不飽和脂肪酸含有リン脂質の製造方法
【課題】脂肪酸組成をコントロールできるリン脂質の製造方法を提供すること。
【解決手段】不飽和脂肪酸またはその化合物を添加した培養液中で微生物を培養し、培養した微生物から脂質を抽出することにより、添加した不飽和脂肪酸を取り込んだリン脂質が製造できる。さらに、アルコール化合物とホスホリパーゼＤを添加して塩基交換反応を行わせることにより、所望の分子種の不飽和脂肪酸含有リン脂質を製造することができる。
【解決手段】不飽和脂肪酸またはその化合物を添加した培養液中で微生物を培養し、培養した微生物から脂質を抽出することにより、添加した不飽和脂肪酸を取り込んだリン脂質が製造できる。さらに、アルコール化合物とホスホリパーゼＤを添加して塩基交換反応を行わせることにより、所望の分子種の不飽和脂肪酸含有リン脂質を製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
構成脂肪酸として不飽和脂肪酸を含有するリン脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜の主要な成分であるリン脂質は、リン酸化アルコールと脂肪酸とから構成される化合物である。リン脂質はそのリン酸化アルコール成分の違いにより複数の分子種があり、たとえばホスファチジルコリン（ＰＣ）やホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は生体膜リン脂質の主要な組成を占めている。また別のリン脂質であるホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は、その高い乳化性から食品素材などとしても有用性が高い。さらにホスファチジルセリン（ＰＳ）は、脳機能に深く関わるリン脂質であり、その摂取により、加齢とともに低下する脳機能の改善効果が知られている。
【０００３】
リン脂質は分子内に２つの脂肪酸を結合しているが、脂肪酸群のうちの一部はヒトを含む動物の体内では合成できないため、食事や他の動植物の補食により摂取する必要がある。しかしながら、ＰＳやＰＧのようなリン脂質の一般食品中の含有量は微量であるため、十分量を食事から摂取することは困難である。
【０００４】
そこで、従来、牛脳から抽出されたリン脂質が市販されていたが、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）問題の発生により安全な供給源が必要とされ、大豆レシチンから抽出されたリン脂質も市販されるようになった。さらに、大豆リン脂質を原料として、ホスホリパーゼＤによる塩基交換反応により、純度のより高いＰＳが製造可能となっている。
【０００５】
また、従来からの動物や植物由来の原料を用いる代わりに、微生物を培養して、その微生物の細胞膜から脂質を抽出する方法も知られていた。
【０００６】
一方、リン脂質の生理活性は、リン脂質を構成する脂肪酸（本願では、構成脂肪酸と称する）の成分にも大きく左右されることが示されている。脂肪酸のうち、例えば分子内に不飽和炭素結合を有する不飽和脂肪酸、中でも不飽和度の高い高度不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、循環器系や神経系に対する効果が注目されている。そこで、高度不飽和脂肪酸を豊富に含有する魚卵（例えば特許文献１、２を参照）やイカ皮（例えば特許文献３を参照）をリン脂質の原料として用いることが提案されている。
【特許文献１】特開平１−１６０９８９号広報
【特許文献２】特開平８−５９６７８号広報
【特許文献３】特開平９−７７７８２号広報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、動物、植物、及び微生物由来の原料を用いたリン脂質の製造方法が開発されてきたが、これらの従来技術においてはいずれの場合も、リン脂質を構成する脂肪酸の組成には原料リン脂質の脂肪酸組成が反映されるため、脂肪酸組成を任意に幅広くコントロールすることはできなかった。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑み、脂肪酸組成をコントロールできるリン脂質の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、リン脂質を構成する不飽和脂肪酸の組成をコントロールする方法を見いだそうと鋭意努力した結果、微生物を培養する際、培地に不飽和脂肪酸を添加することにより、抽出されるリン脂質の組成をコントロールできることを見いだし、本発明の完成に至った。
【００１０】
本発明に係るリン脂質の製造方法は、リン脂質を構成する脂肪酸に不飽和脂肪酸を含有するリン脂質の製造方法であって、不飽和脂肪酸またはその化合物を添加した培養液中で微生物を培養する培養工程と、培養した微生物から脂質を抽出する抽出工程とを含むことを特徴とする。
【００１１】
上記の製造方法によって得られたリン脂質に、アルコール化合物とホスホリパーゼＤを添加して、塩基置換反応をさらに行わせることよって、不飽和脂肪酸含有リン脂質を製造することもできる。
【００１２】
本発明に係るアルコール化合物はセリンであってもよい。
【００１３】
本発明に係る不飽和脂肪酸の化合物は、不飽和脂肪酸のエステル、不飽和脂肪酸の塩、及び不飽和脂肪酸のアミドからなる群から選ばれた少なくとも一つであってもよい。
【００１４】
本発明に係る不飽和脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、α−リノレイン酸、γ−リノレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、共役リノール酸、共役リノレイン酸、共役アラキドン酸、共役エイコサペンタエン酸、共役ドコサペンタエン酸、及び共役ドコサヘキサエン酸からなる群から選ばれた少なくとも一つであってもよい。
【００１５】
本発明に係る微生物は、バクテリア、酵母、糸状菌、微細藻類、及びラビリンチュラからなる群から選ばれた少なくとも一つであってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によって、脂肪酸組成をコントロールできるリン脂質の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
上述したように、微生物を培養し、その微生物の細胞膜から脂質を抽出することにより、リン脂質を製造することができる。本発明に係るリン脂質の製造方法によると、こうした製造方法において、不飽和脂肪酸またはその化合物を添加した培養液で微生物を培養することによって、微生物の脂質代謝を利用することができ、所望の不飽和脂肪酸を含有したリン脂質を得ることができる。
【００１８】
ここで、この培養に用いる微生物は、その細胞膜から脂質を抽出することのできる微生物であればどんなものであってもよい。そのような微生物の例としては、バクテリア、酵母、糸状菌、微細藻類、及びラビリンチュラ（ラビリンチュラ科、ヤブレツボカビ科のいずれの科をも含む）などが挙げられるが、クロレラやユーグレナなどの微細藻類が好ましい。
【００１９】
また、脂質を抽出するための方法は、細胞膜から脂質を抽出するための一般的な方法であればよく、例えばBligh & Dyer法を用いることができる。
【００２０】
次に、リン脂質に含有させるための不飽和脂肪酸は、微生物が代謝することができるものであればいずれのものでもよく、その例としてはオレイン酸、リノール酸、α−リノレイン酸、γ−リノレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、共役リノール酸、共役リノレイン酸、共役アラキドン酸、共役エイコサペンタエン酸、共役ドコサペンタエン酸、及び共役ドコサヘキサエン酸、またはこれらを組み合わせたものが挙げられる。
【００２１】
しかしそれらのうちでも、リン脂質に含有させる不飽和脂肪酸としてより好ましいのは、動物に対して生理活性を持つ脂肪酸であり、たとえばエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、またはそれらの共役酸である。
【００２２】
一方、リン脂質に含有させるために培地に添加する不飽和脂肪酸は、微生物が細胞内に取り込むことができればよく、上述の不飽和脂肪酸の遊離の形のものであってもよいし、あるいは上述の不飽和脂肪酸の化合物、例えばエステル、塩、またはアミド、もしくはそれらの組み合わせであってもよい。
【００２３】
また、上述の不飽和脂肪酸を培地に添加する際には、ビタミンEやビタミンCなどの抗酸化成分を共存させることもできる。さらに不飽和脂肪酸を培地に効率よく分散させるため、天然あるいは合成の乳化剤を用いることは差し支えない。
【００２４】
そして、培地に添加する不飽和脂肪酸またはそれらの化合物の含量は、微生物を培養してそれらを取り込ませることを妨げない範囲であればよく、例えば、培地の重量に対して０．００５重量％〜５重量％の範囲内であってよい。
【００２５】
また、不飽和脂肪酸を添加する際の培地のｐHは、微生物が不飽和脂肪酸を取り込む事を妨げない範囲であればよく、微生物の増殖が可能であるｐHに限定されない。例えばｐH2.0〜9.0の範囲であってよい。
【００２６】
さらに、前述の抽出方法によって得られたリン脂質に対し、アルコール化合物を添加して塩基交換反応をさらに行わせることにより、その化合物由来のアルコールを含むような所望の分子種の不飽和脂肪酸含有リン脂質を製造することもできる。この反応を行わせるにはリン脂質の塩基交換反応を促進する触媒の添加が望ましく、そのような触媒の好ましい例としては、取り扱いの容易なホスホリパーゼＤ（酵素番号 EC 3.1.4.4）があり、例えば放線菌の一種Actinomadura sp.由来のものが市販されている。
【００２７】
そして、添加するアルコール化合物としては、例えばセリンを用いることができ、この場合、反応の産物としてホスファチジルセリンが得られる。また別の例として、グリセリンやエタノールアミンを用いることができ、この場合はそれぞれ天然型リン脂質であるホスファチジルグリセロールやホスファチジルエタノールアミンを得ることができるし、あるいはその他のアルコール化合物を用いて、有機合成では一般に合成が困難な新規リン脂質分子種を製造することもできる。
【００２８】
以下に、本発明の好ましい実施の態様を実施例を用いてより詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びアイデアは、本明細書の記載により当業者には明らかであり、本明細書の記載に基づき、当業者が本発明を再現することは容易である。以下に記載された具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すための例示又は説明として示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【００２９】
＝＝＝ＤＨＡ含有リン脂質の製造＝＝＝
［実施例１］ ５００ｍｌ容振とうフラスコで、グルコースを炭素源、尿素を窒素源とする従属栄養培養液（１L中にグルコース20g、リン酸１カリウム1.2g、硫酸マグネシウム７水和物0.6g、尿素1.5g、EDTA-Fe-Na 15mg、A5金属塩溶液2mlを含む）を用いて、クロレラ（Chlorella vulgaris C-30）（国立環境研究所より入手）を２８℃、暗所にて振とう培養した。増殖が定常期に達した４８時間後に、培養液１００ｍｌに対して０．５重量％のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（遊離脂肪酸、備前化成（株）より入手）（純度９９．０％）を無菌的に添加し、さらに振とう培養を２４時間継続した。次に、遠心分離３０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）によりクロレラ細胞を回収し、凍結乾燥後、Bligh & Dyer法に従い、乾燥細胞１５００ｍｇから、クロロホルム−メタノール混液（クロロホルム：メタノール：水 (1:2:0.7)）３０ｍｌで３回繰り返し総脂質を抽出した。
【００３０】
得られた総脂質２３０ｍｇから、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、以下のようにリン脂質混合物を分画した。まず、クロロホルムに懸濁したシリカゲル１０ｇを、内径２０ｍｍのオープンカラムに充填し、２ｍｌのクロロホルムに溶解した総脂質をシリカゲルに吸着させた。次に、クロロホルム３００ｍｌ、アセトン２００ｍｌ、メタノール３００ｍｌの順にカラムに流し、メタノール溶出画分をリン脂質混合物とした。これにより、８５ｍｇのリン脂質混合物を得た。このリン脂質混合物の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで測定した。まず、リン脂質混合物２０ｍｇをスクリューキャップ付き試験管にとり、１０％塩化水素−メタノール溶液を１ｍｌ加えて８０℃で３時間加熱してメタノリシスを行った。放冷後、蒸留水６ｍｌとヘキサン１ｍｌを添加して激しく振とうしてヘキサン層に脂肪酸メチルエステルを抽出し、ガスクロマトグラフィー用試料とした。ガスクロマトグラフィーは（ガスクロマトグラフ シマヅ GC-2000、カラム HR-Thermon 3000B, 30m X 0,25mm ID、カラム温度 150→220℃ 2℃/min、インジェクション温度 250℃、検出器 FID、検出器温度 250℃、キャリアーガス ヘリウム）の条件で分析した。結果は（C16:0 10.3%、C16:1 1.1%、C16:2 3.1%、C16:3 4.7%、C18:0 1.6%、C18:1 4.1%、C18:2 14.2%、C18:3 1.1%、C20:5 0.9%、C22:6 55.0%、その他 3.9%）となり、総脂肪酸の５５％がＤＨＡであった。また、リン脂質組成を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定したところ、リン脂質中の５７％がホスファチジルコリン（ＰＣ）、３２％がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であった。
【００３１】
[比較例１］ 実施例１と同様に、５００ｍｌ容振とうフラスコ内で培養定常期に達したクロレラの培養液１００ｍｌを、さらに２４時間振とう培養し、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）によりクロレラ細胞を回収し、凍結乾燥後、実施例１と同様に総脂質を抽出し、得られた総脂質１４５ｍｇを分画・分析したところ、結果は（C16:0 25.8%、C16:1 3.7%、C16:2 6.8%、C16:3 8.2%、C18:0 4.6%、C18:1 7.6%、C18:2 29.7%、C18:3 6.3%、C22:6 0.0%その他 7.3%）となり、リン脂質混合物の総脂肪酸中にＤＨＡは検出されなかった。しかし、リン脂質組成は、５９％がＰＣ、３０％がＰＥであり、実施例１と同様、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンが主成分であった。
【００３２】
＝＝＝ＤＨＡ含有ＰＳの製造＝＝＝
［実施例２］ 上記実施例１あるいは比較例１で得られたリン脂質混合物それぞれ１００ｍｇを別のスクリューキャップつき試験管に入れ、各試験管に酢酸エチル２ｍｌ、Ｌ−セリン１２０ｍｇを含有する水溶液５００μｌ、ホスホリパーゼＤ（名糖産業製）２０ｕｎｉｔを含有する水溶液５００μｌを加えた後、ヘッドスペースを窒素置換して５０℃で１２時間激しく振とうすることにより塩基交換反応を行った。反応終了後、各試験管を氷冷し、クロロホルムを２ｍｌ添加してリン脂質混合物を溶解した。クロロホルム層をＨＰＬＣにより分析してリン脂質組成を確認したところ、実施例１で得られたリン脂質は（PS 43%、PC 21%、PE 12%、その他 24%）、比較例１で得られたリン脂質は（PS 45%、PC 19%、PE 13%、その他 22%）を含有していた。それぞれのリン脂質混合物より、以下のように薄層クロマトグラフィーを用いてＰＳ画分を単離し、それぞれのＰＳの脂肪酸組成を測定した。すなわち、シリカゲルHPTLCプレート（メルク製）にリン脂質混合物をスポットし、クロロホルム／1-プロパノール／酢酸エチル／メタノール／0.25%塩化カリウム水溶液(23:25:25:15:9)を展開溶媒として展開し、PS標品(Dittmer試薬で発色)と同様のRf値のシリカゲル層を書き取った。シリカゲルからクロロホルム：メタノール(2:1)によりPSを抽出した。結果は（C16:0 9.7%、C16:1 2.1%、C16:2 2.7%、C16:3 5.1%、C18:0 1.9%、C18:1 5.1%、C18:2 16.0%、C18:3 1.0%、C20:5 0.3%、C22:6 53.0%、その他 3.1%）となり、実施例１により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳには、ＤＨＡが総脂肪酸の53％含まれていた。一方、比較例１により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳの脂肪酸組成は（C16:0 23.0%、C16:1 2.9%、C16:2 8.9%、C16:3 9.2%、C18:0 4.9%、C18:1 8.6%、C18:2 29.0%、C18:3 7.0%、C22:6 0.0%その他 6.5%）であり、ＤＨＡが全く検出されなかった。
【００３３】
＝＝＝ＥＰＡ含有リン脂質の製造＝＝＝
［実施例３］ ５００ｍｌ容振とうフラスコで、グルコース−ペプトン培地（1L中にグルコース20g、ペプトン5g、硫酸アンモニウム0.25g、リン酸１カリウム0.25g、硫酸マグネシウム７水和物0.6g、炭酸カルシウム0.12g、Na2EDTA 50mg、モール塩50mg、硫酸マンガン18mg、硫酸亜鉛25mg、塩酸チアミン2.5mg、シアノコバラミン 0.5mgを含む）を用いて、ユーグレナ（Euglena gracilis Z）（国立環境研究所より入手）を28℃、暗所にて振とう培養し、増殖が定常期に達した48時間後に、培養液１００ｍｌに対して０．５重量％のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）（遊離脂肪酸、備前化成（株）より入手）（純度９９．０％）を無菌的に添加し、さらに振とう培養を２４時間継続した。以下、実施例１と同様に、総脂質を抽出し、得られた総脂質２４０ｍｇから、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画したリン脂質混合物９５ｍｇを得た。このリン脂質混合物の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで測定したところ、結果は（C16:0 4.1%、C16:1 0.1%、C18:0 2.2%、C18:1 8.1%、C18:2 5.9%、C18:3 4.0%、C20:4 5.8%、C20:5 59.0%、C22:6 6.3%、その他 4.5%）となり、総脂肪酸の５９％がＥＰＡであった。また、リン脂質組成をＨＰＬＣで測定したところ、結果は（PC 49%、PE 31%、その他 20%）となり、ＰＣ及びＰＥが主成分であった。
【００３４】
［比較例２］ 実施例３と同様に、５００ｍｌ容振とうフラスコ内で培養定常期に達したユーグレナの培養液１００ｍｌを、さらに２４時間振とう培養し、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）によりユーグレナ細胞を回収し、実施例１と同様に、凍結乾燥後、総脂質を抽出し、得られた総脂質１２２ｍｇを分画・分析したところ、結果は（C16:0 16.7%、C16:1 3.6%、C18:0 7.5%、C18:1 14.1%、C18:2 9.9%、C18:3 8.9%、C20:4 22.3%、C20:5 3.2%、C22:6 1.0%、その他 12.8%）となり、リン脂質混合物の総脂肪酸中にＥＰＡは3.2%、ＤＨＡは１％のみしか検出されなかった。しかし、リン脂質組成は（PC 47%、PE 36%、その他 17%）であり、実施例１と同様、ＰＣ及びＰＥが主成分であった。
【００３５】
＝＝＝ＥＰＡ含有ＰＳの製造＝＝＝
［実施例４］ 実施例２と同様に、実施例３あるいは比較例２で得られたリン脂質混合物それぞれ１００ｍｇを別のスクリューキャップつき試験管に入れ、各試験管に酢酸エチル２ｍｌ、Ｌ−セリン１２０ｍｇを含有する水溶液５００μｌ、ホスホリパーゼＤ２０ｕｎｉｔを含有する水溶液５００μｌを加えた後、ヘッドスペースを窒素置換して５０℃で１２時間激しく振とうすることにより塩基交換反応を行った。反応終了後、各試験管を氷冷し、クロロホルムを２ｍｌ添加してリン脂質混合物を溶解した。クロロホルム層をＨＰＬＣにより分析してリン脂質組成を確認したところ、実施例3で得られたリン脂質は（PS 42%、PC 22%、PE 16%、その他 20%）、比較例2で得られたリン脂質は（PS 46%、PC 17%、PE 15%、その他 22%）を含有していた。それぞれのリン脂質混合物より、薄層クロマトグラフィーによりＰＳ画分を単離し、それぞれのＰＳの脂肪酸組成を測定したところ、結果は（C16:0 4.6%、C16:1 0.9%、C18:0 3.1%、C18:1 9.0%、C18:2 5.0%、C18:3 4.7%、C20:4 5.0%、C20:5 56.0%、C22:6 4.1%、その他 7.6%）となり、実施例３により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳにはＥＰＡが、総脂肪酸の５６％含まれていた。一方、比較例２により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳの脂肪酸組成は（C16:0 17.4%、C16:1 4.1%、C18:0 6.2%、C18:1 14.7%、C18:2 8.8%、C18:3 7.9%、C20:4 24.6%、C20:5 2.0%、C22:6 1.7%、その他 12.6%）であり、ＥＰＡが２％しか検出されなかった。
【００３６】
＝＝＝結論＝＝＝
上記の実施例および比較例の結果から、微生物培養を用いたリン脂質の製造方法において、培養液に不飽和脂肪酸を添加することにより、未添加の場合はほとんどみられなかった所望の不飽和脂肪酸を含有したリン脂質が合成できることが分かった。従って、本発明のリン脂質の製造方法によって、リン脂質を構成する脂肪酸の組成をコントロールすることができるようになる。さらに、エタノール化合物を添加して塩基交換反応を行わせることにより、所望の分子種のリン脂質に転換することも可能となる。
【技術分野】
【０００１】
構成脂肪酸として不飽和脂肪酸を含有するリン脂質の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体膜の主要な成分であるリン脂質は、リン酸化アルコールと脂肪酸とから構成される化合物である。リン脂質はそのリン酸化アルコール成分の違いにより複数の分子種があり、たとえばホスファチジルコリン（ＰＣ）やホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）は生体膜リン脂質の主要な組成を占めている。また別のリン脂質であるホスファチジルグリセロール（ＰＧ）は、その高い乳化性から食品素材などとしても有用性が高い。さらにホスファチジルセリン（ＰＳ）は、脳機能に深く関わるリン脂質であり、その摂取により、加齢とともに低下する脳機能の改善効果が知られている。
【０００３】
リン脂質は分子内に２つの脂肪酸を結合しているが、脂肪酸群のうちの一部はヒトを含む動物の体内では合成できないため、食事や他の動植物の補食により摂取する必要がある。しかしながら、ＰＳやＰＧのようなリン脂質の一般食品中の含有量は微量であるため、十分量を食事から摂取することは困難である。
【０００４】
そこで、従来、牛脳から抽出されたリン脂質が市販されていたが、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）問題の発生により安全な供給源が必要とされ、大豆レシチンから抽出されたリン脂質も市販されるようになった。さらに、大豆リン脂質を原料として、ホスホリパーゼＤによる塩基交換反応により、純度のより高いＰＳが製造可能となっている。
【０００５】
また、従来からの動物や植物由来の原料を用いる代わりに、微生物を培養して、その微生物の細胞膜から脂質を抽出する方法も知られていた。
【０００６】
一方、リン脂質の生理活性は、リン脂質を構成する脂肪酸（本願では、構成脂肪酸と称する）の成分にも大きく左右されることが示されている。脂肪酸のうち、例えば分子内に不飽和炭素結合を有する不飽和脂肪酸、中でも不飽和度の高い高度不飽和脂肪酸であるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、循環器系や神経系に対する効果が注目されている。そこで、高度不飽和脂肪酸を豊富に含有する魚卵（例えば特許文献１、２を参照）やイカ皮（例えば特許文献３を参照）をリン脂質の原料として用いることが提案されている。
【特許文献１】特開平１−１６０９８９号広報
【特許文献２】特開平８−５９６７８号広報
【特許文献３】特開平９−７７７８２号広報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
このように、動物、植物、及び微生物由来の原料を用いたリン脂質の製造方法が開発されてきたが、これらの従来技術においてはいずれの場合も、リン脂質を構成する脂肪酸の組成には原料リン脂質の脂肪酸組成が反映されるため、脂肪酸組成を任意に幅広くコントロールすることはできなかった。
【０００８】
本発明は、上記の問題点に鑑み、脂肪酸組成をコントロールできるリン脂質の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、リン脂質を構成する不飽和脂肪酸の組成をコントロールする方法を見いだそうと鋭意努力した結果、微生物を培養する際、培地に不飽和脂肪酸を添加することにより、抽出されるリン脂質の組成をコントロールできることを見いだし、本発明の完成に至った。
【００１０】
本発明に係るリン脂質の製造方法は、リン脂質を構成する脂肪酸に不飽和脂肪酸を含有するリン脂質の製造方法であって、不飽和脂肪酸またはその化合物を添加した培養液中で微生物を培養する培養工程と、培養した微生物から脂質を抽出する抽出工程とを含むことを特徴とする。
【００１１】
上記の製造方法によって得られたリン脂質に、アルコール化合物とホスホリパーゼＤを添加して、塩基置換反応をさらに行わせることよって、不飽和脂肪酸含有リン脂質を製造することもできる。
【００１２】
本発明に係るアルコール化合物はセリンであってもよい。
【００１３】
本発明に係る不飽和脂肪酸の化合物は、不飽和脂肪酸のエステル、不飽和脂肪酸の塩、及び不飽和脂肪酸のアミドからなる群から選ばれた少なくとも一つであってもよい。
【００１４】
本発明に係る不飽和脂肪酸は、オレイン酸、リノール酸、α−リノレイン酸、γ−リノレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、共役リノール酸、共役リノレイン酸、共役アラキドン酸、共役エイコサペンタエン酸、共役ドコサペンタエン酸、及び共役ドコサヘキサエン酸からなる群から選ばれた少なくとも一つであってもよい。
【００１５】
本発明に係る微生物は、バクテリア、酵母、糸状菌、微細藻類、及びラビリンチュラからなる群から選ばれた少なくとも一つであってもよい。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の方法によって、脂肪酸組成をコントロールできるリン脂質の製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
上述したように、微生物を培養し、その微生物の細胞膜から脂質を抽出することにより、リン脂質を製造することができる。本発明に係るリン脂質の製造方法によると、こうした製造方法において、不飽和脂肪酸またはその化合物を添加した培養液で微生物を培養することによって、微生物の脂質代謝を利用することができ、所望の不飽和脂肪酸を含有したリン脂質を得ることができる。
【００１８】
ここで、この培養に用いる微生物は、その細胞膜から脂質を抽出することのできる微生物であればどんなものであってもよい。そのような微生物の例としては、バクテリア、酵母、糸状菌、微細藻類、及びラビリンチュラ（ラビリンチュラ科、ヤブレツボカビ科のいずれの科をも含む）などが挙げられるが、クロレラやユーグレナなどの微細藻類が好ましい。
【００１９】
また、脂質を抽出するための方法は、細胞膜から脂質を抽出するための一般的な方法であればよく、例えばBligh & Dyer法を用いることができる。
【００２０】
次に、リン脂質に含有させるための不飽和脂肪酸は、微生物が代謝することができるものであればいずれのものでもよく、その例としてはオレイン酸、リノール酸、α−リノレイン酸、γ−リノレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、共役リノール酸、共役リノレイン酸、共役アラキドン酸、共役エイコサペンタエン酸、共役ドコサペンタエン酸、及び共役ドコサヘキサエン酸、またはこれらを組み合わせたものが挙げられる。
【００２１】
しかしそれらのうちでも、リン脂質に含有させる不飽和脂肪酸としてより好ましいのは、動物に対して生理活性を持つ脂肪酸であり、たとえばエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）やドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、またはそれらの共役酸である。
【００２２】
一方、リン脂質に含有させるために培地に添加する不飽和脂肪酸は、微生物が細胞内に取り込むことができればよく、上述の不飽和脂肪酸の遊離の形のものであってもよいし、あるいは上述の不飽和脂肪酸の化合物、例えばエステル、塩、またはアミド、もしくはそれらの組み合わせであってもよい。
【００２３】
また、上述の不飽和脂肪酸を培地に添加する際には、ビタミンEやビタミンCなどの抗酸化成分を共存させることもできる。さらに不飽和脂肪酸を培地に効率よく分散させるため、天然あるいは合成の乳化剤を用いることは差し支えない。
【００２４】
そして、培地に添加する不飽和脂肪酸またはそれらの化合物の含量は、微生物を培養してそれらを取り込ませることを妨げない範囲であればよく、例えば、培地の重量に対して０．００５重量％〜５重量％の範囲内であってよい。
【００２５】
また、不飽和脂肪酸を添加する際の培地のｐHは、微生物が不飽和脂肪酸を取り込む事を妨げない範囲であればよく、微生物の増殖が可能であるｐHに限定されない。例えばｐH2.0〜9.0の範囲であってよい。
【００２６】
さらに、前述の抽出方法によって得られたリン脂質に対し、アルコール化合物を添加して塩基交換反応をさらに行わせることにより、その化合物由来のアルコールを含むような所望の分子種の不飽和脂肪酸含有リン脂質を製造することもできる。この反応を行わせるにはリン脂質の塩基交換反応を促進する触媒の添加が望ましく、そのような触媒の好ましい例としては、取り扱いの容易なホスホリパーゼＤ（酵素番号 EC 3.1.4.4）があり、例えば放線菌の一種Actinomadura sp.由来のものが市販されている。
【００２７】
そして、添加するアルコール化合物としては、例えばセリンを用いることができ、この場合、反応の産物としてホスファチジルセリンが得られる。また別の例として、グリセリンやエタノールアミンを用いることができ、この場合はそれぞれ天然型リン脂質であるホスファチジルグリセロールやホスファチジルエタノールアミンを得ることができるし、あるいはその他のアルコール化合物を用いて、有機合成では一般に合成が困難な新規リン脂質分子種を製造することもできる。
【００２８】
以下に、本発明の好ましい実施の態様を実施例を用いてより詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、及びアイデアは、本明細書の記載により当業者には明らかであり、本明細書の記載に基づき、当業者が本発明を再現することは容易である。以下に記載された具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すための例示又は説明として示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
【実施例】
【００２９】
＝＝＝ＤＨＡ含有リン脂質の製造＝＝＝
［実施例１］ ５００ｍｌ容振とうフラスコで、グルコースを炭素源、尿素を窒素源とする従属栄養培養液（１L中にグルコース20g、リン酸１カリウム1.2g、硫酸マグネシウム７水和物0.6g、尿素1.5g、EDTA-Fe-Na 15mg、A5金属塩溶液2mlを含む）を用いて、クロレラ（Chlorella vulgaris C-30）（国立環境研究所より入手）を２８℃、暗所にて振とう培養した。増殖が定常期に達した４８時間後に、培養液１００ｍｌに対して０．５重量％のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）（遊離脂肪酸、備前化成（株）より入手）（純度９９．０％）を無菌的に添加し、さらに振とう培養を２４時間継続した。次に、遠心分離３０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）によりクロレラ細胞を回収し、凍結乾燥後、Bligh & Dyer法に従い、乾燥細胞１５００ｍｇから、クロロホルム−メタノール混液（クロロホルム：メタノール：水 (1:2:0.7)）３０ｍｌで３回繰り返し総脂質を抽出した。
【００３０】
得られた総脂質２３０ｍｇから、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、以下のようにリン脂質混合物を分画した。まず、クロロホルムに懸濁したシリカゲル１０ｇを、内径２０ｍｍのオープンカラムに充填し、２ｍｌのクロロホルムに溶解した総脂質をシリカゲルに吸着させた。次に、クロロホルム３００ｍｌ、アセトン２００ｍｌ、メタノール３００ｍｌの順にカラムに流し、メタノール溶出画分をリン脂質混合物とした。これにより、８５ｍｇのリン脂質混合物を得た。このリン脂質混合物の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで測定した。まず、リン脂質混合物２０ｍｇをスクリューキャップ付き試験管にとり、１０％塩化水素−メタノール溶液を１ｍｌ加えて８０℃で３時間加熱してメタノリシスを行った。放冷後、蒸留水６ｍｌとヘキサン１ｍｌを添加して激しく振とうしてヘキサン層に脂肪酸メチルエステルを抽出し、ガスクロマトグラフィー用試料とした。ガスクロマトグラフィーは（ガスクロマトグラフ シマヅ GC-2000、カラム HR-Thermon 3000B, 30m X 0,25mm ID、カラム温度 150→220℃ 2℃/min、インジェクション温度 250℃、検出器 FID、検出器温度 250℃、キャリアーガス ヘリウム）の条件で分析した。結果は（C16:0 10.3%、C16:1 1.1%、C16:2 3.1%、C16:3 4.7%、C18:0 1.6%、C18:1 4.1%、C18:2 14.2%、C18:3 1.1%、C20:5 0.9%、C22:6 55.0%、その他 3.9%）となり、総脂肪酸の５５％がＤＨＡであった。また、リン脂質組成を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定したところ、リン脂質中の５７％がホスファチジルコリン（ＰＣ）、３２％がホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）であった。
【００３１】
[比較例１］ 実施例１と同様に、５００ｍｌ容振とうフラスコ内で培養定常期に達したクロレラの培養液１００ｍｌを、さらに２４時間振とう培養し、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）によりクロレラ細胞を回収し、凍結乾燥後、実施例１と同様に総脂質を抽出し、得られた総脂質１４５ｍｇを分画・分析したところ、結果は（C16:0 25.8%、C16:1 3.7%、C16:2 6.8%、C16:3 8.2%、C18:0 4.6%、C18:1 7.6%、C18:2 29.7%、C18:3 6.3%、C22:6 0.0%その他 7.3%）となり、リン脂質混合物の総脂肪酸中にＤＨＡは検出されなかった。しかし、リン脂質組成は、５９％がＰＣ、３０％がＰＥであり、実施例１と同様、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンが主成分であった。
【００３２】
＝＝＝ＤＨＡ含有ＰＳの製造＝＝＝
［実施例２］ 上記実施例１あるいは比較例１で得られたリン脂質混合物それぞれ１００ｍｇを別のスクリューキャップつき試験管に入れ、各試験管に酢酸エチル２ｍｌ、Ｌ−セリン１２０ｍｇを含有する水溶液５００μｌ、ホスホリパーゼＤ（名糖産業製）２０ｕｎｉｔを含有する水溶液５００μｌを加えた後、ヘッドスペースを窒素置換して５０℃で１２時間激しく振とうすることにより塩基交換反応を行った。反応終了後、各試験管を氷冷し、クロロホルムを２ｍｌ添加してリン脂質混合物を溶解した。クロロホルム層をＨＰＬＣにより分析してリン脂質組成を確認したところ、実施例１で得られたリン脂質は（PS 43%、PC 21%、PE 12%、その他 24%）、比較例１で得られたリン脂質は（PS 45%、PC 19%、PE 13%、その他 22%）を含有していた。それぞれのリン脂質混合物より、以下のように薄層クロマトグラフィーを用いてＰＳ画分を単離し、それぞれのＰＳの脂肪酸組成を測定した。すなわち、シリカゲルHPTLCプレート（メルク製）にリン脂質混合物をスポットし、クロロホルム／1-プロパノール／酢酸エチル／メタノール／0.25%塩化カリウム水溶液(23:25:25:15:9)を展開溶媒として展開し、PS標品(Dittmer試薬で発色)と同様のRf値のシリカゲル層を書き取った。シリカゲルからクロロホルム：メタノール(2:1)によりPSを抽出した。結果は（C16:0 9.7%、C16:1 2.1%、C16:2 2.7%、C16:3 5.1%、C18:0 1.9%、C18:1 5.1%、C18:2 16.0%、C18:3 1.0%、C20:5 0.3%、C22:6 53.0%、その他 3.1%）となり、実施例１により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳには、ＤＨＡが総脂肪酸の53％含まれていた。一方、比較例１により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳの脂肪酸組成は（C16:0 23.0%、C16:1 2.9%、C16:2 8.9%、C16:3 9.2%、C18:0 4.9%、C18:1 8.6%、C18:2 29.0%、C18:3 7.0%、C22:6 0.0%その他 6.5%）であり、ＤＨＡが全く検出されなかった。
【００３３】
＝＝＝ＥＰＡ含有リン脂質の製造＝＝＝
［実施例３］ ５００ｍｌ容振とうフラスコで、グルコース−ペプトン培地（1L中にグルコース20g、ペプトン5g、硫酸アンモニウム0.25g、リン酸１カリウム0.25g、硫酸マグネシウム７水和物0.6g、炭酸カルシウム0.12g、Na2EDTA 50mg、モール塩50mg、硫酸マンガン18mg、硫酸亜鉛25mg、塩酸チアミン2.5mg、シアノコバラミン 0.5mgを含む）を用いて、ユーグレナ（Euglena gracilis Z）（国立環境研究所より入手）を28℃、暗所にて振とう培養し、増殖が定常期に達した48時間後に、培養液１００ｍｌに対して０．５重量％のエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）（遊離脂肪酸、備前化成（株）より入手）（純度９９．０％）を無菌的に添加し、さらに振とう培養を２４時間継続した。以下、実施例１と同様に、総脂質を抽出し、得られた総脂質２４０ｍｇから、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分画したリン脂質混合物９５ｍｇを得た。このリン脂質混合物の脂肪酸組成をガスクロマトグラフィーで測定したところ、結果は（C16:0 4.1%、C16:1 0.1%、C18:0 2.2%、C18:1 8.1%、C18:2 5.9%、C18:3 4.0%、C20:4 5.8%、C20:5 59.0%、C22:6 6.3%、その他 4.5%）となり、総脂肪酸の５９％がＥＰＡであった。また、リン脂質組成をＨＰＬＣで測定したところ、結果は（PC 49%、PE 31%、その他 20%）となり、ＰＣ及びＰＥが主成分であった。
【００３４】
［比較例２］ 実施例３と同様に、５００ｍｌ容振とうフラスコ内で培養定常期に達したユーグレナの培養液１００ｍｌを、さらに２４時間振とう培養し、遠心分離（３０００ｒｐｍ×１０ｍｉｎ）によりユーグレナ細胞を回収し、実施例１と同様に、凍結乾燥後、総脂質を抽出し、得られた総脂質１２２ｍｇを分画・分析したところ、結果は（C16:0 16.7%、C16:1 3.6%、C18:0 7.5%、C18:1 14.1%、C18:2 9.9%、C18:3 8.9%、C20:4 22.3%、C20:5 3.2%、C22:6 1.0%、その他 12.8%）となり、リン脂質混合物の総脂肪酸中にＥＰＡは3.2%、ＤＨＡは１％のみしか検出されなかった。しかし、リン脂質組成は（PC 47%、PE 36%、その他 17%）であり、実施例１と同様、ＰＣ及びＰＥが主成分であった。
【００３５】
＝＝＝ＥＰＡ含有ＰＳの製造＝＝＝
［実施例４］ 実施例２と同様に、実施例３あるいは比較例２で得られたリン脂質混合物それぞれ１００ｍｇを別のスクリューキャップつき試験管に入れ、各試験管に酢酸エチル２ｍｌ、Ｌ−セリン１２０ｍｇを含有する水溶液５００μｌ、ホスホリパーゼＤ２０ｕｎｉｔを含有する水溶液５００μｌを加えた後、ヘッドスペースを窒素置換して５０℃で１２時間激しく振とうすることにより塩基交換反応を行った。反応終了後、各試験管を氷冷し、クロロホルムを２ｍｌ添加してリン脂質混合物を溶解した。クロロホルム層をＨＰＬＣにより分析してリン脂質組成を確認したところ、実施例3で得られたリン脂質は（PS 42%、PC 22%、PE 16%、その他 20%）、比較例2で得られたリン脂質は（PS 46%、PC 17%、PE 15%、その他 22%）を含有していた。それぞれのリン脂質混合物より、薄層クロマトグラフィーによりＰＳ画分を単離し、それぞれのＰＳの脂肪酸組成を測定したところ、結果は（C16:0 4.6%、C16:1 0.9%、C18:0 3.1%、C18:1 9.0%、C18:2 5.0%、C18:3 4.7%、C20:4 5.0%、C20:5 56.0%、C22:6 4.1%、その他 7.6%）となり、実施例３により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳにはＥＰＡが、総脂肪酸の５６％含まれていた。一方、比較例２により得られたリン脂質混合物を原料としたＰＳの脂肪酸組成は（C16:0 17.4%、C16:1 4.1%、C18:0 6.2%、C18:1 14.7%、C18:2 8.8%、C18:3 7.9%、C20:4 24.6%、C20:5 2.0%、C22:6 1.7%、その他 12.6%）であり、ＥＰＡが２％しか検出されなかった。
【００３６】
＝＝＝結論＝＝＝
上記の実施例および比較例の結果から、微生物培養を用いたリン脂質の製造方法において、培養液に不飽和脂肪酸を添加することにより、未添加の場合はほとんどみられなかった所望の不飽和脂肪酸を含有したリン脂質が合成できることが分かった。従って、本発明のリン脂質の製造方法によって、リン脂質を構成する脂肪酸の組成をコントロールすることができるようになる。さらに、エタノール化合物を添加して塩基交換反応を行わせることにより、所望の分子種のリン脂質に転換することも可能となる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成脂肪酸として不飽和脂肪酸を含有するリン脂質の製造方法であって、
前記不飽和脂肪酸または前記不飽和脂肪酸の化合物を添加した培養液中で微生物を培養する培養工程と、
前記培養した微生物から前記リン脂質を抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記抽出工程によって得られたリン脂質に、アルコール化合物とホスホリパーゼＤを添加して、塩基交換反応を行わせる反応工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アルコール化合物がセリンであることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記不飽和脂肪酸の化合物が、前記不飽和脂肪酸のエステル、前記不飽和脂肪酸の塩、及び前記不飽和脂肪酸のアミドからなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項1〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記不飽和脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、α−リノレイン酸、γ−リノレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、共役リノール酸、共役リノレイン酸、共役アラキドン酸、共役エイコサペンタエン酸、共役ドコサペンタエン酸、及び共役ドコサヘキサエン酸からなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記微生物が、バクテリア、酵母、糸状菌、微細藻類、及びラビリンチュラからなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１】
構成脂肪酸として不飽和脂肪酸を含有するリン脂質の製造方法であって、
前記不飽和脂肪酸または前記不飽和脂肪酸の化合物を添加した培養液中で微生物を培養する培養工程と、
前記培養した微生物から前記リン脂質を抽出する抽出工程と、
を含むことを特徴とする製造方法。
【請求項２】
前記抽出工程によって得られたリン脂質に、アルコール化合物とホスホリパーゼＤを添加して、塩基交換反応を行わせる反応工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記アルコール化合物がセリンであることを特徴とする、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記不飽和脂肪酸の化合物が、前記不飽和脂肪酸のエステル、前記不飽和脂肪酸の塩、及び前記不飽和脂肪酸のアミドからなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項1〜３のいずれかに記載の製造方法。
【請求項５】
前記不飽和脂肪酸が、オレイン酸、リノール酸、α−リノレイン酸、γ−リノレイン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、ジホモ−γ−リノレイン酸、共役リノール酸、共役リノレイン酸、共役アラキドン酸、共役エイコサペンタエン酸、共役ドコサペンタエン酸、及び共役ドコサヘキサエン酸からなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の製造方法。
【請求項６】
前記微生物が、バクテリア、酵母、糸状菌、微細藻類、及びラビリンチュラからなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の製造方法。
【公開番号】特開２００７−１２９９７３（Ｐ２００７−１２９９７３Ａ）
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３２７７０４（Ｐ２００５−３２７７０４）
【出願日】平成１７年１１月１１日（２００５．１１．１１）
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年５月３１日（２００７．５．３１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１１月１１日（２００５．１１．１１）
【出願人】（５０４２２４１５３）国立大学法人 宮崎大学 (239)
【Ｆターム（参考）】
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