乳酸菌含有抗アレルギー用飲料
【課題】飲料の製造、流通、消費の過程において必然的に生じる長期保存や加熱等の熱履歴において飲料に含まれる乳酸菌の抗アレルギー活性低下が抑制された飲料、および乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制する方法を提供すること。
【解決手段】抗アレルギー活性を有する乳酸菌の乾燥菌体と乳成分を配合することにより、飲料中の乳酸菌の抗アレルギー活性の低下を抑制する。
【解決手段】抗アレルギー活性を有する乳酸菌の乾燥菌体と乳成分を配合することにより、飲料中の乳酸菌の抗アレルギー活性の低下を抑制する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌含有抗アレルギー用飲料、および乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国においてアレルギーは最も頻度が高い疾患のひとつである。アレルギー発症機構は通常Ｉ型からＩＶ型の４つに分類され、Ｉ型、II型およびＩＶ型が食物アレルギーの発症に関与するとされている。一方、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などの環境アレルギーはＩ型の発症機構を持つ。
【０００３】
Ｉ型アレルギーは、アレルゲン特異的ＩｇＥの誘導と、ヒスタミンやロイコトリエン等のケミカルメディエーターの放出を特徴とする。Ｂ細胞において抗体のクラススイッチが起こり、ＩｇＥ抗体が産生されるようになるには、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインを必要とする。実際、アレルギー患者のリンパ球にはＴｈ２細胞が増加していることが分かっている。つまり、外界から侵入したアレルゲンは樹状細胞・マクロファージ等の抗原提示細胞によってその一部をＭＨＣ class II分子に結合した状態でＴ細胞に対して提示され、Ｔｈ２細胞が活性化・分化する。Ｔｈ２細胞が放出したＴｈ２サイトカインはＢ細胞のクラススイッチを誘導し、ＩｇＥ抗体が産生され、ＩｇＥ抗体は組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面のＦｃ・Ｒに結合する。アレルゲンは次回の侵入時にマスト細胞や好塩基球表面に結合しているＩｇＥ抗体に認識され、ＩｇＥ抗体間に架橋が形成される。この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がケミカルメディエーターを爆発的に遊離することによって、アレルギーの諸症状が現れる。
【０００４】
ＩｇＥやケミカルメディエーターを介するアレルギーの予防・治療においては、例えばヒスタミンレセプターにヒスタミンと拮抗的に結合することによって末梢神経からの信号伝達を阻害する抗ヒスタミン剤、ケミカルメディエーターの産生細胞の活性を弱めて症状の軽減を試みる抗アレルギー剤、免疫応答性を弱めることによって炎症を軽減するステロイド剤、アレルゲンそのものを定期的に注射することにより寛容を誘導する減感作療法などがあるが、そのいずれも副作用が問題視されており、効果についても決定的なものがないという問題がある。
【０００５】
また、近年、アトピー性皮膚炎や花粉症など、アレルギーに起因すると考えられる体質変化をおこした人が多く見受けられ、社会問題化している。その中でも特に症状が重い患者に対しては、各種薬剤を使用しての治療行為が行われている。しかし、大部分の対象者は本格治療を行うにまでは至っておらず、日常生活をおこなっていく上で、民間療法を含め、対処療法を行って対処しているのが実情であるという問題がある。
【０００６】
上記第一の問題に対応する方法として、ＩｇＥを抑制するためにＴｈ２サイトカインの産生を調節する方法があり、注目が集まっている。結核菌や溶連菌、乳酸菌などのある種の細菌はＴｈ１免疫を増強することにより、Ｔｈ２免疫を抑制し、その結果ＩｇＥを低下させることが報告されている（非特許文献１、特許文献１）。中でも乳酸菌は、安全性の面から食品などへの応用が容易であり、有用な素材である。しかし一概に乳酸菌といっても全ての乳酸菌にＴｈ１免疫を増強させる強い効果があるわけではなく、有用な株の選択をすることが必須となってくる。抗アレルギー乳酸菌としては、ラクトバチルス・ラムノーサス（L. rhamnosus）ＬＧＧ株が公知であり、妊婦に摂取させることにより、子供のアトピー性皮膚炎発症が抑制されることが示されている（非特許文献２）。乳酸菌を抗アレルギー剤として用いることについては、いくつかの特許公報でも開示されている。例えば、特許文献１には、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、およびＬ．カゼイ等の乳酸菌を添加してマウスリンパ球を培養した際のＩｇＥ産生量が３０ｎｇ／ｍｌ以下のものを抗アレルギー剤として用いることについて、特許文献２には、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ビフィダム等のビフィズス菌を特に食物アレルギーを治療するための抗アレルギー剤として用いることについて、および、特許文献３には、エンテロコッカス・フェカリス、ラクトバシルス・ロイテリーなどの乳酸菌をアレルギー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎等のＩ型アレルギーの抑制剤として用いることについて、それぞれ開示されている。
【０００７】
一方で、乳酸菌等がＴｈ１免疫を増強することは、ＩＬ−１２やＩＦＮ−γなどの産生を介してマクロファージやキラーＴ細胞、ＮＫ細胞の細胞性免疫を活性化することを意味し、ウイルスや細菌感染、ガンの発生に対して抵抗することにつながることが分かっている。具体的には、マクロファージが産生するＩＬ−１２は、未分化のヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞への分化、単球・マクロファージ・ＮＫ細胞の活性化を通して、外敵・ガンに対する抵抗性を獲得させる。従って、強いＩＬ−１２産生を誘導することのできる乳酸菌株は、免疫賦活剤として使用することができることが示唆されている（非特許文献３、特許文献４、特許文献５）。また、特許文献６には強いＩＬ−１２産生を誘導することのできる乳酸菌株が抗アレルギー素材として利用可能であることが述べられている。
【０００８】
上記第二の問題に対応する方法として、食事によってアレルギーを抑えようとする方法があり、その研究が近年活発に行われている。その結果、例えば、シソ油や魚油、特定の茶ポリフェノール等、種々の飲食品の成分に抗アレルギー効果を見出して、それらを用いた対処が行われている。
【０００９】
抗アレルギー効果を有する飲食品の成分として、上述のように特定の乳酸菌にも同様な効果が知られてきており、この乳酸菌を用いたヨーグルトや乳酸菌飲料が、抗アレルギー効果を有する飲食物として一部実用化されている。乳酸菌は安全性の面から食品などへの応用が容易であり、有用な素材として着目されてきた。例えば、乳酸菌を、Ｉ型アレルギーの発症に関わるＩｇＥ抗体量を減少させてアレルギーの治療と予防を容易にする抗アレルギー剤として、各種乳酸菌を有効成分とする抗アレルギー剤が開示されている（特許文献１、特許文献７）。この種の抗アレルギー用飲食品による予防あるいは治療では、安全で、かつマイルドな条件で摂取することが可能である代わり、毎日継続摂取することが必要であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能が発揮されることが必要である。
【００１０】
このように様々な形態で実用化されている抗アレルギー飲食物の抗アレルギー活性は、製造、流通、消費の過程において必然的に生じる長期保存や加熱等の熱履歴により、製品中に含まれている抗アレルギー活性を持つ乳酸菌の物性が変化し、活性が低下してしまう。特に、液体に懸濁した状態など、乾燥状態以外の形状では長期保存による活性低下が顕著であった。製品の製造から流通を経て最終的に飲食物として摂取されるまでには一定の期間が必要となるため、従来においては抗アレルギー飲食物の利用が制約を受けてしまう。しかし、長期保存や加熱等の熱履歴による抗アレルギー活性低下に対する対処としては流通期間を短くすることや、賞味期限を短く設定するなどの方策しか取られていない。
【００１１】
以上のように、従来の技術では、抗アレルギー活性を持つ乳酸菌の長期保存や加熱等の熱履歴による活性の低下を抑制することは困難であり、抗アレルギー活性維持の観点から賞味期限を短くせざるを得ないなど、産業利用上の制約が大きく、抗アレルギー活性の低下を抑制する方法が強く望まれていた。
【００１２】
また、乳酸菌を含むヨーグルト、チーズ、発酵乳等には、原料の一部に脱脂粉乳などの無脂固形分が含まれており、これを発酵した飲食品であるが、嗜好面や栄養面から無脂固形分を利用しているにすぎず、その賞味期限も短い。
【００１３】
【特許文献１】特開平９−２９５９号公報
【特許文献２】特開平１０−３０９１７８号公報
【特許文献３】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献４】特開平７−２２８５３６号公報
【特許文献５】特開２００２−８０３６４号公報
【特許文献６】特開２００５−１３７３５７号公報
【特許文献７】特開２００４−２６７２９号公報
【非特許文献１】臨床免疫、１９９９年、第３２巻、４５４頁；インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー、１９９８年、第１１５巻、２７８頁
【非特許文献２】ランセット、２００１年、第３５７巻、１０７６頁
【非特許文献３】キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー、２０００年、第４９巻、１５７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、飲料の製造、流通、消費の過程において必然的に生じる長期保存や加熱等の熱履歴において、飲料に含まれる乳酸菌の抗アレルギー活性低下が抑制された飲料、および乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、飲料を長期保存した場合、または加熱処理を行った場合の乳酸菌の抗アレルギー活性変化について鋭意研究する中で、乳酸菌と乳成分、特に無脂固形分を飲料中に併存させることにより、通常、長期保存や加熱等の熱履歴によって低下する乳酸菌の抗アレルギー活性が、より安定的に維持されることを見出し、発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明の特徴は、要約すると以下の通りである。
（１）抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を配合した飲料。
（２）乳成分が無脂固形分である、（１）に記載の飲料。
（３）無脂固形分が脱脂粉乳である、（２）に記載の飲料。
（４）脱脂粉乳を０．１〜１５重量％の範囲で配合した、（３）に記載の飲料。
（５）乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラムＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウスＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載の飲料。
（６）乳酸菌乾燥菌体が死菌体である、（１）〜（５）のいずれかに記載の飲料。
（７）乳酸菌乾燥菌体を飲料１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲で配合した、（１）〜（６）のいずれかに記載の飲料。
（８）密封容器入りである、（１）〜（７）のいずれかに記載の飲料。
（９）抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を飲料に配合する、乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制する方法。
（１０）乳成分が無脂固形分である、（９）に記載の方法。
（１１）無脂固形分が脱脂粉乳である、（１０）に記載の方法。
（１２）脱脂粉乳を０．１〜１５重量％の範囲で配合する、（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラムＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウスＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株からなる群から選択される、（９）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）乳酸菌乾燥菌体が死菌体である、（９）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）乳酸菌乾燥菌体を飲料１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲で配合する、（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）密封容器に入れる、（９）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
本明細書において「乳成分」とは、牛乳、山羊乳、羊乳などの獣乳に含まれる成分をいい、乳脂肪分、無脂固形分などが含まれる。
【００１８】
「無脂固形分」とは、牛乳、山羊乳、羊乳などの獣乳から水分を除去した乳固形分からさらに乳脂肪分を除去したものをいう。
【００１９】
「脱脂粉乳」とは、脱脂乳（獣乳からほとんどの乳脂肪分を除去したもの、牛乳の場合、無脂固形分８．０％以上、乳脂肪分０．５％未満）を乾燥したものをいう。厚生省乳等省令では、牛乳の脱脂粉乳は、乳固形分９５．０％以上、水分５．０％以下と規定されているが、脱脂乳を乾燥したものであるので、脱脂粉乳の乳固形分の大部分は無脂固形分である。
【００２０】
また、本明細書において「熱履歴」とは、飲食品の製造、流通、消費等の過程において、その飲食品が経た温度変化の履歴を意味する。例えば、飲食品の製造、流通、消費等の過程では、低温での２ヶ月以上の保存、常温での１ヶ月以上の保存、５０℃以上の温度で行われる殺菌操作、ＵＨＴ殺菌、ホットベンダーにおける商品展示、飲食時の加熱などが行われる。
【００２１】
「乳酸菌の抗アレルギー活性低下」は、「熱履歴」により引き起こされ、加熱または長期保存によって引き起こされる場合も含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、製造から流通、消費までの過程において長期保存や加熱等の熱履歴を経る飲料、特に、流通過程において高温での保存を必要とするなどの保温状態であっても効果を保持する抗アレルギー用飲料を提供できる。本発明により、飲料中の乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制することができるので、実際に飲んだ場合に、より効果的な抗アレルギー作用を得られることが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の飲料は、抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を配合したことを特徴とする。
【００２４】
乳酸菌乾燥菌体と乳成分を配合させる飲料は、特に限定されないが、好ましくは牛乳、乳飲料、清涼飲料（例えば緑茶や紅茶などの茶系飲料、コーヒー、炭酸飲料、果実エキス入り飲料、野菜エキス入りジュース、ニアウォーター、スポーツ飲料、ダイエット飲料、ジュースなど）などが挙げられる。
【００２５】
本発明に用いられる乳成分は、乳脂肪分、無脂固形分などを含む。本発明には無脂固形分が好ましく用いられる。無脂固形分は、タンパク質、炭水化物、カルシウムなどのミネラル、ビタミンＢなどのビタミン類などを含む。無脂固形分は水溶液として利用可能であればよく、その形態は液状、粉末状等を問わない。従って無脂固形分を含む、生乳、部分脱脂乳、脱脂乳、加工乳などや、これらの濃縮液、クリーム状に加工したもの、乾燥させて顆粒状や粉末状、固体状にしたもの等でもよい。本発明においては脱脂粉乳が好ましく用いられる。
【００２６】
無脂固形分または脱脂粉乳を飲料に配合する量は、特に限定されず、飲料の種類や原料などによって調整することができ、適宜目的とする濃度に設定すればよい。配合量は、飲料を１００重量％としたときに好ましくは０．１〜１５重量％、より好ましくは０．５〜３．０重量％の範囲である。無脂固形分または脱脂粉乳が０．１重量％未満であると、活性低下を抑制する効果が期待できず、１５重量％を超えると、飲料としての香味に悪影響を与えるおそれがある。また、飲料に予め無脂固形分または脱脂粉乳が含まれる場合も、上記範囲になるように配合すればよい。例えば、牛乳の無脂固形分は８．０％以上であるが、該無脂固形分と配合する無脂固形分とを合わせて、１５重量％を超えない範囲になるようにすればよい。
【００２７】
また、豆乳、大豆タンパク質など乳タンパク質と類似した物性特性を呈する原料も無脂固形分の代わりに用い得る。
【００２８】
本発明に用いられる抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、乾燥菌体であることを要する。食品製造において、ヨーグルトなどのように原料を乳酸菌で発酵してそのまま食品とする場合、食品の保存が利かないこと、あるいは高い抗アレルギー活性を有する乳酸菌を得ることが難しいこと、またはそのような乳酸菌を含有する食品を得ることが難しいことなどが問題として挙げられる。
【００２９】
しかし、本発明に用いられる乳酸菌は、分別培養された後、乾燥されたものであるので、保存期間が長く、様々な用途に使用することができる。また、培養条件を最適化して、目的とする高い抗アレルギー活性を有する乳酸菌菌体を得ることが比較的容易である。
【００３０】
また、抗アレルギー活性を有する乳酸菌の乾燥菌体が死菌体の場合は、生菌体よりも物性の変化が少なく、さらにハンドリングの向上などの優位な特性を有する点で好ましい。
【００３１】
乳酸菌は、抗アレルギー活性を有するものであれば特に限定されず、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属等のいずれの乳酸菌をも使用することができる。具体的には、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ケフィア、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、ロイコノストック・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス等が挙げられる。
【００３２】
乳酸菌の例およびその入手先を、表１、表２および表３に示す。本発明においては、全ての菌株をＫＷで始まる番号にて識別しているが、これら試験株は独自で単離したもの、市販乳製品で使用されているもの、公的機関等から入手したもの等があるために便宜上統一した識別名を付したものであり、それぞれのＫＷ株と入手由来との関係は表１、表２および表３の通りである。なお、表１および表２の「入手先」において、「ＪＣＭ」は理化学研究所微生物系統保存施設を、「ＩＦＯ」は前財団法人発酵研究所（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物資源センター（ＮＢＲＣ））を表す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
以上の表のうち、特に高い抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）ＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株であり、これらを本発明に用いることが好ましい。
【００３７】
例えばラクトバチルス・パラカゼイ（L. paracasei）ＫＷ３１１０株は、L. casei Ｌ１４株として、日本乳業技術協会から入手することができる。なお、日本乳業技術協会の記載によれば、Ｌ１４株はL. caseiとの記載があるが、本発明者らがQUALICON社製リボプリンターを用いたＲＦＬＰ（Restriction Flagment Length Polymorphism）およびＡＦＬＰ（Amplified Flagment Length Polymorphism）を用いて解析したところ、当該株はL. paracaseiと判断されたため、本発明においてはL. paracaseiと記載した。L. paracasei ＫＷ３１１０は、上記のとおり日本乳業技術協会から入手することができるが、さらに、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く国際寄託当局である、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６３４として寄託されている（寄託日：２００４年２月２０日）。また、L. paracasei ＫＷ３１１０の派生株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６３５として同特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３８】
また、L. plantarum ＫＷ４１１０株はL. plantarum ＪＣＭ１１４９株として、L. paracasei ＫＷ３９２６株はL. paracasei ＪＣＭ８１３２株として、ＪＣＭ（理化学研究所微生物系統保存施設）から入手することができ、および、L.paracasei ＫＷ３９２５株はL. paracasei ＮＲＩＣ１９１７株として、ＮＲＩＣ（東京農業大学）から入手することができる。
【００３９】
乳酸菌は、培地で培養することにより調製することができる。培養に用いる培地は、前記乳酸菌が生育可能な培地であればどのようなものでも利用可能であり、獣乳、脱脂乳、乳性ホエー、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、ＢＬ培地、Briggs Liver Brothや合成培地などを用いることができる。培養温度は２０℃から５０℃、好ましくは２５℃から４２℃とすることができる。また、培養時間は３時間から９６時間とすることができる。培養終了後の培地を必要に応じて処理することにより本発明に用いる乳酸菌とすることができる。具体的には、培養終了後の培地から遠心分離、ろ過等により集菌して菌体のみとしたものをスプレイドライ乾燥菌体としたもの、凍結乾燥菌体としたものが挙げられる。本発明に用いる乳酸菌は、前記乳酸菌菌体に加え、他の成分を含むことができる。他の成分としては、賦形剤等の添加剤、および後述する培地の成分等を挙げることができる。
【００４０】
乳酸菌の具体的調製例を以下に示す。
（乳酸菌ＫＷ３１１０株菌体の調製）
乳酸菌の培養には、培養用培地（グルコース１％、酵母エキスＳ(キリンフードテック（株）)１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ５０ｐｐｍ）を使用する。前培養は、乳酸菌ＫＷ３１１０株を培養用培地１０ｍｌに接種し、３７℃で２０〜２４時間静置して行う。本培養は、前培養液０．６ｍｌを１２０ｍｌの培養用培地に接種し、２００ｍｌ容ファーメンター（モデルＢＭＪ−２５、エイブル社）を用いて、２８℃にて培養する。通気量は０．１２Ｌ／分、攪拌速度は５００ｒｐｍとする。ｐＨは２５％ ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ４．５以下にならないように制御する。培養は４８時間行う。
【００４１】
培養終了後、８５００Ｘｇ、１０分間の遠心分離により、菌体を集菌する。３０ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁し、８５００Ｘｇ、１０分間の遠心分離により、菌体を集菌する。この洗浄操作を３回繰り返し、培地由来成分を除去する。洗浄菌体を、１０ｍｌの滅菌水に懸濁し、オートクレーブにて１００℃、３０分間処理した後、凍結乾燥する。以上の方法により、最終的に乳酸菌乾燥菌体５０〜７０ｍｇが得られる。得られた乳酸菌菌体の抗アレルギー活性を確認する（後述の実施例を参照）。
【００４２】
乳酸菌乾燥菌体を飲料に配合する量は、１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲であることが好ましい。乳酸菌が、飲料１００ｍｌあたり１０９個未満であると、抗アレルギー効果が期待できなくなり、１０１１個を超えると、菌体の沈殿量が多くなり、飲料としての質の低下を招くおそれがある。
【００４３】
飲料のｐＨはとくに限定されないが、好ましくはｐＨ３．０〜６．８、より好ましくはｐＨ３．５〜３．９の範囲である。
【００４４】
飲料の製造に際しては、通常の飲料の処方設計に用いられる糖類、果汁等、食品添加物（酸味料、甘味料、安定剤、香料など）のいずれも使用することができる。飲料の製造に関しては、既存の参考書、例えば「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）等を参考にすることができる。製造された飲料は、密封容器、例えばペットボトル、缶、紙パックなどに入れ、長期保存したり、流通経路に載せて販売することができる。
【００４５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
脱イオン水に菌体濃度が０．０３８重量％（１００ｍｌあたり約３．８×１０１０個に相当）になるように乳酸菌Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株乾燥菌体（加熱死菌：キリンフードテック（株）より入手）を添加し、これを乳酸菌含有水（１）とした。（１）に脱脂粉乳を２．８重量％加えたもの（２）、（１）にペクチンを０．３重量％加えたもの（３）、（１）に大豆多糖類を０．２５重量％加えたもの（４）を用意し、希硫酸を用いてｐＨを３．５〜３．９に調製した。サンプル（１）〜（４）を定法通りＵＨＴ殺菌し、ペットボトルにそれぞれ３本ずつホットパックした。３本のうち１本は５０℃で１１日間、１本は６０℃で３日間、残り１本はペットボトル充填後５℃で１日保存した。
【００４７】
保存後の飲料１５ｍｌより８０００回転、１０分間の遠心分離を行い、乳酸菌を沈殿させた。上清を除いた後ＰＢＳ（−）にて菌体を再懸濁し、同様の遠心操作を繰り返し、最終的に溶媒がＰＢＳ（−）に置換された乳酸菌懸濁液を得た。サンプル（２）については脱脂粉乳が共沈してくるので、遠心後に適度な強さで遠心管を振ることにより脱脂粉乳のみを懸濁させた後に上清を除いた。サンプル（１）〜（４）の乳酸菌ＰＢＳ（−）懸濁液の濁度を測定することで懸濁液中の菌体の濃度を算定した。
【００４８】
乳酸菌のin vitroにおける抗アレルギー活性はマウス脾臓リンパ球と混合培養を行った際に、培地中に放出されるＩＬ−１２量を測定することによって行った。６−１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバー）を解剖し、脾臓からリンパ球を調製した。脾臓リンパ球を１０％となるようにＦＣＳ（ロシュ）を添加したＲＰＭ１１６４０（SIGMA）培地で細胞濃度が２．５×１０６ cells／ｍｌになるように懸濁した。乳酸菌を上記培地に０．５μｇ／ｍｌになるように添加し、２４時間、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、Opt EIA ELISA Set（ベクトン・ディッキンソン）を用いてＩＬ−１２生産量を測定した。
【００４９】
図１にサンプル（１）〜（４）から分離した菌体の抗アレルギー活性を示す。乳酸菌のみ添加した（１）では、５０℃で１１日保存した場合や、６０℃で３日保存した場合に、製造翌日に分離した菌体に対して抗アレルギー活性がそれぞれ８０％、６０％程度に低下していた。それに対して脱脂粉乳を添加した（２）では活性の低下が抑制され、ほぼ１００％を維持していた。一方、ペクチンや大豆多糖類を加えた（３）、（４）では、乳酸菌のみを加えた（１）と同程度もしくはそれ以上の活性低下が起こった。
【００５０】
以上の結果から、乳酸菌と脱脂粉乳を併存させることにより、加熱による乳酸菌抗アレルギー活性の低下が大幅に抑制されることが確認された。また、５０℃や６０℃に加熱した状態での保存する加速試験は一般に長期保存をした場合の飲食品への影響を推定する方法として広く用いられている。このことから、乳酸菌と脱脂粉乳を併存させることにより、５０℃や６０℃で熱履歴に対してのみならず、より低い温度で長期保存した場合にも、抗アレルギー活性の低下が抑制されることが容易に推察できる。
【実施例２】
【００５１】
上記実施例の結果を受けて、以下のように実際に飲料を調製し、より低い温度で長期保存した場合の本発明の効果を確認した。
【００５２】
実施例として、脱脂粉乳２．８重量％に乳酸菌ＫＷ３１１０株乾燥菌体を０．０３８重量％（１００ｍｌあたり約３．８×１０１０個に相当）添加し、香味の調整としてグラニュー糖、ペクチン、大豆多糖類、クエン酸、クエン酸ナトリウム、香料を用いて飲料２を調製した後、定法通りＵＨＴ殺菌し、ペットボトルにホットパックした。
【００５３】
次に比較例として、再公表２００４−０９６２４６号公報の実施例１５（スポーツドリンクの製造）に記載されているように、グラニュー糖、クエン酸、クエン酸ナトリウム、香料に乳酸菌ＫＷ３１１０株乾燥菌体を０．０１４３重量％（１００ｍｌあたり約１．４３×１０１０個に相当）添加し、飲料１を調製した後、定法通りＵＨＴ殺菌し、ペットボトルにホットパックした。
【００５４】
得られた飲料を３５℃の条件で０ヶ月、１ヶ月または２ヶ月保存し、保存後、実施例１と同様の方法で菌体分離およびＩＬ−１２を指標とした活性測定を行った。
【００５５】
図２に飲料１および２から分離した菌体の抗アレルギー活性を示す。飲料１では０ヶ月保存時の活性と比べた場合、１ヶ月では２２％程度、２ヶ月の菌体では７５％程度活性が低下していた。それに対して、脱脂粉乳が併存している飲料２では、２ヶ月保存後の活性低下が２０％程度に抑制されていた。
【００５６】
以上の結果から、加速試験の結果から予測されたとおり、実際に２ヶ月という長期間の保存においても、乳酸菌と無脂固形分である脱脂粉乳を併存させることにより、乳酸菌抗アレルギー活性の低下が抑制された。また、飲料１および２はいずれも満足できる香味を持つ飲料の処方であるので、実施例１のように脱イオン水に乳酸菌と脱脂粉乳を添加した場合のみならず、実際の飲料に脱脂粉乳が併存する場合にも乳酸菌抗アレルギー活性低下抑制効果が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
飲料に含まれる乳酸菌の抗アレルギー活性を、長期保存や加熱等の熱履歴があっても維持することができるので、アレルギー疾患の予防、改善効果を高く保持する機能性飲料の開発に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】加速試験における乳酸菌抗アレルギー活性（相対活性）を示す。
【図２】乳酸菌含有飲料と、脱脂粉乳および乳酸菌含有飲料における乳酸菌抗アレルギー活性（相対活性）を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌含有抗アレルギー用飲料、および乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
先進国においてアレルギーは最も頻度が高い疾患のひとつである。アレルギー発症機構は通常Ｉ型からＩＶ型の４つに分類され、Ｉ型、II型およびＩＶ型が食物アレルギーの発症に関与するとされている。一方、花粉症、アトピー性皮膚炎、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎などの環境アレルギーはＩ型の発症機構を持つ。
【０００３】
Ｉ型アレルギーは、アレルゲン特異的ＩｇＥの誘導と、ヒスタミンやロイコトリエン等のケミカルメディエーターの放出を特徴とする。Ｂ細胞において抗体のクラススイッチが起こり、ＩｇＥ抗体が産生されるようになるには、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３等のＴｈ２サイトカインを必要とする。実際、アレルギー患者のリンパ球にはＴｈ２細胞が増加していることが分かっている。つまり、外界から侵入したアレルゲンは樹状細胞・マクロファージ等の抗原提示細胞によってその一部をＭＨＣ class II分子に結合した状態でＴ細胞に対して提示され、Ｔｈ２細胞が活性化・分化する。Ｔｈ２細胞が放出したＴｈ２サイトカインはＢ細胞のクラススイッチを誘導し、ＩｇＥ抗体が産生され、ＩｇＥ抗体は組織内のマスト細胞や血中の好塩基球表面のＦｃ・Ｒに結合する。アレルゲンは次回の侵入時にマスト細胞や好塩基球表面に結合しているＩｇＥ抗体に認識され、ＩｇＥ抗体間に架橋が形成される。この刺激を引き金としてマスト細胞や好塩基球がケミカルメディエーターを爆発的に遊離することによって、アレルギーの諸症状が現れる。
【０００４】
ＩｇＥやケミカルメディエーターを介するアレルギーの予防・治療においては、例えばヒスタミンレセプターにヒスタミンと拮抗的に結合することによって末梢神経からの信号伝達を阻害する抗ヒスタミン剤、ケミカルメディエーターの産生細胞の活性を弱めて症状の軽減を試みる抗アレルギー剤、免疫応答性を弱めることによって炎症を軽減するステロイド剤、アレルゲンそのものを定期的に注射することにより寛容を誘導する減感作療法などがあるが、そのいずれも副作用が問題視されており、効果についても決定的なものがないという問題がある。
【０００５】
また、近年、アトピー性皮膚炎や花粉症など、アレルギーに起因すると考えられる体質変化をおこした人が多く見受けられ、社会問題化している。その中でも特に症状が重い患者に対しては、各種薬剤を使用しての治療行為が行われている。しかし、大部分の対象者は本格治療を行うにまでは至っておらず、日常生活をおこなっていく上で、民間療法を含め、対処療法を行って対処しているのが実情であるという問題がある。
【０００６】
上記第一の問題に対応する方法として、ＩｇＥを抑制するためにＴｈ２サイトカインの産生を調節する方法があり、注目が集まっている。結核菌や溶連菌、乳酸菌などのある種の細菌はＴｈ１免疫を増強することにより、Ｔｈ２免疫を抑制し、その結果ＩｇＥを低下させることが報告されている（非特許文献１、特許文献１）。中でも乳酸菌は、安全性の面から食品などへの応用が容易であり、有用な素材である。しかし一概に乳酸菌といっても全ての乳酸菌にＴｈ１免疫を増強させる強い効果があるわけではなく、有用な株の選択をすることが必須となってくる。抗アレルギー乳酸菌としては、ラクトバチルス・ラムノーサス（L. rhamnosus）ＬＧＧ株が公知であり、妊婦に摂取させることにより、子供のアトピー性皮膚炎発症が抑制されることが示されている（非特許文献２）。乳酸菌を抗アレルギー剤として用いることについては、いくつかの特許公報でも開示されている。例えば、特許文献１には、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ブフネリ、およびＬ．カゼイ等の乳酸菌を添加してマウスリンパ球を培養した際のＩｇＥ産生量が３０ｎｇ／ｍｌ以下のものを抗アレルギー剤として用いることについて、特許文献２には、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガムおよびビフィドバクテリウム・ビフィダム等のビフィズス菌を特に食物アレルギーを治療するための抗アレルギー剤として用いることについて、および、特許文献３には、エンテロコッカス・フェカリス、ラクトバシルス・ロイテリーなどの乳酸菌をアレルギー性気管支喘息、アレルギー性鼻炎およびアトピー性皮膚炎等のＩ型アレルギーの抑制剤として用いることについて、それぞれ開示されている。
【０００７】
一方で、乳酸菌等がＴｈ１免疫を増強することは、ＩＬ−１２やＩＦＮ−γなどの産生を介してマクロファージやキラーＴ細胞、ＮＫ細胞の細胞性免疫を活性化することを意味し、ウイルスや細菌感染、ガンの発生に対して抵抗することにつながることが分かっている。具体的には、マクロファージが産生するＩＬ−１２は、未分化のヘルパーＴ細胞のＴｈ１細胞への分化、単球・マクロファージ・ＮＫ細胞の活性化を通して、外敵・ガンに対する抵抗性を獲得させる。従って、強いＩＬ−１２産生を誘導することのできる乳酸菌株は、免疫賦活剤として使用することができることが示唆されている（非特許文献３、特許文献４、特許文献５）。また、特許文献６には強いＩＬ−１２産生を誘導することのできる乳酸菌株が抗アレルギー素材として利用可能であることが述べられている。
【０００８】
上記第二の問題に対応する方法として、食事によってアレルギーを抑えようとする方法があり、その研究が近年活発に行われている。その結果、例えば、シソ油や魚油、特定の茶ポリフェノール等、種々の飲食品の成分に抗アレルギー効果を見出して、それらを用いた対処が行われている。
【０００９】
抗アレルギー効果を有する飲食品の成分として、上述のように特定の乳酸菌にも同様な効果が知られてきており、この乳酸菌を用いたヨーグルトや乳酸菌飲料が、抗アレルギー効果を有する飲食物として一部実用化されている。乳酸菌は安全性の面から食品などへの応用が容易であり、有用な素材として着目されてきた。例えば、乳酸菌を、Ｉ型アレルギーの発症に関わるＩｇＥ抗体量を減少させてアレルギーの治療と予防を容易にする抗アレルギー剤として、各種乳酸菌を有効成分とする抗アレルギー剤が開示されている（特許文献１、特許文献７）。この種の抗アレルギー用飲食品による予防あるいは治療では、安全で、かつマイルドな条件で摂取することが可能である代わり、毎日継続摂取することが必要であり、尚かつ該継続摂取することが可能な量で効能が発揮されることが必要である。
【００１０】
このように様々な形態で実用化されている抗アレルギー飲食物の抗アレルギー活性は、製造、流通、消費の過程において必然的に生じる長期保存や加熱等の熱履歴により、製品中に含まれている抗アレルギー活性を持つ乳酸菌の物性が変化し、活性が低下してしまう。特に、液体に懸濁した状態など、乾燥状態以外の形状では長期保存による活性低下が顕著であった。製品の製造から流通を経て最終的に飲食物として摂取されるまでには一定の期間が必要となるため、従来においては抗アレルギー飲食物の利用が制約を受けてしまう。しかし、長期保存や加熱等の熱履歴による抗アレルギー活性低下に対する対処としては流通期間を短くすることや、賞味期限を短く設定するなどの方策しか取られていない。
【００１１】
以上のように、従来の技術では、抗アレルギー活性を持つ乳酸菌の長期保存や加熱等の熱履歴による活性の低下を抑制することは困難であり、抗アレルギー活性維持の観点から賞味期限を短くせざるを得ないなど、産業利用上の制約が大きく、抗アレルギー活性の低下を抑制する方法が強く望まれていた。
【００１２】
また、乳酸菌を含むヨーグルト、チーズ、発酵乳等には、原料の一部に脱脂粉乳などの無脂固形分が含まれており、これを発酵した飲食品であるが、嗜好面や栄養面から無脂固形分を利用しているにすぎず、その賞味期限も短い。
【００１３】
【特許文献１】特開平９−２９５９号公報
【特許文献２】特開平１０−３０９１７８号公報
【特許文献３】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献４】特開平７−２２８５３６号公報
【特許文献５】特開２００２−８０３６４号公報
【特許文献６】特開２００５−１３７３５７号公報
【特許文献７】特開２００４−２６７２９号公報
【非特許文献１】臨床免疫、１９９９年、第３２巻、４５４頁；インターナショナル・アーカイブス・オブ・アレルギー・アンド・イムノロジー、１９９８年、第１１５巻、２７８頁
【非特許文献２】ランセット、２００１年、第３５７巻、１０７６頁
【非特許文献３】キャンサー・イムノロジー・イムノセラピー、２０００年、第４９巻、１５７頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、飲料の製造、流通、消費の過程において必然的に生じる長期保存や加熱等の熱履歴において、飲料に含まれる乳酸菌の抗アレルギー活性低下が抑制された飲料、および乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、飲料を長期保存した場合、または加熱処理を行った場合の乳酸菌の抗アレルギー活性変化について鋭意研究する中で、乳酸菌と乳成分、特に無脂固形分を飲料中に併存させることにより、通常、長期保存や加熱等の熱履歴によって低下する乳酸菌の抗アレルギー活性が、より安定的に維持されることを見出し、発明を完成するに至った。
【００１６】
本発明の特徴は、要約すると以下の通りである。
（１）抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を配合した飲料。
（２）乳成分が無脂固形分である、（１）に記載の飲料。
（３）無脂固形分が脱脂粉乳である、（２）に記載の飲料。
（４）脱脂粉乳を０．１〜１５重量％の範囲で配合した、（３）に記載の飲料。
（５）乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラムＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウスＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株からなる群から選択される、（１）〜（４）のいずれかに記載の飲料。
（６）乳酸菌乾燥菌体が死菌体である、（１）〜（５）のいずれかに記載の飲料。
（７）乳酸菌乾燥菌体を飲料１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲で配合した、（１）〜（６）のいずれかに記載の飲料。
（８）密封容器入りである、（１）〜（７）のいずれかに記載の飲料。
（９）抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を飲料に配合する、乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制する方法。
（１０）乳成分が無脂固形分である、（９）に記載の方法。
（１１）無脂固形分が脱脂粉乳である、（１０）に記載の方法。
（１２）脱脂粉乳を０．１〜１５重量％の範囲で配合する、（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラムＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウスＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株からなる群から選択される、（９）〜（１２）のいずれかに記載の方法。
（１４）乳酸菌乾燥菌体が死菌体である、（９）〜（１３）のいずれかに記載の方法。
（１５）乳酸菌乾燥菌体を飲料１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲で配合する、（９）〜（１４）のいずれかに記載の方法。
（１６）密封容器に入れる、（９）〜（１５）のいずれかに記載の方法。
【００１７】
本明細書において「乳成分」とは、牛乳、山羊乳、羊乳などの獣乳に含まれる成分をいい、乳脂肪分、無脂固形分などが含まれる。
【００１８】
「無脂固形分」とは、牛乳、山羊乳、羊乳などの獣乳から水分を除去した乳固形分からさらに乳脂肪分を除去したものをいう。
【００１９】
「脱脂粉乳」とは、脱脂乳（獣乳からほとんどの乳脂肪分を除去したもの、牛乳の場合、無脂固形分８．０％以上、乳脂肪分０．５％未満）を乾燥したものをいう。厚生省乳等省令では、牛乳の脱脂粉乳は、乳固形分９５．０％以上、水分５．０％以下と規定されているが、脱脂乳を乾燥したものであるので、脱脂粉乳の乳固形分の大部分は無脂固形分である。
【００２０】
また、本明細書において「熱履歴」とは、飲食品の製造、流通、消費等の過程において、その飲食品が経た温度変化の履歴を意味する。例えば、飲食品の製造、流通、消費等の過程では、低温での２ヶ月以上の保存、常温での１ヶ月以上の保存、５０℃以上の温度で行われる殺菌操作、ＵＨＴ殺菌、ホットベンダーにおける商品展示、飲食時の加熱などが行われる。
【００２１】
「乳酸菌の抗アレルギー活性低下」は、「熱履歴」により引き起こされ、加熱または長期保存によって引き起こされる場合も含む。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、製造から流通、消費までの過程において長期保存や加熱等の熱履歴を経る飲料、特に、流通過程において高温での保存を必要とするなどの保温状態であっても効果を保持する抗アレルギー用飲料を提供できる。本発明により、飲料中の乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制することができるので、実際に飲んだ場合に、より効果的な抗アレルギー作用を得られることが期待できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の飲料は、抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を配合したことを特徴とする。
【００２４】
乳酸菌乾燥菌体と乳成分を配合させる飲料は、特に限定されないが、好ましくは牛乳、乳飲料、清涼飲料（例えば緑茶や紅茶などの茶系飲料、コーヒー、炭酸飲料、果実エキス入り飲料、野菜エキス入りジュース、ニアウォーター、スポーツ飲料、ダイエット飲料、ジュースなど）などが挙げられる。
【００２５】
本発明に用いられる乳成分は、乳脂肪分、無脂固形分などを含む。本発明には無脂固形分が好ましく用いられる。無脂固形分は、タンパク質、炭水化物、カルシウムなどのミネラル、ビタミンＢなどのビタミン類などを含む。無脂固形分は水溶液として利用可能であればよく、その形態は液状、粉末状等を問わない。従って無脂固形分を含む、生乳、部分脱脂乳、脱脂乳、加工乳などや、これらの濃縮液、クリーム状に加工したもの、乾燥させて顆粒状や粉末状、固体状にしたもの等でもよい。本発明においては脱脂粉乳が好ましく用いられる。
【００２６】
無脂固形分または脱脂粉乳を飲料に配合する量は、特に限定されず、飲料の種類や原料などによって調整することができ、適宜目的とする濃度に設定すればよい。配合量は、飲料を１００重量％としたときに好ましくは０．１〜１５重量％、より好ましくは０．５〜３．０重量％の範囲である。無脂固形分または脱脂粉乳が０．１重量％未満であると、活性低下を抑制する効果が期待できず、１５重量％を超えると、飲料としての香味に悪影響を与えるおそれがある。また、飲料に予め無脂固形分または脱脂粉乳が含まれる場合も、上記範囲になるように配合すればよい。例えば、牛乳の無脂固形分は８．０％以上であるが、該無脂固形分と配合する無脂固形分とを合わせて、１５重量％を超えない範囲になるようにすればよい。
【００２７】
また、豆乳、大豆タンパク質など乳タンパク質と類似した物性特性を呈する原料も無脂固形分の代わりに用い得る。
【００２８】
本発明に用いられる抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、乾燥菌体であることを要する。食品製造において、ヨーグルトなどのように原料を乳酸菌で発酵してそのまま食品とする場合、食品の保存が利かないこと、あるいは高い抗アレルギー活性を有する乳酸菌を得ることが難しいこと、またはそのような乳酸菌を含有する食品を得ることが難しいことなどが問題として挙げられる。
【００２９】
しかし、本発明に用いられる乳酸菌は、分別培養された後、乾燥されたものであるので、保存期間が長く、様々な用途に使用することができる。また、培養条件を最適化して、目的とする高い抗アレルギー活性を有する乳酸菌菌体を得ることが比較的容易である。
【００３０】
また、抗アレルギー活性を有する乳酸菌の乾燥菌体が死菌体の場合は、生菌体よりも物性の変化が少なく、さらにハンドリングの向上などの優位な特性を有する点で好ましい。
【００３１】
乳酸菌は、抗アレルギー活性を有するものであれば特に限定されず、ラクトバチルス属、ストレプトコッカス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、エンテロコッカス属等のいずれの乳酸菌をも使用することができる。具体的には、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・ケフィア、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノーサス、ラクトバチルス・サリバリウス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクティス、ロイコノストック・ラクティス、ロイコノストック・メセンテロイデス等が挙げられる。
【００３２】
乳酸菌の例およびその入手先を、表１、表２および表３に示す。本発明においては、全ての菌株をＫＷで始まる番号にて識別しているが、これら試験株は独自で単離したもの、市販乳製品で使用されているもの、公的機関等から入手したもの等があるために便宜上統一した識別名を付したものであり、それぞれのＫＷ株と入手由来との関係は表１、表２および表３の通りである。なお、表１および表２の「入手先」において、「ＪＣＭ」は理化学研究所微生物系統保存施設を、「ＩＦＯ」は前財団法人発酵研究所（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 生物資源センター（ＮＢＲＣ））を表す。
【００３３】
【表１】
【００３４】
【表２】
【００３５】
【表３】
【００３６】
以上の表のうち、特に高い抗アレルギー活性を有する乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）ＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）ＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivarius）ＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株であり、これらを本発明に用いることが好ましい。
【００３７】
例えばラクトバチルス・パラカゼイ（L. paracasei）ＫＷ３１１０株は、L. casei Ｌ１４株として、日本乳業技術協会から入手することができる。なお、日本乳業技術協会の記載によれば、Ｌ１４株はL. caseiとの記載があるが、本発明者らがQUALICON社製リボプリンターを用いたＲＦＬＰ（Restriction Flagment Length Polymorphism）およびＡＦＬＰ（Amplified Flagment Length Polymorphism）を用いて解析したところ、当該株はL. paracaseiと判断されたため、本発明においてはL. paracaseiと記載した。L. paracasei ＫＷ３１１０は、上記のとおり日本乳業技術協会から入手することができるが、さらに、特許微生物の寄託のためのブダペスト条約に基く国際寄託当局である、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５−８５６６ 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６３４として寄託されている（寄託日：２００４年２月２０日）。また、L. paracasei ＫＷ３１１０の派生株は、ＦＥＲＭ ＢＰ−０８６３５として同特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３８】
また、L. plantarum ＫＷ４１１０株はL. plantarum ＪＣＭ１１４９株として、L. paracasei ＫＷ３９２６株はL. paracasei ＪＣＭ８１３２株として、ＪＣＭ（理化学研究所微生物系統保存施設）から入手することができ、および、L.paracasei ＫＷ３９２５株はL. paracasei ＮＲＩＣ１９１７株として、ＮＲＩＣ（東京農業大学）から入手することができる。
【００３９】
乳酸菌は、培地で培養することにより調製することができる。培養に用いる培地は、前記乳酸菌が生育可能な培地であればどのようなものでも利用可能であり、獣乳、脱脂乳、乳性ホエー、ＭＲＳ培地、ＧＡＭ培地、ＢＬ培地、Briggs Liver Brothや合成培地などを用いることができる。培養温度は２０℃から５０℃、好ましくは２５℃から４２℃とすることができる。また、培養時間は３時間から９６時間とすることができる。培養終了後の培地を必要に応じて処理することにより本発明に用いる乳酸菌とすることができる。具体的には、培養終了後の培地から遠心分離、ろ過等により集菌して菌体のみとしたものをスプレイドライ乾燥菌体としたもの、凍結乾燥菌体としたものが挙げられる。本発明に用いる乳酸菌は、前記乳酸菌菌体に加え、他の成分を含むことができる。他の成分としては、賦形剤等の添加剤、および後述する培地の成分等を挙げることができる。
【００４０】
乳酸菌の具体的調製例を以下に示す。
（乳酸菌ＫＷ３１１０株菌体の調製）
乳酸菌の培養には、培養用培地（グルコース１％、酵母エキスＳ(キリンフードテック（株）)１％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ５０ｐｐｍ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ５０ｐｐｍ）を使用する。前培養は、乳酸菌ＫＷ３１１０株を培養用培地１０ｍｌに接種し、３７℃で２０〜２４時間静置して行う。本培養は、前培養液０．６ｍｌを１２０ｍｌの培養用培地に接種し、２００ｍｌ容ファーメンター（モデルＢＭＪ−２５、エイブル社）を用いて、２８℃にて培養する。通気量は０．１２Ｌ／分、攪拌速度は５００ｒｐｍとする。ｐＨは２５％ ＮａＯＨ溶液を用いてｐＨ４．５以下にならないように制御する。培養は４８時間行う。
【００４１】
培養終了後、８５００Ｘｇ、１０分間の遠心分離により、菌体を集菌する。３０ｍｌの滅菌蒸留水に懸濁し、８５００Ｘｇ、１０分間の遠心分離により、菌体を集菌する。この洗浄操作を３回繰り返し、培地由来成分を除去する。洗浄菌体を、１０ｍｌの滅菌水に懸濁し、オートクレーブにて１００℃、３０分間処理した後、凍結乾燥する。以上の方法により、最終的に乳酸菌乾燥菌体５０〜７０ｍｇが得られる。得られた乳酸菌菌体の抗アレルギー活性を確認する（後述の実施例を参照）。
【００４２】
乳酸菌乾燥菌体を飲料に配合する量は、１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲であることが好ましい。乳酸菌が、飲料１００ｍｌあたり１０９個未満であると、抗アレルギー効果が期待できなくなり、１０１１個を超えると、菌体の沈殿量が多くなり、飲料としての質の低下を招くおそれがある。
【００４３】
飲料のｐＨはとくに限定されないが、好ましくはｐＨ３．０〜６．８、より好ましくはｐＨ３．５〜３．９の範囲である。
【００４４】
飲料の製造に際しては、通常の飲料の処方設計に用いられる糖類、果汁等、食品添加物（酸味料、甘味料、安定剤、香料など）のいずれも使用することができる。飲料の製造に関しては、既存の参考書、例えば「改訂新版ソフトドリンクス」（株式会社光琳）等を参考にすることができる。製造された飲料は、密封容器、例えばペットボトル、缶、紙パックなどに入れ、長期保存したり、流通経路に載せて販売することができる。
【００４５】
以下、本発明を実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００４６】
脱イオン水に菌体濃度が０．０３８重量％（１００ｍｌあたり約３．８×１０１０個に相当）になるように乳酸菌Lactobacillus paracasei ＫＷ３１１０株乾燥菌体（加熱死菌：キリンフードテック（株）より入手）を添加し、これを乳酸菌含有水（１）とした。（１）に脱脂粉乳を２．８重量％加えたもの（２）、（１）にペクチンを０．３重量％加えたもの（３）、（１）に大豆多糖類を０．２５重量％加えたもの（４）を用意し、希硫酸を用いてｐＨを３．５〜３．９に調製した。サンプル（１）〜（４）を定法通りＵＨＴ殺菌し、ペットボトルにそれぞれ３本ずつホットパックした。３本のうち１本は５０℃で１１日間、１本は６０℃で３日間、残り１本はペットボトル充填後５℃で１日保存した。
【００４７】
保存後の飲料１５ｍｌより８０００回転、１０分間の遠心分離を行い、乳酸菌を沈殿させた。上清を除いた後ＰＢＳ（−）にて菌体を再懸濁し、同様の遠心操作を繰り返し、最終的に溶媒がＰＢＳ（−）に置換された乳酸菌懸濁液を得た。サンプル（２）については脱脂粉乳が共沈してくるので、遠心後に適度な強さで遠心管を振ることにより脱脂粉乳のみを懸濁させた後に上清を除いた。サンプル（１）〜（４）の乳酸菌ＰＢＳ（−）懸濁液の濁度を測定することで懸濁液中の菌体の濃度を算定した。
【００４８】
乳酸菌のin vitroにおける抗アレルギー活性はマウス脾臓リンパ球と混合培養を行った際に、培地中に放出されるＩＬ−１２量を測定することによって行った。６−１０週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズリバー）を解剖し、脾臓からリンパ球を調製した。脾臓リンパ球を１０％となるようにＦＣＳ（ロシュ）を添加したＲＰＭ１１６４０（SIGMA）培地で細胞濃度が２．５×１０６ cells／ｍｌになるように懸濁した。乳酸菌を上記培地に０．５μｇ／ｍｌになるように添加し、２４時間、３７℃、ＣＯ２濃度５％で培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、Opt EIA ELISA Set（ベクトン・ディッキンソン）を用いてＩＬ−１２生産量を測定した。
【００４９】
図１にサンプル（１）〜（４）から分離した菌体の抗アレルギー活性を示す。乳酸菌のみ添加した（１）では、５０℃で１１日保存した場合や、６０℃で３日保存した場合に、製造翌日に分離した菌体に対して抗アレルギー活性がそれぞれ８０％、６０％程度に低下していた。それに対して脱脂粉乳を添加した（２）では活性の低下が抑制され、ほぼ１００％を維持していた。一方、ペクチンや大豆多糖類を加えた（３）、（４）では、乳酸菌のみを加えた（１）と同程度もしくはそれ以上の活性低下が起こった。
【００５０】
以上の結果から、乳酸菌と脱脂粉乳を併存させることにより、加熱による乳酸菌抗アレルギー活性の低下が大幅に抑制されることが確認された。また、５０℃や６０℃に加熱した状態での保存する加速試験は一般に長期保存をした場合の飲食品への影響を推定する方法として広く用いられている。このことから、乳酸菌と脱脂粉乳を併存させることにより、５０℃や６０℃で熱履歴に対してのみならず、より低い温度で長期保存した場合にも、抗アレルギー活性の低下が抑制されることが容易に推察できる。
【実施例２】
【００５１】
上記実施例の結果を受けて、以下のように実際に飲料を調製し、より低い温度で長期保存した場合の本発明の効果を確認した。
【００５２】
実施例として、脱脂粉乳２．８重量％に乳酸菌ＫＷ３１１０株乾燥菌体を０．０３８重量％（１００ｍｌあたり約３．８×１０１０個に相当）添加し、香味の調整としてグラニュー糖、ペクチン、大豆多糖類、クエン酸、クエン酸ナトリウム、香料を用いて飲料２を調製した後、定法通りＵＨＴ殺菌し、ペットボトルにホットパックした。
【００５３】
次に比較例として、再公表２００４−０９６２４６号公報の実施例１５（スポーツドリンクの製造）に記載されているように、グラニュー糖、クエン酸、クエン酸ナトリウム、香料に乳酸菌ＫＷ３１１０株乾燥菌体を０．０１４３重量％（１００ｍｌあたり約１．４３×１０１０個に相当）添加し、飲料１を調製した後、定法通りＵＨＴ殺菌し、ペットボトルにホットパックした。
【００５４】
得られた飲料を３５℃の条件で０ヶ月、１ヶ月または２ヶ月保存し、保存後、実施例１と同様の方法で菌体分離およびＩＬ−１２を指標とした活性測定を行った。
【００５５】
図２に飲料１および２から分離した菌体の抗アレルギー活性を示す。飲料１では０ヶ月保存時の活性と比べた場合、１ヶ月では２２％程度、２ヶ月の菌体では７５％程度活性が低下していた。それに対して、脱脂粉乳が併存している飲料２では、２ヶ月保存後の活性低下が２０％程度に抑制されていた。
【００５６】
以上の結果から、加速試験の結果から予測されたとおり、実際に２ヶ月という長期間の保存においても、乳酸菌と無脂固形分である脱脂粉乳を併存させることにより、乳酸菌抗アレルギー活性の低下が抑制された。また、飲料１および２はいずれも満足できる香味を持つ飲料の処方であるので、実施例１のように脱イオン水に乳酸菌と脱脂粉乳を添加した場合のみならず、実際の飲料に脱脂粉乳が併存する場合にも乳酸菌抗アレルギー活性低下抑制効果が得られることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
飲料に含まれる乳酸菌の抗アレルギー活性を、長期保存や加熱等の熱履歴があっても維持することができるので、アレルギー疾患の予防、改善効果を高く保持する機能性飲料の開発に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】加速試験における乳酸菌抗アレルギー活性（相対活性）を示す。
【図２】乳酸菌含有飲料と、脱脂粉乳および乳酸菌含有飲料における乳酸菌抗アレルギー活性（相対活性）を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を配合したことを特徴とする飲料。
【請求項２】
乳成分が無脂固形分であることを特徴とする、請求項１に記載の飲料。
【請求項３】
無脂固形分が脱脂粉乳であることを特徴とする、請求項２に記載の飲料。
【請求項４】
脱脂粉乳を０．１〜１５重量％の範囲で配合したことを特徴とする、請求項３に記載の飲料。
【請求項５】
乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラムＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウスＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項６】
乳酸菌乾燥菌体が死菌体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項７】
乳酸菌乾燥菌体を飲料１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲で配合したことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項８】
密封容器入りであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項９】
抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を飲料に配合することを特徴とする、乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制する方法。
【請求項１０】
乳成分が無脂固形分であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
無脂固形分が脱脂粉乳であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脱脂粉乳を０．１〜１５重量％の範囲で配合することを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラムＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウスＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
乳酸菌乾燥菌体が死菌体であることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
乳酸菌乾燥菌体を飲料１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲で配合することを特徴とする、請求項９〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
密封容器に入れることを特徴とする、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１】
抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を配合したことを特徴とする飲料。
【請求項２】
乳成分が無脂固形分であることを特徴とする、請求項１に記載の飲料。
【請求項３】
無脂固形分が脱脂粉乳であることを特徴とする、請求項２に記載の飲料。
【請求項４】
脱脂粉乳を０．１〜１５重量％の範囲で配合したことを特徴とする、請求項３に記載の飲料。
【請求項５】
乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラムＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウスＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項６】
乳酸菌乾燥菌体が死菌体であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項７】
乳酸菌乾燥菌体を飲料１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲で配合したことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項８】
密封容器入りであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の飲料。
【請求項９】
抗アレルギー活性を有する乳酸菌乾燥菌体と乳成分を飲料に配合することを特徴とする、乳酸菌の抗アレルギー活性低下を抑制する方法。
【請求項１０】
乳成分が無脂固形分であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
無脂固形分が脱脂粉乳であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
脱脂粉乳を０．１〜１５重量％の範囲で配合することを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
乳酸菌が、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３１１０株、ラクトバチルス・プランタラムＫＷ４１１０株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２５株、ラクトバチルス・パラカゼイＫＷ３９２６株、ストレプトコッカス・サリバリウスＫＷ３２１０株、およびそれらの派生株からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
乳酸菌乾燥菌体が死菌体であることを特徴とする、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
乳酸菌乾燥菌体を飲料１００ｍｌあたり１０９〜１０１１個の範囲で配合することを特徴とする、請求項９〜１４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
密封容器に入れることを特徴とする、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２００９−１１２２１４（Ｐ２００９−１１２２１４Ａ）
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−２８６４５６（Ｐ２００７−２８６４５６）
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【出願人】（５０７０４５９０４）キリンヤクルトネクストステージ株式会社 (5)
【出願人】（３９１０５８３８１）キリンビバレッジ株式会社 (94)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年１１月２日（２００７．１１．２）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【出願人】（５０７０４５９０４）キリンヤクルトネクストステージ株式会社 (5)
【出願人】（３９１０５８３８１）キリンビバレッジ株式会社 (94)
【Ｆターム（参考）】
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