一遺伝子ナノ粒子のパッケージング法
【課題】遺伝子治療や再生医療の革新的治療法を支える遺伝子導入技術として、一遺伝子を均一かつ微小なナノ粒子としそれを脂質膜でコーティングする技術を提供する。
【解決手段】本発明の脂質構造体は、モノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ：ＭＣＤ）で凝縮化された一遺伝子ナノ粒子を有していることを特徴とする。本脂質構造体は、粒子径が非常に小さく非分裂細胞の核膜孔を透過する戦略によって効率的な遺伝子発現が望める。また、粒子の微小化は、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用にも非常に有利な特徴である。本脂質構造体は、均一な粒子径を有するため高品質な製剤化を可能とする。さらに、ＭＣＤから形成されたナノ粒子は、遺伝子放出効率が高いため核内の効率的な遺伝子放出を可能とし、飛躍的な遺伝子発現の上昇を達成する。
【解決手段】本発明の脂質構造体は、モノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ：ＭＣＤ）で凝縮化された一遺伝子ナノ粒子を有していることを特徴とする。本脂質構造体は、粒子径が非常に小さく非分裂細胞の核膜孔を透過する戦略によって効率的な遺伝子発現が望める。また、粒子の微小化は、ｉｎ ｖｉｖｏでの使用にも非常に有利な特徴である。本脂質構造体は、均一な粒子径を有するため高品質な製剤化を可能とする。さらに、ＭＣＤから形成されたナノ粒子は、遺伝子放出効率が高いため核内の効率的な遺伝子放出を可能とし、飛躍的な遺伝子発現の上昇を達成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療、高品質な製剤化を可能する遺伝子発現ベクターを創製するため、一遺伝子を微小かつ均一なナノ粒子としそれを脂質膜でコーティングする技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療を実現するために、目的の遺伝子を標的部位に確実に送達するためのベクターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等のウイルスベクターが開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少ないリポソームベクターやペプチドキャリアーが注目を集めている。リポソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有している。
【０００３】
最近、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの表面をステアリル化オクタアルギニンで修飾することにより、凝縮化ＤＮＡの細胞導入効率が１０００倍、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの細胞への導入効率が１００倍向上したことが報告されている（非特許文献１）。この構造体、多機能性エンベロープ型ナノ構造体（ｏｃｔａａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｔｙｐｅ ｎａｎｏ ｄｅｖｉｃｅ：Ｒ８−ＭＥＮＤ）は、アデノウイルスと同等の遺伝子発現活性を示す事が報告されている（非特許文献２）。しかしながら、Ｒ８−ＭＥＮＤは、粒子径が約３００ ｎｍと大きく、かつ、不均一な構造をとっており、この状態では、実用化は難しい。ｉｎ
ｖｉｖｏ適用に耐えうる２００ ｎｍ以下の平均粒子径を持ち、かつ、均一な粒子径分布を有するＲ８−ＭＥＮＤの開発は、高品質・高性能な製剤化において必須の課題である。
【０００４】
微小、かつ均一なＲ８−ＭＥＮＤを調製するためには、一遺伝子ナノ粒子を形成させ、これを一つずつパッケージする必要がある。従来のＲ８−ＭＥＮＤは、ポリカチオン（ポリエルリジン（Ｐｏｌｙ−ｌ−ｌｙｓｉｎｅ：ＰＬＬ）など）によって複数のプラスミドＤＮＡが凝縮化された不均一なコア粒子を有していた。従来、一遺伝子をナノ粒子化する技術としては、カチオニックディタージェント（例えば、ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）と目的の遺伝子とを混合しナノ粒子を形成させる方法が主に採用されてきた（非特許文献３）。しかし、調製されたナノ粒子の形成過程は、可逆的であるため遺伝子導入を行う目的で細胞培養液中に添加した場合には崩壊が確認されていた。このため、高い遺伝子発現は得られず、さらに放出したカチオニックディタージェントによる細胞毒性も報告されていた（非特許文献４、５）。Ｂｅｈｒらはこの崩壊を防ぐために、チオール結合によってカチオニックディタージェントを架橋させナノ粒子を固定化したが、逆に細胞核内で遺伝子が放出されずに遺伝子治療に十分な遺伝子発現活性は観察されなかった（非特許文献６）。
【非特許文献１】Ｋ．Ｋｏｇｕｒｅ等、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ」、２００４年、９８巻、３１７−３２３頁
【非特許文献２】Ｉ．Ａ．Ｋｈａｌｉｌ等、「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」、２００７年、１４巻、６８２−６８９頁
【非特許文献３】Ｓ．Ｍ．Ｍｅｌｎｉｋｏｖ等、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ」、１９９５年、１１７巻、２４０１−２４０８頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｐ．Ｃｌａｍｍｅ等、「Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ」、２０００年、１４６７巻、３４７−３６１頁
【非特許文献５】Ｊ．Ｓ．Ｒｅｍｙ等、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９４年、５巻、６４７−６５４頁
【非特許文献６】Ｃ．Ｃｈｉｔｔｉｍａｌｌａ等、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ」、２００５年、１２７巻、１１４３６−１１４４１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、効率的な遺伝子発現、臨床応用、高品質な製剤化を可能する手段として、一遺伝子を微小かつ均一なナノ粒子としそれを脂質膜でコーティングする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明の脂質構造体は、凝縮化一遺伝子ナノ粒子を有することを特徴とする（請求項１参照）。微小かつ均一な凝縮化一遺伝子ナノ粒子を脂質膜でパッケージングした脂質膜構造体は、微小かつ均一な物性を保持する。したがって、凝縮化一遺伝子ナノ粒子を有する脂質構造体は、微小な粒子径を有するため、核膜孔を透過する遺伝子送達を可能とし非分裂細胞での効率的な遺伝子発現が可能となる。また、凝縮化一遺伝子ナノ粒子を有する脂質構造体の均一な粒子径分布はｉｎ ｖｉｖｏへの適応、製剤化においても大きな利益をもたらす。すなわち、本発明の脂質構造体は、遺伝子治療を可能とする遺伝子ベクターとして使用することができる（請求項１１参照）。
【０００７】
本発明の脂質膜構造体において、前記凝縮化一遺伝子ナノ粒子が、カチオニックディタージェントによって凝縮された遺伝子ナノ粒子であることが好ましく（請求項２参照）、前期カチオニックディタージェントは、例えば、モノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ : ＭＣＤ）である（請求項３参照）。ＭＣＤによって凝縮された一遺伝子ナノ粒子は微小かつ均一であり、脂質膜でパッケージングした脂質膜構造体の物性は、微小かつ均一に保持される。
【０００８】
本発明の脂質膜構造体において、前記凝縮化一遺伝子ナノ粒子を構成するＭＣＤは、好ましくは1つの長鎖脂肪鎖と１つの芳香族を有した構造である（請求項６参照）。前記長鎖脂肪鎖は、例えば、炭素数が１４〜２０個（請求項７参照）であり、前記芳香族の芳香環の数は、例えば、１〜５個（請求項８参照）である。上記の特徴を有するＭＣＤは、微小かつ均一な凝縮化一遺伝子ナノ粒子を形成する。
【０００９】
上記凝縮化一遺伝子ナノ粒子は、プラスミドＤＮＡとＭＣＤを混合することで形成することができる。混合する際のモル比は、ＭＣＤ種によって異なってもかまわない。
【００１０】
本発明の脂質膜構造体は、凝縮化一遺伝子ナノ粒子が脂質膜にパッケージングされたリポソームであることが好ましい（請求項９参照）。また、凝縮化一遺伝子ナノ粒子を脂質膜でパッケージングした後に、余剰の凝縮化素子が除去されていることが好ましい（請求項４参照）。上記余剰の凝縮化素子の除去は、例えば、疎水性ビーズの使用によって行われる（請求項５参照）。余剰分の凝縮化素子の除去は、脂質膜構造体の脂質膜への影響を回避し、生体内での毒性を回避することが可能となる。
【００１１】
本発明の脂質膜構造体は、可逆的平衡関係にあるＭＣＤによって凝縮化された一遺伝子ナノ粒子を有する事が好ましい（請求項３参照）。この場合、脂質膜内に保持された一遺伝子ナノ粒子は核内まで保持され、体内、細胞内でのヌクレアーゼより保護される。また、核内送達後には効率的に遺伝子を放出し、高い遺伝子発現を発揮することが可能となる（図１参照）。
【００１２】
本発明の脂質膜構造体は核内へ送達しようとする目的遺伝子が内部に封入されていることが好ましく（請求項１０参照）、この場合、本発明の脂質膜構造体は前記目的遺伝子を用いた遺伝子治療用ベクターとして使用することができる（請求項１１参照）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、遺伝子治療や再生医療の革新的治療法を支える遺伝子導入技術として、一遺伝子を微小かつ均一なナノ粒子としそれを脂質膜でコーティングする技術が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の脂質膜構造体について詳細に説明する。本発明の脂質膜構造体は、凝縮化された一遺伝子ナノ粒子を有する限り、リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などのうち、いずれの構造体であっても良いが、リポソームである事が好ましい。本発明の脂質膜構造体がリポソームである場合、本発明の脂質膜構造体の内部に目的遺伝子を封入する事により、目的遺伝子を核内に効率よく送達する事ができる。
【００１５】
本発明の脂質膜構造体がリポソームである場合、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ
ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ
ｖｅｓｉｃｌｅ）等の一枚膜リポソームであってもよい。
【００１６】
本発明の脂質膜構造体のサイズは特に限定されるものではないが、本発明の脂質膜構造体がリポソーム又はエマルションの場合、粒子径は通常は直径５０ｎｍ〜５μｍ、好ましくは直径５０ｎｍ〜５００ｎｍ、さらに好ましくは直径５０ｎｍ〜２００ｎｍである。また、ひも状ミセル又は不定形の層状構造物の場合、１層あたりの厚みは通常５〜１０
ｎｍである。
【００１７】
本発明の脂質膜構造体の内部には、核内に送達しようとする目的遺伝子を封入することができる。目的遺伝子としては、通常核酸が挙げられ、診断、治療等の目的に応じて適宜選択することができる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。
【００１８】
封入すべき核酸を予めカチオン性物質と複合体化させておくことが好ましい。核酸とカチオン性物質と静電的に結合させ複合体化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸の凝集体を調製する事ができる。核酸とカチオン性物質との複合体の存在下、脂質膜を水和し、次いで攪拌又は超音波処理することにより、核酸とカチオン性物質との複合体が封入されたリポソームを簡便かつ効率よく製造することができる。
【００１９】
「カチオン性物質」とは、その分子中にカチオン性基を有する物質を意味し、静電的相互作用により核酸と複合体を形成することができる。カチオン性物質の種類は核酸と複合体を形成し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、カチオン性基を有する低分子；カチオニックディタージェント、カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体（例えばステアリル化誘導体）；ポリエチレンイミン等のポリカチオン性ポリマー；硫酸プロタミン等が挙げられるが、これらのうち特にカチオニックディタージェントが好ましい。カチオニックディタージェントのカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、通常１〜６個であり、好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。
【００２０】
カチオニックディタージェントは、モノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ : ＭＣＤ）であることが好ましい。ＭＣＤの構造は特に限定されるものではないが、1つの長鎖脂肪鎖と１つの芳香族を有した４級アンモニウム塩である事が好ましい。このような疎水基を有するＭＣＤによって凝縮された遺伝子ナノ粒子は微小かつ均一であり、脂質膜でパッケージングした脂質膜構造体の物性は、微小かつ均一に保持される。ＭＣＤ中の長鎖脂肪鎖の炭素数は通常１４〜２０個、好ましくは１５〜１９個、さらに好ましくは１６〜１８個である。ＭＣＤ中の芳香族の芳香環の数は、通常１〜５個、好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個である。ＭＣＤ中の単鎖脂肪鎖の種類は特に限定されるものではなく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。
【００２１】
本発明の脂質膜構造体が有する凝縮化一遺伝子ナノ粒子は、ＭＣＤによって形成されていることが好ましい。ＭＣＤは、可逆的平衡によってナノ粒子を形成している。そのため、核内に送達された後には効率的に遺伝子を放出することが可能となり高い遺伝子発現が期待できる。また、核内に送達されるまでは脂質膜によってパッケージングされているため体内、細胞内で各種ヌクレアーゼより保護される（図１参照）。また、ＭＣＤによって調製されたナノ粒子は微小であるためその脂質膜構造体は、核膜孔を通過する新たな遺伝子送達戦略が可能となる。さらに、均一な粒子径は、ｉｎ ｖｉｖｏでの応用、製剤化において大きな利益をもたらす。
【００２２】
本発明の脂質膜構造体において、脂質膜の構成成分として、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等を含有することができる。
【００２３】
脂質としては、例えば、以下に例示するリン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
[リン脂質]
ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等。
【００２４】
[糖脂質]
グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等。
【００２５】
[ステロール]
動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等。
【００２６】
[飽和又は不飽和の脂肪酸]
パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸等。
【００２７】
膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、その含有量は、リポソーム膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、膜安定化剤の含有量の下限値は０である。
【００２８】
膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
【００２９】
抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、その含有量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、抗酸化剤の含有量の下限値は０である。
【００３０】
抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。
【００３１】
荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、その含有量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、荷電物質の含有量の下限値は０である。
【００３２】
正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。
【００３３】
膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために含有させることができる、リポソーム膜の任意の構成成分であり、その含有量は、リポソーム膜を構成する総物質量の通常１０％（モル比）以下、好ましくは５％（モル比）以下、さらに好ましくは２％（モル比）以下である。なお、膜タンパク質の含有量の下限値は０である。
【００３４】
膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。
【００３５】
本発明の脂質膜構造体において、脂質膜を構成する脂質として、例えば、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、ｐＨ感受性機能などを有する脂質誘導体を使用することができる。これにより、上記のうち１種又は２種以上の機能を脂質膜構造体に付与する事ができる。脂質膜構造体に血中滞留性機能を付与する事により、脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織による補足率を低下させることができる。また、脂質膜構造体に温度変化感受性機能またはｐＨ感受性機能を付与することにより、脂質膜構造体に保持された膜遺伝子の放出性を高めることができる。
【００３６】
血中滞留性機能を付与する事ができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、ポリエチレングリコール誘導体などが挙げられ、温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられ、ｐＨ感受性機能を付与することができるｐＨ感受性脂質誘導体としては、例えば、コレステリルヘミスクシネート等が挙げられる。
【００３７】
本発明の脂質膜構造体には、標的とする細胞、当該細胞が分泌する酵素などを特異的に認識する抗体を保持させる事ができる。抗体としては、モノクローナル抗体を使用することが好ましく、モノクローナル抗体としては、単一のエピトープに対して特異性を有する一種のモノクローナル抗体を使用しても良いし、各種エピトープに対して特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体を組み合わせて使用しても良い。
【００３８】
細胞内への遺伝子導入効率を向上させる点から、脂質膜構造体は、遺伝子導入機能を有する化合物を有する事が好ましい。遺伝子導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の内部、脂質膜中、脂質膜表面、脂質膜層中、脂質膜層表面に存在させる事ができる。
【００３９】
本発明の脂質膜構造体がリポソームである場合、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。
【００４０】
水和法によるリポソームの製造例を以下に示す。
リポソーム膜構成成分である脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜に目的遺伝子が凝縮化されたナノ粒子懸濁液添加し、水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、目的遺伝子が凝縮化されたナノ粒子を有するリポソームを製造することができる。
【００４１】
本発明の脂質膜構造体は、ＭＣＤによって凝縮化された一遺伝子ナノ粒子が脂質膜にパッケージングされたリポソームであることが好ましい。凝縮化一遺伝子ナノ粒子がＭＣＤからなる場合、ナノ粒子は微小かつ均一であり、それを脂質膜でパッケージングしたリポソームとした場合にもこの微小性、均一性は保持されている。ＭＣＤによって調製されたナノ粒子は可逆的平衡関係にあるため余剰のＭＣＤが溶液中に存在している。そのため、脂質膜によってパッケージングした後に、余剰のＭＣＤを除去する事が好ましい。パッケージング後に余剰のＭＣＤを除去してもナノ粒子は崩壊しない。また、余剰のＭＣＤの除去はパッケージングした脂質への影響を回避し、さらに生体内での毒性も回避する。
【００４２】
余剰のＭＣＤの除去は、例えば、疎水性ビーズ法、ゲル濾過法、透析法などが挙げられるが、疎水性ビーズ法である事が好ましい。ＭＣＤによって凝縮化されたナノ粒子を有する脂質膜構造体に疎水性ビーズを添加するとＭＣＤの疎水性基に疎水性ビーズが吸着する。次に遠心分離操作によって疎水性ビーズに吸着したＭＣＤと脂質膜構造体を分離する事が可能である。疎水性ビーズ法は、ゲル濾過法、透析法と比較して非常に簡便であり短時間での処理が可能となる。
【００４３】
疎水性ビーズ法によるＭＣＤの除去回数は通常１〜６回であり、好ましくは２〜５回であり、さらに好ましくは３〜４回である。また、疎水性ビーズと脂質膜構造体とのインキュベーション時間は通常１０〜６０分であり、好ましくは２０〜５０分、さらに好ましくは３０〜４０分である。上記の処理を施した脂質膜構造体は、粒子径が安定しており製剤化に大きな利点を与える。さらに、崩壊しやすい凝縮化一遺伝子ナノ粒子を有する脂質膜構造体は、核内でナノ粒子を効率的に放出するため、高い遺伝子発現能を有する。ポリカチオンによって凝縮化された遺伝子ナノ粒子は非可逆的に凝縮化されるため効率的な遺伝子の放出は不可能であった（Ｉ．Ｎａｙｖｅｌｔ等、「Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２００７年、８巻、４７７−４８４頁）。また従来は、ＭＣＤによって凝縮化されたナノ粒子をパッケージングする技術がなかった。そのため、ＭＣＤによる遺伝子導入は不可能であった。本発明の新たなパッケージング技術によって新しい遺伝子導入技術を提供する事が可能となる。
【００４４】
目的遺伝子の凝縮化一遺伝子ナノ粒子が全体として正に帯電している場合、脂質膜を構成する脂質としてアニオン性脂質（酸性脂質）を使用すれば、目的遺伝子の凝縮化一遺伝子ナノ粒子が保持された脂質膜を効率よく製造する事ができ、目的遺伝子の凝縮化一遺伝子ナノ粒子が全体として負に帯電している場合、脂質膜を構成する脂質としてカチオン性脂質（塩基性脂質）を使用すれば、目的遺伝子の凝縮化一遺伝子ナノ粒子が保持された脂質膜を効率よく製造する事ができる。
【００４５】
本発明の脂質膜構造体が標的とする生物種は特に限定されるものではなく、例えば、動物、植物、微生物等が挙げられるが、動物が好ましく、哺乳動物がさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、本発明の脂質膜構造体が標的とする細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞、ｉＰＳ細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
【００４６】
本発明の脂質膜構造体は、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。
【００４７】
本発明の脂質膜構造体は、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させたリポソームは、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。
【００４８】
本発明の脂質膜構造体は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれにおいても使用することもできる。本発明の脂質膜構造体をｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、脂質膜構造体に封入された目的遺伝子の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
【実施例】
【００４９】
〔実施例１〕微小かつ均一な凝縮一遺伝子ナノ粒子の形成
（１）ＭＣＤによるナノ粒子の調製
微小かつ均一な凝縮一遺伝子ナノ粒子を形成させるために、モノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ： ＭＣＤ）を用いてプラスミドＤＮＡを凝縮化しナノ粒子とした。スクリーニングに用いたＭＣＤは、メチル基を２つと側鎖Ｒ１、Ｒ２有する４級アンモニウム塩である。側鎖Ｒ１、Ｒ２に関しては表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
１０ ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）で０．１ ｍｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ＥＧＦＰ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）水溶液を調製した。ＭＣＤはエタノールに溶解し１ Ｍストック溶液として保存し、使用時に１０ ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーで適当なｎｉｔｒｏｇｅｎ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｎ／Ｐ）比（０．１、０．５、１、１０、２５、５０）となるように系列希釈した。ボルテックスしながら、ＭＣＤ溶液に等量のプラスミドＤＮＡ水溶液を穏やかに添加することでナノ粒子を調製した。以下、ＭＣＤにより調製したナノ粒子をｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＭＣＤ：ＭＣＤ−ＣＤＰという。
【００５２】
（数１）
Ｎ／Ｐ比＝（ＣＭ／ＭＷＰ）／（ＣＤ／ＭＷＤ）
〔式中、ＣＭはＭＣＤ溶液の濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表し、ＭＷＭはＭＣＤの分子量を表し、ＣＤはプラスミドＤＮＡ溶液の濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表し、ＭＷＤはプラスミドＤＮＡに含まれるヌクレオチド１つの平均分子量（３１０）を表す。〕
【００５３】
（２）ナノ粒子の粒子径と表面電位測定
調製したＭＣＤ−ＣＤＰの粒子径及び表面電位をそれぞれ動的光散乱法及び電気泳動法を利用した光散乱測定機 （Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ； Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＷＲ，ＵＫ）によって測定した。
【００５４】
調製したＭＣＤ−ＣＤＰの粒子径（ｎｍ）及び表面電位（ｍＶ）を図２に示す。なお、図２ＡはＴｙｐｅ−Ｃ， Ｄからなるナノ粒子、図２ＢはＴｙｐｅ−Ｅからなるナノ粒子、図２ＣはＴｙｐｅ−Ｆからなるナノ粒子の粒子径（ａ）および表面電位（ｂ）を示す。また、図２Ａ（ａ）及び図２Ｂ（ａ）中、□はＮ／Ｐ比＝２５、■はＮ／Ｐ比＝５０で調製したナノ粒子の粒子径を示す。また、図２Ａ（ｂ）中、○はＣ−１、●はＣ−２、□はＤ−１、■はＤ−２のそれぞれのＮ／Ｐ比で調製したナノ粒子の表面電位を示す。図２Ｂ（ｂ）中、○はＥ−１、△はＥ−２、□はＥ−３のそれぞれのＮ／Ｐ比で調製したナノ粒子の表面電位を示す。
【００５５】
図２に示すように、炭素数が１６個の長鎖脂肪鎖を有するＭＣＤ（Ｃ−２、Ｄ−２、Ｅ−３、Ｆ）は微小なナノ粒子を形成することが確認された。さらに、芳香族基と炭素数が１６個の長鎖脂肪鎖を両方持つＭＣＤであるＥ−３、Ｆは最も微小なナノ粒子を調製することが確認された。また、得たナノ粒子はＮ／Ｐ比１０以上で正電荷を有していた。
【００５６】
以上の結果より、ＭＣＤを用いて小さなナノ粒子を形成するためには、炭素数が１６個（またはそれ以上）の長鎖脂肪鎖と芳香族も有するＭＣＤが必要であることが明らかとなった。スクリーニングより得たＥ−３とＦをＭＣＤ−ＣＤＰ形成のためのＭＣＤとして選択した。以下、Ｅ−３のＭＣＤを「ＢＤＨＡＣ」、ＦのＭＣＤを「ＴＢ」という。
【００５７】
（３）ナノ粒子形成の確認
ＢＤＨＡＣ、ＴＢによってｐＤＮＡが安定なナノ粒子を形成するか否かを確認した。調製したナノ粒子に、終濃度１ ｍｇ／ｍＬとなるようにポリアスパラギン酸（ｐＡｓｐ：ＤＮＡをナノ粒子から放出させる試薬）を加え混合した。０．５％アガロースゲルにアプライし、ＴＡＥ （４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ ｍＭ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で電気泳動を行った（１００Ｖ，２０分間）。泳動後、エチジウムブロマイド染色によってプラスミドＤＮＡを可視化した。エチジウムブロマイドはプラスミドＤＮＡがナノ粒子を形成するとインターカレートできなくなるので、ナノ粒子化されていないプラスミドＤＮＡとナノ粒子化されたプラスミドＤＮＡを区別することができる。
【００５８】
ＢＤＨＡＣからなるナノ粒子のアガロース電気泳動の結果を図３Ａに示し、ＴＢからなるナノ粒子のアガロース電気泳動の結果を図３Ｂに示す。図３Ａ及び図３Ｂ中、レーン１−６はｐＡｓｐ未処理群を示し、レーン７−１２はｐＡｓｐ処理群を示す。また、レーン１及び７はＮ／Ｐ＝１０で調製したＣＤＰを示し、レーン２及び８はＮ／Ｐ＝１２．５で調製したＣＤＰを示し、レーン３及び９はＮ／Ｐ＝１５で調製したＣＤＰを示し、レーン４及び１０はＮ／Ｐ＝２０で調製したＣＤＰを示し、レーン５及び１１はＮ／Ｐ＝２５で調製したＣＤＰを示し、レーン６及び１２はＮ／Ｐ＝５０で調製したＣＤＰを示す。
【００５９】
図３の結果より、ｐＡｓｐ未処理の時（図３Ａ及び図３Ｂのレーン１−６）、ＢＤＨＡＣ、ＴＢともにＮ／Ｐ比の増加に伴って検出されるプラスミドＤＮＡが減少し、Ｎ／Ｐ比２０以上でプラスミドＤＮＡは検出されなくなった。この結果より、Ｎ／Ｐ比２０以上の時に安定したナノ粒子が形成されていると考えた。さらに、ｐＡｓｐ処理によってプラスミドＤＮＡを放出させた時（図３Ａ及び図３Ｂのレーン７−１２）、Ｎ／Ｐ＝２０、２５でプラスミドＤＮＡが検出されるようになったが、Ｎ／Ｐ＝５０ではプラスミドＤＮＡは観察されなかった。
【００６０】
以上の結果より、ＢＤＨＡＣ、ＴＢより調製したナノ粒子は、Ｎ／Ｐ＝２０以上で形成されていることが確認され、さらにＮ／Ｐ＝２０とＮ／Ｐ＝２５で脱凝縮化が可能な構造をしていることが明らかとなった。核内での効率的なプラスミドＤＮＡの放出を考慮してＮ／Ｐ比＝２０で調製したナノ粒子を脂質膜でパッケージングすることにした。以下、ナノ粒子を「ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｐａｒｔｉｃｌｅ：ＣＤＰ」、ＢＤＨＡＣからなるナノ粒子を「ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰ」、ＴＢからなるナノ粒子を「ＴＢ−ＣＤＰ」という。
【００６１】
〔実施例２〕Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の調製と物性評価
（１）ＭＣＤ−ＣＤＰの脂質膜によるパッケージング
ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰ、ＴＢ−ＣＤＰを有する脂質膜構造体を、単純水和法によって次のように調製した。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ＤＯＰＥ）とコレステリルヘミスクシネート （ｃｈｏｌｅｓｔｅｌｙｌ ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ：ＣＨＥＭＳ）とを９：２（モル比）の割合で有機溶媒（クロロホルム）に溶解した後、ガラス試験管に加え、有機溶媒を除去してガラス試験管底に薄膜を形成させた。そこに、ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰ溶液またはＴＢ−ＣＤＰ溶液を加え、脂質膜を水和させた後、超音波処理によって脂質膜コーティングを行った（総脂質濃度０．５〜０．５５ｍＭ）。
【００６２】
以下、ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰを脂質膜によりコーティングした構造体を「ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）」、ＴＢ−ＣＤＰを脂質膜によりコーティングした構造体を「ＭＥＮＤ（ＴＢ）」という。また、ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）とＭＥＮＤ（ＴＢ）のことを、「ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）」という。
【００６３】
脂質膜によるパッケージングの後に、余剰のＭＣＤを除去した。この操作を行わない場合、ＭＣＤによって脂質膜が溶解されＭＥＮＤ（ＭＣＤ）が崩壊する可能性がある。操作は以下のように行った。ＭＣＤ−ＣＤＰをパッケージングした構造体 ２００ ｕＬをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ２（以下、疎水性ビーズ、Ｏｒｇａｎｏ；Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）７０ ｍｇへ添加し、２５℃で３０分間インキュベーションした。その後、２，３００ｇ、２５℃で３分間遠心分離を行い、上清を回収した。さらに、同様の操作を２回繰り返した。この操作によって、余剰のＭＣＤが吸着した疎水性ビーズが沈殿に沈むため、上清のＭＥＮＤ（ＭＣＤ）から余剰のＭＣＤを除去することが可能である。
【００６４】
ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）懸濁液１００ｕＬ、ステアリル化オクタアルギニン溶液（ステアリル化オクタアルギニン濃度：２ ｍｇ／ｍＬ，添加量：２．４４ ｕＬ，溶媒：水）を添加し、室温で一定時間インキュベートすることにより、脂質膜にステアリル化オクタアルギニンを分配させた（ステアリル化オクタアルギニンの分配量：総脂質量の５モル％）。こうして、オクタアルギニン（アルギニン８重合体）を表面に有するＭＥＮＤ（ＭＣＤ）を調製した。
【００６５】
以下、オクタアルギニンを表面に有するＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）を「Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）」、オクタアルギニンを表面に有するＭＥＮＤ（ＴＢ）を「Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）」という。また、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）とＲ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）のことを、「Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）」という。
【００６６】
（２）ＭＣＤ−ＣＤＰのパッケージングの確認
ショ糖密度勾配分画法を用いて、ＭＣＤ−ＣＤＰのパッケージングの確認を行った。Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の脂質膜には、０．５モル％ローダミン（Ｒｈｏ）標識化ＤＯＰＥ（励起波長（Ｅｘ）５６０ｎｍ、蛍光波長（Ｅｍ）５９０ｎｍ）を含有させた。Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）懸濁液、またはＲ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）懸濁液、またはＢＤＨＡＣ−ＣＤＰ懸濁液、またはＴＢ−ＭＣＤ懸濁液５００ μＬを不連続ショ糖密度勾配（０−６０％）に重層し、１６０，０００ｇ、２０℃で２時間超遠心処理を行った。超遠心後、上部から１ ｍＬずつフラクションを回収した。脂質はＲｈｏ標識ＤＯＰＥの蛍光強度、プラスミドＤＮＡはｐＡｓｐ処理後のアガロース電気泳動によってそれぞれ定量した。
【００６７】
Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）、ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰの脂質とプラスミドＤＮＡの分布を図４Aに示し、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）、ＴＢ−ＣＤＰの脂質とプラスミドDNAの分布を図４Bに示す。
【００６８】
図４より、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の脂質及びプラスミドＤＮＡはともにフラクション６を主としてフラクション６−１０に分布することが確認された。ナノ粒子のみについて評価を行った時と比較すると、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）ともにプラスミドＤＮＡ分布はナノ粒子よりもショ糖密度の小さいフラクションへシフトしていた。脂質エンベロープを有するＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の密度はナノ粒子（ＭＣＤ−ＣＤＰ）よりも小さい事が予想されるため、フラクション６−１０で検出された脂質及びプラスミドＤＮＡのピークはいずれもＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）に由来すると考えられた。この結果より、ナノ粒子を脂質膜でコートしたＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）が構築されていることを確認した。
【００６９】
（３）Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の粒子径の大きさと均一性の評価
Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の粒子径と均一性をポリカチオン（ポリエルリジン：ＰＬＬ）からなるＣＤＰを有するＲ８−ＭＥＮＤ（以下、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）という）と比較した。粒子径は、動的光散乱法を利用して測定した。均一性は、粒子径分布より粒子径分布幅を算出しその値を指標とした。
【００７０】
粒子径を図５Ａに示し、粒子径分布を図５Ｂに示す。図５Ａまたは図５Ｂの（ａ）は、ＣＤＰの値を示し、図５Ａまたは図５Ｂの（ｂ）は、Ｒ８−ＭＥＮＤの値を示す。統計処理は、一元分散分析を用いて行い従来型Ｒ８−ＭＥＮＤとの差をＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定により評価した。＊＊は、ｐ＜０．０１で有意な差があることを示す。＊は、ｐ＜０．０５で有意な差があることを示す。
【００７１】
コア粒子を比較した場合、ＭＣＤ−ＣＤＰの粒子径は、ＰＬＬ−ＣＤＰと比較して約４０ｎｍ小さかった（図５Ａ（ａ））。また、粒子径分布幅も有意に小さく、その均一性が示された（図５Ｂ（ａ））。Ｒ８−ＭＥＮＤでの比較を行った場合、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）の粒子径は、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）の半分以下である１２０ｎｍ程度だった（図５Ａ（ｂ））。さらに、パッケージング後にも、ＭＣＤ−ＣＤＰの均一性は保持されていた（図５Ｂ（ｂ））。
【００７２】
図５Ａの結果より、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）と比較して、コア粒子との粒子径増加幅が小さく、少ない数のナノ粒子がパッケージングされている事が示唆された。粒子径の増加幅よりＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は、一遺伝子ナノ粒子を一つだけパッケージングしている可能性が示唆された。また、本方法はＭＣＤをパッケージングの後に除去する調製方法を採用している。一般的に、ディタージェントダイアレシス法によって調製した脂質膜構造体は一枚膜であることが報告されている（Ｗ．Ｌｉ等、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２００５年、７巻、６７−７９頁）。そのため、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は一枚膜に膜枚数が制御されている可能性がある。
【００７３】
〔実施例３〕Ｒ８−ＭＥＮＤ （ＭＣＤ）の機能評価
（１）遺伝子発現活性能の評価
ヒト子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞を用いて、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の遺伝子発現活性を評価した。本実験では、コントロールとして従来型のＲ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）を用いた。前日に、８×１０４細胞／ｍＬの濃度で２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）に播種したＨｅＬａ細胞の培地を無血清培地と交換した後に、プラスミドＤＮＡ（ルシフェラーゼタンパク質を発現する）０．４ μｇを含むＲ８−ＭＥＮＤを細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３時間インキュベーションした。その後、血清添加培地と交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ２存在下で２１時間インキュベーションした。その後、細胞を０．５ ｍＬのＰＢＳで洗い、７５ μＬのｒｅｐｏｒｔｅｒ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （ＰＲＯＭＥＧＡ；ＭＡＤＩＳＯＮ，ＷＩ，ＵＳＡ）で溶解した。−８０℃で２０分間以上インキュベーションした後、１５，０００ｇ、４℃で５分間遠心し５０ μＬを回収した。ルシフェラーゼ活性は細胞ライセート２０ μＬにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）５０ μＬを加え、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ；ＡＴＴＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。細胞ライセートのタンパク質量はＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて決定した。
【００７４】
ルシフェラーゼの発現活性を図６に示す。遺伝子発現量は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙを指標に算出した。ｎａｋｅｄ ｐＤＮＡとは未封入のプラスミドＤＮＡの事を示す。
【００７５】
（数２）
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＲＬＵ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）＝ルシフェラーゼ発現活性（ＲＬＵ／ｍＬ）／蛋白質量（ｍｇ／ｍＬ）
【００７６】
図６の結果より、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）及びＲ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）の遺伝子発現能は、ｎａｋｅｄ ｐＤＮＡより４桁も高く、非常に効率的である事が示された。この値は、従来型のＲ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）と同程度の活性を示す。Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）はアデノウイルスと同等の遺伝子発現能を示すことが報告されている。そのため、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）はウイルスベクターと同等の高い遺伝子発現を有する事が示された。
【００７７】
（２）毒性評価
Ｒ８−ＭＥＮＤの毒性評価を行った。評価は、上記（１）と同様にＨｅＬａ細胞にＲ８−ＭＥＮＤを添加し、２４時間後にタンパク量を測定し、細胞生存率を算出し行った。
【００７８】
（数３）
細胞生存率（％）＝Ｒ８−ＭＥＮＤ処理群の細胞蛋白質量（ｍｇ／ｍＬ）／未処理群の細胞蛋白質量（ｍｇ／ｍＬ）×１００
【００７９】
細胞生存率の評価結果を、図７に示す。−は、余剰のＭＣＤをパッケージング後に除去しなかったＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）を示し、＋は、余剰のＭＣＤをパッケージング後に除去したＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）を示す。
【００８０】
図７よりＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は従来型のＲ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）と同様に細胞毒性がないことが示された。また、ＭＣＤを除去しなかった場合には細胞毒性が顕著に表れていることも確認された。このことは、ＭＣＤ−ＣＤＰをパッケージングした後に実施例２で示したようなＭＣＤの除去操作が非常に重要であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
非常に微小なＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は、核膜孔を透過する新たな戦略が可能となり非分裂細胞への応用が期待される。従って、分裂の遅い細胞への適応が可能となりｉＰＳ細胞などへの応用が期待され再生医療に大きく貢献できる。さらに、均一な粒子径分布は、非ウイルス性遺伝子デリバリーベクターのｉｎ ｖｉｖｏへの応用、製剤化にも大きな利益をもたらすことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明の脂質膜構造体の実施形態を模式的に示す図である。
【図２】ＭＣＤ−ＣＤＰの粒子径と表面電位を示す図である。
【図３】ＭＣＤ−ＣＤＰのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。
【図４】Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の脂質とプラスミドＤＮＡの密度分布を示す図である。
【図５】ＭＣＤ−ＣＤＰとＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の粒子径、粒子径分布幅を示す図である。
【図６】Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の遺伝子発現評価を示す図である。
【図７】Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の毒性評価を示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療、高品質な製剤化を可能する遺伝子発現ベクターを創製するため、一遺伝子を微小かつ均一なナノ粒子としそれを脂質膜でコーティングする技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子治療を実現するために、目的の遺伝子を標的部位に確実に送達するためのベクターやキャリアーの開発が盛んに行われている。例えば、目的の遺伝子を標的細胞へ導入するためのベクターとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス等のウイルスベクターが開発されている。しかしながら、ウイルスベクターは、大量生産の困難性、抗原性、毒性等の問題があるため、このような問題点が少ないリポソームベクターやペプチドキャリアーが注目を集めている。リポソームベクターは、その表面に抗体、タンパク質、糖鎖等の機能性分子を導入することにより、標的部位に対する指向性を向上させることができるという利点も有している。
【０００３】
最近、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの表面をステアリル化オクタアルギニンで修飾することにより、凝縮化ＤＮＡの細胞導入効率が１０００倍、凝縮化ＤＮＡ封入リポソームの細胞への導入効率が１００倍向上したことが報告されている（非特許文献１）。この構造体、多機能性エンベロープ型ナノ構造体（ｏｃｔａａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅ−ｔｙｐｅ ｎａｎｏ ｄｅｖｉｃｅ：Ｒ８−ＭＥＮＤ）は、アデノウイルスと同等の遺伝子発現活性を示す事が報告されている（非特許文献２）。しかしながら、Ｒ８−ＭＥＮＤは、粒子径が約３００ ｎｍと大きく、かつ、不均一な構造をとっており、この状態では、実用化は難しい。ｉｎ
ｖｉｖｏ適用に耐えうる２００ ｎｍ以下の平均粒子径を持ち、かつ、均一な粒子径分布を有するＲ８−ＭＥＮＤの開発は、高品質・高性能な製剤化において必須の課題である。
【０００４】
微小、かつ均一なＲ８−ＭＥＮＤを調製するためには、一遺伝子ナノ粒子を形成させ、これを一つずつパッケージする必要がある。従来のＲ８−ＭＥＮＤは、ポリカチオン（ポリエルリジン（Ｐｏｌｙ−ｌ−ｌｙｓｉｎｅ：ＰＬＬ）など）によって複数のプラスミドＤＮＡが凝縮化された不均一なコア粒子を有していた。従来、一遺伝子をナノ粒子化する技術としては、カチオニックディタージェント（例えば、ｃｅｔｙｌ ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）と目的の遺伝子とを混合しナノ粒子を形成させる方法が主に採用されてきた（非特許文献３）。しかし、調製されたナノ粒子の形成過程は、可逆的であるため遺伝子導入を行う目的で細胞培養液中に添加した場合には崩壊が確認されていた。このため、高い遺伝子発現は得られず、さらに放出したカチオニックディタージェントによる細胞毒性も報告されていた（非特許文献４、５）。Ｂｅｈｒらはこの崩壊を防ぐために、チオール結合によってカチオニックディタージェントを架橋させナノ粒子を固定化したが、逆に細胞核内で遺伝子が放出されずに遺伝子治療に十分な遺伝子発現活性は観察されなかった（非特許文献６）。
【非特許文献１】Ｋ．Ｋｏｇｕｒｅ等、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌｅａｓｅ」、２００４年、９８巻、３１７−３２３頁
【非特許文献２】Ｉ．Ａ．Ｋｈａｌｉｌ等、「Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ」、２００７年、１４巻、６８２−６８９頁
【非特許文献３】Ｓ．Ｍ．Ｍｅｌｎｉｋｏｖ等、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ」、１９９５年、１１７巻、２４０１−２４０８頁
【非特許文献４】Ｊ．Ｐ．Ｃｌａｍｍｅ等、「Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ」、２０００年、１４６７巻、３４７−３６１頁
【非特許文献５】Ｊ．Ｓ．Ｒｅｍｙ等、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、１９９４年、５巻、６４７−６５４頁
【非特許文献６】Ｃ．Ｃｈｉｔｔｉｍａｌｌａ等、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ」、２００５年、１２７巻、１１４３６−１１４４１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、効率的な遺伝子発現、臨床応用、高品質な製剤化を可能する手段として、一遺伝子を微小かつ均一なナノ粒子としそれを脂質膜でコーティングする技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決するために、本発明の脂質構造体は、凝縮化一遺伝子ナノ粒子を有することを特徴とする（請求項１参照）。微小かつ均一な凝縮化一遺伝子ナノ粒子を脂質膜でパッケージングした脂質膜構造体は、微小かつ均一な物性を保持する。したがって、凝縮化一遺伝子ナノ粒子を有する脂質構造体は、微小な粒子径を有するため、核膜孔を透過する遺伝子送達を可能とし非分裂細胞での効率的な遺伝子発現が可能となる。また、凝縮化一遺伝子ナノ粒子を有する脂質構造体の均一な粒子径分布はｉｎ ｖｉｖｏへの適応、製剤化においても大きな利益をもたらす。すなわち、本発明の脂質構造体は、遺伝子治療を可能とする遺伝子ベクターとして使用することができる（請求項１１参照）。
【０００７】
本発明の脂質膜構造体において、前記凝縮化一遺伝子ナノ粒子が、カチオニックディタージェントによって凝縮された遺伝子ナノ粒子であることが好ましく（請求項２参照）、前期カチオニックディタージェントは、例えば、モノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ : ＭＣＤ）である（請求項３参照）。ＭＣＤによって凝縮された一遺伝子ナノ粒子は微小かつ均一であり、脂質膜でパッケージングした脂質膜構造体の物性は、微小かつ均一に保持される。
【０００８】
本発明の脂質膜構造体において、前記凝縮化一遺伝子ナノ粒子を構成するＭＣＤは、好ましくは1つの長鎖脂肪鎖と１つの芳香族を有した構造である（請求項６参照）。前記長鎖脂肪鎖は、例えば、炭素数が１４〜２０個（請求項７参照）であり、前記芳香族の芳香環の数は、例えば、１〜５個（請求項８参照）である。上記の特徴を有するＭＣＤは、微小かつ均一な凝縮化一遺伝子ナノ粒子を形成する。
【０００９】
上記凝縮化一遺伝子ナノ粒子は、プラスミドＤＮＡとＭＣＤを混合することで形成することができる。混合する際のモル比は、ＭＣＤ種によって異なってもかまわない。
【００１０】
本発明の脂質膜構造体は、凝縮化一遺伝子ナノ粒子が脂質膜にパッケージングされたリポソームであることが好ましい（請求項９参照）。また、凝縮化一遺伝子ナノ粒子を脂質膜でパッケージングした後に、余剰の凝縮化素子が除去されていることが好ましい（請求項４参照）。上記余剰の凝縮化素子の除去は、例えば、疎水性ビーズの使用によって行われる（請求項５参照）。余剰分の凝縮化素子の除去は、脂質膜構造体の脂質膜への影響を回避し、生体内での毒性を回避することが可能となる。
【００１１】
本発明の脂質膜構造体は、可逆的平衡関係にあるＭＣＤによって凝縮化された一遺伝子ナノ粒子を有する事が好ましい（請求項３参照）。この場合、脂質膜内に保持された一遺伝子ナノ粒子は核内まで保持され、体内、細胞内でのヌクレアーゼより保護される。また、核内送達後には効率的に遺伝子を放出し、高い遺伝子発現を発揮することが可能となる（図１参照）。
【００１２】
本発明の脂質膜構造体は核内へ送達しようとする目的遺伝子が内部に封入されていることが好ましく（請求項１０参照）、この場合、本発明の脂質膜構造体は前記目的遺伝子を用いた遺伝子治療用ベクターとして使用することができる（請求項１１参照）。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、遺伝子治療や再生医療の革新的治療法を支える遺伝子導入技術として、一遺伝子を微小かつ均一なナノ粒子としそれを脂質膜でコーティングする技術が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の脂質膜構造体について詳細に説明する。本発明の脂質膜構造体は、凝縮化された一遺伝子ナノ粒子を有する限り、リポソーム、Ｏ／Ｗ型エマルション、Ｗ／Ｏ／Ｗ型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、不定型の層状構造物などのうち、いずれの構造体であっても良いが、リポソームである事が好ましい。本発明の脂質膜構造体がリポソームである場合、本発明の脂質膜構造体の内部に目的遺伝子を封入する事により、目的遺伝子を核内に効率よく送達する事ができる。
【００１５】
本発明の脂質膜構造体がリポソームである場合、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）であってもよいし、ＳＵＶ（ｓｍａｌｌ
ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＬＵＶ（ｌａｒｇｅ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ）、ＧＵＶ（ｇｉａｎｔ ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ
ｖｅｓｉｃｌｅ）等の一枚膜リポソームであってもよい。
【００１６】
本発明の脂質膜構造体のサイズは特に限定されるものではないが、本発明の脂質膜構造体がリポソーム又はエマルションの場合、粒子径は通常は直径５０ｎｍ〜５μｍ、好ましくは直径５０ｎｍ〜５００ｎｍ、さらに好ましくは直径５０ｎｍ〜２００ｎｍである。また、ひも状ミセル又は不定形の層状構造物の場合、１層あたりの厚みは通常５〜１０
ｎｍである。
【００１７】
本発明の脂質膜構造体の内部には、核内に送達しようとする目的遺伝子を封入することができる。目的遺伝子としては、通常核酸が挙げられ、診断、治療等の目的に応じて適宜選択することができる。なお、「核酸」には、ＤＮＡ又はＲＮＡに加え、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ等）が含まれる。また、核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよいし、線状又は環状のいずれであってもよい。
【００１８】
封入すべき核酸を予めカチオン性物質と複合体化させておくことが好ましい。核酸とカチオン性物質と静電的に結合させ複合体化することにより、核酸の凝集体を調製することができる。複合体化の際、核酸とカチオン性物質との混合比率を調整することにより、全体として正又は負に帯電する核酸の凝集体を調製する事ができる。核酸とカチオン性物質との複合体の存在下、脂質膜を水和し、次いで攪拌又は超音波処理することにより、核酸とカチオン性物質との複合体が封入されたリポソームを簡便かつ効率よく製造することができる。
【００１９】
「カチオン性物質」とは、その分子中にカチオン性基を有する物質を意味し、静電的相互作用により核酸と複合体を形成することができる。カチオン性物質の種類は核酸と複合体を形成し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、カチオン性基を有する低分子；カチオニックディタージェント、カチオン性基を有する高分子；ポリリジン、ポリアルギニン、リジンとアルギニンの共重合体等の塩基性アミノ酸の単独重合体若しくは共重合体又はこれらの誘導体（例えばステアリル化誘導体）；ポリエチレンイミン等のポリカチオン性ポリマー；硫酸プロタミン等が挙げられるが、これらのうち特にカチオニックディタージェントが好ましい。カチオニックディタージェントのカチオン性基の数は特に限定されるものではないが、通常１〜６個であり、好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜２個である。カチオン性基は正に荷電し得る限り特に限定されるものではなく、例えば、アミノ基；メチルアミノ基、エチルアミノ基等のモノアルキルアミノ基；ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基等のジアルキルアミノ基；イミノ基；グアニジノ基等が挙げられる。
【００２０】
カチオニックディタージェントは、モノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ : ＭＣＤ）であることが好ましい。ＭＣＤの構造は特に限定されるものではないが、1つの長鎖脂肪鎖と１つの芳香族を有した４級アンモニウム塩である事が好ましい。このような疎水基を有するＭＣＤによって凝縮された遺伝子ナノ粒子は微小かつ均一であり、脂質膜でパッケージングした脂質膜構造体の物性は、微小かつ均一に保持される。ＭＣＤ中の長鎖脂肪鎖の炭素数は通常１４〜２０個、好ましくは１５〜１９個、さらに好ましくは１６〜１８個である。ＭＣＤ中の芳香族の芳香環の数は、通常１〜５個、好ましくは１〜４個、さらに好ましくは１〜３個である。ＭＣＤ中の単鎖脂肪鎖の種類は特に限定されるものではなく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基等が挙げられる。
【００２１】
本発明の脂質膜構造体が有する凝縮化一遺伝子ナノ粒子は、ＭＣＤによって形成されていることが好ましい。ＭＣＤは、可逆的平衡によってナノ粒子を形成している。そのため、核内に送達された後には効率的に遺伝子を放出することが可能となり高い遺伝子発現が期待できる。また、核内に送達されるまでは脂質膜によってパッケージングされているため体内、細胞内で各種ヌクレアーゼより保護される（図１参照）。また、ＭＣＤによって調製されたナノ粒子は微小であるためその脂質膜構造体は、核膜孔を通過する新たな遺伝子送達戦略が可能となる。さらに、均一な粒子径は、ｉｎ ｖｉｖｏでの応用、製剤化において大きな利益をもたらす。
【００２２】
本発明の脂質膜構造体において、脂質膜の構成成分として、脂質、膜安定化剤、抗酸化剤、荷電物質、膜タンパク質等を含有することができる。
【００２３】
脂質としては、例えば、以下に例示するリン脂質、糖脂質、ステロール、飽和又は不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
[リン脂質]
ホスファチジルコリン（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルグリセロール（例えば、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジグリセロール等）、ホスファチジルエタノールアミン（例えば、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジエタノールアミン等）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、卵黄レシチン、大豆レシチン、これらの水素添加物等。
【００２４】
[糖脂質]
グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等。
【００２５】
[ステロール]
動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等。
【００２６】
[飽和又は不飽和の脂肪酸]
パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数１２〜２０の飽和又は不飽和の脂肪酸等。
【００２７】
膜安定化剤は、脂質膜を物理的又は化学的に安定させたり、脂質膜の流動性を調節したりするために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、その含有量は、リポソーム膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、膜安定化剤の含有量の下限値は０である。
【００２８】
膜安定化剤としては、例えば、ステロール、グリセリン又はその脂肪酸エステル等が挙げられる。ステロールとしては、上記と同様の具体例が挙げられ、グリセリンの脂肪酸エステルとしては、例えば、トリオレイン、トリオクタノイン等が挙げられる。
【００２９】
抗酸化剤は、脂質膜の酸化を防止するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、その含有量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、抗酸化剤の含有量の下限値は０である。
【００３０】
抗酸化剤としては、例えば、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシトルエン等が挙げられる。
【００３１】
荷電物質は、脂質膜に正荷電又は負荷電を付与するために含有させることができる、脂質膜の任意の構成成分であり、その含有量は、脂質膜を構成する総物質量の通常３０％（モル比）以下、好ましくは２５％（モル比）以下、さらに好ましくは２０％（モル比）以下である。なお、荷電物質の含有量の下限値は０である。
【００３２】
正荷電を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質等が挙げられ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等が挙げられる。
【００３３】
膜タンパク質は、脂質膜の構造を維持したり、脂質膜に機能性を付与したりするために含有させることができる、リポソーム膜の任意の構成成分であり、その含有量は、リポソーム膜を構成する総物質量の通常１０％（モル比）以下、好ましくは５％（モル比）以下、さらに好ましくは２％（モル比）以下である。なお、膜タンパク質の含有量の下限値は０である。
【００３４】
膜タンパク質としては、例えば、膜表在性タンパク質、膜内在性タンパク質等が挙げられる。
【００３５】
本発明の脂質膜構造体において、脂質膜を構成する脂質として、例えば、血中滞留性機能、温度変化感受性機能、ｐＨ感受性機能などを有する脂質誘導体を使用することができる。これにより、上記のうち１種又は２種以上の機能を脂質膜構造体に付与する事ができる。脂質膜構造体に血中滞留性機能を付与する事により、脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓、脾臓等の細網内皮系組織による補足率を低下させることができる。また、脂質膜構造体に温度変化感受性機能またはｐＨ感受性機能を付与することにより、脂質膜構造体に保持された膜遺伝子の放出性を高めることができる。
【００３６】
血中滞留性機能を付与する事ができる血中滞留性脂質誘導体としては、例えば、ポリエチレングリコール誘導体などが挙げられ、温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等が挙げられ、ｐＨ感受性機能を付与することができるｐＨ感受性脂質誘導体としては、例えば、コレステリルヘミスクシネート等が挙げられる。
【００３７】
本発明の脂質膜構造体には、標的とする細胞、当該細胞が分泌する酵素などを特異的に認識する抗体を保持させる事ができる。抗体としては、モノクローナル抗体を使用することが好ましく、モノクローナル抗体としては、単一のエピトープに対して特異性を有する一種のモノクローナル抗体を使用しても良いし、各種エピトープに対して特異性を有する２種以上のモノクローナル抗体を組み合わせて使用しても良い。
【００３８】
細胞内への遺伝子導入効率を向上させる点から、脂質膜構造体は、遺伝子導入機能を有する化合物を有する事が好ましい。遺伝子導入機能を有する化合物は、脂質膜構造体の内部、脂質膜中、脂質膜表面、脂質膜層中、脂質膜層表面に存在させる事ができる。
【００３９】
本発明の脂質膜構造体がリポソームである場合、水和法、超音波処理法、エタノール注入法、エーテル注入法、逆相蒸発法、界面活性剤法、凍結・融解法等の公知の方法を用いて作製することができる。
【００４０】
水和法によるリポソームの製造例を以下に示す。
リポソーム膜構成成分である脂質を有機溶剤に溶解した後、有機溶剤を蒸発除去することにより脂質膜を得る。この際、有機溶剤としては、例えば、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、シクロヘキサン等の炭化水素類；塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；メタノール、エタノール等の低級アルコール類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン等のケトン類等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。次いで、脂質膜に目的遺伝子が凝縮化されたナノ粒子懸濁液添加し、水和させ、攪拌又は超音波処理することにより、目的遺伝子が凝縮化されたナノ粒子を有するリポソームを製造することができる。
【００４１】
本発明の脂質膜構造体は、ＭＣＤによって凝縮化された一遺伝子ナノ粒子が脂質膜にパッケージングされたリポソームであることが好ましい。凝縮化一遺伝子ナノ粒子がＭＣＤからなる場合、ナノ粒子は微小かつ均一であり、それを脂質膜でパッケージングしたリポソームとした場合にもこの微小性、均一性は保持されている。ＭＣＤによって調製されたナノ粒子は可逆的平衡関係にあるため余剰のＭＣＤが溶液中に存在している。そのため、脂質膜によってパッケージングした後に、余剰のＭＣＤを除去する事が好ましい。パッケージング後に余剰のＭＣＤを除去してもナノ粒子は崩壊しない。また、余剰のＭＣＤの除去はパッケージングした脂質への影響を回避し、さらに生体内での毒性も回避する。
【００４２】
余剰のＭＣＤの除去は、例えば、疎水性ビーズ法、ゲル濾過法、透析法などが挙げられるが、疎水性ビーズ法である事が好ましい。ＭＣＤによって凝縮化されたナノ粒子を有する脂質膜構造体に疎水性ビーズを添加するとＭＣＤの疎水性基に疎水性ビーズが吸着する。次に遠心分離操作によって疎水性ビーズに吸着したＭＣＤと脂質膜構造体を分離する事が可能である。疎水性ビーズ法は、ゲル濾過法、透析法と比較して非常に簡便であり短時間での処理が可能となる。
【００４３】
疎水性ビーズ法によるＭＣＤの除去回数は通常１〜６回であり、好ましくは２〜５回であり、さらに好ましくは３〜４回である。また、疎水性ビーズと脂質膜構造体とのインキュベーション時間は通常１０〜６０分であり、好ましくは２０〜５０分、さらに好ましくは３０〜４０分である。上記の処理を施した脂質膜構造体は、粒子径が安定しており製剤化に大きな利点を与える。さらに、崩壊しやすい凝縮化一遺伝子ナノ粒子を有する脂質膜構造体は、核内でナノ粒子を効率的に放出するため、高い遺伝子発現能を有する。ポリカチオンによって凝縮化された遺伝子ナノ粒子は非可逆的に凝縮化されるため効率的な遺伝子の放出は不可能であった（Ｉ．Ｎａｙｖｅｌｔ等、「Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２００７年、８巻、４７７−４８４頁）。また従来は、ＭＣＤによって凝縮化されたナノ粒子をパッケージングする技術がなかった。そのため、ＭＣＤによる遺伝子導入は不可能であった。本発明の新たなパッケージング技術によって新しい遺伝子導入技術を提供する事が可能となる。
【００４４】
目的遺伝子の凝縮化一遺伝子ナノ粒子が全体として正に帯電している場合、脂質膜を構成する脂質としてアニオン性脂質（酸性脂質）を使用すれば、目的遺伝子の凝縮化一遺伝子ナノ粒子が保持された脂質膜を効率よく製造する事ができ、目的遺伝子の凝縮化一遺伝子ナノ粒子が全体として負に帯電している場合、脂質膜を構成する脂質としてカチオン性脂質（塩基性脂質）を使用すれば、目的遺伝子の凝縮化一遺伝子ナノ粒子が保持された脂質膜を効率よく製造する事ができる。
【００４５】
本発明の脂質膜構造体が標的とする生物種は特に限定されるものではなく、例えば、動物、植物、微生物等が挙げられるが、動物が好ましく、哺乳動物がさらに好ましい。哺乳動物としては、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、モルモット等が挙げられる。また、本発明の脂質膜構造体が標的とする細胞の種類は特に限定されるものではなく、例えば、体細胞、生殖細胞、幹細胞、ｉＰＳ細胞又はこれらの培養細胞等が挙げられる。
【００４６】
本発明の脂質膜構造体は、例えば、分散液の状態で使用することができる。分散溶媒としては、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を使用することができる。分散液には、例えば、糖類、多価アルコール、水溶性高分子、非イオン界面活性剤、抗酸化剤、ｐＨ調節剤、水和促進剤等の添加剤を添加して使用してもよい。
【００４７】
本発明の脂質膜構造体は、分散液を乾燥（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥等）させた状態で使用することもできる。乾燥させたリポソームは、生理食塩水、リン酸緩衝液，クエン緩衝液，酢酸緩衝液等の緩衝液を加えて分散液とすることができる。
【００４８】
本発明の脂質膜構造体は、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれにおいても使用することもできる。本発明の脂質膜構造体をｉｎ ｖｉｖｏにおいて使用する場合、投与経路としては、例えば、静脈、腹腔内、皮下、経鼻等の非経口投与が挙げられ、投与量及び投与回数は、脂質膜構造体に封入された目的遺伝子の種類や量等に応じて適宜調節することができる。
【実施例】
【００４９】
〔実施例１〕微小かつ均一な凝縮一遺伝子ナノ粒子の形成
（１）ＭＣＤによるナノ粒子の調製
微小かつ均一な凝縮一遺伝子ナノ粒子を形成させるために、モノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ： ＭＣＤ）を用いてプラスミドＤＮＡを凝縮化しナノ粒子とした。スクリーニングに用いたＭＣＤは、メチル基を２つと側鎖Ｒ１、Ｒ２有する４級アンモニウム塩である。側鎖Ｒ１、Ｒ２に関しては表１に示す。
【００５０】
【表１】
【００５１】
１０ ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．４）で０．１ ｍｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ＥＧＦＰ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）水溶液を調製した。ＭＣＤはエタノールに溶解し１ Ｍストック溶液として保存し、使用時に１０ ｍＭ Ｔｒｉｓバッファーで適当なｎｉｔｒｏｇｅｎ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｎ／Ｐ）比（０．１、０．５、１、１０、２５、５０）となるように系列希釈した。ボルテックスしながら、ＭＣＤ溶液に等量のプラスミドＤＮＡ水溶液を穏やかに添加することでナノ粒子を調製した。以下、ＭＣＤにより調製したナノ粒子をｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ＭＣＤ：ＭＣＤ−ＣＤＰという。
【００５２】
（数１）
Ｎ／Ｐ比＝（ＣＭ／ＭＷＰ）／（ＣＤ／ＭＷＤ）
〔式中、ＣＭはＭＣＤ溶液の濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表し、ＭＷＭはＭＣＤの分子量を表し、ＣＤはプラスミドＤＮＡ溶液の濃度（ｍｇ／ｍＬ）を表し、ＭＷＤはプラスミドＤＮＡに含まれるヌクレオチド１つの平均分子量（３１０）を表す。〕
【００５３】
（２）ナノ粒子の粒子径と表面電位測定
調製したＭＣＤ−ＣＤＰの粒子径及び表面電位をそれぞれ動的光散乱法及び電気泳動法を利用した光散乱測定機 （Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ； Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＷＲ，ＵＫ）によって測定した。
【００５４】
調製したＭＣＤ−ＣＤＰの粒子径（ｎｍ）及び表面電位（ｍＶ）を図２に示す。なお、図２ＡはＴｙｐｅ−Ｃ， Ｄからなるナノ粒子、図２ＢはＴｙｐｅ−Ｅからなるナノ粒子、図２ＣはＴｙｐｅ−Ｆからなるナノ粒子の粒子径（ａ）および表面電位（ｂ）を示す。また、図２Ａ（ａ）及び図２Ｂ（ａ）中、□はＮ／Ｐ比＝２５、■はＮ／Ｐ比＝５０で調製したナノ粒子の粒子径を示す。また、図２Ａ（ｂ）中、○はＣ−１、●はＣ−２、□はＤ−１、■はＤ−２のそれぞれのＮ／Ｐ比で調製したナノ粒子の表面電位を示す。図２Ｂ（ｂ）中、○はＥ−１、△はＥ−２、□はＥ−３のそれぞれのＮ／Ｐ比で調製したナノ粒子の表面電位を示す。
【００５５】
図２に示すように、炭素数が１６個の長鎖脂肪鎖を有するＭＣＤ（Ｃ−２、Ｄ−２、Ｅ−３、Ｆ）は微小なナノ粒子を形成することが確認された。さらに、芳香族基と炭素数が１６個の長鎖脂肪鎖を両方持つＭＣＤであるＥ−３、Ｆは最も微小なナノ粒子を調製することが確認された。また、得たナノ粒子はＮ／Ｐ比１０以上で正電荷を有していた。
【００５６】
以上の結果より、ＭＣＤを用いて小さなナノ粒子を形成するためには、炭素数が１６個（またはそれ以上）の長鎖脂肪鎖と芳香族も有するＭＣＤが必要であることが明らかとなった。スクリーニングより得たＥ−３とＦをＭＣＤ−ＣＤＰ形成のためのＭＣＤとして選択した。以下、Ｅ−３のＭＣＤを「ＢＤＨＡＣ」、ＦのＭＣＤを「ＴＢ」という。
【００５７】
（３）ナノ粒子形成の確認
ＢＤＨＡＣ、ＴＢによってｐＤＮＡが安定なナノ粒子を形成するか否かを確認した。調製したナノ粒子に、終濃度１ ｍｇ／ｍＬとなるようにポリアスパラギン酸（ｐＡｓｐ：ＤＮＡをナノ粒子から放出させる試薬）を加え混合した。０．５％アガロースゲルにアプライし、ＴＡＥ （４０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、４０ ｍＭ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、１ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で電気泳動を行った（１００Ｖ，２０分間）。泳動後、エチジウムブロマイド染色によってプラスミドＤＮＡを可視化した。エチジウムブロマイドはプラスミドＤＮＡがナノ粒子を形成するとインターカレートできなくなるので、ナノ粒子化されていないプラスミドＤＮＡとナノ粒子化されたプラスミドＤＮＡを区別することができる。
【００５８】
ＢＤＨＡＣからなるナノ粒子のアガロース電気泳動の結果を図３Ａに示し、ＴＢからなるナノ粒子のアガロース電気泳動の結果を図３Ｂに示す。図３Ａ及び図３Ｂ中、レーン１−６はｐＡｓｐ未処理群を示し、レーン７−１２はｐＡｓｐ処理群を示す。また、レーン１及び７はＮ／Ｐ＝１０で調製したＣＤＰを示し、レーン２及び８はＮ／Ｐ＝１２．５で調製したＣＤＰを示し、レーン３及び９はＮ／Ｐ＝１５で調製したＣＤＰを示し、レーン４及び１０はＮ／Ｐ＝２０で調製したＣＤＰを示し、レーン５及び１１はＮ／Ｐ＝２５で調製したＣＤＰを示し、レーン６及び１２はＮ／Ｐ＝５０で調製したＣＤＰを示す。
【００５９】
図３の結果より、ｐＡｓｐ未処理の時（図３Ａ及び図３Ｂのレーン１−６）、ＢＤＨＡＣ、ＴＢともにＮ／Ｐ比の増加に伴って検出されるプラスミドＤＮＡが減少し、Ｎ／Ｐ比２０以上でプラスミドＤＮＡは検出されなくなった。この結果より、Ｎ／Ｐ比２０以上の時に安定したナノ粒子が形成されていると考えた。さらに、ｐＡｓｐ処理によってプラスミドＤＮＡを放出させた時（図３Ａ及び図３Ｂのレーン７−１２）、Ｎ／Ｐ＝２０、２５でプラスミドＤＮＡが検出されるようになったが、Ｎ／Ｐ＝５０ではプラスミドＤＮＡは観察されなかった。
【００６０】
以上の結果より、ＢＤＨＡＣ、ＴＢより調製したナノ粒子は、Ｎ／Ｐ＝２０以上で形成されていることが確認され、さらにＮ／Ｐ＝２０とＮ／Ｐ＝２５で脱凝縮化が可能な構造をしていることが明らかとなった。核内での効率的なプラスミドＤＮＡの放出を考慮してＮ／Ｐ比＝２０で調製したナノ粒子を脂質膜でパッケージングすることにした。以下、ナノ粒子を「ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｐａｒｔｉｃｌｅ：ＣＤＰ」、ＢＤＨＡＣからなるナノ粒子を「ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰ」、ＴＢからなるナノ粒子を「ＴＢ−ＣＤＰ」という。
【００６１】
〔実施例２〕Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の調製と物性評価
（１）ＭＣＤ−ＣＤＰの脂質膜によるパッケージング
ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰ、ＴＢ−ＣＤＰを有する脂質膜構造体を、単純水和法によって次のように調製した。ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ｄｉｏｌｅｏｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ：ＤＯＰＥ）とコレステリルヘミスクシネート （ｃｈｏｌｅｓｔｅｌｙｌ ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ：ＣＨＥＭＳ）とを９：２（モル比）の割合で有機溶媒（クロロホルム）に溶解した後、ガラス試験管に加え、有機溶媒を除去してガラス試験管底に薄膜を形成させた。そこに、ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰ溶液またはＴＢ−ＣＤＰ溶液を加え、脂質膜を水和させた後、超音波処理によって脂質膜コーティングを行った（総脂質濃度０．５〜０．５５ｍＭ）。
【００６２】
以下、ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰを脂質膜によりコーティングした構造体を「ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）」、ＴＢ−ＣＤＰを脂質膜によりコーティングした構造体を「ＭＥＮＤ（ＴＢ）」という。また、ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）とＭＥＮＤ（ＴＢ）のことを、「ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）」という。
【００６３】
脂質膜によるパッケージングの後に、余剰のＭＣＤを除去した。この操作を行わない場合、ＭＣＤによって脂質膜が溶解されＭＥＮＤ（ＭＣＤ）が崩壊する可能性がある。操作は以下のように行った。ＭＣＤ−ＣＤＰをパッケージングした構造体 ２００ ｕＬをＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ２（以下、疎水性ビーズ、Ｏｒｇａｎｏ；Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）７０ ｍｇへ添加し、２５℃で３０分間インキュベーションした。その後、２，３００ｇ、２５℃で３分間遠心分離を行い、上清を回収した。さらに、同様の操作を２回繰り返した。この操作によって、余剰のＭＣＤが吸着した疎水性ビーズが沈殿に沈むため、上清のＭＥＮＤ（ＭＣＤ）から余剰のＭＣＤを除去することが可能である。
【００６４】
ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）懸濁液１００ｕＬ、ステアリル化オクタアルギニン溶液（ステアリル化オクタアルギニン濃度：２ ｍｇ／ｍＬ，添加量：２．４４ ｕＬ，溶媒：水）を添加し、室温で一定時間インキュベートすることにより、脂質膜にステアリル化オクタアルギニンを分配させた（ステアリル化オクタアルギニンの分配量：総脂質量の５モル％）。こうして、オクタアルギニン（アルギニン８重合体）を表面に有するＭＥＮＤ（ＭＣＤ）を調製した。
【００６５】
以下、オクタアルギニンを表面に有するＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）を「Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）」、オクタアルギニンを表面に有するＭＥＮＤ（ＴＢ）を「Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）」という。また、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）とＲ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）のことを、「Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）」という。
【００６６】
（２）ＭＣＤ−ＣＤＰのパッケージングの確認
ショ糖密度勾配分画法を用いて、ＭＣＤ−ＣＤＰのパッケージングの確認を行った。Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の脂質膜には、０．５モル％ローダミン（Ｒｈｏ）標識化ＤＯＰＥ（励起波長（Ｅｘ）５６０ｎｍ、蛍光波長（Ｅｍ）５９０ｎｍ）を含有させた。Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）懸濁液、またはＲ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）懸濁液、またはＢＤＨＡＣ−ＣＤＰ懸濁液、またはＴＢ−ＭＣＤ懸濁液５００ μＬを不連続ショ糖密度勾配（０−６０％）に重層し、１６０，０００ｇ、２０℃で２時間超遠心処理を行った。超遠心後、上部から１ ｍＬずつフラクションを回収した。脂質はＲｈｏ標識ＤＯＰＥの蛍光強度、プラスミドＤＮＡはｐＡｓｐ処理後のアガロース電気泳動によってそれぞれ定量した。
【００６７】
Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）、ＢＤＨＡＣ−ＣＤＰの脂質とプラスミドＤＮＡの分布を図４Aに示し、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）、ＴＢ−ＣＤＰの脂質とプラスミドDNAの分布を図４Bに示す。
【００６８】
図４より、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の脂質及びプラスミドＤＮＡはともにフラクション６を主としてフラクション６−１０に分布することが確認された。ナノ粒子のみについて評価を行った時と比較すると、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）ともにプラスミドＤＮＡ分布はナノ粒子よりもショ糖密度の小さいフラクションへシフトしていた。脂質エンベロープを有するＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の密度はナノ粒子（ＭＣＤ−ＣＤＰ）よりも小さい事が予想されるため、フラクション６−１０で検出された脂質及びプラスミドＤＮＡのピークはいずれもＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）に由来すると考えられた。この結果より、ナノ粒子を脂質膜でコートしたＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）が構築されていることを確認した。
【００６９】
（３）Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の粒子径の大きさと均一性の評価
Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の粒子径と均一性をポリカチオン（ポリエルリジン：ＰＬＬ）からなるＣＤＰを有するＲ８−ＭＥＮＤ（以下、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）という）と比較した。粒子径は、動的光散乱法を利用して測定した。均一性は、粒子径分布より粒子径分布幅を算出しその値を指標とした。
【００７０】
粒子径を図５Ａに示し、粒子径分布を図５Ｂに示す。図５Ａまたは図５Ｂの（ａ）は、ＣＤＰの値を示し、図５Ａまたは図５Ｂの（ｂ）は、Ｒ８−ＭＥＮＤの値を示す。統計処理は、一元分散分析を用いて行い従来型Ｒ８−ＭＥＮＤとの差をＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ検定により評価した。＊＊は、ｐ＜０．０１で有意な差があることを示す。＊は、ｐ＜０．０５で有意な差があることを示す。
【００７１】
コア粒子を比較した場合、ＭＣＤ−ＣＤＰの粒子径は、ＰＬＬ−ＣＤＰと比較して約４０ｎｍ小さかった（図５Ａ（ａ））。また、粒子径分布幅も有意に小さく、その均一性が示された（図５Ｂ（ａ））。Ｒ８−ＭＥＮＤでの比較を行った場合、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）の粒子径は、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）の半分以下である１２０ｎｍ程度だった（図５Ａ（ｂ））。さらに、パッケージング後にも、ＭＣＤ−ＣＤＰの均一性は保持されていた（図５Ｂ（ｂ））。
【００７２】
図５Ａの結果より、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）と比較して、コア粒子との粒子径増加幅が小さく、少ない数のナノ粒子がパッケージングされている事が示唆された。粒子径の増加幅よりＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は、一遺伝子ナノ粒子を一つだけパッケージングしている可能性が示唆された。また、本方法はＭＣＤをパッケージングの後に除去する調製方法を採用している。一般的に、ディタージェントダイアレシス法によって調製した脂質膜構造体は一枚膜であることが報告されている（Ｗ．Ｌｉ等、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、２００５年、７巻、６７−７９頁）。そのため、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は一枚膜に膜枚数が制御されている可能性がある。
【００７３】
〔実施例３〕Ｒ８−ＭＥＮＤ （ＭＣＤ）の機能評価
（１）遺伝子発現活性能の評価
ヒト子宮頸癌由来のＨｅＬａ細胞を用いて、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の遺伝子発現活性を評価した。本実験では、コントロールとして従来型のＲ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）を用いた。前日に、８×１０４細胞／ｍＬの濃度で２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）に播種したＨｅＬａ細胞の培地を無血清培地と交換した後に、プラスミドＤＮＡ（ルシフェラーゼタンパク質を発現する）０．４ μｇを含むＲ８−ＭＥＮＤを細胞に加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３時間インキュベーションした。その後、血清添加培地と交換し、さらに３７℃、５％ＣＯ２存在下で２１時間インキュベーションした。その後、細胞を０．５ ｍＬのＰＢＳで洗い、７５ μＬのｒｅｐｏｒｔｅｒ ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ （ＰＲＯＭＥＧＡ；ＭＡＤＩＳＯＮ，ＷＩ，ＵＳＡ）で溶解した。−８０℃で２０分間以上インキュベーションした後、１５，０００ｇ、４℃で５分間遠心し５０ μＬを回収した。ルシフェラーゼ活性は細胞ライセート２０ μＬにｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｒｅａｇｅｎｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）５０ μＬを加え、ルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅｒ−ＰＳＮ；ＡＴＴＯ，Ｊａｐａｎ）を用いて測定した。細胞ライセートのタンパク質量はＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （ＰＩＥＲＣＥ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて決定した。
【００７４】
ルシフェラーゼの発現活性を図６に示す。遺伝子発現量は、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙを指標に算出した。ｎａｋｅｄ ｐＤＮＡとは未封入のプラスミドＤＮＡの事を示す。
【００７５】
（数２）
Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＲＬＵ／ｍｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）＝ルシフェラーゼ発現活性（ＲＬＵ／ｍＬ）／蛋白質量（ｍｇ／ｍＬ）
【００７６】
図６の結果より、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＢＤＨＡＣ）及びＲ８−ＭＥＮＤ（ＴＢ）の遺伝子発現能は、ｎａｋｅｄ ｐＤＮＡより４桁も高く、非常に効率的である事が示された。この値は、従来型のＲ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）と同程度の活性を示す。Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）はアデノウイルスと同等の遺伝子発現能を示すことが報告されている。そのため、Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）はウイルスベクターと同等の高い遺伝子発現を有する事が示された。
【００７７】
（２）毒性評価
Ｒ８−ＭＥＮＤの毒性評価を行った。評価は、上記（１）と同様にＨｅＬａ細胞にＲ８−ＭＥＮＤを添加し、２４時間後にタンパク量を測定し、細胞生存率を算出し行った。
【００７８】
（数３）
細胞生存率（％）＝Ｒ８−ＭＥＮＤ処理群の細胞蛋白質量（ｍｇ／ｍＬ）／未処理群の細胞蛋白質量（ｍｇ／ｍＬ）×１００
【００７９】
細胞生存率の評価結果を、図７に示す。−は、余剰のＭＣＤをパッケージング後に除去しなかったＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）を示し、＋は、余剰のＭＣＤをパッケージング後に除去したＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）を示す。
【００８０】
図７よりＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は従来型のＲ８−ＭＥＮＤ（ＰＬＬ）と同様に細胞毒性がないことが示された。また、ＭＣＤを除去しなかった場合には細胞毒性が顕著に表れていることも確認された。このことは、ＭＣＤ−ＣＤＰをパッケージングした後に実施例２で示したようなＭＣＤの除去操作が非常に重要であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
非常に微小なＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）は、核膜孔を透過する新たな戦略が可能となり非分裂細胞への応用が期待される。従って、分裂の遅い細胞への適応が可能となりｉＰＳ細胞などへの応用が期待され再生医療に大きく貢献できる。さらに、均一な粒子径分布は、非ウイルス性遺伝子デリバリーベクターのｉｎ ｖｉｖｏへの応用、製剤化にも大きな利益をもたらすことが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】本発明の脂質膜構造体の実施形態を模式的に示す図である。
【図２】ＭＣＤ−ＣＤＰの粒子径と表面電位を示す図である。
【図３】ＭＣＤ−ＣＤＰのアガロースゲル電気泳動図を示す図である。
【図４】Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の脂質とプラスミドＤＮＡの密度分布を示す図である。
【図５】ＭＣＤ−ＣＤＰとＲ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の粒子径、粒子径分布幅を示す図である。
【図６】Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の遺伝子発現評価を示す図である。
【図７】Ｒ８−ＭＥＮＤ（ＭＣＤ）の毒性評価を示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝縮化された一遺伝子ナノ粒子が脂質膜でパッケージングされていることを特徴とする脂質膜構造体。
【請求項２】
前記一遺伝子ナノ粒子がカチオニックディタージェントによって凝縮化されたことを特徴とする請求項１記載の脂質膜構造体。
【請求項３】
前記カチオニックディタージェントがモノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ：ＭＣＤ）であることを特徴とする請求項２記載の脂質膜構造体。
【請求項４】
凝縮化一遺伝子ナノ粒子が脂質膜パッケージングされた後に、余剰の凝縮化素子が除去されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
上記余剰の凝縮化素子の除去が疎水性ビーズの使用によって行われることを特徴とする請求項４記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
前記ＭＣＤが、１つの長鎖脂肪鎖と１つの芳香族を有する４級アンモニウム塩であることを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載の脂質膜構造体。
【請求項７】
前記ＭＣＤの長鎖脂肪鎖の炭素数が１４〜２０個であることを特徴とする請求項６記載の脂質膜構造体。
【請求項８】
前記ＭＣＤの芳香族の芳香環の数が１〜５個である事を特徴とする請求項６又は７記載の脂質膜構造体。
【請求項９】
リポソームであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの記載の脂質膜構造体。
【請求項１０】
核内へ送達しようとする目的遺伝子を保持していることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の脂質膜構造体。
【請求項１１】
前記目的遺伝子の遺伝子治療用ベクターとであることを特徴とする請求項１０記載の脂質膜構造体。
【請求項１】
凝縮化された一遺伝子ナノ粒子が脂質膜でパッケージングされていることを特徴とする脂質膜構造体。
【請求項２】
前記一遺伝子ナノ粒子がカチオニックディタージェントによって凝縮化されたことを特徴とする請求項１記載の脂質膜構造体。
【請求項３】
前記カチオニックディタージェントがモノカチオニックディタージェント（Ｍｏｎｏｃａｔｉｏｎｉｃ ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ：ＭＣＤ）であることを特徴とする請求項２記載の脂質膜構造体。
【請求項４】
凝縮化一遺伝子ナノ粒子が脂質膜パッケージングされた後に、余剰の凝縮化素子が除去されていることを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
上記余剰の凝縮化素子の除去が疎水性ビーズの使用によって行われることを特徴とする請求項４記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
前記ＭＣＤが、１つの長鎖脂肪鎖と１つの芳香族を有する４級アンモニウム塩であることを特徴とする請求項３〜５のいずれか記載の脂質膜構造体。
【請求項７】
前記ＭＣＤの長鎖脂肪鎖の炭素数が１４〜２０個であることを特徴とする請求項６記載の脂質膜構造体。
【請求項８】
前記ＭＣＤの芳香族の芳香環の数が１〜５個である事を特徴とする請求項６又は７記載の脂質膜構造体。
【請求項９】
リポソームであることを特徴とする請求項１〜８のいずれかの記載の脂質膜構造体。
【請求項１０】
核内へ送達しようとする目的遺伝子を保持していることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の脂質膜構造体。
【請求項１１】
前記目的遺伝子の遺伝子治療用ベクターとであることを特徴とする請求項１０記載の脂質膜構造体。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２００９−２２１１６５（Ｐ２００９−２２１１６５Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−６８２５９（Ｐ２００８−６８２５９）
【出願日】平成２０年３月１７日（２００８．３．１７）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１日（２００９．１０．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月１７日（２００８．３．１７）
【出願人】（５０４１７３４７１）国立大学法人 北海道大学 (971)
【Ｆターム（参考）】
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