ワムシ単性生殖卵の消毒方法
【課題】ワムシ単性生殖卵を消毒する簡単な方法であって、ふ化率と消毒率が高く、大量のワムシを必要とする魚介類種苗生産の現場に容易に適用できると共に、ワムシに由来する魚介類の細菌性疾病を低減できる消毒方法の提供。
【解決手段】ワムシ単性生殖卵をグルタルアルデヒド溶液に浸漬して消毒する方法であって、好ましくは、グルタルアルデヒド１０００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む天然海水又は人工海水（濃度６０％程度）に２０〜４０分間浸漬する方法。
【解決手段】ワムシ単性生殖卵をグルタルアルデヒド溶液に浸漬して消毒する方法であって、好ましくは、グルタルアルデヒド１０００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む天然海水又は人工海水（濃度６０％程度）に２０〜４０分間浸漬する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワムシ単性生殖卵の消毒方法に関する。詳しくは、ワムシの単性生殖卵について、高いふ化率と消毒率が得られる消毒方法に関する。さらに詳しくは、ワムシ由来の病原体による魚介類の細菌性疾病を予防するために有効なワムシ単性生殖卵の消毒方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国では、２００１年度に５１種類の海産魚介類の種苗生産が行なわれ、多くの種でシオミズツボワムシ(Brachionus plicatilis) などの輪虫類（本発明ではこれら輪虫類のことを「ワムシ」と記す。）の給餌が必須となっている。一方、ワムシが感染源として疑われる細菌性疾病の発生が報告されており、ワムシ由来で種苗生産対象種に疾病が発生することを防除する技術の開発が緊急の課題となっている。そのためには、餌料として供給するワムシの病原体による汚染レベルを低くすることが必要である。
【０００３】
ワムシの病原体による汚染レベルを低くするためには、ワムシ培養に使用する用水・水槽・器具・餌料及び最初に接種するワムシの元種などを消毒する必要がある。ワムシの培養水や水槽・用具などの培養環境の消毒技術はすでに確立されている。しかしながら、餌料や元種の消毒法については未検討であるため、これらの消毒技術を早急に確立する必要がある。
【０００４】
【特許文献１】特開平０７−７９６５９号公報
【特許文献２】特開平１１−９８９６５号公報
【非特許文献１】水産庁／社団法人日本栽培漁業協会発行昭和６３年度栽培漁業技術研修事業基礎理論コース餌料生物シリーズＮｏ．８『シオミズツボワムシ培養に関する最近の知見』（平山和次著）
【非特許文献２】水産庁／社団法人日本栽培漁業協会発行昭和６２年度栽培漁業技術研修事業基礎理論コース餌料生物シリーズＮｏ．１『クロレラの大量培養と水産への利用』（ヤクルト本社・深田哲夫著）
【非特許文献３】Aquaculture Research (1997) vol.28, 559-565, Balompapueng et al.
【非特許文献４】Aquaculture (1999) vol.176, 195-207, G.Rombaut et al.
【０００５】
特許文献１にはワムシ類の高密度大量培養法が開示されている。また、特許文献２には高密度培養ワムシの栄養強化法について開示されている。しかしながら、特許文献１にも特許文献２にも、ワムシの単性生殖卵を消毒する方法については何ら記載されていない。
【０００６】
以下の非特許文献にはワムシの卵を消毒する方法が散見される。すなわち、非特許文献１には、ワムシの初産卵を採取して洗浄し、抗生物質含有液を滅菌海水に対して２対１０の割合で加えたものに約３時間浸漬する操作を数回繰り返した後、さらに滅菌海水中に移して放置することを繰り返して無菌のワムシを得る方法が開示されている。また、非特許文献２には、ワムシの単性生殖卵を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０添加培地で３回洗浄した後、遠沈洗浄し、ペニシリン５００μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン６２５μｇ／ｍＬを含む培地に２５℃で２４時間浸漬した後、遠心分離して無菌ワムシを得る方法が開示されている。しかし、これらのワムシの卵の消毒方法はふ化率が明らかでない上、上記のとおり、複雑な操作を繰り返す必要があるため手間がかかるので、大量の元種を得る目的には適さない。また、この操作によって得られたワムシは、必ずしも無菌になるとは限らない。
【０００７】
なお、ワムシ耐久卵の消毒法に関しては、非特許文献３と非特許文献４に報告されている。すなわち、非特許文献３には、１ｍｇ／Ｌ（０．０００１％）の次亜塩素酸ナトリウムでワムシ耐久卵を６０分間処理することにより、無処理のものよりもふ化率が向上し、ＳＥＭにより卵表面に細菌が観察されなくなったことが報告されている。しかしながら、単性生殖卵に対する次亜塩素酸ナトリウムの毒性が確認されているため、この方法は何ら参考になるものではない。
【０００８】
また、非特許文献４には、０．０５μＬ／Ｌ（０．０５ｍｇ／Ｌ）のグルタルアルデヒドでワムシ耐久卵を６時間処理することにより、無処理のものとふ化率に差がなく、細菌が検出されなくなった旨が報じられている。すなわち、非特許文献５のTable 2 (200頁)
には、ワムシの耐久卵をメチルオレイト又はグルタルアルデヒドを用いて殺菌する場合、グルタルアルデヒド液を０．０５〜０．２５μＬ／Ｌという極めて薄い濃度にして耐久卵を約６時間浸漬すると、５０〜３２％程度のふ化率を示し、細菌は検出されなかった旨が開示されている。
【０００９】
しかしながら、非特許文献４に記載の方法をワムシ単性生殖卵に適用すると、単性生殖卵を消毒剤中に６時間も浸漬することになるので、この間にほとんどの卵がふ化してしまう。すなわち、ワムシ単性生殖卵の消毒では、発育段階を揃えることが非常に困難であるため、消毒中にもふ化する卵があり、長時間の消毒には問題がある。本発明者らの知見では、単性生殖卵の薬剤浸漬は４０分間程度が限界であると考えられる。しかも、単性生殖卵からふ化したワムシは、薬剤に極端に弱いため、この方法では多くのワムシが死亡してしまい、ふ化率が低下することになる。
【００１０】
すなわち、ワムシの卵は、単性生殖卵（正確には複相単性生殖卵）と耐久卵に大別されるが、単性生殖卵は雌が単性生殖により産出して急激な増殖をもたらすのに対して、耐久卵は雄の出現による両性生殖により産出されて休眠をもたらす。消毒剤に対する耐性は耐久卵の方がはるかに大きい。なお、両性生殖の起こり易さはワムシの株によって異なる。
【００１１】
このように、ワムシの単性生殖卵と耐久卵では消毒剤に対する感受性が大きく異なるため、種苗生産の現場において元種となるワムシを得るための卵の消毒に耐久卵の消毒法をそのまま用いることは非常に危険である。すなわち、ワムシ耐久卵は肥厚した第２次卵膜を備えているため、外部環境の変化に極めて強い耐久性を示し（そのため「耐久卵」と呼ばれている。）、例えば塩素による消毒も可能であるのに対し、ワムシ単性生殖卵は第１次卵膜しか有しないため、外部環境の変化に弱く、塩素消毒に耐え得ないことが知られている（水産学シリーズ４４「シオミズツボワムシ−生産学と大量培養」２２頁参照）。また、ワムシの耐久卵は長期の保存が可能であるのに対し、ワムシの単性生殖卵はほとんど保存ができない。例えば、耐久卵は、淡水で洗浄して３年間保存した乾燥卵でもふ化が認められる。さらに、耐久卵は、０〜５℃の暗い海水中で８年間保存してもふ化が認められるが、単性生殖卵はふ化時間が１５℃で１〜２日、２０℃で１〜１．５日、２５℃で０．５〜１．０日、３０℃で３〜１８時間というように直ちにふ化し、保存することができない（福所邦彦・平山和次共同編集「初期餌料生物−シオミズツボワムシ」参照）。このように、同じワムシの卵であっても、耐久卵と単性生殖卵では生態学的な相違が極めて大きく、消毒剤に対する感受性が異なるため、魚介類種苗生産の現場で、耐久卵の知見をそのまま単性生殖卵に適用できないことは、言わば技術常識とされている。
【００１２】
一方、現在我が国の魚介類種苗生産機関で培養されているワムシは、増殖性の良さを基準として選抜が行なわれているため、単性生殖卵を生じる株を用いている機関が多く、耐久卵を生じる株を用いている機関は非常に少ないものと推察される。
【００１３】
したがって、耐久卵の消毒技術とは無関係に、ワムシ単性生殖卵独自の消毒技術を確立する必要がある。特に、ワムシを大量に必要とする魚介類種苗生産の現場に適するワムシの卵の消毒方法を開発する必要がある。しかし、ワムシ単性生殖卵の消毒方法ないし殺菌方法はいまだ確立されていない。本発明者らは、ワムシ単性生殖卵の各種消毒剤に対する感受性と消毒効果について繰り返し試験・検討を行なった結果、ようやくにして本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記の状況に鑑み、本発明は、ワムシ単性生殖卵を消毒する簡単な方法であって大量のワムシを必要とする魚介類種苗生産の現場に容易に適用できる消毒方法を提供することを第１の課題とする。また、本発明は、ワムシ単性生殖卵について、ふ化率と消毒率の高い消毒方法を提供することを第２の課題とする。さらに、本発明は、その消毒方法によって消毒を済ませた卵からふ化したワムシを元種として増やして仔魚の餌料として給餌することによってワムシに由来する魚介類の細菌性疾病を低減できる消毒方法を提供することを第３の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記全ての課題を解決できる本発明のうち、特許請求の範囲・請求項１に記載する発明は、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド溶液に浸漬して消毒することを特徴とするワムシ単性生殖卵の消毒方法である。
【００１６】
同請求項２に記載する発明は、請求項１に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む天然海水又は人工海水に２０〜４０分間浸漬する方法である。
【００１７】
同請求項３に記載する発明は、請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に３０〜４０分間浸漬する方法である。
【００１８】
同請求項４に記載する発明は、請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１２５０ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜４０分間浸漬する方法である。
【００１９】
同請求項５に記載する発明は、請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１５００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜３０分間浸漬する方法である。
【００２０】
また、同請求項６に記載する発明は、マダイ、トラフグ、ヒラメ、アユ、クルマエビの仔魚に給餌するワムシを得るための、請求項１から５のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法である。
【００２１】
また、同請求項７に記載する発明は、魚介類種苗生産の現場において仔魚に給餌するワムシの大量培養に使用する元種を得るための、請求項１から５のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、上記のとおり、きわめて簡単な方法によってワムシ単性生殖卵を消毒する方法であるから、毎日１０億個体ないし１００億個体単位という大量のワムシを必要とする魚介類種苗生産の現場で容易に用いることができる。また、本発明の方法によって消毒したワムシ単性生殖卵は高いふ化率と消毒率を有する。よって、本発明の方法を用いて消毒を済ませたワムシ単性生殖卵からふ化したワムシを元種として用い、細菌学的に安全なワムシを大量に培養することができる。また、本発明の方法を用いて消毒を済ませたワムシ単性生殖卵をふ化させた後不足栄養素の強化処理を行なった上で直ちに仔魚に給餌することによって魚介類の細菌性疾病を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明者らは、ワムシ単性生殖卵の感受性を考慮し、当初は、魚介類の飼育などにおいて消毒剤として通常用いられている薬剤をいくつか選び、これら薬剤を通常用いられる濃度に希釈した消毒用水に単性生殖卵を浸漬して消毒やふ化の状況を観察する試験を行なったが、いずれの薬剤からも好ましい成果を得ることができなかった。次に、魚介類の種苗生産の現場で飼育器具類に対する消毒効果が知られている電解海水やオキシダント海水を用いて同様の試験を実施したが、いずれからも好ましい成果を得ることができなかった。
【００２４】
そこで、消毒剤をグルタルアルデヒドに切り替えて試験したところ、ほぼ好ましい成果が得られ、さらに、グルタルアルデヒドの濃度や適用条件を種々に変えて試験を繰り返した結果、ようやくにして好ましい濃度範囲や条件を確認することができ、本発明を完成するに至った。本発明で用いるグルタルアルデヒドは、アルデヒド系の消毒剤であり、一般細菌、結核菌、カビなど広範囲の微生物に対して殺菌効果を有し、耐性菌ができにくいことで知られている。
【００２５】
本発明は、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド溶液に浸漬して消毒することを特徴とする。具体的には、本発明では、ワムシの単性生殖卵を、グルタルアルデヒド１０００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む天然海水又は人工海水に２０〜４０分間浸漬して消毒する方法を採ることが好ましい。
【００２６】
本発明では、グルタルアルデヒドを溶解させる用水は、天然海水でも人工海水でも差し支えないが、なかでも、塩分濃度５０〜７０％の人工海水を用いることが好ましく、さらに好ましくは、塩分濃度６０％に調整した人工海水の使用であり、最も好ましいのは、６０％濃度のHerbstの人工海水を用いることである。すなわち、６０％濃度のHerbstの人工海水を用いて、グルタルアルデヒド１０００ｍｇ／Ｌを含む海水に３０〜４０分間浸漬するか、又は、同１２５０ｍｇ／Ｌを含む海水に２０〜４０分間浸漬するか、もしくは、同１５００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む海水に２０〜３０分間浸漬して、消毒する方法を採ると、ワムシ単性生殖卵に最適の消毒効果が得ることができる。
【００２７】
一般に、ワムシはＬ型ワムシ（シオミズツボワムシ：Brachionus plicatilis ）とＳ型ワムシ（和名未定：Brachionus rotundiformis）に大別されるが、本発明は、単性生殖卵であれば、どちらにも適用できる。
【００２８】
本発明の方法を用いて消毒したワムシ単性生殖卵からふ化したワムシは、海産魚介類であればどのような魚介類にも給餌できる。例えば、マダイ、トラフグ、ヒラメ、アユ、クルマエビなどの仔魚の餌料として好適に用いることができる。
【００２９】
本発明の方法によって消毒を済ませた卵からふ化したワムシは、これら魚介類の仔魚の餌料として不足栄養素の強化処理を行なった上で直接給餌するか、又はワムシ大量培養の元種として、植物プランクトンや酵母類を餌料として単性生殖によって数を増やしてから不足栄養素の強化処理を行なった上で仔魚の餌料として給餌することができる。
【００３０】
以下、試験例をもって本発明をさらに詳細に説明する。なお、以下の試験例を含め、本発明において示すワムシのふ化率と消毒率は、以下の数式を用いて算出したものである。《ふ化率の計算式》
ふ化率＝〔（生存個体数）÷（生存個体数＋死亡個体数＋単性生殖卵数）〕×１００
《消毒率の計算式》
消毒率＝〔１−（浸漬後の生菌数÷浸漬前の生菌数）〕×１００
【試験例１】
【００３１】
＜消毒用水の選定試験＞
（１）培養水と供試ワムシ
本試験例では、消毒剤を溶解する用水として、独立行政法人水産総合研究センター・能登島栽培漁業センターにおいて、地先から揚水して砂ろ過した天然海水と同センターの井戸から取水した井戸水を用いておよそ２０psu の塩分となるように希釈した培養水（以下「６０％海水」という。）を用い、ワムシは、「６０％海水」中で２０〜２５℃で培養中のシオミズツボワムシ（Ｌ型ワムシ）小浜株を用いた。
（２）単性生殖卵の分離
家庭用ミキサーで「６０％海水」と共にワムシを攪拌して虫体から卵を分離させ、この「６０％海水」をメスシリンダーに移し入れ、卵が沈下するのを待って虫体を含む上清を廃棄した。この沈殿に「６０％海水」を加えて別のメスシリンダーに移し入れ、再度卵の沈下を待って同様に上清を廃棄した。この操作を数回繰り返し、沈下した卵を回収した。（３）消毒用水
消毒剤を溶解する用水として、a)精製水、b)精製水と塩化ナトリウムで調整した０．９％ＮａＣｌ溶液、c)６０％濃度のHerbstの人工海水及びd)「６０％海水」を用いて、以下の試験を行なった。
【００３２】
（４）試験方法
試験は、２０℃の恒温器に１日以上放置した上記の消毒用水を用いて２０℃の室内で行なった。すなわち、それぞれの消毒用水１Ｌを角形水槽（２１０×２７０×４０ｍｍ）に入れ、約１ｇの単性生殖卵を３０分間浸漬した。浸漬中は攪拌機上に水槽を設置し、１００ｒｐｍで攪拌させた。浸漬終了後、ネットで卵を濾し取り、淡水クロレラ（クロレラ工業：生クロレラＶ１２）を１０００万細胞／ｍＬ含む３０ｍＬの「６０％海水」が入った５０ｍＬ試験管に卵を数百粒入れ、１００ｒｐｍの攪拌機上にセットして２昼夜振とうした後、実体顕微鏡下で、クロレラで胃が緑色を呈する虫体を生存個体、呈さない虫体を死亡個体として、さらに未ふ化の卵を計数した。
（５）試験結果
各消毒用水に卵を浸漬したときのふ化率は表１に示すとおりである。
【００３３】
（６）所見
表１から、精製水及び０．９％ＮａＣｌ溶液に卵を３０分間浸漬した場合のふ化率は、それぞれ約１１％及び約６６％であった。これに対して、６０％濃度のHerbst人工海水及び「６０％海水」に卵を浸漬した場合のふ化率は、それぞれ約９７％及び約９５％であった。よって、これら４種類の消毒用水を用いたときのふ化率には有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。さらに、多重比較検定を行なったところ、６０％濃度のHerbst人工海水と「６０％海水」の間では有意差は認められなかったものの、他の消毒用水間では有意差が認められた。したがって、精製水及び０．９％ＮａＣｌ溶液は、消毒剤の効果を検討する用水として適していないものと考えられた。一方、天然海水には有機物が含まれており、消毒剤の減衰をもたらす可能性があること、また、時期により含有成分が異なることが予想され、消毒効果に影響する可能性があると考え、有効な消毒剤を検討する用水として、６０％濃度のHerbstの人工海水、すなわち「６０％人工海水」を用いることとした。
【表１】
【試験例２】
【００３４】
＜消毒剤の選定試験１＞
（１）試験方法
試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵を、試験例１で選定した「６０％人工海水」（６０％濃度のHerbstの人工海水）に一般的に用いられている８種類の消毒剤（エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、次亜塩素酸ナトリウム、フェノール、クレゾール、塩化ベンザルコニウム、ホルマリン）をそれぞれの常用濃度で溶解させた消毒用水に浸漬して（浸漬時間は５〜４０分間）、浸漬後、それぞれの消毒率とふ化率を算出し、消毒剤としての適否を検討した。なお、次亜塩素酸ナトリウムとホルマリンについては、ワムシ卵のふ化が認められる濃度まで試験を行なった。
なお、対照区（消毒剤に浸漬しない卵）のふ化率は、１回目＝73.6％、２回目＝57.1％で、３回目＝62.7％であった。
（２）判定方法
試験結果は表２〜表９に示すとおりである。
各表中のふ化率は、対照区と同等程度と判断できるふ化結果が得られた消毒条件を○、対照区よりもやや劣る程度のふ化率が得られた条件を△、著しく悪いふ化率を示した条件を×と判定した。また、各表中の消毒率は、９９．９％以上の消毒率を示し、十分な消毒効果が得られた条件を○、消毒効果が少し認められた条件を△、消毒効果が認められなかった条件を×と判定した。さらに、総合判定は、ふ化率・消毒率共に○と評価された条件を○、一方でも△又は×と評価された条件を×と判定した。なお、この判定方法は、本発明の他の試験例についても採用した。
【００３５】
（３）試験結果
イ）エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコ−ルなどのアルコ−ル類 （表２〜表４）では、いずれも濃度３０％〜７０％における５〜１５分間の浸漬でふ化 率に悪い影響を及ぼし、×評価となった。
ロ）次亜塩素酸ナトリウム（表９）では、ふ化については濃度０．００１％で△評価が得 られたものの、この濃度での消毒率は×評価となった。一方、０．１％と０．２％に３ ０分間、０．５％に１５分間以上浸漬する場合には、消毒率で○評価となったが、ふ化 率は×評価となった。０．００１％未満の濃度にすると、ふ化率は○評価が得られる可 能性が考えられるが、この濃度での消毒率はすでに×評価であり、「卵消毒」の目的か らはこれ以上の濃度での試験は無意味であると考えられるので、試験を中止した。
ハ）フェノール１％・３％・５％、クレゾール１％・２％・３％、塩化ベンザルコニウム ０．１％の濃度に、それぞれ５・１０・１５分間浸漬したところ、いずれも消毒率は○ 評価であったが、ふ化率は×評価となった（表５〜表７）。
ニ）ホルマリン（表８）では、０．２％以下の濃度に２０分間以内の浸漬でふ化率に△評 価が得られたものの、消毒率では×評価となった。０．１％以下の濃度にすると○評価 のふ化率が得られる可能性はあるが、この濃度における消毒率はすでに×評価であり、 「卵消毒」の目的から、これ以上の濃度での試験は無意味であると判断され、試験を中 止した。ホルマリンはホルムアルデヒドを３５〜３８％程度含む水溶液であるから、ホ ルマリン０．１％はホルムアルデヒド３５０ｍｇ／Ｌに相当する。同じアルデヒド類で あるグルタルアルデヒドが、試験例５に示すように、２０分間以内の浸漬では２０００ ｍｇ／Ｌ以下の濃度で安全性が確認されている。グルタルアルデヒドの殺菌作用は分子 中のアルデヒド基が細菌表面や内部のタンパク質を凝固させると共に酵素を失活させる ことによるとされている。ホルムアルデヒドも同じアルデヒド基が殺菌作用をもたらす と考えられるが、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドではワムシ単性生殖卵に対す る安全性は大きく相違することが確認された。
【００３６】
（４）所見
以上の結果から、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、次亜塩素酸ナトリウム、フェノール、クレゾール、塩化ベンザルコニウム、ホルマリンは、ワムシ単性生殖卵の消毒剤として、いずれも不適であることが確認された。
【００３７】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【試験例３】
【００３８】
＜消毒剤の選定試験２＞
（１）試験方法
試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵をネットに入れ、以下の２種の１００％海水（水温１０〜２０℃）を３Ｌ／分の流量で流水にした２５Ｌ容のコンテナー中に５０〜６０分間振とうしながら浸漬した。浸漬終了後、ネットで卵を濾し取り、滅菌２％ペプトン水（１．５％ＮａＣｌ添加）を十分量加えて、塩素及びオキシダントの作用を止めた。
Ａ．種苗生産の現場で用いる飼育器具類に対する消毒効果が報告されている電解海水（有 効塩素濃度０．５〜４．８ｍｇ／Ｌ：東和電機製作所試作機・海水電解装置で作製）
Ｂ．オキシダント海水（オキシダント濃度０．５ｍｇ／Ｌ：荏原実業製・オゾン卵洗浄装 置（海水オゾン処理装置）で作製）
【００３９】
滅菌したビニール袋に約０．１ｇの卵を入れて秤量後、滅菌したHerbstの人工海水を９倍量加えてホモジナイズした。１０倍希釈液列を作製し、海水寒天培地平板表面に塗抹して２０℃で５日間好気的に培養し、出現コロニー数から生菌数を算出した。なお、殺菌力を有する海水に浸漬する前の生菌数についても同様に測定した。消毒率は前記の式により算出し、消毒効果を評価した。
【００４０】
（２）試験結果
電解処理又はオゾン処理した海水に浸漬したワムシ単性生殖卵の消毒率とふ化率は、表１０に示すとおりである。
【表１０】
【００４１】
（３）所見
表１０から、０．５ｍｇ／Ｌのオキシダントを含むオキシダント海水（オゾン処理した海水）ではワムシ単性生殖卵を６０分間浸漬しても消毒効果は認められなかった。これに対して、電解処理海水では、最大で１オーダー生菌数の減少が認められたが、十分な消毒効果があるとは考えられなかった。さらに、およそ３ｍｇ／Ｌ以上の塩素濃度となると、わずか５分間の浸漬でもふ化率が１０％未満に低下することが判明した。よって、電解処理した海水もワムシ単性生殖卵の有効な消毒剤とは考え難い結果となった。
【試験例４】
【００４２】
＜消毒剤の選定試験３＞
（１）試験方法
試験例１で使用した「６０％人工海水」に４種の消毒剤（イソジン液、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、過酸化水素、水産用グルタラール）を溶解し、試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵を浸漬・測定し、それぞれ消毒率とふ化率を試験例２と同じ方法で算出した。
【００４３】
（２）試験結果
試験結果を表１１に示す。
表１１から、イソジン液を用いて有効ヨウ素濃度５０ｍｇ／Ｌで１０分間以上処理した場合、９９％以上の消毒率が得られたが、ふ化率は２％程度で卵のふ化に悪影響を及ぼすことが確認された。有効ヨウ素濃度５０ｍｇ／Ｌで浸漬時間を５分以下とした場合、９９％以上の消毒率が得られる条件は得られなかった。
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘでは、消毒効果は認められなかった。
ｐＨ及び過酸化水素について検討したところ、ｐＨ２で２オーダー、過酸化水素１００００ｍｇ／Ｌで１オーダーの生菌数の減少が確認されたが、ふ化率が共に０．５％と低かった。ｐＨ４、ｐＨ１２では、消毒率がそれぞれ８１％及び８０％と低かった。
（３）所見
以上の結果から、イソジン液、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、ｐＨ及び過酸化水素は、今回の試験条件下では、有効な消毒剤とは考えられなかった。
【００４４】
一方、水産用グルタラール（グルタルアルデヒド溶液）では、グルタルアルデヒドとして１２５０ｍｇ／Ｌの濃度で１５分間浸漬した場合の消毒率は９９．９％以上、３０分間浸漬した場合にも９９．９９％以上となり、生菌数の減少が認められた。ふ化率は、１５分間浸漬した場合に５９〜７４％、３０分間浸漬した場合に６６〜９６％であった。このように、グルタルアルデヒドでは高い消毒率が得られ、ふ化率も高いことから、ワムシ単性生殖卵の消毒にはグルタルアルデヒド溶液の使用が有用であると認められる。
【００４５】
なお、試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵を消毒せずにふ化試験に供したところ、ふ化率は６０〜９０％であった。統計検定の結果、消毒剤に浸漬しない卵のふ化率、グルタルアルデヒド溶液に１５分間浸漬した卵のふ化率、グルタルアルデヒド溶液に３０分間浸漬した卵のふ化率の間に有意差は認められなかった（ｐ＜０．０５）。
【００４６】
【表１１】
【試験例５】
【００４７】
＜グルタルアルデヒドの適正濃度範囲の確認＞
試験例１で使用した「６０％人工海水」にグルタルアルデヒドを種々の濃度に溶解させて、試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵を浸漬して生菌数を測定し、それぞれ消毒率とふ化率を試験例２と同じ方法で算出した。
【表１２】
【００４８】
（２）試験結果
試験結果を表１２に示す。
表１２から、ふ化率についてみると、１５００ｍｇ／Ｌ以上のグルタルアルデヒドに４０分間浸漬した場合に△評価となった他は、○評価であった。
消毒率は、５００ｍｇ／Ｌ以下のグルタルアルデヒドに浸漬した場合には、いずれの時間も×評価であった。△評価は１０００ｍｇ／Ｌに２０分間浸漬した場合であった。１０００ｍｇ／Ｌに３０分間以上浸漬した場合と１２５０ｍｇ／Ｌ以上に浸漬した場合には、いずれも○評価であった。
（３）所見
ワムシ単性生殖卵は、耐久卵と異なり、ふ化時間が早くて保存ができないことから、浸漬時間は４０分程度が適当であると考えられる。
表１２から、グルタルアルデヒド溶液について、濃度１０００ｍｇ／Ｌで３０〜４０分間、濃度１２５０ｍｇ／Ｌでは２０〜４０分間、濃度１５００〜２０００ｍｇ／Ｌでは２０〜３０分間浸漬することにより、ワムシの単性生殖卵を好適に消毒できることが確認された。
【００４９】
以上の試験を総合すると、魚介類種苗生産現場で細菌学的に安全なワムシを得る目的でワムシ単性生殖卵を消毒するには、単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に３０〜４０分間浸漬するか、又は、グルタルアルデヒド１２５０ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜４０分間浸漬するか、もしくは、グルタルアルデヒド１５００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜３０分間浸漬する方法が、最も効果的であると考えられる。
【試験例６】
【００５０】
＜ヒラメを用いた給餌試験＞
（１）試験方法の概要
以下の２つの試験区のヒラメ仔魚について、それぞれ、単性生殖卵からふ化したワムシを給餌して飼育試験を行なった。
対照区＝消毒していない単性生殖卵からふ化したワムシを給餌する区
消毒区＝消毒を済ませた単性生殖卵からふ化したワムシを給餌する区
試験期間中、水槽の水温は１６．２〜１９．８℃であり、ｐＨは７．９〜８．６であった。飼育水にクロレラを合計で３４１．５〜３７８．５ｍＬ添加し、ヒラメ仔魚合計で１６８５万〜１９７２万個体のワムシを給餌した。
（２）供与ヒラメ
本試験例では、富山県農林水産公社氷見栽培漁業センターから平成１５年５月２６日に譲り受けた受精卵からふ化したヒラメ仔魚を用いた。ふ化は５月２８日から始まり、２９日に１水槽あたり容量法で計数したふ化仔魚１０００尾を収容した。試験は仔魚の開口が確認された５月３０日から開始した。
【００５１】
（３）ワムシ卵の消毒方法
試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵（Ｌ型ワムシ小浜株）を「６０％人工海水」に入れてミルクミキサーＭＸ−４０（花木製作所）で攪拌して卵と虫体を分離して卵のみを採集して用いた。
このワムシ卵を「６０％人工海水」で２００倍に希釈した水産用グルタラール（三鷹製薬）に浸漬し、振とう機を用いて１００ｒｐｍで３０分間振とうして消毒し、亜硫酸水素ナトリウム６５００ｐｐｍを含む６０％人工海水をかけて中和した。
（３）ヒラメの飼育
ヒラメを収容した１００Ｌ水槽は２ｋＬのＦＲＰ円形水槽をウオーターバスとして水温を管理した。環境維持の目的で飼育水槽は２回転／日の換水率となるようにろ過海水を注水した。１４日間飼育水の水温とｐＨを測定し、ふ化直後のワムシのみを給餌して飼育した。飼育終了時に全数計数によりヒラメの生残率を調査した。飼育水のクロレラ密度を朝晩２回計数して５０〜２００万細胞／ｍＬとなるようにスーパー生クロレラＶ１２を添加した。飼育水中のワムシ密度を朝晩２回計数して５〜１０個体／ｍＬとなるように給餌した。ヒラメ仔魚の全長を、試験開始７日目、試験開始１４日目にそれぞれ万能投影機で拡大し、ノギスを用いて測定した。
【００５２】
（４）試験結果
試験結果は表１３と表１４に示すとおりである。
表１４から、飼育１４日目の消毒区の生残率は６８．７〜７８．９％であり、対照区の方がやや高かったが、大きな差は認められなかった。
仔魚の成長の状況についても、消毒区と対照区では差がなかった。
（５）所見
上記のとおり、消毒済みのワムシ単性生殖卵からふ化したワムシを給餌しても、消毒していない卵からふ化したワムシを給餌した場合に比べて、成長・生残に大きな差が認められなかった。したがって、消毒済みのワムシ単性生殖卵からふ化したワムシは、これを給餌しても消毒による害はなく、仔魚の餌料として問題なく使用できることが確認された。
【００５３】
【表１３】
【表１４】
【産業上の利用分野】
【００５４】
以上詳細に説明するとおり、本発明は、きわめて簡単な方法によって、ワムシ単性生殖卵を消毒する方法であり、魚介類種苗生産の現場で実施するのに適した消毒方法である。本発明の方法によって消毒を済ませた単性生殖卵からふ化したワムシを元種として増やして必要栄養素を強化した上で海産魚介類の仔魚に給餌することによって、魚介類の細菌性疾病を適切に予防できる。このように、本発明は海産魚介類の種苗生産の現場で活用できる画期的な方法である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワムシ単性生殖卵の消毒方法に関する。詳しくは、ワムシの単性生殖卵について、高いふ化率と消毒率が得られる消毒方法に関する。さらに詳しくは、ワムシ由来の病原体による魚介類の細菌性疾病を予防するために有効なワムシ単性生殖卵の消毒方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
我が国では、２００１年度に５１種類の海産魚介類の種苗生産が行なわれ、多くの種でシオミズツボワムシ(Brachionus plicatilis) などの輪虫類（本発明ではこれら輪虫類のことを「ワムシ」と記す。）の給餌が必須となっている。一方、ワムシが感染源として疑われる細菌性疾病の発生が報告されており、ワムシ由来で種苗生産対象種に疾病が発生することを防除する技術の開発が緊急の課題となっている。そのためには、餌料として供給するワムシの病原体による汚染レベルを低くすることが必要である。
【０００３】
ワムシの病原体による汚染レベルを低くするためには、ワムシ培養に使用する用水・水槽・器具・餌料及び最初に接種するワムシの元種などを消毒する必要がある。ワムシの培養水や水槽・用具などの培養環境の消毒技術はすでに確立されている。しかしながら、餌料や元種の消毒法については未検討であるため、これらの消毒技術を早急に確立する必要がある。
【０００４】
【特許文献１】特開平０７−７９６５９号公報
【特許文献２】特開平１１−９８９６５号公報
【非特許文献１】水産庁／社団法人日本栽培漁業協会発行昭和６３年度栽培漁業技術研修事業基礎理論コース餌料生物シリーズＮｏ．８『シオミズツボワムシ培養に関する最近の知見』（平山和次著）
【非特許文献２】水産庁／社団法人日本栽培漁業協会発行昭和６２年度栽培漁業技術研修事業基礎理論コース餌料生物シリーズＮｏ．１『クロレラの大量培養と水産への利用』（ヤクルト本社・深田哲夫著）
【非特許文献３】Aquaculture Research (1997) vol.28, 559-565, Balompapueng et al.
【非特許文献４】Aquaculture (1999) vol.176, 195-207, G.Rombaut et al.
【０００５】
特許文献１にはワムシ類の高密度大量培養法が開示されている。また、特許文献２には高密度培養ワムシの栄養強化法について開示されている。しかしながら、特許文献１にも特許文献２にも、ワムシの単性生殖卵を消毒する方法については何ら記載されていない。
【０００６】
以下の非特許文献にはワムシの卵を消毒する方法が散見される。すなわち、非特許文献１には、ワムシの初産卵を採取して洗浄し、抗生物質含有液を滅菌海水に対して２対１０の割合で加えたものに約３時間浸漬する操作を数回繰り返した後、さらに滅菌海水中に移して放置することを繰り返して無菌のワムシを得る方法が開示されている。また、非特許文献２には、ワムシの単性生殖卵を０．１％Ｔｗｅｅｎ８０添加培地で３回洗浄した後、遠沈洗浄し、ペニシリン５００μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン６２５μｇ／ｍＬを含む培地に２５℃で２４時間浸漬した後、遠心分離して無菌ワムシを得る方法が開示されている。しかし、これらのワムシの卵の消毒方法はふ化率が明らかでない上、上記のとおり、複雑な操作を繰り返す必要があるため手間がかかるので、大量の元種を得る目的には適さない。また、この操作によって得られたワムシは、必ずしも無菌になるとは限らない。
【０００７】
なお、ワムシ耐久卵の消毒法に関しては、非特許文献３と非特許文献４に報告されている。すなわち、非特許文献３には、１ｍｇ／Ｌ（０．０００１％）の次亜塩素酸ナトリウムでワムシ耐久卵を６０分間処理することにより、無処理のものよりもふ化率が向上し、ＳＥＭにより卵表面に細菌が観察されなくなったことが報告されている。しかしながら、単性生殖卵に対する次亜塩素酸ナトリウムの毒性が確認されているため、この方法は何ら参考になるものではない。
【０００８】
また、非特許文献４には、０．０５μＬ／Ｌ（０．０５ｍｇ／Ｌ）のグルタルアルデヒドでワムシ耐久卵を６時間処理することにより、無処理のものとふ化率に差がなく、細菌が検出されなくなった旨が報じられている。すなわち、非特許文献５のTable 2 (200頁)
には、ワムシの耐久卵をメチルオレイト又はグルタルアルデヒドを用いて殺菌する場合、グルタルアルデヒド液を０．０５〜０．２５μＬ／Ｌという極めて薄い濃度にして耐久卵を約６時間浸漬すると、５０〜３２％程度のふ化率を示し、細菌は検出されなかった旨が開示されている。
【０００９】
しかしながら、非特許文献４に記載の方法をワムシ単性生殖卵に適用すると、単性生殖卵を消毒剤中に６時間も浸漬することになるので、この間にほとんどの卵がふ化してしまう。すなわち、ワムシ単性生殖卵の消毒では、発育段階を揃えることが非常に困難であるため、消毒中にもふ化する卵があり、長時間の消毒には問題がある。本発明者らの知見では、単性生殖卵の薬剤浸漬は４０分間程度が限界であると考えられる。しかも、単性生殖卵からふ化したワムシは、薬剤に極端に弱いため、この方法では多くのワムシが死亡してしまい、ふ化率が低下することになる。
【００１０】
すなわち、ワムシの卵は、単性生殖卵（正確には複相単性生殖卵）と耐久卵に大別されるが、単性生殖卵は雌が単性生殖により産出して急激な増殖をもたらすのに対して、耐久卵は雄の出現による両性生殖により産出されて休眠をもたらす。消毒剤に対する耐性は耐久卵の方がはるかに大きい。なお、両性生殖の起こり易さはワムシの株によって異なる。
【００１１】
このように、ワムシの単性生殖卵と耐久卵では消毒剤に対する感受性が大きく異なるため、種苗生産の現場において元種となるワムシを得るための卵の消毒に耐久卵の消毒法をそのまま用いることは非常に危険である。すなわち、ワムシ耐久卵は肥厚した第２次卵膜を備えているため、外部環境の変化に極めて強い耐久性を示し（そのため「耐久卵」と呼ばれている。）、例えば塩素による消毒も可能であるのに対し、ワムシ単性生殖卵は第１次卵膜しか有しないため、外部環境の変化に弱く、塩素消毒に耐え得ないことが知られている（水産学シリーズ４４「シオミズツボワムシ−生産学と大量培養」２２頁参照）。また、ワムシの耐久卵は長期の保存が可能であるのに対し、ワムシの単性生殖卵はほとんど保存ができない。例えば、耐久卵は、淡水で洗浄して３年間保存した乾燥卵でもふ化が認められる。さらに、耐久卵は、０〜５℃の暗い海水中で８年間保存してもふ化が認められるが、単性生殖卵はふ化時間が１５℃で１〜２日、２０℃で１〜１．５日、２５℃で０．５〜１．０日、３０℃で３〜１８時間というように直ちにふ化し、保存することができない（福所邦彦・平山和次共同編集「初期餌料生物−シオミズツボワムシ」参照）。このように、同じワムシの卵であっても、耐久卵と単性生殖卵では生態学的な相違が極めて大きく、消毒剤に対する感受性が異なるため、魚介類種苗生産の現場で、耐久卵の知見をそのまま単性生殖卵に適用できないことは、言わば技術常識とされている。
【００１２】
一方、現在我が国の魚介類種苗生産機関で培養されているワムシは、増殖性の良さを基準として選抜が行なわれているため、単性生殖卵を生じる株を用いている機関が多く、耐久卵を生じる株を用いている機関は非常に少ないものと推察される。
【００１３】
したがって、耐久卵の消毒技術とは無関係に、ワムシ単性生殖卵独自の消毒技術を確立する必要がある。特に、ワムシを大量に必要とする魚介類種苗生産の現場に適するワムシの卵の消毒方法を開発する必要がある。しかし、ワムシ単性生殖卵の消毒方法ないし殺菌方法はいまだ確立されていない。本発明者らは、ワムシ単性生殖卵の各種消毒剤に対する感受性と消毒効果について繰り返し試験・検討を行なった結果、ようやくにして本発明を完成するに至った。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
上記の状況に鑑み、本発明は、ワムシ単性生殖卵を消毒する簡単な方法であって大量のワムシを必要とする魚介類種苗生産の現場に容易に適用できる消毒方法を提供することを第１の課題とする。また、本発明は、ワムシ単性生殖卵について、ふ化率と消毒率の高い消毒方法を提供することを第２の課題とする。さらに、本発明は、その消毒方法によって消毒を済ませた卵からふ化したワムシを元種として増やして仔魚の餌料として給餌することによってワムシに由来する魚介類の細菌性疾病を低減できる消毒方法を提供することを第３の課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上記全ての課題を解決できる本発明のうち、特許請求の範囲・請求項１に記載する発明は、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド溶液に浸漬して消毒することを特徴とするワムシ単性生殖卵の消毒方法である。
【００１６】
同請求項２に記載する発明は、請求項１に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む天然海水又は人工海水に２０〜４０分間浸漬する方法である。
【００１７】
同請求項３に記載する発明は、請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に３０〜４０分間浸漬する方法である。
【００１８】
同請求項４に記載する発明は、請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１２５０ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜４０分間浸漬する方法である。
【００１９】
同請求項５に記載する発明は、請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１５００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜３０分間浸漬する方法である。
【００２０】
また、同請求項６に記載する発明は、マダイ、トラフグ、ヒラメ、アユ、クルマエビの仔魚に給餌するワムシを得るための、請求項１から５のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法である。
【００２１】
また、同請求項７に記載する発明は、魚介類種苗生産の現場において仔魚に給餌するワムシの大量培養に使用する元種を得るための、請求項１から５のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法である。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、上記のとおり、きわめて簡単な方法によってワムシ単性生殖卵を消毒する方法であるから、毎日１０億個体ないし１００億個体単位という大量のワムシを必要とする魚介類種苗生産の現場で容易に用いることができる。また、本発明の方法によって消毒したワムシ単性生殖卵は高いふ化率と消毒率を有する。よって、本発明の方法を用いて消毒を済ませたワムシ単性生殖卵からふ化したワムシを元種として用い、細菌学的に安全なワムシを大量に培養することができる。また、本発明の方法を用いて消毒を済ませたワムシ単性生殖卵をふ化させた後不足栄養素の強化処理を行なった上で直ちに仔魚に給餌することによって魚介類の細菌性疾病を予防することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明者らは、ワムシ単性生殖卵の感受性を考慮し、当初は、魚介類の飼育などにおいて消毒剤として通常用いられている薬剤をいくつか選び、これら薬剤を通常用いられる濃度に希釈した消毒用水に単性生殖卵を浸漬して消毒やふ化の状況を観察する試験を行なったが、いずれの薬剤からも好ましい成果を得ることができなかった。次に、魚介類の種苗生産の現場で飼育器具類に対する消毒効果が知られている電解海水やオキシダント海水を用いて同様の試験を実施したが、いずれからも好ましい成果を得ることができなかった。
【００２４】
そこで、消毒剤をグルタルアルデヒドに切り替えて試験したところ、ほぼ好ましい成果が得られ、さらに、グルタルアルデヒドの濃度や適用条件を種々に変えて試験を繰り返した結果、ようやくにして好ましい濃度範囲や条件を確認することができ、本発明を完成するに至った。本発明で用いるグルタルアルデヒドは、アルデヒド系の消毒剤であり、一般細菌、結核菌、カビなど広範囲の微生物に対して殺菌効果を有し、耐性菌ができにくいことで知られている。
【００２５】
本発明は、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド溶液に浸漬して消毒することを特徴とする。具体的には、本発明では、ワムシの単性生殖卵を、グルタルアルデヒド１０００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む天然海水又は人工海水に２０〜４０分間浸漬して消毒する方法を採ることが好ましい。
【００２６】
本発明では、グルタルアルデヒドを溶解させる用水は、天然海水でも人工海水でも差し支えないが、なかでも、塩分濃度５０〜７０％の人工海水を用いることが好ましく、さらに好ましくは、塩分濃度６０％に調整した人工海水の使用であり、最も好ましいのは、６０％濃度のHerbstの人工海水を用いることである。すなわち、６０％濃度のHerbstの人工海水を用いて、グルタルアルデヒド１０００ｍｇ／Ｌを含む海水に３０〜４０分間浸漬するか、又は、同１２５０ｍｇ／Ｌを含む海水に２０〜４０分間浸漬するか、もしくは、同１５００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む海水に２０〜３０分間浸漬して、消毒する方法を採ると、ワムシ単性生殖卵に最適の消毒効果が得ることができる。
【００２７】
一般に、ワムシはＬ型ワムシ（シオミズツボワムシ：Brachionus plicatilis ）とＳ型ワムシ（和名未定：Brachionus rotundiformis）に大別されるが、本発明は、単性生殖卵であれば、どちらにも適用できる。
【００２８】
本発明の方法を用いて消毒したワムシ単性生殖卵からふ化したワムシは、海産魚介類であればどのような魚介類にも給餌できる。例えば、マダイ、トラフグ、ヒラメ、アユ、クルマエビなどの仔魚の餌料として好適に用いることができる。
【００２９】
本発明の方法によって消毒を済ませた卵からふ化したワムシは、これら魚介類の仔魚の餌料として不足栄養素の強化処理を行なった上で直接給餌するか、又はワムシ大量培養の元種として、植物プランクトンや酵母類を餌料として単性生殖によって数を増やしてから不足栄養素の強化処理を行なった上で仔魚の餌料として給餌することができる。
【００３０】
以下、試験例をもって本発明をさらに詳細に説明する。なお、以下の試験例を含め、本発明において示すワムシのふ化率と消毒率は、以下の数式を用いて算出したものである。《ふ化率の計算式》
ふ化率＝〔（生存個体数）÷（生存個体数＋死亡個体数＋単性生殖卵数）〕×１００
《消毒率の計算式》
消毒率＝〔１−（浸漬後の生菌数÷浸漬前の生菌数）〕×１００
【試験例１】
【００３１】
＜消毒用水の選定試験＞
（１）培養水と供試ワムシ
本試験例では、消毒剤を溶解する用水として、独立行政法人水産総合研究センター・能登島栽培漁業センターにおいて、地先から揚水して砂ろ過した天然海水と同センターの井戸から取水した井戸水を用いておよそ２０psu の塩分となるように希釈した培養水（以下「６０％海水」という。）を用い、ワムシは、「６０％海水」中で２０〜２５℃で培養中のシオミズツボワムシ（Ｌ型ワムシ）小浜株を用いた。
（２）単性生殖卵の分離
家庭用ミキサーで「６０％海水」と共にワムシを攪拌して虫体から卵を分離させ、この「６０％海水」をメスシリンダーに移し入れ、卵が沈下するのを待って虫体を含む上清を廃棄した。この沈殿に「６０％海水」を加えて別のメスシリンダーに移し入れ、再度卵の沈下を待って同様に上清を廃棄した。この操作を数回繰り返し、沈下した卵を回収した。（３）消毒用水
消毒剤を溶解する用水として、a)精製水、b)精製水と塩化ナトリウムで調整した０．９％ＮａＣｌ溶液、c)６０％濃度のHerbstの人工海水及びd)「６０％海水」を用いて、以下の試験を行なった。
【００３２】
（４）試験方法
試験は、２０℃の恒温器に１日以上放置した上記の消毒用水を用いて２０℃の室内で行なった。すなわち、それぞれの消毒用水１Ｌを角形水槽（２１０×２７０×４０ｍｍ）に入れ、約１ｇの単性生殖卵を３０分間浸漬した。浸漬中は攪拌機上に水槽を設置し、１００ｒｐｍで攪拌させた。浸漬終了後、ネットで卵を濾し取り、淡水クロレラ（クロレラ工業：生クロレラＶ１２）を１０００万細胞／ｍＬ含む３０ｍＬの「６０％海水」が入った５０ｍＬ試験管に卵を数百粒入れ、１００ｒｐｍの攪拌機上にセットして２昼夜振とうした後、実体顕微鏡下で、クロレラで胃が緑色を呈する虫体を生存個体、呈さない虫体を死亡個体として、さらに未ふ化の卵を計数した。
（５）試験結果
各消毒用水に卵を浸漬したときのふ化率は表１に示すとおりである。
【００３３】
（６）所見
表１から、精製水及び０．９％ＮａＣｌ溶液に卵を３０分間浸漬した場合のふ化率は、それぞれ約１１％及び約６６％であった。これに対して、６０％濃度のHerbst人工海水及び「６０％海水」に卵を浸漬した場合のふ化率は、それぞれ約９７％及び約９５％であった。よって、これら４種類の消毒用水を用いたときのふ化率には有意差が認められた（ｐ＜０．０５）。さらに、多重比較検定を行なったところ、６０％濃度のHerbst人工海水と「６０％海水」の間では有意差は認められなかったものの、他の消毒用水間では有意差が認められた。したがって、精製水及び０．９％ＮａＣｌ溶液は、消毒剤の効果を検討する用水として適していないものと考えられた。一方、天然海水には有機物が含まれており、消毒剤の減衰をもたらす可能性があること、また、時期により含有成分が異なることが予想され、消毒効果に影響する可能性があると考え、有効な消毒剤を検討する用水として、６０％濃度のHerbstの人工海水、すなわち「６０％人工海水」を用いることとした。
【表１】
【試験例２】
【００３４】
＜消毒剤の選定試験１＞
（１）試験方法
試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵を、試験例１で選定した「６０％人工海水」（６０％濃度のHerbstの人工海水）に一般的に用いられている８種類の消毒剤（エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、次亜塩素酸ナトリウム、フェノール、クレゾール、塩化ベンザルコニウム、ホルマリン）をそれぞれの常用濃度で溶解させた消毒用水に浸漬して（浸漬時間は５〜４０分間）、浸漬後、それぞれの消毒率とふ化率を算出し、消毒剤としての適否を検討した。なお、次亜塩素酸ナトリウムとホルマリンについては、ワムシ卵のふ化が認められる濃度まで試験を行なった。
なお、対照区（消毒剤に浸漬しない卵）のふ化率は、１回目＝73.6％、２回目＝57.1％で、３回目＝62.7％であった。
（２）判定方法
試験結果は表２〜表９に示すとおりである。
各表中のふ化率は、対照区と同等程度と判断できるふ化結果が得られた消毒条件を○、対照区よりもやや劣る程度のふ化率が得られた条件を△、著しく悪いふ化率を示した条件を×と判定した。また、各表中の消毒率は、９９．９％以上の消毒率を示し、十分な消毒効果が得られた条件を○、消毒効果が少し認められた条件を△、消毒効果が認められなかった条件を×と判定した。さらに、総合判定は、ふ化率・消毒率共に○と評価された条件を○、一方でも△又は×と評価された条件を×と判定した。なお、この判定方法は、本発明の他の試験例についても採用した。
【００３５】
（３）試験結果
イ）エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコ−ルなどのアルコ−ル類 （表２〜表４）では、いずれも濃度３０％〜７０％における５〜１５分間の浸漬でふ化 率に悪い影響を及ぼし、×評価となった。
ロ）次亜塩素酸ナトリウム（表９）では、ふ化については濃度０．００１％で△評価が得 られたものの、この濃度での消毒率は×評価となった。一方、０．１％と０．２％に３ ０分間、０．５％に１５分間以上浸漬する場合には、消毒率で○評価となったが、ふ化 率は×評価となった。０．００１％未満の濃度にすると、ふ化率は○評価が得られる可 能性が考えられるが、この濃度での消毒率はすでに×評価であり、「卵消毒」の目的か らはこれ以上の濃度での試験は無意味であると考えられるので、試験を中止した。
ハ）フェノール１％・３％・５％、クレゾール１％・２％・３％、塩化ベンザルコニウム ０．１％の濃度に、それぞれ５・１０・１５分間浸漬したところ、いずれも消毒率は○ 評価であったが、ふ化率は×評価となった（表５〜表７）。
ニ）ホルマリン（表８）では、０．２％以下の濃度に２０分間以内の浸漬でふ化率に△評 価が得られたものの、消毒率では×評価となった。０．１％以下の濃度にすると○評価 のふ化率が得られる可能性はあるが、この濃度における消毒率はすでに×評価であり、 「卵消毒」の目的から、これ以上の濃度での試験は無意味であると判断され、試験を中 止した。ホルマリンはホルムアルデヒドを３５〜３８％程度含む水溶液であるから、ホ ルマリン０．１％はホルムアルデヒド３５０ｍｇ／Ｌに相当する。同じアルデヒド類で あるグルタルアルデヒドが、試験例５に示すように、２０分間以内の浸漬では２０００ ｍｇ／Ｌ以下の濃度で安全性が確認されている。グルタルアルデヒドの殺菌作用は分子 中のアルデヒド基が細菌表面や内部のタンパク質を凝固させると共に酵素を失活させる ことによるとされている。ホルムアルデヒドも同じアルデヒド基が殺菌作用をもたらす と考えられるが、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドではワムシ単性生殖卵に対す る安全性は大きく相違することが確認された。
【００３６】
（４）所見
以上の結果から、エタノール、イソプロピルアルコール、ｎ−プロピルアルコール、次亜塩素酸ナトリウム、フェノール、クレゾール、塩化ベンザルコニウム、ホルマリンは、ワムシ単性生殖卵の消毒剤として、いずれも不適であることが確認された。
【００３７】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【試験例３】
【００３８】
＜消毒剤の選定試験２＞
（１）試験方法
試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵をネットに入れ、以下の２種の１００％海水（水温１０〜２０℃）を３Ｌ／分の流量で流水にした２５Ｌ容のコンテナー中に５０〜６０分間振とうしながら浸漬した。浸漬終了後、ネットで卵を濾し取り、滅菌２％ペプトン水（１．５％ＮａＣｌ添加）を十分量加えて、塩素及びオキシダントの作用を止めた。
Ａ．種苗生産の現場で用いる飼育器具類に対する消毒効果が報告されている電解海水（有 効塩素濃度０．５〜４．８ｍｇ／Ｌ：東和電機製作所試作機・海水電解装置で作製）
Ｂ．オキシダント海水（オキシダント濃度０．５ｍｇ／Ｌ：荏原実業製・オゾン卵洗浄装 置（海水オゾン処理装置）で作製）
【００３９】
滅菌したビニール袋に約０．１ｇの卵を入れて秤量後、滅菌したHerbstの人工海水を９倍量加えてホモジナイズした。１０倍希釈液列を作製し、海水寒天培地平板表面に塗抹して２０℃で５日間好気的に培養し、出現コロニー数から生菌数を算出した。なお、殺菌力を有する海水に浸漬する前の生菌数についても同様に測定した。消毒率は前記の式により算出し、消毒効果を評価した。
【００４０】
（２）試験結果
電解処理又はオゾン処理した海水に浸漬したワムシ単性生殖卵の消毒率とふ化率は、表１０に示すとおりである。
【表１０】
【００４１】
（３）所見
表１０から、０．５ｍｇ／Ｌのオキシダントを含むオキシダント海水（オゾン処理した海水）ではワムシ単性生殖卵を６０分間浸漬しても消毒効果は認められなかった。これに対して、電解処理海水では、最大で１オーダー生菌数の減少が認められたが、十分な消毒効果があるとは考えられなかった。さらに、およそ３ｍｇ／Ｌ以上の塩素濃度となると、わずか５分間の浸漬でもふ化率が１０％未満に低下することが判明した。よって、電解処理した海水もワムシ単性生殖卵の有効な消毒剤とは考え難い結果となった。
【試験例４】
【００４２】
＜消毒剤の選定試験３＞
（１）試験方法
試験例１で使用した「６０％人工海水」に４種の消毒剤（イソジン液、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、過酸化水素、水産用グルタラール）を溶解し、試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵を浸漬・測定し、それぞれ消毒率とふ化率を試験例２と同じ方法で算出した。
【００４３】
（２）試験結果
試験結果を表１１に示す。
表１１から、イソジン液を用いて有効ヨウ素濃度５０ｍｇ／Ｌで１０分間以上処理した場合、９９％以上の消毒率が得られたが、ふ化率は２％程度で卵のふ化に悪影響を及ぼすことが確認された。有効ヨウ素濃度５０ｍｇ／Ｌで浸漬時間を５分以下とした場合、９９％以上の消毒率が得られる条件は得られなかった。
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘでは、消毒効果は認められなかった。
ｐＨ及び過酸化水素について検討したところ、ｐＨ２で２オーダー、過酸化水素１００００ｍｇ／Ｌで１オーダーの生菌数の減少が確認されたが、ふ化率が共に０．５％と低かった。ｐＨ４、ｐＨ１２では、消毒率がそれぞれ８１％及び８０％と低かった。
（３）所見
以上の結果から、イソジン液、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、ｐＨ及び過酸化水素は、今回の試験条件下では、有効な消毒剤とは考えられなかった。
【００４４】
一方、水産用グルタラール（グルタルアルデヒド溶液）では、グルタルアルデヒドとして１２５０ｍｇ／Ｌの濃度で１５分間浸漬した場合の消毒率は９９．９％以上、３０分間浸漬した場合にも９９．９９％以上となり、生菌数の減少が認められた。ふ化率は、１５分間浸漬した場合に５９〜７４％、３０分間浸漬した場合に６６〜９６％であった。このように、グルタルアルデヒドでは高い消毒率が得られ、ふ化率も高いことから、ワムシ単性生殖卵の消毒にはグルタルアルデヒド溶液の使用が有用であると認められる。
【００４５】
なお、試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵を消毒せずにふ化試験に供したところ、ふ化率は６０〜９０％であった。統計検定の結果、消毒剤に浸漬しない卵のふ化率、グルタルアルデヒド溶液に１５分間浸漬した卵のふ化率、グルタルアルデヒド溶液に３０分間浸漬した卵のふ化率の間に有意差は認められなかった（ｐ＜０．０５）。
【００４６】
【表１１】
【試験例５】
【００４７】
＜グルタルアルデヒドの適正濃度範囲の確認＞
試験例１で使用した「６０％人工海水」にグルタルアルデヒドを種々の濃度に溶解させて、試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵を浸漬して生菌数を測定し、それぞれ消毒率とふ化率を試験例２と同じ方法で算出した。
【表１２】
【００４８】
（２）試験結果
試験結果を表１２に示す。
表１２から、ふ化率についてみると、１５００ｍｇ／Ｌ以上のグルタルアルデヒドに４０分間浸漬した場合に△評価となった他は、○評価であった。
消毒率は、５００ｍｇ／Ｌ以下のグルタルアルデヒドに浸漬した場合には、いずれの時間も×評価であった。△評価は１０００ｍｇ／Ｌに２０分間浸漬した場合であった。１０００ｍｇ／Ｌに３０分間以上浸漬した場合と１２５０ｍｇ／Ｌ以上に浸漬した場合には、いずれも○評価であった。
（３）所見
ワムシ単性生殖卵は、耐久卵と異なり、ふ化時間が早くて保存ができないことから、浸漬時間は４０分程度が適当であると考えられる。
表１２から、グルタルアルデヒド溶液について、濃度１０００ｍｇ／Ｌで３０〜４０分間、濃度１２５０ｍｇ／Ｌでは２０〜４０分間、濃度１５００〜２０００ｍｇ／Ｌでは２０〜３０分間浸漬することにより、ワムシの単性生殖卵を好適に消毒できることが確認された。
【００４９】
以上の試験を総合すると、魚介類種苗生産現場で細菌学的に安全なワムシを得る目的でワムシ単性生殖卵を消毒するには、単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に３０〜４０分間浸漬するか、又は、グルタルアルデヒド１２５０ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜４０分間浸漬するか、もしくは、グルタルアルデヒド１５００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜３０分間浸漬する方法が、最も効果的であると考えられる。
【試験例６】
【００５０】
＜ヒラメを用いた給餌試験＞
（１）試験方法の概要
以下の２つの試験区のヒラメ仔魚について、それぞれ、単性生殖卵からふ化したワムシを給餌して飼育試験を行なった。
対照区＝消毒していない単性生殖卵からふ化したワムシを給餌する区
消毒区＝消毒を済ませた単性生殖卵からふ化したワムシを給餌する区
試験期間中、水槽の水温は１６．２〜１９．８℃であり、ｐＨは７．９〜８．６であった。飼育水にクロレラを合計で３４１．５〜３７８．５ｍＬ添加し、ヒラメ仔魚合計で１６８５万〜１９７２万個体のワムシを給餌した。
（２）供与ヒラメ
本試験例では、富山県農林水産公社氷見栽培漁業センターから平成１５年５月２６日に譲り受けた受精卵からふ化したヒラメ仔魚を用いた。ふ化は５月２８日から始まり、２９日に１水槽あたり容量法で計数したふ化仔魚１０００尾を収容した。試験は仔魚の開口が確認された５月３０日から開始した。
【００５１】
（３）ワムシ卵の消毒方法
試験例１と同じ方法で分離・採取したワムシ単性生殖卵（Ｌ型ワムシ小浜株）を「６０％人工海水」に入れてミルクミキサーＭＸ−４０（花木製作所）で攪拌して卵と虫体を分離して卵のみを採集して用いた。
このワムシ卵を「６０％人工海水」で２００倍に希釈した水産用グルタラール（三鷹製薬）に浸漬し、振とう機を用いて１００ｒｐｍで３０分間振とうして消毒し、亜硫酸水素ナトリウム６５００ｐｐｍを含む６０％人工海水をかけて中和した。
（３）ヒラメの飼育
ヒラメを収容した１００Ｌ水槽は２ｋＬのＦＲＰ円形水槽をウオーターバスとして水温を管理した。環境維持の目的で飼育水槽は２回転／日の換水率となるようにろ過海水を注水した。１４日間飼育水の水温とｐＨを測定し、ふ化直後のワムシのみを給餌して飼育した。飼育終了時に全数計数によりヒラメの生残率を調査した。飼育水のクロレラ密度を朝晩２回計数して５０〜２００万細胞／ｍＬとなるようにスーパー生クロレラＶ１２を添加した。飼育水中のワムシ密度を朝晩２回計数して５〜１０個体／ｍＬとなるように給餌した。ヒラメ仔魚の全長を、試験開始７日目、試験開始１４日目にそれぞれ万能投影機で拡大し、ノギスを用いて測定した。
【００５２】
（４）試験結果
試験結果は表１３と表１４に示すとおりである。
表１４から、飼育１４日目の消毒区の生残率は６８．７〜７８．９％であり、対照区の方がやや高かったが、大きな差は認められなかった。
仔魚の成長の状況についても、消毒区と対照区では差がなかった。
（５）所見
上記のとおり、消毒済みのワムシ単性生殖卵からふ化したワムシを給餌しても、消毒していない卵からふ化したワムシを給餌した場合に比べて、成長・生残に大きな差が認められなかった。したがって、消毒済みのワムシ単性生殖卵からふ化したワムシは、これを給餌しても消毒による害はなく、仔魚の餌料として問題なく使用できることが確認された。
【００５３】
【表１３】
【表１４】
【産業上の利用分野】
【００５４】
以上詳細に説明するとおり、本発明は、きわめて簡単な方法によって、ワムシ単性生殖卵を消毒する方法であり、魚介類種苗生産の現場で実施するのに適した消毒方法である。本発明の方法によって消毒を済ませた単性生殖卵からふ化したワムシを元種として増やして必要栄養素を強化した上で海産魚介類の仔魚に給餌することによって、魚介類の細菌性疾病を適切に予防できる。このように、本発明は海産魚介類の種苗生産の現場で活用できる画期的な方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド溶液に浸漬して消毒することを特徴とするワムシ単性生殖卵の消毒方法。
【請求項２】
請求項１に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む天然海水又は人工海水に２０〜４０分間浸漬する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に３０〜４０分間浸漬する方法。
【請求項４】
請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１２５０ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜４０分間浸漬する方法。
【請求項５】
請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１５００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜３０分間浸漬する方法。
【請求項６】
マダイ、トラフグ、ヒラメ、アユ、クルマエビの仔魚に給餌するワムシを得るための、請求項１から５のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法。
【請求項７】
魚介類種苗生産の現場において仔魚に給餌するワムシの大量培養に使用する元種を得るための、請求項１から５のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法。
【請求項１】
ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド溶液に浸漬して消毒することを特徴とするワムシ単性生殖卵の消毒方法。
【請求項２】
請求項１に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む天然海水又は人工海水に２０〜４０分間浸漬する方法。
【請求項３】
請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に３０〜４０分間浸漬する方法。
【請求項４】
請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１２５０ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜４０分間浸漬する方法。
【請求項５】
請求項２に記載の消毒方法において、ワムシの単性生殖卵をグルタルアルデヒド１５００〜２０００ｍｇ／Ｌを含む６０％濃度の人工海水に２０〜３０分間浸漬する方法。
【請求項６】
マダイ、トラフグ、ヒラメ、アユ、クルマエビの仔魚に給餌するワムシを得るための、請求項１から５のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法。
【請求項７】
魚介類種苗生産の現場において仔魚に給餌するワムシの大量培養に使用する元種を得るための、請求項１から５のいずれかに記載のワムシ単性生殖卵の消毒方法。
【公開番号】特開２００６−２３０３２８（Ｐ２００６−２３０３２８Ａ）
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５２３４７（Ｐ２００５−５２３４７）
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年９月７日（２００６．９．７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年２月２８日（２００５．２．２８）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【出願人】（５０１１６８８１４）独立行政法人水産総合研究センター (103)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]