三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／ＣｐＧオリゴヌクレオチド／β−１，３−グルカン系三元複合体
【課題】免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いられ得るβ−1,3−グルカン系の三元複合体の製造方法に関し、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させ、反応率を従来の３０倍以上に高め、収率を飛躍的に向上させる三元複合体の製造方法を提供する。
【解決手段】本発明の抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系の三元複合体の製造方法は、側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備える。
【解決手段】本発明の抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系の三元複合体の製造方法は、側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備える。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物の技術分野に属し、特に、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いられ得る三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG DNAまたはCpG ODNと略記）は脊椎動物の免疫システムを活性化することが知られており（非特許文献１−３）、その活性化の初期段階は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、マクロファージ、及びB-細胞によるCpG DNAの細胞認識である。認識されたCpG DNAはエンドサイトーシス経路を通って輸送されるが、その間にファゴソーム様小胞体でトール様受容体9（TLR9）と呼ばれるパターン認識受容体によって認識される（非特許文献４）。このTLR9による認識は、IL-6、TNF−α、IL-12等のサイトカイン産生を誘導するための引き金となり、Th1細胞への分化を促進させる。これらのサイトカインはナチュラルキラー（NK）細胞、樹状細胞等を活性化し（非特許文献５−８）、最終的にIFN−γを産出する。したがって、事実上、CpG DNAとTLR9との相互作用は先天的及び適応型の免疫システムに橋架けしていることになる。最近、CpG DNAと抗原を直接化学結合することによって、効率的な薬理効果が発揮できることが明らかになっている。
【０００３】
例えば、TigheらはEscherichia coli beta-galactosidaseやHIV-1 envelope glycoprotein gp120にCpG ODNを化学結合させてマウスに投与したところ、強力なTh1アジュバントとして働くことを示した（非特許文献９）。また、田村らは、CpG DNAをマウスの気管支喘息モデルの気道局所に前投与することによって，好酸球性炎症とTh2反応を抑制した。この抑制にはCpG DNAと抗原の同時投与が必須であり、CpG DNAと抗原を化学的に結合させ、局所へ前投与した。その結果，本結合体は好酸球性炎症の抑制効果を約百倍増強させ、Th1細胞の誘導効率も同程度に増強させた。以上より、CpGを含むDNAと特異抗原の結合体はアレルギー疾患の新しい治療薬となる可能性が示唆された（非特許文献１０）。
【０００４】
しかしながら、CpG DNA療法には重大な欠点がある。一般に、核酸が単独で生体液の中に露出すると、ヌクレアーゼによる代謝及び血しょう蛋白質との非特異的結合が起こって、直ちに排除される。CpG DNAを実用的な療法に転換するためには、タンパク質とのこれらの好ましくない相互作用を避けることによってCpG DNAを標的細胞に到達させることが本質的に重要である。
【０００５】
そこで、天然型のリン酸バックボーンであるホスホジエステル（phosphodiester：PO）を、S−アナログのホスホロチオエート（Phosphorothioate：PS）に変えることで比較的強いヌクレアーゼ耐性能を付与したものが臨床実験で比較的よく検討されている。しかしながら、補体系で非特異的反応を含む予期されなかった生体反応の細胞障害を引き起こすことが幾つかの最近の研究で指摘された（非特許文献１１−１２）。これらの副作用は、血清タンパク質との非特異的結合及びPSの抗原性により説明されている。そこで、そのようなアナログ型核酸を使用せずに、天然型のリン酸バックボーンを有するCpG DNAでヌクレアーゼ媒介代謝から保護することが望まれている。
【０００６】
β−（1→3）−D−グルカンの主鎖と、各３個のグルコース当りに１個のβ−（1→3）−D−グルコシル側鎖から成るシゾフィラン（以下、SPGと表記する。）と呼ばれる天然多糖類がある（非特許文献１３）。SPGを含むβ−1,3−グルカンに免疫刺激活性があることは従来から知られており、アジュバントとしてワクチンまたは免疫刺激性核酸に添加される例が報告されている（特許文献１及び２）。SPGは婦人科癌に対する免疫増強法の筋肉内注射製剤臨床薬として20年以上の使用実績があり（非特許文献１４及び１５）、生体内での安全性が確認されている（非特許文献１６）。
【０００７】
本発明者らは、上記SPGが１本鎖のホモポリヌクレオチドと新規な複合体を形成することを見出した。そして、この複合体の基本的性質が研究され（非特許文献１７−２０）、その複合体をDNAの輸送に適用した。この複合体がタンパク質との好ましくない相互作用に対してDNAを保護し、その結果、サイトカイン産生を増加させることができることを示し、CpG DNAのキャリヤーとしても適用できる可能性を示している（非特許文献２１−２２、特許文献３及び４）。それらの報告では、古典的なCpG配列のオリゴヌクレオチドのPSアナログの DNAを使用し、それをマクロファージ様細胞のような細胞にin vitroで輸送した。
さらに、本発明者らは、SPGに抗原タンパクを化学結合させた後に、上述した核酸と多糖の複合化能を利用してSPG/抗原タンパク/CpG DNAの3元複合体を作成し、それが、CpG DNAを保護しながら、効果的にTh1細胞の誘導効率を増強させることを示した（非特許文献２３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平９−５０４０００号公報
【特許文献２】特表２００１−５０４０００号公報
【特許文献３】ＷＯ／２００４／１００９６５
【特許文献４】特開２００７−７０３０７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wagner, H.,「Adv. Immunol」, 1999, 73, p.329-368
【非特許文献２】Krieg, A. M.,「Annu. Rev. Immunol」, 2002, 20, p.709-760
【非特許文献３】Yamamoto, S., Yamamoto, T. and Tokunaga, T.,「Springer Semin lmmunopathol」, 2000, 22, 1-2, p.11-19
【非特許文献４】Hemmi, H., Takeuchi, O., Kawai, T., Kaisho, T., Sato, S., Sanjo, H., Matsumoto, M., Hoshino, K., Wagner, H., Takeda, K. and Akira, S.,「Nature」, 2000, 408, 6813, p.740-745
【非特許文献５】Klinman, D. M., Yi, A. K., Beaucage, S. L., Conover, J. and Krieg, A. M.,「Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.」, 1996, 93, 7, p.2879-2883
【非特許文献６】Yamamoto, S, Yamamoto, T., Kataoka, T., Kuramoto, E., Yano, O. and Tokunaga, T.,「J. Immunol」, 1992, 148, 12，p.4072-4076
【非特許文献７】Roman, M, Martin-Orozco, E., Goodman, J．S., Nguyen, M. D., Sato, Y., Ronaghy, A., Kornbluth, R. S., Richman, D. D., Carson, D. A. and Raz, E.,「Nat. Med.」, 1997, 8，p.849-854
【非特許文献８】Sparwasser, T., Miethke, T., Lipford, G., Erdmann, A., Hacker, H., Heeg, K. and Wagner, H.,「Eur. J. Immunol」, 1997, 27, 7, p.1671-1679
【非特許文献９】Tighe, H., Takabayashi, K., Schwartz, D., Marsden, R., Beck, L., Corbeil, J., Richman, D. D., Eiden, J. J. Jr., Spiegelberg, H. L. and Raz, E.,「Eur. J. Immunol」, 2000, 30, 7, p.1939-1947
【非特許文献１０】田村 弦, 佐野公仁夫, 城田英和,「アレルギー・免疫」, 2003, 第10巻, p.1094
【非特許文献１１】Stein, C. A.,「Antisense Nucleic Acid Drug Dev」, 1997, 7, p.207-209
【非特許文献１２】Stein, C. A. and Cheng, Y. C.,「In Science」, 1993, Vo1.261, p. 1004-1012
【非特許文献１３】Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. and Misaki A.,「Carbohydr. Res.」, 1981, 89, 1, p.121-135
【非特許文献１４】清水, 陳, 荷見, 増淵，「Biotherapy」, 1990, 4, p.1390
【非特許文献１５】長谷川，「Oncology and Chemotherapy」, 1992, 8, p.225
【非特許文献１６】Theresa, M. McIntire and David, A. Brant,「J. Am. Chem. Soc.」, 1998, 120, p.6909
【非特許文献１７】Sakurai, K. and Shinkai, S.,「J. Am. Chem. Soc.」, 2000, 122， p.4520-4521
【非特許文献１８】Sakurai, K., Mizu, M. and Shinkai, S.,「Biomaccromolecules」, 2001, 2, 3，p.641-650
【非特許文献１９】Sakurai, K., Uezu, K., Numata, M., Hasegawa, T., Li, C., Kaneko, K. and Shinkai, S.,「Chem. Commun.」, 2005, 35, p.4383-4398
【非特許文献２０】Mizu, M., Koumoto, K., Anada, T., Sakurai, K. and Shinkai, S.,「Biomaterials.」, 2004, 25, 15，p.3117-3123
【非特許文献２１】Mizu, M., Koumoto, K., Anada, T., Matsumoto, T., Numata, M., Shinkai, S., Nagasaki, T. and Sakurai, K.,「J. Am. Chem. Soc.」, 2004, 126, 27，p.8372-8373
【非特許文献２２】Mizu, M., Koumoto, K., Kimura, T., Sakurai, K., and Shinkai, S.,「Biomaterials」, 2004, 25, 15, p.3109-3116
【非特許文献２３】N. Shimada, K. Ishii, Y. Takeda, C. Coban, Y. Torii, S. Shinkai, S. Akira, and K. Sakurai,「Bioconjugate Chem.」, 2006, 17, p.1136-1140
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら上記従来の技術においては、以下のような課題を有していた。
（１）（非特許文献２３）に記載されているSPG/抗原タンパク/CpG DNAの3元複合体の製造方法は、初めにシゾフィラン（SPG）とオボアルブミン（抗原タンパク質。以下、OVAと表記する。）の複合体を調製し、得られた複合体にCpG DNAを結合させて三元複合体を得る方法である。SPGと抗原タンパク質の複合体の調製は、初めにSPGを水に溶解させ、この溶液に過ヨウ素酸ナトリウムを添加した後、５℃で２時間撹拌する。これにより、３重螺旋のβ−1,3−グルカンの1,6−グルコピラノシド分枝の３位と４位若しくは２位と３位の間が切断され、それらの位置にある水酸基がアルデヒドに変換され、側鎖にアルデヒド基（ホルミル基）を有するβ−1,3−グルカンが得られる。次いで、この側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと、OVAと、還元剤としてのシアノ水素化ホウ素ナトリウムとを重炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、室温で14時間撹拌することにより、β−1,3−グルカンの側鎖のホルミル基とOVAのアミノ基との間でのシッフ塩基の形成と還元的アミノ化により、β−1,3−グルカンの側鎖にOVAが共有結合してSPGと抗原タンパク質の複合体を得ることができる。しかし、この調製方法では、非特許文献２３の図２に示すように、SPGへの抗原タンパク質の反応率が極めて低く（本発明者らの実験では、後述するように１％以下）、極めて収率が低いという課題を有していた。これは、３重螺旋のβ−1,3−グルカンは棒状の高分子であり運動性が低いため、抗原タンパク質との反応が遅いことが原因ではないかと推察された。
（２）SPGと抗原タンパク質の複合体の収率が低いため、CpG DNAを結合させて三元複合体を得る際には、SPGと抗原タンパク質の反応物から、目的物をカラム分離により精製する必要があり、操作が極めて煩雑であるとともに生産性に欠けるという課題を有していた。さらに、カラムによる分離を行なう際に、疎水性の高いカラムを用いると抗原タンパク質の高次構造が変性してしまい、抗原としての機能が低下する問題があった。また、通常はカラム生成された溶液は極めて希薄であり濃縮する必要があるが、この濃縮の過程でタンパク質が凝集したり変性したりする等の問題がある。
【００１１】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させ、反応率を従来の３０倍以上に高め、収率を飛躍的に向上させる三元複合体の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性に優れる抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を提供することを目的とする。即ち、本発明の三元複合体を用いることにより、効果的に抗原特異的に免疫反応を誘導することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記従来の課題を解決するために本発明の三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体は、以下の構成を有している。
本発明の請求項１に記載の抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系の三元複合体の製造方法は、側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備えている。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）アルカリ水溶液にβ−1,3−グルカンを溶解すると、β−1,3−グルカンの３重螺旋が１本鎖に解離される。また、β−1,3−グルカンが溶解されたアルカリ水溶液を中和すると、３重螺旋への復帰が生じる。β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備えており、中和に伴いβ−1,3−グルカンが１本鎖から３本螺旋へ復帰する速度が、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応速度に比べて遅く、また中和直後の３重螺旋には欠陥や復帰できない１本鎖部分が数多く残っていると考えられ、さらに抗原タンパク質がアルカリ水溶液で変性するのを中和によって防ぐことができるため、反応工程では、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させ、反応率を高めることができる。また、抗原タンパク質を、有機溶媒を使わず、ｐＨが中性付近の水溶液中で扱うため、タンパク質の変性が大幅に抑えられる。
【００１３】
ここで、β−1,3−グルカンとしては、グルコース環がβ結合で１位と３位の水酸基間が結合した多糖の総称であり、繰り返し単位中に少なくとも１個の１，６−グルコピラノシド分枝を有するものが用いられる。例えば、シゾフィラン、レンチナン、パーマキン、グリホラン、スクレログリカン等を挙げることができる。また、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）やカンジダ菌（Candida albicans）の細胞壁からの抽出物や、アガリクス（Agaricus blaziriensis）由来の比較的長いβ−1,6−グルコシド結合の側鎖を有するβ−1,3−グルカンも用いることができる。さらに、これらの天然由来のβ−1,3−グルカンを化学的に加工して得られる化合物も用いることができる。
なお、CpGオリゴヌクレオチドと安定な三元複合体を形成し、Th1細胞を優位にする効果を発揮させるためには、約２５０００以上の平均分子量にするのが望ましい。
但し、パン酵母やカンジダ菌の細胞壁からの抽出物や、アガリクス由来の比較的長いβ−1,6−グルシド結合の側鎖を有するβ−1,3−グルカンは、水性溶媒に対する溶解性が悪いため、シゾフィラン、レンチナン、パーマキン、グリホラン、スクレログリカン等由来のβ−1,3−グルカンが好適である。
【００１４】
側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンとしては、通常の有機化学の方法を用いβ−1,3−グルカンを化学修飾して得ることができる。例えば、水酸基へのウィリアムソン反応、付加反応、水酸基を酸化して得られるアルデヒド、カルボン酸への付加、縮合反応、水酸基を活性化（ハロゲン化、トシル化、メシル化など）してのウィリアムソン反応などの水酸基を利用した一般的な有機反応等を挙げることができる。
この中で好ましい方法は、β−1,3−グルカンの1,6−グルコピラノシド分枝の過ヨウ素酸酸化である。過ヨウ素酸酸化は、1,2−ジオールを定量的にアルデヒドへと変換する反応であり、使用できる試薬としては、過ヨウ素酸のアルカリ金属塩であれば特に制限はなく、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸ルビジウムなどの中から適当に選択することができる。その中でも、溶解性および価格的な面から過ヨウ素酸ナトリウムがもっとも好ましく用いられる。
過ヨウ素酸酸化反応における溶媒としては、β−1,3−グルカンが溶解し、かつ、反応に影響を与えない極性溶媒であれば特に制限はない。この点を考慮すると、水がもっとも好ましい。これにより、３重螺旋のβ−1,3−グルカンについて過ヨウ素酸酸化を行なうことができる。また、１本鎖のβ−1,3−グルカンについて過ヨウ素酸酸化を行なう場合には、溶媒は極性有機溶媒、特にジメチルスルホキシドが好適である。β−1,3−グルカンの３重螺旋は極性有機溶媒中で１本鎖に解離されるからである。反応温度は過ヨウ素酸の自己分解反応が進行しない条件下であれば特に制限されることはないが、一般的に、反応は０〜５０℃の温度下に行なわれる。
これにより、β−1,3−グルカンの1,6−グルコピラノシド分枝の３位と４位若しくは２位と３位の間が切断され、それらの位置にある水酸基がアルデヒドに変換される。過ヨウ素酸酸化反応の特徴は、1,2−ジオール間のＣ−Ｃ結合のみに反応することにあるが、β−1,3−グルカンの主鎖に1,2−ジオールはないため、過ヨウ素酸酸化反応によって主鎖が切断されたり変性したりすることはない。
【００１５】
抗原タンパク質としては、生体に投与することによって免疫力が増強されワクチン的な効果が期待できるものであれば、特に制限なく用いることができ、例えば、グリアジン，オボムコイド，カゼイン，βラクトグロブリン，オボアルブミン等の抗食物アレルゲン、抗ミトコンドリア抗体に対応した抗原タンパク質群（M1：梅毒、M2：PBC、M7：心筋症）、甲状腺ミクロソームタンパク質、チログリブリン、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）等を用いることができる。
【００１６】
アルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化カルシウム等の水溶液を用いることができる。
アルカリ水溶液の濃度としては、０．１〜１Ｍ／Ｌ好ましくは０．２５〜０．５Ｍ／Ｌが好適である。濃度が０．２５Ｍ／Ｌより低くなるにつれβ−1,3−グルカンの３本螺旋から１本鎖への解離が生じ難く、０．５Ｍ／Ｌより高くなるにつれ、多糖自体の加水分解が起こり、分子量が低下し、この結果Th1細胞を優位にする効果が低下する傾向がみられる。特に、０．１Ｍ／Ｌより低くなるか１Ｍ／Ｌより高くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
反応工程における反応温度としては、抗原タンパク質の変性が生じ難い温度であれば特に制限がなく、例えば、１０〜４０℃が好適である。
【００１７】
反応工程においては、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは、（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なうことができる。
β−1,3−グルカンを溶解させたアルカリ水溶液と、抗原タンパク質を溶解させた酸水溶液とを混合することにより、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なうことができる。
酸水溶液としては、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸等の水溶液を用いることができる。
酸水溶液の濃度としては、０．１〜１Ｍ／Ｌ好ましくは０．２５〜０．５Ｍ／Ｌが好適である。濃度が０．２５Ｍ／Ｌより低くなるにつれ中和力が低下する傾向がみられ、０．５Ｍ／Ｌより高くなるにつれ、抗原タンパク質が変性し易くなり反応性が低下する傾向がみられる。特に、０．１Ｍ／Ｌより低くなるか１Ｍ／Ｌより高くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
【００１８】
また、反応工程においては、β−1,3−グルカンを溶解させたアルカリ水溶液と、抗原タンパク質を緩衝水溶液等に溶解させた溶液とを混合するとともに、酸水溶液を同時に若しくは逐次混合することで、中和を行なうことができる。
また、反応工程において、反応と同時に中和を行なう操作には、β−1,3−グルカンを溶解させたアルカリ水溶液に酸水溶液を混合するとともに、抗原タンパク質を緩衝水溶液等に溶解させた溶液を、酸水溶液と同時に若しくは所定時間内に混合することも含まれる。中和に伴いβ−1,3−グルカンが１本鎖から３本螺旋へ復帰する速度は、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応速度に比べて遅いため、アルカリ水溶液に酸水溶液を混合するとともに、抗原タンパク質の溶液を所定時間内に混合することにより、抗原タンパク質はβ−1,3−グルカンに結合できる。
【００１９】
抗原タンパク質の溶液としては、抗原タンパク質を中性付近のｐＨの緩衝溶液に溶解させた緩衝水溶液が好適である。緩衝溶液としては、トリス塩酸，ＴＥ（トリス，エチレンジアミン四酢酸），ＴＡＥ（トリス，酢酸，エチレンジアミン四酢酸），ＴＢＥ（トリス，ホウ酸，エチレンジアミン四酢酸），ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水），ＨＥＰＥＳ（2-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸）等を挙げることができる。
反応工程において、逐次中和を行なう場合、アルカリ水溶液中でβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応開始から中和されるまでの時間としては、６０分以下が好適である。反応開始から中和されるまでの時間が６０分を超えると、アルカリ水溶液により変性される抗原タンパク質の割合が増大するからである。
【００２０】
本発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記反応工程において結合させ生成された前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンとの複合体を、5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドと非プロトン性有機溶媒中で反応させる構成を有している。
この構成により、請求項１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）抗原タンパク質とβ−1,3−グルカンとの複合体は、非プロトン性有機溶媒中で１本鎖に解離される。非プロトン性有機溶媒中で解離された１本鎖の複合体と、CpGオリゴヌクレオチドの末端に結合したポリ(dA)テールとを結合させ、３重螺旋構造やその他の構造の三元複合体を安定して高収率で製造できる。得られた三元複合体は、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いることができる。また、簡便なワクチンやアジュバントとして使用できる。
【００２１】
ここで、CpGオリゴヌクレオチドは、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドであり、TCGT又はTCGAモチーフを含むＫ−タイプ若しくは3’−末端にGカルテットを有するＤ−タイプ等が用いられる。一般的にプリン-プリン-C-G-ピリミジン-ピリミジンという配列をもつすべてのDNAがこの範疇に含まれる。
CpGオリゴヌクレオチドの5’−末端にポリ(dA)テールを付加するのは、安定した三元複合体を形成させるためである。dA（デオキシアデノシン）の数は特に限定されるものではないが、一般に３０〜８０個好ましくは４０〜６０個である。
各タイプのモチーフは、一つの核酸分子中に複数個存在してもよく、その複数個のタイプが異なるものでも構わない。
【００２２】
非プロトン性有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（DMSO），アセトニトリル，アセトン等を挙げることができ、特にジメチルスルホキシド（DMSO）が好適である。
抗原タンパク質とβ−1,3−グルカンとの複合体を非プロトン性有機溶媒に溶解して１本鎖に解離させ、ポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドの溶液を混合し、例えば５℃で１０〜２４時間保持することにより、三元複合体が形成される。
CpGオリゴヌクレオチドの溶液としては、中性付近のｐＨの緩衝水溶液が好適である。抗原タンパク質とβ−1,3−グルカンとの複合体を溶解させた非プロトン性有機溶媒に、CpGオリゴヌクレオチドを溶解させた緩衝水溶液を混合することにより、非プロトン性有機溶媒中で１本鎖に解離した複合体が、水が混合されることで、β−1,3−グルカン２本とCpGオリゴヌクレオチド１本の３重螺旋構造やその他の構造のCpGオリゴヌクレオチドとの三元複合体となるからである。
緩衝水溶液としては、トリス塩酸，ＴＥ，ＴＡＥ，ＴＢＥ，ＴＢＳ，ＨＥＰＥＳ等の緩衝溶液を挙げることができる。
【００２３】
本発明の請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記反応工程における前記β−1,3−グルカンと前記抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチド又は5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させる構成を有している。
この構成により、請求項１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより、反応工程において、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応に加え、CpGオリゴヌクレオチドのアミノ基との反応が生じ、抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を単一の反応場で操作性良く製造できる。
（２）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場において、アルカリ水溶液中で解離された１本鎖のβ−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドの末端に結合したポリ(dA)テールとを結合させることにより、反応工程において、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応に加え、CpGオリゴヌクレオチドとの反応が生じ、抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を単一の反応場で操作性良く製造できる。
（３）得られた三元複合体は、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いることができる。
【００２４】
ここで、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドや5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドは、酸水溶液若しくは中性付近のｐＨの水溶液に溶解させ、これらの水溶液をアルカリ水溶液に混合することにより、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、CpGオリゴヌクレオチドを共存させることができる。
CpGオリゴヌクレオチドの溶液としては、CpGオリゴヌクレオチドを中性付近のｐＨのトリス塩酸，ＴＥ，ＴＡＥ，ＴＢＥ，ＴＢＳ，ＨＥＰＥＳ等の緩衝溶液に溶解させた緩衝水溶液が好適に用いられる。
酸水溶液としては、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸等の水溶液を用いることができる。
酸水溶液の濃度としては、０．１〜１Ｍ／Ｌ好ましくは０．２５〜０．５Ｍ／Ｌが好適である。濃度が０．２５Ｍ／Ｌより低くなるにつれ中和力が低下する傾向がみられ、０．５Ｍ／Ｌより高くなるにつれ、抗原タンパク質が変性し易くなり反応性が低下する傾向がみられる。特に、０．１Ｍ／Ｌより低くなるか１Ｍ／Ｌより高くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
【００２５】
本発明の請求項４に記載の発明は、請求項２に記載の三元複合体の製造方法であって、前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主として水素結合に基づく非共有性結合である構成を有している。
この構成により、請求項２で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的弱いため、生体内で比較的容易にβ−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとを解離させることができる。
【００２６】
本発明の請求項５に記載の発明は、請求項３に記載の三元複合体の製造方法であって、前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主としてシッフ塩基若しくはアミド結合による構成を有している。
この構成により、請求項３で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドを脱離させることができ、標的指向性を高めることができる。
【００２７】
本発明の請求項６に記載の発明は、請求項１乃至５の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記抗原タンパク質が、オボアルブミン（OVA）である構成を有している。
この構成により、請求項１乃至５の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）オボアルブミン（OVA）は、卵アレルギーにおける主要なアレルゲンと考えられており、アレルギー性疾患の抑制効果を増強させるとともに、Th1細胞の誘導効率も増強させることができる。
【００２８】
本発明の請求項７に記載の発明は、請求項２乃至６の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記CpGオリゴヌクレオチドが、Ｋ−タイプ若しくはＤ−タイプのものである構成を有している。
この構成により、請求項２乃至６の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）CpGオリゴヌクレオチドがＫ−タイプであると、IL-12の産生を強く誘導し、Ｄ−タイプであると、IL-12と同時にINF-αの産生を誘発する。
【００２９】
ここで、Ｋ−タイプのCpGオリゴヌクレオチドとしては、TCGT又はTCGAモチーフを含むものが用いられ、例えば、5’末端に40個のdAが結合され、複数個のCpG をもつK3｛5'−(dA)40−ATCGACTCTCGAGCGTTCTC−3'｝（配列番号１）が挙げられる。
Ｄ−タイプのCpGオリゴヌクレオチドとしては、3’−末端にGカルテットを有するものが用いられ、例えば、D35｛5'−(dA)40−GGTGCATCGATGCAGGGGGG−3'｝（配列番号２）が挙げられる
【００３０】
本発明の請求項８に記載の発明は、請求項１乃至６の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンの結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合による構成を有している。
この構成により、請求項１乃至６の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下で抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性を高めることができる。また、β−1,3−グルカンが抗原タンパク質を覆ったような状態になるため、非特異的吸着や分解酵素による不活性化を防ぎ、生体内での滞留性が向上することが期待される。
【００３１】
本発明の請求項９に記載の抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体は、請求項３に記載の製造方法で得られた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより得られた三元複合体は、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質との結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合によるため、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質との結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性に優れる。DNAは生体内では容易にDNaseによって分解されるが、β−1,3−グルカンと結合することにより、この分解が大幅に抑制される。
【発明の効果】
【００３２】
以上のように、本発明の三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体によれば、以下のような有利な効果が得られる。
請求項１に記載の発明によれば、
（１）β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させることができ、反応率を従来の３０倍以上に高められる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３３】
請求項２に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）非プロトン性有機溶媒中で解離された１本鎖の複合体と、CpGオリゴヌクレオチドの末端に結合したポリ(dA)テールとを結合させ、３重螺旋構造やその他の構造の三元複合体を安定して高収率で製造できる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３４】
請求項３に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応に加え、CpGオリゴヌクレオチドとの反応が生じ、抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を単一の反応場で操作性良く製造できる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３５】
請求項４に記載の発明によれば、請求項２の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的弱いため、生体内で比較的容易にβ−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとを解離させることができる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３６】
請求項５に記載の発明によれば、請求項３の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドを脱離させることができ、標的指向性を高める三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３７】
請求項６に記載の発明によれば、請求項１乃至５の内いずれか１の効果に加え、
（１）アレルギー性疾患の抑制効果を増強させるとともに、Th1細胞の誘導効率も増強させることができる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３８】
請求項７に記載の発明によれば、請求項２乃至６の内いずれか１の効果に加え、
（１）免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に好適な三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３９】
請求項８に記載の発明によれば、請求項１乃至７の内いずれか１の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下で抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性を高める三元複合体の製造方法を提供できる。
【００４０】
請求項９に記載の発明によれば、
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより得られた三元複合体は、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合によるため、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドを脱離させることができ、標的指向性に優れた抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図
【図２】比較例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図
【図３】実施例１と比較例１の溶液をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画した試料の流出時間と吸収値とを示す図
【図４】（ａ）OVAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果 （ｂ）CpG DNAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果
【図５】（ａ）OVAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果 （ｂ）CpG DNAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
文献（A.C.S.38(1), 253(1997);Carbohydrate Research, 89, 121-135(1981)）に記載された方法にて、分子量４５万のシゾフィランを得た。この方法は、最少培地を用いてSchizophyllum commune. Fries(ATCC 44220)を７日間静置培養した後、細胞成分及び不溶残渣を遠心分離して、得られた上清を超音波処理するものである。
このシゾフィラン100mgを水100mlに溶解させた。この溶液を６つに分け、その各々に過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（シゾフィラン側鎖グルコースに対して0％、20％、40%、60%、80％、100％の当量数の水溶液）のいずれかをゆっくりと加え、４℃で２日間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。この試料をそれぞれ、SPG, f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGとよぶ。f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGは、過ヨウ素酸酸化により、シゾフィラン（β−1,3−グルカン）の側鎖にホルミル基を有している。
SPG, f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGの試料各1mgを、0.6NのNaOH 1.0mlに各々溶解し１本鎖に解離させた。１本鎖に解離されたことは、ゲル浸透クロマトグラフ／多角度レーザー光散乱検出器（MALS/GPC，Shodex GPC-101,カラムSB-806M,DAWN HELEOS-A）により、分子量が15万に減少していることにより確認した。
次いで、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との複合体を得るため、これらのアルカリ水溶液の各々に、オボアルブミン（OVA）のトリス塩酸緩衝水溶液（100mg/ml）を2μl添加すると同時に、0.6NのHClを1.0ml添加してアルカリ水溶液を中和した。
【００４３】
図１は実施例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。ウエル（図の上部）に留まっているOVAがSPGと結合して複合体を形成していることを示している。
図１から、f20SPG, f40SPGでは、シゾフィランとオボアルブミンの複合体（SPG-OVA）のバンドがスメア状であるが、f60SPG，f80SPG, f100SPGでは、SPG-OVAが一本のバンドを形成していることがわかる。これは、f60SPG，f80SPG, f100SPG では、シゾフィラン（SPG）にオボアルブミン（OVA）が強固に結合したことを示している。
【００４４】
（比較例１）
実施例１と同様の方法により、シゾフィランからf20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGを合成した後、（非特許文献２３）に記載された方法に従って、OVAを結合させた。具体的には、f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPG の各試料を1mg溶解した水溶液に、それぞれOVAのトリス塩酸緩衝水溶液（100mg/ml）を2μl添加し、それと同時に、還元剤としての水素化ホウ素ナトリウム（NaBH４）100mgを0.1Mの重炭酸ナトリウム水溶液に溶解した溶液を混合した後、室温で14時間撹拌した。
【００４５】
図２は比較例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である
図２からは、未反応のOVAは観測できるが、SPG-OVAの複合体は観測できない。これは、SPGとOVAとの反応性が著しく低いことを示している。
【００４６】
（化学結合率の評価）
次に、実施例１で説明したf40SPGの中和後の溶液と、比較例１で説明したf40SPGの撹拌後の溶液を、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画して、それぞれの吸収を波長240nmで測定した。
図３は実施例１と比較例１の溶液をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画した試料の流出時間と吸収値とを示す図である。なお、図３には光散乱法（90°）で観測したSPGのピークも示した。このピークは、SPG-OVAの重量平均分子量に対応していると考えられる。
図３において、比較例１の大きなピークは、SPGより低分子量である未結合のOVA（フリーOVA）に相当する。一方、実施例１ではフリーOVAに相当するピークが小さくなり、高分子量のSPGに結合したSPG-OVAに相当するピークが大きくなっている。図３に示すフリーOVAに相当するピークの面積（以下、OVAｆという。）と、SPG-OVAに相当するピークの面積（以下、OVAｂという。）とを求め、OVAの結合率｛OVAｂ/（OVAｂ+OVAｆ）｝を算出したところ、実施例１のf40SPGには90％以上のOVAが反応していること（結合率は90％以上）、比較例１のf40SPGには1％以下のOVAしか反応していないこと（結合率は1％以下）が判明した。
以上の実施例から、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なうことにより、反応率を飛躍的に高められることが明らかとなった。
【００４７】
（実施例２）
実施例１で得られたf60SPGとOVAの複合体（以後、f60SPG/OVAという。）に、CpG DNAを反応させる実験を行なった。なお、公知文献（特許第4064108号公報）に明らかなように、SPGのNaOH溶液をHCl溶液で中和することで、dAテールとSPGとの複合化が起きることが知られている。
ここで、本実施例で用いたf60SPG/OVAは、吸光度の測定結果から、SPGの側鎖100残基に対して、約1分子のOVAが結合していることが判明した。
このf60SPG/OVA 1mgを0.6MのNaOH 83 mlに溶解して、f60SPG/OVAの１本鎖のNaOH溶液を作成した。次に、このアルカリ水溶液に0.6M HCl溶液と、5‘端にdAテールがついた配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’のCpG DNA（配列番号３）のトリス塩酸緩衝水溶液49.2ml（DNAの濃度0.16mM）とを同時に添加し反応させた。
円偏光２色性スペクトル（CD）測定によって、反応物はf60SPG/OVA /DNAの三元複合体が形成されていることを確認した。
【００４８】
（実施例３）
実施例１で使用したf60SPG, f80SPGを0.6NのNaOHに溶解し１本鎖に解離させた。この溶液にHClを添加すると同時に、5’端にアミノ基がついたCpG DNA（配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’）（配列番号４）とOVAを、表１の実験No１〜５に示す割合で混合し反応させた。
【００４９】
【表１】
【００５０】
これらの反応物の評価を、アガロースゲル電気泳動によって行った。ただし、OVAとCpG DNAでは分子量に差があるので、OVAを評価する場合は100V , 400 mA , 1.5 h、CpG DNAを評価する場合は100V , 400mA , 20 minの条件で電気泳動を行った。なお、OVAの染色はSimply Blue(登録商標) SafeStain (invitrogen)で行い、CpG DNAの染色はSYBR Gold (invitrogen)で行った。
図４（ａ）はOVAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果であり、図４（ｂ）はCpG DNAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果である。図４に付した１〜５の番号は、表１の第１行に記載した実験No1〜5と対応している。また、ウエル（図の上部）に留まっているOVA若しくはCpG DNAがSPGと結合したものである。
図４から、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより、三元複合体が形成されることが明らかとなった。
なお、実施例１で説明したのと同様に、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によってOVA，CpG DNA，SPGの各ピークの面積を測定し結合率を算出したところ、実験No2ではOVA 100 ％、CpG DNA 58 ％、実験No3ではOVA 100 ％、CpG DNA 48 ％、実験No4ではOVA 100 ％、CpG DNA 35 ％、実験No5ではOVA 100 ％、CpG DNA 29 ％であり、OVAの反応率はほぼ100％であった。
5’−末端にアミノ基を有するCpG DNAに代えて 3’−末端にアミノ基を有するCpG DNAを用いた場合も、ほぼ同様の結果が得られた。
【００５１】
（実施例４）
実施例１で得られたf60SPGの所定量を、0.6NのNaOH 48 mlに溶解し１本鎖に解離させた。このアルカリ水溶液に、HCl（0.6M、48 ml）を添加すると同時に、dAテールがついたCpG DNA（配列番号３）（3g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液と、OVA（100g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液と、を所定量加えて反応させた（実験No１〜５）。表２に、実験No１〜５のf60SPG，OVA，CpG DNAの仕込みのモル比を示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
反応物の評価を、ポリアクリルアミド電気泳動で行った。OVAの染色はSimply Blue（登録商標）SafeStain (invitrogen)で行い、CpG DNAの染色はSYBR Gold (invitrogen)で行った。
図５（ａ）はOVAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果であり、図５（ｂ）はCpG DNAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果である。図５に付した１〜５の番号は、表２に記載したNo１〜５と対応している。
図５（ａ）に示すOVAの染色結果によれば、No３，４，５とf60SPGの量が減少するにつれ、フリーOVAの量が増加する傾向がみられるが、高分子側のバンドも確認できることから、f60SPG とOVAが結合していると考えられる。
図５（ｂ）に示すCpG DNAの染色結果によれば、No３，４，５とf60SPGの量が減少するにつれ、フリーDNAの量が増加する傾向がみられるが、高分子側のバンドが濃くなる傾向がみられることから、f60SPG とCpG DNA も結合していると考えられる。
これらの結果から、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより、三元複合体が形成されていると考えられる。また、高分子側のバンドの濃さから、SPG 1.5分子に対してOVA 1つおよびCpG DNA 2つが複合化していると推察される。
【００５４】
（実施例５）
実施例１で使用したf60SPG 0.5mgを0.6NのNaOH 48 mlに溶解し１本鎖に解離させた。このアルカリ水溶液に、HCl（0.6M、48 ml）を添加した後、定められた時間後に、５‘端にアミノ基がついたCpG DNA（配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’）（配列番号４）（3g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液0.5 mlと、OVA（100g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液1.0 mlと、を加えて反応させた。
これらの反応物の評価を、アガロースゲル電気泳動によって行ったところ、高分子側のバンドが確認された。従って、三元複合体が形成されているものと判断できる。
さらに、実施例１で説明したのと同様に、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によってOVA，CpG DNA，SPGの各ピークの面積を測定し、OVAとDNAの結合率を算出した。
表３に、アルカリ水溶液に塩酸を添加してからOVA及びDNAの溶液を添加するまでの時間と、OVAの結合率（モル％）、DNAの結合率（モル％）との関係を示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
表３より、アルカリ水溶液に塩酸を添加してからOVA及びDNAの溶液を添加するまでの時間が長くなるにつれ、OVAとCpG DNAの結合率が低下する傾向がみられ、60分を超えると、OVAの反応率が50％以下となることがわかる。これは、中和に伴いβ−1,3−グルカンが１本鎖から３重螺旋の棒状の高分子に復帰し、運動性が低下するためであると考えられる。
また、SPGのアルカリ水溶液にOVAを添加してから中和する場合、OVAを添加してから中和するまでの時間が長くなるにつれ、OVAの結合率が低下することも確認した。これは、アルカリ水溶液により変性される抗原タンパク質の割合が増大するためであると考えられる。
【００５７】
（実施例６）
抗ミトコンドリア抗体（AMA）への対応抗原であるM2型抗原を、公知文献（日本生化学会編（1992）「新生化学実験講座 第12巻」東京化学同人）に記載されている方法にて得た。次いで、イムノブロット法にて70kDa, 50kDa, 47kDa, 40kDa の４つの分画を得た。この中で70kDaのタンパク質はM2分画の大部分を占めていた。このM2抗原を、HEPES緩衝水溶液に分散して100mg/mlの溶液を作成した。
実施例１と同様に、f60SPG 1mgを0.6NのNaOH 1.0mlに溶解したアルカリ水溶液に、M2抗原のHEPES緩衝水溶液を2μl添加すると同時に、0.6NのHClを1.0ml添加してアルカリ水溶液を中和した。得られた反応物をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画して、M2抗原（タンパク質）の結合率を算出したところ、80％であった。
また、実施例５と同様に、f60SPG 0.5mgを0.6NのNaOH 48 mlに溶解したアルカリ水溶液に、HCl（0.6M、48 ml）を添加し、20分後に、５‘端にアミノ基がついたCpG DNA（配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’）（配列番号４）（3g/l）のHEPES緩衝水溶液0.5 mlと、M2抗原（100mg/ml）のHEPES緩衝水溶液1.0 mlと、を加えて反応させた。得られた反応物をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画した結果、M2抗原（タンパク質）のM2抗原の結合率は80％、CpG DNAの結合率は35％と算出された。
以上のことから、オボアルブミン（OVA）以外の抗原タンパク質を用いた場合にも、抗原タンパク質／CpG DNA／β−1,3−グルカン系三元複合体を、高い収率で製造できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、医薬組成物の技術分野に属し、Th2細胞関連疾患、特に、アレルギー反応（例えば、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎）を抑制できる薬剤、抗腫瘍（例えば、ガン）効果を期待できる薬剤を提供できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬組成物の技術分野に属し、特に、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いられ得る三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチド（CpG DNAまたはCpG ODNと略記）は脊椎動物の免疫システムを活性化することが知られており（非特許文献１−３）、その活性化の初期段階は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、マクロファージ、及びB-細胞によるCpG DNAの細胞認識である。認識されたCpG DNAはエンドサイトーシス経路を通って輸送されるが、その間にファゴソーム様小胞体でトール様受容体9（TLR9）と呼ばれるパターン認識受容体によって認識される（非特許文献４）。このTLR9による認識は、IL-6、TNF−α、IL-12等のサイトカイン産生を誘導するための引き金となり、Th1細胞への分化を促進させる。これらのサイトカインはナチュラルキラー（NK）細胞、樹状細胞等を活性化し（非特許文献５−８）、最終的にIFN−γを産出する。したがって、事実上、CpG DNAとTLR9との相互作用は先天的及び適応型の免疫システムに橋架けしていることになる。最近、CpG DNAと抗原を直接化学結合することによって、効率的な薬理効果が発揮できることが明らかになっている。
【０００３】
例えば、TigheらはEscherichia coli beta-galactosidaseやHIV-1 envelope glycoprotein gp120にCpG ODNを化学結合させてマウスに投与したところ、強力なTh1アジュバントとして働くことを示した（非特許文献９）。また、田村らは、CpG DNAをマウスの気管支喘息モデルの気道局所に前投与することによって，好酸球性炎症とTh2反応を抑制した。この抑制にはCpG DNAと抗原の同時投与が必須であり、CpG DNAと抗原を化学的に結合させ、局所へ前投与した。その結果，本結合体は好酸球性炎症の抑制効果を約百倍増強させ、Th1細胞の誘導効率も同程度に増強させた。以上より、CpGを含むDNAと特異抗原の結合体はアレルギー疾患の新しい治療薬となる可能性が示唆された（非特許文献１０）。
【０００４】
しかしながら、CpG DNA療法には重大な欠点がある。一般に、核酸が単独で生体液の中に露出すると、ヌクレアーゼによる代謝及び血しょう蛋白質との非特異的結合が起こって、直ちに排除される。CpG DNAを実用的な療法に転換するためには、タンパク質とのこれらの好ましくない相互作用を避けることによってCpG DNAを標的細胞に到達させることが本質的に重要である。
【０００５】
そこで、天然型のリン酸バックボーンであるホスホジエステル（phosphodiester：PO）を、S−アナログのホスホロチオエート（Phosphorothioate：PS）に変えることで比較的強いヌクレアーゼ耐性能を付与したものが臨床実験で比較的よく検討されている。しかしながら、補体系で非特異的反応を含む予期されなかった生体反応の細胞障害を引き起こすことが幾つかの最近の研究で指摘された（非特許文献１１−１２）。これらの副作用は、血清タンパク質との非特異的結合及びPSの抗原性により説明されている。そこで、そのようなアナログ型核酸を使用せずに、天然型のリン酸バックボーンを有するCpG DNAでヌクレアーゼ媒介代謝から保護することが望まれている。
【０００６】
β−（1→3）−D−グルカンの主鎖と、各３個のグルコース当りに１個のβ−（1→3）−D−グルコシル側鎖から成るシゾフィラン（以下、SPGと表記する。）と呼ばれる天然多糖類がある（非特許文献１３）。SPGを含むβ−1,3−グルカンに免疫刺激活性があることは従来から知られており、アジュバントとしてワクチンまたは免疫刺激性核酸に添加される例が報告されている（特許文献１及び２）。SPGは婦人科癌に対する免疫増強法の筋肉内注射製剤臨床薬として20年以上の使用実績があり（非特許文献１４及び１５）、生体内での安全性が確認されている（非特許文献１６）。
【０００７】
本発明者らは、上記SPGが１本鎖のホモポリヌクレオチドと新規な複合体を形成することを見出した。そして、この複合体の基本的性質が研究され（非特許文献１７−２０）、その複合体をDNAの輸送に適用した。この複合体がタンパク質との好ましくない相互作用に対してDNAを保護し、その結果、サイトカイン産生を増加させることができることを示し、CpG DNAのキャリヤーとしても適用できる可能性を示している（非特許文献２１−２２、特許文献３及び４）。それらの報告では、古典的なCpG配列のオリゴヌクレオチドのPSアナログの DNAを使用し、それをマクロファージ様細胞のような細胞にin vitroで輸送した。
さらに、本発明者らは、SPGに抗原タンパクを化学結合させた後に、上述した核酸と多糖の複合化能を利用してSPG/抗原タンパク/CpG DNAの3元複合体を作成し、それが、CpG DNAを保護しながら、効果的にTh1細胞の誘導効率を増強させることを示した（非特許文献２３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特表平９−５０４０００号公報
【特許文献２】特表２００１−５０４０００号公報
【特許文献３】ＷＯ／２００４／１００９６５
【特許文献４】特開２００７−７０３０７号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Wagner, H.,「Adv. Immunol」, 1999, 73, p.329-368
【非特許文献２】Krieg, A. M.,「Annu. Rev. Immunol」, 2002, 20, p.709-760
【非特許文献３】Yamamoto, S., Yamamoto, T. and Tokunaga, T.,「Springer Semin lmmunopathol」, 2000, 22, 1-2, p.11-19
【非特許文献４】Hemmi, H., Takeuchi, O., Kawai, T., Kaisho, T., Sato, S., Sanjo, H., Matsumoto, M., Hoshino, K., Wagner, H., Takeda, K. and Akira, S.,「Nature」, 2000, 408, 6813, p.740-745
【非特許文献５】Klinman, D. M., Yi, A. K., Beaucage, S. L., Conover, J. and Krieg, A. M.,「Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.」, 1996, 93, 7, p.2879-2883
【非特許文献６】Yamamoto, S, Yamamoto, T., Kataoka, T., Kuramoto, E., Yano, O. and Tokunaga, T.,「J. Immunol」, 1992, 148, 12，p.4072-4076
【非特許文献７】Roman, M, Martin-Orozco, E., Goodman, J．S., Nguyen, M. D., Sato, Y., Ronaghy, A., Kornbluth, R. S., Richman, D. D., Carson, D. A. and Raz, E.,「Nat. Med.」, 1997, 8，p.849-854
【非特許文献８】Sparwasser, T., Miethke, T., Lipford, G., Erdmann, A., Hacker, H., Heeg, K. and Wagner, H.,「Eur. J. Immunol」, 1997, 27, 7, p.1671-1679
【非特許文献９】Tighe, H., Takabayashi, K., Schwartz, D., Marsden, R., Beck, L., Corbeil, J., Richman, D. D., Eiden, J. J. Jr., Spiegelberg, H. L. and Raz, E.,「Eur. J. Immunol」, 2000, 30, 7, p.1939-1947
【非特許文献１０】田村 弦, 佐野公仁夫, 城田英和,「アレルギー・免疫」, 2003, 第10巻, p.1094
【非特許文献１１】Stein, C. A.,「Antisense Nucleic Acid Drug Dev」, 1997, 7, p.207-209
【非特許文献１２】Stein, C. A. and Cheng, Y. C.,「In Science」, 1993, Vo1.261, p. 1004-1012
【非特許文献１３】Tabata, K., Ito, W., Kojima, T., Kawabata, S. and Misaki A.,「Carbohydr. Res.」, 1981, 89, 1, p.121-135
【非特許文献１４】清水, 陳, 荷見, 増淵，「Biotherapy」, 1990, 4, p.1390
【非特許文献１５】長谷川，「Oncology and Chemotherapy」, 1992, 8, p.225
【非特許文献１６】Theresa, M. McIntire and David, A. Brant,「J. Am. Chem. Soc.」, 1998, 120, p.6909
【非特許文献１７】Sakurai, K. and Shinkai, S.,「J. Am. Chem. Soc.」, 2000, 122， p.4520-4521
【非特許文献１８】Sakurai, K., Mizu, M. and Shinkai, S.,「Biomaccromolecules」, 2001, 2, 3，p.641-650
【非特許文献１９】Sakurai, K., Uezu, K., Numata, M., Hasegawa, T., Li, C., Kaneko, K. and Shinkai, S.,「Chem. Commun.」, 2005, 35, p.4383-4398
【非特許文献２０】Mizu, M., Koumoto, K., Anada, T., Sakurai, K. and Shinkai, S.,「Biomaterials.」, 2004, 25, 15，p.3117-3123
【非特許文献２１】Mizu, M., Koumoto, K., Anada, T., Matsumoto, T., Numata, M., Shinkai, S., Nagasaki, T. and Sakurai, K.,「J. Am. Chem. Soc.」, 2004, 126, 27，p.8372-8373
【非特許文献２２】Mizu, M., Koumoto, K., Kimura, T., Sakurai, K., and Shinkai, S.,「Biomaterials」, 2004, 25, 15, p.3109-3116
【非特許文献２３】N. Shimada, K. Ishii, Y. Takeda, C. Coban, Y. Torii, S. Shinkai, S. Akira, and K. Sakurai,「Bioconjugate Chem.」, 2006, 17, p.1136-1140
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら上記従来の技術においては、以下のような課題を有していた。
（１）（非特許文献２３）に記載されているSPG/抗原タンパク/CpG DNAの3元複合体の製造方法は、初めにシゾフィラン（SPG）とオボアルブミン（抗原タンパク質。以下、OVAと表記する。）の複合体を調製し、得られた複合体にCpG DNAを結合させて三元複合体を得る方法である。SPGと抗原タンパク質の複合体の調製は、初めにSPGを水に溶解させ、この溶液に過ヨウ素酸ナトリウムを添加した後、５℃で２時間撹拌する。これにより、３重螺旋のβ−1,3−グルカンの1,6−グルコピラノシド分枝の３位と４位若しくは２位と３位の間が切断され、それらの位置にある水酸基がアルデヒドに変換され、側鎖にアルデヒド基（ホルミル基）を有するβ−1,3−グルカンが得られる。次いで、この側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと、OVAと、還元剤としてのシアノ水素化ホウ素ナトリウムとを重炭酸ナトリウム水溶液に溶解し、室温で14時間撹拌することにより、β−1,3−グルカンの側鎖のホルミル基とOVAのアミノ基との間でのシッフ塩基の形成と還元的アミノ化により、β−1,3−グルカンの側鎖にOVAが共有結合してSPGと抗原タンパク質の複合体を得ることができる。しかし、この調製方法では、非特許文献２３の図２に示すように、SPGへの抗原タンパク質の反応率が極めて低く（本発明者らの実験では、後述するように１％以下）、極めて収率が低いという課題を有していた。これは、３重螺旋のβ−1,3−グルカンは棒状の高分子であり運動性が低いため、抗原タンパク質との反応が遅いことが原因ではないかと推察された。
（２）SPGと抗原タンパク質の複合体の収率が低いため、CpG DNAを結合させて三元複合体を得る際には、SPGと抗原タンパク質の反応物から、目的物をカラム分離により精製する必要があり、操作が極めて煩雑であるとともに生産性に欠けるという課題を有していた。さらに、カラムによる分離を行なう際に、疎水性の高いカラムを用いると抗原タンパク質の高次構造が変性してしまい、抗原としての機能が低下する問題があった。また、通常はカラム生成された溶液は極めて希薄であり濃縮する必要があるが、この濃縮の過程でタンパク質が凝集したり変性したりする等の問題がある。
【００１１】
本発明は上記従来の課題を解決するもので、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させ、反応率を従来の３０倍以上に高め、収率を飛躍的に向上させる三元複合体の製造方法を提供することを目的とする。
また、本発明は、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性に優れる抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を提供することを目的とする。即ち、本発明の三元複合体を用いることにより、効果的に抗原特異的に免疫反応を誘導することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記従来の課題を解決するために本発明の三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体は、以下の構成を有している。
本発明の請求項１に記載の抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系の三元複合体の製造方法は、側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備えている。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）アルカリ水溶液にβ−1,3−グルカンを溶解すると、β−1,3−グルカンの３重螺旋が１本鎖に解離される。また、β−1,3−グルカンが溶解されたアルカリ水溶液を中和すると、３重螺旋への復帰が生じる。β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備えており、中和に伴いβ−1,3−グルカンが１本鎖から３本螺旋へ復帰する速度が、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応速度に比べて遅く、また中和直後の３重螺旋には欠陥や復帰できない１本鎖部分が数多く残っていると考えられ、さらに抗原タンパク質がアルカリ水溶液で変性するのを中和によって防ぐことができるため、反応工程では、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させ、反応率を高めることができる。また、抗原タンパク質を、有機溶媒を使わず、ｐＨが中性付近の水溶液中で扱うため、タンパク質の変性が大幅に抑えられる。
【００１３】
ここで、β−1,3−グルカンとしては、グルコース環がβ結合で１位と３位の水酸基間が結合した多糖の総称であり、繰り返し単位中に少なくとも１個の１，６−グルコピラノシド分枝を有するものが用いられる。例えば、シゾフィラン、レンチナン、パーマキン、グリホラン、スクレログリカン等を挙げることができる。また、パン酵母（Saccharomyces cerevisiae）やカンジダ菌（Candida albicans）の細胞壁からの抽出物や、アガリクス（Agaricus blaziriensis）由来の比較的長いβ−1,6−グルコシド結合の側鎖を有するβ−1,3−グルカンも用いることができる。さらに、これらの天然由来のβ−1,3−グルカンを化学的に加工して得られる化合物も用いることができる。
なお、CpGオリゴヌクレオチドと安定な三元複合体を形成し、Th1細胞を優位にする効果を発揮させるためには、約２５０００以上の平均分子量にするのが望ましい。
但し、パン酵母やカンジダ菌の細胞壁からの抽出物や、アガリクス由来の比較的長いβ−1,6−グルシド結合の側鎖を有するβ−1,3−グルカンは、水性溶媒に対する溶解性が悪いため、シゾフィラン、レンチナン、パーマキン、グリホラン、スクレログリカン等由来のβ−1,3−グルカンが好適である。
【００１４】
側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンとしては、通常の有機化学の方法を用いβ−1,3−グルカンを化学修飾して得ることができる。例えば、水酸基へのウィリアムソン反応、付加反応、水酸基を酸化して得られるアルデヒド、カルボン酸への付加、縮合反応、水酸基を活性化（ハロゲン化、トシル化、メシル化など）してのウィリアムソン反応などの水酸基を利用した一般的な有機反応等を挙げることができる。
この中で好ましい方法は、β−1,3−グルカンの1,6−グルコピラノシド分枝の過ヨウ素酸酸化である。過ヨウ素酸酸化は、1,2−ジオールを定量的にアルデヒドへと変換する反応であり、使用できる試薬としては、過ヨウ素酸のアルカリ金属塩であれば特に制限はなく、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウム、過ヨウ素酸ルビジウムなどの中から適当に選択することができる。その中でも、溶解性および価格的な面から過ヨウ素酸ナトリウムがもっとも好ましく用いられる。
過ヨウ素酸酸化反応における溶媒としては、β−1,3−グルカンが溶解し、かつ、反応に影響を与えない極性溶媒であれば特に制限はない。この点を考慮すると、水がもっとも好ましい。これにより、３重螺旋のβ−1,3−グルカンについて過ヨウ素酸酸化を行なうことができる。また、１本鎖のβ−1,3−グルカンについて過ヨウ素酸酸化を行なう場合には、溶媒は極性有機溶媒、特にジメチルスルホキシドが好適である。β−1,3−グルカンの３重螺旋は極性有機溶媒中で１本鎖に解離されるからである。反応温度は過ヨウ素酸の自己分解反応が進行しない条件下であれば特に制限されることはないが、一般的に、反応は０〜５０℃の温度下に行なわれる。
これにより、β−1,3−グルカンの1,6−グルコピラノシド分枝の３位と４位若しくは２位と３位の間が切断され、それらの位置にある水酸基がアルデヒドに変換される。過ヨウ素酸酸化反応の特徴は、1,2−ジオール間のＣ−Ｃ結合のみに反応することにあるが、β−1,3−グルカンの主鎖に1,2−ジオールはないため、過ヨウ素酸酸化反応によって主鎖が切断されたり変性したりすることはない。
【００１５】
抗原タンパク質としては、生体に投与することによって免疫力が増強されワクチン的な効果が期待できるものであれば、特に制限なく用いることができ、例えば、グリアジン，オボムコイド，カゼイン，βラクトグロブリン，オボアルブミン等の抗食物アレルゲン、抗ミトコンドリア抗体に対応した抗原タンパク質群（M1：梅毒、M2：PBC、M7：心筋症）、甲状腺ミクロソームタンパク質、チログリブリン、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）等を用いることができる。
【００１６】
アルカリ水溶液としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、水酸化カルシウム等の水溶液を用いることができる。
アルカリ水溶液の濃度としては、０．１〜１Ｍ／Ｌ好ましくは０．２５〜０．５Ｍ／Ｌが好適である。濃度が０．２５Ｍ／Ｌより低くなるにつれβ−1,3−グルカンの３本螺旋から１本鎖への解離が生じ難く、０．５Ｍ／Ｌより高くなるにつれ、多糖自体の加水分解が起こり、分子量が低下し、この結果Th1細胞を優位にする効果が低下する傾向がみられる。特に、０．１Ｍ／Ｌより低くなるか１Ｍ／Ｌより高くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
反応工程における反応温度としては、抗原タンパク質の変性が生じ難い温度であれば特に制限がなく、例えば、１０〜４０℃が好適である。
【００１７】
反応工程においては、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは、（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なうことができる。
β−1,3−グルカンを溶解させたアルカリ水溶液と、抗原タンパク質を溶解させた酸水溶液とを混合することにより、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なうことができる。
酸水溶液としては、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸等の水溶液を用いることができる。
酸水溶液の濃度としては、０．１〜１Ｍ／Ｌ好ましくは０．２５〜０．５Ｍ／Ｌが好適である。濃度が０．２５Ｍ／Ｌより低くなるにつれ中和力が低下する傾向がみられ、０．５Ｍ／Ｌより高くなるにつれ、抗原タンパク質が変性し易くなり反応性が低下する傾向がみられる。特に、０．１Ｍ／Ｌより低くなるか１Ｍ／Ｌより高くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
【００１８】
また、反応工程においては、β−1,3−グルカンを溶解させたアルカリ水溶液と、抗原タンパク質を緩衝水溶液等に溶解させた溶液とを混合するとともに、酸水溶液を同時に若しくは逐次混合することで、中和を行なうことができる。
また、反応工程において、反応と同時に中和を行なう操作には、β−1,3−グルカンを溶解させたアルカリ水溶液に酸水溶液を混合するとともに、抗原タンパク質を緩衝水溶液等に溶解させた溶液を、酸水溶液と同時に若しくは所定時間内に混合することも含まれる。中和に伴いβ−1,3−グルカンが１本鎖から３本螺旋へ復帰する速度は、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応速度に比べて遅いため、アルカリ水溶液に酸水溶液を混合するとともに、抗原タンパク質の溶液を所定時間内に混合することにより、抗原タンパク質はβ−1,3−グルカンに結合できる。
【００１９】
抗原タンパク質の溶液としては、抗原タンパク質を中性付近のｐＨの緩衝溶液に溶解させた緩衝水溶液が好適である。緩衝溶液としては、トリス塩酸，ＴＥ（トリス，エチレンジアミン四酢酸），ＴＡＥ（トリス，酢酸，エチレンジアミン四酢酸），ＴＢＥ（トリス，ホウ酸，エチレンジアミン四酢酸），ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水），ＨＥＰＥＳ（2-〔4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル〕エタンスルホン酸）等を挙げることができる。
反応工程において、逐次中和を行なう場合、アルカリ水溶液中でβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応開始から中和されるまでの時間としては、６０分以下が好適である。反応開始から中和されるまでの時間が６０分を超えると、アルカリ水溶液により変性される抗原タンパク質の割合が増大するからである。
【００２０】
本発明の請求項２に記載の発明は、請求項１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記反応工程において結合させ生成された前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンとの複合体を、5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドと非プロトン性有機溶媒中で反応させる構成を有している。
この構成により、請求項１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）抗原タンパク質とβ−1,3−グルカンとの複合体は、非プロトン性有機溶媒中で１本鎖に解離される。非プロトン性有機溶媒中で解離された１本鎖の複合体と、CpGオリゴヌクレオチドの末端に結合したポリ(dA)テールとを結合させ、３重螺旋構造やその他の構造の三元複合体を安定して高収率で製造できる。得られた三元複合体は、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いることができる。また、簡便なワクチンやアジュバントとして使用できる。
【００２１】
ここで、CpGオリゴヌクレオチドは、非メチル化CpG配列を含むオリゴヌクレオチドであり、TCGT又はTCGAモチーフを含むＫ−タイプ若しくは3’−末端にGカルテットを有するＤ−タイプ等が用いられる。一般的にプリン-プリン-C-G-ピリミジン-ピリミジンという配列をもつすべてのDNAがこの範疇に含まれる。
CpGオリゴヌクレオチドの5’−末端にポリ(dA)テールを付加するのは、安定した三元複合体を形成させるためである。dA（デオキシアデノシン）の数は特に限定されるものではないが、一般に３０〜８０個好ましくは４０〜６０個である。
各タイプのモチーフは、一つの核酸分子中に複数個存在してもよく、その複数個のタイプが異なるものでも構わない。
【００２２】
非プロトン性有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（DMSO），アセトニトリル，アセトン等を挙げることができ、特にジメチルスルホキシド（DMSO）が好適である。
抗原タンパク質とβ−1,3−グルカンとの複合体を非プロトン性有機溶媒に溶解して１本鎖に解離させ、ポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドの溶液を混合し、例えば５℃で１０〜２４時間保持することにより、三元複合体が形成される。
CpGオリゴヌクレオチドの溶液としては、中性付近のｐＨの緩衝水溶液が好適である。抗原タンパク質とβ−1,3−グルカンとの複合体を溶解させた非プロトン性有機溶媒に、CpGオリゴヌクレオチドを溶解させた緩衝水溶液を混合することにより、非プロトン性有機溶媒中で１本鎖に解離した複合体が、水が混合されることで、β−1,3−グルカン２本とCpGオリゴヌクレオチド１本の３重螺旋構造やその他の構造のCpGオリゴヌクレオチドとの三元複合体となるからである。
緩衝水溶液としては、トリス塩酸，ＴＥ，ＴＡＥ，ＴＢＥ，ＴＢＳ，ＨＥＰＥＳ等の緩衝溶液を挙げることができる。
【００２３】
本発明の請求項３に記載の発明は、請求項１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記反応工程における前記β−1,3−グルカンと前記抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチド又は5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させる構成を有している。
この構成により、請求項１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより、反応工程において、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応に加え、CpGオリゴヌクレオチドのアミノ基との反応が生じ、抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を単一の反応場で操作性良く製造できる。
（２）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場において、アルカリ水溶液中で解離された１本鎖のβ−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドの末端に結合したポリ(dA)テールとを結合させることにより、反応工程において、β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応に加え、CpGオリゴヌクレオチドとの反応が生じ、抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を単一の反応場で操作性良く製造できる。
（３）得られた三元複合体は、免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に用いることができる。
【００２４】
ここで、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドや5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドは、酸水溶液若しくは中性付近のｐＨの水溶液に溶解させ、これらの水溶液をアルカリ水溶液に混合することにより、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、CpGオリゴヌクレオチドを共存させることができる。
CpGオリゴヌクレオチドの溶液としては、CpGオリゴヌクレオチドを中性付近のｐＨのトリス塩酸，ＴＥ，ＴＡＥ，ＴＢＥ，ＴＢＳ，ＨＥＰＥＳ等の緩衝溶液に溶解させた緩衝水溶液が好適に用いられる。
酸水溶液としては、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、クエン酸等の水溶液を用いることができる。
酸水溶液の濃度としては、０．１〜１Ｍ／Ｌ好ましくは０．２５〜０．５Ｍ／Ｌが好適である。濃度が０．２５Ｍ／Ｌより低くなるにつれ中和力が低下する傾向がみられ、０．５Ｍ／Ｌより高くなるにつれ、抗原タンパク質が変性し易くなり反応性が低下する傾向がみられる。特に、０．１Ｍ／Ｌより低くなるか１Ｍ／Ｌより高くなると、これらの傾向が著しくなるため、いずれも好ましくない。
【００２５】
本発明の請求項４に記載の発明は、請求項２に記載の三元複合体の製造方法であって、前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主として水素結合に基づく非共有性結合である構成を有している。
この構成により、請求項２で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的弱いため、生体内で比較的容易にβ−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとを解離させることができる。
【００２６】
本発明の請求項５に記載の発明は、請求項３に記載の三元複合体の製造方法であって、前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主としてシッフ塩基若しくはアミド結合による構成を有している。
この構成により、請求項３で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドを脱離させることができ、標的指向性を高めることができる。
【００２７】
本発明の請求項６に記載の発明は、請求項１乃至５の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記抗原タンパク質が、オボアルブミン（OVA）である構成を有している。
この構成により、請求項１乃至５の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）オボアルブミン（OVA）は、卵アレルギーにおける主要なアレルゲンと考えられており、アレルギー性疾患の抑制効果を増強させるとともに、Th1細胞の誘導効率も増強させることができる。
【００２８】
本発明の請求項７に記載の発明は、請求項２乃至６の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記CpGオリゴヌクレオチドが、Ｋ−タイプ若しくはＤ−タイプのものである構成を有している。
この構成により、請求項２乃至６の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）CpGオリゴヌクレオチドがＫ−タイプであると、IL-12の産生を強く誘導し、Ｄ−タイプであると、IL-12と同時にINF-αの産生を誘発する。
【００２９】
ここで、Ｋ−タイプのCpGオリゴヌクレオチドとしては、TCGT又はTCGAモチーフを含むものが用いられ、例えば、5’末端に40個のdAが結合され、複数個のCpG をもつK3｛5'−(dA)40−ATCGACTCTCGAGCGTTCTC−3'｝（配列番号１）が挙げられる。
Ｄ−タイプのCpGオリゴヌクレオチドとしては、3’−末端にGカルテットを有するものが用いられ、例えば、D35｛5'−(dA)40−GGTGCATCGATGCAGGGGGG−3'｝（配列番号２）が挙げられる
【００３０】
本発明の請求項８に記載の発明は、請求項１乃至６の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法であって、前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンの結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合による構成を有している。
この構成により、請求項１乃至６の内いずれか１で得られる作用に加え、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下で抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性を高めることができる。また、β−1,3−グルカンが抗原タンパク質を覆ったような状態になるため、非特異的吸着や分解酵素による不活性化を防ぎ、生体内での滞留性が向上することが期待される。
【００３１】
本発明の請求項９に記載の抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体は、請求項３に記載の製造方法で得られた構成を有している。
この構成により、以下のような作用が得られる。
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより得られた三元複合体は、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質との結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合によるため、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質との結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドや抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性に優れる。DNAは生体内では容易にDNaseによって分解されるが、β−1,3−グルカンと結合することにより、この分解が大幅に抑制される。
【発明の効果】
【００３２】
以上のように、本発明の三元複合体の製造方法及び抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体によれば、以下のような有利な効果が得られる。
請求項１に記載の発明によれば、
（１）β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応を容易に進行させることができ、反応率を従来の３０倍以上に高められる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３３】
請求項２に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）非プロトン性有機溶媒中で解離された１本鎖の複合体と、CpGオリゴヌクレオチドの末端に結合したポリ(dA)テールとを結合させ、３重螺旋構造やその他の構造の三元複合体を安定して高収率で製造できる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３４】
請求項３に記載の発明によれば、請求項１の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンのホルミル基と抗原タンパク質のアミノ基との反応に加え、CpGオリゴヌクレオチドとの反応が生じ、抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を単一の反応場で操作性良く製造できる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３５】
請求項４に記載の発明によれば、請求項２の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的弱いため、生体内で比較的容易にβ−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとを解離させることができる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３６】
請求項５に記載の発明によれば、請求項３の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドを脱離させることができ、標的指向性を高める三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３７】
請求項６に記載の発明によれば、請求項１乃至５の内いずれか１の効果に加え、
（１）アレルギー性疾患の抑制効果を増強させるとともに、Th1細胞の誘導効率も増強させることができる三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３８】
請求項７に記載の発明によれば、請求項２乃至６の内いずれか１の効果に加え、
（１）免疫系におけるTh1細胞とTh2細胞のバランスを調節してTh2細胞関連疾患の予防や治療に好適な三元複合体の製造方法を提供できる。
【００３９】
請求項８に記載の発明によれば、請求項１乃至７の内いずれか１の効果に加え、
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下で抗原タンパク質を脱離させることができ、標的指向性を高める三元複合体の製造方法を提供できる。
【００４０】
請求項９に記載の発明によれば、
（１）β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端若しくは3’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより得られた三元複合体は、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合によるため、β−1,3−グルカンとCpGオリゴヌクレオチドとの結合力が比較的強く、生体内で加水分解等を受け得るような条件下でCpGオリゴヌクレオチドを脱離させることができ、標的指向性に優れた抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】実施例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図
【図２】比較例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図
【図３】実施例１と比較例１の溶液をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画した試料の流出時間と吸収値とを示す図
【図４】（ａ）OVAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果 （ｂ）CpG DNAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果
【図５】（ａ）OVAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果 （ｂ）CpG DNAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果
【発明を実施するための形態】
【００４２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
文献（A.C.S.38(1), 253(1997);Carbohydrate Research, 89, 121-135(1981)）に記載された方法にて、分子量４５万のシゾフィランを得た。この方法は、最少培地を用いてSchizophyllum commune. Fries(ATCC 44220)を７日間静置培養した後、細胞成分及び不溶残渣を遠心分離して、得られた上清を超音波処理するものである。
このシゾフィラン100mgを水100mlに溶解させた。この溶液を６つに分け、その各々に過ヨウ素酸ナトリウム水溶液（シゾフィラン側鎖グルコースに対して0％、20％、40%、60%、80％、100％の当量数の水溶液）のいずれかをゆっくりと加え、４℃で２日間撹拌した。反応溶液を透析膜（排除限界12000）で透析後、凍結乾燥した。この試料をそれぞれ、SPG, f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGとよぶ。f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGは、過ヨウ素酸酸化により、シゾフィラン（β−1,3−グルカン）の側鎖にホルミル基を有している。
SPG, f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGの試料各1mgを、0.6NのNaOH 1.0mlに各々溶解し１本鎖に解離させた。１本鎖に解離されたことは、ゲル浸透クロマトグラフ／多角度レーザー光散乱検出器（MALS/GPC，Shodex GPC-101,カラムSB-806M,DAWN HELEOS-A）により、分子量が15万に減少していることにより確認した。
次いで、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との複合体を得るため、これらのアルカリ水溶液の各々に、オボアルブミン（OVA）のトリス塩酸緩衝水溶液（100mg/ml）を2μl添加すると同時に、0.6NのHClを1.0ml添加してアルカリ水溶液を中和した。
【００４３】
図１は実施例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。ウエル（図の上部）に留まっているOVAがSPGと結合して複合体を形成していることを示している。
図１から、f20SPG, f40SPGでは、シゾフィランとオボアルブミンの複合体（SPG-OVA）のバンドがスメア状であるが、f60SPG，f80SPG, f100SPGでは、SPG-OVAが一本のバンドを形成していることがわかる。これは、f60SPG，f80SPG, f100SPG では、シゾフィラン（SPG）にオボアルブミン（OVA）が強固に結合したことを示している。
【００４４】
（比較例１）
実施例１と同様の方法により、シゾフィランからf20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPGを合成した後、（非特許文献２３）に記載された方法に従って、OVAを結合させた。具体的には、f20SPG, f40SPG, f60SPG, f80SPG, f100SPG の各試料を1mg溶解した水溶液に、それぞれOVAのトリス塩酸緩衝水溶液（100mg/ml）を2μl添加し、それと同時に、還元剤としての水素化ホウ素ナトリウム（NaBH４）100mgを0.1Mの重炭酸ナトリウム水溶液に溶解した溶液を混合した後、室温で14時間撹拌した。
【００４５】
図２は比較例１における反応物のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である
図２からは、未反応のOVAは観測できるが、SPG-OVAの複合体は観測できない。これは、SPGとOVAとの反応性が著しく低いことを示している。
【００４６】
（化学結合率の評価）
次に、実施例１で説明したf40SPGの中和後の溶液と、比較例１で説明したf40SPGの撹拌後の溶液を、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画して、それぞれの吸収を波長240nmで測定した。
図３は実施例１と比較例１の溶液をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画した試料の流出時間と吸収値とを示す図である。なお、図３には光散乱法（90°）で観測したSPGのピークも示した。このピークは、SPG-OVAの重量平均分子量に対応していると考えられる。
図３において、比較例１の大きなピークは、SPGより低分子量である未結合のOVA（フリーOVA）に相当する。一方、実施例１ではフリーOVAに相当するピークが小さくなり、高分子量のSPGに結合したSPG-OVAに相当するピークが大きくなっている。図３に示すフリーOVAに相当するピークの面積（以下、OVAｆという。）と、SPG-OVAに相当するピークの面積（以下、OVAｂという。）とを求め、OVAの結合率｛OVAｂ/（OVAｂ+OVAｆ）｝を算出したところ、実施例１のf40SPGには90％以上のOVAが反応していること（結合率は90％以上）、比較例１のf40SPGには1％以下のOVAしか反応していないこと（結合率は1％以下）が判明した。
以上の実施例から、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なうことにより、反応率を飛躍的に高められることが明らかとなった。
【００４７】
（実施例２）
実施例１で得られたf60SPGとOVAの複合体（以後、f60SPG/OVAという。）に、CpG DNAを反応させる実験を行なった。なお、公知文献（特許第4064108号公報）に明らかなように、SPGのNaOH溶液をHCl溶液で中和することで、dAテールとSPGとの複合化が起きることが知られている。
ここで、本実施例で用いたf60SPG/OVAは、吸光度の測定結果から、SPGの側鎖100残基に対して、約1分子のOVAが結合していることが判明した。
このf60SPG/OVA 1mgを0.6MのNaOH 83 mlに溶解して、f60SPG/OVAの１本鎖のNaOH溶液を作成した。次に、このアルカリ水溶液に0.6M HCl溶液と、5‘端にdAテールがついた配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’のCpG DNA（配列番号３）のトリス塩酸緩衝水溶液49.2ml（DNAの濃度0.16mM）とを同時に添加し反応させた。
円偏光２色性スペクトル（CD）測定によって、反応物はf60SPG/OVA /DNAの三元複合体が形成されていることを確認した。
【００４８】
（実施例３）
実施例１で使用したf60SPG, f80SPGを0.6NのNaOHに溶解し１本鎖に解離させた。この溶液にHClを添加すると同時に、5’端にアミノ基がついたCpG DNA（配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’）（配列番号４）とOVAを、表１の実験No１〜５に示す割合で混合し反応させた。
【００４９】
【表１】
【００５０】
これらの反応物の評価を、アガロースゲル電気泳動によって行った。ただし、OVAとCpG DNAでは分子量に差があるので、OVAを評価する場合は100V , 400 mA , 1.5 h、CpG DNAを評価する場合は100V , 400mA , 20 minの条件で電気泳動を行った。なお、OVAの染色はSimply Blue(登録商標) SafeStain (invitrogen)で行い、CpG DNAの染色はSYBR Gold (invitrogen)で行った。
図４（ａ）はOVAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果であり、図４（ｂ）はCpG DNAについて評価したアガロースゲル電気泳動の結果である。図４に付した１〜５の番号は、表１の第１行に記載した実験No1〜5と対応している。また、ウエル（図の上部）に留まっているOVA若しくはCpG DNAがSPGと結合したものである。
図４から、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより、三元複合体が形成されることが明らかとなった。
なお、実施例１で説明したのと同様に、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によってOVA，CpG DNA，SPGの各ピークの面積を測定し結合率を算出したところ、実験No2ではOVA 100 ％、CpG DNA 58 ％、実験No3ではOVA 100 ％、CpG DNA 48 ％、実験No4ではOVA 100 ％、CpG DNA 35 ％、実験No5ではOVA 100 ％、CpG DNA 29 ％であり、OVAの反応率はほぼ100％であった。
5’−末端にアミノ基を有するCpG DNAに代えて 3’−末端にアミノ基を有するCpG DNAを用いた場合も、ほぼ同様の結果が得られた。
【００５１】
（実施例４）
実施例１で得られたf60SPGの所定量を、0.6NのNaOH 48 mlに溶解し１本鎖に解離させた。このアルカリ水溶液に、HCl（0.6M、48 ml）を添加すると同時に、dAテールがついたCpG DNA（配列番号３）（3g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液と、OVA（100g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液と、を所定量加えて反応させた（実験No１〜５）。表２に、実験No１〜５のf60SPG，OVA，CpG DNAの仕込みのモル比を示す。
【００５２】
【表２】
【００５３】
反応物の評価を、ポリアクリルアミド電気泳動で行った。OVAの染色はSimply Blue（登録商標）SafeStain (invitrogen)で行い、CpG DNAの染色はSYBR Gold (invitrogen)で行った。
図５（ａ）はOVAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果であり、図５（ｂ）はCpG DNAについて評価したポリアクリルアミド電気泳動の結果である。図５に付した１〜５の番号は、表２に記載したNo１〜５と対応している。
図５（ａ）に示すOVAの染色結果によれば、No３，４，５とf60SPGの量が減少するにつれ、フリーOVAの量が増加する傾向がみられるが、高分子側のバンドも確認できることから、f60SPG とOVAが結合していると考えられる。
図５（ｂ）に示すCpG DNAの染色結果によれば、No３，４，５とf60SPGの量が減少するにつれ、フリーDNAの量が増加する傾向がみられるが、高分子側のバンドが濃くなる傾向がみられることから、f60SPG とCpG DNA も結合していると考えられる。
これらの結果から、β−1,3−グルカンと抗原タンパク質との反応場に、5’−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることにより、三元複合体が形成されていると考えられる。また、高分子側のバンドの濃さから、SPG 1.5分子に対してOVA 1つおよびCpG DNA 2つが複合化していると推察される。
【００５４】
（実施例５）
実施例１で使用したf60SPG 0.5mgを0.6NのNaOH 48 mlに溶解し１本鎖に解離させた。このアルカリ水溶液に、HCl（0.6M、48 ml）を添加した後、定められた時間後に、５‘端にアミノ基がついたCpG DNA（配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’）（配列番号４）（3g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液0.5 mlと、OVA（100g/l）のトリス塩酸緩衝水溶液1.0 mlと、を加えて反応させた。
これらの反応物の評価を、アガロースゲル電気泳動によって行ったところ、高分子側のバンドが確認された。従って、三元複合体が形成されているものと判断できる。
さらに、実施例１で説明したのと同様に、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によってOVA，CpG DNA，SPGの各ピークの面積を測定し、OVAとDNAの結合率を算出した。
表３に、アルカリ水溶液に塩酸を添加してからOVA及びDNAの溶液を添加するまでの時間と、OVAの結合率（モル％）、DNAの結合率（モル％）との関係を示す。
【００５５】
【表３】
【００５６】
表３より、アルカリ水溶液に塩酸を添加してからOVA及びDNAの溶液を添加するまでの時間が長くなるにつれ、OVAとCpG DNAの結合率が低下する傾向がみられ、60分を超えると、OVAの反応率が50％以下となることがわかる。これは、中和に伴いβ−1,3−グルカンが１本鎖から３重螺旋の棒状の高分子に復帰し、運動性が低下するためであると考えられる。
また、SPGのアルカリ水溶液にOVAを添加してから中和する場合、OVAを添加してから中和するまでの時間が長くなるにつれ、OVAの結合率が低下することも確認した。これは、アルカリ水溶液により変性される抗原タンパク質の割合が増大するためであると考えられる。
【００５７】
（実施例６）
抗ミトコンドリア抗体（AMA）への対応抗原であるM2型抗原を、公知文献（日本生化学会編（1992）「新生化学実験講座 第12巻」東京化学同人）に記載されている方法にて得た。次いで、イムノブロット法にて70kDa, 50kDa, 47kDa, 40kDa の４つの分画を得た。この中で70kDaのタンパク質はM2分画の大部分を占めていた。このM2抗原を、HEPES緩衝水溶液に分散して100mg/mlの溶液を作成した。
実施例１と同様に、f60SPG 1mgを0.6NのNaOH 1.0mlに溶解したアルカリ水溶液に、M2抗原のHEPES緩衝水溶液を2μl添加すると同時に、0.6NのHClを1.0ml添加してアルカリ水溶液を中和した。得られた反応物をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画して、M2抗原（タンパク質）の結合率を算出したところ、80％であった。
また、実施例５と同様に、f60SPG 0.5mgを0.6NのNaOH 48 mlに溶解したアルカリ水溶液に、HCl（0.6M、48 ml）を添加し、20分後に、５‘端にアミノ基がついたCpG DNA（配列5’-TCCATGACGTTCCTGATG-3’）（配列番号４）（3g/l）のHEPES緩衝水溶液0.5 mlと、M2抗原（100mg/ml）のHEPES緩衝水溶液1.0 mlと、を加えて反応させた。得られた反応物をゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）で分画した結果、M2抗原（タンパク質）のM2抗原の結合率は80％、CpG DNAの結合率は35％と算出された。
以上のことから、オボアルブミン（OVA）以外の抗原タンパク質を用いた場合にも、抗原タンパク質／CpG DNA／β−1,3−グルカン系三元複合体を、高い収率で製造できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は、医薬組成物の技術分野に属し、Th2細胞関連疾患、特に、アレルギー反応（例えば、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎）を抑制できる薬剤、抗腫瘍（例えば、ガン）効果を期待できる薬剤を提供できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系の三元複合体の製造方法であって、
側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備えていることを特徴とする三元複合体の製造方法。
【請求項２】
前記反応工程において結合させ生成された前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンとの複合体を、5'−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドと非プロトン性有機溶媒中で反応させることを特徴とする請求項１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項３】
前記反応工程における前記β−1,3−グルカンと前記抗原タンパク質との反応場に、5'−末端若しくは3'−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチド又は5'−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることを特徴とする請求項１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項４】
前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主として水素結合に基づく非共有性結合であることを特徴とする請求項２に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項５】
前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主としてシッフ塩基若しくはアミド結合によることを特徴とする請求項３に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項６】
前記抗原タンパク質が、オボアルブミン（OVA）であることを特徴とする請求項１乃至５の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項７】
前記CpGオリゴヌクレオチドが、K−タイプ若しくはD−タイプのものであることを特徴とする請求項２乃至６の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項８】
前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンの結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合によることを特徴とする請求項１乃至７の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項９】
請求項３に記載の製造方法で得られた抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体。
【請求項１】
抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系の三元複合体の製造方法であって、
側鎖にホルミル基を有するβ−1,3−グルカンと抗原タンパク質とを、（ａ）アルカリ水溶液中で反応させると同時に中和を行なう、若しくは（ｂ）アルカリ水溶液中で反応させて逐次中和を行なう反応工程を備えていることを特徴とする三元複合体の製造方法。
【請求項２】
前記反応工程において結合させ生成された前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンとの複合体を、5'−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドと非プロトン性有機溶媒中で反応させることを特徴とする請求項１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項３】
前記反応工程における前記β−1,3−グルカンと前記抗原タンパク質との反応場に、5'−末端若しくは3'−末端にアミノ基を有するCpGオリゴヌクレオチド又は5'−末端にポリ(dA)テールを有するCpGオリゴヌクレオチドを共存させることを特徴とする請求項１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項４】
前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主として水素結合に基づく非共有性結合であることを特徴とする請求項２に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項５】
前記β−1,3−グルカンと前記CpGオリゴヌクレオチドとの結合が、主としてシッフ塩基若しくはアミド結合によることを特徴とする請求項３に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項６】
前記抗原タンパク質が、オボアルブミン（OVA）であることを特徴とする請求項１乃至５の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項７】
前記CpGオリゴヌクレオチドが、K−タイプ若しくはD−タイプのものであることを特徴とする請求項２乃至６の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項８】
前記抗原タンパク質と前記β−1,3−グルカンの結合が、シッフ塩基若しくはアミド結合によることを特徴とする請求項１乃至７の内いずれか１に記載の三元複合体の製造方法。
【請求項９】
請求項３に記載の製造方法で得られた抗原タンパク質／CpGオリゴヌクレオチド／β−1,3−グルカン系三元複合体。
【図３】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【図１】
【図２】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２０１０−１７４１０７（Ｐ２０１０−１７４１０７Ａ）
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１７０９３（Ｐ２００９−１７０９３）
【出願日】平成２１年１月２８日（２００９．１．２８）
【出願人】（８０２００００３１）財団法人北九州産業学術推進機構 (187)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月１２日（２０１０．８．１２）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１月２８日（２００９．１．２８）
【出願人】（８０２００００３１）財団法人北九州産業学術推進機構 (187)
【Ｆターム（参考）】
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