ロミデプシンをベースとする癌の処置
本発明は、ロミデプシンを調製するための改善されたプロセスを提供する。上記プロセスは、望ましくない付加生成物の形成を妨げる条件下で、ロミデプシンを生成するか、精製するか、または貯蔵する工程を包含する。約６．０より低い見かけのｐＨ（例えば、４．０〜６．０の間の見かけのｐＨ）でのロミデプシンの精製は、ロミデプシンのジスルフィド結合の還元、およびその後のダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化した付加生成物の形成を防止することが決定された。本発明はまた、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化した付加生成物を含まないモノマー性ロミデプシンの薬学的組成物を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００６年１２月２９日に出願された、米国仮特許出願第６０／８８２，７１２号に対する優先権を主張し、この出願は本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ロミデプシン（Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ）は、藤沢薬品工業によってＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍから単離された天然の生成物である。特許文献１（１９９５）；特許文献２（１９９０年１２月１１日発行）（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。ロミデプシンは、４つのアミノ酸残基（Ｄ−バリン、Ｄ−システイン、デヒドロブチリン（ｄｅｈｙｄｒｏｂｕｔｙｒｉｎｅ）、およびＬ−バリン）からなる二環式ペプチドであり、かつ新規な酸（３−ヒドロキシ−７−メルカプト−４−ヘプタン酸）である。ロミデプシンは、アミド結合およびエステル結合の両方を含むデプシペプチドである。発酵を使用するＣ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍの生成に加えて、ロミデプシンはまた、合成手段または半合成手段によって調製され得る。Ｋａｈｎらによって報告されたロミデプシンの全合成は、１４工程を要し、１８％の全体収率でロミデプシンを生じる。非特許文献１を参照のこと。ロミデプシンの構造は、以下に示される：
【０００３】
【化１】
ロミデプシンは、抗微生物活性、免疫抑制活性、および抗腫瘍活性を有することが示された。ロミデプシンは、例えば、血液悪性疾患（例えば、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫など）および固形腫瘍（例えば、前立腺癌、膵臓癌など））を有する患者を処置することにおいて使用するために、現在試験している最中である。デアセチラーゼ（例えば、ヒストンデアセチラーゼ、チューブリンデアセチラーゼ）を選択的に阻害することによって作用することが考えられ、新たな標的が抗癌治療の新たなクラスを開発する見込みがある。Ｎａｋａｊｉｍａら，非特許文献２。作用の１つの様式は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の１つ以上のクラスの阻害を包含する。
【０００４】
ヒストンデアセチラーゼは、その作用部位に亜鉛を有するメタロデアセチル化酵素である。Ｆｉｎｎｉｎら，非特許文献３。この酵素は、ＤＮＡに対するアセチル化ヒストンのアフィニティーを調節することによって、特定の遺伝子の発現を調節すると考えられる。ヒストンのアセチル化は、アセチル化と脱アセチル化との間のバランスによって制御される。上記ヒストンのアセチル化は、上記ヒストンタンパク質のリジン残基において起こる。上記リジン残基のアセチル化は、上記タンパク質にその正の電荷のうちのいくらかを喪失させ、それによって、ＤＮＡとのその相互作用を低下させる。ロミデプシンは、ヒストンの上記増大したアセチル化および処理細胞における他の調節性タンパク質を引き起こすことが見いだされた。このことは、細胞周期制御、分化、およびアポトーシスに関与する種々の遺伝子の転写性制御に影響を及ぼす。より最近では、ＨＤＡＣインヒビターは、自食作用の制御に関与していた。
【０００５】
ロミデプシンに加えて、種々の誘導体が調製および研究されてきた。以下の特許および特許出願は、種々のロミデプシンの誘導体を記載している：特許文献３；特許文献４；特許文献５；および特許文献６；これらの各々は、本明細書に参考として援用される。
【０００６】
薬剤としてのロミデプシンにおける関心を考慮すれば、コスト効率的な様式で大量の高度に精製された物質を調製する必要性がある。ロミデプシンを発酵ブロスから精製する種々の研究が、報告されてきた。特許文献７；特許文献８；これらの各々は、本明細書に参考として援用される。例えば、特許文献８は、特定のアミノ酸（例えば、Ｌ−システイン）を培養培地に添加することによる、発酵プロセスからのロミデプシンの生成の増大を記載している。このような発見は、発酵によるロミデプシンの改善された生成を提供してきたが、研究用途および医療用途のために大量の純粋なロミデプシンを調製するよりよい方法が未だ必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−６４８７２号公報
【特許文献２】米国特許第４，９７７，１３８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５４８，４７９号明細書
【特許文献４】国際公開第０５／０２０９１３４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０５／０５８２９８号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０６／１２９１０５号パンフレット
【特許文献７】米国特許第４，９７７，１３８号明細書
【特許文献８】国際公開第０２／２０８１７号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：７２３７−７２３８，１９９６
【非特許文献２】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２４１：１２６−１３３，１９９８
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ，４０１：１８８−１９３，１９９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、純粋なロミデプシン（特に、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンのような夾雑物を含まないロミデプシン）を再現可能に生成しないという認識に基づいている。この認識に基づくと、本発明は、これら夾雑する副生成物のレベルを減少させる条件下で、ロミデプシンを再現可能に調製するためのシステムを提供する。約６．５未満の、より好ましくは、約６．０未満の見かけのｐＨで、ロミデプシンを生成、精製および／または貯蔵することによって、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンの形成が妨げられることが見いだされた。ロミデプシンの精製プロセスにおけるこの改善は、公知のプロセスによって提供されるものより、高い収量のロミデプシンおよび／または高い純度のロミデプシンを可能にする。このような改善は、ヒトにおける使用のための製薬グレードのロミデプシンを調製するのに特に有用である。
【００１０】
ロミデプシンは、代表的には、天然の生成物を生成する微生物（例えば、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）の培養物からロミデプシンを精製することによって生成される。本発明は、その後に、ダイマー化、オリゴマー化、またはポリマー化して、望ましくない夾雑物を形成し得る、減少したロミデプシンの形成を排除もしくは低下させるために、上記精製工程のうちの少なくともいくつかの間に、低い見かけのｐＨを維持することが必要であることを実証する。
【００１１】
上記精製工程のうちの１つ以上は、６．５未満の見かけのｐＨ、またはさらには６．０未満の見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、１つ以上の精製工程は、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、上記精製工程のうちのすべてが、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。望ましくない夾雑物の形成を妨げるために、ロミデプシンを含む溶液の見かけのｐＨは、約７．０を上回るか、またはより好ましくは約６．０を上回る見かけのｐＨに達することを許容しない。すべての生成プロセスの見かけのｐＨは、好ましくは、モニターされ、かつその後に、必要であれば、約６．０未満の見かけのｐＨに調節される。特定の実施形態において、それは、約４．０〜約６．０の見かけのｐＨ範囲内で維持される。水溶液を使用して上記プロセスもしくは工程の最後近くに、精製工程における見かけのｐＨの制御は、望ましくない夾雑物の形成を減少もしくは排除することにおいて特に有用であることが見いだされた。任意の酸もしくは緩衝剤が、ｐＨを制御するために使用され得る。特定の実施形態において、有機酸（例えば、酢酸もしくはギ酸）は、上記精製工程のうちの１つ以上においてｐＨを制御するために使用される。特定の実施形態において、無機酸（例えば、リン酸もしくは塩酸）が使用される。
【００１２】
ロミデプシンを精製するための任意のプロセスは、発酵からであろうと、半合成であろうと、全合成であろうと、見かけのｐＨをモニターし、必要であれば、見かけのｐＨを低下させることによって、望ましくない副生成物の形成を妨げるように、本発明に基づいて改変され得る。
【００１３】
一局面において、本発明は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの培養物からロミデプシンを調製するためのプロセスを提供する。その発酵ブロスは、上記培養物中の微生物を不活性化もしくは死滅させるために、酸性化される。上記酸性化された発酵ブロスは、予備的に、バッチまたはカラムクロマトグラフィーによって精製される。その後、複数のカラムクロマトグラフィー工程が、所望のレベルの純度を達成するために使用され得る。特定の実施形態において、上記第１のクロマトグラフィーは、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８５０（非イオン性吸着樹脂）を利用する。上記ロミデプシンは、さらなるカラムクロマトグラフィー工程によってさらに精製され得る。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、その後、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳ樹脂を使用するカラムクロマトグラフィー、続いて、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０樹脂を使用するカラムクロマトグラフィー、そして最後に、アルミナ上でのカラムクロマトグラフィーによって、精製される。特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィーは、約４〜約６の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。特定の具体的な実施形態において、上記第２のカラムクロマトグラフィー工程は、低下した見かけのｐＨ（例えば、約４〜６の見かけのｐＨ）において行われる。上記ロミデプシンは、必要に応じて、結晶化によってさらに精製される。１つ以上の結晶化工程が、行われ得る。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、まず、メタノールを使用して結晶化され、次いで、８５％ アセトン水溶液を使用して結晶化される。その得られたロミデプシンは、次いで、必要に応じて、濾過され、洗浄され、乾燥される。特定の実施形態において、上記結晶化工程または任意のその後の工程は、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ、低下した見かけのｐＨにおいて行われる。最後の工程は、低下した見かけのｐＨにおいて行われることが特に重要である。なぜなら、その後のいかなる精製工程も、望ましくない夾雑物を除去するために利用しないからである。発酵および／もしくは精製プロセスにおいて使用される任意の設備（例えば、管系、ポンプ、フィルター、乾燥機など）は、水もしくは酸性溶液（例えば、酢酸）で洗浄して、上記設備上の任意のアルカリ性残渣も除去もしくは中和する。
【００１４】
さらに、ロミデプシンの薬学的投与形態の調製（賦形剤、溶媒、共溶媒、および／もしくはロミデプシンの薬理学的活性を増強するために使用される他の薬剤と混ぜ合わせる工程を包含する）は、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンの形成を最小にするために、低下した見かけのｐＨ（例えば、約４．０未満の見かけのｐＨ）において行われ得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、夾雑するダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンを実質的に含まない、ロミデプシンの組成物を提供する。本発明によって提供されるロミデプシンは、９８％より多くがモノマー性であるか、９９％より多くがモノマー性であるか、９９．９５％より多くがモノマー性であるか、または９９．９％より多くがモノマー性である。いくつかの実施形態において、上記ロミデプシンは、すべての夾雑物に関して、好ましくは、９８％より高い純度であるか、９９％より高い純度であるか、９９．９５％より高い純度であるか、または９９．９％より高い純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、１．０％未満、０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満のすべての他の未知の物質を含む。ロミデプシンの組成物は、好ましくは、検出可能な、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化した物質を含まない。上記ロミデプシンの純度は、代表的には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、赤外線分光法、粉末ｘ線回折（ＸＲＰＤ）分析、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、比旋光度、またはＮＭＲ分光法によって決定される。特定の実施形態において、上記純度は、ロミデプシンのクロロホルム溶液の比旋光度を測定することによって決定される。本発明はまた、約６．０未満、好ましくは、約４．０〜約６．０の間の上記調製物の見かけのｐＨを維持する、ロミデプシンの緩衝化調製物を提供する。このような調製物は、代表的には、長期化した貯蔵寿命を有する。
【００１６】
（定義）
特定の官能基および化学用語の定義は、以下でより詳細に記載される。本発明の目的のために、化学元素は、元素周期表（ＣＡＳバージョン，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，第７５版，表紙の裏側）に従って同定され、そして特定の官能基は、一般に、本明細書に記載されるように定義される。さらに、有機化学の一般原理、ならびに特定の官能部分および反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９（その全体は、本明細書に参考として援用される）に記載される。
【００１７】
本発明の特定の化合物は、特定の幾何形態（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｆｏｒｍ）または立体異性形態において存在し得る。本発明は、すべてのこのような化合物（ｃｉｓ−異性体およびｔｒａｎｓ−異性体、Ｅ−異性体およびＺ−異性体、Ｒ−鏡像異性体およびＳ−鏡像異性体、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、（−）−異性体および（＋）−異性体、それらのラセミ混合物、ならびにそれらの他の混合物を含む）を、本発明の範囲内に入るものとして企図する。さらなる不斉炭素原子は、置換基（例えば、脂肪族（例えば、アルキル）またはヘテロ脂肪族基）中に存在し得る。すべてのこのような異性体、およびこれらの混合物は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００１８】
任意の種々の異性体の比を含む異性体混合物は、本発明に従って利用され得る。例えば、２種のみの異性体が合わされる場合、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、９９：１、もしくは１００：０の異性体比を含む混合物は、本発明によってすべて企図される。当業者は、類似の比が、より複雑な異性体混合物について企図されることを容易に認識する。
【００１９】
上記化合物は、本明細書に記載されるように、任意の数の置換基もしくは官能部分で置換され得ることが認識される。一般に、用語「必要に応じて」が先行していようといまいと、用語「置換された」、および本発明の式に含まれる置換基は、所定の構造中の水素ラジカルが、特定の置換基のラジカルで置換されていることをいう。特定の実施形態において、所定の構造中の１つの水素ラジカルのみが、特定の置換基のラジカルで置換される。他の実施形態において、所定の構造中の１個、２個、または３個の水素ラジカルは、特定の置換基の同じもしくは異なるラジカルで置換される。任意の所定の構造において、１個より多くの位置が、特定の基から選択される１個より多い置換基で置換され得る場合、上記置換基は、あらゆる位置で同じであってもよいし、異なっていてもよい。本明細書で使用される場合、用語「置換された」とは、すべての許容可能な置換基もしくは有機化合物を含むことが企図される。広い局面において、上記許容可能な置換基としては、有機化合物の、非環式および環式、分枝状および非分枝状、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族の置換基が挙げられる。本発明の目的のために、窒素のようなヘテロ原子は、水素置換基および／または上記ヘテロ原子の結合価を満たす、本明細書に記載される有機化合物の任意の許容可能な置換基を有し得る。さらに、本発明は、有機化合物の上記許容可能な置換基によって、いかなる様式でも制限されることを意図しない。本発明によって想定される置換基と変数との組み合わせは、好ましくは、上記処置において有用な、例えば、増殖性疾患（例えば、癌）の処置において有用な安定な化合物の形成を生じるものである。用語「安定な」とは、本明細書で使用される場合、好ましくは、製造を可能にするに十分な安定性を有し、かつ検出されるのに十分な期間にわたって、好ましくは、本明細書に記載される目的に有用であるに十分な期間にわたって、上記化合物の完全性を維持する化合物に言及する。
【００２０】
用語「脂肪族」とは、本明細書で使用される場合、飽和および不飽和両方の、直鎖状（すなわち、分枝していない）、分枝状、非環式、環式、もしくは多環式の脂肪族炭化水素を含み、これらは、必要に応じて、１個以上の官能基で置換される。当業者によって認識されるように、「脂肪族」とは、以下を含むがそれらに限定されないことが本明細書で意図される：アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルの部分。従って、本明細書で使用される場合、用語「アルキル」とは、直鎖状、分枝状、および環式のアルキル基を含む。類似の慣習は、他の包括的な用語（例えば、「アルケニル」、「アルキニル」など）に適用する。さらに、本明細書で使用される場合、用語「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」などは、置換された基および置換されていない基の両方を包含する。特定の実施形態において、本明細書で使用される場合、「低級アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有するそれらのアルキル基（環状、非環状、置換された、置換されていない、分枝状、または非分枝状）を示すために使用される。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜２０個の脂肪族炭素原子を含む。特定の他の実施形態において、本明細書中において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜１０個の脂肪族炭素原子を含む。なお他の実施形態において、本発明において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜８個の脂肪族炭素原子を含む。なお他の実施形態において、本発明において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜６個の脂肪族炭素原子を含む。なお他の実施形態において、本発明において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜４個の炭素原子を含む。従って、例示的な脂肪族基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、−ＣＨ２−シクロプロピル、ビニル、アルキル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、−ＣＨ２−シクロブチル、ｎ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、シクロペンチル、−ＣＨ２−シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、シクロヘキシル、−ＣＨ２−シクロヘキシル部分などが挙げられるが、これらに限定されない。これらは、繰り返すと、１個以上の置換基を含んでいてもよい。アルケニル基としては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアルキニル基としては、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−プロピニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の化合物の上記の脂肪族（および他の）部分の置換基のいくつかの例としては、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘが挙げられるが、これらに限定されない。ここでＲｘの各出現は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルが挙げられるが、これらに限定されず、上記および本明細書中の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のうちのいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよいし、分枝状であっても分枝状でなくてもよいし、環状であっても非環状であってもよいし、そして上記および本明細書中のアリールまたはヘテロアリール置換基のうちのいずれかは、置換されていてもよいし、置換されていてもよい。一般に適用可能である置換基のさらなる例は、本明細書に記載される実施例に示される具体的実施形態によって例示される。
【００２３】
一般に、用語「アリール」および「ヘテロアリール」とは、本明細書で使用される場合、好ましくは、３〜１４個の炭素原子を有する、安定な単環式または多環式の、複素環式の、多環式の、および複素多環式（ｐｏｌｙｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）の不飽和部分であって、それらの各々は、置換されていても置換されていなくてもよいものをいう。置換基としては、上記で言及した置換基（すなわち、脂肪族部分、または本明細書において定義される他の部分に関して記載される置換基）のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されず、安定な化合物の形成を生じる。本発明の特定の実施形態において、「アリール」とは、１個もしくは２個の芳香族環（フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが挙げられるが、これらに限定されない）を有する単環式もしくは二環式の炭素環式環系をいう。本発明の特定の実施形態において、用語「ヘテロアリール」とは、本明細書で使用される場合、５〜１０個の環原子を有する環式の芳香族ラジカルであって、上記環原子のうちの１つの環原子は、Ｓ、Ｏ、およびＮから選択され；０個、１個、または２個の環原子が、Ｓ、Ｏ、およびＮから独立して選択されるさらなるヘテロ原子であり；その残りの環原子が炭素であり、上記ラジカルは、上記環原子のうちのいずれかを介して上記分子の残りに結合されるもの（例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなど）をいう。
【００２４】
アリールおよびヘテロアリール基が置換されていなくてもよいし、置換されていなくてもよく、ここで置換は、その上の水素原子の１個、２個、３個以上は、以下の部分のうちのいずれか１個以上での独立した置換を含むことが認識される。上記部分としては、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘ，が挙げられるが、これらに限定されない。ここでＲｘの各出現は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、もしくはヘテロアリールアルキルが挙げられるが、これらに限定されず、上記および本明細書に記載される脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、もしくはヘテロアリールアルキル置換基のうちのいずれかは、置換されていても、置換されていなくてもよいし、分枝状であっても分枝していなくてもよいし、環式であっても非環式であってもよいし、上記および本明細書に記載されるアリールもしくはヘテロアリール置換基のうちのいずれかは、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。一般に適用可能な置換基のさらなる例は、本明細書に記載される実施例に示される具体的な実施形態によって例示される。
【００２５】
用語「ヘテロ脂肪族」とは、本明細書で使用される場合、例えば、炭素原子の代わりに、１個以上の酸素、硫黄、窒素、リン、またはケイ素原子を含む脂肪族部分をいう。ヘテロ脂肪族部分は、分枝状であっても、非分枝状であっても、環式であっても、非環式であってもよく、飽和および不飽和の複素環（例えば、モルホリノ、ピロリジニルなど）を包含する。特定の実施形態において、ヘテロ脂肪族部分は、その上の水素原子のうちの１個以上を、１個以上の以下の部分で独立して置換することによって、置換されており、上記１個以上の部分としては、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘが挙げられるが、これらに限定されず、ここでＲｘの各出現は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルが挙げられるが、これらに限定されず、上記および本明細書に記載される脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のうちのいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよく、分枝状であっても非分枝状であってもよく、環式であっても非環式であってもよく、そして上記または本明細書に記載されるアリールもしくはヘテロアリール置換基のうちのいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよい。一般に適用可能な置換基のさらなる例は、本明細書に記載される実施例に示される具体的実施形態によって例示される。
【００２６】
用語「ハロ」および「ハロゲン」とは、本明細書で使用される場合、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される原子をいう。
【００２７】
「独立して選択される」：用語「独立して選択される」とは、Ｒ基が同一であり得るかまたは異なり得ることを示すために、本明細書で使用される。
【００２８】
本明細書を通じて使用される他の用語の定義は、以下を包含する：
「酸」：用語「酸」は、本明細書で使用される場合、無機酸および有機酸をいう。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、およびリン酸が挙げられるが、これらに限定されない。有機酸の例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸が挙げられるが、これらに限定されない。任意の酸が、上記緩衝剤またはロミデプシンの溶液またはロミデプシンの精製において使用されるもののｐＨを調節するために使用され得る。特定の実施形態において、酢酸が使用される。特定の実施形態において、塩酸が使用される。特定の実施形態において、クエン酸が使用される。特定の実施形態において、硫酸が使用される。
【００２９】
「デプシペプチド」：用語「デプシペプチド」とは、本明細書で使用される場合、エステル結合およびアミド結合の両方を含むポリペプチドをいう。天然に存在するデプシペプチドは、通常は環状である。いくつかのデプシペプチドは、強力な抗菌活性を有することが示された。デプシペプチドの例としては、アクチノマイシン、エニアチン、バリノマイシン、およびロミデプシンが挙げられる。
【００３０】
「ペプチド」または「タンパク質」：本発明によれば、「ペプチド」または「タンパク質」とは、ペプチド結合によっていっしょに連結される少なくとも３個のアミノ酸のつながりを含む。用語「タンパク質」および「ペプチド」は、交換可能に使用され得る。ペプチドは、好ましくは、天然のアミノ酸のみを含むが、天然でないアミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る化合物）および／または当該分野で公知のアミノ酸アナログが、代わりに使用され得る。また、ペプチド中のアミノ酸のうちの１個以上は、例えば、化学的実体（例えば、炭水化物基、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、結合、官能化、もしくは他の改変のためのリンカーなど）の付加によって改変され得る。特定の実施形態において、上記ペプチドの改変は、より安定なペプチド（例えば、インビボでのより長い半減期）をもたらす。これら改変としては、上記ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組み込みなどが挙げられ得る。上記改変はいずれも、上記ペプチドの望ましい生物学的活性を実質的に妨害するべきでない。特定の実施形態において、ペプチドとは、デプシペプチドをいう。
【００３１】
「ロミデプシン」：用語「ロミデプシン」とは、以下の化学構造：
【００３２】
【化２】
の天然の生成物をいう。ロミデプシンは、強力なＨＤＡＣインヒビターであり、そしてまた、名称ＦＫ２２８、ＦＲ９０１２２８、ＮＳＣ６３０１７６、またはデプシペプチドによって当該分野で公知である。ロミデプシンの同定および調製は、米国特許第４，９７７，１３８号（これは、本明細書に参考として援用される）に記載される。その分子式は、Ｃ２４Ｈ３６Ｎ４Ｏ６Ｓ２である；そしてその分子量は、５４０．７１である。ロミデプシンは、化学名（１Ｓ，４Ｓ，１０Ｓ，１６Ｅ，２１Ｒ）−７−［（２Ｚ）−エチリデン］−４，２１−ジイソプロピル−２−オキサ−１２，１３−ジチア−５，８，２０，２３−テトラアザビシクロ［８．７．６］トリコス−１６−エン−３，６，９，１９，２２−ペンタノンである。ロミデプシンは、ＣＡＳ番号１２８５１７−０７−７を割り当てられた。結晶形態において、ロミデプシンは、代表的には、白色から淡黄白色の結晶または結晶様粉末である。用語「ロミデプシン」とは、この化合物およびその任意の薬学的に受容可能な塩形態を包含する。特定の実施形態において、上記用語「ロミデプシン」はまた、そのプロドラッグ、エステル、保護された形態、および誘導体を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ロミデプシンをＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの培養物から精製するためのフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（本発明の特定の実施形態の詳細な説明）
本発明は、ロミデプシン（癌の処置において有用な公知のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）インヒビター）を調製するための改善されたシステムを提供する。不運なことに、ロミデプシンを調製するための公開された方法は、純粋な、モノマー性のロミデプシンを再現可能に精製しない。驚くべきことに、上記精製プロセスの間のｐＨ制御は、純粋なモノマー性のロミデプシンを再現可能に提供することが見いだされた。特に、低下した見かけのｐＨ（例えば、４〜６の範囲に及ぶ見かけのｐＨ）で上記精製の少なくとも特定の部分を行うことは、ダイマー化、オリゴマー化、またはポリマー化した副生成物が夾雑することなく、精製されたモノマー性のロミデプシンのより高い収量を生じる。
【００３５】
ロミデプシンは、ジスルフィド結合を有する環状デプシペプチドである。本発明は、ロミデプシンを塩基性条件（例えば、約７より高い見かけのｐＨ）に曝すことによって、このジスルフィド結合の還元が促進されるという発見に基づく。その遊離のチオールを有する還元されたロミデプシンは、ダイマー化、オリゴマー化、またはポリマー化を受けやすいことが見いだされた。このような付加生成物は、代表的には、不溶性でありかつ精製されたロミデプシンから除去することは困難である。特定の実施形態において、このような夾雑する付加生成物は、ロミデプシンの調製物が望ましい仕様（例えば、溶解度、純度、旋光度など）を満たすことを妨げる。薬学的組成物において、これら付加生成物は、活性薬剤であるロミデプシンの純度を低下させる。ロミデプシンは、ヒトにおいて薬剤として使用されているので、純粋で安定なモノマー性のロミデプシンが、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの発酵から再現可能に得られることは重要である。本発明は、アルカリ性条件が、これらの望ましくないロミデプシン付加生成物の形成を引き起こすという認識から起こり、そしてこの課題に対する新たな解決策を提供する。
【００３６】
本発明のシステムはまた、ロミデプシンの誘導体、特に、ジスルフィド結合を含む誘導体を調製することにおいて有用である。特定の実施形態において、ロミデプシンの誘導体は、式（Ｉ）のものである：
【００３７】
【化３】
ここで
ｍは、１、２、３もしくは４であり；
ｎは、０、１、２もしくは３であり；
ｐおよびｑは、独立して、１もしくは２であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、もしくはＮＲ８であり；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立して、水素；置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；不飽和もしくは飽和の、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式のヘテロ脂肪族；置換されているかもしくは置換されていないアリール；または置換されていないかもしくは置換されているヘテロアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素；または置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；およびその薬学的に受容可能な塩である。特定の実施形態において、ｍは１である。特定の実施形態において、ｎは１である。特定の実施形態において、ｐは１である。特定の実施形態において、ｑは１である。特定の実施形態において、ＸはＯである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、非環式脂肪族である。特定の実施形態において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、すべて水素である。
【００３８】
特定の実施形態において、ロミデプシンの誘導体は、式（ＩＩ）のものである：
【００３９】
【化４】
ここで：
ｍは、１、２、３もしくは４であり；
ｎは、０、１、２もしくは３であり；
ｑは、２もしくは３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、もしくはＮＲ８であり；
Ｙは、ＯＲ８もしくはＳＲ８であり；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素；置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式のヘテロ脂肪族；置換されていないかもしくは置換されているアリール；または置換されていないかもしくは置換されているヘテロアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素；または置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；およびその薬学的に受容可能な塩から独立して選択される。特定の実施形態において、ｍは１である。特定の実施形態において、ｎは１である。特定の実施形態において、ｑは２である。特定の実施形態において、ＸはＯである。他の実施形態において、ＸはＮＨである。特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、非環式の脂肪族である。特定の実施形態において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、すべて水素である。
【００４０】
特定の実施形態において、ロミデプシンの誘導体は、（ＩＩＩ）のものである：
【００４１】
【化５】
ここでＡは、チオール基を生じるように生理学的条件下で切断される部分であり、そして例えば、脂肪族部分もしくは芳香族アシル部分（チオエステル結合を形成するために）；脂肪族もしくは芳香族チオキシ（ａｒｏｍａｔｉｃ ｔｈｉｏｘｙ）（ジスルフィド結合を形成するために）など；およびそのラセミ混合物、鏡像異性体、異性体、互変異性体、塩、エステル、およびプロドラッグを含む。このような脂肪族もしくは芳香族の基は、置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族基；置換されているかもしくは置換されていない芳香族基；置換されているかもしくは置換されていないヘテロ芳香族基；または置換されているかもしくは置換されていない複素環式基を含み得る。Ａは、例えば、−ＣＯＲ１、−ＳＣ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ１、もしくは−ＳＲ２であり得る。Ｒ１は、独立して、水素；置換されているかもしくは置換されていないアミノ；置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；置換されているかもしくは置換されていない芳香族基；置換されているかもしくは置換されていないヘテロ芳香族基；または置換されているかもしくは置換されていない複素環式基である。特定の実施形態において、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ベンジル、もしくはブロモベンジルである。Ｒ２は、置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族基；置換されているかもしくは置換されていない芳香族基；置換されているかもしくは置換されていないヘテロ芳香族基；または置換されているかもしくは置換されていない複素環式基である。特定の実施形態において、Ｒ２は、メチル、エチル、２−ヒドロキシエチル、イソブチル、脂肪酸、置換されているかもしくは置換されていないベンジル、置換されているかもしくは置換されていないアリール、システイン、ホモシステイン、またはグルタチオンである。
【００４２】
特定の実施形態において、ロミデプシンの誘導体は、式（ＩＶ）もしくは（ＩＶ’）のものである：
【００４３】
【化６】
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、同じであるかまたは異なっており、そしてアミノ酸側鎖部分を表し、各Ｒ６は、同じであるかまたは異なっており、そして水素もしくはＣ１−Ｃ４アルキルを表し、そしてＰｒ１およびＰｒ２は、同じであるかもしくは異なっており、そして水素もしくはチオール保護基を表す。特定の実施形態において、上記アミノ酸側鎖部分は、天然のアミノ酸から由来するものである。他の実施形態において、上記アミノ酸側鎖部分は、非天然のアミノ酸に由来するものである。特定の実施形態において、各アミノ酸側鎖は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ２−Ｃ６アルケニル、−Ｌ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ’、−Ｌ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ”、−Ｌ−Ａ、−Ｌ−ＮＲ”Ｒ”、−Ｌ−Ｈｅｔ−Ｃ（Ｏ）−Ｈｅｔ−Ｒ”、および−Ｌ−Ｈｅｔ−Ｒ”から選択される部分であり、ここでＬは、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基であり、Ａは、フェニルまたは５員もしくは６員のヘテロアリール基であり、各Ｒ’は、同じであるかもしくは異なっており、そしてＣ１−Ｃ４アルキルを表し、各Ｒ”は、同じであるかもしくは異なっており、そしてＨもしくはＣ１−Ｃ６アルキルを表し、各−Ｈｅｔ−は、同じであるかもしくは異なっており、そして−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’’’）−、および−Ｓ−から選択されるヘテロ原子スペーサーであり、各Ｒ’’’は、同じであるかもしくは異なっており、そしてＨもしくはＣ１−Ｃ４アルキルを表す。特定の実施形態において、Ｒ６は−Ｈである。特定の実施形態において、Ｐｒ１およびＰｒ２は、同じであるかもしくは異なっており、そして水素、ならびに必要に応じてＣ１−Ｃ６アルコキシによって置換されるベンジル基、Ｃ１−Ｃ６アシルオキシ、ヒドロキシ、ニトロ、ピコリル、ピコリル−Ｎ−オキシド、アントリルメチル、ジフェニルメチル、フェニル、ｔ−ブチル、アダマンチル、Ｃ１−Ｃ６アシルオキシメチル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジルチオメチル、フェニルチオメチル、チアゾリジン、アセトアミドメチル、ベンズアミドメチル、三級ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アセチルおよびその誘導体、ベンゾイルおよびその誘導体、カルバモイル、フェニルカルバモイル、およびＣ１−Ｃ６アルキルカルバモイルから選択される保護基から選択される。特定の実施形態において、Ｐｒ１およびＰｒ２は水素である。式（ＩＶ）および（ＩＶ’）の種々のロミデプシン誘導体は、公開されたＰＣＴ出願 ＷＯ ２００６／１２９１０５（２００６年１２月７日に公開；これは、本明細書に参考として援用される）において開示される。
【００４４】
本発明はまた、ジスルフィド連結を含む他の天然の生成物の調製において有用である。本発明は、環式もしくは非環式のペプチドの調製において使用され得る。特定の実施形態において、ジスルフィド結合を含む環式ペプチドは、本発明のシステムを使用して精製される。特定の実施形態において、ロミデプシン以外の他のデプシペプチドは、低下した見かけのｐＨを使用して、分子内ジスルフィド結合の還元を制限もしくは排除するという、本発明に基づいて精製される。
【００４５】
本発明によれば、ロミデプシンもしくはロミデプシンの誘導体の望ましくない付加生成物の形成は、ロミデプシンを、約７．０より大きい見かけのｐＨ、より好ましくは、約６．５より大きい見かけのｐＨ、もしくは最も好ましくは、約６．０より大きい見かけのｐＨの条件下で調製もしくは精製しないことによって、妨げられ得る。上記調製および精製は、代表的には、約４．０の見かけのｐＨ〜約６．０の見かけのｐＨの間で維持される。特定の実施形態において、さらに低い見かけのｐＨが使用され得る。この認識は、ロミデプシンを調製するための任意の生成法もしくは精製法に適用され得る。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、発酵物から精製される。他の実施形態において、ロミデプシンは、半合成もしくは全合成によって調製される。この発見はまた、ロミデプシンのアナログもしくは誘導体（例えば、塩、エステル、プロドラッグ、異性体、鏡像異性体、互変異性体、保護形態、誘導体化生成物など）の調製および／または生成に適用され得る。ロミデプシンの特定の誘導体は、本明細書に記載される。
【００４６】
ロミデプシンを調製するためのプロセスは、当該分野で公知である。例えば、Ｕｅｄａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）４７：３０１−３１０，１９９４；Ｎａｋａｊｉｍａら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２４１：１２６−１３３，１９９８；ＷＯ ０２／２０８１７；米国特許第４，９７７，１３８号を参照のこと；これらの各々は、本明細書に参考として援用される。ロミデプシンは、天然の生成物であるので、代表的には、これを生成する微生物の発酵物から単離することによって調製される。特定の実施形態において、上記微生物は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。ロミデプシンを生成することが公知である例示的微生物は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍである。任意の天然もしくは人工の改変体のＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍは、本発明のシステムを使用して、ロミデプシンを単離するために使用され得る。特定の実施形態において、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの株は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＷＢ９６８である。特定の実施形態において、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの株は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＷＢ９６８の変異株である。特定の実施形態において、上記微生物は、ロミデプシンを生成するように遺伝的に動作されている。例えば、ロミデプシンを生成する細胞機構を担う遺伝子は、別の微生物（例えば、細菌もしくは真菌）に配置され得る。
【００４７】
上記生物は、ロミデプシンの生成に適した条件下で増殖される。好ましくは、上記培養条件は、最小レベルの夾雑付加生成物もしくは分解物で、高レベルのロミデプシンを生成するように最適化される。上記培養培地は、好ましくは、窒素源および炭素源、ならびに任意の必須ビタミンおよびミネラルを含む。上記培養は、代表的には、好気条件下で増殖される。上記培養の大きさは、１０ｍＬ〜１０，０００Ｌまたはそれ以上の範囲に及び得る。特定の実施形態において、上記培養容積は、５００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、１０００Ｌより大きい。なお他の実施形態において、上記容積は、２０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、３０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、５０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、６０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、７０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、８０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、９０００Ｌより大きい。特定の実施形態において、上記培養容積は、約５０００Ｌ〜約１００００Ｌの範囲に及ぶ。微生物を発酵するにおいて有用な振盪フラスコ、ファーメンター、バイオリアクター、または任意の他の装置が使用され得る。適切な場合、種培養物（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）および少量のファーメンター培養物は、徐々に増える培養物を播種するために使用される。
【００４８】
特定の実施形態において、消泡剤（例えば、ポリアルキレングリコール消泡剤（Ａｄｅｋａｎｏｌ ＬＧ−１０９））が、より大きな培養において使用される。他の市販の消泡剤もまた、使用され得る。消泡剤は、ファーメンターが、ロミデプシンの生成のために使用される場合、特に有用である。
【００４９】
培養培地中の炭素源は、任意の炭水化物であり得る。特定の実施形態において、上記炭素源は、モノサッカリドもしくはジサッカリド（例えば、グルコース）である。特定の具体的な実施形態において、上記炭素源は、グルコースもしくはマルトデキストリンである。他の炭素源（例えば、デンプン、マルトース、フルクトース、もしくはグリセリン）は、特定の実施形態において使用され得る。特定の実施形態において、上記窒素源は、アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム）などである。他の実施形態において、上記窒素源は、植物性ペプトン（ｐｌａｎｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）（例えば、ポリペプトンＮＳ、コーンスティープリカー、Ｈｉｎｕｔｅ Ｒ）である。使用され得る他の窒素源としては、ブイヨン、酵母抽出物、ダイズペプトン、グルテンミール、綿実粉末（ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄ ｆｌｏｕｒ）、ダイズミール、乾燥酵母、および小麦胚芽が挙げられる。特定の実施形態において、上記窒素源は、尿素もしくはアミノ酸である。特定の実施形態において、上記窒素源は、窒素を含む有機低分子である。特定の実施形態において、上記培地には、アミノ酸が補充される。例えば、上記培地には、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、もしくはＬ−システインが補充され得る。特定の実施形態において、上記培地には、Ｌ−システインが補充される。ＷＯ ０２／２０８１７を参照のこと；本明細書に参考として援用される。特定の実施形態において、上記培地には、Ｌ−システインおよびＬ−バリンが補充される。このような補充は、上記発酵において生成されるロミデプシンの量を増加させるか、そして／あるいは関連する物質および／もしくは分解物の量を減少させると考えられる。上記培養培地は、ミネラル（例えば、マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム）、およびホスフェート（例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム））を含み得る。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース、植物性ペプトン（ポリペプトンＮＳ）もしくはコーンスティープリカー（ＣＳＬ）、硫酸マグネシウム、および水を含む。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース、ポリペプトン（ポリペプトンＮＳ）、硫酸マグネシウム、消泡剤、および水を含む。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース（０．４５〜１．０％）、植物性ペプトン（ポリペプトンＮＳ）もしくはＣＳＬ（０．９〜４．０％）、硫酸マグネシウム（０．００５４〜０．０１０％）、消泡剤（０．０９％〜０．１１％）、および水（残量（ｂａｌａｎｃｅ））を含む。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース、酸化型デンプン（例えば、Ｐｉｎｅｄｅｘ ＃１００）もしくはマルトデキストリンダイズペプトン（例えば、Ｈｉｎｕｔｅ−Ｒ）、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、消泡剤（例えば、Ａｄｅｋａｎｏｌ ＬＧ−１０９）、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、および水を含む。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース（２〜１０％）、酸化型デンプン（例えば、Ｐｉｎｅｄｅｘ ＃１００）もしくはマルトデキストリン（１〜１５％）、ダイズペプトン（例えば、Ｈｉｎｕｔｅ−Ｒ）（１〜６％）、硫酸アンモニウム（０〜０．５％）、硫酸マグネシウム（０〜２％）、リン酸二水素カリウム（０．２７５〜１．６５％）、リン酸水素二ナトリウム（０．１８〜１．０８％）、消泡剤（例えば、Ａｄｅｋａｎｏｌ ＬＧ−１０９）（０．２〜０．６６％）、Ｌ−システイン（０〜３０ｍＭ）、Ｌ−バリン（０〜１５ｍＭ）、および水を含む。
【００５０】
上記培養物は、代表的には、上記微生物の増殖に適した条件下（例えば、温度、ｐＨ、酸素濃度など）で増殖される。特定の実施形態において、上記培養物のｐＨは、モニターされ、および／もしくは調節される。上記培養物のｐＨは、ｐＨ５．０〜７．５の範囲に及び得る。ロミデプシン生成のための任意の生物は、上記培養物が増殖される条件下に依存して、増殖のための好ましい温度を有する。特定の実施形態において、上記培養物は、１５℃〜３７℃、好ましくは、２３℃〜３２℃の範囲に及ぶ温度で増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、１８℃〜２７℃の間の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約１８℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約１９℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２０℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２１℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２２℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２３℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２４℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２５℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２６℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２７℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２８℃において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２９℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約３０℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約３１℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約３２℃の温度において増殖される。
【００５１】
上記培養物における酸素濃度は、１０〜５０％の範囲に及ぶレベルで維持される。特定の実施形態において、上記酸素濃度は、２０％より高く維持される。上記酸素レベルは、曝気、圧力、および／もしくは攪拌によって維持される。
【００５２】
得られた培養物は、代表的には、約１０〜１００時間にわたって増殖される。上記培養物は、２０時間後、３０時間後、４０時間後、５０時間後、６０時間後、７０時間後、または８０時間後に回収され得る。特定の実施形態において、上記培養物は、約３０時間後、３５時間後、４０時間後、４５時間後、もしくは５０時間後に回収される。特定の実施形態において、上記培養物は、約３６時間で回収される。特定の実施形態において、上記培養物は、約５０時間で回収される。代表的には、上記培養物は、飽和まで増殖される。ロミデプシンは、二次代謝産物であるので、最大収量は、より後期の培養物から得られる。いくつかの実施形態において、上記培養物は、対数期で回収される。当業者によって認識されるように、上記培養物は、代表的には、顕著な量の分解物が形成される前に回収される。上記回収時間は、ロミデプシンの生成のために発酵のサンプルをアッセイすることによって、経験的に決定され得る。特定の実施形態において、上記培養物は、ロミデプシンの力価が、０．５〜１．５ｇ／ｋｇの間に達するときに、回収される。特定の実施形態において、上記培養物は、上記力価が少なくとも０．６ｇ／ｋｇ、０．７ｇ／ｋｇ、０．８ｇ／ｋｇ、０．９ｇ／ｋｇ、１．０ｇ／ｋｇ、もしくは１．１ｇ／ｋｇに達したときに回収される。特定の実施形態において、上記培養物は、上記力価が少なくとも０．８ｇ／ｋｇに達したときに回収される。上記サンプルはまた、関連した物質もしくは分解物についてアッセイされ得、そして上記培養物は、ロミデプシンの望ましいレベル、関連する物質もしくは分解物の望ましいレベル、または上記２つのある比率が達成されたときに回収され得る。回収の時間はまた、培地中の成分（例えば、グルコース）の消費に基づいて決定される。他の実施形態において、上記回収の時間は、代謝産物の生成に基づく。上記回収の時間は、上記基準の組み合わせに基づいて決定され得る。
【００５３】
上記培養物を十分な時間にわたって増殖させた後、上記培養物は、回収される。上記望ましいロミデプシンは、上記培養培地中、および上記培養物の細胞中に見いだされ得る。上記細胞は、必要に応じて、死滅させられ、そして／または精製前に溶解される。特定の実施形態において、上記細胞は、酸（例えば、硫酸）の添加によって死滅させられる。特定の実施形態において、上記ｐＨは、約ｐＨ２．０〜３．０に下げられる。
【００５４】
次いで、得られた物質は、必要に応じて、容積が減少させられる。上記ロミデプシンは、ペプチド、天然生成物、および／もしくは有機分子を精製するための当該分野で公知の任意の精製技術によって、精製される。例示的な精製技術としては、バッチクロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、および結晶化が挙げられる。上記精製プロセスは、望ましい程度の純度を達成するために、１つ以上の工程を包含し得る。特定の実施形態において、上記抽出される物質は、非イオン性吸着樹脂を使用して精製される。特定の実施形態において、逆相樹脂が、上記精製工程において使用される。特定の具体的な実施形態において、逆相樹脂を使用する複数のカラムクロマトグラフィー工程が、使用される。上記精製プロセスにおいて有用な例示的な樹脂としては、アルミナ、シリカゲル、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８５０、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳ、およびＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０が挙げられる。特定の実施形態において、上記Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳおよび／もしくはＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手される。特定の実施形態において、アルミナは、上記カラム材料として使用される。特定の実施形態において、シリカゲルは、上記樹脂として使用される。特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィー工程のうちの１つ以上が、６．０未満の見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、これら工程のうちの１つ以上は、４．０〜６．０の間の見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィー工程のうちのすべてが、６．０未満の見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィー工程のうちのすべてが、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。
【００５５】
特定の実施形態において、ロミデプシンの精製は、上記抽出した物質を、１つより多いカラムクロマトグラフィー工程もしくはバッチクロマトグラフィー工程を使用して、精製することを包含する。特定の実施形態において、バッチクロマトグラフィー工程の後に、カラムクロマトグラフィー工程が行われる。特定の実施形態において、上記抽出された物質は、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８５０を用いたバッチクロマトグラフィー、続いて、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳを充填したカラム、続いて、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０を充填したカラム、続いて最後に、アルミナを充填したカラムによって精製される。これらクロマトグラフィー工程のうちのすべては、好ましくは、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。他の実施形態において、上記抽出された物質は、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０を充填したカラム、続いて、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳを充填したカラム、続いて最後にＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０を充填したもう一つのカラムを使用して精製される。この代替の精製プロセスにおいて、上記カラムクロマトグラフィー工程のうちのすべては、好ましくは、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。上記カラムの各々は、必要に応じて、水もしくは他の水溶液で洗浄され、続いて、有機溶媒（例えば、アセトン）の水溶液を用いたロミデプシンの溶出が行われる。特定の実施形態において、上記抽出された物質は、シリカゲルを使用して精製される。シリカゲルクロマトグラフィーはまた、他の樹脂もしくは充填物質を使用したクロマトグラフィーとともに、さらなる精製工程として使用され得る。特定の実施形態において、上記抽出された物質は、アルミナを使用して精製される。アルミナクロマトグラフィーはまた、他の樹脂もしくは充填物質を使用したクロマトグラフィーとともに、さらなる精製工程として使用され得る。
【００５６】
特定の実施形態において、上記粗製ロミデプシンを含む物質は、６．０未満の見かけのｐＨ、好ましくは、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨで予備平衡化されたマトリクス上に載せられる。次いで、上記マトリクスは、不純物を除去するために洗浄される。代表的には、上記マトリクスの洗浄は、ロミデプシンの溶出液より極性の高い溶液（すなわち、水のパーセンテージがより高い）において行われる。例えば、上記マトリクスは、２５〜５０％までのアセトン水溶液で洗浄され得、続いて、５０〜１００％ アセトン水溶液でロミデプシンの溶出が行われる。当業者によって認識されるように、上記洗浄溶媒および溶出溶媒は、使用されるマトリクスおよび上記化合物の極性によって決定される。
【００５７】
特定の実施形態において、上記クロマトグラフィー工程（載せる工程、洗浄する工程、および樹脂の溶出工程を包含する）のうちの１つ以上は、６．０未満の見かけのｐＨで行われる。特定の具体的な実施形態において、上記クロマトグラフィー工程は、３．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。特定の他の実施形態において、上記クロマトグラフィー工程は、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。上記マトリクスに載せられた溶液の見かけのｐＨは、酸を添加することによって、望ましい見かけのｐＨに調節され得る。本明細書に記載される酸のいずれかが、上記溶液の見かけのｐＨを低下させるために使用され得る。上記洗浄溶液および溶出溶液の見かけのｐＨは、同様に、望ましい見かけのｐＨに調節され得る。特定の実施形態において、ロミデプシンを含むすべての溶液の見かけのｐＨは、約６．０未満の見かけのｐＨに維持され、それによって、望ましくない付加生成物の形成が妨げられる。特定の実施形態において、上記溶液の見かけのｐＨは、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて緩衝化される。特定の実施形態において、上記アセトン／水 溶液の見かけのｐＨは、酢酸、塩酸、酢酸アンモニウム緩衝液、もしくはクエン酸を使用して、望ましい見かけのｐＨに調節される。特定の実施形態において、酢酸緩衝化系が、使用される。
【００５８】
ロミデプシンは、代替的にもしくはさらに、結晶化によって精製される。結晶化による精製は、カラムクロマトグラフィーおよび／もしくはバッチクロマトグラフィーを含む他の精製法とともに、使用され得る。特定の実施形態において、結晶化は、カラムクロマトグラフィーおよび／もしくはバッチクロマトグラフィーによって精製した後に使用される。特定の具体的な実施形態において、上記結晶化は、上記のカラムクロマトグラフィーおよび／もしくはバッチクロマトグラフィーによって精製した後に行われる。上記結晶化は、任意の適切な溶媒中で行われ得る。ロミデプシンは、好ましくは、上記溶媒中に最小限に可溶性である。特定の実施形態において、上記結晶化溶媒は、アルコールである。特定の実施形態において、上記結晶化溶媒は、メタノールである。特定の実施形態において、上記結晶化溶媒は、エタノールである。特定の実施形態において、混合溶媒系が使用される。上記結晶化溶媒は、アルコール／水混合物であり得る。他の実施形態において、上記結晶化溶媒は、アセトンと水との混合物である。特定の具体的な実施形態において、ロミデプシンは、アセトン水溶液（例えば、８５％ アセトン）中に溶解され、水をゆっくりと添加することによって沈澱させられる。特定の実施形態において、ロミデプシンは、溶媒（例えば、メタノール）中に溶解され、そして得られた溶液は、濃縮されて、上記ロミデプシンが結晶化させられる。他の実施形態において、上記ロミデプシンは、水／有機溶媒混合物（例えば、８５％ アセトン水溶液）中に溶解され、そして上記ロミデプシンは、水を添加することによって沈澱させられる。結晶化工程から得られた結晶は、代表的には、濾過によって回収され、および必要に応じて、洗浄および乾燥される。特定の実施形態において、上記結晶化溶媒の見かけのｐＨは、６．０未満である。特定の具体的な実施形態において、上記溶媒の見かけのｐＨは、４．０〜６．０の間である。得られた結晶の任意の洗浄がまた、低下した見かけのｐＨ（例えば、４．０〜６．０の間の見かけのｐＨ）において行われる。
【００５９】
代替的にまたはさらに、上記結晶化プロセスの間の上記ロミデプシンの貯蔵時間もしくは保持時間は、約２０時間未満である。特定の実施形態において、上記貯蔵時間もしくは保持時間は、１０時間未満である。他の実施形態において、上記貯蔵時間もしくは保持時間は、５時間未満である。特定の具体的な実施形態において、上記結晶化プロセスは、上記結晶化溶液を形成する際にすぐに行われる。
【００６０】
本発明は、望ましくない付加生成物を含まないかもしくは実質的に含まない、精製ロミデプシンを提供する。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９８％夾雑する付加生成物を含まないか、少なくとも９９％夾雑する付加生成物を含まないか、または少なくとも９９．５％付加生成物を含まない。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９８％モノマー性、少なくとも９９％モノマー性、または少なくとも９９．５％モノマー性である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．９％モノマー性である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．９５％モノマー性である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、検出可能なダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンを含まない。
【００６１】
特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度、または少なくとも９９．５％の純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．７％の純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．８％の純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．９％の純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．９５％の純度である。特定の具体的な実施形態において、上記ロミデプシンは、０．２％未満の「他の未知物質」といわれる不純物を含む。特定の具体的な実施形態において、上記ロミデプシンは、０．１％未満の「他の未知物質」を含む。このように高度に精製されたロミデプシンは、薬学的組成物の調製において有用である。このような組成物は、癌もしくは他の増殖性疾患の処置において特に有用である。上記組成物はまた、ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害することによって処置され得る他の疾患において使用され得る。上記組成物はまた、チューブリンデアセチラーゼ活性を阻害することによって処置され得る他の疾患において使用され得る。上記組成物はまた、デアセチラーゼ活性を阻害することによって処置され得る他の疾患において使用され得る。本発明の精製ロミデプシンはまた、研究目的のために有用である。
【００６２】
上記ロミデプシンの純度は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、評価され得る。純度の評価法としては、外観、ＨＰＬＣ、比旋光度、ＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法、ＵＶ／可視光分光法、粉末ｘ線回折（ＸＲＰＤ）分析、元素分析、ＬＣ−質量分析、および質量分析が挙げられる。特定の実施形態において、上記純度は、ＨＰＬＣによって評価され、このＨＰＬＣは、約０．０５％の不純物検出限界を有する。特定の実施形態において、上記純度は、ＮＭＲ分光法によって評価される。特定の実施形態において、上記純度は、ＩＲ分光法によって評価される。特定の実施形態において、上記純度は、ＵＶ／可視光分光法によって評価される。特定の実施形態において、上記純度は、ＸＲＰＤによって評価される。
【００６３】
特定の実施形態において、上記純度は、適切な溶媒中での比旋光度によって評価される。特定の実施形態において、上記比旋光度に使用される溶媒は、クロロホルム（ＣＨＣＬ３）である。他の実施形態において、上記使用される溶媒は、アルコール（例えば、メタノールもしくはエタノール）である。さらに他の実施形態において、上記使用される溶媒は、水もしくは水／アルコール溶液である。特定の実施形態において、上記比旋光度は、米国局方（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）、欧州局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）、日本局方（ＪＰ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）または英国局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）に記載されるもののような分析法（ｃｏｍｐｅｎｄｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、チェックされる。特定の実施形態において、上記比旋光度は、ロミデプシンのクロロホルム溶液を用いて行われる。上記溶液の濃度は、５ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲に及び得る。特定の実施形態において、上記濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬである。上記ロミデプシンの旋光度は、＋３８°〜＋４７°に及ぶ。特定の実施形態において、上記比旋光度は、＋３９°〜＋４１°の範囲に及ぶ。特定の実施形態において、上記比旋光度は、＋４０．０°〜＋４０．５°の範囲に及ぶ。特定の具体的な実施形態において、上記比旋光度は、約＋４０°である。夾雑する付加生成物の存在は、ロミデプシンをクロロホルム中に溶解した場合に沈澱を生じることが、発見された。
【００６４】
溶液中に存在する場合、上記ロミデプシンは、好ましくは、約６．０未満の見かけのｐＨで貯蔵される。特定の実施形態において、上記見かけのｐＨは、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ。特定の実施形態において、ロミデプシンの処方物もしくは調製物は、７．０より高い、より好ましくは、６．０より高い見かけのｐＨを防ぐために、緩衝化される。特定の実施形態において、上記処方物もしくは調製物は、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨに緩衝化される。
【００６５】
（使用）
本明細書に記載されるように調製されたロミデプシンは、インビトロまたはインビボで使用され得る。上記ロミデプシンは、新生物のインビボでの処置において特に有用である。しかし、上記組み合わせはまた、研究目的または臨床目的で（例えば、ロミデプシンに対する患者の疾患の感受性を決定するために）インビトロで使用され得る。特定の実施形態において、上記新生物は、良性の新生物である。他の実施形態において、上記新生物は、悪性の新生物である。任意の癌が、ロミデプシンを用いて、単独で、もしくは別の薬剤と組み合わせて、処置され得る。
【００６６】
特定の実施形態において、上記悪性疾患は、血液の悪性疾患である。血液の悪性疾患は、血液、骨髄、および／またはリンパ節に影響を及ぼすタイプの癌である。ロミデプシンを用いて処置され得る血液の悪性疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群。特定の実施形態において、本発明の組み合わせは、多発性骨髄腫を処置するために使用される。特定の具体的な実施形態において、上記癌は、再発したおよび／または抵抗性の（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）多発性骨髄腫である。他の実施形態において、本発明の組み合わせは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を処置するために使用される。特定の具体的な実施形態において、上記癌は、再発したおよび／または抵抗性のＣＬＬである。他の実施形態において、本発明の組み合わせは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を処置するために使用される。特定の実施形態において、本発明の組み合わせは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を処置するために使用される。特定の実施形態において、本発明の組み合わせは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するために使用される。特定の実施形態において、上記癌は、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である。他の実施形態において、上記癌は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）である。特定の実施形態において、上記癌は、骨髄異形成症候群である。
【００６７】
血液の悪性疾患以外の他の癌はまた、ロミデプシンを用いて処置され得る。特定の実施形態において、上記癌は、固形腫瘍である。組み合わせ両方を用いて処置され得る例示的な癌としては、結腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、皮膚癌、脳眼、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、神経内分泌の癌などが挙げられる。特定の実施形態において、ロミデプシンは、膵臓癌を処置するために使用される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、前立腺癌を処置するために使用される。特定の具体的実施形態において、上記前立腺癌は、ホルモン抵抗性前立腺癌である。
【００６８】
新生物（例えば、被験体における癌）の処置において、ロミデプシンは、代表的には、１〜２８ｍｇ／ｍ２において投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、１〜１５ｍｇ／ｍ２において投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、５〜１４ｍｇ／ｍ２において投与される。特定の具体的な実施形態において、ロミデプシン（ｒｏｍｄｉｅｐｓｉｎ）は、８ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１２ｍｇ／ｍ２、または１４ｍｇ／ｍ２において投与される。ロミデプシンは、代表的には、２８日サイクルにおいて投与され、ロミデプシンは、１日目、８日目、および１５日目に投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、１日目および１５日目に投与され、８日目は省略される。当業者によって認識されるように、ロミデプシンの投与量および投与のタイミングは、処置される患者に依存して変動し得る。例えば、有害な副作用は、投与されるロミデプシンの投与量を低下させることを要し得る。
【００６９】
ロミデプシンはまた、細胞をインビトロで処置および／または死滅させるために使用され得る、特定の実施形態において、ロミデプシンの細胞傷害性濃度は、細胞を死滅させるために、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、ロミデプシンの濃度は、０．０１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲に及ぶ。特定の実施形態において、ロミデプシンの濃度は、０．１ｎＭ〜５０ｎＭの範囲に及ぶ。特定の実施形態において、ロミデプシンの濃度は、１ｎＭ〜１０ｎＭの範囲に及ぶ。
【００７０】
任意のタイプの細胞は、ロミデプシンで処置または死滅させられ得る。上記細胞は、任意の動物、植物、細菌、または真菌の供給源に由来し得る。特定の実施形態において、上記細胞は、動物細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、ヒト細胞である。上記細胞は、発生の任意の段階における男性および女性のヒトに由来し得る。特定の実施形態において、上記細胞は、霊長類細胞である。他の実施形態において、上記細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ）に由来する。特定の実施形態において、上記細胞は、飼い慣らされた動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタなど）から得られる。上記細胞はまた、遺伝的に操作された動物もしくは植物（例えば、トランスジェニックマウス）に由来し得る。
【００７１】
上記使用される細胞は、野生型細胞もしくは変異細胞であり得る。上記細胞は、遺伝的に操作され得る。特定の実施形態において、上記細胞は、正常細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、新生物細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、癌細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、血液の悪性疾患に由来する。他の実施形態において、上記細胞は、固形腫瘍に由来する。例えば、上記細胞は、患者の腫瘍に（例えば、生検または外科手術切除に）由来し得る。細胞傷害性に対するこのような試験は、患者が特定の併用療法に応答するか否かを決定するにあたって有用であり得る。このような試験はまた、上記悪性疾患を処置するために必要とされる投与量を決定するにあたって有用であり得る。ロミデプシンに対する患者の癌の感受性の試験は、患者に対する影響なく、薬物の不要な投与を妨げる。上記試験はまた、上記患者の癌が、ロミデプシンに対して特に感受性である場合に、上記薬物のうちの一方または両方の低い用量を使用することを可能にし得る。
【００７２】
他の実施形態において、上記細胞は、癌細胞株に由来する。特定の実施形態において、上記細胞は、血液の悪性疾患（例えば、本明細書で議論されるもの）に由来する。ヒト白血病細胞株としては、Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１、Ｒａｊｉ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、およびＪｕｒｋａｔが挙げられる。例示的なＣＬＬ細胞株としては、ＪＶＭ−３およびＭＥＣ−２が挙げられる。例示的な骨髄腫細胞株としては、ＭＭ１．Ｓ、ＭＭ１．Ｒ（デキサメタゾン耐性）、ＲＰＭＩ８２２６、ＮＣＩ−Ｈ９２９、およびＵ２６６が挙げられる。例示的なリンパ腫細胞株としては、Ｋａｒｐａｓ、ＳＵＤＨ−６、ＳＵＤＨ−１６、Ｌ４２８、ＫＭＨ２、およびＧｒａｎｔａ マントル細胞リンパ腫細胞株（Ｇｒａｎｔａ ｍａｎｔｌｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ）が挙げられる。特定の実施形態において、上記細胞は、ＡＭＬ細胞もしくは多発性骨髄腫（ＣＤ１３８＋）細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、造血性幹細胞もしくは前駆細胞である。例えば、特定の実施形態において、上記細胞は、造血性前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋骨髄細胞）である。特定の実施形態において、上記細胞株は、特定の化学療法剤に耐性である。他の実施形態において、上記細胞株は、ステロイド耐性（例えば、デキサメタゾン耐性）である。特定の具体的な実施形態において、上記細胞は、ステロイド耐性ヒト多発性骨髄腫細胞である。
【００７３】
（薬学的組成物）
本発明はまた、本明細書に記載されるように調製されたロミデプシンを含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、上記組成物は、新生物細胞（例えば、血液の悪性疾患）に対する細胞増殖抑制性活性または細胞傷害性活性を示す。ロミデプシンの例示的投与は、上記に記載される。特定の実施形態において、上記薬学的組成物は、上記薬物の１用量についてのロミデプシンの量を含む。本発明の他の薬学的組成物は、ロミデプシンの複数の用量（例えば、サイクルもしくは全体の処置レジメンを完了するために必要とされる用量の総数）を含み得る。特定の実施形態において、投与されるロミデプシンの量は、上記被験体の血流において細胞傷害性レベル（例えば、ナノモルレベル）を達成するに十分である。特定の実施形態において、上記投与される量は、上記被験体における癌の部位において、ロミデプシンの細胞傷害性濃度（例えば、ナノモルレベル）を達成するに十分である。
【００７４】
本発明の薬学的調製物はまた、ロミデプシンおよび他の薬剤がいっしょに投与され得るように、他の薬剤を含み得る。このような調製物は、両方の投与のために適した量の各薬剤を含む。特定の実施形態において、ロミデプシンは、１種以上のさらなる治療剤（例えば、別の細胞傷害性薬剤）と組み合わせて投与される。ロミデプシンと組み合わせて投与され得る例示的な細胞傷害性薬剤としては、ゲムシタビン、デシタビン、およびフラボピリドールが挙げられる。他の実施形態において、ロミデプシンは、抗炎症剤（例えば、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンなど）、鎮痛剤（ｐａｉｎ ｒｅｌｉｅｖｅｒ）、制吐剤（ａｎｔｉ−ｎａｕｓｅａ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）、または解熱剤と組み合わせて投与される。特定の他の実施形態において、ロミデプシン（ｒｏｍｄｅｐｓｉｎ）は、ステロイド剤（例えば、デキサメタゾン）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、胃腸障害（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）（例えば、悪心、嘔吐、および下痢）を処置するための薬剤とともに投与される。これらのさらなる薬剤としては、制吐剤（ａｎｔｉ−ｅｍｅｔｉｃ）、下痢止め、補液（ｆｌｕｉｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、電解質置換物（ｅｌｅｔｒｏｌｙｔｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）などが挙げられ得る。他の実施形態において、ロミデプシンは、電解質置換物または電解質補充物（例えば、カリウム、マグネシウム、およびカルシウム、特に、カリウムおよびマグネシウム）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、不整脈治療剤（ａｎｔｉ−ａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ ａｇｅｎｔ）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、血小板ブースター（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｂｏｏｓｔｅｒ）（例えば、血小板の生成を増大させる薬剤）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、血球の生成を増大させる薬剤（例えば、エリスロポエチン）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、高血糖症を防止するための薬剤と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシン（これは、ＨＡＤＣ阻害性活性を有する）は、別のＨＤＡＣインヒビターとともに投与されない。
【００７５】
ロミデプシンが処置のための遊離の形態で存在し得るか、または適切な場合、その薬学的に受容可能な形態として存在し得ることもまた、認識される。本発明によれば、薬学的に受容可能な形態としては、必要な患者への投与の際に、直接的にもしくは間接的に、ロミデプシンを、またはその代謝産物もしくは残渣（ｒｅｓｉｄｕｅ）（例えば、プロドラッグ）を提供することができる、薬学的に受容可能な塩、エステル、このようなエステルの塩、または任意の他の付加生成物もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能な塩」とは、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答などなくして、ヒトおよび下級動物の組織と接触させるための使用に適しており、かつ妥当な便益／リスク比と釣り合っている塩をいう。薬学的に受容可能な塩は、当該分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９，１９７７（本明細書に参考として援用される）において薬学的に受容可能な塩を詳細に記載している。上記塩は、ロミデプシンの最終的な単離および精製の間にインサイチュで、または遊離の塩基官能基と、適切な有機酸もしくは無機酸とを反応させることによって別々に、調製され得る。薬学的に受容可能な、非毒性の酸付加塩の例は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸）と、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸と形成されるか、または当該分野で使用される他の方法（例えば、イオン交換）を使用することによって形成される、アミノ基と塩である。他の薬学的に受容可能な塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩（ｈｅｒｎｉｓｕｌｆａｔｅ）、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレン硫酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらに薬学的に受容可能な塩としては、適切な場合、対イオン（例えば、ハライド、ヒドロキシド、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ニトレート、低級アルキルスルホネート、およびアリールスルホネート）を使用して形成される非毒性のアンモニウムカチオン、四級アンモニウムカチオン、およびアミンカチオンが挙げられる。
【００７７】
さらに、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なエステル」とは、好ましくは、インビボで加水分解しかつ人体で容易に分解して、親化合物（例えば、ロミデプシン）もしくはその塩を放出するものを含むエステルをいう。適切なエステル基としては、例えば、薬学的に受容可能な脂肪族カルボン酸、特に、アルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸、およびアルカン二酸に由来するものが挙げられ、ここで各アルキルもしくはアルケニル部分は、有利には、多くて６個の炭素原子を有する。特定のエステルの例としては、ホルメート、アセテート、プロピオネート、ブチレート、アクリレート、およびエチルスクシネートが挙げられる。特定の実施形態において、上記エステルは、酵素（例えば、エステラーゼ）によって切断される。
【００７８】
さらに、用語「薬学的に受容可能なプロドラッグ」とは、本明細書で使用される場合、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答などなくして、ヒトおよび下級動物の組織と接触させるための使用に適しており、かつ妥当な便益／リスク比と釣り合っており、それらの意図された用途に有効であるロミデプシンのプロドラッグ、ならびにロミデプシンの双性イオン形態、または考えられる場合、その誘導体をいう。用語「プロドラッグ」とは、インビボで迅速に変換されて、例えば、血中での加水分解によって親化合物を生じる化合物をいう。詳細な議論は、Ａ．Ｃ．Ｓ． Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ＳｅｒｉｅｓのＴ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１４、およびＥｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，編，Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７（これらはともに、本明細書に参考として援用される）において提供される。
【００７９】
上記で記載されるように、本発明の薬学的組成物は、望まれる特定の投与形態に適するように、薬学的に受容可能なキャリア（これは、本明細書で使用される場合、任意のおよびすべての溶媒、希釈剤、もしくは他の液体ビヒクル、分散補助剤もしくは懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、濃化剤もしくは乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などを含む）をさらに含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９７５）は、薬学的組成物を処方するにあたって使用されかつその調製のための公知の種々のキャリアを開示する。例えば、任意の望ましくない生物学的効果を生じることによって、またはさもなければ、上記薬学的組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することによって、任意の従来のキャリア媒体がロミデプシンと不適合性である範囲を除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが予期される。薬学的に受容可能なキャリアとして働き得る物質のいくつかの例としては、糖（例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース）；デンプン（例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース）；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ；Ｓｏｌｕｔｏｌ；賦形剤（例えば、カカオ脂および坐剤用ワックス）；油（例えば、ラッカセイ油、綿実油；紅花油；ごま油；オリーブ油；コーン油および大豆油）；グリコール（例えば、プロピレングリコール）；エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル）；寒天；緩衝化剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張性生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液、ならびに他の非毒性の適合性滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）が挙げられるが、これらに限定されず、同様に、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭剤、保存剤および抗酸化剤もまた、処方者の判断に従って、上記組成物中に存在し得る。
【００８０】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の実施例を考慮すれば、さらに認識され、以下の実施例は、本発明の特定の具体的実施形態を例示するが、特許請求の範囲に規定されるような、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００８１】
（実施例１：ロミデプシンの精製）
（吸着樹脂によるロミデプシンの精製）
約４００ｇのロミデプシンを含むＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの培養ブロス（約６００Ｌ；Ｈ２ＳＯ４でｐＨ２．５に調節される）を抽出し、その抽出ブロスを、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８５０（非イオン性吸着樹脂）を充填したカラムに適用する。ロミデプシン（せいぜい６ｇ−ロミデプシン／Ｌ−樹脂）を、せいぜいｓｖ＝６の流速で、上記樹脂に結合させる。水道水（約３倍樹脂容積）および２５％ アセトン水溶液（約５倍樹脂容積）で洗浄した後、約６５％ アセトン水溶液およびせいぜいｓｖ＝４の流速で溶出を行う。
【００８２】
（ＨＰ２０ＳＳクロマトグラフィーによるロミデプシンの精製）
上記溶出液を水で希釈して、水溶液を生成する（約７５％ 水分含有量）。この溶液を、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳカラムに適用する。この非イオン性吸着樹脂は、せいぜいｓｖ＝５の流速でロミデプシンを吸着する（約１０ｇ−ロミデプシン／Ｌ−樹脂）。２５％ アセトン水溶液（約０．５倍樹脂容積）および４０％ アセトン水溶液（約４倍樹脂容積）で洗浄した後、４７％ アセトン水溶液で溶出を行う。上記溶出液を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分析する。その活性画分を、中間保持タンクの中で合わせる。
【００８３】
（非水性溶媒中の水性溶媒を吸着カラムによる置換）
上記ＨＰ２０ＳＳカラムから得られる溶出液を水で希釈して、水溶液（約８０％ 水分含有量）を生成する。この溶液をＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムに適用する。２０％ アセトン水溶液で洗浄した後、アセトンで溶出を行う。この溶出液を真空中で濃縮する。上記濃縮物に酢酸エチルを添加した後、上記濃縮物を、真空中でさらに濃縮する。この工程を反復して行う。
【００８４】
（アルミナによるロミデプシンの精製）
得られた濃縮物を酢酸エチル中に溶解し（約６ｍｇ／ｍＬ）、アルミナ樹脂カラムに適用する（約７５ｇ−ロミデプシン／Ｌ−樹脂）。上記カラムを酢酸エチル（約２倍アルミナ容積）、およびアセトンと酢酸エチルとの混合物（０．５〜２．０ ｖ／ｖ、約８倍アルミナ容積）で展開する。上記濃縮物にアセチルを添加した後、得られた溶液をさらに濃縮する。
【００８５】
（結晶化１（メタノール））
上記工程から得られる濃縮物をメタノールで希釈し、真空中で濃縮して、粗製ロミデプシン結晶を生じる。沈澱した結晶を、濾過により集める。
【００８６】
結晶化２（アセトン／水）
上記粗製ロミデプシン結晶を、８５％ アセトン水溶液中に溶解し（約１３Ｌ／ｋｇ−粗製ロミデプシン結晶）、そして攪拌しながら精製水をゆっくりと添加することによって沈澱させる（約６５Ｌ／ｋｇ−粗製ロミデプシン結晶）。上記沈澱した結晶を濾過により集め、１５％ アセトン水溶液で洗浄する（約５Ｌ／ｋｇ−粗製ロミデプシン）。上記湿っている結晶を、−７０℃未満において真空下で乾燥させる。
【００８７】
（等価物および範囲）
前述は、本発明の特定の非限定的な好ましい実施形態を記載してきた。当業者は、単なる慣用的実験を用いて、本明細書に記載される、本発明の具体的実施形態に対する多くの等価物を認識するかまたは確認することができる。当業者は、この記載に対する種々の変更および改変を認識し、これらの変更および改変は、以下の特許請求の範囲において規定される本発明の趣旨からも範囲からも逸脱することなく行われ得る。
【００８８】
特許請求の範囲において、冠詞、例えば、「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「該、前記、上記（ｔｈｅ）」は、相反するものまたは文脈から明らかに別のものを示さない限り、１つ以上を意味し得る。ある群のうちの１つ以上のメンバー間で「もしくは、または、あるいは（ｏｒ）」を含む請求項もしくは説明は、上記群のメンバーのうちの１つ、１つより多く、またはすべてが、相反するものまたは文脈から明らかに別のものを示さない限り、所定の生成物もしくはプロセスに存在するか、使用され得るか、またはさもなければ関連する場合に満たされるとみなされる。本発明は、上記群のうちの正確に１つのメンバーが、所定の生成物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、またはさもなければ関連する実施形態を包含する。本発明はまた、上記群のメンバーのうちの１つより多く、またはすべてが、所定の生成物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、またはさもなければ関連する実施形態を包含する。さらに、本発明が、すべてのバリエーション、組み合わせ、および変更を包含し、これらバリエーション、組み合わせおよび変更において、請求項のうちの１つ以上または上記説明の関連部分からの１つ以上の限定、要素、文節、記述用語などは、別の請求項に導入されることが理解されるべきである。例えば、ある請求項に従属する任意の請求項は、同じ独立請求項（ｂａｓｅ ｃｌａｉｍ）に従属する任意の他の請求項において見いだされる１つ以上の限定を含むように改変され得る。さらに、上記請求項が組成物を記載している場合、本明細書に開示される目的のうちのいずれかのために上記組成物を使用するための方法が含まれ、そして本明細書に開示される作製方法または当該分野で公知の他の方法のうちのいずれかに従って上記組成物を作製するための方法は、別段記載されなければ、または矛盾（ｃｏｎｔｒａｄｉｃｔｉｏｎ ｏｒ ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）が生じることが当業者に明らかでなければ、含められる、ということが理解されるべきである。さらに、本発明は、本明細書に開示される組成物を調製するための方法のうちのいずれかに従って作製される組成物を包含する。
【００８９】
要素がリストとして、例えば、マーカッシュグループ形式で提示される場合、上記要素の各サブグループもまた開示され、そして任意の要素が上記群から除かれ得ることが理解されるべきである。用語「含む、包含する」は、開放系であることが意図され、さらなる要素または工程の包含を許容することにも、注意する。一般に、本発明、または本発明の局面が、特定の要素、特徴、工程などを含むとして言及されている場合、本発明の特定の実施形態または本発明の局面が、そのような要素、特徴、工程などからなるか、またはそれらから本質的になることが理解されるべきである。簡略化を目的として、それらの実施形態は、本明細書において文字通り具体的に記載されているわけではない。従って、１つ以上の要素、特徴、工程などを含む本発明の各実施形態について、本発明はまた、それらの要素、特徴、工程などからなるかまたはそれらから本質的になる実施形態を提供する。
【００９０】
範囲が与えられている場合、終点は含められる。さらに、別段示されない限り、または文脈および／または当業者の理解から明らかである別のものが示されない限り、範囲として表される値は、本発明の異なる実施形態において、文脈が明らかに別のものを規定しない限り、示された範囲の下限の単位の１０分の１まで上記範囲内の任意の具体的値を想定し得ることが理解されるべきである。別段示されない限りまたは文脈および／または当業者の理解から明らかな別のものを示さない限り、範囲として表される値は、上記所定の範囲内の任意の部分範囲を想定し得、ここで上記部分範囲の終点は、上記範囲の下限の単位の１０分の１と同じ程度の正確性まで表されることもまた理解されるべきである。
【００９１】
さらに、本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除かれ得ることが理解されるべきである。本発明の組成物および方法の任意の実施形態、要素、特徴、適用、または局面は、いずれか１つ以上の請求項から除かれ得る。簡潔さを目的として、１つ以上の要素、特徴、目的、または局面が除かれる実施形態はすべて、本明細書に明示的に示されていない。
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、米国特許法§１１９（ｅ）の下、２００６年１２月２９日に出願された、米国仮特許出願第６０／８８２，７１２号に対する優先権を主張し、この出願は本明細書中で参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ロミデプシン（Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ）は、藤沢薬品工業によってＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍから単離された天然の生成物である。特許文献１（１９９５）；特許文献２（１９９０年１２月１１日発行）（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。ロミデプシンは、４つのアミノ酸残基（Ｄ−バリン、Ｄ−システイン、デヒドロブチリン（ｄｅｈｙｄｒｏｂｕｔｙｒｉｎｅ）、およびＬ−バリン）からなる二環式ペプチドであり、かつ新規な酸（３−ヒドロキシ−７−メルカプト−４−ヘプタン酸）である。ロミデプシンは、アミド結合およびエステル結合の両方を含むデプシペプチドである。発酵を使用するＣ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍの生成に加えて、ロミデプシンはまた、合成手段または半合成手段によって調製され得る。Ｋａｈｎらによって報告されたロミデプシンの全合成は、１４工程を要し、１８％の全体収率でロミデプシンを生じる。非特許文献１を参照のこと。ロミデプシンの構造は、以下に示される：
【０００３】
【化１】
ロミデプシンは、抗微生物活性、免疫抑制活性、および抗腫瘍活性を有することが示された。ロミデプシンは、例えば、血液悪性疾患（例えば、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫など）および固形腫瘍（例えば、前立腺癌、膵臓癌など））を有する患者を処置することにおいて使用するために、現在試験している最中である。デアセチラーゼ（例えば、ヒストンデアセチラーゼ、チューブリンデアセチラーゼ）を選択的に阻害することによって作用することが考えられ、新たな標的が抗癌治療の新たなクラスを開発する見込みがある。Ｎａｋａｊｉｍａら，非特許文献２。作用の１つの様式は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の１つ以上のクラスの阻害を包含する。
【０００４】
ヒストンデアセチラーゼは、その作用部位に亜鉛を有するメタロデアセチル化酵素である。Ｆｉｎｎｉｎら，非特許文献３。この酵素は、ＤＮＡに対するアセチル化ヒストンのアフィニティーを調節することによって、特定の遺伝子の発現を調節すると考えられる。ヒストンのアセチル化は、アセチル化と脱アセチル化との間のバランスによって制御される。上記ヒストンのアセチル化は、上記ヒストンタンパク質のリジン残基において起こる。上記リジン残基のアセチル化は、上記タンパク質にその正の電荷のうちのいくらかを喪失させ、それによって、ＤＮＡとのその相互作用を低下させる。ロミデプシンは、ヒストンの上記増大したアセチル化および処理細胞における他の調節性タンパク質を引き起こすことが見いだされた。このことは、細胞周期制御、分化、およびアポトーシスに関与する種々の遺伝子の転写性制御に影響を及ぼす。より最近では、ＨＤＡＣインヒビターは、自食作用の制御に関与していた。
【０００５】
ロミデプシンに加えて、種々の誘導体が調製および研究されてきた。以下の特許および特許出願は、種々のロミデプシンの誘導体を記載している：特許文献３；特許文献４；特許文献５；および特許文献６；これらの各々は、本明細書に参考として援用される。
【０００６】
薬剤としてのロミデプシンにおける関心を考慮すれば、コスト効率的な様式で大量の高度に精製された物質を調製する必要性がある。ロミデプシンを発酵ブロスから精製する種々の研究が、報告されてきた。特許文献７；特許文献８；これらの各々は、本明細書に参考として援用される。例えば、特許文献８は、特定のアミノ酸（例えば、Ｌ−システイン）を培養培地に添加することによる、発酵プロセスからのロミデプシンの生成の増大を記載している。このような発見は、発酵によるロミデプシンの改善された生成を提供してきたが、研究用途および医療用途のために大量の純粋なロミデプシンを調製するよりよい方法が未だ必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平７−６４８７２号公報
【特許文献２】米国特許第４，９７７，１３８号明細書
【特許文献３】米国特許第６，５４８，４７９号明細書
【特許文献４】国際公開第０５／０２０９１３４号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０５／０５８２９８号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０６／１２９１０５号パンフレット
【特許文献７】米国特許第４，９７７，１３８号明細書
【特許文献８】国際公開第０２／２０８１７号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：７２３７−７２３８，１９９６
【非特許文献２】Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２４１：１２６−１３３，１９９８
【非特許文献３】Ｎａｔｕｒｅ，４０１：１８８−１９３，１９９９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、純粋なロミデプシン（特に、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンのような夾雑物を含まないロミデプシン）を再現可能に生成しないという認識に基づいている。この認識に基づくと、本発明は、これら夾雑する副生成物のレベルを減少させる条件下で、ロミデプシンを再現可能に調製するためのシステムを提供する。約６．５未満の、より好ましくは、約６．０未満の見かけのｐＨで、ロミデプシンを生成、精製および／または貯蔵することによって、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンの形成が妨げられることが見いだされた。ロミデプシンの精製プロセスにおけるこの改善は、公知のプロセスによって提供されるものより、高い収量のロミデプシンおよび／または高い純度のロミデプシンを可能にする。このような改善は、ヒトにおける使用のための製薬グレードのロミデプシンを調製するのに特に有用である。
【００１０】
ロミデプシンは、代表的には、天然の生成物を生成する微生物（例えば、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）の培養物からロミデプシンを精製することによって生成される。本発明は、その後に、ダイマー化、オリゴマー化、またはポリマー化して、望ましくない夾雑物を形成し得る、減少したロミデプシンの形成を排除もしくは低下させるために、上記精製工程のうちの少なくともいくつかの間に、低い見かけのｐＨを維持することが必要であることを実証する。
【００１１】
上記精製工程のうちの１つ以上は、６．５未満の見かけのｐＨ、またはさらには６．０未満の見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、１つ以上の精製工程は、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、上記精製工程のうちのすべてが、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。望ましくない夾雑物の形成を妨げるために、ロミデプシンを含む溶液の見かけのｐＨは、約７．０を上回るか、またはより好ましくは約６．０を上回る見かけのｐＨに達することを許容しない。すべての生成プロセスの見かけのｐＨは、好ましくは、モニターされ、かつその後に、必要であれば、約６．０未満の見かけのｐＨに調節される。特定の実施形態において、それは、約４．０〜約６．０の見かけのｐＨ範囲内で維持される。水溶液を使用して上記プロセスもしくは工程の最後近くに、精製工程における見かけのｐＨの制御は、望ましくない夾雑物の形成を減少もしくは排除することにおいて特に有用であることが見いだされた。任意の酸もしくは緩衝剤が、ｐＨを制御するために使用され得る。特定の実施形態において、有機酸（例えば、酢酸もしくはギ酸）は、上記精製工程のうちの１つ以上においてｐＨを制御するために使用される。特定の実施形態において、無機酸（例えば、リン酸もしくは塩酸）が使用される。
【００１２】
ロミデプシンを精製するための任意のプロセスは、発酵からであろうと、半合成であろうと、全合成であろうと、見かけのｐＨをモニターし、必要であれば、見かけのｐＨを低下させることによって、望ましくない副生成物の形成を妨げるように、本発明に基づいて改変され得る。
【００１３】
一局面において、本発明は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの培養物からロミデプシンを調製するためのプロセスを提供する。その発酵ブロスは、上記培養物中の微生物を不活性化もしくは死滅させるために、酸性化される。上記酸性化された発酵ブロスは、予備的に、バッチまたはカラムクロマトグラフィーによって精製される。その後、複数のカラムクロマトグラフィー工程が、所望のレベルの純度を達成するために使用され得る。特定の実施形態において、上記第１のクロマトグラフィーは、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８５０（非イオン性吸着樹脂）を利用する。上記ロミデプシンは、さらなるカラムクロマトグラフィー工程によってさらに精製され得る。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、その後、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳ樹脂を使用するカラムクロマトグラフィー、続いて、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０樹脂を使用するカラムクロマトグラフィー、そして最後に、アルミナ上でのカラムクロマトグラフィーによって、精製される。特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィーは、約４〜約６の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。特定の具体的な実施形態において、上記第２のカラムクロマトグラフィー工程は、低下した見かけのｐＨ（例えば、約４〜６の見かけのｐＨ）において行われる。上記ロミデプシンは、必要に応じて、結晶化によってさらに精製される。１つ以上の結晶化工程が、行われ得る。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、まず、メタノールを使用して結晶化され、次いで、８５％ アセトン水溶液を使用して結晶化される。その得られたロミデプシンは、次いで、必要に応じて、濾過され、洗浄され、乾燥される。特定の実施形態において、上記結晶化工程または任意のその後の工程は、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ、低下した見かけのｐＨにおいて行われる。最後の工程は、低下した見かけのｐＨにおいて行われることが特に重要である。なぜなら、その後のいかなる精製工程も、望ましくない夾雑物を除去するために利用しないからである。発酵および／もしくは精製プロセスにおいて使用される任意の設備（例えば、管系、ポンプ、フィルター、乾燥機など）は、水もしくは酸性溶液（例えば、酢酸）で洗浄して、上記設備上の任意のアルカリ性残渣も除去もしくは中和する。
【００１４】
さらに、ロミデプシンの薬学的投与形態の調製（賦形剤、溶媒、共溶媒、および／もしくはロミデプシンの薬理学的活性を増強するために使用される他の薬剤と混ぜ合わせる工程を包含する）は、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンの形成を最小にするために、低下した見かけのｐＨ（例えば、約４．０未満の見かけのｐＨ）において行われ得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、夾雑するダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンを実質的に含まない、ロミデプシンの組成物を提供する。本発明によって提供されるロミデプシンは、９８％より多くがモノマー性であるか、９９％より多くがモノマー性であるか、９９．９５％より多くがモノマー性であるか、または９９．９％より多くがモノマー性である。いくつかの実施形態において、上記ロミデプシンは、すべての夾雑物に関して、好ましくは、９８％より高い純度であるか、９９％より高い純度であるか、９９．９５％より高い純度であるか、または９９．９％より高い純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、１．０％未満、０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満のすべての他の未知の物質を含む。ロミデプシンの組成物は、好ましくは、検出可能な、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化した物質を含まない。上記ロミデプシンの純度は、代表的には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、赤外線分光法、粉末ｘ線回折（ＸＲＰＤ）分析、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、比旋光度、またはＮＭＲ分光法によって決定される。特定の実施形態において、上記純度は、ロミデプシンのクロロホルム溶液の比旋光度を測定することによって決定される。本発明はまた、約６．０未満、好ましくは、約４．０〜約６．０の間の上記調製物の見かけのｐＨを維持する、ロミデプシンの緩衝化調製物を提供する。このような調製物は、代表的には、長期化した貯蔵寿命を有する。
【００１６】
（定義）
特定の官能基および化学用語の定義は、以下でより詳細に記載される。本発明の目的のために、化学元素は、元素周期表（ＣＡＳバージョン，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃｓ，第７５版，表紙の裏側）に従って同定され、そして特定の官能基は、一般に、本明細書に記載されるように定義される。さらに、有機化学の一般原理、ならびに特定の官能部分および反応性は、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｔｈｏｍａｓ Ｓｏｒｒｅｌｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｏｏｋｓ，Ｓａｕｓａｌｉｔｏ，１９９９（その全体は、本明細書に参考として援用される）に記載される。
【００１７】
本発明の特定の化合物は、特定の幾何形態（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｆｏｒｍ）または立体異性形態において存在し得る。本発明は、すべてのこのような化合物（ｃｉｓ−異性体およびｔｒａｎｓ−異性体、Ｅ−異性体およびＺ−異性体、Ｒ−鏡像異性体およびＳ−鏡像異性体、ジアステレオマー、（Ｄ）−異性体、（Ｌ）−異性体、（−）−異性体および（＋）−異性体、それらのラセミ混合物、ならびにそれらの他の混合物を含む）を、本発明の範囲内に入るものとして企図する。さらなる不斉炭素原子は、置換基（例えば、脂肪族（例えば、アルキル）またはヘテロ脂肪族基）中に存在し得る。すべてのこのような異性体、およびこれらの混合物は、本発明の範囲内であるとみなされる。
【００１８】
任意の種々の異性体の比を含む異性体混合物は、本発明に従って利用され得る。例えば、２種のみの異性体が合わされる場合、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０、９０：１０、９５：５、９６：４、９７：３、９８：２、９９：１、もしくは１００：０の異性体比を含む混合物は、本発明によってすべて企図される。当業者は、類似の比が、より複雑な異性体混合物について企図されることを容易に認識する。
【００１９】
上記化合物は、本明細書に記載されるように、任意の数の置換基もしくは官能部分で置換され得ることが認識される。一般に、用語「必要に応じて」が先行していようといまいと、用語「置換された」、および本発明の式に含まれる置換基は、所定の構造中の水素ラジカルが、特定の置換基のラジカルで置換されていることをいう。特定の実施形態において、所定の構造中の１つの水素ラジカルのみが、特定の置換基のラジカルで置換される。他の実施形態において、所定の構造中の１個、２個、または３個の水素ラジカルは、特定の置換基の同じもしくは異なるラジカルで置換される。任意の所定の構造において、１個より多くの位置が、特定の基から選択される１個より多い置換基で置換され得る場合、上記置換基は、あらゆる位置で同じであってもよいし、異なっていてもよい。本明細書で使用される場合、用語「置換された」とは、すべての許容可能な置換基もしくは有機化合物を含むことが企図される。広い局面において、上記許容可能な置換基としては、有機化合物の、非環式および環式、分枝状および非分枝状、炭素環式および複素環式、芳香族および非芳香族の置換基が挙げられる。本発明の目的のために、窒素のようなヘテロ原子は、水素置換基および／または上記ヘテロ原子の結合価を満たす、本明細書に記載される有機化合物の任意の許容可能な置換基を有し得る。さらに、本発明は、有機化合物の上記許容可能な置換基によって、いかなる様式でも制限されることを意図しない。本発明によって想定される置換基と変数との組み合わせは、好ましくは、上記処置において有用な、例えば、増殖性疾患（例えば、癌）の処置において有用な安定な化合物の形成を生じるものである。用語「安定な」とは、本明細書で使用される場合、好ましくは、製造を可能にするに十分な安定性を有し、かつ検出されるのに十分な期間にわたって、好ましくは、本明細書に記載される目的に有用であるに十分な期間にわたって、上記化合物の完全性を維持する化合物に言及する。
【００２０】
用語「脂肪族」とは、本明細書で使用される場合、飽和および不飽和両方の、直鎖状（すなわち、分枝していない）、分枝状、非環式、環式、もしくは多環式の脂肪族炭化水素を含み、これらは、必要に応じて、１個以上の官能基で置換される。当業者によって認識されるように、「脂肪族」とは、以下を含むがそれらに限定されないことが本明細書で意図される：アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルの部分。従って、本明細書で使用される場合、用語「アルキル」とは、直鎖状、分枝状、および環式のアルキル基を含む。類似の慣習は、他の包括的な用語（例えば、「アルケニル」、「アルキニル」など）に適用する。さらに、本明細書で使用される場合、用語「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」などは、置換された基および置換されていない基の両方を包含する。特定の実施形態において、本明細書で使用される場合、「低級アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を有するそれらのアルキル基（環状、非環状、置換された、置換されていない、分枝状、または非分枝状）を示すために使用される。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜２０個の脂肪族炭素原子を含む。特定の他の実施形態において、本明細書中において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜１０個の脂肪族炭素原子を含む。なお他の実施形態において、本発明において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜８個の脂肪族炭素原子を含む。なお他の実施形態において、本発明において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜６個の脂肪族炭素原子を含む。なお他の実施形態において、本発明において使用されるアルキル、アルケニル、およびアルキニル基は、１〜４個の炭素原子を含む。従って、例示的な脂肪族基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、−ＣＨ２−シクロプロピル、ビニル、アルキル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、シクロブチル、−ＣＨ２−シクロブチル、ｎ−ペンチル、ｓｅｃ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、シクロペンチル、−ＣＨ２−シクロペンチル、ｎ−ヘキシル、ｓｅｃ−ヘキシル、シクロヘキシル、−ＣＨ２−シクロヘキシル部分などが挙げられるが、これらに限定されない。これらは、繰り返すと、１個以上の置換基を含んでいてもよい。アルケニル基としては、例えば、エテニル、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イルなどが挙げられるが、これらに限定されない。代表的なアルキニル基としては、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、１−プロピニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本発明の化合物の上記の脂肪族（および他の）部分の置換基のいくつかの例としては、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；Ｆ；Ｃｌ；Ｂｒ；Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘが挙げられるが、これらに限定されない。ここでＲｘの各出現は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルが挙げられるが、これらに限定されず、上記および本明細書中の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のうちのいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよいし、分枝状であっても分枝状でなくてもよいし、環状であっても非環状であってもよいし、そして上記および本明細書中のアリールまたはヘテロアリール置換基のうちのいずれかは、置換されていてもよいし、置換されていてもよい。一般に適用可能である置換基のさらなる例は、本明細書に記載される実施例に示される具体的実施形態によって例示される。
【００２３】
一般に、用語「アリール」および「ヘテロアリール」とは、本明細書で使用される場合、好ましくは、３〜１４個の炭素原子を有する、安定な単環式または多環式の、複素環式の、多環式の、および複素多環式（ｐｏｌｙｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ）の不飽和部分であって、それらの各々は、置換されていても置換されていなくてもよいものをいう。置換基としては、上記で言及した置換基（すなわち、脂肪族部分、または本明細書において定義される他の部分に関して記載される置換基）のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されず、安定な化合物の形成を生じる。本発明の特定の実施形態において、「アリール」とは、１個もしくは２個の芳香族環（フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、インデニルなどが挙げられるが、これらに限定されない）を有する単環式もしくは二環式の炭素環式環系をいう。本発明の特定の実施形態において、用語「ヘテロアリール」とは、本明細書で使用される場合、５〜１０個の環原子を有する環式の芳香族ラジカルであって、上記環原子のうちの１つの環原子は、Ｓ、Ｏ、およびＮから選択され；０個、１個、または２個の環原子が、Ｓ、Ｏ、およびＮから独立して選択されるさらなるヘテロ原子であり；その残りの環原子が炭素であり、上記ラジカルは、上記環原子のうちのいずれかを介して上記分子の残りに結合されるもの（例えば、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニルなど）をいう。
【００２４】
アリールおよびヘテロアリール基が置換されていなくてもよいし、置換されていなくてもよく、ここで置換は、その上の水素原子の１個、２個、３個以上は、以下の部分のうちのいずれか１個以上での独立した置換を含むことが認識される。上記部分としては、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘ，が挙げられるが、これらに限定されない。ここでＲｘの各出現は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、もしくはヘテロアリールアルキルが挙げられるが、これらに限定されず、上記および本明細書に記載される脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、もしくはヘテロアリールアルキル置換基のうちのいずれかは、置換されていても、置換されていなくてもよいし、分枝状であっても分枝していなくてもよいし、環式であっても非環式であってもよいし、上記および本明細書に記載されるアリールもしくはヘテロアリール置換基のうちのいずれかは、置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい。一般に適用可能な置換基のさらなる例は、本明細書に記載される実施例に示される具体的な実施形態によって例示される。
【００２５】
用語「ヘテロ脂肪族」とは、本明細書で使用される場合、例えば、炭素原子の代わりに、１個以上の酸素、硫黄、窒素、リン、またはケイ素原子を含む脂肪族部分をいう。ヘテロ脂肪族部分は、分枝状であっても、非分枝状であっても、環式であっても、非環式であってもよく、飽和および不飽和の複素環（例えば、モルホリノ、ピロリジニルなど）を包含する。特定の実施形態において、ヘテロ脂肪族部分は、その上の水素原子のうちの１個以上を、１個以上の以下の部分で独立して置換することによって、置換されており、上記１個以上の部分としては、脂肪族；ヘテロ脂肪族；アリール；ヘテロアリール；アリールアルキル；ヘテロアリールアルキル；アルコキシ；アリールオキシ；ヘテロアルコキシ；ヘテロアリールオキシ；アルキルチオ；アリールチオ；ヘテロアルキルチオ；ヘテロアリールチオ；−Ｆ；−Ｃｌ；−Ｂｒ；−Ｉ；−ＯＨ；−ＮＯ２；−ＣＮ；−ＣＦ３；−ＣＨ２ＣＦ３；−ＣＨＣｌ２；−ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；−ＣＨ２ＮＨ２；−ＣＨ２ＳＯ２ＣＨ３；−Ｃ（Ｏ）Ｒｘ；−ＣＯ２（Ｒｘ）；−ＣＯＮ（Ｒｘ）２；−ＯＣ（Ｏ）Ｒｘ；−ＯＣＯ２Ｒｘ；−ＯＣＯＮ（Ｒｘ）２；−Ｎ（Ｒｘ）２；−Ｓ（Ｏ）２Ｒｘ；−ＮＲｘ（ＣＯ）Ｒｘが挙げられるが、これらに限定されず、ここでＲｘの各出現は、独立して、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキルが挙げられるが、これらに限定されず、上記および本明細書に記載される脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキル、またはヘテロアリールアルキル置換基のうちのいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよく、分枝状であっても非分枝状であってもよく、環式であっても非環式であってもよく、そして上記または本明細書に記載されるアリールもしくはヘテロアリール置換基のうちのいずれかは、置換されていても置換されていなくてもよい。一般に適用可能な置換基のさらなる例は、本明細書に記載される実施例に示される具体的実施形態によって例示される。
【００２６】
用語「ハロ」および「ハロゲン」とは、本明細書で使用される場合、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択される原子をいう。
【００２７】
「独立して選択される」：用語「独立して選択される」とは、Ｒ基が同一であり得るかまたは異なり得ることを示すために、本明細書で使用される。
【００２８】
本明細書を通じて使用される他の用語の定義は、以下を包含する：
「酸」：用語「酸」は、本明細書で使用される場合、無機酸および有機酸をいう。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、およびリン酸が挙げられるが、これらに限定されない。有機酸の例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、およびｐ−トルエンスルホン酸が挙げられるが、これらに限定されない。任意の酸が、上記緩衝剤またはロミデプシンの溶液またはロミデプシンの精製において使用されるもののｐＨを調節するために使用され得る。特定の実施形態において、酢酸が使用される。特定の実施形態において、塩酸が使用される。特定の実施形態において、クエン酸が使用される。特定の実施形態において、硫酸が使用される。
【００２９】
「デプシペプチド」：用語「デプシペプチド」とは、本明細書で使用される場合、エステル結合およびアミド結合の両方を含むポリペプチドをいう。天然に存在するデプシペプチドは、通常は環状である。いくつかのデプシペプチドは、強力な抗菌活性を有することが示された。デプシペプチドの例としては、アクチノマイシン、エニアチン、バリノマイシン、およびロミデプシンが挙げられる。
【００３０】
「ペプチド」または「タンパク質」：本発明によれば、「ペプチド」または「タンパク質」とは、ペプチド結合によっていっしょに連結される少なくとも３個のアミノ酸のつながりを含む。用語「タンパク質」および「ペプチド」は、交換可能に使用され得る。ペプチドは、好ましくは、天然のアミノ酸のみを含むが、天然でないアミノ酸（すなわち、天然には存在しないが、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る化合物）および／または当該分野で公知のアミノ酸アナログが、代わりに使用され得る。また、ペプチド中のアミノ酸のうちの１個以上は、例えば、化学的実体（例えば、炭水化物基、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、結合、官能化、もしくは他の改変のためのリンカーなど）の付加によって改変され得る。特定の実施形態において、上記ペプチドの改変は、より安定なペプチド（例えば、インビボでのより長い半減期）をもたらす。これら改変としては、上記ペプチドの環化、Ｄ−アミノ酸の組み込みなどが挙げられ得る。上記改変はいずれも、上記ペプチドの望ましい生物学的活性を実質的に妨害するべきでない。特定の実施形態において、ペプチドとは、デプシペプチドをいう。
【００３１】
「ロミデプシン」：用語「ロミデプシン」とは、以下の化学構造：
【００３２】
【化２】
の天然の生成物をいう。ロミデプシンは、強力なＨＤＡＣインヒビターであり、そしてまた、名称ＦＫ２２８、ＦＲ９０１２２８、ＮＳＣ６３０１７６、またはデプシペプチドによって当該分野で公知である。ロミデプシンの同定および調製は、米国特許第４，９７７，１３８号（これは、本明細書に参考として援用される）に記載される。その分子式は、Ｃ２４Ｈ３６Ｎ４Ｏ６Ｓ２である；そしてその分子量は、５４０．７１である。ロミデプシンは、化学名（１Ｓ，４Ｓ，１０Ｓ，１６Ｅ，２１Ｒ）−７−［（２Ｚ）−エチリデン］−４，２１−ジイソプロピル−２−オキサ−１２，１３−ジチア−５，８，２０，２３−テトラアザビシクロ［８．７．６］トリコス−１６−エン−３，６，９，１９，２２−ペンタノンである。ロミデプシンは、ＣＡＳ番号１２８５１７−０７−７を割り当てられた。結晶形態において、ロミデプシンは、代表的には、白色から淡黄白色の結晶または結晶様粉末である。用語「ロミデプシン」とは、この化合物およびその任意の薬学的に受容可能な塩形態を包含する。特定の実施形態において、上記用語「ロミデプシン」はまた、そのプロドラッグ、エステル、保護された形態、および誘導体を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ロミデプシンをＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの培養物から精製するためのフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
（本発明の特定の実施形態の詳細な説明）
本発明は、ロミデプシン（癌の処置において有用な公知のヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）インヒビター）を調製するための改善されたシステムを提供する。不運なことに、ロミデプシンを調製するための公開された方法は、純粋な、モノマー性のロミデプシンを再現可能に精製しない。驚くべきことに、上記精製プロセスの間のｐＨ制御は、純粋なモノマー性のロミデプシンを再現可能に提供することが見いだされた。特に、低下した見かけのｐＨ（例えば、４〜６の範囲に及ぶ見かけのｐＨ）で上記精製の少なくとも特定の部分を行うことは、ダイマー化、オリゴマー化、またはポリマー化した副生成物が夾雑することなく、精製されたモノマー性のロミデプシンのより高い収量を生じる。
【００３５】
ロミデプシンは、ジスルフィド結合を有する環状デプシペプチドである。本発明は、ロミデプシンを塩基性条件（例えば、約７より高い見かけのｐＨ）に曝すことによって、このジスルフィド結合の還元が促進されるという発見に基づく。その遊離のチオールを有する還元されたロミデプシンは、ダイマー化、オリゴマー化、またはポリマー化を受けやすいことが見いだされた。このような付加生成物は、代表的には、不溶性でありかつ精製されたロミデプシンから除去することは困難である。特定の実施形態において、このような夾雑する付加生成物は、ロミデプシンの調製物が望ましい仕様（例えば、溶解度、純度、旋光度など）を満たすことを妨げる。薬学的組成物において、これら付加生成物は、活性薬剤であるロミデプシンの純度を低下させる。ロミデプシンは、ヒトにおいて薬剤として使用されているので、純粋で安定なモノマー性のロミデプシンが、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの発酵から再現可能に得られることは重要である。本発明は、アルカリ性条件が、これらの望ましくないロミデプシン付加生成物の形成を引き起こすという認識から起こり、そしてこの課題に対する新たな解決策を提供する。
【００３６】
本発明のシステムはまた、ロミデプシンの誘導体、特に、ジスルフィド結合を含む誘導体を調製することにおいて有用である。特定の実施形態において、ロミデプシンの誘導体は、式（Ｉ）のものである：
【００３７】
【化３】
ここで
ｍは、１、２、３もしくは４であり；
ｎは、０、１、２もしくは３であり；
ｐおよびｑは、独立して、１もしくは２であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、もしくはＮＲ８であり；
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、独立して、水素；置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；不飽和もしくは飽和の、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式のヘテロ脂肪族；置換されているかもしくは置換されていないアリール；または置換されていないかもしくは置換されているヘテロアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素；または置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；およびその薬学的に受容可能な塩である。特定の実施形態において、ｍは１である。特定の実施形態において、ｎは１である。特定の実施形態において、ｐは１である。特定の実施形態において、ｑは１である。特定の実施形態において、ＸはＯである。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、非環式脂肪族である。特定の実施形態において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、すべて水素である。
【００３８】
特定の実施形態において、ロミデプシンの誘導体は、式（ＩＩ）のものである：
【００３９】
【化４】
ここで：
ｍは、１、２、３もしくは４であり；
ｎは、０、１、２もしくは３であり；
ｑは、２もしくは３であり；
Ｘは、Ｏ、ＮＨ、もしくはＮＲ８であり；
Ｙは、ＯＲ８もしくはＳＲ８であり；
Ｒ２およびＲ３は、独立して、水素；置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式のヘテロ脂肪族；置換されていないかもしくは置換されているアリール；または置換されていないかもしくは置換されているヘテロアリールであり；
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素；または置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；およびその薬学的に受容可能な塩から独立して選択される。特定の実施形態において、ｍは１である。特定の実施形態において、ｎは１である。特定の実施形態において、ｑは２である。特定の実施形態において、ＸはＯである。他の実施形態において、ＸはＮＨである。特定の実施形態において、Ｒ２およびＲ３は、置換されていないかもしくは置換されている、分枝状もしくは非分枝状の、非環式の脂肪族である。特定の実施形態において、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、すべて水素である。
【００４０】
特定の実施形態において、ロミデプシンの誘導体は、（ＩＩＩ）のものである：
【００４１】
【化５】
ここでＡは、チオール基を生じるように生理学的条件下で切断される部分であり、そして例えば、脂肪族部分もしくは芳香族アシル部分（チオエステル結合を形成するために）；脂肪族もしくは芳香族チオキシ（ａｒｏｍａｔｉｃ ｔｈｉｏｘｙ）（ジスルフィド結合を形成するために）など；およびそのラセミ混合物、鏡像異性体、異性体、互変異性体、塩、エステル、およびプロドラッグを含む。このような脂肪族もしくは芳香族の基は、置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族基；置換されているかもしくは置換されていない芳香族基；置換されているかもしくは置換されていないヘテロ芳香族基；または置換されているかもしくは置換されていない複素環式基を含み得る。Ａは、例えば、−ＣＯＲ１、−ＳＣ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｒ１、もしくは−ＳＲ２であり得る。Ｒ１は、独立して、水素；置換されているかもしくは置換されていないアミノ；置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族；置換されているかもしくは置換されていない芳香族基；置換されているかもしくは置換されていないヘテロ芳香族基；または置換されているかもしくは置換されていない複素環式基である。特定の実施形態において、Ｒ１は、水素、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ベンジル、もしくはブロモベンジルである。Ｒ２は、置換されているかもしくは置換されていない、分枝状もしくは非分枝状の、環式もしくは非環式の脂肪族基；置換されているかもしくは置換されていない芳香族基；置換されているかもしくは置換されていないヘテロ芳香族基；または置換されているかもしくは置換されていない複素環式基である。特定の実施形態において、Ｒ２は、メチル、エチル、２−ヒドロキシエチル、イソブチル、脂肪酸、置換されているかもしくは置換されていないベンジル、置換されているかもしくは置換されていないアリール、システイン、ホモシステイン、またはグルタチオンである。
【００４２】
特定の実施形態において、ロミデプシンの誘導体は、式（ＩＶ）もしくは（ＩＶ’）のものである：
【００４３】
【化６】
ここでＲ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、同じであるかまたは異なっており、そしてアミノ酸側鎖部分を表し、各Ｒ６は、同じであるかまたは異なっており、そして水素もしくはＣ１−Ｃ４アルキルを表し、そしてＰｒ１およびＰｒ２は、同じであるかもしくは異なっており、そして水素もしくはチオール保護基を表す。特定の実施形態において、上記アミノ酸側鎖部分は、天然のアミノ酸から由来するものである。他の実施形態において、上記アミノ酸側鎖部分は、非天然のアミノ酸に由来するものである。特定の実施形態において、各アミノ酸側鎖は、−Ｈ、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ２−Ｃ６アルケニル、−Ｌ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｒ’、−Ｌ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ”、−Ｌ−Ａ、−Ｌ−ＮＲ”Ｒ”、−Ｌ−Ｈｅｔ−Ｃ（Ｏ）−Ｈｅｔ−Ｒ”、および−Ｌ−Ｈｅｔ−Ｒ”から選択される部分であり、ここでＬは、Ｃ１−Ｃ６アルキレン基であり、Ａは、フェニルまたは５員もしくは６員のヘテロアリール基であり、各Ｒ’は、同じであるかもしくは異なっており、そしてＣ１−Ｃ４アルキルを表し、各Ｒ”は、同じであるかもしくは異なっており、そしてＨもしくはＣ１−Ｃ６アルキルを表し、各−Ｈｅｔ−は、同じであるかもしくは異なっており、そして−Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’’’）−、および−Ｓ−から選択されるヘテロ原子スペーサーであり、各Ｒ’’’は、同じであるかもしくは異なっており、そしてＨもしくはＣ１−Ｃ４アルキルを表す。特定の実施形態において、Ｒ６は−Ｈである。特定の実施形態において、Ｐｒ１およびＰｒ２は、同じであるかもしくは異なっており、そして水素、ならびに必要に応じてＣ１−Ｃ６アルコキシによって置換されるベンジル基、Ｃ１−Ｃ６アシルオキシ、ヒドロキシ、ニトロ、ピコリル、ピコリル−Ｎ−オキシド、アントリルメチル、ジフェニルメチル、フェニル、ｔ−ブチル、アダマンチル、Ｃ１−Ｃ６アシルオキシメチル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシメチル、テトラヒドロピラニル、ベンジルチオメチル、フェニルチオメチル、チアゾリジン、アセトアミドメチル、ベンズアミドメチル、三級ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、アセチルおよびその誘導体、ベンゾイルおよびその誘導体、カルバモイル、フェニルカルバモイル、およびＣ１−Ｃ６アルキルカルバモイルから選択される保護基から選択される。特定の実施形態において、Ｐｒ１およびＰｒ２は水素である。式（ＩＶ）および（ＩＶ’）の種々のロミデプシン誘導体は、公開されたＰＣＴ出願 ＷＯ ２００６／１２９１０５（２００６年１２月７日に公開；これは、本明細書に参考として援用される）において開示される。
【００４４】
本発明はまた、ジスルフィド連結を含む他の天然の生成物の調製において有用である。本発明は、環式もしくは非環式のペプチドの調製において使用され得る。特定の実施形態において、ジスルフィド結合を含む環式ペプチドは、本発明のシステムを使用して精製される。特定の実施形態において、ロミデプシン以外の他のデプシペプチドは、低下した見かけのｐＨを使用して、分子内ジスルフィド結合の還元を制限もしくは排除するという、本発明に基づいて精製される。
【００４５】
本発明によれば、ロミデプシンもしくはロミデプシンの誘導体の望ましくない付加生成物の形成は、ロミデプシンを、約７．０より大きい見かけのｐＨ、より好ましくは、約６．５より大きい見かけのｐＨ、もしくは最も好ましくは、約６．０より大きい見かけのｐＨの条件下で調製もしくは精製しないことによって、妨げられ得る。上記調製および精製は、代表的には、約４．０の見かけのｐＨ〜約６．０の見かけのｐＨの間で維持される。特定の実施形態において、さらに低い見かけのｐＨが使用され得る。この認識は、ロミデプシンを調製するための任意の生成法もしくは精製法に適用され得る。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、発酵物から精製される。他の実施形態において、ロミデプシンは、半合成もしくは全合成によって調製される。この発見はまた、ロミデプシンのアナログもしくは誘導体（例えば、塩、エステル、プロドラッグ、異性体、鏡像異性体、互変異性体、保護形態、誘導体化生成物など）の調製および／または生成に適用され得る。ロミデプシンの特定の誘導体は、本明細書に記載される。
【００４６】
ロミデプシンを調製するためのプロセスは、当該分野で公知である。例えば、Ｕｅｄａら，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．（Ｔｏｋｙｏ）４７：３０１−３１０，１９９４；Ｎａｋａｊｉｍａら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２４１：１２６−１３３，１９９８；ＷＯ ０２／２０８１７；米国特許第４，９７７，１３８号を参照のこと；これらの各々は、本明細書に参考として援用される。ロミデプシンは、天然の生成物であるので、代表的には、これを生成する微生物の発酵物から単離することによって調製される。特定の実施形態において、上記微生物は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。ロミデプシンを生成することが公知である例示的微生物は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍである。任意の天然もしくは人工の改変体のＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍは、本発明のシステムを使用して、ロミデプシンを単離するために使用され得る。特定の実施形態において、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの株は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＷＢ９６８である。特定の実施形態において、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの株は、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＷＢ９６８の変異株である。特定の実施形態において、上記微生物は、ロミデプシンを生成するように遺伝的に動作されている。例えば、ロミデプシンを生成する細胞機構を担う遺伝子は、別の微生物（例えば、細菌もしくは真菌）に配置され得る。
【００４７】
上記生物は、ロミデプシンの生成に適した条件下で増殖される。好ましくは、上記培養条件は、最小レベルの夾雑付加生成物もしくは分解物で、高レベルのロミデプシンを生成するように最適化される。上記培養培地は、好ましくは、窒素源および炭素源、ならびに任意の必須ビタミンおよびミネラルを含む。上記培養は、代表的には、好気条件下で増殖される。上記培養の大きさは、１０ｍＬ〜１０，０００Ｌまたはそれ以上の範囲に及び得る。特定の実施形態において、上記培養容積は、５００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、１０００Ｌより大きい。なお他の実施形態において、上記容積は、２０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、３０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、５０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、６０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、７０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、８０００Ｌより大きい。他の実施形態において、上記容積は、９０００Ｌより大きい。特定の実施形態において、上記培養容積は、約５０００Ｌ〜約１００００Ｌの範囲に及ぶ。微生物を発酵するにおいて有用な振盪フラスコ、ファーメンター、バイオリアクター、または任意の他の装置が使用され得る。適切な場合、種培養物（ｓｅｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）および少量のファーメンター培養物は、徐々に増える培養物を播種するために使用される。
【００４８】
特定の実施形態において、消泡剤（例えば、ポリアルキレングリコール消泡剤（Ａｄｅｋａｎｏｌ ＬＧ−１０９））が、より大きな培養において使用される。他の市販の消泡剤もまた、使用され得る。消泡剤は、ファーメンターが、ロミデプシンの生成のために使用される場合、特に有用である。
【００４９】
培養培地中の炭素源は、任意の炭水化物であり得る。特定の実施形態において、上記炭素源は、モノサッカリドもしくはジサッカリド（例えば、グルコース）である。特定の具体的な実施形態において、上記炭素源は、グルコースもしくはマルトデキストリンである。他の炭素源（例えば、デンプン、マルトース、フルクトース、もしくはグリセリン）は、特定の実施形態において使用され得る。特定の実施形態において、上記窒素源は、アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム）などである。他の実施形態において、上記窒素源は、植物性ペプトン（ｐｌａｎｔ ｐｅｐｔｏｎｅ）（例えば、ポリペプトンＮＳ、コーンスティープリカー、Ｈｉｎｕｔｅ Ｒ）である。使用され得る他の窒素源としては、ブイヨン、酵母抽出物、ダイズペプトン、グルテンミール、綿実粉末（ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄ ｆｌｏｕｒ）、ダイズミール、乾燥酵母、および小麦胚芽が挙げられる。特定の実施形態において、上記窒素源は、尿素もしくはアミノ酸である。特定の実施形態において、上記窒素源は、窒素を含む有機低分子である。特定の実施形態において、上記培地には、アミノ酸が補充される。例えば、上記培地には、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、もしくはＬ−システインが補充され得る。特定の実施形態において、上記培地には、Ｌ−システインが補充される。ＷＯ ０２／２０８１７を参照のこと；本明細書に参考として援用される。特定の実施形態において、上記培地には、Ｌ−システインおよびＬ−バリンが補充される。このような補充は、上記発酵において生成されるロミデプシンの量を増加させるか、そして／あるいは関連する物質および／もしくは分解物の量を減少させると考えられる。上記培養培地は、ミネラル（例えば、マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム）、およびホスフェート（例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム））を含み得る。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース、植物性ペプトン（ポリペプトンＮＳ）もしくはコーンスティープリカー（ＣＳＬ）、硫酸マグネシウム、および水を含む。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース、ポリペプトン（ポリペプトンＮＳ）、硫酸マグネシウム、消泡剤、および水を含む。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース（０．４５〜１．０％）、植物性ペプトン（ポリペプトンＮＳ）もしくはＣＳＬ（０．９〜４．０％）、硫酸マグネシウム（０．００５４〜０．０１０％）、消泡剤（０．０９％〜０．１１％）、および水（残量（ｂａｌａｎｃｅ））を含む。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース、酸化型デンプン（例えば、Ｐｉｎｅｄｅｘ ＃１００）もしくはマルトデキストリンダイズペプトン（例えば、Ｈｉｎｕｔｅ−Ｒ）、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、消泡剤（例えば、Ａｄｅｋａｎｏｌ ＬＧ−１０９）、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、および水を含む。特定の実施形態において、上記培養培地は、グルコース（２〜１０％）、酸化型デンプン（例えば、Ｐｉｎｅｄｅｘ ＃１００）もしくはマルトデキストリン（１〜１５％）、ダイズペプトン（例えば、Ｈｉｎｕｔｅ−Ｒ）（１〜６％）、硫酸アンモニウム（０〜０．５％）、硫酸マグネシウム（０〜２％）、リン酸二水素カリウム（０．２７５〜１．６５％）、リン酸水素二ナトリウム（０．１８〜１．０８％）、消泡剤（例えば、Ａｄｅｋａｎｏｌ ＬＧ−１０９）（０．２〜０．６６％）、Ｌ−システイン（０〜３０ｍＭ）、Ｌ−バリン（０〜１５ｍＭ）、および水を含む。
【００５０】
上記培養物は、代表的には、上記微生物の増殖に適した条件下（例えば、温度、ｐＨ、酸素濃度など）で増殖される。特定の実施形態において、上記培養物のｐＨは、モニターされ、および／もしくは調節される。上記培養物のｐＨは、ｐＨ５．０〜７．５の範囲に及び得る。ロミデプシン生成のための任意の生物は、上記培養物が増殖される条件下に依存して、増殖のための好ましい温度を有する。特定の実施形態において、上記培養物は、１５℃〜３７℃、好ましくは、２３℃〜３２℃の範囲に及ぶ温度で増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、１８℃〜２７℃の間の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約１８℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約１９℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２０℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２１℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２２℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２３℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２４℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２５℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２６℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２７℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２８℃において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約２９℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約３０℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約３１℃の温度において増殖される。特定の実施形態において、上記培養物は、約３２℃の温度において増殖される。
【００５１】
上記培養物における酸素濃度は、１０〜５０％の範囲に及ぶレベルで維持される。特定の実施形態において、上記酸素濃度は、２０％より高く維持される。上記酸素レベルは、曝気、圧力、および／もしくは攪拌によって維持される。
【００５２】
得られた培養物は、代表的には、約１０〜１００時間にわたって増殖される。上記培養物は、２０時間後、３０時間後、４０時間後、５０時間後、６０時間後、７０時間後、または８０時間後に回収され得る。特定の実施形態において、上記培養物は、約３０時間後、３５時間後、４０時間後、４５時間後、もしくは５０時間後に回収される。特定の実施形態において、上記培養物は、約３６時間で回収される。特定の実施形態において、上記培養物は、約５０時間で回収される。代表的には、上記培養物は、飽和まで増殖される。ロミデプシンは、二次代謝産物であるので、最大収量は、より後期の培養物から得られる。いくつかの実施形態において、上記培養物は、対数期で回収される。当業者によって認識されるように、上記培養物は、代表的には、顕著な量の分解物が形成される前に回収される。上記回収時間は、ロミデプシンの生成のために発酵のサンプルをアッセイすることによって、経験的に決定され得る。特定の実施形態において、上記培養物は、ロミデプシンの力価が、０．５〜１．５ｇ／ｋｇの間に達するときに、回収される。特定の実施形態において、上記培養物は、上記力価が少なくとも０．６ｇ／ｋｇ、０．７ｇ／ｋｇ、０．８ｇ／ｋｇ、０．９ｇ／ｋｇ、１．０ｇ／ｋｇ、もしくは１．１ｇ／ｋｇに達したときに回収される。特定の実施形態において、上記培養物は、上記力価が少なくとも０．８ｇ／ｋｇに達したときに回収される。上記サンプルはまた、関連した物質もしくは分解物についてアッセイされ得、そして上記培養物は、ロミデプシンの望ましいレベル、関連する物質もしくは分解物の望ましいレベル、または上記２つのある比率が達成されたときに回収され得る。回収の時間はまた、培地中の成分（例えば、グルコース）の消費に基づいて決定される。他の実施形態において、上記回収の時間は、代謝産物の生成に基づく。上記回収の時間は、上記基準の組み合わせに基づいて決定され得る。
【００５３】
上記培養物を十分な時間にわたって増殖させた後、上記培養物は、回収される。上記望ましいロミデプシンは、上記培養培地中、および上記培養物の細胞中に見いだされ得る。上記細胞は、必要に応じて、死滅させられ、そして／または精製前に溶解される。特定の実施形態において、上記細胞は、酸（例えば、硫酸）の添加によって死滅させられる。特定の実施形態において、上記ｐＨは、約ｐＨ２．０〜３．０に下げられる。
【００５４】
次いで、得られた物質は、必要に応じて、容積が減少させられる。上記ロミデプシンは、ペプチド、天然生成物、および／もしくは有機分子を精製するための当該分野で公知の任意の精製技術によって、精製される。例示的な精製技術としては、バッチクロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、および結晶化が挙げられる。上記精製プロセスは、望ましい程度の純度を達成するために、１つ以上の工程を包含し得る。特定の実施形態において、上記抽出される物質は、非イオン性吸着樹脂を使用して精製される。特定の実施形態において、逆相樹脂が、上記精製工程において使用される。特定の具体的な実施形態において、逆相樹脂を使用する複数のカラムクロマトグラフィー工程が、使用される。上記精製プロセスにおいて有用な例示的な樹脂としては、アルミナ、シリカゲル、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８５０、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳ、およびＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０が挙げられる。特定の実施形態において、上記Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳおよび／もしくはＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手される。特定の実施形態において、アルミナは、上記カラム材料として使用される。特定の実施形態において、シリカゲルは、上記樹脂として使用される。特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィー工程のうちの１つ以上が、６．０未満の見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、これら工程のうちの１つ以上は、４．０〜６．０の間の見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィー工程のうちのすべてが、６．０未満の見かけのｐＨにおいて行われる。特定の実施形態において、上記カラムクロマトグラフィー工程のうちのすべてが、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。
【００５５】
特定の実施形態において、ロミデプシンの精製は、上記抽出した物質を、１つより多いカラムクロマトグラフィー工程もしくはバッチクロマトグラフィー工程を使用して、精製することを包含する。特定の実施形態において、バッチクロマトグラフィー工程の後に、カラムクロマトグラフィー工程が行われる。特定の実施形態において、上記抽出された物質は、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８５０を用いたバッチクロマトグラフィー、続いて、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳを充填したカラム、続いて、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０を充填したカラム、続いて最後に、アルミナを充填したカラムによって精製される。これらクロマトグラフィー工程のうちのすべては、好ましくは、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。他の実施形態において、上記抽出された物質は、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０を充填したカラム、続いて、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳを充填したカラム、続いて最後にＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０を充填したもう一つのカラムを使用して精製される。この代替の精製プロセスにおいて、上記カラムクロマトグラフィー工程のうちのすべては、好ましくは、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。上記カラムの各々は、必要に応じて、水もしくは他の水溶液で洗浄され、続いて、有機溶媒（例えば、アセトン）の水溶液を用いたロミデプシンの溶出が行われる。特定の実施形態において、上記抽出された物質は、シリカゲルを使用して精製される。シリカゲルクロマトグラフィーはまた、他の樹脂もしくは充填物質を使用したクロマトグラフィーとともに、さらなる精製工程として使用され得る。特定の実施形態において、上記抽出された物質は、アルミナを使用して精製される。アルミナクロマトグラフィーはまた、他の樹脂もしくは充填物質を使用したクロマトグラフィーとともに、さらなる精製工程として使用され得る。
【００５６】
特定の実施形態において、上記粗製ロミデプシンを含む物質は、６．０未満の見かけのｐＨ、好ましくは、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨで予備平衡化されたマトリクス上に載せられる。次いで、上記マトリクスは、不純物を除去するために洗浄される。代表的には、上記マトリクスの洗浄は、ロミデプシンの溶出液より極性の高い溶液（すなわち、水のパーセンテージがより高い）において行われる。例えば、上記マトリクスは、２５〜５０％までのアセトン水溶液で洗浄され得、続いて、５０〜１００％ アセトン水溶液でロミデプシンの溶出が行われる。当業者によって認識されるように、上記洗浄溶媒および溶出溶媒は、使用されるマトリクスおよび上記化合物の極性によって決定される。
【００５７】
特定の実施形態において、上記クロマトグラフィー工程（載せる工程、洗浄する工程、および樹脂の溶出工程を包含する）のうちの１つ以上は、６．０未満の見かけのｐＨで行われる。特定の具体的な実施形態において、上記クロマトグラフィー工程は、３．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。特定の他の実施形態において、上記クロマトグラフィー工程は、４．０〜６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて行われる。上記マトリクスに載せられた溶液の見かけのｐＨは、酸を添加することによって、望ましい見かけのｐＨに調節され得る。本明細書に記載される酸のいずれかが、上記溶液の見かけのｐＨを低下させるために使用され得る。上記洗浄溶液および溶出溶液の見かけのｐＨは、同様に、望ましい見かけのｐＨに調節され得る。特定の実施形態において、ロミデプシンを含むすべての溶液の見かけのｐＨは、約６．０未満の見かけのｐＨに維持され、それによって、望ましくない付加生成物の形成が妨げられる。特定の実施形態において、上記溶液の見かけのｐＨは、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨにおいて緩衝化される。特定の実施形態において、上記アセトン／水 溶液の見かけのｐＨは、酢酸、塩酸、酢酸アンモニウム緩衝液、もしくはクエン酸を使用して、望ましい見かけのｐＨに調節される。特定の実施形態において、酢酸緩衝化系が、使用される。
【００５８】
ロミデプシンは、代替的にもしくはさらに、結晶化によって精製される。結晶化による精製は、カラムクロマトグラフィーおよび／もしくはバッチクロマトグラフィーを含む他の精製法とともに、使用され得る。特定の実施形態において、結晶化は、カラムクロマトグラフィーおよび／もしくはバッチクロマトグラフィーによって精製した後に使用される。特定の具体的な実施形態において、上記結晶化は、上記のカラムクロマトグラフィーおよび／もしくはバッチクロマトグラフィーによって精製した後に行われる。上記結晶化は、任意の適切な溶媒中で行われ得る。ロミデプシンは、好ましくは、上記溶媒中に最小限に可溶性である。特定の実施形態において、上記結晶化溶媒は、アルコールである。特定の実施形態において、上記結晶化溶媒は、メタノールである。特定の実施形態において、上記結晶化溶媒は、エタノールである。特定の実施形態において、混合溶媒系が使用される。上記結晶化溶媒は、アルコール／水混合物であり得る。他の実施形態において、上記結晶化溶媒は、アセトンと水との混合物である。特定の具体的な実施形態において、ロミデプシンは、アセトン水溶液（例えば、８５％ アセトン）中に溶解され、水をゆっくりと添加することによって沈澱させられる。特定の実施形態において、ロミデプシンは、溶媒（例えば、メタノール）中に溶解され、そして得られた溶液は、濃縮されて、上記ロミデプシンが結晶化させられる。他の実施形態において、上記ロミデプシンは、水／有機溶媒混合物（例えば、８５％ アセトン水溶液）中に溶解され、そして上記ロミデプシンは、水を添加することによって沈澱させられる。結晶化工程から得られた結晶は、代表的には、濾過によって回収され、および必要に応じて、洗浄および乾燥される。特定の実施形態において、上記結晶化溶媒の見かけのｐＨは、６．０未満である。特定の具体的な実施形態において、上記溶媒の見かけのｐＨは、４．０〜６．０の間である。得られた結晶の任意の洗浄がまた、低下した見かけのｐＨ（例えば、４．０〜６．０の間の見かけのｐＨ）において行われる。
【００５９】
代替的にまたはさらに、上記結晶化プロセスの間の上記ロミデプシンの貯蔵時間もしくは保持時間は、約２０時間未満である。特定の実施形態において、上記貯蔵時間もしくは保持時間は、１０時間未満である。他の実施形態において、上記貯蔵時間もしくは保持時間は、５時間未満である。特定の具体的な実施形態において、上記結晶化プロセスは、上記結晶化溶液を形成する際にすぐに行われる。
【００６０】
本発明は、望ましくない付加生成物を含まないかもしくは実質的に含まない、精製ロミデプシンを提供する。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９８％夾雑する付加生成物を含まないか、少なくとも９９％夾雑する付加生成物を含まないか、または少なくとも９９．５％付加生成物を含まない。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９８％モノマー性、少なくとも９９％モノマー性、または少なくとも９９．５％モノマー性である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．９％モノマー性である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．９５％モノマー性である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、検出可能なダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンを含まない。
【００６１】
特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９８％の純度、少なくとも９９％の純度、または少なくとも９９．５％の純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．７％の純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．８％の純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．９％の純度である。特定の実施形態において、上記ロミデプシンは、少なくとも９９．９５％の純度である。特定の具体的な実施形態において、上記ロミデプシンは、０．２％未満の「他の未知物質」といわれる不純物を含む。特定の具体的な実施形態において、上記ロミデプシンは、０．１％未満の「他の未知物質」を含む。このように高度に精製されたロミデプシンは、薬学的組成物の調製において有用である。このような組成物は、癌もしくは他の増殖性疾患の処置において特に有用である。上記組成物はまた、ヒストンデアセチラーゼ活性を阻害することによって処置され得る他の疾患において使用され得る。上記組成物はまた、チューブリンデアセチラーゼ活性を阻害することによって処置され得る他の疾患において使用され得る。上記組成物はまた、デアセチラーゼ活性を阻害することによって処置され得る他の疾患において使用され得る。本発明の精製ロミデプシンはまた、研究目的のために有用である。
【００６２】
上記ロミデプシンの純度は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、評価され得る。純度の評価法としては、外観、ＨＰＬＣ、比旋光度、ＮＭＲ分光法、ＩＲ分光法、ＵＶ／可視光分光法、粉末ｘ線回折（ＸＲＰＤ）分析、元素分析、ＬＣ−質量分析、および質量分析が挙げられる。特定の実施形態において、上記純度は、ＨＰＬＣによって評価され、このＨＰＬＣは、約０．０５％の不純物検出限界を有する。特定の実施形態において、上記純度は、ＮＭＲ分光法によって評価される。特定の実施形態において、上記純度は、ＩＲ分光法によって評価される。特定の実施形態において、上記純度は、ＵＶ／可視光分光法によって評価される。特定の実施形態において、上記純度は、ＸＲＰＤによって評価される。
【００６３】
特定の実施形態において、上記純度は、適切な溶媒中での比旋光度によって評価される。特定の実施形態において、上記比旋光度に使用される溶媒は、クロロホルム（ＣＨＣＬ３）である。他の実施形態において、上記使用される溶媒は、アルコール（例えば、メタノールもしくはエタノール）である。さらに他の実施形態において、上記使用される溶媒は、水もしくは水／アルコール溶液である。特定の実施形態において、上記比旋光度は、米国局方（Ｕ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）、欧州局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）、日本局方（ＪＰ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）または英国局方（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ）に記載されるもののような分析法（ｃｏｍｐｅｎｄｉａｌ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して、チェックされる。特定の実施形態において、上記比旋光度は、ロミデプシンのクロロホルム溶液を用いて行われる。上記溶液の濃度は、５ｍｇ／ｍＬ〜３０ｍｇ／ｍＬの範囲に及び得る。特定の実施形態において、上記濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬである。上記ロミデプシンの旋光度は、＋３８°〜＋４７°に及ぶ。特定の実施形態において、上記比旋光度は、＋３９°〜＋４１°の範囲に及ぶ。特定の実施形態において、上記比旋光度は、＋４０．０°〜＋４０．５°の範囲に及ぶ。特定の具体的な実施形態において、上記比旋光度は、約＋４０°である。夾雑する付加生成物の存在は、ロミデプシンをクロロホルム中に溶解した場合に沈澱を生じることが、発見された。
【００６４】
溶液中に存在する場合、上記ロミデプシンは、好ましくは、約６．０未満の見かけのｐＨで貯蔵される。特定の実施形態において、上記見かけのｐＨは、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ。特定の実施形態において、ロミデプシンの処方物もしくは調製物は、７．０より高い、より好ましくは、６．０より高い見かけのｐＨを防ぐために、緩衝化される。特定の実施形態において、上記処方物もしくは調製物は、約４．０〜約６．０の範囲に及ぶ見かけのｐＨに緩衝化される。
【００６５】
（使用）
本明細書に記載されるように調製されたロミデプシンは、インビトロまたはインビボで使用され得る。上記ロミデプシンは、新生物のインビボでの処置において特に有用である。しかし、上記組み合わせはまた、研究目的または臨床目的で（例えば、ロミデプシンに対する患者の疾患の感受性を決定するために）インビトロで使用され得る。特定の実施形態において、上記新生物は、良性の新生物である。他の実施形態において、上記新生物は、悪性の新生物である。任意の癌が、ロミデプシンを用いて、単独で、もしくは別の薬剤と組み合わせて、処置され得る。
【００６６】
特定の実施形態において、上記悪性疾患は、血液の悪性疾患である。血液の悪性疾患は、血液、骨髄、および／またはリンパ節に影響を及ぼすタイプの癌である。ロミデプシンを用いて処置され得る血液の悪性疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリーセル白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、多発性骨髄腫、および骨髄異形成症候群。特定の実施形態において、本発明の組み合わせは、多発性骨髄腫を処置するために使用される。特定の具体的な実施形態において、上記癌は、再発したおよび／または抵抗性の（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）多発性骨髄腫である。他の実施形態において、本発明の組み合わせは、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を処置するために使用される。特定の具体的な実施形態において、上記癌は、再発したおよび／または抵抗性のＣＬＬである。他の実施形態において、本発明の組み合わせは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を処置するために使用される。特定の実施形態において、本発明の組み合わせは、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を処置するために使用される。特定の実施形態において、本発明の組み合わせは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を処置するために使用される。特定の実施形態において、上記癌は、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）である。他の実施形態において、上記癌は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）である。特定の実施形態において、上記癌は、骨髄異形成症候群である。
【００６７】
血液の悪性疾患以外の他の癌はまた、ロミデプシンを用いて処置され得る。特定の実施形態において、上記癌は、固形腫瘍である。組み合わせ両方を用いて処置され得る例示的な癌としては、結腸癌、肺癌、骨癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、皮膚癌、脳眼、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、神経内分泌の癌などが挙げられる。特定の実施形態において、ロミデプシンは、膵臓癌を処置するために使用される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、前立腺癌を処置するために使用される。特定の具体的実施形態において、上記前立腺癌は、ホルモン抵抗性前立腺癌である。
【００６８】
新生物（例えば、被験体における癌）の処置において、ロミデプシンは、代表的には、１〜２８ｍｇ／ｍ２において投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、１〜１５ｍｇ／ｍ２において投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、５〜１４ｍｇ／ｍ２において投与される。特定の具体的な実施形態において、ロミデプシン（ｒｏｍｄｉｅｐｓｉｎ）は、８ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１２ｍｇ／ｍ２、または１４ｍｇ／ｍ２において投与される。ロミデプシンは、代表的には、２８日サイクルにおいて投与され、ロミデプシンは、１日目、８日目、および１５日目に投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、１日目および１５日目に投与され、８日目は省略される。当業者によって認識されるように、ロミデプシンの投与量および投与のタイミングは、処置される患者に依存して変動し得る。例えば、有害な副作用は、投与されるロミデプシンの投与量を低下させることを要し得る。
【００６９】
ロミデプシンはまた、細胞をインビトロで処置および／または死滅させるために使用され得る、特定の実施形態において、ロミデプシンの細胞傷害性濃度は、細胞を死滅させるために、細胞と接触させられる。特定の実施形態において、ロミデプシンの濃度は、０．０１ｎＭ〜１００ｎＭの範囲に及ぶ。特定の実施形態において、ロミデプシンの濃度は、０．１ｎＭ〜５０ｎＭの範囲に及ぶ。特定の実施形態において、ロミデプシンの濃度は、１ｎＭ〜１０ｎＭの範囲に及ぶ。
【００７０】
任意のタイプの細胞は、ロミデプシンで処置または死滅させられ得る。上記細胞は、任意の動物、植物、細菌、または真菌の供給源に由来し得る。特定の実施形態において、上記細胞は、動物細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、ヒト細胞である。上記細胞は、発生の任意の段階における男性および女性のヒトに由来し得る。特定の実施形態において、上記細胞は、霊長類細胞である。他の実施形態において、上記細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ）に由来する。特定の実施形態において、上記細胞は、飼い慣らされた動物（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ブタなど）から得られる。上記細胞はまた、遺伝的に操作された動物もしくは植物（例えば、トランスジェニックマウス）に由来し得る。
【００７１】
上記使用される細胞は、野生型細胞もしくは変異細胞であり得る。上記細胞は、遺伝的に操作され得る。特定の実施形態において、上記細胞は、正常細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、新生物細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、癌細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、血液の悪性疾患に由来する。他の実施形態において、上記細胞は、固形腫瘍に由来する。例えば、上記細胞は、患者の腫瘍に（例えば、生検または外科手術切除に）由来し得る。細胞傷害性に対するこのような試験は、患者が特定の併用療法に応答するか否かを決定するにあたって有用であり得る。このような試験はまた、上記悪性疾患を処置するために必要とされる投与量を決定するにあたって有用であり得る。ロミデプシンに対する患者の癌の感受性の試験は、患者に対する影響なく、薬物の不要な投与を妨げる。上記試験はまた、上記患者の癌が、ロミデプシンに対して特に感受性である場合に、上記薬物のうちの一方または両方の低い用量を使用することを可能にし得る。
【００７２】
他の実施形態において、上記細胞は、癌細胞株に由来する。特定の実施形態において、上記細胞は、血液の悪性疾患（例えば、本明細書で議論されるもの）に由来する。ヒト白血病細胞株としては、Ｕ９３７、ＨＬ−６０、ＴＨＰ−１、Ｒａｊｉ、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、およびＪｕｒｋａｔが挙げられる。例示的なＣＬＬ細胞株としては、ＪＶＭ−３およびＭＥＣ−２が挙げられる。例示的な骨髄腫細胞株としては、ＭＭ１．Ｓ、ＭＭ１．Ｒ（デキサメタゾン耐性）、ＲＰＭＩ８２２６、ＮＣＩ−Ｈ９２９、およびＵ２６６が挙げられる。例示的なリンパ腫細胞株としては、Ｋａｒｐａｓ、ＳＵＤＨ−６、ＳＵＤＨ−１６、Ｌ４２８、ＫＭＨ２、およびＧｒａｎｔａ マントル細胞リンパ腫細胞株（Ｇｒａｎｔａ ｍａｎｔｌｅ ｌｙｍｐｈｏｍａ）が挙げられる。特定の実施形態において、上記細胞は、ＡＭＬ細胞もしくは多発性骨髄腫（ＣＤ１３８＋）細胞である。特定の実施形態において、上記細胞は、造血性幹細胞もしくは前駆細胞である。例えば、特定の実施形態において、上記細胞は、造血性前駆細胞（例えば、ＣＤ３４＋骨髄細胞）である。特定の実施形態において、上記細胞株は、特定の化学療法剤に耐性である。他の実施形態において、上記細胞株は、ステロイド耐性（例えば、デキサメタゾン耐性）である。特定の具体的な実施形態において、上記細胞は、ステロイド耐性ヒト多発性骨髄腫細胞である。
【００７３】
（薬学的組成物）
本発明はまた、本明細書に記載されるように調製されたロミデプシンを含む薬学的組成物を提供する。特定の実施形態において、上記組成物は、新生物細胞（例えば、血液の悪性疾患）に対する細胞増殖抑制性活性または細胞傷害性活性を示す。ロミデプシンの例示的投与は、上記に記載される。特定の実施形態において、上記薬学的組成物は、上記薬物の１用量についてのロミデプシンの量を含む。本発明の他の薬学的組成物は、ロミデプシンの複数の用量（例えば、サイクルもしくは全体の処置レジメンを完了するために必要とされる用量の総数）を含み得る。特定の実施形態において、投与されるロミデプシンの量は、上記被験体の血流において細胞傷害性レベル（例えば、ナノモルレベル）を達成するに十分である。特定の実施形態において、上記投与される量は、上記被験体における癌の部位において、ロミデプシンの細胞傷害性濃度（例えば、ナノモルレベル）を達成するに十分である。
【００７４】
本発明の薬学的調製物はまた、ロミデプシンおよび他の薬剤がいっしょに投与され得るように、他の薬剤を含み得る。このような調製物は、両方の投与のために適した量の各薬剤を含む。特定の実施形態において、ロミデプシンは、１種以上のさらなる治療剤（例えば、別の細胞傷害性薬剤）と組み合わせて投与される。ロミデプシンと組み合わせて投与され得る例示的な細胞傷害性薬剤としては、ゲムシタビン、デシタビン、およびフラボピリドールが挙げられる。他の実施形態において、ロミデプシンは、抗炎症剤（例えば、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンなど）、鎮痛剤（ｐａｉｎ ｒｅｌｉｅｖｅｒ）、制吐剤（ａｎｔｉ−ｎａｕｓｅａ ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）、または解熱剤と組み合わせて投与される。特定の他の実施形態において、ロミデプシン（ｒｏｍｄｅｐｓｉｎ）は、ステロイド剤（例えば、デキサメタゾン）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、胃腸障害（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｄｉｓｔｕｒｂａｎｃｅ）（例えば、悪心、嘔吐、および下痢）を処置するための薬剤とともに投与される。これらのさらなる薬剤としては、制吐剤（ａｎｔｉ−ｅｍｅｔｉｃ）、下痢止め、補液（ｆｌｕｉｄ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、電解質置換物（ｅｌｅｔｒｏｌｙｔｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）などが挙げられ得る。他の実施形態において、ロミデプシンは、電解質置換物または電解質補充物（例えば、カリウム、マグネシウム、およびカルシウム、特に、カリウムおよびマグネシウム）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、不整脈治療剤（ａｎｔｉ−ａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ ａｇｅｎｔ）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、血小板ブースター（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｂｏｏｓｔｅｒ）（例えば、血小板の生成を増大させる薬剤）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、血球の生成を増大させる薬剤（例えば、エリスロポエチン）と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシンは、高血糖症を防止するための薬剤と組み合わせて投与される。特定の実施形態において、ロミデプシン（これは、ＨＡＤＣ阻害性活性を有する）は、別のＨＤＡＣインヒビターとともに投与されない。
【００７５】
ロミデプシンが処置のための遊離の形態で存在し得るか、または適切な場合、その薬学的に受容可能な形態として存在し得ることもまた、認識される。本発明によれば、薬学的に受容可能な形態としては、必要な患者への投与の際に、直接的にもしくは間接的に、ロミデプシンを、またはその代謝産物もしくは残渣（ｒｅｓｉｄｕｅ）（例えば、プロドラッグ）を提供することができる、薬学的に受容可能な塩、エステル、このようなエステルの塩、または任意の他の付加生成物もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能な塩」とは、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答などなくして、ヒトおよび下級動物の組織と接触させるための使用に適しており、かつ妥当な便益／リスク比と釣り合っている塩をいう。薬学的に受容可能な塩は、当該分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９，１９７７（本明細書に参考として援用される）において薬学的に受容可能な塩を詳細に記載している。上記塩は、ロミデプシンの最終的な単離および精製の間にインサイチュで、または遊離の塩基官能基と、適切な有機酸もしくは無機酸とを反応させることによって別々に、調製され得る。薬学的に受容可能な、非毒性の酸付加塩の例は、無機酸（例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸）と、または有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、もしくはマロン酸と形成されるか、または当該分野で使用される他の方法（例えば、イオン交換）を使用することによって形成される、アミノ基と塩である。他の薬学的に受容可能な塩としては、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩（ｈｅｒｎｉｓｕｌｆａｔｅ）、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレン硫酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリ金属塩もしくはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが挙げられる。さらに薬学的に受容可能な塩としては、適切な場合、対イオン（例えば、ハライド、ヒドロキシド、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ニトレート、低級アルキルスルホネート、およびアリールスルホネート）を使用して形成される非毒性のアンモニウムカチオン、四級アンモニウムカチオン、およびアミンカチオンが挙げられる。
【００７７】
さらに、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に受容可能なエステル」とは、好ましくは、インビボで加水分解しかつ人体で容易に分解して、親化合物（例えば、ロミデプシン）もしくはその塩を放出するものを含むエステルをいう。適切なエステル基としては、例えば、薬学的に受容可能な脂肪族カルボン酸、特に、アルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸、およびアルカン二酸に由来するものが挙げられ、ここで各アルキルもしくはアルケニル部分は、有利には、多くて６個の炭素原子を有する。特定のエステルの例としては、ホルメート、アセテート、プロピオネート、ブチレート、アクリレート、およびエチルスクシネートが挙げられる。特定の実施形態において、上記エステルは、酵素（例えば、エステラーゼ）によって切断される。
【００７８】
さらに、用語「薬学的に受容可能なプロドラッグ」とは、本明細書で使用される場合、堅実な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー性応答などなくして、ヒトおよび下級動物の組織と接触させるための使用に適しており、かつ妥当な便益／リスク比と釣り合っており、それらの意図された用途に有効であるロミデプシンのプロドラッグ、ならびにロミデプシンの双性イオン形態、または考えられる場合、その誘導体をいう。用語「プロドラッグ」とは、インビボで迅速に変換されて、例えば、血中での加水分解によって親化合物を生じる化合物をいう。詳細な議論は、Ａ．Ｃ．Ｓ． Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ＳｅｒｉｅｓのＴ．Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ．Ｓｔｅｌｌａ，Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｏｌ．１４、およびＥｄｗａｒｄ Ｂ．Ｒｏｃｈｅ，編，Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８７（これらはともに、本明細書に参考として援用される）において提供される。
【００７９】
上記で記載されるように、本発明の薬学的組成物は、望まれる特定の投与形態に適するように、薬学的に受容可能なキャリア（これは、本明細書で使用される場合、任意のおよびすべての溶媒、希釈剤、もしくは他の液体ビヒクル、分散補助剤もしくは懸濁補助剤、界面活性剤、等張剤、濃化剤もしくは乳化剤、保存剤、固体結合剤、滑沢剤などを含む）をさらに含む。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９７５）は、薬学的組成物を処方するにあたって使用されかつその調製のための公知の種々のキャリアを開示する。例えば、任意の望ましくない生物学的効果を生じることによって、またはさもなければ、上記薬学的組成物の任意の他の成分と有害な様式で相互作用することによって、任意の従来のキャリア媒体がロミデプシンと不適合性である範囲を除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが予期される。薬学的に受容可能なキャリアとして働き得る物質のいくつかの例としては、糖（例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース）；デンプン（例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース）；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ；Ｓｏｌｕｔｏｌ；賦形剤（例えば、カカオ脂および坐剤用ワックス）；油（例えば、ラッカセイ油、綿実油；紅花油；ごま油；オリーブ油；コーン油および大豆油）；グリコール（例えば、プロピレングリコール）；エステル（例えば、オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル）；寒天；緩衝化剤（例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム）；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張性生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール、およびリン酸緩衝溶液、ならびに他の非毒性の適合性滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）が挙げられるが、これらに限定されず、同様に、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、矯味矯臭剤、保存剤および抗酸化剤もまた、処方者の判断に従って、上記組成物中に存在し得る。
【００８０】
本発明のこれらおよび他の局面は、以下の実施例を考慮すれば、さらに認識され、以下の実施例は、本発明の特定の具体的実施形態を例示するが、特許請求の範囲に規定されるような、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【００８１】
（実施例１：ロミデプシンの精製）
（吸着樹脂によるロミデプシンの精製）
約４００ｇのロミデプシンを含むＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍの培養ブロス（約６００Ｌ；Ｈ２ＳＯ４でｐＨ２．５に調節される）を抽出し、その抽出ブロスを、Ｓｅｐａｂｅａｄｓ ＳＰ８５０（非イオン性吸着樹脂）を充填したカラムに適用する。ロミデプシン（せいぜい６ｇ−ロミデプシン／Ｌ−樹脂）を、せいぜいｓｖ＝６の流速で、上記樹脂に結合させる。水道水（約３倍樹脂容積）および２５％ アセトン水溶液（約５倍樹脂容積）で洗浄した後、約６５％ アセトン水溶液およびせいぜいｓｖ＝４の流速で溶出を行う。
【００８２】
（ＨＰ２０ＳＳクロマトグラフィーによるロミデプシンの精製）
上記溶出液を水で希釈して、水溶液を生成する（約７５％ 水分含有量）。この溶液を、Ｄｉａｉｏｎ ＨＰ２０ＳＳカラムに適用する。この非イオン性吸着樹脂は、せいぜいｓｖ＝５の流速でロミデプシンを吸着する（約１０ｇ−ロミデプシン／Ｌ−樹脂）。２５％ アセトン水溶液（約０．５倍樹脂容積）および４０％ アセトン水溶液（約４倍樹脂容積）で洗浄した後、４７％ アセトン水溶液で溶出を行う。上記溶出液を、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分析する。その活性画分を、中間保持タンクの中で合わせる。
【００８３】
（非水性溶媒中の水性溶媒を吸着カラムによる置換）
上記ＨＰ２０ＳＳカラムから得られる溶出液を水で希釈して、水溶液（約８０％ 水分含有量）を生成する。この溶液をＤｉａｉｏｎ ＨＰ２０カラムに適用する。２０％ アセトン水溶液で洗浄した後、アセトンで溶出を行う。この溶出液を真空中で濃縮する。上記濃縮物に酢酸エチルを添加した後、上記濃縮物を、真空中でさらに濃縮する。この工程を反復して行う。
【００８４】
（アルミナによるロミデプシンの精製）
得られた濃縮物を酢酸エチル中に溶解し（約６ｍｇ／ｍＬ）、アルミナ樹脂カラムに適用する（約７５ｇ−ロミデプシン／Ｌ−樹脂）。上記カラムを酢酸エチル（約２倍アルミナ容積）、およびアセトンと酢酸エチルとの混合物（０．５〜２．０ ｖ／ｖ、約８倍アルミナ容積）で展開する。上記濃縮物にアセチルを添加した後、得られた溶液をさらに濃縮する。
【００８５】
（結晶化１（メタノール））
上記工程から得られる濃縮物をメタノールで希釈し、真空中で濃縮して、粗製ロミデプシン結晶を生じる。沈澱した結晶を、濾過により集める。
【００８６】
結晶化２（アセトン／水）
上記粗製ロミデプシン結晶を、８５％ アセトン水溶液中に溶解し（約１３Ｌ／ｋｇ−粗製ロミデプシン結晶）、そして攪拌しながら精製水をゆっくりと添加することによって沈澱させる（約６５Ｌ／ｋｇ−粗製ロミデプシン結晶）。上記沈澱した結晶を濾過により集め、１５％ アセトン水溶液で洗浄する（約５Ｌ／ｋｇ−粗製ロミデプシン）。上記湿っている結晶を、−７０℃未満において真空下で乾燥させる。
【００８７】
（等価物および範囲）
前述は、本発明の特定の非限定的な好ましい実施形態を記載してきた。当業者は、単なる慣用的実験を用いて、本明細書に記載される、本発明の具体的実施形態に対する多くの等価物を認識するかまたは確認することができる。当業者は、この記載に対する種々の変更および改変を認識し、これらの変更および改変は、以下の特許請求の範囲において規定される本発明の趣旨からも範囲からも逸脱することなく行われ得る。
【００８８】
特許請求の範囲において、冠詞、例えば、「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「該、前記、上記（ｔｈｅ）」は、相反するものまたは文脈から明らかに別のものを示さない限り、１つ以上を意味し得る。ある群のうちの１つ以上のメンバー間で「もしくは、または、あるいは（ｏｒ）」を含む請求項もしくは説明は、上記群のメンバーのうちの１つ、１つより多く、またはすべてが、相反するものまたは文脈から明らかに別のものを示さない限り、所定の生成物もしくはプロセスに存在するか、使用され得るか、またはさもなければ関連する場合に満たされるとみなされる。本発明は、上記群のうちの正確に１つのメンバーが、所定の生成物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、またはさもなければ関連する実施形態を包含する。本発明はまた、上記群のメンバーのうちの１つより多く、またはすべてが、所定の生成物もしくはプロセスに存在するか、使用されるか、またはさもなければ関連する実施形態を包含する。さらに、本発明が、すべてのバリエーション、組み合わせ、および変更を包含し、これらバリエーション、組み合わせおよび変更において、請求項のうちの１つ以上または上記説明の関連部分からの１つ以上の限定、要素、文節、記述用語などは、別の請求項に導入されることが理解されるべきである。例えば、ある請求項に従属する任意の請求項は、同じ独立請求項（ｂａｓｅ ｃｌａｉｍ）に従属する任意の他の請求項において見いだされる１つ以上の限定を含むように改変され得る。さらに、上記請求項が組成物を記載している場合、本明細書に開示される目的のうちのいずれかのために上記組成物を使用するための方法が含まれ、そして本明細書に開示される作製方法または当該分野で公知の他の方法のうちのいずれかに従って上記組成物を作製するための方法は、別段記載されなければ、または矛盾（ｃｏｎｔｒａｄｉｃｔｉｏｎ ｏｒ ｉｎｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）が生じることが当業者に明らかでなければ、含められる、ということが理解されるべきである。さらに、本発明は、本明細書に開示される組成物を調製するための方法のうちのいずれかに従って作製される組成物を包含する。
【００８９】
要素がリストとして、例えば、マーカッシュグループ形式で提示される場合、上記要素の各サブグループもまた開示され、そして任意の要素が上記群から除かれ得ることが理解されるべきである。用語「含む、包含する」は、開放系であることが意図され、さらなる要素または工程の包含を許容することにも、注意する。一般に、本発明、または本発明の局面が、特定の要素、特徴、工程などを含むとして言及されている場合、本発明の特定の実施形態または本発明の局面が、そのような要素、特徴、工程などからなるか、またはそれらから本質的になることが理解されるべきである。簡略化を目的として、それらの実施形態は、本明細書において文字通り具体的に記載されているわけではない。従って、１つ以上の要素、特徴、工程などを含む本発明の各実施形態について、本発明はまた、それらの要素、特徴、工程などからなるかまたはそれらから本質的になる実施形態を提供する。
【００９０】
範囲が与えられている場合、終点は含められる。さらに、別段示されない限り、または文脈および／または当業者の理解から明らかである別のものが示されない限り、範囲として表される値は、本発明の異なる実施形態において、文脈が明らかに別のものを規定しない限り、示された範囲の下限の単位の１０分の１まで上記範囲内の任意の具体的値を想定し得ることが理解されるべきである。別段示されない限りまたは文脈および／または当業者の理解から明らかな別のものを示さない限り、範囲として表される値は、上記所定の範囲内の任意の部分範囲を想定し得、ここで上記部分範囲の終点は、上記範囲の下限の単位の１０分の１と同じ程度の正確性まで表されることもまた理解されるべきである。
【００９１】
さらに、本発明の任意の特定の実施形態は、請求項のうちのいずれか１つ以上から明示的に除かれ得ることが理解されるべきである。本発明の組成物および方法の任意の実施形態、要素、特徴、適用、または局面は、いずれか１つ以上の請求項から除かれ得る。簡潔さを目的として、１つ以上の要素、特徴、目的、または局面が除かれる実施形態はすべて、本明細書に明示的に示されていない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、
ロミデプシン；および
薬学的に受容可能な賦形剤
を含み、ここで該ロミデプシンのうちの少なくとも９８％は、モノマー性である、薬学的組成物。
【請求項２】
前記ロミデプシンのうちの少なくとも９９％は、モノマー性である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ロミデプシンのうちの少なくとも９９．５％は、モノマー性である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ロミデプシンのうちの少なくとも９９．９５％は、モノマー性である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記組成物は、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンを実質的に含まない、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記組成物は、１．０％以下の総不純物および０．２％以下の個々の不純物を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記組成物は、新生物を処置するために有効な量のロミデプシンを含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記新生物は癌である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記新生物は、血液性悪性疾患である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記新生物は、白血病またはリンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記新生物は、ホジキンリンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記新生物は、非ホジキンリンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記新生物は、多発性骨髄腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記新生物は、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記新生物は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記新生物は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記新生物は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記新生物は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記新生物は、骨髄異形成症候群である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記新生物は膵臓癌である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記新生物は前立腺癌である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、１〜５６ｍｇのロミデプシンを含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
経口投与のために処方されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
非経口投与のために処方されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
静脈内投与のために処方されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
別の細胞傷害性薬剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記細胞傷害性薬剤は、ゲムシタビンまたはデシタビンである、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記細胞傷害性薬剤は、フラボピリドールである、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
抗炎症剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
鎮痛剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
制吐剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
解熱剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
電解質補充物をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
カリウム補充物をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
マグネシウム補充物をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
不整脈治療剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
血小板ブースターをさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
エリスロポエチンをさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
抗高血糖剤（ａｎｔｉ−ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ａｇｅｎｔ）をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
ステロイド剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記ステロイド剤はデキサメタゾンである、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記組成物は、ロミデプシン以外には、別のＨＤＡＣインヒビターを含まない、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
ロミデプシンの薬学的組成物を調製するための方法であって、該方法は、少なくとも９８％の純度のロミデプシンと薬学的に受容可能な賦形剤とを組み合わせる工程を包含する、方法。
【請求項４４】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載の、少なくとも１種の薬学的組成物および該組成物を投与するための指示書を含む、キット。
【請求項１】
薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、
ロミデプシン；および
薬学的に受容可能な賦形剤
を含み、ここで該ロミデプシンのうちの少なくとも９８％は、モノマー性である、薬学的組成物。
【請求項２】
前記ロミデプシンのうちの少なくとも９９％は、モノマー性である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記ロミデプシンのうちの少なくとも９９．５％は、モノマー性である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ロミデプシンのうちの少なくとも９９．９５％は、モノマー性である、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記組成物は、ダイマー化、オリゴマー化またはポリマー化したロミデプシンを実質的に含まない、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記組成物は、１．０％以下の総不純物および０．２％以下の個々の不純物を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記組成物は、新生物を処置するために有効な量のロミデプシンを含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記新生物は癌である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記新生物は、血液性悪性疾患である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記新生物は、白血病またはリンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記新生物は、ホジキンリンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記新生物は、非ホジキンリンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記新生物は、多発性骨髄腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記新生物は、皮膚性Ｔ細胞リンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記新生物は、末梢性Ｔ細胞リンパ腫である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記新生物は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
前記新生物は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
前記新生物は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
前記新生物は、骨髄異形成症候群である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
前記新生物は膵臓癌である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
前記新生物は前立腺癌である、請求項７に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
前記組成物は、１〜５６ｍｇのロミデプシンを含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
経口投与のために処方されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
非経口投与のために処方されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
静脈内投与のために処方されている、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
別の細胞傷害性薬剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記細胞傷害性薬剤は、ゲムシタビンまたはデシタビンである、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記細胞傷害性薬剤は、フラボピリドールである、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
抗炎症剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
鎮痛剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
制吐剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
解熱剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
電解質補充物をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
カリウム補充物をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
マグネシウム補充物をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
不整脈治療剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
血小板ブースターをさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
エリスロポエチンをさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
抗高血糖剤（ａｎｔｉ−ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉｃ ａｇｅｎｔ）をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
ステロイド剤をさらに含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記ステロイド剤はデキサメタゾンである、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記組成物は、ロミデプシン以外には、別のＨＤＡＣインヒビターを含まない、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
ロミデプシンの薬学的組成物を調製するための方法であって、該方法は、少なくとも９８％の純度のロミデプシンと薬学的に受容可能な賦形剤とを組み合わせる工程を包含する、方法。
【請求項４４】
請求項１〜４２のいずれか１項に記載の、少なくとも１種の薬学的組成物および該組成物を投与するための指示書を含む、キット。
【図１】
【公表番号】特表２０１０−５１４８０２（Ｐ２０１０−５１４８０２Ａ）
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４４２９３（Ｐ２００９−５４４２９３）
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８９０７０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８３２９０
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０９１８１２７５）グラスター ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年５月６日（２０１０．５．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１２月２８日（２００７．１２．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０８９０７０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０８３２９０
【国際公開日】平成２０年７月１０日（２００８．７．１０）
【出願人】（５０９１８１２７５）グラスター ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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