乳酸菌含有免疫賦活用組成物
【課題】ＩＬ−１２産生誘導活性が高い状態で維持されるように乳酸菌死菌体を調製し、当該活性を損失することなく得られた死菌体を飲食品に添加することにより、体内においてＩＬ−１２産生を効果的に誘導できる乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法を提供する。
【解決手段】ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌を培養し、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点で直ちに菌を死滅させて得た死菌体を飲食品に添加することにより、ＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物を製造する。
【解決手段】ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌を培養し、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点で直ちに菌を死滅させて得た死菌体を飲食品に添加することにより、ＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物を製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌は、マクロファージを活性化させて、ナチュラルキラー細胞を活性化するサイトカインであるＩＬ−１２（インターロイキン１２）の産生を促進することが知られている。ラクトバチルス属に属する乳酸菌は、実質的に副作用がなく、常用に適した免疫賦活剤であり、他の免疫賦活剤との併用も有効である（特許文献１）。
ラクトバチルス属に属する乳酸菌を免疫賦活剤として含む製品が従来提案されている。たとえば、特許文献２には、ラクトバチルス属に属する菌またはその処理物と３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類とを含むＩＬ−１２産生誘導組成物が記載されている。特許文献３には、免疫賦活剤として、アスコルビン酸とラクトバチルス属に属する乳酸菌とを含有する製剤が記載されている。特許文献４には、ビタミンＥとラクトバチルス属に属する乳酸菌とを含有する免疫増強組成物が記載されている。
【０００３】
乳酸菌を医薬、食品などの製品に添加する場合、生菌より死菌体の方が扱いが容易であることから、これらの製品には通常死菌体が用いられる。しかし、乳酸菌を培養する工程のどの段階で死滅させるかによって、得られた死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性にバラつきが生じるため、常に高いＩＬ−１２産生誘導活性を維持した死菌体を調製できる方法の完成が期待されている。
【特許文献１】特開平１０−１６７９７２号公報
【特許文献２】特開平１１−２２８４２５号公報
【特許文献３】特開２００２−８０３６４号公報
【特許文献４】特開２００７−２０４４８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＩＬ−１２産生誘導活性が高い状態で維持されるように乳酸菌死菌体を調製し、当該活性を損失することなく得られた死菌体を飲食品に添加することにより、体内においてＩＬ−１２産生を効果的に誘導できる乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、下記の乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法、及び乳酸菌含有免疫賦活用組成物を提供する。
（１） ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌の死菌体を飲食品に添加することを特徴とする、ＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法。
（２） 乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する菌である前記（１）に記載の方法。
（３） 乳酸菌がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）である前記（２）に記載の方法。
（４） 死菌体が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌を培養し、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点で直ちに菌を死滅させることにより得られるものである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 菌の死滅を加熱により行う前記（４）に記載の方法。
【０００６】
（６） 飲食品が飲料である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） 飲料が、エネルギードリンク、スポーツドリンク、アイソトニックドリンク、機能性ウォーター、ボトルドウォーター、フレーバーウォーター、フレーバードリンク、ミルク非添加食事代替飲料、フレーバーミルク、ミルク飲料、ミルク添加食事代替飲料、豆乳、果実ジュース、ネクター、果汁入り飲料、野菜ジュース、牛乳、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、ウーロン茶飲料、及びブレンド茶系飲料からなる群より選ばれるものである前記（６）記載の方法。
（８） 飲食品が発酵食品である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（９） 発酵食品がヨーグルト、発酵乳、及び飲むヨーグルトからなる群より選ばれるものである前記（８）記載の製造方法。
（１０） 飲食品が半固形食品である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（１１） 半固形食品が豆腐、濃厚流動食、ゼリー飲料、ゼリー、ムース、及びプリンからなる群より選ばれるものである前記（１０）に記載の方法。
【０００７】
（１２） 飲食品が固形食品である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（１３） 固形食品がインスタント朝食用シリアル、シリアルバー、エネルギーバー、栄養バー、大豆バー、チョコレート、低脂肪スプレッド、及び豆腐ハンバーグステーキからなる群より選ばれるものである前記（１２）に記載の方法。
（１４） 飲食品が粉末食品である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（１５） 粉末食品が粉末飲料、粉末エネルギードリンク、粉末スポーツドリンク、粉末アイソトニックドリンク、粉末機能性ウォーター、粉末ボトルドウォーター、粉末フレーバーウォーター、粉末フレーバードリンク、粉末ココア、粉末麦芽飲料、粉末スープ、卓上人工甘味料、クリーミングパウダー、乳児用調製粉乳、ピザ粉、たこ焼き粉、お好み焼き粉、ホットケーキミックス、スキムミルク、粉末紅茶、粉末緑茶、粉末梅茶、粉末昆布茶、粉末ジュース、及びインスタントコーヒーからなる群より選ばれるものである前記（１４）に記載の方法。
（１６） 前記（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法により得られるＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、ＩＬ−１２産生誘導活性が高い状態で維持された乳酸菌死菌体を調製し、当該活性を損失することなく得られた死菌体を飲食品に添加した乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法を提供することができる。上記乳酸菌含有免疫賦活用組成物を日常的に摂取することにより、体内におけるＩＬ−１２産生誘導が向上し、免疫力が増強され、丈夫なカラダづくりが実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（I）乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法
本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法は、ラクトバチルス属に属する乳酸菌の死菌体を飲食品に添加することを含む方法である。
【００１０】
〔乳酸菌〕
ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ケフィア（Lactobacillus kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）などが挙げられる。これらはいずれも公知の乳酸菌であり、公知の細胞供給施設（例えばＡＴＣＣ（American Type Culture Collection））より入手可能である。中でも、ＩＬ−１２産生誘導活性の点で、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）がより好ましく、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７；独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）がさらにより好ましい。
また、本発明においては、１種類の乳酸菌を単独で用いてもよいし、複数種類の乳酸菌を任意に組み合わせてもよい。
【００１１】
上記乳酸菌は、例えば天然培地、合成培地、半合成培地などの培地を用いて培養することにより増殖させることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としてはたとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等であり、炭素源としては、たとえば、グルコース、マルトース、キシロース、フラクトース、イノシトール、水アメ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリンなどが用いられる。このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン更に各種ビタミン類その他を添加することができる。培養温度は約２５〜４０℃、好ましくは約２７〜３５℃であり、培養時間は１２〜４８時間程度であり、通気振盪してもよい。
【００１２】
〔死菌体〕
培養した乳酸菌は、培養物中で死滅させてもよいし、培養物から遠心分離などにより分離した後に死滅させてもよい。死滅方法としては、例えば加熱、紫外線の照射、ホルマリン処理などが挙げられる。中でも、ＩＬ−１２産生誘導活性が高い状態で維持されるという理由で、加熱により死滅させる方法が好ましい。乳酸菌を死滅させる場合の加熱温度としては、約６５〜１００℃が好ましく、約７０〜９０℃がより好ましく、約７５〜８５℃がさらにより好ましい。また、乳酸菌を死滅させる場合の加熱時間としては、約５〜９０分が好ましく、約１０〜６０分がより好ましく、約１５〜３０分がさらにより好ましい。上記範囲であれば、乳酸菌を死滅させることができ、かつ死菌体におけるＩＬ−１２産生誘導活性の低下が抑制できる。
乳酸菌の死菌体は、ペースト状態あるいは乾燥させた粉末状態で使用することができる。取り扱いの簡便さから、粉末状態で使用することが好ましい。分離した死菌体を、さらに摩砕、破砕、酵素分解、抽出処理すると、ＩＬ−１２産生誘導活性が低下するので、このような操作は行わない。
【００１３】
〔培養液のｐＨ〕
本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法において、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌を培養し、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点で菌を死滅させることにより得られた死菌体を用いることが好ましい。このようにして得られた死菌体は、高いＩＬ−１２産生誘導活性を維持しているからである。
「培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点」とは、一定間隔毎に測定される培養液のｐＨの低下率が鈍化した時点であって、その後培養を継続してもｐＨが実質的に変化しない時点をいう。例えば、ｐＨの低下が３時間当たり０．１未満になった時点を基準とすることができるが、これに限定されない。用いる乳酸菌、培地、培養条件等に応じて、予備試験を行い決定することが好ましい。具体例を挙げれば、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株をＧＹＰの改変培地２００ｍｌを用いて３２℃で培養する場合、培養約１８時間後に培養液のｐＨが実質的に低下しなくなる（実施例参照）。
また、「直ちに」とは、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点から約３０分以内に加熱を開始するなどにより、乳酸菌を死滅させることを意味し、乳酸菌の増殖を止めた状態（例えば低温）で保存した後に死滅させた場合は含まれない。
【００１４】
〔飲食品への添加〕
飲食品への死菌体の添加は、飲食品の製造時にその他の原料とともに混合してもよいし、飲食品製造の最後に添加してもよい。
飲食品とは、経口的に摂取されるものを意味し、飲料、発酵食品、半固形食品、固形食品、粉末食品などが挙げられる。
飲料としては、エネルギードリンク、スポーツドリンク、アイソトニックドリンク、機能性ウォーター、ボトルドウォーター、フレーバーウォーター、フレーバードリンク、ミルク非添加食事代替飲料、フレーバーミルク、ミルク飲料、ミルク添加食事代替飲料、豆乳、果実ジュース、ネクター、果汁入り飲料、野菜ジュース、牛乳、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、ウーロン茶飲料、ブレンド茶系飲料などが挙げられる。
発酵食品としては、ヨーグルト、発酵乳、飲むヨーグルトなどが挙げられる。
半固形食品としては、豆腐、濃厚流動食、ゼリー飲料、ゼリー、ムース、プリンなどが挙げられる。
固形食品としては、インスタント朝食用シリアル、シリアルバー、エネルギーバー、栄養バー、大豆バー、チョコレート、低脂肪スプレッド、豆腐ハンバーグステーキなどが挙げられる。
粉末食品としては、粉末飲料、粉末エネルギードリンク、粉末スポーツドリンク、粉末アイソトニックドリンク、粉末機能性ウォーター、粉末ボトルドウォーター、粉末フレーバーウォーター、粉末フレーバードリンク、粉末ココア、粉末麦芽飲料、粉末スープ、卓上人工甘味料、クリーミングパウダー、乳児用調製粉乳、ピザ粉、たこ焼き粉、お好み焼き粉、ホットケーキミックス、スキムミルク、粉末紅茶、粉末緑茶、粉末梅茶、粉末昆布茶、粉末ジュース、インスタントコーヒーなどが挙げられる。
【００１５】
〔死菌体の添加量〕
飲食品への死菌体の添加量は、吸収率を考慮して、成人（体重６０ｋｇ）１人当たりの１日量が、乾燥死菌体として、好ましくは約０．５〜２００ｍｇ、より好ましくは約１〜１００ｍｇ、さらにより好ましくは約２〜５０ｍｇ摂取されるように設定するのが望ましい。
【００１６】
（II）乳酸菌含有免疫賦活用組成物
本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物とは、上記方法により得られるＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物である。
本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物を哺乳動物及び鳥に投与することにより、哺乳動物及び鳥の体内でＩＬ−１２産生を誘導することができる。本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物を投与された哺乳動物及び鳥は、免疫系が賦活化され丈夫なカラダづくりが実現できる。哺乳動物はヒトでもよいし、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコなどの哺乳動物でもよい。鳥はニワトリでもよいし、ハト、スズメ、カモ、ダチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、ガチョウなどの鳥でもよい。投与経路は限定されないが、通常経口的に投与される。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を、実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
試験例１：各種乳酸菌によるＩＬ−１２産生誘導活性の比較
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地２００ｍｌにビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をそれぞれスターターとして１重量％接種し、３２℃で２４時間培養を行った。培養後、８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、それぞれの乾燥死菌体を得た。
【００１９】
このようにして調製した乾燥死菌体を用いて、各種乳酸菌乾燥死菌体のマウス脾臓細胞ＩＬ−１２産生誘導活性を検証した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、１２週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。これに各種乳酸菌乾燥死菌体を０．２μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間および4日間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００２０】
結果を表１に示す。 表から明らかなごとく、ラクトバチルス属に属する乳酸菌にＩＬ−１２産生誘導活性が認められた。その中でもラクトバチルス・プランタラムの活性が強く、特にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が強力な活性を示した。
【００２１】
【表１】
【００２２】
試験例２：ｐＨによるＩＬ−１２産生誘導活性の低下
予備試験
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地２００ｍｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で２４時間培養を行い、３、６、９、１２、１５、１８、２４時間目に培地ｐＨを測定した。
結果を表２に示す。表２から明らかなごとく、培養１８時間を経過すると培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった。
【００２３】
【表２】
【００２４】
本試験
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地２００ｍｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして４重量％接種し、３２℃で１５、１８、２１、２４時間培養を行い、各培養液のｐＨを測定した後、８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、それぞれの乾燥死菌体を得た。
【００２５】
このようにして調製した乾燥死菌体を用いて、乳酸菌乾燥死菌体を調製するときの培養条件がマウス脾臓細胞ＩＬ−１２産生誘導活性に及ぼす影響を検証した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、２９週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。これに培養時間が異なるラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を１μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２３時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００２６】
結果を表３に示す。表３から明らかなごとく、培養１８時間以降は、培養を継続すると、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性が低下し、ｐＨ４．０での培養停止に比べてｐＨ３．８での培養停止により得られた乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性は２６％低下した。したがって、乳酸菌加熱死菌体を調製するときの培養は、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった段階で停止することが必要であることが明らかとなった。
【００２７】
【表３】
【００２８】
試験例３：乳酸菌培養後の放置によるＩＬ−１２産生誘導活性の低下
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で１８時間培養を行い、直ちに８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を得た。
【００２９】
同様に乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で１８時間培養を行い、１８℃で７時間３０分放置し、８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７培養後放置加熱乾燥死菌体を得た。
【００３０】
このようにして調製した乾燥死菌体を用いて、乳酸菌乾燥死菌体を調製するときの加熱処理条件がマウス脾臓細胞ＩＬ−１２産生誘導活性に及ぼす影響を検証した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、１２週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。これに培養時間が異なるラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を１μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００３１】
結果を表４に示す。表４から明らかなごとく、培養後に培養液を低温で放置し加熱処理すると、得られた乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性が低下した。培養直後の加熱処理に比べて培養後放置後の加熱処理で得られた乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性は３７％低下した。したがって、乳酸菌加熱死菌体を調製するときの加熱処理は、培養停止直後に行うことが必要であることが明らかとなった。また、乳酸菌を生菌の状態で製品化する場合、製造工程や保存期間中に本試験で認められたＩＬ−１２産生誘導活性の低下が起こると推測されるので、乳酸菌含有免疫賦活用組成物を提供する場合、死菌体の状態で配合するのが望ましいことが示された。
【００３２】
【表４】
【００３３】
試験例４：ＩＬ−１２産生誘導活性の耐熱性試験
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で１８時間培養を行い、直ちに８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を得た。
【００３４】
このようにして調製した乳酸菌乾燥死菌体を４０重量％の濃度で蒸留水に分散させ、高圧蒸気滅菌器を用いて、１２１℃で１０、２０、４０分間処理した。同様に、蒸留水に４０重量％の濃度で分散させた乳酸菌乾燥死菌体を、１００℃で１０、２０、４０分間処理した。
【００３５】
水に分散させて加熱処理した乳酸菌死菌体を用いて、乳酸菌乾燥死菌体のマウス腹腔細胞ＩＬ−１２産生誘導活性の熱安定性を検証した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１６週齡）から腹腔細胞を調製し、細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を１．０×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。加熱処理を施したラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を乾燥死菌体に換算して０．２μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００３６】
結果を表５に示す。表５から明らかなごとく、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性は、水溶液中での１２１℃の加熱処理により著しく低下した。しかしながら、水溶液中での１００℃の加熱処理では、その活性はほとんど低下しなかった。したがって、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体は、レトルト食品のような約１１０〜１３０℃、約３０〜６０分間の高圧蒸気滅菌工程を経る製品へ添加しても免疫賦活効果は期待できないことが示された。一方で、通常の飲料を製造するときの加熱殺菌条件、例えば牛乳の場合の６３℃で３０分間、７５℃で１５秒間、１２０℃で３秒間、あるいはｐＨ４以上の清涼飲料水の場合の８５℃で３０分間では、ＩＬ−１２産生誘導活性は保持されるので、乳酸菌含有免疫賦活用組成物を提供する場合、飲料への配合は適していることが示された。
【００３７】
【表５】
【００３８】
〔実施例〕
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして４重量％接種し、３２℃で２４時間培養を行った後、８０℃達温により殺菌した。その後、精密濾過膜を用いて加熱死菌体を水洗した後、洗浄液に加熱死菌体の４倍量のデキストリンを添加し、噴霧乾燥によりラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を得た。得られた死菌体粉末は、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体を２０重量パーセント含有している。当該粉末を用いて以下の食品を調製した。
【００３９】
（１）アイソトニックドリンク
表６に示す各成分を測りとり、指定量の水を加え、十分に溶解および分散させた後、９８℃で３０秒間殺菌し、死菌体粉末含有アイソトニックドリンク原液および対照アイソトニックドリンク原液を得た。調製後直ちに、１００ｍｌ透明瓶に各原液１００ｍｌを注入し、ポリプロピレンキャップで密栓し、死菌体粉末含有アイソトニックドリンクおよび対照アイソトニックドリンクを調製した。このようにして調製した各アイソトニックドリンクを４℃および４０℃で２週間保存し、配合した死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性を調べた。
【００４０】
【表６】
【００４１】
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、７週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。
これに、４℃で２週間保存した死菌体粉末含有アイソトニックドリンクをＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末として５００ｎｇ／ｍｌ）、４０℃で２週間保存した死菌体粉末含有アイソトニックドリンクをＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液、４℃で２週間保存した対照アイソトニックドリンクをＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を５００ｎｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液、またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００４２】
結果を表７に示す。表７から明らかなごとく、アイソトニックドリンク調製後もラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性は維持されており、４０℃で品質低下が加速される保存条件下においても、ＩＬ−１２産生誘導活性の低下は軽度だった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末は、通常の殺菌条件で製造され常温流通されるアイソトニックドリンクに、その活性を損なうことなく配合できることが示された。
【００４３】
【表７】
【００４４】
（２）果汁入り飲料
表８に示す各成分を測りとり、指定量の水を加え、十分に溶解および分散させた後、９８℃で３０秒間殺菌し、死菌体粉末含有果汁入り飲料原液および対照果汁入り飲料原液を得た。調製後直ちに、１００ｍｌ透明瓶に各原液１００ｍｌを注入し、ポリプロピレンキャップで密栓し、死菌体粉末含有果汁入り飲料および対照果汁入り飲料を調製した。このようにして調製した各果汁入り飲料を４℃および４０℃で２週間保存し、配合した死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性を調べた。
【００４５】
【表８】
【００４６】
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、７週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。
これに、４℃で２週間保存した死菌体粉末含有果汁入り飲料をＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末として５００ｎｇ／ｍｌ）、４０℃で２週間保存した死菌体粉末含有果汁入り飲料をＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液、４℃で２週間保存した対照果汁入り飲料をＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を５００ｎｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液、またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００４７】
結果を表９に示す。表９から明らかなごとく、調製後４℃で保存した果汁入り飲料においてラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性は維持されていた。一方、４０℃で品質低下が加速される保存条件下においては、ＩＬ−１２産生誘導活性の低下が大きかった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末は、通常の殺菌条件で製造されチルド流通される果汁入り飲料に、その活性を損なうことなく配合できることが示された。
【００４８】
【表９】
【００４９】
（３）豆腐
表１０に示す量の大豆加工品および死菌体粉末を指定量の水に入れて十分分散させた後、弱火で４分間沸騰させた。加熱を止め、凝固剤を添加して１０秒間強くかき混ぜ、直ちに、口栓付きアルミ蒸着袋に１００ｍｌを注入して密栓し、７５℃で５分間殺菌した後放冷して、死菌体粉末含有豆腐および対照豆腐を調製した。このようにして調製した各豆腐のＩＬ−１２産生誘導活性を調べた。
【００５０】
【表１０】
【００５１】
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、２０週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。
これに、死菌体粉末含有豆腐をＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて１０００倍に希釈した液（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末として５００ｎｇ／ｍｌ）を１００μＬ、対照豆腐をＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて１０００倍に希釈した液を１００μＬ、対照豆腐をＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて５００倍に希釈した液を５０μＬとラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を１０００ｎｇ／ｍＬの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液を５０μＬとの混合液を１００μＬ、またはＲＰＭＩ１６４０培地を１００μＬ、それぞれを１穴あたりに加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００５２】
結果を表１１に示す。表１１から明らかなごとく、死菌体粉末を豆腐調製時に添加したときと、測定直前に添加したときのＩＬ−１２産生誘導活性に大差なかった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末は、通常の工程で製造される豆腐に、その活性を損なうことなく配合できることが示された。
【表１１】
【００５３】
（４）チョコレート
表１２に示す量のチョコレートを粉砕し、指定量の死菌体粉末およびデキストリンを加え分散させ、３０℃で１０分間混練した。チョコレート型に入れ放冷し、死菌体粉末含有チョコレートおよび対照チョコレートを調製した。このようにして調製した各チョコレートのＩＬ−１２産生誘導活性を調べた。
【００５４】
【表１２】
【００５５】
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、７週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。
これに、死菌体粉末含有チョコレートを融かし、ＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて２０００倍に希釈した液（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末として５００ｎｇ／ｍｌ）を１００μＬ、対照チョコレートをＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて２０００倍に希釈した液を１００μＬ、対照チョコレートを融かし、ＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて１０００倍に希釈した液を５０μＬとラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を１０００ｎｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液を５０μＬとの混合液を１００μＬ、またはＲＰＭＩ１６４０培地を１００μＬ、それぞれを１穴あたりに加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００５６】
結果を表１３に示す。表１３から明らかなごとく、死菌体粉末をチョコレート調製時に添加したときと、測定直前に添加したときのＩＬ−１２産生誘導活性に差はなかった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末は、通常の工程で製造されるチョコレートに、その活性を損なうことなく配合できることが示された。
【００５７】
【表１３】
【００５８】
以上のように、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を添加したアイソトニックドリンク、果汁入り飲料、豆腐およびチョコレートは、いずれも死菌体粉末を添加しない対照と比較して、高いＩＬ−１２産生誘導活性を有することが示された。実施例では、比較的品質の維持が困難な高含水食品及び高脂肪食品を調製及び／又は保存したときにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性が維持されることを示しており、そうすれば、比較的品質の維持が容易な乾燥食品を調製及び保存するときのラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性は当然維持されることは自明である。すなわち、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を飲料、発酵食品、半固形食品、固形食品、粉末食品に添加すると、体内においてＩＬ−１２産生を効果的に誘導できる。したがって、このような飲食品を日常的に摂取することで、丈夫なカラダづくりが実現できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌は、マクロファージを活性化させて、ナチュラルキラー細胞を活性化するサイトカインであるＩＬ−１２（インターロイキン１２）の産生を促進することが知られている。ラクトバチルス属に属する乳酸菌は、実質的に副作用がなく、常用に適した免疫賦活剤であり、他の免疫賦活剤との併用も有効である（特許文献１）。
ラクトバチルス属に属する乳酸菌を免疫賦活剤として含む製品が従来提案されている。たとえば、特許文献２には、ラクトバチルス属に属する菌またはその処理物と３−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラシル−Ｄ−グルコースを構成単位として含有する糖類とを含むＩＬ−１２産生誘導組成物が記載されている。特許文献３には、免疫賦活剤として、アスコルビン酸とラクトバチルス属に属する乳酸菌とを含有する製剤が記載されている。特許文献４には、ビタミンＥとラクトバチルス属に属する乳酸菌とを含有する免疫増強組成物が記載されている。
【０００３】
乳酸菌を医薬、食品などの製品に添加する場合、生菌より死菌体の方が扱いが容易であることから、これらの製品には通常死菌体が用いられる。しかし、乳酸菌を培養する工程のどの段階で死滅させるかによって、得られた死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性にバラつきが生じるため、常に高いＩＬ−１２産生誘導活性を維持した死菌体を調製できる方法の完成が期待されている。
【特許文献１】特開平１０−１６７９７２号公報
【特許文献２】特開平１１−２２８４２５号公報
【特許文献３】特開２００２−８０３６４号公報
【特許文献４】特開２００７−２０４４８８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、ＩＬ−１２産生誘導活性が高い状態で維持されるように乳酸菌死菌体を調製し、当該活性を損失することなく得られた死菌体を飲食品に添加することにより、体内においてＩＬ−１２産生を効果的に誘導できる乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、下記の乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法、及び乳酸菌含有免疫賦活用組成物を提供する。
（１） ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌の死菌体を飲食品に添加することを特徴とする、ＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法。
（２） 乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する菌である前記（１）に記載の方法。
（３） 乳酸菌がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）である前記（２）に記載の方法。
（４） 死菌体が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌を培養し、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点で直ちに菌を死滅させることにより得られるものである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５） 菌の死滅を加熱により行う前記（４）に記載の方法。
【０００６】
（６） 飲食品が飲料である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７） 飲料が、エネルギードリンク、スポーツドリンク、アイソトニックドリンク、機能性ウォーター、ボトルドウォーター、フレーバーウォーター、フレーバードリンク、ミルク非添加食事代替飲料、フレーバーミルク、ミルク飲料、ミルク添加食事代替飲料、豆乳、果実ジュース、ネクター、果汁入り飲料、野菜ジュース、牛乳、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、ウーロン茶飲料、及びブレンド茶系飲料からなる群より選ばれるものである前記（６）記載の方法。
（８） 飲食品が発酵食品である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（９） 発酵食品がヨーグルト、発酵乳、及び飲むヨーグルトからなる群より選ばれるものである前記（８）記載の製造方法。
（１０） 飲食品が半固形食品である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（１１） 半固形食品が豆腐、濃厚流動食、ゼリー飲料、ゼリー、ムース、及びプリンからなる群より選ばれるものである前記（１０）に記載の方法。
【０００７】
（１２） 飲食品が固形食品である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（１３） 固形食品がインスタント朝食用シリアル、シリアルバー、エネルギーバー、栄養バー、大豆バー、チョコレート、低脂肪スプレッド、及び豆腐ハンバーグステーキからなる群より選ばれるものである前記（１２）に記載の方法。
（１４） 飲食品が粉末食品である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（１５） 粉末食品が粉末飲料、粉末エネルギードリンク、粉末スポーツドリンク、粉末アイソトニックドリンク、粉末機能性ウォーター、粉末ボトルドウォーター、粉末フレーバーウォーター、粉末フレーバードリンク、粉末ココア、粉末麦芽飲料、粉末スープ、卓上人工甘味料、クリーミングパウダー、乳児用調製粉乳、ピザ粉、たこ焼き粉、お好み焼き粉、ホットケーキミックス、スキムミルク、粉末紅茶、粉末緑茶、粉末梅茶、粉末昆布茶、粉末ジュース、及びインスタントコーヒーからなる群より選ばれるものである前記（１４）に記載の方法。
（１６） 前記（１）〜（１５）のいずれかに記載の方法により得られるＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の方法により、ＩＬ−１２産生誘導活性が高い状態で維持された乳酸菌死菌体を調製し、当該活性を損失することなく得られた死菌体を飲食品に添加した乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法を提供することができる。上記乳酸菌含有免疫賦活用組成物を日常的に摂取することにより、体内におけるＩＬ−１２産生誘導が向上し、免疫力が増強され、丈夫なカラダづくりが実現できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。
（I）乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法
本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法は、ラクトバチルス属に属する乳酸菌の死菌体を飲食品に添加することを含む方法である。
【００１０】
〔乳酸菌〕
ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ブフネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ケフィア（Lactobacillus kefir）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）などが挙げられる。これらはいずれも公知の乳酸菌であり、公知の細胞供給施設（例えばＡＴＣＣ（American Type Culture Collection））より入手可能である。中でも、ＩＬ−１２産生誘導活性の点で、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）がより好ましく、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）（ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６０７；独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）がさらにより好ましい。
また、本発明においては、１種類の乳酸菌を単独で用いてもよいし、複数種類の乳酸菌を任意に組み合わせてもよい。
【００１１】
上記乳酸菌は、例えば天然培地、合成培地、半合成培地などの培地を用いて培養することにより増殖させることができる。培地としては、窒素源および炭素源を含有するものが用いられる。窒素源としてはたとえば、肉エキス、ペプトン、グルテン、カゼイン、酵母エキス、アミノ酸等であり、炭素源としては、たとえば、グルコース、マルトース、キシロース、フラクトース、イノシトール、水アメ、麹汁、澱粉、バカス、フスマ、糖蜜、グリセリンなどが用いられる。このほか、無機質として、たとえば硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、塩化マグネシウム、食塩、鉄、マンガン、モリブデン更に各種ビタミン類その他を添加することができる。培養温度は約２５〜４０℃、好ましくは約２７〜３５℃であり、培養時間は１２〜４８時間程度であり、通気振盪してもよい。
【００１２】
〔死菌体〕
培養した乳酸菌は、培養物中で死滅させてもよいし、培養物から遠心分離などにより分離した後に死滅させてもよい。死滅方法としては、例えば加熱、紫外線の照射、ホルマリン処理などが挙げられる。中でも、ＩＬ−１２産生誘導活性が高い状態で維持されるという理由で、加熱により死滅させる方法が好ましい。乳酸菌を死滅させる場合の加熱温度としては、約６５〜１００℃が好ましく、約７０〜９０℃がより好ましく、約７５〜８５℃がさらにより好ましい。また、乳酸菌を死滅させる場合の加熱時間としては、約５〜９０分が好ましく、約１０〜６０分がより好ましく、約１５〜３０分がさらにより好ましい。上記範囲であれば、乳酸菌を死滅させることができ、かつ死菌体におけるＩＬ−１２産生誘導活性の低下が抑制できる。
乳酸菌の死菌体は、ペースト状態あるいは乾燥させた粉末状態で使用することができる。取り扱いの簡便さから、粉末状態で使用することが好ましい。分離した死菌体を、さらに摩砕、破砕、酵素分解、抽出処理すると、ＩＬ−１２産生誘導活性が低下するので、このような操作は行わない。
【００１３】
〔培養液のｐＨ〕
本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法において、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌を培養し、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点で菌を死滅させることにより得られた死菌体を用いることが好ましい。このようにして得られた死菌体は、高いＩＬ−１２産生誘導活性を維持しているからである。
「培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点」とは、一定間隔毎に測定される培養液のｐＨの低下率が鈍化した時点であって、その後培養を継続してもｐＨが実質的に変化しない時点をいう。例えば、ｐＨの低下が３時間当たり０．１未満になった時点を基準とすることができるが、これに限定されない。用いる乳酸菌、培地、培養条件等に応じて、予備試験を行い決定することが好ましい。具体例を挙げれば、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株をＧＹＰの改変培地２００ｍｌを用いて３２℃で培養する場合、培養約１８時間後に培養液のｐＨが実質的に低下しなくなる（実施例参照）。
また、「直ちに」とは、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点から約３０分以内に加熱を開始するなどにより、乳酸菌を死滅させることを意味し、乳酸菌の増殖を止めた状態（例えば低温）で保存した後に死滅させた場合は含まれない。
【００１４】
〔飲食品への添加〕
飲食品への死菌体の添加は、飲食品の製造時にその他の原料とともに混合してもよいし、飲食品製造の最後に添加してもよい。
飲食品とは、経口的に摂取されるものを意味し、飲料、発酵食品、半固形食品、固形食品、粉末食品などが挙げられる。
飲料としては、エネルギードリンク、スポーツドリンク、アイソトニックドリンク、機能性ウォーター、ボトルドウォーター、フレーバーウォーター、フレーバードリンク、ミルク非添加食事代替飲料、フレーバーミルク、ミルク飲料、ミルク添加食事代替飲料、豆乳、果実ジュース、ネクター、果汁入り飲料、野菜ジュース、牛乳、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、ウーロン茶飲料、ブレンド茶系飲料などが挙げられる。
発酵食品としては、ヨーグルト、発酵乳、飲むヨーグルトなどが挙げられる。
半固形食品としては、豆腐、濃厚流動食、ゼリー飲料、ゼリー、ムース、プリンなどが挙げられる。
固形食品としては、インスタント朝食用シリアル、シリアルバー、エネルギーバー、栄養バー、大豆バー、チョコレート、低脂肪スプレッド、豆腐ハンバーグステーキなどが挙げられる。
粉末食品としては、粉末飲料、粉末エネルギードリンク、粉末スポーツドリンク、粉末アイソトニックドリンク、粉末機能性ウォーター、粉末ボトルドウォーター、粉末フレーバーウォーター、粉末フレーバードリンク、粉末ココア、粉末麦芽飲料、粉末スープ、卓上人工甘味料、クリーミングパウダー、乳児用調製粉乳、ピザ粉、たこ焼き粉、お好み焼き粉、ホットケーキミックス、スキムミルク、粉末紅茶、粉末緑茶、粉末梅茶、粉末昆布茶、粉末ジュース、インスタントコーヒーなどが挙げられる。
【００１５】
〔死菌体の添加量〕
飲食品への死菌体の添加量は、吸収率を考慮して、成人（体重６０ｋｇ）１人当たりの１日量が、乾燥死菌体として、好ましくは約０．５〜２００ｍｇ、より好ましくは約１〜１００ｍｇ、さらにより好ましくは約２〜５０ｍｇ摂取されるように設定するのが望ましい。
【００１６】
（II）乳酸菌含有免疫賦活用組成物
本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物とは、上記方法により得られるＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物である。
本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物を哺乳動物及び鳥に投与することにより、哺乳動物及び鳥の体内でＩＬ−１２産生を誘導することができる。本発明の乳酸菌含有免疫賦活用組成物を投与された哺乳動物及び鳥は、免疫系が賦活化され丈夫なカラダづくりが実現できる。哺乳動物はヒトでもよいし、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコなどの哺乳動物でもよい。鳥はニワトリでもよいし、ハト、スズメ、カモ、ダチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、ガチョウなどの鳥でもよい。投与経路は限定されないが、通常経口的に投与される。
【実施例】
【００１７】
以下、本発明を、実施例を挙げてより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１８】
試験例１：各種乳酸菌によるＩＬ−１２産生誘導活性の比較
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地２００ｍｌにビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタラムＪＣＭ１１４９、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をそれぞれスターターとして１重量％接種し、３２℃で２４時間培養を行った。培養後、８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、それぞれの乾燥死菌体を得た。
【００１９】
このようにして調製した乾燥死菌体を用いて、各種乳酸菌乾燥死菌体のマウス脾臓細胞ＩＬ−１２産生誘導活性を検証した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、１２週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。これに各種乳酸菌乾燥死菌体を０．２μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間および4日間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００２０】
結果を表１に示す。 表から明らかなごとく、ラクトバチルス属に属する乳酸菌にＩＬ−１２産生誘導活性が認められた。その中でもラクトバチルス・プランタラムの活性が強く、特にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７が強力な活性を示した。
【００２１】
【表１】
【００２２】
試験例２：ｐＨによるＩＬ−１２産生誘導活性の低下
予備試験
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地２００ｍｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で２４時間培養を行い、３、６、９、１２、１５、１８、２４時間目に培地ｐＨを測定した。
結果を表２に示す。表２から明らかなごとく、培養１８時間を経過すると培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった。
【００２３】
【表２】
【００２４】
本試験
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地２００ｍｌにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして４重量％接種し、３２℃で１５、１８、２１、２４時間培養を行い、各培養液のｐＨを測定した後、８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、それぞれの乾燥死菌体を得た。
【００２５】
このようにして調製した乾燥死菌体を用いて、乳酸菌乾燥死菌体を調製するときの培養条件がマウス脾臓細胞ＩＬ−１２産生誘導活性に及ぼす影響を検証した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、２９週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。これに培養時間が異なるラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を１μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２３時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００２６】
結果を表３に示す。表３から明らかなごとく、培養１８時間以降は、培養を継続すると、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性が低下し、ｐＨ４．０での培養停止に比べてｐＨ３．８での培養停止により得られた乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性は２６％低下した。したがって、乳酸菌加熱死菌体を調製するときの培養は、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった段階で停止することが必要であることが明らかとなった。
【００２７】
【表３】
【００２８】
試験例３：乳酸菌培養後の放置によるＩＬ−１２産生誘導活性の低下
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で１８時間培養を行い、直ちに８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を得た。
【００２９】
同様に乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で１８時間培養を行い、１８℃で７時間３０分放置し、８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７培養後放置加熱乾燥死菌体を得た。
【００３０】
このようにして調製した乾燥死菌体を用いて、乳酸菌乾燥死菌体を調製するときの加熱処理条件がマウス脾臓細胞ＩＬ−１２産生誘導活性に及ぼす影響を検証した。マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、１２週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。これに培養時間が異なるラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を１μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００３１】
結果を表４に示す。表４から明らかなごとく、培養後に培養液を低温で放置し加熱処理すると、得られた乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性が低下した。培養直後の加熱処理に比べて培養後放置後の加熱処理で得られた乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性は３７％低下した。したがって、乳酸菌加熱死菌体を調製するときの加熱処理は、培養停止直後に行うことが必要であることが明らかとなった。また、乳酸菌を生菌の状態で製品化する場合、製造工程や保存期間中に本試験で認められたＩＬ−１２産生誘導活性の低下が起こると推測されるので、乳酸菌含有免疫賦活用組成物を提供する場合、死菌体の状態で配合するのが望ましいことが示された。
【００３２】
【表４】
【００３３】
試験例４：ＩＬ−１２産生誘導活性の耐熱性試験
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして１重量％接種し、３２℃で１８時間培養を行い、直ちに８０℃で２０分間殺菌し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そして、上清を除き、菌体を集めた。さらに、集めた菌体ペーストを生理食塩水に良く分散し、３０００ｒｐｍで２０分間遠心分離したのち、上清を除き、菌体を集めた。これを３回繰り返したのち、蒸留水に分散し、凍結乾燥し、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体を得た。
【００３４】
このようにして調製した乳酸菌乾燥死菌体を４０重量％の濃度で蒸留水に分散させ、高圧蒸気滅菌器を用いて、１２１℃で１０、２０、４０分間処理した。同様に、蒸留水に４０重量％の濃度で分散させた乳酸菌乾燥死菌体を、１００℃で１０、２０、４０分間処理した。
【００３５】
水に分散させて加熱処理した乳酸菌死菌体を用いて、乳酸菌乾燥死菌体のマウス腹腔細胞ＩＬ−１２産生誘導活性の熱安定性を検証した。マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、雌、１６週齡）から腹腔細胞を調製し、細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を１．０×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。加熱処理を施したラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７を乾燥死菌体に換算して０．２μｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００３６】
結果を表５に示す。表５から明らかなごとく、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体のＩＬ−１２産生誘導活性は、水溶液中での１２１℃の加熱処理により著しく低下した。しかしながら、水溶液中での１００℃の加熱処理では、その活性はほとんど低下しなかった。したがって、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７乾燥死菌体は、レトルト食品のような約１１０〜１３０℃、約３０〜６０分間の高圧蒸気滅菌工程を経る製品へ添加しても免疫賦活効果は期待できないことが示された。一方で、通常の飲料を製造するときの加熱殺菌条件、例えば牛乳の場合の６３℃で３０分間、７５℃で１５秒間、１２０℃で３秒間、あるいはｐＨ４以上の清涼飲料水の場合の８５℃で３０分間では、ＩＬ−１２産生誘導活性は保持されるので、乳酸菌含有免疫賦活用組成物を提供する場合、飲料への配合は適していることが示された。
【００３７】
【表５】
【００３８】
〔実施例〕
乳酸菌培養培地であるＧＹＰの改変培地にラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７をスターターとして４重量％接種し、３２℃で２４時間培養を行った後、８０℃達温により殺菌した。その後、精密濾過膜を用いて加熱死菌体を水洗した後、洗浄液に加熱死菌体の４倍量のデキストリンを添加し、噴霧乾燥によりラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を得た。得られた死菌体粉末は、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体を２０重量パーセント含有している。当該粉末を用いて以下の食品を調製した。
【００３９】
（１）アイソトニックドリンク
表６に示す各成分を測りとり、指定量の水を加え、十分に溶解および分散させた後、９８℃で３０秒間殺菌し、死菌体粉末含有アイソトニックドリンク原液および対照アイソトニックドリンク原液を得た。調製後直ちに、１００ｍｌ透明瓶に各原液１００ｍｌを注入し、ポリプロピレンキャップで密栓し、死菌体粉末含有アイソトニックドリンクおよび対照アイソトニックドリンクを調製した。このようにして調製した各アイソトニックドリンクを４℃および４０℃で２週間保存し、配合した死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性を調べた。
【００４０】
【表６】
【００４１】
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、７週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。
これに、４℃で２週間保存した死菌体粉末含有アイソトニックドリンクをＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末として５００ｎｇ／ｍｌ）、４０℃で２週間保存した死菌体粉末含有アイソトニックドリンクをＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液、４℃で２週間保存した対照アイソトニックドリンクをＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を５００ｎｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液、またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００４２】
結果を表７に示す。表７から明らかなごとく、アイソトニックドリンク調製後もラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性は維持されており、４０℃で品質低下が加速される保存条件下においても、ＩＬ−１２産生誘導活性の低下は軽度だった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末は、通常の殺菌条件で製造され常温流通されるアイソトニックドリンクに、その活性を損なうことなく配合できることが示された。
【００４３】
【表７】
【００４４】
（２）果汁入り飲料
表８に示す各成分を測りとり、指定量の水を加え、十分に溶解および分散させた後、９８℃で３０秒間殺菌し、死菌体粉末含有果汁入り飲料原液および対照果汁入り飲料原液を得た。調製後直ちに、１００ｍｌ透明瓶に各原液１００ｍｌを注入し、ポリプロピレンキャップで密栓し、死菌体粉末含有果汁入り飲料および対照果汁入り飲料を調製した。このようにして調製した各果汁入り飲料を４℃および４０℃で２週間保存し、配合した死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性を調べた。
【００４５】
【表８】
【００４６】
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、７週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。
これに、４℃で２週間保存した死菌体粉末含有果汁入り飲料をＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末として５００ｎｇ／ｍｌ）、４０℃で２週間保存した死菌体粉末含有果汁入り飲料をＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液、４℃で２週間保存した対照果汁入り飲料をＲＰＭＩ１６４０培地で１０００倍に希釈した液、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を５００ｎｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液、またはＲＰＭＩ１６４０培地を、それぞれ１穴あたり１００μＬ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００４７】
結果を表９に示す。表９から明らかなごとく、調製後４℃で保存した果汁入り飲料においてラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性は維持されていた。一方、４０℃で品質低下が加速される保存条件下においては、ＩＬ−１２産生誘導活性の低下が大きかった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末は、通常の殺菌条件で製造されチルド流通される果汁入り飲料に、その活性を損なうことなく配合できることが示された。
【００４８】
【表９】
【００４９】
（３）豆腐
表１０に示す量の大豆加工品および死菌体粉末を指定量の水に入れて十分分散させた後、弱火で４分間沸騰させた。加熱を止め、凝固剤を添加して１０秒間強くかき混ぜ、直ちに、口栓付きアルミ蒸着袋に１００ｍｌを注入して密栓し、７５℃で５分間殺菌した後放冷して、死菌体粉末含有豆腐および対照豆腐を調製した。このようにして調製した各豆腐のＩＬ−１２産生誘導活性を調べた。
【００５０】
【表１０】
【００５１】
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、２０週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。
これに、死菌体粉末含有豆腐をＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて１０００倍に希釈した液（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末として５００ｎｇ／ｍｌ）を１００μＬ、対照豆腐をＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて１０００倍に希釈した液を１００μＬ、対照豆腐をＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて５００倍に希釈した液を５０μＬとラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を１０００ｎｇ／ｍＬの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液を５０μＬとの混合液を１００μＬ、またはＲＰＭＩ１６４０培地を１００μＬ、それぞれを１穴あたりに加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００５２】
結果を表１１に示す。表１１から明らかなごとく、死菌体粉末を豆腐調製時に添加したときと、測定直前に添加したときのＩＬ−１２産生誘導活性に大差なかった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末は、通常の工程で製造される豆腐に、その活性を損なうことなく配合できることが示された。
【表１１】
【００５３】
（４）チョコレート
表１２に示す量のチョコレートを粉砕し、指定量の死菌体粉末およびデキストリンを加え分散させ、３０℃で１０分間混練した。チョコレート型に入れ放冷し、死菌体粉末含有チョコレートおよび対照チョコレートを調製した。このようにして調製した各チョコレートのＩＬ−１２産生誘導活性を調べた。
【００５４】
【表１２】
【００５５】
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌、７週齡）から脾臓を摘出し、ＲＰＭＩ１６４０培地中で押し潰し、♯２００メッシュに通し脾臓細胞浮遊液を得た。脾臓細胞浮遊液の細胞数を自動血球計測装置で測定した後、細胞数を５×１０6／ｍｌの濃度にＲＰＭＩ１６４０培地で調製し、９６穴組織培養プレートに１穴あたり１００μＬを播種した。
これに、死菌体粉末含有チョコレートを融かし、ＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて２０００倍に希釈した液（ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末として５００ｎｇ／ｍｌ）を１００μＬ、対照チョコレートをＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて２０００倍に希釈した液を１００μＬ、対照チョコレートを融かし、ＲＰＭＩ１６４０培地で十分に分散させて１０００倍に希釈した液を５０μＬとラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を１０００ｎｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ１６４０培地に分散させた液を５０μＬとの混合液を１００μＬ、またはＲＰＭＩ１６４０培地を１００μＬ、それぞれを１穴あたりに加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器内で２４時間培養した。培養後の培養上清のＩＬ−１２濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。
【００５６】
結果を表１３に示す。表１３から明らかなごとく、死菌体粉末をチョコレート調製時に添加したときと、測定直前に添加したときのＩＬ−１２産生誘導活性に差はなかった。このことから、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末は、通常の工程で製造されるチョコレートに、その活性を損なうことなく配合できることが示された。
【００５７】
【表１３】
【００５８】
以上のように、ラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末を添加したアイソトニックドリンク、果汁入り飲料、豆腐およびチョコレートは、いずれも死菌体粉末を添加しない対照と比較して、高いＩＬ−１２産生誘導活性を有することが示された。実施例では、比較的品質の維持が困難な高含水食品及び高脂肪食品を調製及び／又は保存したときにラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性が維持されることを示しており、そうすれば、比較的品質の維持が容易な乾燥食品を調製及び保存するときのラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７死菌体粉末のＩＬ−１２産生誘導活性は当然維持されることは自明である。すなわち、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を飲料、発酵食品、半固形食品、固形食品、粉末食品に添加すると、体内においてＩＬ−１２産生を効果的に誘導できる。したがって、このような飲食品を日常的に摂取することで、丈夫なカラダづくりが実現できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌の死菌体を飲食品に添加することを特徴とする、ＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法。
【請求項２】
乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する菌である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
乳酸菌がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
死菌体が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌を培養し、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点で直ちに菌を死滅させることにより得られるものである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
菌の死滅を加熱により行う請求項４に記載の方法。
【請求項６】
飲食品が飲料である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
飲料が、エネルギードリンク、スポーツドリンク、アイソトニックドリンク、機能性ウォーター、ボトルドウォーター、フレーバーウォーター、フレーバードリンク、ミルク非添加食事代替飲料、フレーバーミルク、ミルク飲料、ミルク添加食事代替飲料、豆乳、果実ジュース、ネクター、果汁入り飲料、野菜ジュース、牛乳、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、ウーロン茶飲料、及びブレンド茶系飲料からなる群より選ばれるものである請求項６記載の方法。
【請求項８】
飲食品が発酵食品である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
発酵食品がヨーグルト、発酵乳、及び飲むヨーグルトからなる群より選ばれるものである請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
飲食品が半固形食品である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
半固形食品が豆腐、濃厚流動食、ゼリー飲料、ゼリー、ムース、及びプリンからなる群より選ばれるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
飲食品が固形食品である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
固形食品がインスタント朝食用シリアル、シリアルバー、エネルギーバー、栄養バー、大豆バー、チョコレート、低脂肪スプレッド、及び豆腐ハンバーグステーキからなる群より選ばれるものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
飲食品が粉末食品である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
粉末食品が粉末飲料、粉末エネルギードリンク、粉末スポーツドリンク、粉末アイソトニックドリンク、粉末機能性ウォーター、粉末ボトルドウォーター、粉末フレーバーウォーター、粉末フレーバードリンク、粉末ココア、粉末麦芽飲料、粉末スープ、卓上人工甘味料、クリーミングパウダー、乳児用調製粉乳、ピザ粉、たこ焼き粉、お好み焼き粉、ホットケーキミックス、スキムミルク、粉末紅茶、粉末緑茶、粉末梅茶、粉末昆布茶、粉末ジュース、及びインスタントコーヒーからなる群より選ばれるものである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られるＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物。
【請求項１】
ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌の死菌体を飲食品に添加することを特徴とする、ＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物の製造方法。
【請求項２】
乳酸菌がラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）に属する菌である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
乳酸菌がラクトバチルス・プランタラムＬ−１３７株（Lactobacillus plantarum L-137）である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
死菌体が、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌を培養し、培養液のｐＨが実質的に低下しなくなった時点で直ちに菌を死滅させることにより得られるものである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
菌の死滅を加熱により行う請求項４に記載の方法。
【請求項６】
飲食品が飲料である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
飲料が、エネルギードリンク、スポーツドリンク、アイソトニックドリンク、機能性ウォーター、ボトルドウォーター、フレーバーウォーター、フレーバードリンク、ミルク非添加食事代替飲料、フレーバーミルク、ミルク飲料、ミルク添加食事代替飲料、豆乳、果実ジュース、ネクター、果汁入り飲料、野菜ジュース、牛乳、コーヒー飲料、紅茶飲料、緑茶飲料、ウーロン茶飲料、及びブレンド茶系飲料からなる群より選ばれるものである請求項６記載の方法。
【請求項８】
飲食品が発酵食品である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
発酵食品がヨーグルト、発酵乳、及び飲むヨーグルトからなる群より選ばれるものである請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
飲食品が半固形食品である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
半固形食品が豆腐、濃厚流動食、ゼリー飲料、ゼリー、ムース、及びプリンからなる群より選ばれるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
飲食品が固形食品である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
固形食品がインスタント朝食用シリアル、シリアルバー、エネルギーバー、栄養バー、大豆バー、チョコレート、低脂肪スプレッド、及び豆腐ハンバーグステーキからなる群より選ばれるものである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
飲食品が粉末食品である請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
粉末食品が粉末飲料、粉末エネルギードリンク、粉末スポーツドリンク、粉末アイソトニックドリンク、粉末機能性ウォーター、粉末ボトルドウォーター、粉末フレーバーウォーター、粉末フレーバードリンク、粉末ココア、粉末麦芽飲料、粉末スープ、卓上人工甘味料、クリーミングパウダー、乳児用調製粉乳、ピザ粉、たこ焼き粉、お好み焼き粉、ホットケーキミックス、スキムミルク、粉末紅茶、粉末緑茶、粉末梅茶、粉末昆布茶、粉末ジュース、及びインスタントコーヒーからなる群より選ばれるものである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法により得られるＩＬ−１２産生誘導活性を有する乳酸菌含有免疫賦活用組成物。
【公開番号】特開２０１０−９５４６５（Ｐ２０１０−９５４６５Ａ）
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−２６７０３７（Ｐ２００８−２６７０３７）
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（３０６０１９０３０）ハウスウェルネスフーズ株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年４月３０日（２０１０．４．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１０月１６日（２００８．１０．１６）
【出願人】（３０６０１９０３０）ハウスウェルネスフーズ株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
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