乳酸発酵方法
【課題】 糸状菌の形態制御が容易な乳酸発酵方法を実現する。
【解決手段】 本発明の乳酸発酵方法では、乳酸生成能を有する糸状菌をスポンジ様多孔質材料からなる担体に担持して乳酸発酵に用いる。ため、糸状菌の菌糸の増殖は担体内に限定され、糸状菌を胞子接種量や培養の流動条件に依存せずに一定サイズの均一なペレット形態とすることができ、培養容器などへの付着を防止することができる。担体は連通した気孔を備えた多孔質材料からなるため、糸状菌の菌糸が増殖しやすく、多量に担持させることができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。また、連通した気孔を備え圧縮性を有しているため、内部の空気を容易に抜くことができる。
【解決手段】 本発明の乳酸発酵方法では、乳酸生成能を有する糸状菌をスポンジ様多孔質材料からなる担体に担持して乳酸発酵に用いる。ため、糸状菌の菌糸の増殖は担体内に限定され、糸状菌を胞子接種量や培養の流動条件に依存せずに一定サイズの均一なペレット形態とすることができ、培養容器などへの付着を防止することができる。担体は連通した気孔を備えた多孔質材料からなるため、糸状菌の菌糸が増殖しやすく、多量に担持させることができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。また、連通した気孔を備え圧縮性を有しているため、内部の空気を容易に抜くことができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌を用いた乳酸発酵方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、醸造、漬物、清涼飲料の酸味料などの食品用、医療用、塗料、溶剤、生分解性プラスチックなどの工業用といろいろな分野で用いられており、その需要が増加している。従来より、乳酸の製造方法として、食用バイオマスを主原料とし、乳酸菌により発酵製造する方法が行われている。ここで、乳酸菌による乳酸の製造では、発酵条件の制御が容易で、乳酸収率が高いという利点があるが、乳酸菌の培養に多くの栄養素を必要とし、培地組成が複雑でコストがかかる、また、乳酸菌は自身の生産する乳酸の酸性で死滅しやすいため、発酵は炭酸カルシウムなどのアルカリを添加して生成乳酸を中和しながら行う必要があるが、このとき副生される石膏の処理にコストがかかる、などの問題点があった。
また、培地に副原料が多量に残っている場合には、高純度の乳酸を得ることは困難である。これらの課題を解消するために、糸状菌を用いて乳酸を製造する方法が各種開発されている。糸状菌を用いて乳酸を製造する方法では、培地成分としては炭素源と無機塩であればよく、製造コストを低減することができる。また、光学純度の高いL-乳酸を生成することができる。更に、非食用バイオマスを原料とすることができる。このような技術として、例えば、特許文献１には、糸状菌の胞子を液体培地に植菌し、通気による撹拌を行いつつ培養することにより生成する菌体集合物（ペレット）を液体培地中に浮遊させて発酵を行わせることを特徴とする乳酸の製造方法が開示されている。
【特許文献１】特開平６−２５３８７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、糸状菌は、胞子接種量、培地組成、ｐＨ変化、攪拌の強さなどの培養条件によりその形態が大きく変動し、菌糸が培地の液面に浮上したり、発酵装置の内壁に付着したりして、発酵効率が悪くなりやすい。そのため、上述のような技術では、糸状菌をペレット状にするために、培養条件を高度に制御する必要があり、培養操作が難しいという問題があった。
【０００４】
そこで、本発明は、糸状菌の形態制御が容易な乳酸発酵方法を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この発明は、上記目的を達成するため、請求項１に記載の発明では、乳酸発酵方法において、連通した気孔を備え圧縮性を有するスポンジ様多孔質材料からなる担体に、乳酸生成能を有する糸状菌を担持し、当該担体を液体培地中に浮遊させて乳酸発酵を行わせる、という技術的手段を用いる。
【０００６】
請求項１に記載の発明によれば、乳酸生成能を有する糸状菌をスポンジ様多孔質材料からなる担体に担持して乳酸発酵に用いるため、糸状菌の菌糸の増殖は担体内に限定され、糸状菌を胞子接種量や培養の流動条件に依存せずに一定サイズの均一なペレット形態とすることができ、培養容器などへの付着を防止することができる。担体は連通した気孔を備えた多孔質材料からなるため、糸状菌の菌糸が増殖しやすく、多量に担持させることができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。また、連通した気孔を備え圧縮性を有しているため、内部の空気を容易に抜くことができ、担体が液体培地表面に浮き上がることがなく、担体を液体培地中に懸濁させることができる。更に、液体培地のみを容易に分離できるため、菌体を繰り返し用いる反復回分培養や連続培養を容易に行うことができる。
【０００７】
請求項２に記載の発明では、請求項１に記載の乳酸発酵方法において、前記担体は、気孔率が９０％以上である、という技術的手段を用いる。
【０００８】
請求項２に記載の発明では、担体は気孔率が９０％以上と極めて高い気孔率を有するため、多くの糸状菌を担持することができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。
【０００９】
請求項３に記載の発明では、請求項１または請求項２に記載の乳酸発酵方法において、前記担体は、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されている、という技術的手段を用いる。
【００１０】
糸状菌を用いた乳酸発酵において、菌の様相が１〜７ｍｍのペレット状の場合に乳酸収率が高く発酵速度が早いことが知られており、請求項３に記載の発明のように、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されている担体は、乳酸の製造効率を高くすることができるので、好適に用いることができる。なお、塊状とは、各種形態を包括するものであり、立方体、球形、不定形などの形態を採用することができる。
【００１１】
請求項４に記載の発明では、請求項１ないし請求項３のいずれか１つに記載の乳酸発酵方法において、前記糸状菌は、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体である、という技術的手段を用いる。
【００１２】
請求項４に記載の発明のように、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体は、無機塩と炭素源だけで生育でき、生成されるＬ−乳酸の純度が高い。また、ヘキソースだけでなくペントースからも乳酸を得ることができるため、非食用バイオマス(木質・草本系バイオマス)を原料とすることもできる。特に、リゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ：和名クモノスカビ）はＬ−乳酸を多量に生産することができることから好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明における乳酸発酵方法について、図を参照して説明する。図１は、担体の構造を示す説明図である。
【００１４】
本発明の乳酸発酵方法において用いる担体は、例えば、図１に示すような連通した気孔を備えた多孔質材料からなる担体１０である。担体１０は連通した気孔１１を備えた高気孔率の多孔質材料１２からなるため、糸状菌の菌糸が増殖しやすく、多量に担持させることができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。ここで、気孔率は９０％以上であると、十分に糸状菌の菌糸が増殖しやすく好ましい。
【００１５】
担体１０は連通した気孔１１を備え圧縮性を有しているため、内部の空気を容易に抜くことができ、担体１０が液体培地表面に浮き上がることがなく、担体１０を液体培地中に懸濁させることができる。
【００１６】
上述のような担体１０は、例えば、ポリウレタンフォームなどのスポンジ様の多孔質材料により立方体状に形成される。
【００１７】
乳酸発酵は、以下の手順で実施する。ここでは、糸状菌として、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属するリゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ：和名クモノスカビ）を用いる。リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体は、無機塩と炭素源だけで生育でき、生成されるＬ−乳酸の純度が高い。また、ヘキソースだけでなくペントースからも乳酸を得ることができるため、非食用バイオマス(木質・草本系バイオマス)を原料とすることもできる。リゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ：和名クモノスカビ）はＬ−乳酸を多量に生産することができることから好適に用いることができる。
【００１８】
まず、リゾプス オリゼの胞子をポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地などで培養し、無菌水などでミキシングすることにより所定の初発濃度の胞子懸濁液を作製する。無菌水にはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ系界面活性剤などを添加することもできる。これにより、胞子を無菌水中に効果的に分散させることができ、均質な懸濁液を得ることができる。
【００１９】
次に、乳酸発酵に用いる液体培地を用意する。液体培地は、グルコースやキシロースなどの炭素源に、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの少量の無機塩を添加して作製する。なお、液体培地としては、糸状菌の菌体を生育できる通常の液体培地であれば種類は問わない。
【００２０】
続いて、発酵容器に液体培地と担体を装入し、オートクレーブで滅菌処理した後に、胞子懸濁液を無菌的に植菌する。担体は、液体培地内で押圧することにより容易に脱気することができる。ここで、担体は、滅菌処理で加熱（１２１℃）されるため、当該温度での耐久性が要求される。
【００２１】
リゾプス オリゼによる乳酸発酵は好気性発酵であるため、液体培地と担体とを撹拌翼やエア−リフトなどにより撹拌しながら、所定の温度、ｐＨなどの発酵条件により、リゾプス オリゼを増殖させながら乳酸発酵を行う。ここで、担体は脱気されているため、液体培地中で良好に懸濁される。
【００２２】
ここで、リゾプス オリゼは、担体に担持されて増殖が担体内に限定されるため、胞子接種量や流動などの培養条件に依存せずに一定サイズの均一なペレット形態とすることができ、培養容器などへの付着を防止することができる。ここで、担体は、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されていることが好ましい。糸状菌を用いた乳酸発酵においては、菌の様相が１〜７ｍｍのペレット状の場合に乳酸収率が高く発酵速度が早いためである。このとき、例えば、担体１ｍｌあたり１０５〜１０６個の糸状菌が担持されている。なお、塊状とは、各種形態を包括するものであり、立方体、球形、不定形などの形態を採用することができる。
【００２３】
リゾプス オリゼはほとんど担体にのみ増殖しているため、液体培地とリゾプス オリゼとの分離は、液体培地と担体とを分離することにより、容易に行うことができる。これにより、菌体は担体に残存するため、菌体を繰り返し用いる反復回分培養や連続培養を容易に行うことができる。
【００２４】
上述の工程では、リゾプス オリゼを発酵とともに担体に担持したが、発酵前に担体に担持することもできる。また、担持方法としては、上述の方法以外に物理的に吸着させたり、他の方法を採用することもできる。
【００２５】
（実施例）
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明に係わる担体、菌体、発酵方法などは実施例に限定されない。
【００２６】
担体粒子としては、連続気孔を有するスポンジ様の気孔率９５〜９６％のポリウレタンフォームを３．５ｍｍ角の立方体形状に成型されたものを用いた。
【００２７】
菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部から入手しＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ４７０７を用いた。
【００２８】
液体培地は、表１の組成で作製した各Ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを表２の割合で混合したものを用いた。初発のｐＨは５．２６であった。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】
胞子の調製法を以下に示す。入手した菌株の胞子を復水液に懸濁し、２枚のＰＤＡ寒天培地に塗布し、インキュベータで１週間３０℃の条件で培養した。得られた寒天培地上に生育した胞子に滅菌した０．０３％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液を適量入れ、スプレッダ−やスパーテルで集めて、２０枚のＰＤＡ寒天培地上に塗布し、インキュベータで１週間３０℃の条件で培養した。得られた胞子は０．０３％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液＋４０％
ｇｌｙｃｅｒｏｌ水溶液（１：１）の溶液で胞子懸濁液をつくった。このように得られた胞子懸濁液を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液で適当に希釈し、トーマ血球計によって顕微鏡下で一定容積中の菌数を繰り返し数え、胞子懸濁液の濃度とした。この胞子懸濁液は−８０℃で保存した。胞子の初発接種量は、２×１０6／ｍＬとした。
【００３２】
（実施例１）
胞子懸濁液を融解した後に、均一な状態にした胞子懸濁液２×１０6／ｍＬを３００ｍｌ容量の三角フラスコ内の滅菌済みの液体培地に接種し、３７℃、攪拌速度１５０ｒｐｍの条件で振とう培養を行った。担体は液体培地５０ｍＬに対して３００個の割合で使用した。炭素源以外の液体培地にスポンジ担体を装入し、パンチングメタルを介して押圧し、担体内の空気を脱気した。発酵生成したＬ−乳酸の量は、発酵液を毎日５００μＬずつ採取し、原子吸光法により分析した。三角フラスコは、バッフル付のものとバッフルがないものを用意し、担体の影響とともにバッフルの有無の影響も調べた。
【００３３】
図２にＬ−乳酸生産量の経時変化を示す。担体及びバッフル付三角フラスコを用いた場合がＬ−-乳酸の収率が高く、最大乳酸生成速度も早かった。菌体が担体に入って均一な状態になったこと、バッフルによって通常に比べて攪拌・通気効果が上がったことにより収率が上がったと考えられる。担体を使用した場合には、菌体は担体内部でのみ増殖したが、担体を使用しなかった場合、菌体は三角フラスコ内壁に付着したり、大きな塊となり液体培地に浮遊したりしていた。
【００３４】
（実施例２）
実施例１をスケールアップさせて、ファーメンターでの培養を行った。滅菌後、装置をセットし、約３７℃で表１に記載のＡ(炭素源)を接種口から流しいれた。その後、均一にした胞子懸濁液２×１０6／ｍＬになるように接種口から接種し、３７℃、攪拌速度２５０ｒｐｍの条件で培養を開始した。全量は１．５Ｌとした。担体は液体培地５０ｍＬに対して３００個の割合で使用した。
【００３５】
図３に培養後の菌体の形態を示す。図３（Ａ）では担体を用いなかった場合の菌体の形態、図３（Ｂ）では担体を用いた場合の菌体の形態を示す。図３（Ａ）に示すように、担体を用いなかった場合では、菌体は、液体培地中に塊になって浮遊したり、内壁や攪拌羽、攪拌棒にパルプ状に付着したりしたため、装置が作動しなくなってしまった。一方、図３（Ｂ）に示すように、担体を用いた場合では、担体中に菌体が均一に入っており、内壁などに菌体が付着することはなかった。
【００３６】
（実施例３）
担体中の菌体量の経時変化を調べた。培養条件は、３７℃、攪拌速度１５０ｒｐｍで、９日間の培養を行った。図４に担体に担持された菌体量の経時変化を示す。菌体量は３日までは急増し、その後は緩やかに増加し、約０．５ｍｇ／担体で一定となった。液体培地はほぼ透明であり、菌体が担体内でのみ成長することが確認された。
【００３７】
（実施例４）
実施例１と同様の培養条件により、繰り返し回分培養を行った。Ｌ−乳酸の生産量がが１２〜１３ｇ／Ｌになった時点で、クリーンベンチ内で液体培地を除き、滅菌済みの液体培地をいれて一度担体を洗い、新しい滅菌済みの液体培地を加えて培養機へ戻した。この操作を１０回繰り返し行った。発酵生成したＬ−乳酸の量は、発酵液を毎日５００μＬずつ採取し、原子吸光法により分析した。なお、４回目の培養のみキシロースの濃度を６０ｇ／Ｌとした。
【００３８】
図５に繰り返し回分培養でのＬ−乳酸生産量の経時変化を示す。Ｌ−乳酸生産量の経時変化は、繰り返し回数に依存せず、ほぼ一定の挙動を示し、４回目を除き、乳酸収率は約０．４ｇ／ｇと良好な結果を示した。これにより、本発明の担体を用いて繰り返し回分培養を良好な条件で実施することができることが確認された。
【００３９】
（実施例５）
初発胞子量のＬ−乳酸生産量への影響を調べた。初発胞子量は、２×１０4／ｍＬ、２×１０5／ｍＬ、２×１０6／ｍＬ、２×１０7／ｍＬの４水準とし、担体とバッフル付三角フラスコを用いて、実施例１と同じ培養条件で培養を行った。発酵生成したＬ−乳酸の量は、発酵液を毎日５００μＬずつ採取し、原子吸光法により分析した。
【００４０】
図６に異なった初発胞子量によるＬ−乳酸生産量の経時変化を示す。Ｌ−乳酸の収率及び最大乳酸生産速度は、初発胞子量２×１０5／ｍＬの場合が最も高い値を示した。初発胞子量が少なくなるのにつれて、Ｌ−乳酸が生産され始める時間も遅くなった。また、目視によると、初発胞子量２×１０7／ｍＬの場合は、三角フラスコの上部内壁に多量の菌体が付着していた。接種胞子数が多ければ多いほどＬ−乳酸の生成速度や収率が上がるわけではないことから、担体粒子１個当りの初発胞子量に上限値があり、それ以上多くしても胞子は担体内に入りきれないと考えられた。
【００４１】
（実施例６）
異なる炭素源でのＬ−乳酸生産量の経時変化を調べた。実施例１〜５で用いた炭素源ヘキソースであるＸｙｌｏｓｅに加え、ペントースであるＧｌｕｃｏｓｅを用いて、実施例３と同様の条件で最大１０日間の培養を行った。図７にＬ−乳酸生産量の経時変化を示す。図中の直線は、最大乳酸生成速度を求めるための近似直線である。表３に最大乳酸生成速度及びＬ−乳酸の収率を示す。
【００４２】
【表３】
【００４３】
最大乳酸生成速度は、Ｇｌｕｃｏｓｅを用いた場合がＸｙｌｏｓｅを用いた場合よりも約２倍速かった。乳酸の収率は、いずれも約０．５ｇ／ｇであり、Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｘｙｌｏｓｅともに乳酸発酵に好適に用いることができる。これにより、ヘキソースだけでなくペントースからも乳酸を得ることができることが確認された。
【００４４】
なお、各実施例では、菌株として、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ４７０７を用いたが、これに限定されるものではなく、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ５３８４も好適に用いることができる。
【００４５】
［最良の実施形態の効果］
（１）本発明の乳酸発酵方法によれば、乳酸生成能を有する糸状菌をスポンジ様多孔質材料からなる担体に担持して乳酸発酵に用いるため、糸状菌の菌糸の増殖は担体内に限定され、糸状菌を胞子接種量や培養の流動条件に依存せずに一定サイズの均一なペレット形態とすることができ、培養容器などへの付着を防止することができる。担体は連通した気孔を備えた多孔質材料からなるため、糸状菌の菌糸が増殖しやすく、多量に担持させることができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。また、連通した気孔を備え圧縮性を有しているため、内部の空気を容易に抜くことができ、担体が液体培地表面に浮き上がることがなく、担体を液体培地中に懸濁させることができる。更に、液体培地のみを容易に分離できるため、菌体を繰り返し用いる反復回分培養や連続培養を容易に行うことができる。
【００４６】
（２）担体は気孔率が９０％以上と極めて高い気孔率を有するため、多くの糸状菌を担持することができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。
【００４７】
（３）糸状菌を用いた乳酸発酵において、菌の様相が１〜７ｍｍのペレット状の場合に乳酸収率が高く発酵速度が早いことが知られており、請求項３に記載の発明のように、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されている担体は、乳酸の製造効率を高くすることができるので、好適に用いることができる。なお、塊状とは、各種形態を包括するものであり、立方体、球形、不定形などの形態を採用することができる。
【００４８】
（４）リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体は、無機塩と炭素源だけで生育でき、生成されるＬ−乳酸の純度が高い。また、ヘキソースだけでなくペントースからも乳酸を得ることができるため、非食用バイオマス(木質・草本系バイオマス)を原料とすることもできる。特に、リゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ：和名クモノスカビ）はＬ−乳酸を多量に生産することができることから好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】担体の構造を示す説明図である。
【図２】実施例１におけるＬ−乳酸生産量の経時変化を示す説明図である。
【図３】実施例２における培養後の菌体の形態を説明図である。図３（Ａ）では担体を用いなかった場合の菌体の形態、図３（Ｂ）では担体を用いた場合の菌体の形態を示す。
【図４】実施例３における担体に担持された菌体量の経時変化を示す説明図である。
【図５】実施例４における繰り返し回分培養でのＬ−乳酸生産量の経時変化を示す説明図である。
【図６】実施例５における異なった初発胞子量によるＬ−乳酸生産量の経時変化を示す説明図である。
【図７】実施例６におけるＬ−乳酸生産量の経時変化を示す説明図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糸状菌を用いた乳酸発酵方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸は、醸造、漬物、清涼飲料の酸味料などの食品用、医療用、塗料、溶剤、生分解性プラスチックなどの工業用といろいろな分野で用いられており、その需要が増加している。従来より、乳酸の製造方法として、食用バイオマスを主原料とし、乳酸菌により発酵製造する方法が行われている。ここで、乳酸菌による乳酸の製造では、発酵条件の制御が容易で、乳酸収率が高いという利点があるが、乳酸菌の培養に多くの栄養素を必要とし、培地組成が複雑でコストがかかる、また、乳酸菌は自身の生産する乳酸の酸性で死滅しやすいため、発酵は炭酸カルシウムなどのアルカリを添加して生成乳酸を中和しながら行う必要があるが、このとき副生される石膏の処理にコストがかかる、などの問題点があった。
また、培地に副原料が多量に残っている場合には、高純度の乳酸を得ることは困難である。これらの課題を解消するために、糸状菌を用いて乳酸を製造する方法が各種開発されている。糸状菌を用いて乳酸を製造する方法では、培地成分としては炭素源と無機塩であればよく、製造コストを低減することができる。また、光学純度の高いL-乳酸を生成することができる。更に、非食用バイオマスを原料とすることができる。このような技術として、例えば、特許文献１には、糸状菌の胞子を液体培地に植菌し、通気による撹拌を行いつつ培養することにより生成する菌体集合物（ペレット）を液体培地中に浮遊させて発酵を行わせることを特徴とする乳酸の製造方法が開示されている。
【特許文献１】特開平６−２５３８７１号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、糸状菌は、胞子接種量、培地組成、ｐＨ変化、攪拌の強さなどの培養条件によりその形態が大きく変動し、菌糸が培地の液面に浮上したり、発酵装置の内壁に付着したりして、発酵効率が悪くなりやすい。そのため、上述のような技術では、糸状菌をペレット状にするために、培養条件を高度に制御する必要があり、培養操作が難しいという問題があった。
【０００４】
そこで、本発明は、糸状菌の形態制御が容易な乳酸発酵方法を実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
この発明は、上記目的を達成するため、請求項１に記載の発明では、乳酸発酵方法において、連通した気孔を備え圧縮性を有するスポンジ様多孔質材料からなる担体に、乳酸生成能を有する糸状菌を担持し、当該担体を液体培地中に浮遊させて乳酸発酵を行わせる、という技術的手段を用いる。
【０００６】
請求項１に記載の発明によれば、乳酸生成能を有する糸状菌をスポンジ様多孔質材料からなる担体に担持して乳酸発酵に用いるため、糸状菌の菌糸の増殖は担体内に限定され、糸状菌を胞子接種量や培養の流動条件に依存せずに一定サイズの均一なペレット形態とすることができ、培養容器などへの付着を防止することができる。担体は連通した気孔を備えた多孔質材料からなるため、糸状菌の菌糸が増殖しやすく、多量に担持させることができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。また、連通した気孔を備え圧縮性を有しているため、内部の空気を容易に抜くことができ、担体が液体培地表面に浮き上がることがなく、担体を液体培地中に懸濁させることができる。更に、液体培地のみを容易に分離できるため、菌体を繰り返し用いる反復回分培養や連続培養を容易に行うことができる。
【０００７】
請求項２に記載の発明では、請求項１に記載の乳酸発酵方法において、前記担体は、気孔率が９０％以上である、という技術的手段を用いる。
【０００８】
請求項２に記載の発明では、担体は気孔率が９０％以上と極めて高い気孔率を有するため、多くの糸状菌を担持することができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。
【０００９】
請求項３に記載の発明では、請求項１または請求項２に記載の乳酸発酵方法において、前記担体は、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されている、という技術的手段を用いる。
【００１０】
糸状菌を用いた乳酸発酵において、菌の様相が１〜７ｍｍのペレット状の場合に乳酸収率が高く発酵速度が早いことが知られており、請求項３に記載の発明のように、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されている担体は、乳酸の製造効率を高くすることができるので、好適に用いることができる。なお、塊状とは、各種形態を包括するものであり、立方体、球形、不定形などの形態を採用することができる。
【００１１】
請求項４に記載の発明では、請求項１ないし請求項３のいずれか１つに記載の乳酸発酵方法において、前記糸状菌は、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体である、という技術的手段を用いる。
【００１２】
請求項４に記載の発明のように、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体は、無機塩と炭素源だけで生育でき、生成されるＬ−乳酸の純度が高い。また、ヘキソースだけでなくペントースからも乳酸を得ることができるため、非食用バイオマス(木質・草本系バイオマス)を原料とすることもできる。特に、リゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ：和名クモノスカビ）はＬ−乳酸を多量に生産することができることから好適に用いることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明における乳酸発酵方法について、図を参照して説明する。図１は、担体の構造を示す説明図である。
【００１４】
本発明の乳酸発酵方法において用いる担体は、例えば、図１に示すような連通した気孔を備えた多孔質材料からなる担体１０である。担体１０は連通した気孔１１を備えた高気孔率の多孔質材料１２からなるため、糸状菌の菌糸が増殖しやすく、多量に担持させることができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。ここで、気孔率は９０％以上であると、十分に糸状菌の菌糸が増殖しやすく好ましい。
【００１５】
担体１０は連通した気孔１１を備え圧縮性を有しているため、内部の空気を容易に抜くことができ、担体１０が液体培地表面に浮き上がることがなく、担体１０を液体培地中に懸濁させることができる。
【００１６】
上述のような担体１０は、例えば、ポリウレタンフォームなどのスポンジ様の多孔質材料により立方体状に形成される。
【００１７】
乳酸発酵は、以下の手順で実施する。ここでは、糸状菌として、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属するリゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ：和名クモノスカビ）を用いる。リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体は、無機塩と炭素源だけで生育でき、生成されるＬ−乳酸の純度が高い。また、ヘキソースだけでなくペントースからも乳酸を得ることができるため、非食用バイオマス(木質・草本系バイオマス)を原料とすることもできる。リゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ：和名クモノスカビ）はＬ−乳酸を多量に生産することができることから好適に用いることができる。
【００１８】
まず、リゾプス オリゼの胞子をポテトデキストロース寒天（ＰＤＡ）培地などで培養し、無菌水などでミキシングすることにより所定の初発濃度の胞子懸濁液を作製する。無菌水にはＴｗｅｅｎ８０などのＴｗｅｅｎ系界面活性剤などを添加することもできる。これにより、胞子を無菌水中に効果的に分散させることができ、均質な懸濁液を得ることができる。
【００１９】
次に、乳酸発酵に用いる液体培地を用意する。液体培地は、グルコースやキシロースなどの炭素源に、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの少量の無機塩を添加して作製する。なお、液体培地としては、糸状菌の菌体を生育できる通常の液体培地であれば種類は問わない。
【００２０】
続いて、発酵容器に液体培地と担体を装入し、オートクレーブで滅菌処理した後に、胞子懸濁液を無菌的に植菌する。担体は、液体培地内で押圧することにより容易に脱気することができる。ここで、担体は、滅菌処理で加熱（１２１℃）されるため、当該温度での耐久性が要求される。
【００２１】
リゾプス オリゼによる乳酸発酵は好気性発酵であるため、液体培地と担体とを撹拌翼やエア−リフトなどにより撹拌しながら、所定の温度、ｐＨなどの発酵条件により、リゾプス オリゼを増殖させながら乳酸発酵を行う。ここで、担体は脱気されているため、液体培地中で良好に懸濁される。
【００２２】
ここで、リゾプス オリゼは、担体に担持されて増殖が担体内に限定されるため、胞子接種量や流動などの培養条件に依存せずに一定サイズの均一なペレット形態とすることができ、培養容器などへの付着を防止することができる。ここで、担体は、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されていることが好ましい。糸状菌を用いた乳酸発酵においては、菌の様相が１〜７ｍｍのペレット状の場合に乳酸収率が高く発酵速度が早いためである。このとき、例えば、担体１ｍｌあたり１０５〜１０６個の糸状菌が担持されている。なお、塊状とは、各種形態を包括するものであり、立方体、球形、不定形などの形態を採用することができる。
【００２３】
リゾプス オリゼはほとんど担体にのみ増殖しているため、液体培地とリゾプス オリゼとの分離は、液体培地と担体とを分離することにより、容易に行うことができる。これにより、菌体は担体に残存するため、菌体を繰り返し用いる反復回分培養や連続培養を容易に行うことができる。
【００２４】
上述の工程では、リゾプス オリゼを発酵とともに担体に担持したが、発酵前に担体に担持することもできる。また、担持方法としては、上述の方法以外に物理的に吸着させたり、他の方法を採用することもできる。
【００２５】
（実施例）
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明に係わる担体、菌体、発酵方法などは実施例に限定されない。
【００２６】
担体粒子としては、連続気孔を有するスポンジ様の気孔率９５〜９６％のポリウレタンフォームを３．５ｍｍ角の立方体形状に成型されたものを用いた。
【００２７】
菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部から入手しＲｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ４７０７を用いた。
【００２８】
液体培地は、表１の組成で作製した各Ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎを表２の割合で混合したものを用いた。初発のｐＨは５．２６であった。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【表２】
【００３１】
胞子の調製法を以下に示す。入手した菌株の胞子を復水液に懸濁し、２枚のＰＤＡ寒天培地に塗布し、インキュベータで１週間３０℃の条件で培養した。得られた寒天培地上に生育した胞子に滅菌した０．０３％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液を適量入れ、スプレッダ−やスパーテルで集めて、２０枚のＰＤＡ寒天培地上に塗布し、インキュベータで１週間３０℃の条件で培養した。得られた胞子は０．０３％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液＋４０％
ｇｌｙｃｅｒｏｌ水溶液（１：１）の溶液で胞子懸濁液をつくった。このように得られた胞子懸濁液を０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０水溶液で適当に希釈し、トーマ血球計によって顕微鏡下で一定容積中の菌数を繰り返し数え、胞子懸濁液の濃度とした。この胞子懸濁液は−８０℃で保存した。胞子の初発接種量は、２×１０6／ｍＬとした。
【００３２】
（実施例１）
胞子懸濁液を融解した後に、均一な状態にした胞子懸濁液２×１０6／ｍＬを３００ｍｌ容量の三角フラスコ内の滅菌済みの液体培地に接種し、３７℃、攪拌速度１５０ｒｐｍの条件で振とう培養を行った。担体は液体培地５０ｍＬに対して３００個の割合で使用した。炭素源以外の液体培地にスポンジ担体を装入し、パンチングメタルを介して押圧し、担体内の空気を脱気した。発酵生成したＬ−乳酸の量は、発酵液を毎日５００μＬずつ採取し、原子吸光法により分析した。三角フラスコは、バッフル付のものとバッフルがないものを用意し、担体の影響とともにバッフルの有無の影響も調べた。
【００３３】
図２にＬ−乳酸生産量の経時変化を示す。担体及びバッフル付三角フラスコを用いた場合がＬ−-乳酸の収率が高く、最大乳酸生成速度も早かった。菌体が担体に入って均一な状態になったこと、バッフルによって通常に比べて攪拌・通気効果が上がったことにより収率が上がったと考えられる。担体を使用した場合には、菌体は担体内部でのみ増殖したが、担体を使用しなかった場合、菌体は三角フラスコ内壁に付着したり、大きな塊となり液体培地に浮遊したりしていた。
【００３４】
（実施例２）
実施例１をスケールアップさせて、ファーメンターでの培養を行った。滅菌後、装置をセットし、約３７℃で表１に記載のＡ(炭素源)を接種口から流しいれた。その後、均一にした胞子懸濁液２×１０6／ｍＬになるように接種口から接種し、３７℃、攪拌速度２５０ｒｐｍの条件で培養を開始した。全量は１．５Ｌとした。担体は液体培地５０ｍＬに対して３００個の割合で使用した。
【００３５】
図３に培養後の菌体の形態を示す。図３（Ａ）では担体を用いなかった場合の菌体の形態、図３（Ｂ）では担体を用いた場合の菌体の形態を示す。図３（Ａ）に示すように、担体を用いなかった場合では、菌体は、液体培地中に塊になって浮遊したり、内壁や攪拌羽、攪拌棒にパルプ状に付着したりしたため、装置が作動しなくなってしまった。一方、図３（Ｂ）に示すように、担体を用いた場合では、担体中に菌体が均一に入っており、内壁などに菌体が付着することはなかった。
【００３６】
（実施例３）
担体中の菌体量の経時変化を調べた。培養条件は、３７℃、攪拌速度１５０ｒｐｍで、９日間の培養を行った。図４に担体に担持された菌体量の経時変化を示す。菌体量は３日までは急増し、その後は緩やかに増加し、約０．５ｍｇ／担体で一定となった。液体培地はほぼ透明であり、菌体が担体内でのみ成長することが確認された。
【００３７】
（実施例４）
実施例１と同様の培養条件により、繰り返し回分培養を行った。Ｌ−乳酸の生産量がが１２〜１３ｇ／Ｌになった時点で、クリーンベンチ内で液体培地を除き、滅菌済みの液体培地をいれて一度担体を洗い、新しい滅菌済みの液体培地を加えて培養機へ戻した。この操作を１０回繰り返し行った。発酵生成したＬ−乳酸の量は、発酵液を毎日５００μＬずつ採取し、原子吸光法により分析した。なお、４回目の培養のみキシロースの濃度を６０ｇ／Ｌとした。
【００３８】
図５に繰り返し回分培養でのＬ−乳酸生産量の経時変化を示す。Ｌ−乳酸生産量の経時変化は、繰り返し回数に依存せず、ほぼ一定の挙動を示し、４回目を除き、乳酸収率は約０．４ｇ／ｇと良好な結果を示した。これにより、本発明の担体を用いて繰り返し回分培養を良好な条件で実施することができることが確認された。
【００３９】
（実施例５）
初発胞子量のＬ−乳酸生産量への影響を調べた。初発胞子量は、２×１０4／ｍＬ、２×１０5／ｍＬ、２×１０6／ｍＬ、２×１０7／ｍＬの４水準とし、担体とバッフル付三角フラスコを用いて、実施例１と同じ培養条件で培養を行った。発酵生成したＬ−乳酸の量は、発酵液を毎日５００μＬずつ採取し、原子吸光法により分析した。
【００４０】
図６に異なった初発胞子量によるＬ−乳酸生産量の経時変化を示す。Ｌ−乳酸の収率及び最大乳酸生産速度は、初発胞子量２×１０5／ｍＬの場合が最も高い値を示した。初発胞子量が少なくなるのにつれて、Ｌ−乳酸が生産され始める時間も遅くなった。また、目視によると、初発胞子量２×１０7／ｍＬの場合は、三角フラスコの上部内壁に多量の菌体が付着していた。接種胞子数が多ければ多いほどＬ−乳酸の生成速度や収率が上がるわけではないことから、担体粒子１個当りの初発胞子量に上限値があり、それ以上多くしても胞子は担体内に入りきれないと考えられた。
【００４１】
（実施例６）
異なる炭素源でのＬ−乳酸生産量の経時変化を調べた。実施例１〜５で用いた炭素源ヘキソースであるＸｙｌｏｓｅに加え、ペントースであるＧｌｕｃｏｓｅを用いて、実施例３と同様の条件で最大１０日間の培養を行った。図７にＬ−乳酸生産量の経時変化を示す。図中の直線は、最大乳酸生成速度を求めるための近似直線である。表３に最大乳酸生成速度及びＬ−乳酸の収率を示す。
【００４２】
【表３】
【００４３】
最大乳酸生成速度は、Ｇｌｕｃｏｓｅを用いた場合がＸｙｌｏｓｅを用いた場合よりも約２倍速かった。乳酸の収率は、いずれも約０．５ｇ／ｇであり、Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｘｙｌｏｓｅともに乳酸発酵に好適に用いることができる。これにより、ヘキソースだけでなくペントースからも乳酸を得ることができることが確認された。
【００４４】
なお、各実施例では、菌株として、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ４７０７を用いたが、これに限定されるものではなく、例えば、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＮＢＲＣ５３８４も好適に用いることができる。
【００４５】
［最良の実施形態の効果］
（１）本発明の乳酸発酵方法によれば、乳酸生成能を有する糸状菌をスポンジ様多孔質材料からなる担体に担持して乳酸発酵に用いるため、糸状菌の菌糸の増殖は担体内に限定され、糸状菌を胞子接種量や培養の流動条件に依存せずに一定サイズの均一なペレット形態とすることができ、培養容器などへの付着を防止することができる。担体は連通した気孔を備えた多孔質材料からなるため、糸状菌の菌糸が増殖しやすく、多量に担持させることができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。また、連通した気孔を備え圧縮性を有しているため、内部の空気を容易に抜くことができ、担体が液体培地表面に浮き上がることがなく、担体を液体培地中に懸濁させることができる。更に、液体培地のみを容易に分離できるため、菌体を繰り返し用いる反復回分培養や連続培養を容易に行うことができる。
【００４６】
（２）担体は気孔率が９０％以上と極めて高い気孔率を有するため、多くの糸状菌を担持することができるので、乳酸の製造効率を高くすることができる。
【００４７】
（３）糸状菌を用いた乳酸発酵において、菌の様相が１〜７ｍｍのペレット状の場合に乳酸収率が高く発酵速度が早いことが知られており、請求項３に記載の発明のように、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されている担体は、乳酸の製造効率を高くすることができるので、好適に用いることができる。なお、塊状とは、各種形態を包括するものであり、立方体、球形、不定形などの形態を採用することができる。
【００４８】
（４）リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体は、無機塩と炭素源だけで生育でき、生成されるＬ−乳酸の純度が高い。また、ヘキソースだけでなくペントースからも乳酸を得ることができるため、非食用バイオマス(木質・草本系バイオマス)を原料とすることもできる。特に、リゾプス オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ：和名クモノスカビ）はＬ−乳酸を多量に生産することができることから好適に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】担体の構造を示す説明図である。
【図２】実施例１におけるＬ−乳酸生産量の経時変化を示す説明図である。
【図３】実施例２における培養後の菌体の形態を説明図である。図３（Ａ）では担体を用いなかった場合の菌体の形態、図３（Ｂ）では担体を用いた場合の菌体の形態を示す。
【図４】実施例３における担体に担持された菌体量の経時変化を示す説明図である。
【図５】実施例４における繰り返し回分培養でのＬ−乳酸生産量の経時変化を示す説明図である。
【図６】実施例５における異なった初発胞子量によるＬ−乳酸生産量の経時変化を示す説明図である。
【図７】実施例６におけるＬ−乳酸生産量の経時変化を示す説明図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
連通した気孔を備え圧縮性を有するスポンジ様多孔質材料からなる担体に、乳酸生成能を有する糸状菌を担持し、当該担体を液体培地中に浮遊させて乳酸発酵を行わせることを特徴とする乳酸発酵方法。
【請求項２】
前記担体は、気孔率が９０％以上であることを特徴とする請求項１に記載の乳酸発酵方法。
【請求項３】
前記担体は、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の乳酸発酵方法。
【請求項４】
前記糸状菌は、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体であることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１つに記載の乳酸発酵方法。
【請求項１】
連通した気孔を備え圧縮性を有するスポンジ様多孔質材料からなる担体に、乳酸生成能を有する糸状菌を担持し、当該担体を液体培地中に浮遊させて乳酸発酵を行わせることを特徴とする乳酸発酵方法。
【請求項２】
前記担体は、気孔率が９０％以上であることを特徴とする請求項１に記載の乳酸発酵方法。
【請求項３】
前記担体は、外形寸法が１〜７ｍｍの塊状に形成されていることを特徴とする請求項１または請求項２に記載の乳酸発酵方法。
【請求項４】
前記糸状菌は、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属に属する菌体であることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１つに記載の乳酸発酵方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１０−１９３８４６（Ｐ２０１０−１９３８４６Ａ）
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−４５２６２（Ｐ２００９−４５２６２）
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（５００４３３２２５）学校法人中部大学 (105)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月２７日（２００９．２．２７）
【出願人】（５００４３３２２５）学校法人中部大学 (105)
【Ｆターム（参考）】
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