乳酸菌数計測方法および乳酸菌数計測装置
【課題】乳酸菌含有検体から乳酸菌を効率良く採取し、乳酸菌を正確に検出し計測することを目的とする。
【解決手段】採取フィルタ７で、ろ過抽出した乳酸菌含有検体を蛍光発光色素で染色し、採取フィルタ７を乳酸菌数計測装置の検査台６にセット、励起光を照射し蛍光発光させ、光電変換素子で撮影した画像を面積解析する。面積解析は、発光点の面積および発光輝度から単体の菌と乳酸菌の塊、異物を区別し、乳酸菌と判断した発光点の面積および発光輝度から、乳酸菌の塊りと判断したものを発光面積の大きさにおける乳酸菌数を算出して乳酸菌数を計測する。
【解決手段】採取フィルタ７で、ろ過抽出した乳酸菌含有検体を蛍光発光色素で染色し、採取フィルタ７を乳酸菌数計測装置の検査台６にセット、励起光を照射し蛍光発光させ、光電変換素子で撮影した画像を面積解析する。面積解析は、発光点の面積および発光輝度から単体の菌と乳酸菌の塊、異物を区別し、乳酸菌と判断した発光点の面積および発光輝度から、乳酸菌の塊りと判断したものを発光面積の大きさにおける乳酸菌数を算出して乳酸菌数を計測する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌含有検体の乳酸菌数計測をおこなうための乳酸菌数計測方法および計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来この種の計測および検査方法は、栄養成分が含まれる寒天培地に検体を０．１ｍｌ滴下しコンラージ棒にて塗抹する塗抹寒天培養法、寒天培地が固まらない状態で検体１ｍｌを混釈する混釈培養法、液体培地にて検体を０．１ｍｌもしくは１ｍｌ添加する液体培養法などで培養し、その増殖活性を検出する培養法が用いられている。培養法での検査は、現在最も広く利用されている検出手段であるが、培養に２４〜７２時間かかること、培養条件（温度、時間、培地栄養成分）が一致しない場合は培養することができないことなどが課題として挙げられる。
【０００３】
また、メンブレンフィルターを使用して計測する方法として、アデノシン三リン酸（以下ＡＴＰ）分解酵素を含む溶液をメンブレンフィルターに施した後、乾燥処理をしたメンブレンフィルターに検体中の微生物をろ過捕集し、必要であれば所要時間培養した後、ＡＴＰを抽出するための液体抽出試薬と発光試薬であるルシフェリン・ルシフェラーゼを霧状に噴霧することにより、ルシフェリンとルシフェラーゼがＡＴＰと反応して、１分子のルシフェリンの酸化によって１フォトンの発光をし、その発光を高感度ＣＣＤカメラで撮り込み微生物を計測していた（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平９−５１２７１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような従来の検査法である培養法は、検査の結果が得られるまでに２４〜４８時間またはそれ以上の培養時間が必要となり、生鮮食品などの製造あるいは製品出荷の段階で検査結果待ちを要し、時間的、経済的に大きなデメリットとなっており、場合によっては検査結果が判る前に出荷せざるをえないという課題があり、検体中乳酸菌数を計測するのに要する時間を短時間にすることが要求されている。
【０００６】
また、検体中に乳酸菌と同じように発光する蛍光異物等が含まれる検体の検査においては、乳酸菌と同じように発光する蛍光異物等と乳酸菌の蛍光との明確な差が得られず、正確な乳酸菌数の計測ができないという課題があり、正確な乳酸菌数を計測することが要求されている。
【０００７】
本発明は、従来の課題を解決するものであり、検体中の乳酸菌数を計測するのに要する時間を短時間に、また、メンブレンフィルターに捕集した乳酸菌と異物を判別し、検体中の正確な乳酸菌数を検出する乳酸菌数計測方法および乳酸菌数計測装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の乳酸菌数計測方法および計測装置は上記目的を達成するために、ろ過抽出した乳酸菌含有検体に、励起光を照射し発光点を光電変換素子で撮影した画像を面積解析して乳酸菌数を計測することを特徴とする乳酸菌数計測方法としたものである。
【０００９】
また、面積解析は、発光点の面積および発光輝度から単体の菌と乳酸菌の塊、異物を区別する乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１０】
また、乳酸菌と判断した発光点の面積および発光輝度から、乳酸菌の塊りと判断したものを発光面積の大きさにおける乳酸菌数を算出する乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１１】
また、順次撮影した画像から、乳酸菌の数量を積算する手段を有する乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１２】
また、ろ過抽出した乳酸菌含有検体に染色法を用いる乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１３】
また、ろ過抽出した乳酸菌含有検体のｐＨを調整する乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１４】
また、染色法が蛍光染色法である乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１５】
また、採取フィルタで乳酸菌をろ過抽出し、第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類の試薬を用いて乳酸菌を染色した後、予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって照射されて発光する予め定めたれた波長域の光を前記採取フィルタの設定した一定面積を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し撮影した画像を、その受光した光量が設定したしきい値の範囲で、かつ設定した面積の範囲であるものを乳酸菌と判断する乳酸菌判断手段と、乳酸菌判断手段によって乳酸菌と判断した発光点１個の大きさから、単体の菌と乳酸菌の塊りを判断して、塊りの大きさにおける乳酸菌の数量を算出し、順次積算することで乳酸菌の数量を算出する、前記採取フィルタの１部あるいは全面積の発光点を確認するために、前記採取フィルタあるいは受光手段を移動させる移動手段で、乳酸菌の数量を順次積算する手段を有する乳酸菌数測定方法を行なうための乳酸菌数計測装置としたものである。
【００１６】
また、前記採取フィルタが表面形状の変形しないフィルタである乳酸菌数計測装置としたものである。
【００１７】
また、前記採取フィルタが色落ちしないフィルタである乳酸菌数計測装置としたものである。
【００１８】
また、前記フィルタ上に顔料を担持した乳酸菌数計測装置としたものである。
【００１９】
また、前記採取フィルタが暗色のフィルタである乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２０】
また、前記採取フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成された乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２１】
また、受光手段が、少なくとも乳酸菌の大きさが認識できる面積を有した複数個の光電変換素子である乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２２】
また、光源を１種類あるいは複数種類であり、予め定められた波長域を１種類あるいは複数種類であり、その１種類あるいは複数種類の波長域で照射された発光する光を予め定められた、複数種類の波長域の光を各々受光する受光手段と、各々の波長域での光量の比から発光した点あるいは面積を乳酸菌と判断する乳酸菌判断を有する乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２３】
また、複数種類の光源と複数の波長域を受光する受光手段を１種類あるいは設定した種類の前記光源および受光手段を切替て、設定した種類のみ波長域の光源と受光手段で乳酸菌を検知する乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２４】
また、乳酸菌判断手段によって、設定した面積以上のため微生物以外と認識された発光点の面積を順次積算あるいはその面積を１つと認識して順次個数を積算し、その総面積あるいは総個数が、設定した面積あるいは個数以上のときに注意を表わす注意手段を有した乳酸菌数計測装置としたものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、乳酸菌含有検体において、採取フィルタ上で乳酸菌を捕集することが可能となり、連鎖菌が含まれる乳酸菌においても短時間で検出および計測ができる。
【００２６】
また、採取フィルタに捕集した乳酸菌と異物を判別し、検体中の正確な乳酸菌数を検出および計測ができる。
【００２７】
また、フィルタ形状の変形や脱色しないフィルタであるため、染色法あるいは蛍光染色法での測定であっても、乳酸菌の検出および計測に影響を与えず精度良く乳酸菌検出および計測ができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施の形態２の乳酸菌数計測装置の一態様を示す構成図
【図２】同フローチャート
【図３】同計測フローチャート
【図４】本発明の実施例の蛍光発光画像の顕微鏡写真
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の請求項１記載の乳酸菌数計測方法は、ろ過抽出した乳酸菌含有検体に励起光を照射し発光点を光電変換素子で撮影した画像を面積解析して乳酸菌数を計測することを特徴とする乳酸菌検出方法としたものであり、効率良く簡単な構成で乳酸菌を検出するという作用を有する。
【００３０】
また、面積解析は、発光点の面積および発光輝度から単体の菌と乳酸菌の塊、異物を区別し、検体中の発光物の判断をおこなって計測することができるという作用を有する。
【００３１】
また、乳酸菌と判断した発光点の面積および発光輝度から、乳酸菌の塊りと判断したものを発光面積の大きさにおける乳酸菌数を算出し、順次積算することで、乳酸菌の数量を積算する手段を有するものであり、検体中の乳酸菌濃度を正確に計測することができるという作用を有する。
【００３２】
また、順次撮影した画像から、乳酸菌の数量を積算する手段を有するものであり、検体中の乳酸菌濃度を正確に計測することができるという作用を有する。
【００３３】
また、ろ過抽出した乳酸菌含有検体に染色法を用い乳酸菌を検出するという作用を有する。
【００３４】
また、ろ過抽出した乳酸菌含有検体のｐＨを採取フィルタ表面上で乳酸菌の性質が変化しないように、ｐＨを調整する手段を備える乳酸菌数計測方法としたものであり、検出時の染色性を高め、感度良く乳酸菌を検出することができるという作用を有する。
【００３５】
また、前記採取フィルタ上に捕捉した、乳酸菌を染色法あるいは蛍光染色法で検知あるいはカウントする乳酸菌数計測方法であり、発光した乳酸菌を光学的に計測するという作用を有する。
【００３６】
また、採取フィルタで乳酸菌をろ過抽出し、第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類の試薬を用いて乳酸菌を染色した後、予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって照射されて発光する予め定めたれた波長域の光を前記採取フィルタの設定した一定面積を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し撮影した画像を、その受光した光量が設定したしきい値の範囲で、かつ設定した面積の範囲であるものを乳酸菌と判断する乳酸菌判断手段と、乳酸菌判断手段によって乳酸菌と判断した発光点１個の大きさから、単体の菌と乳酸菌の塊りを判断して、塊りの大きさにおける乳酸菌の数量を算出し、順次積算することで乳酸菌の数量を算出する、前記採取フィルタの１部あるいは全面積の発光点を確認するために、前記採取フィルタあるいは受光手段を移動させる移動手段で、乳酸菌の数量を順次積算する手段を有するものであり、発光した物質と乳酸菌を差別化し計測するという作用を有する。
【００３７】
また、前記フィルタが表面形状の変形しないフィルタである乳酸菌数計測方法としたものであり、フィルタ表面の平面性を高め、乳酸菌の検出位置を明確にし、検出・計測時の装置構成を簡略にすることができるという作用を有する。
【００３８】
また、前記フィルタが、色落ちしない暗色のフィルタとした乳酸菌数計測方法であり、蛍光検出時バックグランドの輝度を抑え、感度を高くするという作用を有する。
【００３９】
また、前記フィルタ上に、金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成されたものである乳酸菌数計測方法であり、乳酸菌検出時に励起光を照射した際の光の反射を防止することができ、乳酸菌の検出および計測を妨害することなく、正確に乳酸菌の検出および計測するという作用を有する。
【００４０】
また、光源を１種類あるいは複数種類であり、予め定められた波長域を１種類あるいは複数種類であり、その１種類あるいは複数種類の波長域で照射された発光する光を予め定められた、複数種類の波長域の光を各々受光する受光手段と、各々の波長域での光量の比から発光した点あるいは面積を乳酸菌と判断し検知するという作用を有する。
【００４１】
また、複数種類の光源と複数の波長域を受光する受光手段を１種類あるいは設定した種類の前記光源および受光手段を切替て、設定した種類のみ波長域の光源と受光手段で乳酸菌を検知するという作用を有する。
【００４２】
また、乳酸菌判断手段によって、設定した面積以上のため乳酸菌以外と認識された発光点の面積を順次積算あるいは、その面積を１つと認識して順次個数を積算し、その総面積あるいは総個数が、設定した面積あるいは個数以上のときに検知し、注意を表わす手段を有する。
【００４３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００４４】
（実施の形態１）
例えば乳酸菌やまた、それを含む各種食品があるが、乳酸菌の検出もしくは計測する場合、従来の検査法である培養法は、検査の結果が得られるまでに２４〜４８時間またはそれ以上の培養時間が必要となり、製造あるいは製品出荷の段階で検査結果待ちを要し、時間的、経済的に大きなデメリットとなっており、場合によっては検査結果が判る前に出荷せざるをえないということもあるため、迅速な乳酸菌の計測が必要となっている。
【００４５】
また、乳製品の成分には、染色試薬や蛍光染色試薬と反応しやすい成分も含まれており、顕微鏡などで観察する場合、非常に難しく、熟練を要する。
【００４６】
通常、微生物をメンブレンフィルタ法で測定するためには、０．２〜０．４μｍのフィルタでろ過を行い、フィルタ上に捕集された微生物を顕微鏡で観察、あるいは、そのフィルタを培地上に載せて培養する。また、食品分野においては、目的とする微生物を捕集でき、且つ、ろ過に影響が少ない０．４μｍの孔径を持つフィルタを用いられることが多い。
【００４７】
また、フィルタの種類はＰＰ（Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ＰＶＣ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ） ＰＣ（Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＰＴＦＥ（Ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ＭＣＥ（Ｍｉｘｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｓｔｅｒｓ）、ＰＥＳ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＮＹＬ（Ｎｙｌｏｎ）などがある。
【００４８】
例えばＰＣの材質のように表面がフラット（±２μｍ以下、好ましくは±１μ以下）で、しかも、放射線を用いて穴をあけており、非常に均一な細孔があいているために、微生物がフィルタ上の表面に埋まることなく捕集されるため、通常用いられている。このようなフィルタは、細孔の柔軟性も悪く、かつ開口率も低いために、細孔以上の粒径の粒子があると、ろ過が困難である。但し、微生物以外の物質や成分がなければ、表面の凹凸も少なく細孔に微生物が埋まることが無い為、その後の顕微鏡観察や特に自動化して機械的に測定する場合においても望ましい。
【００４９】
ろ過した後、染色あるいは蛍光染色した乳酸菌を顕微鏡で観察、自動化した装置で測定する場合、色落ちしない暗色のフィルタを用いることで、精度良く測定することが可能である。暗色とは、黒色あるいはそれに近い色であるが、顕微鏡で観察するときに白色光あるいは紫外光など試薬の特性に応じた特定の波長の光を照射した際に照射した光を吸収しない色であることを示している。上記に示したフィルタの材質は、白または白に近いものが多く、特に紫外線を照射したときに反射あるいは自家蛍光して測定が困難になることがある。フィルタは、水に濡れることで、反射は起こしにくくなるが、水に濡れた状態で反射が防止できていることが、フィルタの色としては重要である。通常フィルタの材料は、暗色であることが少ないため、黒または黒に近い灰色で着色が必要で、その方法としては、色落ちがしにくい顔料や墨汁などが望ましい。
【００５０】
金、銅、クロム、白金、パラジウムなどから選ばれた金属の薄膜をフィルタ表面に蒸着などで被覆することで、反射を防止することができる。特に金は紫外線の反射率が低い。つまり、暗色とは、黒に近い色を示すとともに光の反射が少ないことを示す。
【００５１】
微生物を染色する方法としては、細胞若しくは微生物が付着した検体に第１の試薬である４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と第２の試薬であるプロピュームイオダイドと第３の試薬である６−カルボキシフルオレセインジアセテートと第４の試薬である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドをそれぞれ混合した試薬を接触させる。生死細胞の核酸と結合した４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は、励起波長３５９ｎｍの時に励起波長を吸収して４６１ｎｍの蛍光波長を発し生死細胞の発色させる。また死細胞の核酸と結合したプロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時、励起波長の光量を吸収して６１７ｎｍの蛍光波長に変え死細胞のみを発色させる。
【００５２】
また、他の蛍光試薬として生死細胞用蛍光発光試薬では、例えばＹＴＯ１１〜ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２０〜ＳＹＴＯ２５、ＳＹＴＯ４０〜ＳＹＴＯ４５、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ５９〜ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８０〜ＳＹＴＯ８５、ＤＡＰＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＳＹＴＯ９とがある。また、死細胞用蛍光発光試薬では例えばＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ３、ＳＹＴＯＸＢｌｕｅ、ＳＹＴＯＸＯｒａｎｇｅとがある。蛍光試薬によって、それぞれ励起光の波長を設定することで、試薬と反応した生死細胞、死細胞を蛍光発光することができる。
【００５３】
また、生菌だけが有しているエステラーゼと反応するものや呼吸活性を検知できる試薬を用いて生菌だけを染色するもの、細胞膜を透過しないために細胞膜が損傷を受けて死んだ場合に、そこから透過してＤＮＡなどの核酸と結合して染色することで死菌だけを染色するもの、同様にＤＮＡなどの核酸と結合するもので、細胞膜を透過する性質であるため、生菌と死菌の両方を染色するもの、特定の微生物だけが代謝する特定微生物由来物質と反応することや特定の微生物とのみ反応する蛍光ラベルを有した抗体やマイクロファージで特定の微生物のみを染色するものなどがある。
【００５４】
また、微生物検査を行う場合、サンプル量は多いほど良い。従来の培養法では、０．１ｍｌが最大であるため、ろ過ができることでサンプル量を０．１ｍｌあるいは１ｍｌ以上が可能になり、菌濃度は１ｍｌ当たりの個数として測定するため、サンプル量が多ければ多いほど感度、精度が向上する。
【００５５】
（実施の形態２）
図１は乳酸菌数計測装置の一態様を示す構成図である。この乳酸菌数計測装置は、光源集光手段としてのレンズ１、受光部２を含む。光源３から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ４で分光する。分光された励起光はプリズム５を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ１を経て検査台６に設置された乳酸菌の採取フィルタ７を含む部位、即ち、採取フィルタ７と台座８からなる組合せ体の採取フィルタ７の表面に集光される。そこで励起光によって励起された乳酸菌が有する蛍光は、再びプリズム５を透過し、受光部２に到達する。受光部２に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ９を経て、受光部に内蔵された光電変換素子１０に到達し、信号化され、認識される。また、図に示していないが、この乳酸菌数計測装置は検査台６を移動する手段を備えており、採取フィルタ７の表面の蛍光発光を全て、若しくは一部を受光することができる。
【００５６】
光電変換素子１０に到達した４６１ｎｍと６１７ｎｍの蛍光において、生菌と死菌は４６１ｎｍの蛍光発光しており、更に死菌は６１７ｎｍでも蛍光発光しているので、乳酸菌判断手段１１により、乳酸菌若しくは異物と光の波長の違いを蛍光分光フィルタ９で分光後目的の蛍光波長のみが取り出され光電変換素子１０に到達し、励起波長３５９ｎｍを吸収し励起されて４６１ｎｍで蛍光発光しているものは生菌と死菌を含む乳酸菌と判断され、励起波長５３５ｎｍを吸収し励起され６１７ｎｍで蛍光発光しているものは死菌と判断され、４６１ｎｍと６１７ｎｍの両方で蛍光発光してないものは異物と判断され、乳酸菌と判断された蛍光は積算されて、その数量が計測される。乳酸菌判断手段１１としては、上記判断手順をプログラミングされたマイコン等がある。
【００５７】
光源３より発生した励起光は、レンズ１によって集光されるが、その際レンズ１によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。つまり微小な一定面積とは、乳酸菌判断手段１１にて大きさで乳酸菌と認識できる大きさである。受光部２は、複数の光電変換素子１０でフィルタ全体を一度で画像として撮影しても良いし、微小（一辺が１０μｍ以下）で１個の光電変換素子１０で撮影後、ひとつひとつの画像を組合わせて、最終的に乳酸菌の大きさを認識しても良い。
【００５８】
レンズ１によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する試薬の消光時間と励起光強度に依存する。試薬の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。
【００５９】
発光を検出する際、光源３の波長の幅が広いものである場合は、励起光分光フィルタ４によって励起波長を調整、分光することが可能となる。励起光分光フィルタ４は、目的の検出対象に応じて変えられるため、様々な蛍光を発する試薬に対応できる。
【００６０】
また、同時に、発光した蛍光波長の幅が広いものである場合は、目的の発光を検出するために蛍光分光フィルタ９を目的の検出対象に応じて変えることで様々な蛍光を発する試薬に対応できる。
【００６１】
光源３としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これらの光源のうち、最大励起波長が比較的限定されているダイオード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光分光フィルタ４および蛍光分光フィルタ９を使用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲンランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィルタ４および蛍光分光フィルタ９を使用する必要がある場合がある。
【００６２】
プリズム５およびレンズ１は、必要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光で励起される試薬などにも対応できる。微生物の採取フィルタ７を含む部位を設置する検査台６は回転能を有する。レンズ１により集光された励起光は、微生物の採取フィルタ７の外周部より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分の距離を移動する。その際、レンズ１により集光された励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存在するときで検査台６の回転速度を変化させることによって、レンズ１により集光された励起光が外周部に存在するときと中心部に存在するときで励起された試薬が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防止することができる。
【００６３】
図１に示したように検査台６は採取フィルタ７を含む部位を嵌合させるための陥没部分（装置溝）を有し、ここに採取フィルタ７を含む部位をそのまま組み込むことができる形状としてある。なお、この際、例えば、検査台６に、採取フィルタ７がその上に位置するように金属平板を設け、採取フィルタ７が金属平板に押し付けられるような状態で組み込まれるようにすることで、検査台６上で採取フィルタ７が凹凸なく平滑に保持されるようにすれば、採取フィルタ７に捕集された乳酸菌の定量をより確実なものにすることができる。
【００６４】
なお、集光した位置を認識する手段を設けることでレンズ１によって集光された励起光の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すように設定されるものである。
【００６５】
なお、励起光を照射する微小な一定面積は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円形などでも可能であり、検体を照射できるものであればよい。
【００６６】
なお、励起光もしくは蛍光を分光する手段として回折格子などを利用することも可能である。
【００６７】
なお、検査台６の回転速度を調整することで蛍光の残像および残光を防ぐこととしたが、励起光を照射するレンズ１の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも可能である。
【００６８】
なお、集光した位置を認識する手段は、必ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要は無く、採取フィルタ７上の軌道を把握するものであればよい。
【実施例】
【００６９】
図２は、本発明の乳酸菌含有検体において、乳酸菌検出方法および乳酸菌数計測装置の計測フローチャート図である。
【００７０】
検体染色においては、ステップ１にて採取フィルタ７で乳酸菌含有検体を１ｍｌろ過する。ステップ２にて採取フィルタ７表面の乳酸菌以外の残留成分およびｐＨ調整を生理食塩水３ｍｌにて洗浄除去とｐＨ調整を行なう。ステップ３にて、採取フィルタ７にて捕集された乳酸菌を染色する蛍光染色試薬を０．１ｍｌ滴下し採取フィルタ７全面に広げて２分間染色を行う。染色試薬は乳酸菌のＤＮＡに結合し染色される試薬を用いた。ステップ４にて染色試薬の余剰試薬を生理食塩水にて０．１ｍｌ洗浄を行い検体染色完了となる。
【００７１】
測定においては、ステップ５で微生物の採取フィルタ７を乳酸菌数計測装置の台にセットする。この台については、微生物の採取フィルタ７を計測面にセットすることで平面になる状態に構成されており、それにより安定した計測が可能とすることができる。ステップ６にて計測装置により、採取された乳酸菌の計測が行われ計測完了となる。
【００７２】
蛍光染色して蛍光発光した画像を図４に示す。図に示すように、蛍光発光点の大きさは様々あり、微小な大きさは、顕微鏡にて観察した結果、菌体が１つのものであることが確認できた。微小な発光物以外の大きさの蛍光発光点は、菌体の固まった連鎖菌であることも確認できた。
【００７３】
図３に図１の乳酸菌数計測装置で撮影した１視野の画像について、乳酸菌を計測するフロー図を示す。多数の視野を計測する場合には、このフローを繰り返し、フィルタ全体の面積と測定した面積（視野面積×視野数）の比に計測した乳酸菌数を乗じることでフィルタ全体の乳酸菌数を算出することができる。
【００７４】
なお、実施例では、蛍光色素として、単一の染色を実施したが、二重染色することもできる。
【００７５】
なお、実施例では、余剰試薬の洗浄工程を記載したが、計測時のバックグランドに影響がなければ、余剰試薬を洗浄する工程を除くことができる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の、乳酸菌を含みうる検体において、励起光を照射し撮影した後、形状と面積および発光輝度を面積解析手段で認識させることで乳酸菌の検出を行う、乳酸菌数計測方法および計測装置は、熟練した技能の必要がなく、誰でも容易に計測ができるため、より生産現場に近い所での品質管理に適用できる。また、近年、食品の品質レベルが向上しており、より迅速・高精度・簡単に乳酸菌数を計量できる装置が求められており、従来の検査にかわる方法としても適用できる。
【符号の説明】
【００７７】
１ レンズ
２ 受光部
３ 光源
４ 励起光分光フィルタ
５ プリズム
６ 検査台
７ 採取フィルタ
８ 台座
９ 蛍光分光フィルタ
１０ 光電変換素子
１１ 乳酸菌判断手段
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳酸菌含有検体の乳酸菌数計測をおこなうための乳酸菌数計測方法および計測装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来この種の計測および検査方法は、栄養成分が含まれる寒天培地に検体を０．１ｍｌ滴下しコンラージ棒にて塗抹する塗抹寒天培養法、寒天培地が固まらない状態で検体１ｍｌを混釈する混釈培養法、液体培地にて検体を０．１ｍｌもしくは１ｍｌ添加する液体培養法などで培養し、その増殖活性を検出する培養法が用いられている。培養法での検査は、現在最も広く利用されている検出手段であるが、培養に２４〜７２時間かかること、培養条件（温度、時間、培地栄養成分）が一致しない場合は培養することができないことなどが課題として挙げられる。
【０００３】
また、メンブレンフィルターを使用して計測する方法として、アデノシン三リン酸（以下ＡＴＰ）分解酵素を含む溶液をメンブレンフィルターに施した後、乾燥処理をしたメンブレンフィルターに検体中の微生物をろ過捕集し、必要であれば所要時間培養した後、ＡＴＰを抽出するための液体抽出試薬と発光試薬であるルシフェリン・ルシフェラーゼを霧状に噴霧することにより、ルシフェリンとルシフェラーゼがＡＴＰと反応して、１分子のルシフェリンの酸化によって１フォトンの発光をし、その発光を高感度ＣＣＤカメラで撮り込み微生物を計測していた（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表平９−５１２７１３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような従来の検査法である培養法は、検査の結果が得られるまでに２４〜４８時間またはそれ以上の培養時間が必要となり、生鮮食品などの製造あるいは製品出荷の段階で検査結果待ちを要し、時間的、経済的に大きなデメリットとなっており、場合によっては検査結果が判る前に出荷せざるをえないという課題があり、検体中乳酸菌数を計測するのに要する時間を短時間にすることが要求されている。
【０００６】
また、検体中に乳酸菌と同じように発光する蛍光異物等が含まれる検体の検査においては、乳酸菌と同じように発光する蛍光異物等と乳酸菌の蛍光との明確な差が得られず、正確な乳酸菌数の計測ができないという課題があり、正確な乳酸菌数を計測することが要求されている。
【０００７】
本発明は、従来の課題を解決するものであり、検体中の乳酸菌数を計測するのに要する時間を短時間に、また、メンブレンフィルターに捕集した乳酸菌と異物を判別し、検体中の正確な乳酸菌数を検出する乳酸菌数計測方法および乳酸菌数計測装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の乳酸菌数計測方法および計測装置は上記目的を達成するために、ろ過抽出した乳酸菌含有検体に、励起光を照射し発光点を光電変換素子で撮影した画像を面積解析して乳酸菌数を計測することを特徴とする乳酸菌数計測方法としたものである。
【０００９】
また、面積解析は、発光点の面積および発光輝度から単体の菌と乳酸菌の塊、異物を区別する乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１０】
また、乳酸菌と判断した発光点の面積および発光輝度から、乳酸菌の塊りと判断したものを発光面積の大きさにおける乳酸菌数を算出する乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１１】
また、順次撮影した画像から、乳酸菌の数量を積算する手段を有する乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１２】
また、ろ過抽出した乳酸菌含有検体に染色法を用いる乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１３】
また、ろ過抽出した乳酸菌含有検体のｐＨを調整する乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１４】
また、染色法が蛍光染色法である乳酸菌数計測方法としたものである。
【００１５】
また、採取フィルタで乳酸菌をろ過抽出し、第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類の試薬を用いて乳酸菌を染色した後、予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって照射されて発光する予め定めたれた波長域の光を前記採取フィルタの設定した一定面積を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し撮影した画像を、その受光した光量が設定したしきい値の範囲で、かつ設定した面積の範囲であるものを乳酸菌と判断する乳酸菌判断手段と、乳酸菌判断手段によって乳酸菌と判断した発光点１個の大きさから、単体の菌と乳酸菌の塊りを判断して、塊りの大きさにおける乳酸菌の数量を算出し、順次積算することで乳酸菌の数量を算出する、前記採取フィルタの１部あるいは全面積の発光点を確認するために、前記採取フィルタあるいは受光手段を移動させる移動手段で、乳酸菌の数量を順次積算する手段を有する乳酸菌数測定方法を行なうための乳酸菌数計測装置としたものである。
【００１６】
また、前記採取フィルタが表面形状の変形しないフィルタである乳酸菌数計測装置としたものである。
【００１７】
また、前記採取フィルタが色落ちしないフィルタである乳酸菌数計測装置としたものである。
【００１８】
また、前記フィルタ上に顔料を担持した乳酸菌数計測装置としたものである。
【００１９】
また、前記採取フィルタが暗色のフィルタである乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２０】
また、前記採取フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成された乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２１】
また、受光手段が、少なくとも乳酸菌の大きさが認識できる面積を有した複数個の光電変換素子である乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２２】
また、光源を１種類あるいは複数種類であり、予め定められた波長域を１種類あるいは複数種類であり、その１種類あるいは複数種類の波長域で照射された発光する光を予め定められた、複数種類の波長域の光を各々受光する受光手段と、各々の波長域での光量の比から発光した点あるいは面積を乳酸菌と判断する乳酸菌判断を有する乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２３】
また、複数種類の光源と複数の波長域を受光する受光手段を１種類あるいは設定した種類の前記光源および受光手段を切替て、設定した種類のみ波長域の光源と受光手段で乳酸菌を検知する乳酸菌数計測装置としたものである。
【００２４】
また、乳酸菌判断手段によって、設定した面積以上のため微生物以外と認識された発光点の面積を順次積算あるいはその面積を１つと認識して順次個数を積算し、その総面積あるいは総個数が、設定した面積あるいは個数以上のときに注意を表わす注意手段を有した乳酸菌数計測装置としたものである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によれば、乳酸菌含有検体において、採取フィルタ上で乳酸菌を捕集することが可能となり、連鎖菌が含まれる乳酸菌においても短時間で検出および計測ができる。
【００２６】
また、採取フィルタに捕集した乳酸菌と異物を判別し、検体中の正確な乳酸菌数を検出および計測ができる。
【００２７】
また、フィルタ形状の変形や脱色しないフィルタであるため、染色法あるいは蛍光染色法での測定であっても、乳酸菌の検出および計測に影響を与えず精度良く乳酸菌検出および計測ができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の実施の形態２の乳酸菌数計測装置の一態様を示す構成図
【図２】同フローチャート
【図３】同計測フローチャート
【図４】本発明の実施例の蛍光発光画像の顕微鏡写真
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明の請求項１記載の乳酸菌数計測方法は、ろ過抽出した乳酸菌含有検体に励起光を照射し発光点を光電変換素子で撮影した画像を面積解析して乳酸菌数を計測することを特徴とする乳酸菌検出方法としたものであり、効率良く簡単な構成で乳酸菌を検出するという作用を有する。
【００３０】
また、面積解析は、発光点の面積および発光輝度から単体の菌と乳酸菌の塊、異物を区別し、検体中の発光物の判断をおこなって計測することができるという作用を有する。
【００３１】
また、乳酸菌と判断した発光点の面積および発光輝度から、乳酸菌の塊りと判断したものを発光面積の大きさにおける乳酸菌数を算出し、順次積算することで、乳酸菌の数量を積算する手段を有するものであり、検体中の乳酸菌濃度を正確に計測することができるという作用を有する。
【００３２】
また、順次撮影した画像から、乳酸菌の数量を積算する手段を有するものであり、検体中の乳酸菌濃度を正確に計測することができるという作用を有する。
【００３３】
また、ろ過抽出した乳酸菌含有検体に染色法を用い乳酸菌を検出するという作用を有する。
【００３４】
また、ろ過抽出した乳酸菌含有検体のｐＨを採取フィルタ表面上で乳酸菌の性質が変化しないように、ｐＨを調整する手段を備える乳酸菌数計測方法としたものであり、検出時の染色性を高め、感度良く乳酸菌を検出することができるという作用を有する。
【００３５】
また、前記採取フィルタ上に捕捉した、乳酸菌を染色法あるいは蛍光染色法で検知あるいはカウントする乳酸菌数計測方法であり、発光した乳酸菌を光学的に計測するという作用を有する。
【００３６】
また、採取フィルタで乳酸菌をろ過抽出し、第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類の試薬を用いて乳酸菌を染色した後、予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって照射されて発光する予め定めたれた波長域の光を前記採取フィルタの設定した一定面積を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し撮影した画像を、その受光した光量が設定したしきい値の範囲で、かつ設定した面積の範囲であるものを乳酸菌と判断する乳酸菌判断手段と、乳酸菌判断手段によって乳酸菌と判断した発光点１個の大きさから、単体の菌と乳酸菌の塊りを判断して、塊りの大きさにおける乳酸菌の数量を算出し、順次積算することで乳酸菌の数量を算出する、前記採取フィルタの１部あるいは全面積の発光点を確認するために、前記採取フィルタあるいは受光手段を移動させる移動手段で、乳酸菌の数量を順次積算する手段を有するものであり、発光した物質と乳酸菌を差別化し計測するという作用を有する。
【００３７】
また、前記フィルタが表面形状の変形しないフィルタである乳酸菌数計測方法としたものであり、フィルタ表面の平面性を高め、乳酸菌の検出位置を明確にし、検出・計測時の装置構成を簡略にすることができるという作用を有する。
【００３８】
また、前記フィルタが、色落ちしない暗色のフィルタとした乳酸菌数計測方法であり、蛍光検出時バックグランドの輝度を抑え、感度を高くするという作用を有する。
【００３９】
また、前記フィルタ上に、金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成されたものである乳酸菌数計測方法であり、乳酸菌検出時に励起光を照射した際の光の反射を防止することができ、乳酸菌の検出および計測を妨害することなく、正確に乳酸菌の検出および計測するという作用を有する。
【００４０】
また、光源を１種類あるいは複数種類であり、予め定められた波長域を１種類あるいは複数種類であり、その１種類あるいは複数種類の波長域で照射された発光する光を予め定められた、複数種類の波長域の光を各々受光する受光手段と、各々の波長域での光量の比から発光した点あるいは面積を乳酸菌と判断し検知するという作用を有する。
【００４１】
また、複数種類の光源と複数の波長域を受光する受光手段を１種類あるいは設定した種類の前記光源および受光手段を切替て、設定した種類のみ波長域の光源と受光手段で乳酸菌を検知するという作用を有する。
【００４２】
また、乳酸菌判断手段によって、設定した面積以上のため乳酸菌以外と認識された発光点の面積を順次積算あるいは、その面積を１つと認識して順次個数を積算し、その総面積あるいは総個数が、設定した面積あるいは個数以上のときに検知し、注意を表わす手段を有する。
【００４３】
以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
【００４４】
（実施の形態１）
例えば乳酸菌やまた、それを含む各種食品があるが、乳酸菌の検出もしくは計測する場合、従来の検査法である培養法は、検査の結果が得られるまでに２４〜４８時間またはそれ以上の培養時間が必要となり、製造あるいは製品出荷の段階で検査結果待ちを要し、時間的、経済的に大きなデメリットとなっており、場合によっては検査結果が判る前に出荷せざるをえないということもあるため、迅速な乳酸菌の計測が必要となっている。
【００４５】
また、乳製品の成分には、染色試薬や蛍光染色試薬と反応しやすい成分も含まれており、顕微鏡などで観察する場合、非常に難しく、熟練を要する。
【００４６】
通常、微生物をメンブレンフィルタ法で測定するためには、０．２〜０．４μｍのフィルタでろ過を行い、フィルタ上に捕集された微生物を顕微鏡で観察、あるいは、そのフィルタを培地上に載せて培養する。また、食品分野においては、目的とする微生物を捕集でき、且つ、ろ過に影響が少ない０．４μｍの孔径を持つフィルタを用いられることが多い。
【００４７】
また、フィルタの種類はＰＰ（Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ＰＶＣ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ） ＰＣ（Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＰＴＦＥ（Ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ＭＣＥ（Ｍｉｘｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｓｔｅｒｓ）、ＰＥＳ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＮＹＬ（Ｎｙｌｏｎ）などがある。
【００４８】
例えばＰＣの材質のように表面がフラット（±２μｍ以下、好ましくは±１μ以下）で、しかも、放射線を用いて穴をあけており、非常に均一な細孔があいているために、微生物がフィルタ上の表面に埋まることなく捕集されるため、通常用いられている。このようなフィルタは、細孔の柔軟性も悪く、かつ開口率も低いために、細孔以上の粒径の粒子があると、ろ過が困難である。但し、微生物以外の物質や成分がなければ、表面の凹凸も少なく細孔に微生物が埋まることが無い為、その後の顕微鏡観察や特に自動化して機械的に測定する場合においても望ましい。
【００４９】
ろ過した後、染色あるいは蛍光染色した乳酸菌を顕微鏡で観察、自動化した装置で測定する場合、色落ちしない暗色のフィルタを用いることで、精度良く測定することが可能である。暗色とは、黒色あるいはそれに近い色であるが、顕微鏡で観察するときに白色光あるいは紫外光など試薬の特性に応じた特定の波長の光を照射した際に照射した光を吸収しない色であることを示している。上記に示したフィルタの材質は、白または白に近いものが多く、特に紫外線を照射したときに反射あるいは自家蛍光して測定が困難になることがある。フィルタは、水に濡れることで、反射は起こしにくくなるが、水に濡れた状態で反射が防止できていることが、フィルタの色としては重要である。通常フィルタの材料は、暗色であることが少ないため、黒または黒に近い灰色で着色が必要で、その方法としては、色落ちがしにくい顔料や墨汁などが望ましい。
【００５０】
金、銅、クロム、白金、パラジウムなどから選ばれた金属の薄膜をフィルタ表面に蒸着などで被覆することで、反射を防止することができる。特に金は紫外線の反射率が低い。つまり、暗色とは、黒に近い色を示すとともに光の反射が少ないことを示す。
【００５１】
微生物を染色する方法としては、細胞若しくは微生物が付着した検体に第１の試薬である４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩と第２の試薬であるプロピュームイオダイドと第３の試薬である６−カルボキシフルオレセインジアセテートと第４の試薬である４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシドをそれぞれ混合した試薬を接触させる。生死細胞の核酸と結合した４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩は、励起波長３５９ｎｍの時に励起波長を吸収して４６１ｎｍの蛍光波長を発し生死細胞の発色させる。また死細胞の核酸と結合したプロピデュームイオダイドは、励起波長５３５ｎｍの時、励起波長の光量を吸収して６１７ｎｍの蛍光波長に変え死細胞のみを発色させる。
【００５２】
また、他の蛍光試薬として生死細胞用蛍光発光試薬では、例えばＹＴＯ１１〜ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２０〜ＳＹＴＯ２５、ＳＹＴＯ４０〜ＳＹＴＯ４５、ＳＹＴＯ１７、ＳＹＴＯ５９〜ＳＹＴＯ６４、ＳＹＴＯ８０〜ＳＹＴＯ８５、ＤＡＰＩ、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、ＳＹＴＯ９とがある。また、死細胞用蛍光発光試薬では例えばＰｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎ、ＢＯＢＯ−１、ＹＯＹＯ−１、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−１、ＰＯＰＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ３、ＳＹＴＯＸＢｌｕｅ、ＳＹＴＯＸＯｒａｎｇｅとがある。蛍光試薬によって、それぞれ励起光の波長を設定することで、試薬と反応した生死細胞、死細胞を蛍光発光することができる。
【００５３】
また、生菌だけが有しているエステラーゼと反応するものや呼吸活性を検知できる試薬を用いて生菌だけを染色するもの、細胞膜を透過しないために細胞膜が損傷を受けて死んだ場合に、そこから透過してＤＮＡなどの核酸と結合して染色することで死菌だけを染色するもの、同様にＤＮＡなどの核酸と結合するもので、細胞膜を透過する性質であるため、生菌と死菌の両方を染色するもの、特定の微生物だけが代謝する特定微生物由来物質と反応することや特定の微生物とのみ反応する蛍光ラベルを有した抗体やマイクロファージで特定の微生物のみを染色するものなどがある。
【００５４】
また、微生物検査を行う場合、サンプル量は多いほど良い。従来の培養法では、０．１ｍｌが最大であるため、ろ過ができることでサンプル量を０．１ｍｌあるいは１ｍｌ以上が可能になり、菌濃度は１ｍｌ当たりの個数として測定するため、サンプル量が多ければ多いほど感度、精度が向上する。
【００５５】
（実施の形態２）
図１は乳酸菌数計測装置の一態様を示す構成図である。この乳酸菌数計測装置は、光源集光手段としてのレンズ１、受光部２を含む。光源３から発せられた励起光から目的の波長を取り出すために励起光分光フィルタ４で分光する。分光された励起光はプリズム５を経て、光路を変化させられる。光路を変化させられた励起光はレンズ１を経て検査台６に設置された乳酸菌の採取フィルタ７を含む部位、即ち、採取フィルタ７と台座８からなる組合せ体の採取フィルタ７の表面に集光される。そこで励起光によって励起された乳酸菌が有する蛍光は、再びプリズム５を透過し、受光部２に到達する。受光部２に到達した蛍光は、目的の蛍光のみを取り出すために蛍光分光フィルタ９を経て、受光部に内蔵された光電変換素子１０に到達し、信号化され、認識される。また、図に示していないが、この乳酸菌数計測装置は検査台６を移動する手段を備えており、採取フィルタ７の表面の蛍光発光を全て、若しくは一部を受光することができる。
【００５６】
光電変換素子１０に到達した４６１ｎｍと６１７ｎｍの蛍光において、生菌と死菌は４６１ｎｍの蛍光発光しており、更に死菌は６１７ｎｍでも蛍光発光しているので、乳酸菌判断手段１１により、乳酸菌若しくは異物と光の波長の違いを蛍光分光フィルタ９で分光後目的の蛍光波長のみが取り出され光電変換素子１０に到達し、励起波長３５９ｎｍを吸収し励起されて４６１ｎｍで蛍光発光しているものは生菌と死菌を含む乳酸菌と判断され、励起波長５３５ｎｍを吸収し励起され６１７ｎｍで蛍光発光しているものは死菌と判断され、４６１ｎｍと６１７ｎｍの両方で蛍光発光してないものは異物と判断され、乳酸菌と判断された蛍光は積算されて、その数量が計測される。乳酸菌判断手段１１としては、上記判断手順をプログラミングされたマイコン等がある。
【００５７】
光源３より発生した励起光は、レンズ１によって集光されるが、その際レンズ１によって励起光を照射する範囲は微小な一定面積に集光される。この場合、微小な一定面積とは微生物の大きさに基づいて設定した場合、一辺０．２μｍ乃至７．０μｍ程度の範囲を指し示す。また、現在最も利用されている微生物検出手段の一つである寒天培地拡散法との比較に基づいた場合、寒天培地拡散法によって培養、増殖した微生物の集団によって形成されるコロニーは、その距離が近接している場合、コロニー同士が重なり合う場合があり、最終的に目視で確認した場合、一つのコロニーとして認識してしまう事例が生ずる場合がある。そこで、この場合の微小な一定面積とは、コロニー同士が重なり合わない距離に基づいた場合、一辺１００μｍ乃至５００μｍ程度の範囲を指し示す。つまり微小な一定面積とは、乳酸菌判断手段１１にて大きさで乳酸菌と認識できる大きさである。受光部２は、複数の光電変換素子１０でフィルタ全体を一度で画像として撮影しても良いし、微小（一辺が１０μｍ以下）で１個の光電変換素子１０で撮影後、ひとつひとつの画像を組合わせて、最終的に乳酸菌の大きさを認識しても良い。
【００５８】
レンズ１によって集光された励起光の照射時間は、蛍光を発する試薬の消光時間と励起光強度に依存する。試薬の種類によっては、自然界に存在する紫外光によっても分解する場合があり、２秒乃至３００秒前後の範囲内で励起光を照射することが望ましい。
【００５９】
発光を検出する際、光源３の波長の幅が広いものである場合は、励起光分光フィルタ４によって励起波長を調整、分光することが可能となる。励起光分光フィルタ４は、目的の検出対象に応じて変えられるため、様々な蛍光を発する試薬に対応できる。
【００６０】
また、同時に、発光した蛍光波長の幅が広いものである場合は、目的の発光を検出するために蛍光分光フィルタ９を目的の検出対象に応じて変えることで様々な蛍光を発する試薬に対応できる。
【００６１】
光源３としては、各種ダイオード、ハロゲンランプ、キセノンランプ、冷陰極管、レーザー、ブラックライト、水銀ランプなどが挙げられる。これらの光源のうち、最大励起波長が比較的限定されているダイオード、冷陰極管、ブラックライトなどは、前記励起光分光フィルタ４および蛍光分光フィルタ９を使用することなく実施できる場合がある。また、ハロゲンランプ、水銀ランプなどについては、励起光分光フィルタ４および蛍光分光フィルタ９を使用する必要がある場合がある。
【００６２】
プリズム５およびレンズ１は、必要に応じてそれぞれ紫外光を透過する性質を有する。紫外光を透過する性質を有するものとしては石英ガラスなどが挙げられる。これにより紫外光で励起される試薬などにも対応できる。微生物の採取フィルタ７を含む部位を設置する検査台６は回転能を有する。レンズ１により集光された励起光は、微生物の採取フィルタ７の外周部より中心部へ、若しくは、中心部より外周部へ、半径分の距離を移動する。その際、レンズ１により集光された励起光の位置が外周部に存在するときと中心部に存在するときで検査台６の回転速度を変化させることによって、レンズ１により集光された励起光が外周部に存在するときと中心部に存在するときで励起された試薬が発した蛍光のずれ、残像および残光の発生を防止することができる。
【００６３】
図１に示したように検査台６は採取フィルタ７を含む部位を嵌合させるための陥没部分（装置溝）を有し、ここに採取フィルタ７を含む部位をそのまま組み込むことができる形状としてある。なお、この際、例えば、検査台６に、採取フィルタ７がその上に位置するように金属平板を設け、採取フィルタ７が金属平板に押し付けられるような状態で組み込まれるようにすることで、検査台６上で採取フィルタ７が凹凸なく平滑に保持されるようにすれば、採取フィルタ７に捕集された乳酸菌の定量をより確実なものにすることができる。
【００６４】
なお、集光した位置を認識する手段を設けることでレンズ１によって集光された励起光の位置を認識し、集光が軌道から逸れないように、また、逸れた場合は再び軌道に戻すように設定されるものである。
【００６５】
なお、励起光を照射する微小な一定面積は、正方形を含む多角形に限らず、円形、楕円形などでも可能であり、検体を照射できるものであればよい。
【００６６】
なお、励起光もしくは蛍光を分光する手段として回折格子などを利用することも可能である。
【００６７】
なお、検査台６の回転速度を調整することで蛍光の残像および残光を防ぐこととしたが、励起光を照射するレンズ１の移動速度を調整することで残像および残光を防ぐことも可能である。
【００６８】
なお、集光した位置を認識する手段は、必ずしも励起光の集光位置を直接認識する必要は無く、採取フィルタ７上の軌道を把握するものであればよい。
【実施例】
【００６９】
図２は、本発明の乳酸菌含有検体において、乳酸菌検出方法および乳酸菌数計測装置の計測フローチャート図である。
【００７０】
検体染色においては、ステップ１にて採取フィルタ７で乳酸菌含有検体を１ｍｌろ過する。ステップ２にて採取フィルタ７表面の乳酸菌以外の残留成分およびｐＨ調整を生理食塩水３ｍｌにて洗浄除去とｐＨ調整を行なう。ステップ３にて、採取フィルタ７にて捕集された乳酸菌を染色する蛍光染色試薬を０．１ｍｌ滴下し採取フィルタ７全面に広げて２分間染色を行う。染色試薬は乳酸菌のＤＮＡに結合し染色される試薬を用いた。ステップ４にて染色試薬の余剰試薬を生理食塩水にて０．１ｍｌ洗浄を行い検体染色完了となる。
【００７１】
測定においては、ステップ５で微生物の採取フィルタ７を乳酸菌数計測装置の台にセットする。この台については、微生物の採取フィルタ７を計測面にセットすることで平面になる状態に構成されており、それにより安定した計測が可能とすることができる。ステップ６にて計測装置により、採取された乳酸菌の計測が行われ計測完了となる。
【００７２】
蛍光染色して蛍光発光した画像を図４に示す。図に示すように、蛍光発光点の大きさは様々あり、微小な大きさは、顕微鏡にて観察した結果、菌体が１つのものであることが確認できた。微小な発光物以外の大きさの蛍光発光点は、菌体の固まった連鎖菌であることも確認できた。
【００７３】
図３に図１の乳酸菌数計測装置で撮影した１視野の画像について、乳酸菌を計測するフロー図を示す。多数の視野を計測する場合には、このフローを繰り返し、フィルタ全体の面積と測定した面積（視野面積×視野数）の比に計測した乳酸菌数を乗じることでフィルタ全体の乳酸菌数を算出することができる。
【００７４】
なお、実施例では、蛍光色素として、単一の染色を実施したが、二重染色することもできる。
【００７５】
なお、実施例では、余剰試薬の洗浄工程を記載したが、計測時のバックグランドに影響がなければ、余剰試薬を洗浄する工程を除くことができる。
【産業上の利用可能性】
【００７６】
本発明の、乳酸菌を含みうる検体において、励起光を照射し撮影した後、形状と面積および発光輝度を面積解析手段で認識させることで乳酸菌の検出を行う、乳酸菌数計測方法および計測装置は、熟練した技能の必要がなく、誰でも容易に計測ができるため、より生産現場に近い所での品質管理に適用できる。また、近年、食品の品質レベルが向上しており、より迅速・高精度・簡単に乳酸菌数を計量できる装置が求められており、従来の検査にかわる方法としても適用できる。
【符号の説明】
【００７７】
１ レンズ
２ 受光部
３ 光源
４ 励起光分光フィルタ
５ プリズム
６ 検査台
７ 採取フィルタ
８ 台座
９ 蛍光分光フィルタ
１０ 光電変換素子
１１ 乳酸菌判断手段
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ろ過抽出した乳酸菌含有検体に励起光を照射し発光点を光電変換素子で撮影した画像を面積解析して乳酸菌数を計測する乳酸菌数計測方法。
【請求項２】
面積解析は、発光点の面積および発光輝度から単体の菌と乳酸菌の塊、異物を区別する請求項１記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項３】
乳酸菌と判断した発光点の面積および発光輝度から、乳酸菌の塊りと判断したものを発光面積の大きさにおける乳酸菌数を算出する請求項１または２記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項４】
順次撮影した画像から、乳酸菌の数量を積算する手段を有する請求項１乃至３のいずれかに記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項５】
ろ過抽出した乳酸菌含有検体に染色法を用いる、請求項１乃至４のいずれかに記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項６】
ろ過抽出した乳酸菌含有検体のｐＨを調整する請求項１乃至５のいずれかに記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項７】
染色法が蛍光染色法である請求項５または６記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項８】
採取フィルタで乳酸菌をろ過抽出し、第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類の試薬を用いて乳酸菌を染色した後、予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって照射されて発光する予め定めたれた波長域の光を前記採取フィルタの設定した一定面積を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し撮影した画像を、その受光した光量が設定したしきい値の範囲で、かつ設定した面積の範囲であるものを乳酸菌と判断する乳酸菌判断手段と、乳酸菌判断手段によって乳酸菌と判断した発光点１個の大きさから、単体の菌と乳酸菌の塊りを判断して、塊りの大きさにおける乳酸菌の数量を算出し、順次積算することで乳酸菌の数量を算出する、前記採取フィルタの１部あるいは全面積の発光点を確認するために、前記採取フィルタあるいは受光手段を移動させる移動手段で、乳酸菌の数量を順次積算する手段を有する乳酸菌数測定方法を行なうための乳酸菌数計測装置。
【請求項９】
前記採取フィルタが表面形状の変形しないフィルタである請求項８記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１０】
前記採取フィルタが色落ちしないフィルタである請求項８または９記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１１】
前記フィルタ上に顔料を担持した請求項８乃至１０のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１２】
前記採取フィルタが暗色のフィルタである請求項８乃至１１のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１３】
前記採取フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成された請求項８乃至１２のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１４】
受光手段が、少なくとも乳酸菌の大きさが認識できる面積を有した複数個の光電変換素子である８乃至１３のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１５】
光源は少なくとも１種類以上であり、光源の波長域を少なくとも１種類以上とし、受光手段は各々の波長域で照射された発光する光を各々の波長域別に各々受光し、各々の波長域での光量の比から発光した点あるいは面積を乳酸菌と判断する請求項８乃至１４のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１６】
複数種類の光源と複数の波長域を受光する受光手段を１種類あるいは設定した種類の前記光源および受光手段を切替て、設定した波長域の光源と受光手段で乳酸菌を検知する請求項８乃至１５のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１７】
乳酸菌判断手段によって、設定した面積以上のため微生物以外と認識された発光点の面積を順次積算あるいはその面積を１つと認識して順次個数を積算し、その総面積あるいは総個数が、設定した面積あるいは個数以上のときに注意を表わす注意手段を有した請求項１５乃至１６のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１】
ろ過抽出した乳酸菌含有検体に励起光を照射し発光点を光電変換素子で撮影した画像を面積解析して乳酸菌数を計測する乳酸菌数計測方法。
【請求項２】
面積解析は、発光点の面積および発光輝度から単体の菌と乳酸菌の塊、異物を区別する請求項１記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項３】
乳酸菌と判断した発光点の面積および発光輝度から、乳酸菌の塊りと判断したものを発光面積の大きさにおける乳酸菌数を算出する請求項１または２記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項４】
順次撮影した画像から、乳酸菌の数量を積算する手段を有する請求項１乃至３のいずれかに記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項５】
ろ過抽出した乳酸菌含有検体に染色法を用いる、請求項１乃至４のいずれかに記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項６】
ろ過抽出した乳酸菌含有検体のｐＨを調整する請求項１乃至５のいずれかに記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項７】
染色法が蛍光染色法である請求項５または６記載の乳酸菌数計測方法。
【請求項８】
採取フィルタで乳酸菌をろ過抽出し、第１の試薬と、第２の試薬と、第３の試薬と、第４の試薬の中でいずれか１種類あるいは複数種類の試薬を用いて乳酸菌を染色した後、予め定められた波長域で励起光を照射する光源と、前記励起光によって照射されて発光する予め定めたれた波長域の光を前記採取フィルタの設定した一定面積を受光する受光手段と、前記光源によって照射されて発光した光を設定した一定の時間内に受光し撮影した画像を、その受光した光量が設定したしきい値の範囲で、かつ設定した面積の範囲であるものを乳酸菌と判断する乳酸菌判断手段と、乳酸菌判断手段によって乳酸菌と判断した発光点１個の大きさから、単体の菌と乳酸菌の塊りを判断して、塊りの大きさにおける乳酸菌の数量を算出し、順次積算することで乳酸菌の数量を算出する、前記採取フィルタの１部あるいは全面積の発光点を確認するために、前記採取フィルタあるいは受光手段を移動させる移動手段で、乳酸菌の数量を順次積算する手段を有する乳酸菌数測定方法を行なうための乳酸菌数計測装置。
【請求項９】
前記採取フィルタが表面形状の変形しないフィルタである請求項８記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１０】
前記採取フィルタが色落ちしないフィルタである請求項８または９記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１１】
前記フィルタ上に顔料を担持した請求項８乃至１０のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１２】
前記採取フィルタが暗色のフィルタである請求項８乃至１１のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１３】
前記採取フィルタ上に金、銅、クロム、白金、パラジウムから選ばれる少なくとも１種類の金属成分を含む薄膜が形成された請求項８乃至１２のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１４】
受光手段が、少なくとも乳酸菌の大きさが認識できる面積を有した複数個の光電変換素子である８乃至１３のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１５】
光源は少なくとも１種類以上であり、光源の波長域を少なくとも１種類以上とし、受光手段は各々の波長域で照射された発光する光を各々の波長域別に各々受光し、各々の波長域での光量の比から発光した点あるいは面積を乳酸菌と判断する請求項８乃至１４のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１６】
複数種類の光源と複数の波長域を受光する受光手段を１種類あるいは設定した種類の前記光源および受光手段を切替て、設定した波長域の光源と受光手段で乳酸菌を検知する請求項８乃至１５のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【請求項１７】
乳酸菌判断手段によって、設定した面積以上のため微生物以外と認識された発光点の面積を順次積算あるいはその面積を１つと認識して順次個数を積算し、その総面積あるいは総個数が、設定した面積あるいは個数以上のときに注意を表わす注意手段を有した請求項１５乃至１６のいずれかに記載の乳酸菌数計測装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２０１０−２４６４４２（Ｐ２０１０−２４６４４２Ａ）
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−９７８４７（Ｐ２００９−９７８４７）
【出願日】平成２１年４月１４日（２００９．４．１４）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年１１月４日（２０１０．１１．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年４月１４日（２００９．４．１４）
【出願人】（０００００５８２１）パナソニック株式会社 (73,050)
【Ｆターム（参考）】
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