本発明は、シアリル転移酵素及び／又はトランスシアリダーゼを含めて、１組の糖転移酵素の異種発現によってシアル酸付加糖タンパク質を産生するように改変されて、ほ乳動物、例えば、ヒト治療用糖タンパク質の製造用宿主系統になる、真核生物宿主細胞に関する。シアル酸付加糖タンパク質の産生用ＣＭＰ−シアル酸生合成経路を発現する新規真核生物宿主細胞も提供する。本発明は、（シアリル化に関与するほ乳動物酵素活性などの）ほ乳動物酵素活性を、真核生物宿主細胞中の細胞内区画に首尾よく向け、発現させるのに使用することができる、核酸分子及びコンビナトリアルライブラリーを提供する。方法は、グリコシル化に関与する任意の望ましい遺伝子を発現させ、標的にするのに使用することができる、操作された宿主細胞を与える。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞が、Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生するように選択又は設計され、方法が、シアリル転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含み、この酵素は、シアリル転移酵素触媒ドメインと及びシアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含み、組換え糖タンパク質が宿主細胞の分泌経路を通過すると、ＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法。
【請求項２】
細胞内指向性シグナルペプチドが、小胞体、ゴルジ体、トランスゴルジ網及び分泌小胞からなる群から選択される分泌経路中の場所にシアリル転移酵素触媒ドメインを向ける、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
宿主細胞が、Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生するように選択又は設計され、方法が、
（ａ）シアリル転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸と、及び
（ｂ）ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする核酸と
を宿主細胞に導入する段階を含み、
組換え糖タンパク質が宿主細胞の分泌経路を通過すると、ＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、
宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法。
【請求項５】
シアリル転移酵素活性を有する酵素が、シアリル転移酵素触媒ドメインと及びシアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
トランスシアリダーゼ酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入することを含む、真核生物宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法。
【請求項７】
前記核酸が、トランスシアリダーゼ触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路、細胞壁又は細胞膜に向ける細胞内指向性シグナルペプチドと一緒にトランスシアリダーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＣＭＰ−シアル酸の生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする１種類以上の核酸を宿主細胞に導入する段階を更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記宿主細胞が、末端ガラクトースを含む糖タンパク質を産生する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
宿主細胞が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生するように選択又は設計され、方法が、シアリル転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含み、この酵素は、シアリル転移酵素触媒ドメインと及びシアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含み、組換え糖タンパク質が宿主細胞の分泌経路を通過すると、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法。
【請求項１１】
宿主細胞が、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生するように選択又は設計され、方法が、
（ａ）シアリル転移酵素活性を有する酵素をコードする核酸と、及び
（ｂ）ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする核酸と
を宿主細胞に導入する段階を含み、
組換え糖タンパク質が宿主細胞のゴルジ体を通過すると、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質が産生される、
宿主細胞中で組換えシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法。
【請求項１２】
前記宿主細胞がＣＭＰ−シアル酸の細胞プールを含む、請求項１、４、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成に関与する１種類以上の酵素が、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ、Ｎ−アセチルノイラミナート−９−ホスファターゼ及びＣＭＰ−シアル酸シンターゼからなる群から選択されるほ乳動物酵素である、請求項３、４又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成に関与する１種類以上の酵素が、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ、シアラートシンターゼ及びＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼからなる群から選択される細菌酵素である、請求項３、４又は１１に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成に関与する１種類以上の酵素が、細菌ＮｅｕＣ、細菌ＮｅｕＢ及びほ乳動物ＣＭＰ−Ｓｉａシンターゼからなる群から選択される、請求項３、４又は１１に記載の方法。
【請求項１６】
シアル酸供与体又はシアル酸供与体前駆体の存在下で前記宿主細胞を培養することを更に含む、請求項１、４、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１７】
糖転移酵素、グリコシダーゼ及び糖トランスポーターからなる群から選択される１種類以上の酵素をコードする１種類以上の追加の核酸を宿主細胞に導入する段階を更に含む、請求項１、４、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＭＰ−シアル酸トランスポーターをコードする１種類以上の追加の核酸を宿主細胞に導入する段階を更に含む、請求項１、４、１０又は１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記宿主細胞が内在性シアリル転移酵素活性を欠く、請求項１、４、１０又は１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主細胞が、下等真核生物宿主細胞、昆虫細胞又は植物細胞からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、ピキア種（Pichia sp.）のいずれか、サッカロミセス種（Saccharomyces sp.）のいずれか、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クルイベロミセス種(Kluyveromyces sp.)のいずれか、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス種(Aspergillus sp)のいずれか、トリコデルマ・リーセイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム種(Fusarium sp.)のいずれか及びニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crossa）からなる群から選択される、請求項１、４、１０又は１１に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１、４、１０又は１１のいずれか一項に記載の方法によって製造される組換え糖タンパク質を含む、糖タンパク質組成物。
【請求項２３】
前記組換え糖タンパク質が、ＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む、請求項２２に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項２４】
前記組換え糖タンパク質が、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む、請求項２２に記載の糖タンパク質組成物。
【請求項２５】
シアリル転移酵素触媒ドメインを宿主細胞のゴルジ体に向ける細胞内指向性シグナルペプチドに作用可能に結合したシアリル転移酵素触媒ドメインを含む酵素をコードする核酸。
【請求項２６】
トランスシアリダーゼ触媒ドメインと及びトランスシアリダーゼ触媒ドメインを宿主細胞の分泌経路、細胞壁又は細胞膜に向ける細胞内指向性シグナルペプチドとを含む融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項２７】
請求項２５又は２６に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２８】
ＣＭＰ−シアル酸を更に産生する、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
ＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生することができる、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生することができる、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
トランスシアリダーゼ酵素及びシアル酸供与体を宿主増殖用培地に導入することを含む、組換え非ヒト真核生物宿主細胞中でシアル酸付加糖タンパク質を製造する方法。
【請求項３２】
ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含む、宿主細胞におけるＣＭＰ−シアル酸の産生を促進する方法。
【請求項３３】
シアラートアルドラーゼ活性を有する酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を含む、宿主細胞におけるＣＭＰ−シアル酸の産生を促進する方法。
【請求項３４】
ＣＭＰ−Ｓｉａの生合成又は輸送に関与する１種類以上の酵素をコードする核酸を宿主細胞に導入する段階を更に含む、請求項１０に記載の方法。

【図１Ａ】

【図１Ｂ】

【図２】

【図３】

【図４Ａ】

【図４Ｂ】

【図４Ｃ】

【図４Ｄ】

【図４Ｅ】

【図４Ｆ】

【図５】

【図５Ａ】

【図５Ｂ】

【図５Ｃ】

【図５Ｄ】

【図５Ｅ】

【図６】

【図６Ａ】

【図６Ｂ】

【図６Ｃ】

【図６Ｄ】

【図６Ｅ】

【図６Ｆ】

【図７】

【図７Ａ】

【図７Ｂ】

【図７Ｃ】

【図８】

【図８Ａ】

【図８Ｂ】

【図８Ｃ】

【図９】

【図９Ａ】

【図９Ｂ】

【図９Ｃ】

【図１０】

【図１０Ａ】

【図１０Ｂ】

【図１１】

【図１２】

【図１２Ａ】

【図１２Ｂ】

【図１２Ｃ】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【公表番号】特表２００９−５３６０３１（Ｐ２００９−５３６０３１Ａ）
【公表日】平成２１年１０月８日（２００９．１０．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０９７６２（Ｐ２００９−５０９７６２）
【出願日】平成１９年５月４日（２００７．５．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１０９４１
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１３０６３８
【国際公開日】平成１９年１１月１５日（２００７．１１．１５）
【出願人】（５０３００７２８７）グライコフィ，　インコーポレイテッド (37)
【Ｆターム（参考）】