不死化フィーダー細胞
本発明は、不死化フィーダー細胞株に関する。不死化フィーダー細胞株は、胚性線維芽細胞から得ることができ、これはマウス胚性線維芽細胞であり得る。好適な培地中の本発明による不死化フィーダー細胞株の培養物、好適な担体又は希釈剤中に本発明による不死化フィーダー細胞株を含む組成物、及び本発明による不死化フィーダー細胞株の増殖により生じた条件培地も提供される。更に、本発明は、本発明による細胞株又は条件培地の使用を含む幹細胞の培養方法、及びそうして産生された細胞を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不死化フィーダー細胞株、その培地、並びに幹細胞、特にヒト胚性幹細胞の培養におけるこれらの細胞及び培地の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
着床前胚の内細胞塊からのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の単離が成功したため、今では、未分化ｈＥＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで無制限に培養し、それにより再生治療に使用すべき３つの胚性胚葉から細胞へ分化することができる材料の出発供給源を潜在的に提供することが可能である［１］。従来は、ｈＥＳＣは共培養物としてフィーダー層上に直接維持され、これらのフィーダーはマウス又はヒトの供給源から得ていた［２〜７］。つい最近では、ｈＥＳＣは無フィーダー条件下でうまく培養されている。ここでは、細胞をマトリゲルのような細胞外マトリックス上で増殖させ、フィーダー層由来の条件培地（ＣＭ）を添加する［８、９］。供給源にかかわらず、フィーダーは初代組織に由来するため、培養では寿命が限られている。例えば、初代フィーダーはおよそ７〜９継代しか培養できずに細胞が老化する。したがって、新鮮なフィーダーのバッチを定期的に調製する必要があり、これはバッチ間変動をもたらし得る。更に、フィーダーからｈＥＳＣへ病原菌が伝達され得るという懸念もある。
【０００３】
ｈＥＳＣを培養するため、特にスケールアップするための、持続可能で有効な、一貫したフィーダーの供給源を得るための可能な解決策の１つは、初代フィーダーの不死化である。不死化にはこれまでにいくつかの方法が用いられており、それらにはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのＤＮＡ腫瘍ウイルス由来の遺伝子による正常細胞の形質導入が含まれる［１０〜１４］。つい最近では、いくつかのグループが、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素ｈＴＥＲＴの過剰発現も、体細胞又は分化細胞の寿命を延長できることを報告している［１５、１６］。
【非特許文献１】Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ、Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ Ｊ、Ｓｈａｐｉｒｏ ＳＳら、ヒト胚盤胞由来胚性幹細胞株。Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８；２８２：１１４５−１１４７．
【非特許文献２】Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｍ、Ｆｏｎｇ ＣＹ、Ｃｈａｎ ＷＫら、ヒトフィーダーはヒト内細胞塊及び胚性幹細胞の長期未分化増殖を支持する。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２；２０：９３３−９３６．
【非特許文献３】Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ＢＥ、Ｐｅｒａ ＭＦ、Ｆｏｎｇ ＣＹら、ヒト胚盤胞由来胚性幹細胞株：ｉｎ ｖｉｔｒｏ体細胞分化。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０００；１８：３９９−４０４．
【非特許文献４】Ｃｈｏｏ ＡＢ、Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ Ｊ、Ｃｈｉｎ ＡＣら、多能性ヒト胚性幹細胞のヒトフィーダー上での増殖。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００４；８８：３２１−３３１．
【非特許文献５】Ａｍｉｔ Ｍ、Ｍａｒｇｕｌｅｔｓ Ｖ、Ｓｅｇｅｖ Ｈら、ヒト胚性幹細胞のためのヒトフィーダー層。Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２００３；６８：２１５０−２１５６．
【非特許文献６】Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｍ、Ｔａｎ Ｓ、Ｆｏｎｇ ＣＹら、ヒト胚性幹細胞の長期未分化増殖のための各種ヒトフィーダーに関する比較評価。Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００３；２１：５４６−５５６．
【非特許文献７】Ｈｏｖａｔｔａ Ｏ、Ｍｉｋｋｏｌａ Ｍ、Ｇｅｒｔｏｗ Ｋら、ヒト包皮線維芽細胞をフィーダー細胞として用いる培養系はヒト胚性幹細胞の産生を可能にする。Ｈｕｍ Ｒｅｐｒｏｄ ２００３；１８：１４０４−１４０９．
【非特許文献８】Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ＭＫ、Ｒｏｓｌｅｒ ＥＳ、Ｆｉｓｋ ＧＪら、無フィーダー培養系で維持された４種のヒト胚性幹細胞株の特性。Ｄｅｖ Ｄｙｎ ２００４；２２９：２４３−２５８．
【非特許文献９】Ｘｕ Ｃ、Ｉｎｏｋｕｍａ ＭＳ、Ｄｅｎｈａｍ Ｊら、未分化ヒト胚性幹細胞の無フィーダー増殖。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００１；１９：９７１−９７４．
【非特許文献１０】Ｂｒｙａｎ ＴＭ、Ｒｅｄｄｅｌ ＲＲ、ＳＶ４０誘導性のヒト細胞の不死化。Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｏｎｃｏｇ １９９４；５：３３１−３５７．
【非特許文献１１】Ｇｕｄｊｏｎｓｓｏｎ Ｔ、Ｖｉｌｌａｄｓｅｎ Ｒ、Ｎｉｅｌｓｅｎ ＨＬら、幹細胞特性を有するヒト乳房上皮細胞株の単離、不死化、及び特徴付け。Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２００２；１６：６９３−７０６．
【非特許文献１２】Ｊｈａ ＫＫ、Ｂａｎｇａ Ｓ、Ｐａｌｅｊｗａｌａ Ｖら、ＳＶ４０介在性の不死化。Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １９９８；２４５：１−７．
【非特許文献１３】Ｓｕｇｉｍｏｔｏ Ｍ、Ｉｄｅ Ｔ、Ｇｏｔｏ Ｍら、エプスタイン・バー・ウイルスで形質転換したヒトＢリンパ芽細胞株の老化、不死化、及びテロメア維持に関する再考。Ｍｅｃｈ Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ １９９９；１０７：５１−６０．
【非特許文献１４】Ｙａｍａｍｏｔｏ Ａ、Ｋｕｍａｋｕｒａ Ｓ、Ｕｃｈｉｄａ Ｍら、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６遺伝子又はＥ７遺伝子の単独導入による正常ヒト胚線維芽細胞の不死化、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ２００３；１０６：３０１−３０９．
【非特許文献１５】Ｂｏｄｎａｒ ＡＧ、Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ Ｍ、Ｆｒｏｌｋｉｓ Ｍら、正常ヒト細胞へのテロメラーゼ導入による寿命延長。Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８；２７９：３４９−３５２．
【非特許文献１６】Ｘｕ Ｃ、Ｊｉａｎｇ Ｊ、Ｓｏｔｔｉｌｅ Ｖら、ヒト胚性幹細胞由来不死化線維芽細胞様細胞は未分化細胞増殖を支持する。Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００４；２２：９７２−９８０．
【非特許文献１７】Ｋｌｉｎｇｅｌｈｕｔｚ Ａｌ、Ｆｏｓｔｅｒ ＳＡ、ＭｃＤｏｕｇａｌｌ ＪＫ、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６遺伝子産物によるテロメラーゼ活性化。Ｎａｔｕｒｅ １９９６；３８０：７９−８２．
【非特許文献１８】Ｂｏｙｅｒ ＳＮ、Ｗａｚｅｒ ＤＥ、Ｂａｎｄ Ｖ、ヒトパピローマウイルス１６のＥ７タンパク質は網膜芽細胞腫タンパク質の分解をユビキチン−プロテアソーム経路を介して誘発する。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９６；５６：４６２０−４６２４．
【非特許文献１９】Ｓｈｉｇａ Ｔ、Ｓｈｉｒａｓａｗａ Ｈ、Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｋら、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）Ｅ６−Ｅ７遺伝子の導入により不死化した正常ヒト線維芽細胞。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；４１：３１３−３１９．
【非特許文献２０】Ｈａｌｂｅｒｔ ＣＬ、Ｄｅｍｅｒｓ ＧＷ、Ｇａｌｌｏｗａｙ ＤＡ、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ７遺伝子はヒト上皮細胞の不死化に十分である。Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９１；６５：４７３−４７８．
【非特許文献２１】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｅｌ編、『奇形癌腫と胚性幹細胞』、オックスフォード：ＩＲＬ出版、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．、胚由来幹細胞株。１９８７：７１−１１２．
【非特許文献２２】Ｗａｚｅｒ ＤＥ、Ｌｉｕ ＸＬ、Ｃｈｕ Ｑら、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６又はＥ７による異なるヒト乳房上皮細胞種の不死化。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９５；９２：３６８７−３６９１．
【非特許文献２３】Ｃｏｗａｎ ＣＡ、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ Ｉ、ＭｃＭａｈｏｎ Ｉら、ヒト胚盤胞由来胚性幹細胞株の派生。Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２００４；３５０：１３５３−１３５６．
【非特許文献２４】Ｙｅａｇｅｒ ＴＲ、Ｒｅｄｄｅｌ ＲＲ、不死化ヒト細胞株の構築。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９９；１０：４６５−４６９．
【非特許文献２５】Ｍｕｒｖａｉ Ｍ、Ｂｏｒｂｅｌｙ ＡＡ、Ｋｏｎｙａ Ｉら、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６及びＥ７がん遺伝子のトランスフォーミング成長因子−β２（ＴＧＦ−β２）プロモーター活性に対する効果。Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２００４；１４９：２３７９−２３９２．
【非特許文献２６】Ｎｅｅｓ Ｍ、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ＪＭ、Ｍｕｎｓｏｎ Ｐら、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６及びＥ７タンパク質は頚部ケラチノサイトにおいてトランスフォーミング成長因子−β２の分化依存性発現を阻害する。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６０：４２８９−４２９８．
【非特許文献２７】Ｄｅｙ Ａ、Ａｔｃｈａ ＩＡ、Ｂａｇｃｈｉ Ｓ、ＨＰＶ１６のＥ６発癌タンパク質は線維芽細胞においてＧＣに富んだ特異配列を介してトランスフォーミング成長因子−β１プロモーターを刺激する。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７；２２８：１９０−１９９．
【発明の開示】
【０００４】
発明の説明
第１の側面では、本発明は、不死化フィーダー細胞株を提供する。特に、本発明は、胚線維芽細胞由来の不死化フィーダー細胞株を提供する。より詳細には、不死化フィーダー細胞株はマウス胚線維芽細胞に由来する。より詳細には、不死化フィーダー細胞株は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の分解、ｃ−ｍｙｃ発現の増加、テロメラーゼの活性化、及びｐＲｂの分解のうちの１つ以上によってマウス胚線維芽細胞から得る。より詳細には、不死化フィーダー細胞株は、ＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の導入によって胚線維芽細胞から得る。Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子は形質導入によって導入されることが好ましい。胚線維芽細胞にＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを感染させることが好ましい。大半の細胞は正常な寿命を越えて増殖し続け、レトロウイルスによる感染後のＧ４１８による抗生物質選択に耐性であることが好ましい。細胞株は不死化後腫瘍原性にならないことが好ましい。ｉｎ ｖｉｖｏでＳＣＩＤへ細胞を筋肉注射しても蝕知可能な腫瘍を注射後１６週目であっても生じないことが好ましい。
【０００５】
本発明の細胞株は、７、８、又は９継代を越えて増殖する。本発明の好ましい細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７０継代を越えて増殖し、腫瘍原性の表現型を獲得しない。本発明の細胞株は、特徴的な未分化形態を共培養物においてもＣＭ添加無フィーダー培養物においても＞４０継代維持し続け；多能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、アルカリホスファターゼを発現し続け；正常な核型を維持し；そしてＳＣＩＤマウスに注射すると３つの胚性胚葉に代表的な組織を有する奇形腫を形成するｈＥＳＣを支持する。
【０００６】
本発明の細胞株は、未分化ｈＥＳＣの増殖を支持する。ｈＥＳＣ株はこれらのフィーダーに容易に適応し、フィーダー培養物においても無フィーダー培養物においても未分化ｈＥＳＣ培養物の典型的な形態を維持する。ｈＥＳＣは、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、及びアルカリホスファターゼを含めた多能性マーカーも発現し続ける。２５継代後、細胞は安定な核型を保持し、ＳＣＩＤマウスにおいて分化して奇形腫を形成できることが好ましい。好ましくは、ｈＥＳＣ無フィーダー培養物のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析により、細胞はＯｃｔ−４に対して陽性のままであるがＥ６抗原及びＥ７抗原に対して陰性であることを確認する。
【０００７】
本発明は、Ｅ６抗原及びＥ７抗原の過剰発現により不死化した初代ＭＥＦを提供する。好ましい態様では、細胞株は本明細書に記載のΔＥ−ＭＥＦである。細胞株ΔＥ−ＭＥＦを、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づくアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。２００５年５月９日に寄託し、受託番号ＰＴＡ−６７０５が付された。
【０００８】
また、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＰＴＡ−６７０５で寄託した不死化フィーダー細胞株を提供する。
更に、本発明は、好適な培地中の第１の側面の不死化フィーダー細胞株の培養物、及び好適な担体又は希釈剤中に第１の側面の不死化フィーダー細胞株を含む組成物を提供する。
【０００９】
第２の側面では、本発明は、第１の側面の不死化フィーダー細胞株の増殖から生ずる条件培地を提供する。
条件培地はマトリゲルのような細胞外マトリックスとともに用いてもよい。
【００１０】
第３の側面では、本発明は、第１の側面の細胞株のフィーダー細胞としての使用を含む、幹細胞の培養方法を提供する。好ましくは、幹細胞はヒト幹細胞である。より好ましくは、幹細胞はヒト胚性幹細胞である。
【００１１】
第４の側面では、本発明は、第２の側面の条件培地の使用を含む、幹細胞の培養方法を提供する。好ましくは、幹細胞はヒト幹細胞である。より好ましくは、幹細胞はヒト胚性幹細胞である。
【００１２】
第３及び第４の側面の方法には、セルファクトリーのような培養容器中でスケールアップした量の未分化ｈＥＳＣが含まれる。スケールアップした量は＞１０８細胞であり得る。
【００１３】
第５の側面では、本発明は、本発明の第３又は第４の側面の方法によって培養される幹細胞を提供する。好ましくは、幹細胞はヒト幹細胞である。より好ましくは、幹細胞はヒト胚性幹細胞である。
【００１４】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、培養で無制限に増殖する可能性を有し、広範な細胞への分化能を依然として保持する多能性細胞である。しかしながら、ｈＥＳＣ培養物は、直接接触するフィーダーかフィーダー由来の条件培地（ＣＭ）を必要とする。最も一般的なフィーダーの供給源は、初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である。
【００１５】
本研究では、初代ＭＥＦの増殖能を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子をコードするレトロウイルスベクターで感染後その正常な寿命を越えて延長できるかどうか調査した。Ｅ６タンパク質の過剰発現は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の分解とともに、ｃ−ｍｙｃ発現の増加及びテロメラーゼの活性化を引き起こす［１７］。一方、発現したＥ７タンパク質は網膜芽細胞腫タンパク質ｐＲｂに結合し、ｐＲｂの分解をもたらす［１８］。Ｅ６及びＥ７の発現により、正常ヒト線維芽細胞、乳房上皮細胞、及び包皮ケラチノサイトを効率的に不死化できることが以前に示されている［１１、１９、２０］。本研究において、Ｅ６抗原及びＥ７抗原の過剰発現により初代ＭＥＦをうまく不死化させた。不死化ＭＥＦであるΔＥ−ＭＥＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７０継代を越えて増殖し続け、腫瘍原性の表現型を獲得する細胞は生じなかった。更に、初代ＭＥＦ上で先に増殖させた３つのｈＥＳＣ株は、フィーダー条件又は無フィーダー条件でもΔＥ−ＭＥＦに容易に適応した。
【００１６】
形態学的にｈＥＳＣは未分化のままであり、多能性に特徴的な細胞内マーカー及び細胞外マーカーをともに発現し続けた。ｈＥＳＣ培養物は正常な核型も保持し、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて奇形腫を形成した。
【００１７】
本研究では、ＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを感染させることにより初代ＭＥＦ株を不死化させた。初代細胞は老化するが、不死化株ΔＥ−ＭＥＦは７〜９継代を越えて増殖でき、寿命が７０継代を越えて延長する。ｈＥＳＣ増殖支持能を試験したところ、ΔＥ−ＭＥＦとの共培養物においてもΔＥ−ＭＥＦ由来ＣＭを添加した無フィーダー培養物においてもｈＥＳＣは特徴的な未分化形態を＞４０継代維持し続けることがわかった。培養物は、多能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、アルカリホスファターゼも発現し続け、正常な核型を維持する。更に、これらのｈＥＳＣはＳＣＩＤマウスに注射すると３つの胚性胚葉に代表的な組織を有する奇形腫を形成した。最後に、顕著な量の未分化ｈＥＳＣ（＞１０８細胞）をセルファクトリーのような培養容器内でΔＥ−ＭＥＦを用いてスケールアップ可能であることも実証した。この研究の結果は、不死化フィーダーが、ｈＥＳＣの増殖及び研究のためのフィーダーの一貫した再現性のある供給源を提供することができ、したがって、初代フィーダーよりも有益であることを示唆している。
【００１８】
形態学的にｈＥＳＣは未分化のままであり、多能性に特徴的な細胞内マーカーと細胞外マーカーをともに発現し続けた。ｈＥＳＣ培養物は正常な核型も保持し、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて奇形腫を形成した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
材料及び方法
細胞培養
ヒト胚性幹細胞株ＨＥＳ−２（４６Ｘ，Ｘ）、ＨＥＳ−３（４６Ｘ，Ｘ）、及びＨＥＳ−４（４６Ｘ，Ｙ）をＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手した。細胞を、ゼラチンコーティングされた器官培養シャーレ内にてマイトマイシンＣで不活化したフィーダー（〜４×１０４細胞／ｃｍ２）上で（共培養物）、又はフィーダー由来ＣＭを添加したマトリゲルコーティングされた器官培養シャーレ内で（無フィーダー培養物）、３７℃／５％ＣＯ２にて培養した。ｈＥＳＣの培養に用いる培地は、１５％ＫＯ血清代替物、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、及び０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、及び４〜８ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（インビトロジェン）を添加した８５％ＫＯ−ＤＭＥＭを含有するノックアウト（ＫＯ）培地である。培地を毎日交換し、先に記載されたように培養物を毎週、酵素処理の後で継代した［４］。無フィーダー培養物の培養シャーレを、冷ＫＯ−ＤＭＥＭで希釈した（１：３０希釈）マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）とともに４０℃で一晩インキュベーションした。
【００２０】
ＭＥＦ及びＭＥＦ条件培地（ＣＭ）の調製
初代ＭＥＦをＲｏｂｅｒｔｓｏｎら［２１］に記載の方法を用いて１２９Ｘ１／ＳｖＪマウス（交尾後１３．５日目）の胎児から単離した。単層の初代ＭＥＦ（継代４）をコンフルエントになるまで培養し、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣで２．５〜３時間処理した。処理後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を剥がし、Ｆ−ＤＭＥＭ培地の入った器官培養シャーレ上に上記のように蒔いた。この培地は、９０％ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５Ｕ／ｍｌペニシリン、及び２５μｇ／ｍｌストレプトマイシン（インビトロジェン）から成る。播種後２４時間に培地をＫＯ培地に交換し、ｈＥＳＣ又はＭＥＦ−ＣＭの回収物を添加する前に更に２４時間平衡化させた。ＭＥＦ−ＣＭについては、培養シャーレに１．４×１０５細胞／ｃｍ２のマイトマイシンＣで処理したＭＥＦを蒔き、ＫＯ培地をシャーレに添加した後、ＣＭを２４時間毎に回収した。ＣＭをろ過し（０．２２μｍ）、更に８ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（インビトロジェン）を添加した。
【００２１】
不死化フィーダー株ΔＥ−ＭＥＦの確立
継代３の初代ＭＥＦ（３×１０５細胞）を７５ｃｍ２のＴフラスコに蒔き、Ｆ−ＤＭＥＭ培地中で一晩接着させた。次に細胞に、ＰＡ３１７ ＬＸＳＮ ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７又はＰＡ３１７ ＰＸＳＶパッケージング細胞株（それぞれＣＲＬ−２２０３及びＣＲＬ−２２０２、ＡＴＣＣ）由来のレトロウイルスを含有する滅菌ろ過した上清を８μｇ／ｍｌのポリブレン（シグマアルドリッチ）存在下で３７℃にて８時間形質導入した［２２］。その後、ウイルス含有培地を除去し、新鮮なＦ−ＤＭＥＭに交換して更に３日間インキュベーションした。次に形質導入細胞を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグアルドリッチ）存在下で１４日間選択した。確立したフィーダー株ΔＥ−ＭＥＦは抗生物質不含Ｆ−ＤＭＥＭ培地中で日常的に培養し、ストックは９０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存した。
【００２２】
増殖速度及び倍加時間
０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン）で処理後、ＭＥＦ及びｈＥＳＣの単一細胞懸濁液を毎日回収した（植菌後１〜６日）。トリパンブルー色素排除法を用いて各サンプルについて生存細胞数及び生存率を測定した。生存細胞数対時間のグラフをプロットして指数関数的増殖相における細胞の比増殖速度を概算した。これから、以下の等式：ｔｄ＝ｌｎ（２）／μ（式中、μは比増殖速度（ｈｒ−１）である）を用いて倍加時間（ｔｄ）を計算した。
【００２３】
Ｏｃｔ−４発現のフローサイトメトリー解析
ｈＥＳＣ集団における細胞内転写因子Ｏｃｔ−４の発現レベルを、フローサイトメトリーを用いた免疫蛍光法にて評価した。細胞をトリプシンを用いて単一細胞懸濁液として回収し、固定し、透過性にし（カルタグラボラトリーズ）、１：２０希釈した抗Ｏｃｔ−４マウスモノクローナル抗体（サンタクルーズ）とともにインキュベーションした。次に細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、１：５００希釈したＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（ＤＡＫＯ）とともに暗所にてインキュベーションした。インキュベーション後、細胞を再度洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）による解析のため１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁させた。全てのインキュベーションは室温で１５分間行った。陰性対照として、細胞を適切なアイソタイプ対照で染色した。
【００２４】
免疫細胞化学
細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温にて４５分間固定し、ＳＳＥＡ−４（原液、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１（３０μｇ／ｍｌ、ケミコン）に対する抗体とともに室温で１時間インキュベーションした。抗体の局在をＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（１：５００希釈；ＤＡＫＯ）を用いて可視化した。
【００２５】
アルカリホスファターゼ染色
ベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットＩ（ベクターラボラトリーズ）を用いて、製造者のプロトコールにしたがいアルカリホスファターゼ染色を行った。簡潔には、ｈＥＳＣをＰＢＳで１回洗浄後、ベクターレッド基質作用液とともに暗所で４５分間室温にてインキュベーションした。ローダミン励起フィルターと発光フィルターを用いて反応産物を可視化した。
【００２６】
ＲＮＡの単離と逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ製ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡＩＩキットを用いてｈＥＳＣ及びＭＥＦから全ＲＮＡを単離し、紫外線分光光度法にて定量した。オリゴｄＴプライマー及びＩｍＰｒｏｍ ＩＩ逆転写酵素（プロメガ）を用いて、１μｇの全ＲＮＡについて標準の逆転写反応を行った。Ｏｃｔ−４、β−アクチン、ＨＰＶ−１６ Ｅ６、及びＨＰＶ−１６ Ｅ７に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った（表１）。増幅に用いたサイクリングパラメータは、９５℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を３０サイクルである。この後に７２℃で１０分間の最終伸長が続いた。増殖産物を１％アガロースゲル上で可視化し、エチジウムブロマイドで染色した。
【００２７】
ＳＣＩＤマウスモデル
ΔＭＥＦ及びｈＥＳＣを酵素処理し、およそ４〜５×１０６細胞を滅菌２２Ｇ針で４週齢雄性ＳＣＩＤマウスの後肢筋肉に注射した。腫瘍を発症した動物（注射後およそ９〜１０週）を屠殺し、腫瘍を切開し、１０％ホルマリンで固定した。腫瘍をパラフィンに包埋し、切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色後、組織学的に試験した。
【００２８】
核型分析
ＮＵＳ又はＫＫ女性及び小児病院の産婦人科の細胞遺伝学実験室で核型分析を行った。
ｈＥＳＣ共培養物のスケールアップ
ｈＥＳＣ量をスケールアップするため、共培養物を組織培養フラスコ（Ｔ７５、７５ｃｍ２）、トリプルフラスコ（ＴＦ、５００ｃｍ２）、及びセルファクトリー（ＣＦ、６３２ｃｍ２）（Ｎｕｎｃ）で増殖させた。用いた培養条件は上記と同様であった。全ての表面に対し、マイトマイシンＣ不活化フィーダーをゼラチンコーティングした培養表面におよそ４×１０４細胞／ｃｍ２で蒔いた。継代のため、細胞をリン酸緩衝食塩水＋（ＰＢＳ＋）で洗浄し、次いで０．０５％トリプシン（インビトロジェン）とともに室温で２〜３分間インキュベーションした。細胞をフラスコからタッピングにより剥がし、ピペッティングを穏やかに繰り返すことによってより小さな塊まで更に分離させた。その後、トリプシンを中和し、不活化フィーダーを蒔いた新たなゼラチンコーティングフラスコへ細胞塊を１：３の比で播種した。
【００２９】
結果
不死化ＭＥＦの確立と特徴付け
継代３の初代ＭＥＦにＨＰＶ１６−Ｅ６、ＨＰＶ１６−Ｅ７、及びネオマイシン耐性を同時にコードするレトロウイルスを感染させた（ΔＥ−ＭＥＦ）。陰性対照として、ネオマイシン耐性のみを含有する対照レトロウイルスを細胞に感染させた（ΔＣ−ＭＥＦ）。感染後４継代目に（感染後およそ１２日、Ｐ７）、ΔＥ−ＭＥＦは１９．７時間の適切な倍加時間で増殖し続けた（図１ａ）。更に、ΔＥ−ＭＥＦの増殖速度及び倍加時間は継代４の初代ＭＥＦに匹敵するものであった（表２）。対照的に、継代７の対照ウイルス感染細胞（ΔＣ−ＭＥＦ）は、同一の６日間にわたって生存細胞数が顕著に増加しなかったため老化の徴候を示した（図１ａ）。４５継代後（１６５集団倍加）、ΔＥ−ＭＥＦは、継代７に匹敵する類似の成長速度を維持し続け（図１ａ）、現在のところ７０継代を越えて増殖能が低下することなく培養されている（データは示していない）。継代７のΔＥ−ＭＥＦ及びΔＣ−ＭＥＦからＲＮＡを単離し、レトロウイルス感染の結果として導入されたＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現に関し、ＲＴ−ＰＣＲで試験した。図１ｂから、ΔＥ−ＭＥＦはＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子のｍＲＮＡを発現した（それぞれレーン２及び４）が、細胞に対照ウイルスを感染させたΔＣ−ＭＥＦでは発現が全く見られない（レーン１及び３）ことが明らかとなった。
【００３０】
ΔＥ−ＭＥＦが、Ｅ６及びＥ７による不死化の後、腫瘍形成可能であるかどうか決定するために、５×１０６細胞をＳＣＩＤマウスに注射した。動物を定期的に試験したところ、蝕知可能な腫瘍は細胞の注射後１６週目であっても全く見られなかった（データは示していない）。
【００３１】
不死化ＭＥＦを用いたフィーダー条件及び無フィーダー条件におけるｈＥＳＣの増殖及び形態
初代ＭＥＦ上で直接（共培養物）又は初代ＭＥＦ培養物由来条件培地を添加したマトリゲル上で（無フィーダー）ヒトＥＳ細胞株ＨＥＳ−３を日常的に培養した。不死化ＭＥＦ株ΔＥ−ＭＥＦがｈＥＳＣの未分化増殖を支持可能かどうか評価するために、代わりにΔＥ−ＭＥＦを用いてＨＥＳ−３細胞をそれぞれの条件で蒔いた。
【００３２】
共培養物の場合、ΔＥ−ＭＥＦ上に蒔いたＨＥＳ−３細胞塊は、フィーダーを脇へ押しやりながら増殖し、コロニーを形成した。これは、コロニー周辺の線維芽細胞の非常に目立つ境界をコロニーにもたらした（図２ａ及び２ｃ）。形態学的に、コロニー内のｈＥＳＣは密に集団化したままであり、高い核対細胞質比を維持した（図２ｅ）。無フィーダー培養物の場合、フィーダーがないにもかかわらず、ΔＥ−ＭＥＦ条件培地を添加されたマトリゲル上のｈＥＳＣは、フィーダー上で培養されたｈＥＳＣと同様の目立つ小型コロニーを形成し続けた（図２ｂ及び２ｄ）。興味深いことに、未分化コロニーの境界周返に分化した線維芽細胞様細胞が観察されたが、これらの細胞の密度はｈＥＳＣと比較して顕著に少なかった（図２ｄ）。フィーダー条件及び無フィーダー条件では、ＨＥＳ−３細胞は未分化ｈＥＳＣの形態を４０連続継代（２１０集団倍加、ＰＤ）より長く維持し続けた。更に２つのｈＥＳＣ株ＨＥＳ−２及びＨＥＳ−４についてもフィーダー培養物及び無フィーダー培養物において類似の形態が１０継代より長く観察された（データは示していない）。更に、これら２つの培養条件におけるＨＥＳ−３細胞の比増殖速度及び倍加時間は同程度のものであり（表２）、既刊文献に相当した［４、２３］。
【００３３】
未分化ｈＥＳＣに特有のマーカーの特徴付け
未分化ｈＥＳＣは、細胞内転写因子Ｏｃｔ−４、及びＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１などの表面マーカーのような一連のマーカーの発現を特徴とする。フローサイトメトリーを用いて、３つのｈＥＳＣ株全てにおいて、フィーダー条件及び無フィーダー条件におけるＯｃｔ−４の発現を比較した（図３）。初代ＭＥＦ上で培養されたＨＥＳ−３細胞と同様に（図３ａ）、ΔＥ−ＭＥＦ上で培養されたＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、及びＨＥＳ−４細胞の＞８８％はＯｃｔ−４に対して陽性に染色された（それぞれ図３ｃ、３ｂ、及び３ｄ）。同様に、ΔＥ−ＭＥＦ由来ＣＭを添加して無フィーダー条件で維持したところ、＞９７％の細胞（３つのｈＥＳＣ株全て）はＯｃｔ−４に対して陽性であった（図３ｅ〜３ｇ）。更に、ΔＥ−ＭＥＦ（図４、上部パネル）又はΔＥ−ＭＥＦ ＣＭ（図４、下部パネル）上で培養されたＨＥＳ−３細胞は、ＳＳＥＡ−４（図４ａ、４ｅ）、Ｔｒａ−１−６０（図４ｂ、４ｆ）、Ｔｒａ−１−８１（図４ｃ、４ｇ）に対して陽性に染色され、アルカリホスファターゼ活性が高かった（図４ｄ、４ｈ）。
【００３４】
分化した組織をｉｎ ｖｉｖｏで形成する可能性を評価するために、ΔＥ−ＭＥＦを用いてフィーダー培養物又は無フィーダー培養物上で維持したＨＥＳ−３細胞をＳＣＩＤマウスへ注射した。注射後１０週目に、全ての条件で奇形腫が観察された。腫瘍から切片を作製し、組織学的に試験した。切片から、消化管様上皮（内肺葉、図５ａ）、神経上皮（外胚葉、図５ｂ）、筋肉、軟骨、及び骨（中胚葉、図５ｃ〜５ｅ）を含めた３つの胚性胚葉に代表的な組織が同定された。更に、少なくとも２５連続継代（１３０ＰＤ）後、フィーダー細胞集団及び無フィーダー細胞集団に由来するＨＥＳ−３細胞について細胞遺伝学的試験を行った（それぞれ図６ａ及び６ｂ）。解析の結果は、ＨＥＳ−３細胞がいずれの培養条件下においても正常な核型（４６Ｘ，Ｘ）を維持し続けたことを示した。
【００３５】
最後に、レトロウイルスを用いて初代ＭＥＦを不死化したため、ｈＥＳＣをＥ６抗原及びＥ７抗原で感染させ得るウイルスがΔＥ−ＭＥＦによって産生されていないことを立証することが重要であった。ＲＴ−ＰＣＲは４０継代後のＨＥＳ−３無フィーダー培養物においてＥ６抗原及びＥ７抗原の発現を検出しなかった（図７ｂ）。代わりに、Ｏｃｔ−４の発現が検出され、ｈＥＳＣが未分化のままであることを確認した。対照として、ΔＥ−ＭＥＦについてもＲＴ−ＰＣＲを行った（図７ａ）。ここで、フィーダーによるＥ６抗原及びＦ７抗原の発現は検出されたが、Ｏｃｔ−４は検出されなかった。
【００３６】
ΔＥ−ＭＥＦを用いたＨＥＳ−３共培養物のスケールアップ
ΔＥ−ＭＥＦが未分化ｈＥＳＣのスケールアップに使用できることを実証するために、共培養物を器官培養シャーレから組織培養フラスコへ増殖させた。次に組織培養フラスコの細胞を、トリプルフラスコ及びセルファクトリーへのｈＥＳＣの増殖のための播種材料として用いた。表３から、これらの大きな培養容器において７日後に得た総細胞収率は、およそ２〜３×１０８細胞であった。器官培養シャーレと比較してトリプルフラスコ及びセルファクトリーの表面積がそれぞれ２０８倍及び２６３倍に増加したにもかかわらず、細胞密度はおよそ０．３７〜０．４７×１０６細胞／ｃｍ２に維持されたことも明らかとなった。更に、トリプルフラスコ及びセルファクトリー内の８９％〜９６％の増殖ｈＥＳＣ集団はＯｃｔ−４に対して陽性に染色され続けた（それぞれ図８ａ及び８ｂ）。総合すると、これらの結果は、未分化ｈＥＳＣをΔＥ−ＭＥＦ共培養物上で顕著な量まで増殖可能であることを示唆している。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
考察
フィーダー細胞は、ｈＥＳＣの培養において必須成分である。マウス胚性幹細胞とは異なり、ｈＥＳＣは、フィーダーに直接接触する共培養物としても、フィーダー−ＣＭを添加した無フィーダー培養物においても増殖する。これらの条件下では、ｈＥＳＣは未分化表現型を維持し続ける。しかしながら、ｈＥＳＣの研究に近年用いられたフィーダーは、マウス又はヒトの供給源の初代組織に由来することが主要な限界である。正常体細胞のように、培養におけるそれらの寿命は限られており、有限数の複製後に老化するであろう。ＨＰＶ１６ Ｅ６抗原及びＥ７抗原による初代細胞の形質導入は、ヒト線維芽細胞の寿命を２００集団倍加を越えて延長させることを示している［１９］。
【００４１】
本研究では、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７の感染により、初代ＭＥＦの寿命を７〜９継代から７０継代（２５０集団倍加）を越えて延長させることができることを実証した。Ｅ６抗原及びＥ７抗原の発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した。ＳＶ４０、Ｅ６／Ｅ７などの遺伝子を用いて不死化させた細胞は、大部分の細胞が老化する危機段階に入ることが先に報告されている。この集団から、分裂し続ける細胞は不死化細胞株を形成し続ける［２４］。興味深いことに、これは、ΔＥ−ＭＥＦでは観察されなかった。大半の細胞は正常な寿命を越えて増殖し続け、レトロウイルス感染後のＧ４１８による抗生物質選択に耐性であった。ｉｎ ｖｉｖｏでＳＣＩＤへΔＥ−ＭＥＦを筋肉注射しても、注射後１６週目であっても蝕知可能な腫瘍を生じなかった。これは、ΔＥ−ＭＥＦが不死化後も腫瘍原性になっていないことを裏付けている。対照的に、等量のｈＥＳＣを注射すると、注射後９〜１０週目におよそ直径１〜２ｃｍの奇形腫を形成した。
【００４２】
細胞を不死化させるためにＥ６抗原及びＥ７抗原を使用することの主な懸念は、不死化はｐ５３及び網膜芽細胞腫タンパク質の分解により達成できるが、Ｅ６及びＥ７は不死化細胞の他の経路や細胞機能にも影響を及ぼし得ることが報告されていることである。Ｍｕｒｖａｉら［２５］は、ＨＰＶ１６ Ｅ７もトランスフォーミング成長因子−β２（ＴＧＦ−β２）プロモーターの活性をＮＩＨ／３Ｔ３細胞において抑制したことを観察した。ヒトケラチノサイトでは、Ｅ６及びＥ７の過剰発現により、ＴＧＦ−β２のｍＲＮＡの発現と生物学的に活性なＴＧＦ−β２の分泌が低下した［２６］。一方、ＨＰＶ１６ Ｅ６はＴＧＦ−β１プロモーターの活性を６倍まで顕著に誘導したが、この効果は細胞種特異的であり、線維芽細胞でのみ観察されたが上皮細胞では観察されなかった［２７］。
【００４３】
本研究の状況では、Ｅ６とＥ７による不死化はΔＥ−ＭＥＦによる未分化ｈＥＳＣの増殖支持能を変化させない。３つのｈＥＳＣ株はこれらのフィーダーに容易に適応し、未分化ｈＥＳＣ培養物の典型的な形態をフィーダー培養物においても無フィーダー培養物においても維持したことを観察した。ｈＥＳＣもＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、及びアルカリホスファターゼを含めた多能性マーカーを発現し続けた。２５継代後、細胞は安定な核型を保持し、ＳＣＩＤマウスにおいて分化して奇形腫を形成できた。更に、ＨＥＳ−３無フィーダー培養物のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析により、細胞はＯｃｔ−４に対して陽性のままであるが、Ｅ６抗原及びＥ７抗原に対して陰性であることを確認した。後者の結果は、ΔＥ−ＭＥＦはｈＥＳＣとともに使用しても安全であり、これらの抗原がフィーダーからｈＥＳＣへ伝達される危険性がないことが証明されたため特筆すべきものである。顕著な量の未分化ｈＥＳＣを産生する試みでは、セルファクトリーのような大きな培養容器（およそ２〜３×１０８細胞）におけるＨＥＳ−３細胞の共培養物のスケールアップがΔＥ−ＭＥＦを用いて実現可能であることを実証した。器官培養シャーレと比較して表面積が２０８〜２６３倍に増加したにもかかわらず、培養７日後も細胞の質を落とすことなく同程度ｈＥＳＣ密度を得ることが可能であった。
【００４４】
つい最近では、本発明者らは、本明細書に記載の方法を用いて、ｈＥＳＣ増殖を支持することを以前に示した［４］３つのヒト包皮線維芽細胞（ｈＦ）株もうまく不死化させている。ΔＥ−ＭＥＦのように、不死化ｈＦ株ΔＥ−Ｈｓ６８は、未分化ＨＥＳ−３細胞の増殖支持能をフィーダー共培養物（＞２６継代）においても無フィーダー培養物（＞１６継代）においても保持した。初代Ｈｓ６８共培養物上のＨＥＳ−３細胞の３３．３時間と比較して、ＨＥＳ−３細胞の倍加時間はそれぞれ３４．５時間及び３６．４時間であった。ｈＥＳＣもＯｃｔ−４、ＧＣＴＭ−２、ＳＯＸ−２、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１に対して陽性に染色され続けた（結果は示していない）。
【００４５】
結論として、これらの結果は、Ｅ６及びＥ７を用いて細胞を不死化することはマウスフィーダーにもヒトフィーダーにも適用できる包括的戦略であることを示唆している。フィーダーの正常寿命を越える増殖能と、それにもかかわらずｈＥＳＣ増殖支持能を保持することは、初代フィーダーを頻繁に調製する必要性を排除するため有益である。この一貫したフィーダー供給源は、フィーダー条件においても無フィーダー条件においても、結果、特にｈＥＳＣのスケールアップの再現性を容易にし、フィーダーの質のバッチ間変動に関連する問題も軽減させるであろう。更に、これらの不死化フィーダー細胞株をスクリーニングして、フィーダーからｈＥＳＣへ移動し得る潜在的病原菌がないことを確実にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１ａ】初代ＭＥＦの不死化。（ａ）：Ｅ６／Ｅ７を発現するレトロウイルスを感染させたＭＥＦ（ΔＥ−ＭＥＦ）の継代７（□）及び継代４５（△）の増殖曲線、又は対照レトロウイルスを感染させたＭＥＦ（ΔＣ−ＭＥＦ）の継代７（■）の増殖曲線。培養サンプルを毎日回収し、トリパンブルー色素排除法により細胞数を測定した。
【図１ｂ】初代ＭＥＦの不死化。（ｂ）：Ｅ６／Ｅ７感染細胞（ΔＥ−ＭＥＦ、レーン２及び４）及び対照ウイルス感染細胞（ΔＣ−ＭＥＦ、レーン１及び３）におけるＨＰＶ−Ｅ６遺伝子及びＨＰＶ−Ｅ７遺伝子の発現に関するＲＴ−ＰＣＲ解析。増殖産物を１％アガロースゲルで分離した。ＭＷ１００ｂｐ ＤＮＡラダー（プロメガ）。
【図２】ΔＥ−ＭＥＦ上で直接（左パネル）又はΔＥ−ＭＥＦ由来条件培地を添加したマトリゲル上で（右パネル）培養したｈＥＳＣ株ＨＥＳ−３細胞の形態。実体顕微鏡を用いて４０倍の拡大率（ａ及びｂ、スケールバー＝４００μｍ）、並びに位相差顕微鏡を用いて４０倍（ｃ及びｄ、スケールバー＝３００μｍ）及び１００倍（ｅ、スケールバー＝１００μｍ）の拡大率で撮影したコロニーの代表的画像。
【図３】フィーダー培養物（ａ〜ｄ）又は無フィーダー培養物（ｅ〜ｇ）上のｈＥＳＣ株における細胞内Ｏｃｔ−４のフローサイトメトリー解析。ｈＥＳＣの単一細胞懸濁液を固定し、透過性にし、抗Ｏｃｔ−４モノクローナル抗体で染色した。ＦＩＴＣ結合抗マウス抗体で標識細胞を検出した。網掛けヒストグラムは陰性対照染色を表し、オープンヒストグラムはＯｃｔ−４モノクローナル抗体染色を表す。
【図４】ΔＥ−ＭＥＦと共培養した（上部パネル）又はΔＥ−ＭＥＦ由来ＣＭと培養した（下部パネル）ＨＥＳ−３上の細胞表面マーカーの発現。ＳＳＥＡ−４（ａ、ｅ）、Ｔｒａ−１−６０（ｂ、ｆ）、Ｔｒａ−１−８１（ｃ、ｇ）、及びアルカリホスファターゼ（ｄ、ｈ）を有する細胞を染色。ＳＳＥＡ−４及びＴｒａ−１−６０／８１については、その後コロニーをＰＥ結合２次抗体で染色した。ＡＰの場合、陽性の活性はローダミンフィルターにより蛍光を発する赤い沈殿物を特徴とした。スケールバー＝１００μｍ。
【図５】ΔＥ−ＭＥＦ由来ＣＭを添加した無フィーダー条件下で１４継代（７０ＰＤ）培養した、ＨＥＳ−３細胞由来の奇形腫の切片。消化管様上皮（ａ）、神経上皮（ｂ）、筋肉（ｃ）、軟骨（ｄ）、及び骨（ｅ）。スケールバー＝２０μｍ。
【図６】フィーダー条件（ａ）又は無フィーダー条件（ｂ）で培養した未分化ＨＥＳ−３細胞の細胞遺伝学的解析。２つの培養物由来のｈＥＳＣについて正常な雌性核型（４６Ｘ，Ｘ）を観察した。
【図７】ΔＥ−ＭＥＦ培養物（ａ）及びＨＥＳ−３無フィーダー培養物（ｂ）におけるＨＰＶ−Ｅ６、ＨＰＶ−Ｅ７、Ｏｃｔ−４、及びβ−アクチンの発現に関するＲＴ−ＰＣＲ解析。ＲＴ−ＰＣＲ後、増殖産物を１％アガロースゲルで分離した。
【図８】トリプルフラスコ（ａ）及びセルファクトリー（ｂ）を用いてΔＥ−ＭＥＦ上で増殖させたＨＥＳ−３細胞における細胞内Ｏｃｔ−４のフローサイトメトリー解析。網掛けヒストグラムは陰性対照染色を表し、オープンヒストグラムＯｃｔ−４モノクローナル抗体染色を表す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、不死化フィーダー細胞株、その培地、並びに幹細胞、特にヒト胚性幹細胞の培養におけるこれらの細胞及び培地の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
着床前胚の内細胞塊からのヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の単離が成功したため、今では、未分化ｈＥＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで無制限に培養し、それにより再生治療に使用すべき３つの胚性胚葉から細胞へ分化することができる材料の出発供給源を潜在的に提供することが可能である［１］。従来は、ｈＥＳＣは共培養物としてフィーダー層上に直接維持され、これらのフィーダーはマウス又はヒトの供給源から得ていた［２〜７］。つい最近では、ｈＥＳＣは無フィーダー条件下でうまく培養されている。ここでは、細胞をマトリゲルのような細胞外マトリックス上で増殖させ、フィーダー層由来の条件培地（ＣＭ）を添加する［８、９］。供給源にかかわらず、フィーダーは初代組織に由来するため、培養では寿命が限られている。例えば、初代フィーダーはおよそ７〜９継代しか培養できずに細胞が老化する。したがって、新鮮なフィーダーのバッチを定期的に調製する必要があり、これはバッチ間変動をもたらし得る。更に、フィーダーからｈＥＳＣへ病原菌が伝達され得るという懸念もある。
【０００３】
ｈＥＳＣを培養するため、特にスケールアップするための、持続可能で有効な、一貫したフィーダーの供給源を得るための可能な解決策の１つは、初代フィーダーの不死化である。不死化にはこれまでにいくつかの方法が用いられており、それらにはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）、及びヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）などのＤＮＡ腫瘍ウイルス由来の遺伝子による正常細胞の形質導入が含まれる［１０〜１４］。つい最近では、いくつかのグループが、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素ｈＴＥＲＴの過剰発現も、体細胞又は分化細胞の寿命を延長できることを報告している［１５、１６］。
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【非特許文献２】Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｍ、Ｆｏｎｇ ＣＹ、Ｃｈａｎ ＷＫら、ヒトフィーダーはヒト内細胞塊及び胚性幹細胞の長期未分化増殖を支持する。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２００２；２０：９３３−９３６．
【非特許文献３】Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ＢＥ、Ｐｅｒａ ＭＦ、Ｆｏｎｇ ＣＹら、ヒト胚盤胞由来胚性幹細胞株：ｉｎ ｖｉｔｒｏ体細胞分化。Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０００；１８：３９９−４０４．
【非特許文献４】Ｃｈｏｏ ＡＢ、Ｐａｄｍａｎａｂｈａｎ Ｊ、Ｃｈｉｎ ＡＣら、多能性ヒト胚性幹細胞のヒトフィーダー上での増殖。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ ２００４；８８：３２１−３３１．
【非特許文献５】Ａｍｉｔ Ｍ、Ｍａｒｇｕｌｅｔｓ Ｖ、Ｓｅｇｅｖ Ｈら、ヒト胚性幹細胞のためのヒトフィーダー層。Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２００３；６８：２１５０−２１５６．
【非特許文献６】Ｒｉｃｈａｒｄｓ Ｍ、Ｔａｎ Ｓ、Ｆｏｎｇ ＣＹら、ヒト胚性幹細胞の長期未分化増殖のための各種ヒトフィーダーに関する比較評価。Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００３；２１：５４６−５５６．
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【非特許文献１９】Ｓｈｉｇａ Ｔ、Ｓｈｉｒａｓａｗａ Ｈ、Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｋら、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ−１６）Ｅ６−Ｅ７遺伝子の導入により不死化した正常ヒト線維芽細胞。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７；４１：３１３−３１９．
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【非特許文献２５】Ｍｕｒｖａｉ Ｍ、Ｂｏｒｂｅｌｙ ＡＡ、Ｋｏｎｙａ Ｉら、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６及びＥ７がん遺伝子のトランスフォーミング成長因子−β２（ＴＧＦ−β２）プロモーター活性に対する効果。Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ２００４；１４９：２３７９−２３９２．
【非特許文献２６】Ｎｅｅｓ Ｍ、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ ＪＭ、Ｍｕｎｓｏｎ Ｐら、ヒトパピローマウイルス１６型のＥ６及びＥ７タンパク質は頚部ケラチノサイトにおいてトランスフォーミング成長因子−β２の分化依存性発現を阻害する。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０００；６０：４２８９−４２９８．
【非特許文献２７】Ｄｅｙ Ａ、Ａｔｃｈａ ＩＡ、Ｂａｇｃｈｉ Ｓ、ＨＰＶ１６のＥ６発癌タンパク質は線維芽細胞においてＧＣに富んだ特異配列を介してトランスフォーミング成長因子−β１プロモーターを刺激する。Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９７；２２８：１９０−１９９．
【発明の開示】
【０００４】
発明の説明
第１の側面では、本発明は、不死化フィーダー細胞株を提供する。特に、本発明は、胚線維芽細胞由来の不死化フィーダー細胞株を提供する。より詳細には、不死化フィーダー細胞株はマウス胚線維芽細胞に由来する。より詳細には、不死化フィーダー細胞株は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の分解、ｃ−ｍｙｃ発現の増加、テロメラーゼの活性化、及びｐＲｂの分解のうちの１つ以上によってマウス胚線維芽細胞から得る。より詳細には、不死化フィーダー細胞株は、ＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の導入によって胚線維芽細胞から得る。Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子は形質導入によって導入されることが好ましい。胚線維芽細胞にＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを感染させることが好ましい。大半の細胞は正常な寿命を越えて増殖し続け、レトロウイルスによる感染後のＧ４１８による抗生物質選択に耐性であることが好ましい。細胞株は不死化後腫瘍原性にならないことが好ましい。ｉｎ ｖｉｖｏでＳＣＩＤへ細胞を筋肉注射しても蝕知可能な腫瘍を注射後１６週目であっても生じないことが好ましい。
【０００５】
本発明の細胞株は、７、８、又は９継代を越えて増殖する。本発明の好ましい細胞株は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７０継代を越えて増殖し、腫瘍原性の表現型を獲得しない。本発明の細胞株は、特徴的な未分化形態を共培養物においてもＣＭ添加無フィーダー培養物においても＞４０継代維持し続け；多能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、アルカリホスファターゼを発現し続け；正常な核型を維持し；そしてＳＣＩＤマウスに注射すると３つの胚性胚葉に代表的な組織を有する奇形腫を形成するｈＥＳＣを支持する。
【０００６】
本発明の細胞株は、未分化ｈＥＳＣの増殖を支持する。ｈＥＳＣ株はこれらのフィーダーに容易に適応し、フィーダー培養物においても無フィーダー培養物においても未分化ｈＥＳＣ培養物の典型的な形態を維持する。ｈＥＳＣは、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、及びアルカリホスファターゼを含めた多能性マーカーも発現し続ける。２５継代後、細胞は安定な核型を保持し、ＳＣＩＤマウスにおいて分化して奇形腫を形成できることが好ましい。好ましくは、ｈＥＳＣ無フィーダー培養物のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析により、細胞はＯｃｔ−４に対して陽性のままであるがＥ６抗原及びＥ７抗原に対して陰性であることを確認する。
【０００７】
本発明は、Ｅ６抗原及びＥ７抗原の過剰発現により不死化した初代ＭＥＦを提供する。好ましい態様では、細胞株は本明細書に記載のΔＥ−ＭＥＦである。細胞株ΔＥ−ＭＥＦを、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定に基づくアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託した。２００５年５月９日に寄託し、受託番号ＰＴＡ−６７０５が付された。
【０００８】
また、本発明は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＰＴＡ−６７０５で寄託した不死化フィーダー細胞株を提供する。
更に、本発明は、好適な培地中の第１の側面の不死化フィーダー細胞株の培養物、及び好適な担体又は希釈剤中に第１の側面の不死化フィーダー細胞株を含む組成物を提供する。
【０００９】
第２の側面では、本発明は、第１の側面の不死化フィーダー細胞株の増殖から生ずる条件培地を提供する。
条件培地はマトリゲルのような細胞外マトリックスとともに用いてもよい。
【００１０】
第３の側面では、本発明は、第１の側面の細胞株のフィーダー細胞としての使用を含む、幹細胞の培養方法を提供する。好ましくは、幹細胞はヒト幹細胞である。より好ましくは、幹細胞はヒト胚性幹細胞である。
【００１１】
第４の側面では、本発明は、第２の側面の条件培地の使用を含む、幹細胞の培養方法を提供する。好ましくは、幹細胞はヒト幹細胞である。より好ましくは、幹細胞はヒト胚性幹細胞である。
【００１２】
第３及び第４の側面の方法には、セルファクトリーのような培養容器中でスケールアップした量の未分化ｈＥＳＣが含まれる。スケールアップした量は＞１０８細胞であり得る。
【００１３】
第５の側面では、本発明は、本発明の第３又は第４の側面の方法によって培養される幹細胞を提供する。好ましくは、幹細胞はヒト幹細胞である。より好ましくは、幹細胞はヒト胚性幹細胞である。
【００１４】
ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）は、培養で無制限に増殖する可能性を有し、広範な細胞への分化能を依然として保持する多能性細胞である。しかしながら、ｈＥＳＣ培養物は、直接接触するフィーダーかフィーダー由来の条件培地（ＣＭ）を必要とする。最も一般的なフィーダーの供給源は、初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）である。
【００１５】
本研究では、初代ＭＥＦの増殖能を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子をコードするレトロウイルスベクターで感染後その正常な寿命を越えて延長できるかどうか調査した。Ｅ６タンパク質の過剰発現は、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の分解とともに、ｃ−ｍｙｃ発現の増加及びテロメラーゼの活性化を引き起こす［１７］。一方、発現したＥ７タンパク質は網膜芽細胞腫タンパク質ｐＲｂに結合し、ｐＲｂの分解をもたらす［１８］。Ｅ６及びＥ７の発現により、正常ヒト線維芽細胞、乳房上皮細胞、及び包皮ケラチノサイトを効率的に不死化できることが以前に示されている［１１、１９、２０］。本研究において、Ｅ６抗原及びＥ７抗原の過剰発現により初代ＭＥＦをうまく不死化させた。不死化ＭＥＦであるΔＥ−ＭＥＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで７０継代を越えて増殖し続け、腫瘍原性の表現型を獲得する細胞は生じなかった。更に、初代ＭＥＦ上で先に増殖させた３つのｈＥＳＣ株は、フィーダー条件又は無フィーダー条件でもΔＥ−ＭＥＦに容易に適応した。
【００１６】
形態学的にｈＥＳＣは未分化のままであり、多能性に特徴的な細胞内マーカー及び細胞外マーカーをともに発現し続けた。ｈＥＳＣ培養物は正常な核型も保持し、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて奇形腫を形成した。
【００１７】
本研究では、ＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを感染させることにより初代ＭＥＦ株を不死化させた。初代細胞は老化するが、不死化株ΔＥ−ＭＥＦは７〜９継代を越えて増殖でき、寿命が７０継代を越えて延長する。ｈＥＳＣ増殖支持能を試験したところ、ΔＥ−ＭＥＦとの共培養物においてもΔＥ−ＭＥＦ由来ＣＭを添加した無フィーダー培養物においてもｈＥＳＣは特徴的な未分化形態を＞４０継代維持し続けることがわかった。培養物は、多能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、アルカリホスファターゼも発現し続け、正常な核型を維持する。更に、これらのｈＥＳＣはＳＣＩＤマウスに注射すると３つの胚性胚葉に代表的な組織を有する奇形腫を形成した。最後に、顕著な量の未分化ｈＥＳＣ（＞１０８細胞）をセルファクトリーのような培養容器内でΔＥ−ＭＥＦを用いてスケールアップ可能であることも実証した。この研究の結果は、不死化フィーダーが、ｈＥＳＣの増殖及び研究のためのフィーダーの一貫した再現性のある供給源を提供することができ、したがって、初代フィーダーよりも有益であることを示唆している。
【００１８】
形態学的にｈＥＳＣは未分化のままであり、多能性に特徴的な細胞内マーカーと細胞外マーカーをともに発現し続けた。ｈＥＳＣ培養物は正常な核型も保持し、ＳＣＩＤマウスモデルにおいて奇形腫を形成した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
材料及び方法
細胞培養
ヒト胚性幹細胞株ＨＥＳ−２（４６Ｘ，Ｘ）、ＨＥＳ−３（４６Ｘ，Ｘ）、及びＨＥＳ−４（４６Ｘ，Ｙ）をＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから入手した。細胞を、ゼラチンコーティングされた器官培養シャーレ内にてマイトマイシンＣで不活化したフィーダー（〜４×１０４細胞／ｃｍ２）上で（共培養物）、又はフィーダー由来ＣＭを添加したマトリゲルコーティングされた器官培養シャーレ内で（無フィーダー培養物）、３７℃／５％ＣＯ２にて培養した。ｈＥＳＣの培養に用いる培地は、１５％ＫＯ血清代替物、１ｍＭ Ｌ−グルタミン、１％非必須アミノ酸、及び０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール、及び４〜８ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（インビトロジェン）を添加した８５％ＫＯ−ＤＭＥＭを含有するノックアウト（ＫＯ）培地である。培地を毎日交換し、先に記載されたように培養物を毎週、酵素処理の後で継代した［４］。無フィーダー培養物の培養シャーレを、冷ＫＯ−ＤＭＥＭで希釈した（１：３０希釈）マトリゲル（ベクトン・ディッキンソン）とともに４０℃で一晩インキュベーションした。
【００２０】
ＭＥＦ及びＭＥＦ条件培地（ＣＭ）の調製
初代ＭＥＦをＲｏｂｅｒｔｓｏｎら［２１］に記載の方法を用いて１２９Ｘ１／ＳｖＪマウス（交尾後１３．５日目）の胎児から単離した。単層の初代ＭＥＦ（継代４）をコンフルエントになるまで培養し、１０μｇ／ｍｌマイトマイシンＣで２．５〜３時間処理した。処理後、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡで細胞を剥がし、Ｆ−ＤＭＥＭ培地の入った器官培養シャーレ上に上記のように蒔いた。この培地は、９０％ＤＭＥＭ高グルコース、１０％ＦＢＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２５Ｕ／ｍｌペニシリン、及び２５μｇ／ｍｌストレプトマイシン（インビトロジェン）から成る。播種後２４時間に培地をＫＯ培地に交換し、ｈＥＳＣ又はＭＥＦ−ＣＭの回収物を添加する前に更に２４時間平衡化させた。ＭＥＦ−ＣＭについては、培養シャーレに１．４×１０５細胞／ｃｍ２のマイトマイシンＣで処理したＭＥＦを蒔き、ＫＯ培地をシャーレに添加した後、ＣＭを２４時間毎に回収した。ＣＭをろ過し（０．２２μｍ）、更に８ｎｇ／ｍｌの組換えヒト塩基性線維芽細胞成長因子（インビトロジェン）を添加した。
【００２１】
不死化フィーダー株ΔＥ−ＭＥＦの確立
継代３の初代ＭＥＦ（３×１０５細胞）を７５ｃｍ２のＴフラスコに蒔き、Ｆ−ＤＭＥＭ培地中で一晩接着させた。次に細胞に、ＰＡ３１７ ＬＸＳＮ ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７又はＰＡ３１７ ＰＸＳＶパッケージング細胞株（それぞれＣＲＬ−２２０３及びＣＲＬ−２２０２、ＡＴＣＣ）由来のレトロウイルスを含有する滅菌ろ過した上清を８μｇ／ｍｌのポリブレン（シグマアルドリッチ）存在下で３７℃にて８時間形質導入した［２２］。その後、ウイルス含有培地を除去し、新鮮なＦ−ＤＭＥＭに交換して更に３日間インキュベーションした。次に形質導入細胞を１００μｇ／ｍｌのＧ４１８（シグアルドリッチ）存在下で１４日間選択した。確立したフィーダー株ΔＥ−ＭＥＦは抗生物質不含Ｆ−ＤＭＥＭ培地中で日常的に培養し、ストックは９０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯ中で凍結保存した。
【００２２】
増殖速度及び倍加時間
０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（インビトロジェン）で処理後、ＭＥＦ及びｈＥＳＣの単一細胞懸濁液を毎日回収した（植菌後１〜６日）。トリパンブルー色素排除法を用いて各サンプルについて生存細胞数及び生存率を測定した。生存細胞数対時間のグラフをプロットして指数関数的増殖相における細胞の比増殖速度を概算した。これから、以下の等式：ｔｄ＝ｌｎ（２）／μ（式中、μは比増殖速度（ｈｒ−１）である）を用いて倍加時間（ｔｄ）を計算した。
【００２３】
Ｏｃｔ−４発現のフローサイトメトリー解析
ｈＥＳＣ集団における細胞内転写因子Ｏｃｔ−４の発現レベルを、フローサイトメトリーを用いた免疫蛍光法にて評価した。細胞をトリプシンを用いて単一細胞懸濁液として回収し、固定し、透過性にし（カルタグラボラトリーズ）、１：２０希釈した抗Ｏｃｔ−４マウスモノクローナル抗体（サンタクルーズ）とともにインキュベーションした。次に細胞を１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、１：５００希釈したＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（ＤＡＫＯ）とともに暗所にてインキュベーションした。インキュベーション後、細胞を再度洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ）による解析のため１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁させた。全てのインキュベーションは室温で１５分間行った。陰性対照として、細胞を適切なアイソタイプ対照で染色した。
【００２４】
免疫細胞化学
細胞を４％パラホルムアルデヒドで室温にて４５分間固定し、ＳＳＥＡ−４（原液、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ）、Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１（３０μｇ／ｍｌ、ケミコン）に対する抗体とともに室温で１時間インキュベーションした。抗体の局在をＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウス抗体（１：５００希釈；ＤＡＫＯ）を用いて可視化した。
【００２５】
アルカリホスファターゼ染色
ベクターレッドアルカリホスファターゼ基質キットＩ（ベクターラボラトリーズ）を用いて、製造者のプロトコールにしたがいアルカリホスファターゼ染色を行った。簡潔には、ｈＥＳＣをＰＢＳで１回洗浄後、ベクターレッド基質作用液とともに暗所で４５分間室温にてインキュベーションした。ローダミン励起フィルターと発光フィルターを用いて反応産物を可視化した。
【００２６】
ＲＮＡの単離と逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ製ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡＩＩキットを用いてｈＥＳＣ及びＭＥＦから全ＲＮＡを単離し、紫外線分光光度法にて定量した。オリゴｄＴプライマー及びＩｍＰｒｏｍ ＩＩ逆転写酵素（プロメガ）を用いて、１μｇの全ＲＮＡについて標準の逆転写反応を行った。Ｏｃｔ−４、β−アクチン、ＨＰＶ−１６ Ｅ６、及びＨＰＶ−１６ Ｅ７に特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行った（表１）。増幅に用いたサイクリングパラメータは、９５℃で１分間、５５℃で１分間、及び７２℃で１分間を３０サイクルである。この後に７２℃で１０分間の最終伸長が続いた。増殖産物を１％アガロースゲル上で可視化し、エチジウムブロマイドで染色した。
【００２７】
ＳＣＩＤマウスモデル
ΔＭＥＦ及びｈＥＳＣを酵素処理し、およそ４〜５×１０６細胞を滅菌２２Ｇ針で４週齢雄性ＳＣＩＤマウスの後肢筋肉に注射した。腫瘍を発症した動物（注射後およそ９〜１０週）を屠殺し、腫瘍を切開し、１０％ホルマリンで固定した。腫瘍をパラフィンに包埋し、切片を作製し、ヘマトキシリン・エオシン染色後、組織学的に試験した。
【００２８】
核型分析
ＮＵＳ又はＫＫ女性及び小児病院の産婦人科の細胞遺伝学実験室で核型分析を行った。
ｈＥＳＣ共培養物のスケールアップ
ｈＥＳＣ量をスケールアップするため、共培養物を組織培養フラスコ（Ｔ７５、７５ｃｍ２）、トリプルフラスコ（ＴＦ、５００ｃｍ２）、及びセルファクトリー（ＣＦ、６３２ｃｍ２）（Ｎｕｎｃ）で増殖させた。用いた培養条件は上記と同様であった。全ての表面に対し、マイトマイシンＣ不活化フィーダーをゼラチンコーティングした培養表面におよそ４×１０４細胞／ｃｍ２で蒔いた。継代のため、細胞をリン酸緩衝食塩水＋（ＰＢＳ＋）で洗浄し、次いで０．０５％トリプシン（インビトロジェン）とともに室温で２〜３分間インキュベーションした。細胞をフラスコからタッピングにより剥がし、ピペッティングを穏やかに繰り返すことによってより小さな塊まで更に分離させた。その後、トリプシンを中和し、不活化フィーダーを蒔いた新たなゼラチンコーティングフラスコへ細胞塊を１：３の比で播種した。
【００２９】
結果
不死化ＭＥＦの確立と特徴付け
継代３の初代ＭＥＦにＨＰＶ１６−Ｅ６、ＨＰＶ１６−Ｅ７、及びネオマイシン耐性を同時にコードするレトロウイルスを感染させた（ΔＥ−ＭＥＦ）。陰性対照として、ネオマイシン耐性のみを含有する対照レトロウイルスを細胞に感染させた（ΔＣ−ＭＥＦ）。感染後４継代目に（感染後およそ１２日、Ｐ７）、ΔＥ−ＭＥＦは１９．７時間の適切な倍加時間で増殖し続けた（図１ａ）。更に、ΔＥ−ＭＥＦの増殖速度及び倍加時間は継代４の初代ＭＥＦに匹敵するものであった（表２）。対照的に、継代７の対照ウイルス感染細胞（ΔＣ−ＭＥＦ）は、同一の６日間にわたって生存細胞数が顕著に増加しなかったため老化の徴候を示した（図１ａ）。４５継代後（１６５集団倍加）、ΔＥ−ＭＥＦは、継代７に匹敵する類似の成長速度を維持し続け（図１ａ）、現在のところ７０継代を越えて増殖能が低下することなく培養されている（データは示していない）。継代７のΔＥ−ＭＥＦ及びΔＣ−ＭＥＦからＲＮＡを単離し、レトロウイルス感染の結果として導入されたＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子の発現に関し、ＲＴ−ＰＣＲで試験した。図１ｂから、ΔＥ−ＭＥＦはＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子のｍＲＮＡを発現した（それぞれレーン２及び４）が、細胞に対照ウイルスを感染させたΔＣ−ＭＥＦでは発現が全く見られない（レーン１及び３）ことが明らかとなった。
【００３０】
ΔＥ−ＭＥＦが、Ｅ６及びＥ７による不死化の後、腫瘍形成可能であるかどうか決定するために、５×１０６細胞をＳＣＩＤマウスに注射した。動物を定期的に試験したところ、蝕知可能な腫瘍は細胞の注射後１６週目であっても全く見られなかった（データは示していない）。
【００３１】
不死化ＭＥＦを用いたフィーダー条件及び無フィーダー条件におけるｈＥＳＣの増殖及び形態
初代ＭＥＦ上で直接（共培養物）又は初代ＭＥＦ培養物由来条件培地を添加したマトリゲル上で（無フィーダー）ヒトＥＳ細胞株ＨＥＳ−３を日常的に培養した。不死化ＭＥＦ株ΔＥ−ＭＥＦがｈＥＳＣの未分化増殖を支持可能かどうか評価するために、代わりにΔＥ−ＭＥＦを用いてＨＥＳ−３細胞をそれぞれの条件で蒔いた。
【００３２】
共培養物の場合、ΔＥ−ＭＥＦ上に蒔いたＨＥＳ−３細胞塊は、フィーダーを脇へ押しやりながら増殖し、コロニーを形成した。これは、コロニー周辺の線維芽細胞の非常に目立つ境界をコロニーにもたらした（図２ａ及び２ｃ）。形態学的に、コロニー内のｈＥＳＣは密に集団化したままであり、高い核対細胞質比を維持した（図２ｅ）。無フィーダー培養物の場合、フィーダーがないにもかかわらず、ΔＥ−ＭＥＦ条件培地を添加されたマトリゲル上のｈＥＳＣは、フィーダー上で培養されたｈＥＳＣと同様の目立つ小型コロニーを形成し続けた（図２ｂ及び２ｄ）。興味深いことに、未分化コロニーの境界周返に分化した線維芽細胞様細胞が観察されたが、これらの細胞の密度はｈＥＳＣと比較して顕著に少なかった（図２ｄ）。フィーダー条件及び無フィーダー条件では、ＨＥＳ−３細胞は未分化ｈＥＳＣの形態を４０連続継代（２１０集団倍加、ＰＤ）より長く維持し続けた。更に２つのｈＥＳＣ株ＨＥＳ−２及びＨＥＳ−４についてもフィーダー培養物及び無フィーダー培養物において類似の形態が１０継代より長く観察された（データは示していない）。更に、これら２つの培養条件におけるＨＥＳ−３細胞の比増殖速度及び倍加時間は同程度のものであり（表２）、既刊文献に相当した［４、２３］。
【００３３】
未分化ｈＥＳＣに特有のマーカーの特徴付け
未分化ｈＥＳＣは、細胞内転写因子Ｏｃｔ−４、及びＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１などの表面マーカーのような一連のマーカーの発現を特徴とする。フローサイトメトリーを用いて、３つのｈＥＳＣ株全てにおいて、フィーダー条件及び無フィーダー条件におけるＯｃｔ−４の発現を比較した（図３）。初代ＭＥＦ上で培養されたＨＥＳ−３細胞と同様に（図３ａ）、ΔＥ−ＭＥＦ上で培養されたＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、及びＨＥＳ−４細胞の＞８８％はＯｃｔ−４に対して陽性に染色された（それぞれ図３ｃ、３ｂ、及び３ｄ）。同様に、ΔＥ−ＭＥＦ由来ＣＭを添加して無フィーダー条件で維持したところ、＞９７％の細胞（３つのｈＥＳＣ株全て）はＯｃｔ−４に対して陽性であった（図３ｅ〜３ｇ）。更に、ΔＥ−ＭＥＦ（図４、上部パネル）又はΔＥ−ＭＥＦ ＣＭ（図４、下部パネル）上で培養されたＨＥＳ−３細胞は、ＳＳＥＡ−４（図４ａ、４ｅ）、Ｔｒａ−１−６０（図４ｂ、４ｆ）、Ｔｒａ−１−８１（図４ｃ、４ｇ）に対して陽性に染色され、アルカリホスファターゼ活性が高かった（図４ｄ、４ｈ）。
【００３４】
分化した組織をｉｎ ｖｉｖｏで形成する可能性を評価するために、ΔＥ−ＭＥＦを用いてフィーダー培養物又は無フィーダー培養物上で維持したＨＥＳ−３細胞をＳＣＩＤマウスへ注射した。注射後１０週目に、全ての条件で奇形腫が観察された。腫瘍から切片を作製し、組織学的に試験した。切片から、消化管様上皮（内肺葉、図５ａ）、神経上皮（外胚葉、図５ｂ）、筋肉、軟骨、及び骨（中胚葉、図５ｃ〜５ｅ）を含めた３つの胚性胚葉に代表的な組織が同定された。更に、少なくとも２５連続継代（１３０ＰＤ）後、フィーダー細胞集団及び無フィーダー細胞集団に由来するＨＥＳ−３細胞について細胞遺伝学的試験を行った（それぞれ図６ａ及び６ｂ）。解析の結果は、ＨＥＳ−３細胞がいずれの培養条件下においても正常な核型（４６Ｘ，Ｘ）を維持し続けたことを示した。
【００３５】
最後に、レトロウイルスを用いて初代ＭＥＦを不死化したため、ｈＥＳＣをＥ６抗原及びＥ７抗原で感染させ得るウイルスがΔＥ−ＭＥＦによって産生されていないことを立証することが重要であった。ＲＴ−ＰＣＲは４０継代後のＨＥＳ−３無フィーダー培養物においてＥ６抗原及びＥ７抗原の発現を検出しなかった（図７ｂ）。代わりに、Ｏｃｔ−４の発現が検出され、ｈＥＳＣが未分化のままであることを確認した。対照として、ΔＥ−ＭＥＦについてもＲＴ−ＰＣＲを行った（図７ａ）。ここで、フィーダーによるＥ６抗原及びＦ７抗原の発現は検出されたが、Ｏｃｔ−４は検出されなかった。
【００３６】
ΔＥ−ＭＥＦを用いたＨＥＳ−３共培養物のスケールアップ
ΔＥ−ＭＥＦが未分化ｈＥＳＣのスケールアップに使用できることを実証するために、共培養物を器官培養シャーレから組織培養フラスコへ増殖させた。次に組織培養フラスコの細胞を、トリプルフラスコ及びセルファクトリーへのｈＥＳＣの増殖のための播種材料として用いた。表３から、これらの大きな培養容器において７日後に得た総細胞収率は、およそ２〜３×１０８細胞であった。器官培養シャーレと比較してトリプルフラスコ及びセルファクトリーの表面積がそれぞれ２０８倍及び２６３倍に増加したにもかかわらず、細胞密度はおよそ０．３７〜０．４７×１０６細胞／ｃｍ２に維持されたことも明らかとなった。更に、トリプルフラスコ及びセルファクトリー内の８９％〜９６％の増殖ｈＥＳＣ集団はＯｃｔ−４に対して陽性に染色され続けた（それぞれ図８ａ及び８ｂ）。総合すると、これらの結果は、未分化ｈＥＳＣをΔＥ−ＭＥＦ共培養物上で顕著な量まで増殖可能であることを示唆している。
【００３７】
【表１】
【００３８】
【表２】
【００３９】
【表３】
【００４０】
考察
フィーダー細胞は、ｈＥＳＣの培養において必須成分である。マウス胚性幹細胞とは異なり、ｈＥＳＣは、フィーダーに直接接触する共培養物としても、フィーダー−ＣＭを添加した無フィーダー培養物においても増殖する。これらの条件下では、ｈＥＳＣは未分化表現型を維持し続ける。しかしながら、ｈＥＳＣの研究に近年用いられたフィーダーは、マウス又はヒトの供給源の初代組織に由来することが主要な限界である。正常体細胞のように、培養におけるそれらの寿命は限られており、有限数の複製後に老化するであろう。ＨＰＶ１６ Ｅ６抗原及びＥ７抗原による初代細胞の形質導入は、ヒト線維芽細胞の寿命を２００集団倍加を越えて延長させることを示している［１９］。
【００４１】
本研究では、ＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７の感染により、初代ＭＥＦの寿命を７〜９継代から７０継代（２５０集団倍加）を越えて延長させることができることを実証した。Ｅ６抗原及びＥ７抗原の発現をＲＴ−ＰＣＲで確認した。ＳＶ４０、Ｅ６／Ｅ７などの遺伝子を用いて不死化させた細胞は、大部分の細胞が老化する危機段階に入ることが先に報告されている。この集団から、分裂し続ける細胞は不死化細胞株を形成し続ける［２４］。興味深いことに、これは、ΔＥ−ＭＥＦでは観察されなかった。大半の細胞は正常な寿命を越えて増殖し続け、レトロウイルス感染後のＧ４１８による抗生物質選択に耐性であった。ｉｎ ｖｉｖｏでＳＣＩＤへΔＥ−ＭＥＦを筋肉注射しても、注射後１６週目であっても蝕知可能な腫瘍を生じなかった。これは、ΔＥ−ＭＥＦが不死化後も腫瘍原性になっていないことを裏付けている。対照的に、等量のｈＥＳＣを注射すると、注射後９〜１０週目におよそ直径１〜２ｃｍの奇形腫を形成した。
【００４２】
細胞を不死化させるためにＥ６抗原及びＥ７抗原を使用することの主な懸念は、不死化はｐ５３及び網膜芽細胞腫タンパク質の分解により達成できるが、Ｅ６及びＥ７は不死化細胞の他の経路や細胞機能にも影響を及ぼし得ることが報告されていることである。Ｍｕｒｖａｉら［２５］は、ＨＰＶ１６ Ｅ７もトランスフォーミング成長因子−β２（ＴＧＦ−β２）プロモーターの活性をＮＩＨ／３Ｔ３細胞において抑制したことを観察した。ヒトケラチノサイトでは、Ｅ６及びＥ７の過剰発現により、ＴＧＦ−β２のｍＲＮＡの発現と生物学的に活性なＴＧＦ−β２の分泌が低下した［２６］。一方、ＨＰＶ１６ Ｅ６はＴＧＦ−β１プロモーターの活性を６倍まで顕著に誘導したが、この効果は細胞種特異的であり、線維芽細胞でのみ観察されたが上皮細胞では観察されなかった［２７］。
【００４３】
本研究の状況では、Ｅ６とＥ７による不死化はΔＥ−ＭＥＦによる未分化ｈＥＳＣの増殖支持能を変化させない。３つのｈＥＳＣ株はこれらのフィーダーに容易に適応し、未分化ｈＥＳＣ培養物の典型的な形態をフィーダー培養物においても無フィーダー培養物においても維持したことを観察した。ｈＥＳＣもＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、及びアルカリホスファターゼを含めた多能性マーカーを発現し続けた。２５継代後、細胞は安定な核型を保持し、ＳＣＩＤマウスにおいて分化して奇形腫を形成できた。更に、ＨＥＳ−３無フィーダー培養物のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析により、細胞はＯｃｔ−４に対して陽性のままであるが、Ｅ６抗原及びＥ７抗原に対して陰性であることを確認した。後者の結果は、ΔＥ−ＭＥＦはｈＥＳＣとともに使用しても安全であり、これらの抗原がフィーダーからｈＥＳＣへ伝達される危険性がないことが証明されたため特筆すべきものである。顕著な量の未分化ｈＥＳＣを産生する試みでは、セルファクトリーのような大きな培養容器（およそ２〜３×１０８細胞）におけるＨＥＳ−３細胞の共培養物のスケールアップがΔＥ−ＭＥＦを用いて実現可能であることを実証した。器官培養シャーレと比較して表面積が２０８〜２６３倍に増加したにもかかわらず、培養７日後も細胞の質を落とすことなく同程度ｈＥＳＣ密度を得ることが可能であった。
【００４４】
つい最近では、本発明者らは、本明細書に記載の方法を用いて、ｈＥＳＣ増殖を支持することを以前に示した［４］３つのヒト包皮線維芽細胞（ｈＦ）株もうまく不死化させている。ΔＥ−ＭＥＦのように、不死化ｈＦ株ΔＥ−Ｈｓ６８は、未分化ＨＥＳ−３細胞の増殖支持能をフィーダー共培養物（＞２６継代）においても無フィーダー培養物（＞１６継代）においても保持した。初代Ｈｓ６８共培養物上のＨＥＳ−３細胞の３３．３時間と比較して、ＨＥＳ−３細胞の倍加時間はそれぞれ３４．５時間及び３６．４時間であった。ｈＥＳＣもＯｃｔ−４、ＧＣＴＭ−２、ＳＯＸ−２、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１に対して陽性に染色され続けた（結果は示していない）。
【００４５】
結論として、これらの結果は、Ｅ６及びＥ７を用いて細胞を不死化することはマウスフィーダーにもヒトフィーダーにも適用できる包括的戦略であることを示唆している。フィーダーの正常寿命を越える増殖能と、それにもかかわらずｈＥＳＣ増殖支持能を保持することは、初代フィーダーを頻繁に調製する必要性を排除するため有益である。この一貫したフィーダー供給源は、フィーダー条件においても無フィーダー条件においても、結果、特にｈＥＳＣのスケールアップの再現性を容易にし、フィーダーの質のバッチ間変動に関連する問題も軽減させるであろう。更に、これらの不死化フィーダー細胞株をスクリーニングして、フィーダーからｈＥＳＣへ移動し得る潜在的病原菌がないことを確実にすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１ａ】初代ＭＥＦの不死化。（ａ）：Ｅ６／Ｅ７を発現するレトロウイルスを感染させたＭＥＦ（ΔＥ−ＭＥＦ）の継代７（□）及び継代４５（△）の増殖曲線、又は対照レトロウイルスを感染させたＭＥＦ（ΔＣ−ＭＥＦ）の継代７（■）の増殖曲線。培養サンプルを毎日回収し、トリパンブルー色素排除法により細胞数を測定した。
【図１ｂ】初代ＭＥＦの不死化。（ｂ）：Ｅ６／Ｅ７感染細胞（ΔＥ−ＭＥＦ、レーン２及び４）及び対照ウイルス感染細胞（ΔＣ−ＭＥＦ、レーン１及び３）におけるＨＰＶ−Ｅ６遺伝子及びＨＰＶ−Ｅ７遺伝子の発現に関するＲＴ−ＰＣＲ解析。増殖産物を１％アガロースゲルで分離した。ＭＷ１００ｂｐ ＤＮＡラダー（プロメガ）。
【図２】ΔＥ−ＭＥＦ上で直接（左パネル）又はΔＥ−ＭＥＦ由来条件培地を添加したマトリゲル上で（右パネル）培養したｈＥＳＣ株ＨＥＳ−３細胞の形態。実体顕微鏡を用いて４０倍の拡大率（ａ及びｂ、スケールバー＝４００μｍ）、並びに位相差顕微鏡を用いて４０倍（ｃ及びｄ、スケールバー＝３００μｍ）及び１００倍（ｅ、スケールバー＝１００μｍ）の拡大率で撮影したコロニーの代表的画像。
【図３】フィーダー培養物（ａ〜ｄ）又は無フィーダー培養物（ｅ〜ｇ）上のｈＥＳＣ株における細胞内Ｏｃｔ−４のフローサイトメトリー解析。ｈＥＳＣの単一細胞懸濁液を固定し、透過性にし、抗Ｏｃｔ−４モノクローナル抗体で染色した。ＦＩＴＣ結合抗マウス抗体で標識細胞を検出した。網掛けヒストグラムは陰性対照染色を表し、オープンヒストグラムはＯｃｔ−４モノクローナル抗体染色を表す。
【図４】ΔＥ−ＭＥＦと共培養した（上部パネル）又はΔＥ−ＭＥＦ由来ＣＭと培養した（下部パネル）ＨＥＳ−３上の細胞表面マーカーの発現。ＳＳＥＡ−４（ａ、ｅ）、Ｔｒａ−１−６０（ｂ、ｆ）、Ｔｒａ−１−８１（ｃ、ｇ）、及びアルカリホスファターゼ（ｄ、ｈ）を有する細胞を染色。ＳＳＥＡ−４及びＴｒａ−１−６０／８１については、その後コロニーをＰＥ結合２次抗体で染色した。ＡＰの場合、陽性の活性はローダミンフィルターにより蛍光を発する赤い沈殿物を特徴とした。スケールバー＝１００μｍ。
【図５】ΔＥ−ＭＥＦ由来ＣＭを添加した無フィーダー条件下で１４継代（７０ＰＤ）培養した、ＨＥＳ−３細胞由来の奇形腫の切片。消化管様上皮（ａ）、神経上皮（ｂ）、筋肉（ｃ）、軟骨（ｄ）、及び骨（ｅ）。スケールバー＝２０μｍ。
【図６】フィーダー条件（ａ）又は無フィーダー条件（ｂ）で培養した未分化ＨＥＳ−３細胞の細胞遺伝学的解析。２つの培養物由来のｈＥＳＣについて正常な雌性核型（４６Ｘ，Ｘ）を観察した。
【図７】ΔＥ−ＭＥＦ培養物（ａ）及びＨＥＳ−３無フィーダー培養物（ｂ）におけるＨＰＶ−Ｅ６、ＨＰＶ−Ｅ７、Ｏｃｔ−４、及びβ−アクチンの発現に関するＲＴ−ＰＣＲ解析。ＲＴ−ＰＣＲ後、増殖産物を１％アガロースゲルで分離した。
【図８】トリプルフラスコ（ａ）及びセルファクトリー（ｂ）を用いてΔＥ−ＭＥＦ上で増殖させたＨＥＳ−３細胞における細胞内Ｏｃｔ−４のフローサイトメトリー解析。網掛けヒストグラムは陰性対照染色を表し、オープンヒストグラムＯｃｔ−４モノクローナル抗体染色を表す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不死化フィーダー細胞株。
【請求項２】
胚線維芽細胞由来の不死化フィーダー細胞株。
【請求項３】
マウス胚線維芽細胞由来の不死化フィーダー細胞株。
【請求項４】
ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の分解、ｃ−ｍｙｃ発現の増加、テロメラーゼ活性化、及びｐＲｂの分解のうちの１つ以上によってマウス胚線維芽細胞から得た不死化フィーダー細胞株。
【請求項５】
ＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子を導入することによって胚線維芽細胞から得た不死化フィーダー細胞株。
【請求項６】
Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子が形質導入によって導入される、請求項５に記載の不死化フィーダー細胞。
【請求項７】
胚線維芽細胞にＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを感染させる、請求項６に記載の不死化フィーダー細胞。
【請求項８】
大半の細胞が正常な寿命を越えて増殖し続け、レトロウイルス感染後のＧ４１８による抗生物質選択に耐性である、請求項７に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項９】
不死化後腫瘍原性にならない、請求項７に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１０】
ｉｎ ｖｉｖｏでＳＣＩＤへ細胞を筋肉注射しても、蝕知可能な腫瘍を注射後１６週目であっても生じない、請求項９に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１１】
７、８、又は９継代を越えて増殖する、請求項１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで７０継代を越えて増殖し、腫瘍原性の表現型を獲得しない、請求項１１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１３】
特徴的な未分化形態を共培養物においてもＣＭを添加した無フィーダー培養物においても＞４０継代維持し続け；多能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、アルカリホスファターゼを発現し続け；正常な核型を維持し；そしてＳＣＩＤマウスに注射すると３つの胚性胚葉に代表的な組織を有する奇形腫を形成するｈＥＳＣを支持する、請求項１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１４】
未分化ｈＥＳＣの増殖を支持する、請求項１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１５】
ｈＥＳＣ株が容易に適応し、未分化ｈＥＳＣ培養物の典型的な形態をフィーダー培養物においても無フィーダー培養物においても維持する、請求項１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１６】
ｈＥＳＣが、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、及びアルカリホスファターゼを含めた多能性マーカーを発現し続ける、請求項１５に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１７】
２５継代後、ｈＥＳＣが安定な核型を保持し、ＳＣＩＤマウスにおいて分化して奇形腫を形成可能である、請求項１５に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１８】
ＨＥＳ無フィーダー培養物のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析により、細胞はＯｃｔ−４に対して陽性のままであるが、Ｅ６抗原及びＥ７抗原に対して陰性であることを確認する、請求項１５に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１９】
Ｅ６抗原及びＥ７抗原の過剰発現により不死化した初代ＭＥＦ。
【請求項２０】
本明細書に記載の細胞株ΔＥ−ＭＥＦ。
【請求項２１】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＰＴＡ−６７０５で寄託した不死化フィーダー細胞株。
【請求項２２】
好適な培地中の、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の不死化フィーダー細胞株の培養物。
【請求項２３】
好適な担体又は希釈剤中に請求項１〜２１のいずれか１項に記載の不死化フィーダー細胞株を含む組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の不死化フィーダー細胞株の増殖から生ずる条件培地。
【請求項２５】
マトリゲルなどの細胞外マトリックスとともに用いる、請求項２４に記載の条件培地。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の細胞株のフィーダー細胞としての使用を含む、幹細胞の培養方法。
【請求項２７】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２４又は２５に記載の条件培地の使用を含む、幹細胞の培養方法。
【請求項３０】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
スケールアップした量の未分化ｈＥＳＣをセルファクトリーなどの培養容器内で産生する、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
スケールアップした量が＞１０８細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
クレーム２６〜３１のいずれか１項に記載の方法によって培養された幹細胞。
【請求項３５】
請求項３４に記載のヒト幹細胞。
【請求項３６】
請求項３２に記載のヒト胚性幹細胞。
【請求項１】
不死化フィーダー細胞株。
【請求項２】
胚線維芽細胞由来の不死化フィーダー細胞株。
【請求項３】
マウス胚線維芽細胞由来の不死化フィーダー細胞株。
【請求項４】
ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の分解、ｃ−ｍｙｃ発現の増加、テロメラーゼ活性化、及びｐＲｂの分解のうちの１つ以上によってマウス胚線維芽細胞から得た不死化フィーダー細胞株。
【請求項５】
ＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子を導入することによって胚線維芽細胞から得た不死化フィーダー細胞株。
【請求項６】
Ｅ６遺伝子及びＥ７遺伝子が形質導入によって導入される、請求項５に記載の不死化フィーダー細胞。
【請求項７】
胚線維芽細胞にＨＰＶ１６由来のＥ６遺伝子及びＥ７遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを感染させる、請求項６に記載の不死化フィーダー細胞。
【請求項８】
大半の細胞が正常な寿命を越えて増殖し続け、レトロウイルス感染後のＧ４１８による抗生物質選択に耐性である、請求項７に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項９】
不死化後腫瘍原性にならない、請求項７に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１０】
ｉｎ ｖｉｖｏでＳＣＩＤへ細胞を筋肉注射しても、蝕知可能な腫瘍を注射後１６週目であっても生じない、請求項９に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１１】
７、８、又は９継代を越えて増殖する、請求項１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで７０継代を越えて増殖し、腫瘍原性の表現型を獲得しない、請求項１１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１３】
特徴的な未分化形態を共培養物においてもＣＭを添加した無フィーダー培養物においても＞４０継代維持し続け；多能性マーカーＯｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、アルカリホスファターゼを発現し続け；正常な核型を維持し；そしてＳＣＩＤマウスに注射すると３つの胚性胚葉に代表的な組織を有する奇形腫を形成するｈＥＳＣを支持する、請求項１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１４】
未分化ｈＥＳＣの増殖を支持する、請求項１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１５】
ｈＥＳＣ株が容易に適応し、未分化ｈＥＳＣ培養物の典型的な形態をフィーダー培養物においても無フィーダー培養物においても維持する、請求項１に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１６】
ｈＥＳＣが、Ｏｃｔ−４、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、及びアルカリホスファターゼを含めた多能性マーカーを発現し続ける、請求項１５に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１７】
２５継代後、ｈＥＳＣが安定な核型を保持し、ＳＣＩＤマウスにおいて分化して奇形腫を形成可能である、請求項１５に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１８】
ＨＥＳ無フィーダー培養物のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析により、細胞はＯｃｔ−４に対して陽性のままであるが、Ｅ６抗原及びＥ７抗原に対して陰性であることを確認する、請求項１５に記載の不死化フィーダー細胞株。
【請求項１９】
Ｅ６抗原及びＥ７抗原の過剰発現により不死化した初代ＭＥＦ。
【請求項２０】
本明細書に記載の細胞株ΔＥ−ＭＥＦ。
【請求項２１】
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＰＴＡ−６７０５で寄託した不死化フィーダー細胞株。
【請求項２２】
好適な培地中の、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の不死化フィーダー細胞株の培養物。
【請求項２３】
好適な担体又は希釈剤中に請求項１〜２１のいずれか１項に記載の不死化フィーダー細胞株を含む組成物。
【請求項２４】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の不死化フィーダー細胞株の増殖から生ずる条件培地。
【請求項２５】
マトリゲルなどの細胞外マトリックスとともに用いる、請求項２４に記載の条件培地。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の細胞株のフィーダー細胞としての使用を含む、幹細胞の培養方法。
【請求項２７】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２４又は２５に記載の条件培地の使用を含む、幹細胞の培養方法。
【請求項３０】
幹細胞がヒト幹細胞である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
幹細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
スケールアップした量の未分化ｈＥＳＣをセルファクトリーなどの培養容器内で産生する、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
スケールアップした量が＞１０８細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
クレーム２６〜３１のいずれか１項に記載の方法によって培養された幹細胞。
【請求項３５】
請求項３４に記載のヒト幹細胞。
【請求項３６】
請求項３２に記載のヒト胚性幹細胞。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図８】
【図４】
【図７】
【図１ｂ】
【図２】
【図３】
【図５】
【図６】
【図８】
【図４】
【図７】
【公表番号】特表２００８−５３１００１（Ｐ２００８−５３１００１Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５６４６３（Ｐ２００７−５５６４６３）
【出願日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００６／０００２２０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８９３５３
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（５０７２８４４６６）エージェンシー・フォー・サイエンス・テクノロジー・アンド・リサーチ (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年２月２３日（２００６．２．２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＵ２００６／０００２２０
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０８９３５３
【国際公開日】平成１８年８月３１日（２００６．８．３１）
【出願人】（５０７２８４４６６）エージェンシー・フォー・サイエンス・テクノロジー・アンド・リサーチ (5)
【Ｆターム（参考）】
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