乳酸脱水素酵素活性の測定方法
【課題】 新規な測定試薬を用い、比色法によって乳酸脱水素酵素の活性を測定することのできるようにした測定方法を提供する。
【解決手段】 乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、ピルビン酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させる。
ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させる。
血液、唾液その他の体液、または細胞培養液を検査対象とすることができる。
【解決手段】 乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、ピルビン酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させる。
ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させる。
血液、唾液その他の体液、または細胞培養液を検査対象とすることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳酸脱水素酵素活性の測定方法に関し、特に新規な測定試薬を用いて比色法によって乳酸脱水素酵素の活性を測定することができるようにした方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸脱水素酵素〔Ｌ−Ｌａｃｔａｔｅ：ＮＡＤ+ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＥＣ１．１．１．２７）〕は乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）からピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）への反応、およびその逆反応を触媒する酵素である。本酵素は解糖系の最終段階の酵素であり、ほとんど全ての細胞の可溶性画分に存在する。細胞が障害を受けると、乳酸脱水素酵素は細胞外に漏出し、血中の酵素活性が上昇するため、臨床検査においては重要な検査項目の一つとなっている。
【０００３】
また、臨床検査以外にも培養細胞を用いて、生理活性物質による細胞障害、細胞性免疫による細胞障害、補体依存性細胞障害、抗体依存性細胞障害などの試験、および細胞の生存率の測定等にも乳酸脱水素酵素の活性が指標として用いられている。
【０００４】
従来、乳酸脱水素酵素が触媒する、乳酸＋ＮＡＤ+→ピルビン酸＋ＮＡＤＨ、又はピルビン酸＋ＮＡＤＨ→乳酸＋ＮＡＤ+の反応をＮＡＤＨ量の増減による３４０ｎｍの吸光度変化を指標に検出し、これによって乳酸脱水素酵素の活性を測定する方法、あるいは正反応において生成するＮＡＤＨと例えばジアホラーゼを用いてテトラゾリウム塩を還元発色させ、比色法によって乳酸脱水素酵素の活性を求める方法が知られている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−４３２２０号公報
【特許文献２】特開２００４−２２９５３７号公報
【特許文献３】特開２００４−３２９１４１号公報
【特許文献４】特開２０００−６９９９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はかかる状況において、新規な測定試薬を用いて比色法によって乳酸脱水素酵素の活性を測定できるようにした乳酸脱水素酵素活性の測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る乳酸脱水素酵素活性の測定方法は、乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、ピルビン酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させることを特徴とする。
【０００８】
化学式１に示されるように、まず乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質に用いて、試料中の乳酸脱水素酵素によりピルビン酸を生成する。生じたピルビン酸はリン酸、酸素および水からピルビン酸オキシダーゼにより、アセチルリン酸、二酸化炭素、および過酸化水素に変換される。ここで、生成した過酸化水素はさらにペルオキシダーゼの存在下、種々の指示薬の酸化により色素を生成する。この色素を目視することによって乳酸脱水素酵素の活性を簡易迅速に求めることができる。また、この色素による吸光度の変化を指標にして例えば分光光度計によって高精度に乳酸脱水素酵素活性を測定することもできる。
【０００９】
【化１】
【００１０】
また、本発明に係る乳酸脱水素酵素活性の測定方法は、ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させることを特徴とする。
【００１１】
化学式２に示されるように、ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質に用いて、試料中の乳酸脱水素酵素により乳酸を生成する。生じた乳酸は乳酸オキシダーゼにより、ピルビン酸と過酸化水素に変換される。生成するピルビン酸は乳酸脱水素酵素の基質として回収され、過酸化水素はさらにペルオキシダーゼの存在下、種々の指示薬の酸化により色素を生成する。この色素を目視することによって乳酸脱水素酵素の活性を簡易迅速に求めることができる。また、この色素による吸光度の変化を指標として例えば分光光度計によって高精度に乳酸脱水素酵素活性を測定することもできる。
【００１２】
【化２】
【００１３】
本発明に係る乳酸脱水素酵素活性測定試薬は、ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、ピルビン酸オキシダーゼ補酵素、ピルビン酸オキシダーゼ活性剤、リン酸、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むことを特徴とする。
【００１４】
この乳酸脱水素酵素活性測定試薬におけるペルオキシダーゼ発色基質には、４−アミノアンチピリンとフェノール誘導体又はアニリン誘導体を用いることができる。
【００１５】
また、本発明に係る乳酸脱水素酵素測定試薬は、乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、乳酸脱水素酵素補酵素、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むことを特徴とする。
【００１６】
この乳酸脱水素酵素測定試薬におけるペルオキシダーゼ発色基質には、２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、またはｏ−フェニレンジアミン誘導体を用いることができる。
【００１７】
本発明に係る乳酸脱水素酵素活性測定キットは、ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、ピルビン酸オキシダーゼ補酵素、ピルビン酸オキシダーゼ活性剤、リン酸、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含む乳酸脱水素酵素活性測定試薬を、吸水性基材に含浸させてなることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る乳酸脱水素酵素活性測定キットは、乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、乳酸脱水素酵素補酵素、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含む乳酸脱水素酵素測定試薬を、吸水性基材に含浸させてなることを特徴とする。
【００１９】
本発明に係る乳酸脱水素酵素活性測定方法および簡易測定キットは血液、唾液、その他の体液、および細胞培養液を検査対象とすることができる。
【００２０】
乳酸脱水素酵素の基質としては、乳酸、乳酸リチウム、乳酸ナトリウム、乳酸アンモニウム、乳酸マグネシウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウム、ピルビン酸リチウム、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸アンモニウム、ピルビン酸マグネシウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸カルシウム等が好適に用いられる。これらの基質は発色液中の最終濃度が０．１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが望ましい。
【００２１】
ｐＨ緩衝剤としてはｐＨ４〜９において緩衝作用を示す、シュウ酸、マレイン酸、リン酸、マロン酸、クエン酸、ジメチルグルタル酸、乳酸、または、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ，Ｔｒｉｓ，Ｂｉｃｉｎｅ，Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ，ＴＡＰＳ等のＧｏｏｄの緩衝液を用いることができる。特に、ピルビン酸オキシダーゼを用いる場合にはその基質でもあるリン酸をｐＨ緩衝剤として最終濃度が１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように用いることが望ましい。
【００２２】
ピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼは、例えば、植物由来のもの、動物由来のもの、微生物由来のもの、または遺伝子組換えにより調製されたものを用いることができる。添加濃度としてはそれぞれ０．１〜１００Ｕ／ｍＬが望ましい。
【００２３】
ピルビン酸オキシダーゼおよび乳酸オキシダーゼの補酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩を最終濃度が０．５〜１００μｍｏｌ／Ｌとなるように、チアミンピロフォスフェートを最終濃度が１．０〜５００μｍｏｌ／Ｌとなるように用いることが望ましい。また、活性化剤としてマンガン、マグネシウム、カルシウム、コバルト等が用いられる。添加濃度としては０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが望ましい。
【００２４】
安定化剤としては、ウシ血清アルブミン等のタンパク質、トレハロース、スクロース等の糖類、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール類が好適に用いられる。添加濃度としては、０．００５〜５％が望ましい。
【００２５】
ペルオキシダーゼ発色基質としては、例えば、４−アミノアンチピリンおよびフェノールもしくはその誘導体、またはアニリン誘導体の組み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンおよびアニリン誘導体の組み合わせ、２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、またはｏ−フェニレンジアミン誘導体が挙げられる。
【００２６】
フェノール誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、または２，４，６−トリクロロフェノールが挙げられる。
【００２７】
アニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３、５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３、５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）または、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）が挙げられる。
【００２８】
ロイコ色素としては、例えば、ロイコマラカイトグリーン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェノール）−２−スルホニルメタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジスルホプロポキシフェニルメタン、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０−［３−（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルアミノカルボニル］−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等が挙げられる。
【００２９】
ジフェニルアミン誘導体としては、例えば、ビス［４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ−２−メチルフェニル］アミン、またはＮ，Ｎ−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニル尿酸等が挙げられる。
【００３０】
ベンジジン誘導体としては、例えば、ベンジジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）トリジン、または３，３’、５，５’−テトラアミノベンジジン等が挙げられる。
【００３１】
トリアリルイミダゾール誘導体としては、例えば、２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、または２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール等が挙げられる。
【００３２】
これら色素原体の使用濃度としては、４−アミノアンチピリンは０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、フェノール誘導体、アニリン誘導体については１．０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌが望ましい。
【００３３】
吸水性基材には通常の濾紙、書道用吸い取り紙、高分子吸収体、不織布などが用いられる。本発明により製造された乳酸脱水素酵素活性測定キットは、検体溶液を浸した後、通常室温で１０秒から１０分間、好ましくは１分から５分間放置後の呈色を色調見本の色と比較して酵素活性を判定するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１における乳酸脱水素酵素活性（［ＬＤＨ］）と５５０ｎｍにおける吸光度の変化量（ΔＡ５５０）との関係を示す図である。
【図２】実施例２の結果において乳酸脱水素酵素活性（［ＬＤＨ］）と５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）との関係を示す図である。
【図３】実施例３の結果において乳酸脱水素酵素活性（［ＬＤＨ］）と５６０ｎｍにおける吸光度（Ａ５６０）との関係を示す図である。
【図４】実施例４の結果において乳酸脱水素酵素濃度と試験紙の色調のＲＧＢ値の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３６】
ピルビン酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させる方法で乳酸脱水素酵素活性を測定した。乳酸リチウム２０ｍｇ／ｍＬ、リン酸一ナトリウム二水和物１５ｍｇ／ｍＬ、塩化マグネシウム六水和物２．０ｍｇ／ｍＬおよびウシ血清アルブミン５．０ｍｇ／ｍＬを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、３７℃）８９０μＬを予め３７°Ｃに加温し、ブタ心臓由来乳酸脱水素酵素溶液（０〜５０Ｕ／ｍＬ）を１０μＬ添加した後、下記の発色液１を１００μＬ添加して、反応を開始した。５分間反応後の５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）を測定し、ＬＤＨ非存在下における測定値との差（ΔＡ５５０）を乳酸脱水素酵素濃度（［ＬＤＨ］）に対してプロットした。
【００３７】
〔発色液１の組成（ｐＨ６．０）〕
乳酸リチウム ２０ｍｇ／ｍＬ
リン酸一ナトリウム二水和物 １５ｍｇ／ｍＬ
塩化マグネシウム六水和物 ２．０ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン ５．０ｍｇ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．２０ｍｇ／ｍＬ
チアミンピロフォスフェート ０．１１ｍｇ／ｍＬ
フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム １０μｇ／ｍＬ
ＴＯＯＳ ０．２４ｍｇ／ｍＬ
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド一リチウム ３．０ｍｇ／ｍＬ
西洋ワサビペルオキシダーゼ ５Ｕ／ｍＬ
ピルビン酸オキシダーゼ １０Ｕ／ｍＬ
【００３８】
結果を図１に示す。上記の測定条件において、５分間反応後のΔＡ５５０は乳酸脱水素酵素濃度の上昇に伴い、ミカエリスメンテン型の飽和曲線状に増大した（図１）。図１に示す測定データの近似式は次の数式１で表される（相関係数０．９９９６）。
【００３９】
【数１】
【００４０】
本測定条件において最大発色変化量の１／２を示す乳酸脱水素酵素量は０．１２Ｕ／ｍＬと求められ、本法により乳酸脱水素酵素活性を定量的に測定できることが示された。
【実施例２】
【００４１】
乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させる方法で乳酸脱水素酵素活性を測定した。ピルビン酸ナトリウム０．１１ｍｇ／ｍＬ、リン酸一ナトリウム二水和物１５ｍｇ／ｍＬおよびウシ血清アルブミン５．０ｍｇ／ｍＬを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、３７℃）８００μＬを予め３７℃に加温し、ブタ心臓由来乳酸脱水素酵素溶液（０〜０．５Ｕ／ｍＬ）を１００μＬ添加した後、下記の発色液２を１００μＬ添加して、反応を開始した。５分間反応後の５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）を測定し、乳酸脱水素酵素濃度（［ＬＤＨ］）に対してプロットした。
【００４２】
〔発色液２の組成（ｐＨ６．０）〕
ピルビン酸ナトリウム ０．１１ｍｇ／ｍＬ
リン酸一ナトリウム二水和物 １５ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン ５．０ｍｇ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．２０ｍｇ／ｍＬ
フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム １０μｇ／ｍＬ
ＴＯＯＳ ０．２４ｍｇ／ｍＬ
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド ３．０ｍｇ／ｍＬ
西洋ワサビペルオキシダーゼ ５Ｕ／ｍＬ
ピルビン酸オキシダーゼ １０Ｕ／ｍＬ
【００４３】
結果を図２に示す。上記の測定条件において５分間反応後のＡ５５０は［ＬＤＨ］の増大に伴い、シグモイド曲線状に増大した。図２に示す測定データの近似式は次の数式２で表される（相関係数０．９９８４）。
【００４４】
【数２】
【００４５】
本測定条件下においては５５０ｎｍにおける吸光度の測定値（Ａ５５０）から数式２を用いて、乳酸脱水素酵素活性（［ＬＤＨ］）を算出することができる。本法によっても乳酸脱水素酵素活性を定量的に測定できることが示された。
【実施例３】
【００４６】
和光純薬工業製ＬＤＨ細胞毒性テストワコーを用いて乳酸脱水素酵素活性を測定した。本測定キットはジアホラーゼとテトラゾリウム塩を含み、乳酸脱水素酵素活性を反応系で生成するジホルマザン色素量で検出するものである。
【００４７】
緩衝液４００μＬと蒸留水４００μＬを混合して予め３７℃に加温した後、発色液１００μＬおよびブタ心臓由来乳酸脱水素酵素溶液（０〜１．０Ｕ／ｍＬ）１００μＬを添加して反応を開始した。５分間反応後の５６０ｎｍにおける吸光度（Ａ５６０）を測定し、乳酸脱水素酵素濃度（［ＬＤＨ］）に対してプロットした。
【００４８】
結果を図３に示す。上記の測定条件において５分間反応後のＡ５６０は［ＬＤＨ］の増大に伴い、シグモイド曲線状に増大した。検出シグナルの強弱や検出に要する時間等は発色液の酵素濃度、基質濃度、またｐＨ等の条件によりある程度上下することが考えられるが、請求項１および請求項２記載の乳酸脱水素酵素活性の測定法は従来法を用いる市販の測定キットを使用した場合と比較して遜色なく利用できることが示唆された。
【実施例４】
【００４９】
実施例１記載の発色液を書道用吸い取り紙（墨運堂社製、５ｍｍ×１０ｍｍ）に浸漬したのち、遮光下で凍結乾燥を行い、乳酸脱水素酵素活性検出試験紙を得た。得られた試験紙にブタ心臓由来乳酸脱水素酵素溶液（０〜５０Ｕ／ｍＬ）を２０μＬ添加して室温で５分間放置した後、１Ｎ塩酸を１０μＬ添加して反応を停止した。発色した試験紙をスキャナーで読み取り、画像処理ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標））を用いて、色調を数値化（ＲＧＢ値）した。
【００５０】
結果を図４に示す。得られた試験紙は乳酸脱水素酵素との反応により赤紫色に変色した。Ｒ値、Ｇ値、およびＢ値の最大変化量の１／２の変化に要する乳酸脱水素酵素量はそれぞれ、１．４−０．５〜１．４＋０．５、２．１−０．６〜２．１＋０．６、および１．４−０．３〜１．４＋０．３（Ｕ／ｍＬ）と求められた。本試薬濃度条件で作成された試験紙は０〜２Ｕ／ｍＬの範囲の乳酸脱水素酵素活性の半定量に適していた。
【技術分野】
【０００１】
本発明は乳酸脱水素酵素活性の測定方法に関し、特に新規な測定試薬を用いて比色法によって乳酸脱水素酵素の活性を測定することができるようにした方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳酸脱水素酵素〔Ｌ−Ｌａｃｔａｔｅ：ＮＡＤ+ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＥＣ１．１．１．２７）〕は乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ+）からピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）への反応、およびその逆反応を触媒する酵素である。本酵素は解糖系の最終段階の酵素であり、ほとんど全ての細胞の可溶性画分に存在する。細胞が障害を受けると、乳酸脱水素酵素は細胞外に漏出し、血中の酵素活性が上昇するため、臨床検査においては重要な検査項目の一つとなっている。
【０００３】
また、臨床検査以外にも培養細胞を用いて、生理活性物質による細胞障害、細胞性免疫による細胞障害、補体依存性細胞障害、抗体依存性細胞障害などの試験、および細胞の生存率の測定等にも乳酸脱水素酵素の活性が指標として用いられている。
【０００４】
従来、乳酸脱水素酵素が触媒する、乳酸＋ＮＡＤ+→ピルビン酸＋ＮＡＤＨ、又はピルビン酸＋ＮＡＤＨ→乳酸＋ＮＡＤ+の反応をＮＡＤＨ量の増減による３４０ｎｍの吸光度変化を指標に検出し、これによって乳酸脱水素酵素の活性を測定する方法、あるいは正反応において生成するＮＡＤＨと例えばジアホラーゼを用いてテトラゾリウム塩を還元発色させ、比色法によって乳酸脱水素酵素の活性を求める方法が知られている（特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００８−４３２２０号公報
【特許文献２】特開２００４−２２９５３７号公報
【特許文献３】特開２００４−３２９１４１号公報
【特許文献４】特開２０００−６９９９７号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明はかかる状況において、新規な測定試薬を用いて比色法によって乳酸脱水素酵素の活性を測定できるようにした乳酸脱水素酵素活性の測定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明に係る乳酸脱水素酵素活性の測定方法は、乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、ピルビン酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させることを特徴とする。
【０００８】
化学式１に示されるように、まず乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質に用いて、試料中の乳酸脱水素酵素によりピルビン酸を生成する。生じたピルビン酸はリン酸、酸素および水からピルビン酸オキシダーゼにより、アセチルリン酸、二酸化炭素、および過酸化水素に変換される。ここで、生成した過酸化水素はさらにペルオキシダーゼの存在下、種々の指示薬の酸化により色素を生成する。この色素を目視することによって乳酸脱水素酵素の活性を簡易迅速に求めることができる。また、この色素による吸光度の変化を指標にして例えば分光光度計によって高精度に乳酸脱水素酵素活性を測定することもできる。
【０００９】
【化１】
【００１０】
また、本発明に係る乳酸脱水素酵素活性の測定方法は、ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させることを特徴とする。
【００１１】
化学式２に示されるように、ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質に用いて、試料中の乳酸脱水素酵素により乳酸を生成する。生じた乳酸は乳酸オキシダーゼにより、ピルビン酸と過酸化水素に変換される。生成するピルビン酸は乳酸脱水素酵素の基質として回収され、過酸化水素はさらにペルオキシダーゼの存在下、種々の指示薬の酸化により色素を生成する。この色素を目視することによって乳酸脱水素酵素の活性を簡易迅速に求めることができる。また、この色素による吸光度の変化を指標として例えば分光光度計によって高精度に乳酸脱水素酵素活性を測定することもできる。
【００１２】
【化２】
【００１３】
本発明に係る乳酸脱水素酵素活性測定試薬は、ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、ピルビン酸オキシダーゼ補酵素、ピルビン酸オキシダーゼ活性剤、リン酸、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むことを特徴とする。
【００１４】
この乳酸脱水素酵素活性測定試薬におけるペルオキシダーゼ発色基質には、４−アミノアンチピリンとフェノール誘導体又はアニリン誘導体を用いることができる。
【００１５】
また、本発明に係る乳酸脱水素酵素測定試薬は、乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、乳酸脱水素酵素補酵素、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むことを特徴とする。
【００１６】
この乳酸脱水素酵素測定試薬におけるペルオキシダーゼ発色基質には、２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、またはｏ−フェニレンジアミン誘導体を用いることができる。
【００１７】
本発明に係る乳酸脱水素酵素活性測定キットは、ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、ピルビン酸オキシダーゼ補酵素、ピルビン酸オキシダーゼ活性剤、リン酸、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含む乳酸脱水素酵素活性測定試薬を、吸水性基材に含浸させてなることを特徴とする。
【００１８】
また、本発明に係る乳酸脱水素酵素活性測定キットは、乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、乳酸脱水素酵素補酵素、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含む乳酸脱水素酵素測定試薬を、吸水性基材に含浸させてなることを特徴とする。
【００１９】
本発明に係る乳酸脱水素酵素活性測定方法および簡易測定キットは血液、唾液、その他の体液、および細胞培養液を検査対象とすることができる。
【００２０】
乳酸脱水素酵素の基質としては、乳酸、乳酸リチウム、乳酸ナトリウム、乳酸アンモニウム、乳酸マグネシウム、乳酸カリウム、乳酸カルシウム、ピルビン酸リチウム、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸アンモニウム、ピルビン酸マグネシウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸カルシウム等が好適に用いられる。これらの基質は発色液中の最終濃度が０．１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように添加することが望ましい。
【００２１】
ｐＨ緩衝剤としてはｐＨ４〜９において緩衝作用を示す、シュウ酸、マレイン酸、リン酸、マロン酸、クエン酸、ジメチルグルタル酸、乳酸、または、ＨＥＰＥＳ、ＨＥＰＰＳ，Ｔｒｉｓ，Ｂｉｃｉｎｅ，Ｇｌｙｃｙｌｇｌｙｃｉｎｅ，ＴＡＰＳ等のＧｏｏｄの緩衝液を用いることができる。特に、ピルビン酸オキシダーゼを用いる場合にはその基質でもあるリン酸をｐＨ緩衝剤として最終濃度が１０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌとなるように用いることが望ましい。
【００２２】
ピルビン酸オキシダーゼ、乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼは、例えば、植物由来のもの、動物由来のもの、微生物由来のもの、または遺伝子組換えにより調製されたものを用いることができる。添加濃度としてはそれぞれ０．１〜１００Ｕ／ｍＬが望ましい。
【００２３】
ピルビン酸オキシダーゼおよび乳酸オキシダーゼの補酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチドまたはその塩を最終濃度が０．５〜１００μｍｏｌ／Ｌとなるように、チアミンピロフォスフェートを最終濃度が１．０〜５００μｍｏｌ／Ｌとなるように用いることが望ましい。また、活性化剤としてマンガン、マグネシウム、カルシウム、コバルト等が用いられる。添加濃度としては０．１〜１００ｍｍｏｌ／Ｌが望ましい。
【００２４】
安定化剤としては、ウシ血清アルブミン等のタンパク質、トレハロース、スクロース等の糖類、エチレングリコール、ポリエチレングリコール等のアルコール類が好適に用いられる。添加濃度としては、０．００５〜５％が望ましい。
【００２５】
ペルオキシダーゼ発色基質としては、例えば、４−アミノアンチピリンおよびフェノールもしくはその誘導体、またはアニリン誘導体の組み合わせ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾンおよびアニリン誘導体の組み合わせ、２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、またはｏ−フェニレンジアミン誘導体が挙げられる。
【００２６】
フェノール誘導体としては、例えば、４−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、２，４−ジブロモフェノール、または２，４，６−トリクロロフェノールが挙げられる。
【００２７】
アニリン誘導体としては、例えば、Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプロピル−３、５−ジメトキシアニリン（ＨＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシアニリン（ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３、５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリン（ＦＤＡＰＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３，５−ジメトキシアニリン（ＣＥＤＢ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ−（３−スルホプロピル）アニリン（ＨＡＬＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３、５−ジメチルアニリン（ＭＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）−３−メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メチルアニリン（ＣＥＭＢ）または、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン（ＣＥＭＯ）が挙げられる。
【００２８】
ロイコ色素としては、例えば、ロイコマラカイトグリーン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェノール）−２−スルホニルメタン、ビス（ｐ−ジエチルアミノフェニル）−３，４−ジスルホプロポキシフェニルメタン、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン、１０−［３−（メトキシカルボニルアミノメチル）フェニルメチルアミノカルボニル］−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジン等が挙げられる。
【００２９】
ジフェニルアミン誘導体としては、例えば、ビス［４−ジ（２−ブトキシエチル）アミノ−２−メチルフェニル］アミン、またはＮ，Ｎ−ビス（４−ジエチルアミノ−２−メチルフェニル）−Ｎ’−ｐ−トルエンスルホニル尿酸等が挙げられる。
【００３０】
ベンジジン誘導体としては、例えば、ベンジジン、ｏ−トリジン、ｏ−ジアニシジン、３，３’−ジアミノベンジジン、Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）トリジン、または３，３’、５，５’−テトラアミノベンジジン等が挙げられる。
【００３１】
トリアリルイミダゾール誘導体としては、例えば、２−（４−カルボキシフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール、または２−（３−メトキシ−４−ジエチルアミノフェニル）−３−Ｎ−メチルカルバモイル−４，５−ビス（２−メチル−４−ジエチルアミノフェニル）イミダゾール等が挙げられる。
【００３２】
これら色素原体の使用濃度としては、４−アミノアンチピリンは０．１〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ、フェノール誘導体、アニリン誘導体については１．０〜５００ｍｍｏｌ／Ｌが望ましい。
【００３３】
吸水性基材には通常の濾紙、書道用吸い取り紙、高分子吸収体、不織布などが用いられる。本発明により製造された乳酸脱水素酵素活性測定キットは、検体溶液を浸した後、通常室温で１０秒から１０分間、好ましくは１分から５分間放置後の呈色を色調見本の色と比較して酵素活性を判定するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】実施例１における乳酸脱水素酵素活性（［ＬＤＨ］）と５５０ｎｍにおける吸光度の変化量（ΔＡ５５０）との関係を示す図である。
【図２】実施例２の結果において乳酸脱水素酵素活性（［ＬＤＨ］）と５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）との関係を示す図である。
【図３】実施例３の結果において乳酸脱水素酵素活性（［ＬＤＨ］）と５６０ｎｍにおける吸光度（Ａ５６０）との関係を示す図である。
【図４】実施例４の結果において乳酸脱水素酵素濃度と試験紙の色調のＲＧＢ値の関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００３６】
ピルビン酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させる方法で乳酸脱水素酵素活性を測定した。乳酸リチウム２０ｍｇ／ｍＬ、リン酸一ナトリウム二水和物１５ｍｇ／ｍＬ、塩化マグネシウム六水和物２．０ｍｇ／ｍＬおよびウシ血清アルブミン５．０ｍｇ／ｍＬを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、３７℃）８９０μＬを予め３７°Ｃに加温し、ブタ心臓由来乳酸脱水素酵素溶液（０〜５０Ｕ／ｍＬ）を１０μＬ添加した後、下記の発色液１を１００μＬ添加して、反応を開始した。５分間反応後の５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）を測定し、ＬＤＨ非存在下における測定値との差（ΔＡ５５０）を乳酸脱水素酵素濃度（［ＬＤＨ］）に対してプロットした。
【００３７】
〔発色液１の組成（ｐＨ６．０）〕
乳酸リチウム ２０ｍｇ／ｍＬ
リン酸一ナトリウム二水和物 １５ｍｇ／ｍＬ
塩化マグネシウム六水和物 ２．０ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン ５．０ｍｇ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．２０ｍｇ／ｍＬ
チアミンピロフォスフェート ０．１１ｍｇ／ｍＬ
フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム １０μｇ／ｍＬ
ＴＯＯＳ ０．２４ｍｇ／ｍＬ
酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド一リチウム ３．０ｍｇ／ｍＬ
西洋ワサビペルオキシダーゼ ５Ｕ／ｍＬ
ピルビン酸オキシダーゼ １０Ｕ／ｍＬ
【００３８】
結果を図１に示す。上記の測定条件において、５分間反応後のΔＡ５５０は乳酸脱水素酵素濃度の上昇に伴い、ミカエリスメンテン型の飽和曲線状に増大した（図１）。図１に示す測定データの近似式は次の数式１で表される（相関係数０．９９９６）。
【００３９】
【数１】
【００４０】
本測定条件において最大発色変化量の１／２を示す乳酸脱水素酵素量は０．１２Ｕ／ｍＬと求められ、本法により乳酸脱水素酵素活性を定量的に測定できることが示された。
【実施例２】
【００４１】
乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させる方法で乳酸脱水素酵素活性を測定した。ピルビン酸ナトリウム０．１１ｍｇ／ｍＬ、リン酸一ナトリウム二水和物１５ｍｇ／ｍＬおよびウシ血清アルブミン５．０ｍｇ／ｍＬを含むリン酸緩衝液（ｐＨ６．０、３７℃）８００μＬを予め３７℃に加温し、ブタ心臓由来乳酸脱水素酵素溶液（０〜０．５Ｕ／ｍＬ）を１００μＬ添加した後、下記の発色液２を１００μＬ添加して、反応を開始した。５分間反応後の５５０ｎｍにおける吸光度（Ａ５５０）を測定し、乳酸脱水素酵素濃度（［ＬＤＨ］）に対してプロットした。
【００４２】
〔発色液２の組成（ｐＨ６．０）〕
ピルビン酸ナトリウム ０．１１ｍｇ／ｍＬ
リン酸一ナトリウム二水和物 １５ｍｇ／ｍＬ
ウシ血清アルブミン ５．０ｍｇ／ｍＬ
４−アミノアンチピリン ０．２０ｍｇ／ｍＬ
フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム １０μｇ／ｍＬ
ＴＯＯＳ ０．２４ｍｇ／ｍＬ
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド ３．０ｍｇ／ｍＬ
西洋ワサビペルオキシダーゼ ５Ｕ／ｍＬ
ピルビン酸オキシダーゼ １０Ｕ／ｍＬ
【００４３】
結果を図２に示す。上記の測定条件において５分間反応後のＡ５５０は［ＬＤＨ］の増大に伴い、シグモイド曲線状に増大した。図２に示す測定データの近似式は次の数式２で表される（相関係数０．９９８４）。
【００４４】
【数２】
【００４５】
本測定条件下においては５５０ｎｍにおける吸光度の測定値（Ａ５５０）から数式２を用いて、乳酸脱水素酵素活性（［ＬＤＨ］）を算出することができる。本法によっても乳酸脱水素酵素活性を定量的に測定できることが示された。
【実施例３】
【００４６】
和光純薬工業製ＬＤＨ細胞毒性テストワコーを用いて乳酸脱水素酵素活性を測定した。本測定キットはジアホラーゼとテトラゾリウム塩を含み、乳酸脱水素酵素活性を反応系で生成するジホルマザン色素量で検出するものである。
【００４７】
緩衝液４００μＬと蒸留水４００μＬを混合して予め３７℃に加温した後、発色液１００μＬおよびブタ心臓由来乳酸脱水素酵素溶液（０〜１．０Ｕ／ｍＬ）１００μＬを添加して反応を開始した。５分間反応後の５６０ｎｍにおける吸光度（Ａ５６０）を測定し、乳酸脱水素酵素濃度（［ＬＤＨ］）に対してプロットした。
【００４８】
結果を図３に示す。上記の測定条件において５分間反応後のＡ５６０は［ＬＤＨ］の増大に伴い、シグモイド曲線状に増大した。検出シグナルの強弱や検出に要する時間等は発色液の酵素濃度、基質濃度、またｐＨ等の条件によりある程度上下することが考えられるが、請求項１および請求項２記載の乳酸脱水素酵素活性の測定法は従来法を用いる市販の測定キットを使用した場合と比較して遜色なく利用できることが示唆された。
【実施例４】
【００４９】
実施例１記載の発色液を書道用吸い取り紙（墨運堂社製、５ｍｍ×１０ｍｍ）に浸漬したのち、遮光下で凍結乾燥を行い、乳酸脱水素酵素活性検出試験紙を得た。得られた試験紙にブタ心臓由来乳酸脱水素酵素溶液（０〜５０Ｕ／ｍＬ）を２０μＬ添加して室温で５分間放置した後、１Ｎ塩酸を１０μＬ添加して反応を停止した。発色した試験紙をスキャナーで読み取り、画像処理ソフトウェア（Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（登録商標））を用いて、色調を数値化（ＲＧＢ値）した。
【００５０】
結果を図４に示す。得られた試験紙は乳酸脱水素酵素との反応により赤紫色に変色した。Ｒ値、Ｇ値、およびＢ値の最大変化量の１／２の変化に要する乳酸脱水素酵素量はそれぞれ、１．４−０．５〜１．４＋０．５、２．１−０．６〜２．１＋０．６、および１．４−０．３〜１．４＋０．３（Ｕ／ｍＬ）と求められた。本試薬濃度条件で作成された試験紙は０〜２Ｕ／ｍＬの範囲の乳酸脱水素酵素活性の半定量に適していた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、ピルビン酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させることを特徴とする乳酸脱水素酵素活性の測定方法。
【請求項２】
ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させることを特徴とする乳酸脱水素酵素活性の測定方法。
【請求項３】
検査対象が血液、唾液その他の体液、または細胞培養液である請求項１又は２記載の乳酸脱水素酵素活性の測定方法。
【請求項４】
ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、ピルビン酸オキシダーゼ補酵素、ピルビン酸オキシダーゼ活性剤、リン酸、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むことを特徴とする乳酸脱水素酵素活性測定試薬。
【請求項５】
ペルオキシダーゼ発色基質として、４−アミノアンチピリンとフェノール誘導体またはアニリン誘導体を用いる請求項４記載の乳酸脱水素酵素測定試薬。
【請求項６】
乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、乳酸脱水素酵素補酵素、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むことを特徴とする乳酸脱水素酵素測定試薬。
【請求項７】
ペルオキシダーゼ発色基質として、２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、またはｏ−フェニレンジアミン誘導体を用いる請求項６記載の乳酸脱水素酵素測定試薬。
【請求項８】
ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、ピルビン酸オキシダーゼ補酵素、ピルビン酸オキシダーゼ活性剤、リン酸、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含む乳酸脱水素酵素活性測定試薬を、吸水性基材に含浸させてなることを特徴とする乳酸脱水素酵素活性測定キット。
【請求項９】
乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、乳酸脱水素酵素補酵素、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含む乳酸脱水素酵素測定試薬を、吸水性基材に含浸させてなることを特徴とする乳酸脱水素酵素活性測定キット。
【請求項１】
乳酸と酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、ピルビン酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させることを特徴とする乳酸脱水素酵素活性の測定方法。
【請求項２】
ピルビン酸と還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを基質として乳酸脱水素酵素活性を測定するにあたり、乳酸オキシダーゼおよびペルオキシダーゼを共存させることを特徴とする乳酸脱水素酵素活性の測定方法。
【請求項３】
検査対象が血液、唾液その他の体液、または細胞培養液である請求項１又は２記載の乳酸脱水素酵素活性の測定方法。
【請求項４】
ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、ピルビン酸オキシダーゼ補酵素、ピルビン酸オキシダーゼ活性剤、リン酸、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むことを特徴とする乳酸脱水素酵素活性測定試薬。
【請求項５】
ペルオキシダーゼ発色基質として、４−アミノアンチピリンとフェノール誘導体またはアニリン誘導体を用いる請求項４記載の乳酸脱水素酵素測定試薬。
【請求項６】
乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、乳酸脱水素酵素補酵素、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含むことを特徴とする乳酸脱水素酵素測定試薬。
【請求項７】
ペルオキシダーゼ発色基質として、２、２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、ロイコ色素、ジフェニルアミン誘導体、ベンジジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、またはｏ−フェニレンジアミン誘導体を用いる請求項６記載の乳酸脱水素酵素測定試薬。
【請求項８】
ピルビン酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、ピルビン酸オキシダーゼ補酵素、ピルビン酸オキシダーゼ活性剤、リン酸、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含む乳酸脱水素酵素活性測定試薬を、吸水性基材に含浸させてなることを特徴とする乳酸脱水素酵素活性測定キット。
【請求項９】
乳酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、乳酸脱水素酵素基質、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはその塩、乳酸脱水素酵素補酵素、ペルオキシダーゼ発色基質、酵素安定化剤およびｐＨ緩衝剤を含む乳酸脱水素酵素測定試薬を、吸水性基材に含浸させてなることを特徴とする乳酸脱水素酵素活性測定キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１１−１９４６５（Ｐ２０１１−１９４６５Ａ）
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１６８４２３（Ｐ２００９−１６８４２３）
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（３９１０２９３３６）長田産業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月３日（２０１１．２．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１７日（２００９．７．１７）
【出願人】（３９１０２９３３６）長田産業株式会社 (4)
【Ｆターム（参考）】
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