないために、本発明の方法はより実用的になる。
【００７１】
発明の効果
上述のように、本発明のロタキサン化合物によって、固体基板に形成された接合層の中で、ロタキサン分子の一定の間隔が得られる。このため、高い感度および選択性を有するバイオチップを製造できる。
【００７２】
図面の簡単な説明
図１は、ククルビツリルまたはその誘導体の内部空洞に長鎖状化合物が垂直に貫通したロタキサン化合物から形成される接合層が結合した固体基板、および接合層を構成する分子間の間隔がククルビツリルまたはその誘導体の直径以上に対応する距離で互いに離れて配置される原理を図式的に表現した図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
以下、実施例を介して本発明をさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、単に本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例により制限されるものではない。
【実施例】
【００７４】
実施例１：ロタキサン化合物の調製
下記化学式４のスペルミン四塩酸１８０ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を水１０ｍｌに溶かし、ククルビト［６］ウリル（ＣＢ［６］）５００ｍｇ（０．５ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をメンブランフィルタで濾過し、濾液にヘキサフルオロリン酸アンモニウム３４０ｍｇ（２ｍｍｏｌ）を加えた。得られた沈殿をメンブランフィルタで濾過し、乾燥させて化学式５の化合物を得た。
【００７５】
【化２１】
【００７６】
【化２２】
【００７７】
実施例２：ロタキサン化合物の調製
化学式５の化合物１．０３ｇ（０．５８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド５０ｍｌに溶かした。塩化アクリロイル３９５ｍｌ（４．６２ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン３４８ｍｌ（２．３２ｍｍｏｌ）とを加え、撹拌した。反応が完了した後、塩化テトラブチルアンモニウムの飽和水溶液を加え、得られた沈殿をメンブランフィルタで濾過した後、乾燥させて化学式６の化合物を得た。
【００７８】
【化２３】
【００７９】
実施例３：固体基板の調製及び導入されたアミン基の密度測定
ピラニア溶液（硫酸：過酸化水素＝３：１混合物）でガラス基板を洗浄し、ガラス基板の表面にヒドロキシル基を導入し、その後窒素雰囲気下で１０ｍｌバイアルに入れた。次いで、（３−イソシアンプロピル）トリエトキシシランのトルエン溶液（１０ｍＭ）を入れ、常温で保管してシラン化を行った。
【００８０】
シラン化が完了した後、ガラス基板をトルエンで洗浄し、真空乾燥した。前記実施例１の化学式５の化合物のジメチルホルムアミド溶液とトリエチルアミン４当量とを加え、常温、窒素雰囲気下で撹拌した。その後、ガラス基板を無水ジメチルホルムアミドで洗浄し、エタノールアミンの無水ジメチルホルムアミド溶液に浸し、残っているイソシアンシランの反応性を除去し、希塩酸で洗浄して化学式１４の固体基板を得た：
【００８１】
【化２４】
【００８２】
実施例３のガラス基板上に存在するアミン基の密度は、９−アントラアルデヒドの蛍光を用いて測定した。このとき、９−アントラアルデヒドを用いた密度測定は、９−アントラアルデヒドの、化学式１のＣＢ［６］よりも小さいサイズに基づいている（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，１９，２００３，ｐ．２３５７）。
【００８３】
測定結果によると、実施例３のガラス基板の表面に存在するアミン基の表面密度は、０．１アミン／ｎｍ２と示された。
【００８４】
実施例４：固体基板の調製及び導入されたアミン基の密度測定
ピラニア溶液でガラス基板を洗浄し、ガラス基板の表面にヒドロキシル基を導入し、窒素雰囲気下で１０ｍｌバイアルに入れた。次いで、（３−アミノプロピル）トリエトキシシランのトルエン溶液（１０ｍＭ）を入れた後、常温で保管してシラン化を行った。
【００８５】
シラン化が完了した後、ガラス基板をトルエンで洗浄し、減圧下で１時間１２０℃に加熱した。前記ガラス基板を冷却し、１，４−ジイソチオシアン酸フェニルの無水ジメチルホルムアミド溶液に浸し、常温、窒素雰囲気下で撹拌した。
【００８６】
前記ガラス基板をきれいに洗浄し、前記実施例１の化学式５の化合物の無水ジメチルホルムアミド溶液とトリエチルアミン４当量とを加え、常温、窒素雰囲気下で撹拌した。その後、ガラス基板を無水ジメチルホルムアミドできれいに洗浄し、エタノールアミンの無水ジメチルホルムアミド溶液に浸し、残っているイソチオシアンシランの反応性を除去し、希塩酸で洗浄して下記化学式１５の固体基板を得た：
【００８７】
【化２５】
【００８８】
上述のように調製された前記化学式１５のガラス基板上に存在するアミン基密度を、前記実施例３と同様に測定した。
【００８９】
測定結果によると、前記化学式１５のガラス基板の表面に存在するアミン基の表面密度は、０．１アミン／ｎｍ２と示された。
【００９０】
実施例５：固体基板の調製及び導入されたアミン基の密度測定
ピラニア溶液でガラス基板を洗浄し、ガラス基板の表面にヒドロキシル基を導入し、その後、窒素雰囲気下で１０ｍｌバイアルに入れた。次いで、（３−チオールプロピル）トリエトキシシランのトルエン溶液（１０ｍＭ）を入れ、常温で保管してシラン化を行った。
【００９１】
シラン化が完了した後、ガラス基板をトルエンできれいに洗浄し、前記実施例２の化学式６の化合物の水溶液に加え、常温で撹拌した。ガラス基板を蒸溜水できれいに洗浄し、アクリロニトリルのジメチルホルムアミド溶液に浸して残った反応性を除去し、ジメチルホルムアミドとメタノールとで洗浄し、化学式１６の固体基板を得た：
【００９２】
【化２６】
【００９３】
前記化学式１６のガラス基板上に存在するアミン基の密度を、前記実施例３と同様に測定した。測定結果によると、前記化学式１６のガラス基板の表面に存在するアミン基の表面密度は、０．１アミン／ｎｍ２と示された。
【００９４】
密度の測定結果によれば、前記実施例３ないし実施例５で調製された固体基板上に存在するアミン基の密度は、アミノシランで修飾されたガラス基板に比べ、非常に低下していることが分かる。二本鎖ＤＮＡの直径が約２ｎｍであることを勘案すれば、ＤＮＡ１個当たり０．４個のアミンが対応するので、前記実施例３ないし実施例５のガラス基板は、ＤＮＡのハイブリダイゼーションの際に立体障害を生じない。また、Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓらが報告した方法によれば、固体基板上に存在するアミン基の密度が約０．０１アミン／ｎｍ２である。この点で、本発明の固体基板上のアミン基の密度は、従来の固体基板のものより１０倍高い。したがって、より高い検出感度が期待される。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ククルビツリルまたはその誘導体の内部空洞に長鎖状化合物が垂直に貫通したロタキサン化合物から形成される接合層が結合した固体基板、および接合層を構成する分子間の間隔がククルビツリルまたはその誘導体の直径以上に対応する距離で互いに離れて配置される原理を図式的に表現した図面である。
【符号の説明】
【００９６】
１ 固体基板、
２ 接合層、
３ 検出層、
４ ロタキサン化合物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の内部空洞に下記化学式３の化合物が垂直に貫通した下記化学式１の化合物：
【化１】
前記化学式１で、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、飽和もしくは不飽和のＣ２〜Ｃ１０の直鎖アルキレン、エチレングリコールオリゴマー、１，４−置換ベンゼン、または１，４−置換ピリジンであり、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の酸素原子とのイオン−双極子相互作用のための正に荷電した官能基であり、Ｙ１は、遺伝子または蛋白質を含む生体物質との結合のための官能基であり、Ｙ２は、固体基板との結合のための官能基であり、
【化２】
前記化学式２で、ｎは、４ないし２０の整数であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有し、末端が不飽和結合であるアルケニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有するカルボキシアルキルスルフィニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するカルボキシアルキルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するアミノアルキルオキシ基、または置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するヒドロキシアルキルオキシ基であり、
【化３】
前記化学式３で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１及びＹ２は、前記化学式１で定義された通りである。
【請求項２】
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して２級アンモニウム、１，４−置換ピリジニウム、またはベンジルアンモニウムであり、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して１級アミン基、アミド基、アクリルアミン基、アルキルエステル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アルコキシシラン基、ハロゲン化アシル基、ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン基、シアン基、イソシアン基またはイソチオシアン基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
下記化学式５ないし化学式１３で表される化合物からなる群から選択される請求項１に記載の化合物：
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【請求項４】
化学式１の化合物と共有結合または非共有結合を介して結合した固体基板。
【請求項５】
前記化学式１の化合物が０．０５ないし０．６個／ｎｍ２の密度で存在する、請求項４に記載の固体基板。
【請求項６】
ガラス、シリコンウェーハ、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）ガラス、酸化アルミニウム基板、または二酸化チタン基板である、請求項４に記載の固体基板。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の固体基板を含む遺伝子チップ。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の固体基板を含む蛋白質チップ。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の固体基板を含む生体物質分析用センサ。
【請求項１】
下記化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の内部空洞に下記化学式３の化合物が垂直に貫通した下記化学式１の化合物：
【化１】
前記化学式１で、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、飽和もしくは不飽和のＣ２〜Ｃ１０の直鎖アルキレン、エチレングリコールオリゴマー、１，４−置換ベンゼン、または１，４−置換ピリジンであり、Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して化学式２のククルビツリルまたはその誘導体の酸素原子とのイオン−双極子相互作用のための正に荷電した官能基であり、Ｙ１は、遺伝子または蛋白質を含む生体物質との結合のための官能基であり、Ｙ２は、固体基板との結合のための官能基であり、
【化２】
前記化学式２で、ｎは、４ないし２０の整数であり、Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立して水素、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有し、末端が不飽和結合であるアルケニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ２０のアルキル部分を有するカルボキシアルキルスルフィニルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するカルボキシアルキルオキシ基、置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するアミノアルキルオキシ基、または置換もしくは非置換のＣ２〜Ｃ８のアルキル部分を有するヒドロキシアルキルオキシ基であり、
【化３】
前記化学式３で、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１及びＹ２は、前記化学式１で定義された通りである。
【請求項２】
Ｘ１及びＸ２は、それぞれ独立して２級アンモニウム、１，４−置換ピリジニウム、またはベンジルアンモニウムであり、Ｙ１及びＹ２は、それぞれ独立して１級アミン基、アミド基、アクリルアミン基、アルキルエステル基、アルデヒド基、カルボキシル基、アルコキシシラン基、ハロゲン化アシル基、ヒドロキシル基、チオール基、ハロゲン基、シアン基、イソシアン基またはイソチオシアン基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
下記化学式５ないし化学式１３で表される化合物からなる群から選択される請求項１に記載の化合物：
【化４】
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【請求項４】
化学式１の化合物と共有結合または非共有結合を介して結合した固体基板。
【請求項５】
前記化学式１の化合物が０．０５ないし０．６個／ｎｍ２の密度で存在する、請求項４に記載の固体基板。
【請求項６】
ガラス、シリコンウェーハ、インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）ガラス、酸化アルミニウム基板、または二酸化チタン基板である、請求項４に記載の固体基板。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の固体基板を含む遺伝子チップ。
【請求項８】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の固体基板を含む蛋白質チップ。
【請求項９】
請求項４〜６のいずれか１項に記載の固体基板を含む生体物質分析用センサ。
【図１】
【公表番号】特表２００７−５２１２８９（Ｐ２００７−５２１２８９Ａ）
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１８５４１（Ｐ２００６−５１８５４１）
【出願日】平成１６年７月５日（２００４．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１６５１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３１３６
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５００３４５４７８）ポステック・ファウンデーション (25)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年８月２日（２００７．８．２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年７月５日（２００４．７．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００４／００１６５１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３１３６
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５００３４５４７８）ポステック・ファウンデーション (25)
【Ｆターム（参考）】
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