二置換フタラジンヘッジホッグ経路アンタゴニスト
本発明は、癌の治療において有用な新規１，４−二置換フタラジンヘッジホッグ経路アンタゴニストを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト、より具体的には、新規１，４−二置換フタラジン、及びその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は、細胞の分化及び増殖を導くことにより、胚のパターン形成及び成体組織の維持において重要な役割を果たしている。ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、及びデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）を含むヘッジホッグ（Ｈｈ）タンパク質ファミリーは、自己触媒的切断及びコレステロールのアミノ末端ペプチドへのカップリングを含む翻訳後修飾を受けて、シグナル伝達活性を有する断片を形成する分泌糖タンパク質である。Ｈｈは、１２回膜貫通型タンパク質Ｐｔｃｈ（Ｐｔｃｈ１及びＰｔｃｈ２）に結合して、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）のＰｔｃｈ介在性抑制を軽減する。Ｓｍｏの活性化は、Ｇｌｉ転写因子（Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、及びＧｌｉ３）を安定化させ、且つ細胞増殖、細胞生存、血管形成、及び侵入に関与するＧｌｉ依存性遺伝子を発現させる一連の細胞内事象を誘発する。
【０００３】
Ｈｈシグナル伝達は、近年、Ｓｈｈシグナル伝達の異常な活性化が、種々の腫瘍、例えば、膵癌、髄芽腫、基底細胞癌、小細胞肺癌、及び前立腺癌の形成を導くという発見に基づいて、大きな注目を集めている。特許文献１は、ヘッジホッグアンタゴニストであると主張されている特定の１，４−二置換フタラジン化合物を開示している。同様に、特許文献２は、ヘッジホッグ経路関連病態の診断及び治療に関連する特定の１，４−二置換フタラジン化合物を開示している。特許文献３は、不適切なヘッジホッグシグナル伝達により推進される全ての腫瘍に対する治療の選択肢であると主張されている特定の１，４−二置換フタラジン化合物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５０３３２８８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８１１０６１１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００９００２４６９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
強力なヘッジホッグ経路阻害剤、特に所望の毒物学的プロファイルを有するものが、依然として必要とされている。本発明は、この経路の強力なアンタゴニストである新規１，４−二置換フタラジンを提供する。本発明の特定の化合物は、可逆的な及び／又は作用機序に基づいた不可逆的なＣＹＰ３Ａ４阻害能に関する望ましい薬物−薬物相互作用及び関連する安全性プロファイルを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ１は、水素又はメチルであり；Ｒ２は、水素又はメチルであり；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７は、独立して、水素、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、メチルスルホニル、又はトリフルオロメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも３つは水素である）の化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。
【０００７】
また、本発明は薬学的に許容できる賦形剤、担体、又は希釈剤と共に、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物を提供する。
【０００８】
また、本発明は、哺乳動物における脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される癌を治療する方法であって、前記哺乳動物に有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
更に、本発明は、治療において使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。また、本発明は、癌の治療において使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。具体的には、前記癌は、脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される。
【００１０】
また、本発明は、治療における式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩の使用を提供する。更に、本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩の使用を提供する。具体的には、前記癌は、脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される。
【００１１】
更に、本発明は、脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される癌を治療するための活性成分として、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
具体的な式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩は、以下のものである：
（ａ）Ｒ１が、メチルである；
（ｂ）Ｒ２が、メチルである；
（ｃ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７が、独立して、水素、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルである；
（ｄ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７が、独立して、水素、フルオロ、又はトリフルオロメチルである；
（ｅ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも２つが、独立して、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ３及びＲ７が同時に水素であることはない；
（ｆ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも２つが、独立して、フルオロ又はトリフルオロメチルであるが、但し、Ｒ３及びＲ７が同時に水素であることはない；
（ｇ）Ｒ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；
（ｈ）Ｒ３及びＲ５が、独立して、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；
（ｉ）Ｒ３及びＲ５が、独立して、フルオロ又はトリフルオロメチルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；
（ｊ）Ｒ１が、メチルであり；且つＲ２が、メチルである；
（ｋ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；且つＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７が、独立して、水素、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルである；
（ｌ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；且つＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７が、独立して、水素、フルオロ、又はトリフルオロメチルである；
（ｍ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；且つＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも２つが、独立して、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ３及びＲ７が同時に水素であることはない；
（ｎ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも２つが、独立して、フルオロ又はトリフルオロメチルであるが、但し、Ｒ３及びＲ７が同時に水素であることはない；
（ｏ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；
（ｐ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；Ｒ３及びＲ５が、独立して、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；並びに
（ｑ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；Ｒ３及びＲ５が、独立して、フルオロ又はトリフルオロメチルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上記で使用されたとき、及び本発明の明細書全体にわたって、特に指示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００１４】
「薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤」は、哺乳動物、例えばヒトに生理活性物質を送達するために当技術分野において一般的に許容されている媒体である。
【００１５】
「薬学的に許容できる塩」は、本発明の化合物の比較的無毒な無機及び有機塩を指す。
【００１６】
「治療上有効量」又は「有効量」は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医によって求められている、組織、系、動物、哺乳動物若しくはヒトの生物学的若しくは医学的応答、又は前記組織、系、動物、哺乳動物若しくはヒトに対する望ましい治療効果を誘発する本発明の式Ｉの化合物若しくはその薬学的に許容できる塩、又は本発明の式Ｉの化合物若しくはその薬学的に許容できる塩を含有する医薬組成物の量を意味する。
【００１７】
用語「治療」、「治療する」、「治療している」等は、障害の進行の減速又は逆行を含むことを意味する。また、これらの用語は、たとえ実際に障害や状態を排除しなくても、障害又は状態の進行それ自体を減速又は逆行させなくても、障害又は状態のうちの１つ以上の病徴を軽減、回復、減弱、排除、又は緩和することを含む。
【００１８】
この開示全体にわたって使用される標準的な命名法の下では、指定の側鎖の末端部を先ず記載し、続いて結合点に向かって隣接する官能基を記載する。例えば、メチルスルホニル置換基はＣＨ３−ＳＯ２−に相当する。
【００１９】
本発明の化合物は、例えば、多くの無機及び有機酸と反応して、薬学的に許容できる酸付加塩を形成することができる。かかる薬学的に許容できる塩、及びそれを調製する慣用的な方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ６６，Ｎｏ．１，１９７７年，１月を参照。
【００２０】
本発明の化合物は、好ましくは、薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を用いて医薬組成物として製剤化され、様々な経路によって投与される。好ましくは、かかる組成物は、経口又は静脈内投与用である。かかる医薬組成物及びそれを調製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら編，第１９版，Ｍａｃｋ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，１９９５）を参照。
【００２１】
実際に投与される化合物は、治療される症状、選択される投与経路、投与される実際の化合物（１又は複数）、個々の患者の年齢、体重及び応答、並びに患者の病徴の重篤度を含む関連状況に基づいて、医師により決定される。１日当たりの投与量は、通常、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内に入る。ある場合には、前述の範囲の下限を下回る投与量レベルであっても十分な量を超えている場合もあり、他の場合には、更に多い投与量が用いられる場合もある。
【００２２】
式Ｉの化合物、又はその塩は、当該技術分野において既知である様々な手順、並びに以下のスキーム、調製例、及び実施例に記載される手順により調製することができる。式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を調製するために、記載される経路の各々についての特定の合成工程を様々な方法で組み合わせてもよい。
【００２３】
置換基は、特に指示しない限り、既に定義した通りである。試薬及び出発物質は、概して、当業者が容易に入手可能なものである。他の試薬及び出発物質は、有機化学及び複素環化学の標準的な技術、既知の構造的に類似している化合物の合成に類似する技術、並びに任意の新規手順を含む以下の調製例及び実施例に記載される手順によって作製することができる。以下の調製例及び実施例の命名は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ１０．０におけるＳｔｒｕｃｔ＝Ｎａｍｅ命名機能を使用して行う。
【００２４】
本明細書で使用するとき、以下の用語は、指定される意味を有する：「Ｅｔ２Ｏ」は、ジエチルエーテルを指し；「ＤＭＦ」は、ジメチルホルムアミドを指し；「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し；「ＤＭＡＣ」は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを指し；「ＮＭＰ」はＮ−メチルピロリジンを指し；「ＭｅＯＨ」は、メタノールを指し；「ｂｏｃ」又は「ｔ−ｂｏｃ」は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを指し；「ＩＣ５０」は、ある剤が可能である最大阻害反応の５０％を生じさせる前記剤の濃度を指す。
【００２５】
【化２】
【００２６】
式Ｉの化合物は、スキームに図示されている反応に従って調製することができる。
【００２７】
工程１では、芳香族求核置換（ＳＮＡｒ）においてジハロ置換フタラジン（１）（Ｘ＝Ｃｌ又はＢｒ）と４−アミノｂｏｃで保護されたピペリジン（２）とを反応させて式（３）のハロピペリジルフタラジンを得る。この反応は、有機又は無機塩基の存在下において、ＤＭＦ、ＤＭＡＣ又はＮＭＰ等の二極性の非プロトン性溶媒中にて進行する。好ましくは、前記反応は５０〜１４０℃の温度で、炭酸カリウムの存在下において、ＮＭＰ中にて起こる。
【００２８】
工程２では、式（３）のハロピペリジルフタラジンとピラゾールボロン酸エステル又は酸（４）とのスズキクロスカップリング反応が生じる。例えば、ハロピペリジルフタラジン（３）は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム等のパラジウム触媒、及び重炭酸ナトリウム等の無機塩基の存在下で、１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−ボロン酸ピナコールエステルと組み合わせられる。前記反応はトルエン／エタノール／水の溶媒混合物中にて進行して、式（５）のピラゾリルフタラジンが得られる。
【００２９】
工程３は、式（６）のアミノピペリジニルフタラジンを得るためにジエチルエーテル又はジオキサン中ＨＣｌ等の酸性条件下で行われる単なるｂｏｃ脱保護である。窒素及び酸素保護基を導入及び除去する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９９年）を参照）。
【００３０】
工程４では、式（６）のアミノピペリジニルフタラジンをアシル化して、式Ｉのピペリジニルアミドを得る。１つの方法では、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基の存在下で、ジクロロメタン等の不活性溶媒中にて、アミンを適切に置換された塩化ベンゾイルと反応させる。或いは、適切に置換された安息香酸を使用して、アミドを形成させる。アミンとの反応に続いて、ペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィン酸塩を使用して、活性エステルを形成させる。前記反応は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基の存在下において、約−１０〜１００℃の温度で、ＤＭＦ／ＤＭＳＯの溶媒混合物中にて進行する。
【００３１】
調製例１
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
【化３】
Ｎ−メチルピロリジン（２００ｍＬ）中炭酸カリウム（２１．２３ｇ、１５３．６ｍｍｏｌ）、１，４−ジクロロフタラジン（２６ｇ、１２８ｍｍｏｌ）及びメチル−ピペリジン−４−イルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３０．０１ｇ、１３４．４ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で一晩加熱する。前記反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。ジエチルエーテルを添加し、生じた固体（出発物質の不純物に由来する４−クロロフタラジン−１−オール）を濾し取る。濾液を濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）によって精製して、白色の固体（１７．６６ｇ、３７％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３７Ｃｌ）３７７．０（Ｍ＋１）。
【００３２】
調製例２
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イルカルバメート
【化４】
ピペリジン−４−イル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを使用して、調製例１に記載された手順に本質的に従って表題化合物を調製する。反応混合物を冷却し、水（５００ｍＬ）に注ぐ。酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去して、黄色の固体（３６ｇ、９７％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３６３．０（Ｍ＋１）。
【００３３】
調製例３
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメート
【化５】
トルエン（５０ｍＬ）、エタノール（１７ｍＬ）及び水（１７ｍＬ）の混合物を含むフラスコに、炭酸ナトリウム（３．８２ｇ、３６．０９ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（６．８ｇ、１８．０４ｍｍｏｌ）及び１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−ボロン酸ピナコールエステル（５．６３ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）を入れる。窒素ガスで１０分間混合物を脱気する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．４ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を７４℃で一晩加熱する。混合物を周囲温度に冷却し、ジクロロメタンで希釈する。有機部分をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：ＭｅＯＨ中２Ｍ ＮＨ３＝２０：５：１）によって精製して、黄色の発泡体（５．３３ｇ、７０％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４２３．２（Ｍ＋１）。
【００３４】
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメートを調製するための代替手順：調製例４〜６
【００３５】
調製例４
１，４−ジブロモフタラジン
【化６】
圧力管に五臭化リン（２４．５ｇ、５４．１ｍｍｏｌ）及び２，３−ジヒドロ−フタラジン−１，４−ジオン（５．００ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）を充填する。前記管を密閉し、１４０℃で６〜７時間加熱する。一晩冷却する。圧力を作用させて前記管を慎重に開ける。固体を削り取り（Ｃｈｉｓｅｌ ｏｕｔ）、氷水へ注ぐ。氷水中で撹拌し、生じる固体を吸引濾過によって回収する。真空オーブンにおいて乾燥させて、最終生成物（８．３１ｇ、９３％）を得る。ＥＳ／ＭＳ（７９Ｂｒ，８１Ｂｒ）ｍ／ｚ ２８８．８（Ｍ＋）。Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９６５，４３，２７０８を参照されたい。
【００３６】
調製例５
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−ブロモフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
【化７】
１，４−ジブロモフタラジン（０．７０ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルピロリドン（７．０ｍＬ）、炭酸カリウム（３９５ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ）及びメチル−ピペリジン−４−イル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５３２ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を合わせる。８０℃で一晩加熱する。冷却し、水に注ぐ。固体を回収し、周囲温度で一晩真空オーブンにおいて乾燥させて、最終生成物（０．９６ｇ、９５％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（８１Ｂｒ）４２１．０（Ｍ＋１）。
【００３７】
調製例６
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメート
【化８】
反応管にｔｅｒｔ−ブチル１−（４−ブロモフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（５００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−ボロン酸ピナコールエステル（３７０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２５２ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）、トルエン（３．７５ｍＬ）、エタノール（１．２５ｍＬ）及び水（１．２５ｍＬ）を充填する。１０分間窒素で反応混合物を脱気する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１３７．１ｍｇ、１１８．７μｍｏｌ）を添加する。更に１０分間、反応混合物を窒素でバブリングする。反応バイアルに蓋をし、９０℃で一晩加熱する。反応物を冷却し、シリカゲルパッドを通して濾過し、５％のＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で溶出する。この画分を減圧下で濃縮する。生じる残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ中の２％の２Ｎ ＮＨ３：ＣＨ２Ｃｌ２）を用いて精製して、最終生成物（３４５．６ｍｇ、６９％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４２３．２（Ｍ＋１）。
【００３８】
調製例７
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−（１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
【化９】
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート及び１Ｈ−ピラゾール−３−ボロン酸ピナコールエステルを使用して、調製例３に記載された手順に本質的に従って表題化合物を調製し、５８０ｍｇ（６７％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４０９．２（Ｍ＋１）。
【００３９】
調製例８
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イルカルバメート
【化１０】
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イルカルバメートを使用して、調製例３に記載された手順に本質的に従って表題化合物を調製し、５．９２ｇ（９４％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３０８．８（Ｍ＋）。
【００４０】
調製例９
Ｎ−メチル−１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−アミン
【化１１】
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメート（７．７７ｇ、１８．３９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させる。過剰量のジエチルエーテル（２０ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）中１Ｍ塩化水素を溶液に添加し、２時間周囲温度で撹拌する。減圧下で濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン：ＭｅＯＨ中２Ｍ ＮＨ３＝１０：１）によって精製して、黄色の発泡体（５．８３ｇ、９８％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３２３．２（Ｍ＋１）。
【００４１】
ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌを使用して適切にｔ−Ｂｏｃ保護されているアミンを脱保護することを除いて、調製例９に記載された手順に本質的に従って以下の表中の中間体を調製する。
【表１】
【実施例】
【００４２】
実施例１
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド
【化１２】
Ｎ−メチル−１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−アミン（２．８ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．３６ｍＬ、２６．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）溶液を４−フルオロ−２−（トリフルオロメチル）ベンゾイル塩化物（２．１４ｍＬ、１０．４２ｍｍｏｌ）で処理する。周囲温度で３時間撹拌する。減圧下で反応混合物を濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：ＭｅＯＨ中２ＭのＮＨ３＝２０：５：１）によって精製して、黄色の発泡体として遊離塩基（３．８３ｇ、８６％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５１３．０（Ｍ＋１）。
【００４３】
実施例１ａ
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド塩酸塩
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（７．１３ｇ、１３．９１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、過剰量のジエチルエーテル（３０ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）中１Ｎ ＨＣｌを添加する。減圧下で溶媒を除去して、表題化合物（７．０５ｇ、９２％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５１３．０（Ｍ＋１）。ＮＭＲは、アミド回転異性体の２：１混合物であることを示した。多数の回転異性体；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．３４（ｍ，１Ｈ），８．２６（ｍ，２Ｈ），７．９５（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．５５（ｍ，１Ｈ），６．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），５．１５（ｂｒ，１Ｈ），４．７１（ｍ，１Ｈ），４．２２（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），２．１９（ｍ，２Ｈ），１．８９（ｍ，２Ｈ）。少数の回転異性体；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．２７（ｍ，１Ｈ），８．２４（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｍ，１Ｈ），７．７３（ｍ，１Ｈ），７．６３（ｍ，３Ｈ），６．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），５．１５（ｂｒ，１Ｈ），４．７１（ｍ，１Ｈ），４．０７（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．１６（ｍ，２Ｈ），２．９２（ｓ，３Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｍ ２Ｈ）。
【００４４】
適切なピペリジニルフタラジン及び置換塩化ベンゾイルを用いて、実施例１及び１ａに記載された手順に本質的に従って、以下の表中のアミドを調製する。
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【００４５】
実施例１４
４−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（メチルスルホニル）ベンズアミド塩酸塩
【化１３】
Ｎ−メチル−１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−アミン（１００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、４−クロロ−２−（メチルスルホニル）安息香酸（８７ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（０．２６ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を６０℃でＤＭＦ：ＤＭＳＯ＝４：１（２ｍＬ）に溶解させる。０℃に冷却し、ＤＭＦ：ＤＭＳＯ＝１：１（１ｍＬ）中のペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィン酸塩（２５０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を溶液に添加する。混合物を６０℃で一晩撹拌する。反応混合物を周囲温度に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：ＭｅＯＨ中２Ｍ ＮＨ３＝２０：５：１）によって精製して、生成物を得る。単離された生成物に過剰量のジエチルエーテル（１ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）中１Ｎ ＨＣｌを添加し、溶媒を除去して、表題化合物（１５０ｍｇ、８４％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５３９．０（Ｍ＋１）。
【００４６】
適切なピペリジニルフタラジン及び置換安息香酸を用いて、実施例１４に記載された手順に本質的に従って、以下の表中のアミドを調製する。
【表３−１】
【表３−２】
【００４７】
ヘッジホッグは、以下の癌の生存因子として意味づけられてきた：基底細胞癌；上部消化管癌（食道、胃、膵臓及び胆管）；前立腺癌；乳癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；Ｂ細胞リンパ腫；多発性骨髄腫；胃癌；卵巣癌；結腸直腸癌；肝臓癌；黒色腫；頭頸部癌；中皮腫；軟部組織肉腫；骨肉腫；白血病；睾丸癌；腎臓癌；及び脳腫瘍。
【００４８】
ヘッジホッグ経路の要素は、癌治療の潜在的創薬標的であると主張されてきた。髄芽腫腫瘍から確立されたＤａｏｙ細胞株（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１８６）は、Ｈｈリガンドに反応する。これら細胞を体外から添加されたＳｈｈ条件培地で処理すると、Ｈｈシグナル伝達経路が活性化され、Ｇｌｉ１の発現が増加する。イキシア（Ｖｅｒａｔｒｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）から単離されたアルカロイドであるシクロパミンは、弱いヘッジホッグアンタゴニストであり、Ｓｈｈ刺激に応答してＧｌｉ１の発現を抑制することが示されている。最近の研究によれば、シクロパミンが培養髄芽腫細胞及び同種移植片の増殖を阻害することが示唆されている。このＤａｏｙ細胞モデル系を用いて、ヘッジホッグシグナル伝達経路の強力な阻害剤を同定することができる。本発明の化合物は、ヘッジホッグアンタゴニストであるため、前述の種類の腫瘍の治療に好適である。
【００４９】
生物活性ＩＣ５０の測定：Ｄａｏｙ細胞におけるＧｌｉ１の阻害を測定するための機能アッセイ
以下のアッセイプロトコル及びその結果は、本発明の化合物及び方法の有用性並びに有効性を更に示す。機能アッセイは、本発明の化合物がＳｈｈシグナル伝達阻害能を示すことを支持する。以下のアッセイで用いられるリガンド、溶媒、及び試薬は全て、商業的供給元から容易に入手可能であるか、又は当業者により容易に調製され得る。
【００５０】
生物活性は、Ｄａｏｙ神経細胞性癌細胞における機能アッセイを用いて測定され、ｂＤＮＡ（分岐デオキシリボ核酸）アッセイ系（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて、Ｇｌｉ１リボ核酸の量を測定する。Ｇｌｉは、最初に神経膠芽腫細胞株で発見され、Ｓｈｈシグナル伝達により活性化されるジンクフィンガータンパク質をコードする。最大反応は、２４時間、条件培地（組換えＳｈｈを安定的に発現するヒト胚腎臓、ＨＥＫ２９３細胞）でＤａｏｙ細胞におけるＧｌｉ１転写を誘導し、次いで刺激されたＧｌｉ１転写量を測定することにより得られる。最小反応は、２４時間、条件培地（組換えＳｈｈを安定的に発現するヒト胚腎臓、ＨＥＫ２９３細胞）で刺激されたＤａｏｙ細胞中にて、対照化合物で阻害されたＧｌｉ１転写量である。
【００５１】
ｂＤＮＡアッセイ系は、標的リボ核酸（転写物）を増幅させるために、分岐鎖ＤＮＡ技術を利用する。前記技術は、標的転写物と複合体としてハイブリダイズして、ハイブリダイゼーションシグナルを増幅させる、標的転写物の特異性を決定する３種の合成ハイブリッド短Ｇｌｉ１特異的ｃＤＮＡプローブ［キャプチャエキステンダ（ＣＥ）、ラベルエキステンダ（ＬＥ）、及びブロッカ（ＢＬ）］を用いる。増幅工程中、化学発光基質を添加することにより、発光を用いる検出が可能になる。
【００５２】
０．１ｎＭ 非必須アミノ酸及び１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含む１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えた最小必須培地（ＭＥＭ）を含有するＤａｏｙ増殖培地中にて、組織培養用Ｔ２２５−フラスコ内で、コンフルエントになるまでＤａｏｙ細胞を増殖させる。トリプシンエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いてＴ−２２５フラスコから細胞を取り出し、遠心分離し、培地に再懸濁させ、次いで計数する。
【００５３】
次いで、Ｄａｏｙ細胞を、５０，０００細胞／ウェルで、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル透明組織培養プレート内の増殖培地に播種し、３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ２）下で一晩インキュベートする。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、次いで１００μＬのＳｈｈ条件培地（Ｓｈｈ−ＣＭ）を添加して、Ｇｌｉ１発現量を刺激する。対照増殖培地（０．１％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地））を用いて最大刺激に達するまでＳｈｈ−ＣＭを希釈する。次いで、Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞を、約１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の様々な濃度のヘッジホッグ阻害剤で処理する。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間、試験化合物をインキュベートする。
【００５４】
Ｇｌｉ１転写物の測定は、製造業者（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）により記載されている通り、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ２．０ Ｇｌｉ１アッセイを用いて実施する。プロテイナーゼＫを含む希釈溶解混合物（ＤＬＭ）緩衝液を調製する。化合物と共に２４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１８０μＬのＤＬＭを前記細胞に添加する。溶解緩衝液を含む細胞プレートをシールし、５５℃で３０〜４５分間放置する。次いで、得られる細胞溶解物を５回すりつぶす。製造業者の指示に従ってプローブをＤＬＭで希釈し、次いで２０μＬのワーキングプローブセットを、８０μＬのＤａｏｙ溶解物と共にｂＤＮＡアッセイプレートに添加することにより、Ｇｌｉ１プローブを含むワーキングプローブセットを作製する。プレートをシールし、５５℃で一晩インキュベートする。次いで、製造業者の指示に従ってｂＤＮＡプレートを処理する。発光を検出するＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーを用いてプレートを読み取ることにより、シグナルを定量する。発光シグナルは、サンプル中に存在する標的転写物の量に正比例する。
【００５５】
機能アッセイから得られた発光シグナルデータを用いて、インビトロアッセイのＩＣ５０を算出する。データは、最大対照値（Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞）及び最小対照値（Ｓｈｈ−ＣＭ、及び抑制濃度の対照化合物である１μＭのＮ−（３−（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）−４−クロロフェニル）−３，５−ジメトキシベンズアミドで処理したＤａｏｙ細胞）に基づいて算出される。４つのパラメーターのロジスティック曲線適合を用いて、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェアプログラムバージョン５．３、式２０５（Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０，２００８，Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ及びＮＩＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いてＩＣ５０値を求める。
【００５６】
記載されたプロトコルに従うと、本明細書で例証される化合物は、４０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。例えば、実施例１ａの化合物は、上記アッセイにおいて約２．４ｎＭのＩＣ５０を有し、標準誤差は０．５（ｎ＝７、幾何平均及び幾何学標準誤差として計算される）である。これらの結果は、本発明の化合物が強力なヘッジホッグアンタゴニストであり、したがって、抗癌剤として有用であるという証拠を提供する。
【００５７】
ＣＹＰ３Ａ４阻害アッセイ
ヒト肝臓ミクロソーム調製物を試験阻害剤（最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬのタンパク質、１００ｍＭ ＮａＰＯ４中１０μＭ阻害剤、ｐＨ７．４緩衝液）に添加し、混合することによって、インキュベーションサンプルを調製する。３７℃で約５分間、サンプルをプレインキュベートする。プレインキュベート期間後、酵素基質としてＮＡＤＰＨ及びミダゾラムを含有する溶液（最終濃度１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、５μＭミダゾラム）を添加して反応を開始させる。ＮＡＤＰＨ溶液を添加した後、約３７℃で３分間サンプルをインキュベートする。インキュベート期間後、５０μＬのメタノール（及びクロマトグラフィー用の内部標準）を添加することにより前記反応をクエンチし、前記サンプルを十分混合する。反応をクエンチした後、約５℃で１５分間、約４０００ｒｐｍにて混合物を遠心分離し、ＬＣ／ＭＳ分析によって分析する。
【００５８】
短い従来のＣ１８カラムにて勾配溶出法でＨＰＬＣ／ＭＳを使用してサンプルを分析する（ロード用移動相−１％の酢酸を含む９５／５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、移動相Ｂ−１％の酢酸を含む８０／２０ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、移動相Ｃ−１％の酢酸を含む５／９５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、すすぎ用移動相−７５／２５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（ｖ／ｖ））。
【００５９】
陽性条件下でターボイオンスプレーを用いて、質量３４２．１（１−ＯＨ−ミダゾラム）及び３４６．１（α−ヒドロキシミダゾラム−ｄ４内部標準）で選択イオン検出（ＳＩＭ）用の質量スペクトル分析機にサンプルを注入する。１０μＭの濃度の阻害剤の存在下における１−ＯＨミダゾラムの形成阻害率（％）としてデータを報告する。
【００６０】
記載されたプロトコルに従うと、実施例１ａは１３．５％のＣＹＰ３Ａ４阻害を示す。低い可逆的ＣＹＰ３Ａ４阻害能を示す実施例１ａ等の化合物は、患者における投薬量を変化させたり、投薬を中止する必要性を生じさせたりし得る他の医薬との負の相互作用の可能性が低い。したがって、かかる化合物は望ましく、改善された安全性プロファイルを有する。
【００６１】
インビトロにおけるＣＹＰ３Ａの機序に基づく阻害
この相互作用の速度定数ｋｉｎａｃｔ及びＫＩを得るために、ＣＹＰ３Ａの機序に基づく阻害剤として実施例１ａの化合物を評価する。（Ｋｉｎａｃｔは不活性酵素複合体形成の最高速度定数である。ＫＩは最大不活性化濃度の半分の濃度である）。２段階のインビトロインキュベーション（阻害剤に酵素を不活化させる不活化反応、及びプローブとしてミダゾラムの１’−ヒドロキシル化を使用して、ミクロゾームタンパク質の残存活性を評価する活性アッセイ）において、前記化合物をヒト肝ミクロソーム（ＣＹＰ３Ａ４活性が高発現するヒト肝ミクロソームのプール）と共にインキュベートする。
【００６２】
１ｍＭ ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型）が存在しない又は存在する状態における、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有する不活性化反応物（最終体積１００μＬ）と０．７５μＭ〜２４μＭの濃度の試験化合物との反応物を、トリプリケートで３７℃にて３分間プレインキュベートする。高ＣＹＰ３Ａ活性ミクロソームプール（ＣｅｌｌｚＤｉｒｅｃｔ、Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加することにより、不活化反応を開始させる。複合の時点（０、２．５、５、１０及び３０分）で、不活化反応混合物の５μＬのアリコートを採取し、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ及びミダゾラム（１００μＭ）を含有する予熱（３７℃）ＣＹＰ３Ａ４活性アッセイインキュベーション系（９５μＬ）で１／２０に希釈する。この活性アッセイ混合物を、最終タンパク濃度０．０２５ｍｇ／ｍＬ及び１／２０の阻害剤濃度で、更に１分間インキュベート（３７℃）した後、５０μＬのＭｅＯＨを添加することにより反応を停止させる。サンプルを混合し、変性タンパク質を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離することにより除去する。
【００６３】
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ ４μヒドロ−ＲＰカラムにて勾配溶出法でＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、１’−ＯＨミダゾラムの形成を分析する。（移動相Ａ−５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む９５／５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、移動相Ｂ−５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む５／９５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、ニードル洗浄用溶媒Ａ−９０／１０ アセトニトリル／Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）中０．４％のトリフルオロ酢酸、ニードル洗浄用溶媒Ｂ−５０／５０ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ））。陽性条件下でターボイオンスプレーを用いて、質量３４２．０（１−ＯＨ−ミダゾラム）及び３４７．０（α−ヒドロキシミダゾラム−ｄ３内部標準）で選択反応検出のためにＳｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００にサンプルを注入する。
【００６４】
ミクロソームインキュベーション物における１’−ＯＨミダゾラムの形成減少（ＣＹＰ３Ａ４活性）を、各試験化合物濃度についてプレインキュベーション時間の関数として、残存ＣＹＰ３Ａ４活性の対数パーセントとしてプロットする。データに以下の等式を適合させるためにＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌを使用して、不活化の動力学的パラメーターを決定する：
等式１：阻害率（ｔ）＝１００（ｔ＝０）×ｅ（−λｔ）
（式中、λは、以下の通り定義される
等式２：λ＝（ｋｉｎａｃｔ×Ｉ）／（ＫＩ＋Ｉ））。
【００６５】
実施例１ａの化合物の活性減少は、１１％〜２２％までの範囲であり、濃度依存性ではない。したがって、等式２からｋｉｎａｃｔ及びＫＩの値を決定することはできない。これらのデータに基づいて、実施例１ａの化合物はＣＹＰ３Ａ４の機序に基づく阻害剤ではない。機序に基づく不可逆的なＣＹＰ３Ａ４阻害能の低い又は示さない実施例１ａ等の化合物は、患者における投薬量を変化させたり、投薬を中止する必要性を生じさせたりし得る他の医薬との負の相互作用の可能性が低い。したがって、かかる化合物は望ましく、改善された安全性プロファイルを有する。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヘッジホッグ経路アンタゴニスト、より具体的には、新規１，４−二置換フタラジン、及びその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘッジホッグ（Ｈｈ）シグナル伝達経路は、細胞の分化及び増殖を導くことにより、胚のパターン形成及び成体組織の維持において重要な役割を果たしている。ソニックヘッジホッグ（Ｓｈｈ）、インディアンヘッジホッグ（Ｉｈｈ）、及びデザートヘッジホッグ（Ｄｈｈ）を含むヘッジホッグ（Ｈｈ）タンパク質ファミリーは、自己触媒的切断及びコレステロールのアミノ末端ペプチドへのカップリングを含む翻訳後修飾を受けて、シグナル伝達活性を有する断片を形成する分泌糖タンパク質である。Ｈｈは、１２回膜貫通型タンパク質Ｐｔｃｈ（Ｐｔｃｈ１及びＰｔｃｈ２）に結合して、Ｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄ（Ｓｍｏ）のＰｔｃｈ介在性抑制を軽減する。Ｓｍｏの活性化は、Ｇｌｉ転写因子（Ｇｌｉ１、Ｇｌｉ２、及びＧｌｉ３）を安定化させ、且つ細胞増殖、細胞生存、血管形成、及び侵入に関与するＧｌｉ依存性遺伝子を発現させる一連の細胞内事象を誘発する。
【０００３】
Ｈｈシグナル伝達は、近年、Ｓｈｈシグナル伝達の異常な活性化が、種々の腫瘍、例えば、膵癌、髄芽腫、基底細胞癌、小細胞肺癌、及び前立腺癌の形成を導くという発見に基づいて、大きな注目を集めている。特許文献１は、ヘッジホッグアンタゴニストであると主張されている特定の１，４−二置換フタラジン化合物を開示している。同様に、特許文献２は、ヘッジホッグ経路関連病態の診断及び治療に関連する特定の１，４−二置換フタラジン化合物を開示している。特許文献３は、不適切なヘッジホッグシグナル伝達により推進される全ての腫瘍に対する治療の選択肢であると主張されている特定の１，４−二置換フタラジン化合物を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２００５０３３２８８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８１１０６１１号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００９００２４６９号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
強力なヘッジホッグ経路阻害剤、特に所望の毒物学的プロファイルを有するものが、依然として必要とされている。本発明は、この経路の強力なアンタゴニストである新規１，４−二置換フタラジンを提供する。本発明の特定の化合物は、可逆的な及び／又は作用機序に基づいた不可逆的なＣＹＰ３Ａ４阻害能に関する望ましい薬物−薬物相互作用及び関連する安全性プロファイルを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、式Ｉ：
【化１】
（式中、Ｒ１は、水素又はメチルであり；Ｒ２は、水素又はメチルであり；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７は、独立して、水素、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、メチルスルホニル、又はトリフルオロメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも３つは水素である）の化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。
【０００７】
また、本発明は薬学的に許容できる賦形剤、担体、又は希釈剤と共に、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物を提供する。
【０００８】
また、本発明は、哺乳動物における脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される癌を治療する方法であって、前記哺乳動物に有効量の式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を投与することを含む方法を提供する。
【０００９】
更に、本発明は、治療において使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。また、本発明は、癌の治療において使用するための式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を提供する。具体的には、前記癌は、脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される。
【００１０】
また、本発明は、治療における式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩の使用を提供する。更に、本発明は、癌を治療する医薬を製造するための、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩の使用を提供する。具体的には、前記癌は、脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される。
【００１１】
更に、本発明は、脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される癌を治療するための活性成分として、式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物を提供する。
【００１２】
具体的な式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩は、以下のものである：
（ａ）Ｒ１が、メチルである；
（ｂ）Ｒ２が、メチルである；
（ｃ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７が、独立して、水素、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルである；
（ｄ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７が、独立して、水素、フルオロ、又はトリフルオロメチルである；
（ｅ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも２つが、独立して、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ３及びＲ７が同時に水素であることはない；
（ｆ）Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも２つが、独立して、フルオロ又はトリフルオロメチルであるが、但し、Ｒ３及びＲ７が同時に水素であることはない；
（ｇ）Ｒ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；
（ｈ）Ｒ３及びＲ５が、独立して、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；
（ｉ）Ｒ３及びＲ５が、独立して、フルオロ又はトリフルオロメチルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；
（ｊ）Ｒ１が、メチルであり；且つＲ２が、メチルである；
（ｋ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；且つＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７が、独立して、水素、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルである；
（ｌ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；且つＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７が、独立して、水素、フルオロ、又はトリフルオロメチルである；
（ｍ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；且つＲ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも２つが、独立して、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ３及びＲ７が同時に水素であることはない；
（ｎ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも２つが、独立して、フルオロ又はトリフルオロメチルであるが、但し、Ｒ３及びＲ７が同時に水素であることはない；
（ｏ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；
（ｐ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；Ｒ３及びＲ５が、独立して、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である；並びに
（ｑ）Ｒ１が、メチルであり；Ｒ２が、メチルであり；Ｒ３及びＲ５が、独立して、フルオロ又はトリフルオロメチルであり；且つＲ４、Ｒ６及びＲ７が、水素である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上記で使用されたとき、及び本発明の明細書全体にわたって、特に指示されない限り、以下の用語は、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００１４】
「薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤」は、哺乳動物、例えばヒトに生理活性物質を送達するために当技術分野において一般的に許容されている媒体である。
【００１５】
「薬学的に許容できる塩」は、本発明の化合物の比較的無毒な無機及び有機塩を指す。
【００１６】
「治療上有効量」又は「有効量」は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医によって求められている、組織、系、動物、哺乳動物若しくはヒトの生物学的若しくは医学的応答、又は前記組織、系、動物、哺乳動物若しくはヒトに対する望ましい治療効果を誘発する本発明の式Ｉの化合物若しくはその薬学的に許容できる塩、又は本発明の式Ｉの化合物若しくはその薬学的に許容できる塩を含有する医薬組成物の量を意味する。
【００１７】
用語「治療」、「治療する」、「治療している」等は、障害の進行の減速又は逆行を含むことを意味する。また、これらの用語は、たとえ実際に障害や状態を排除しなくても、障害又は状態の進行それ自体を減速又は逆行させなくても、障害又は状態のうちの１つ以上の病徴を軽減、回復、減弱、排除、又は緩和することを含む。
【００１８】
この開示全体にわたって使用される標準的な命名法の下では、指定の側鎖の末端部を先ず記載し、続いて結合点に向かって隣接する官能基を記載する。例えば、メチルスルホニル置換基はＣＨ３−ＳＯ２−に相当する。
【００１９】
本発明の化合物は、例えば、多くの無機及び有機酸と反応して、薬学的に許容できる酸付加塩を形成することができる。かかる薬学的に許容できる塩、及びそれを調製する慣用的な方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｐ．Ｓｔａｈｌら，ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＡＬＴＳ：ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，ＳＥＬＥＣＴＩＯＮ ＡＮＤ ＵＳＥ，（ＶＣＨＡ／Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）；Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅら，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ６６，Ｎｏ．１，１９７７年，１月を参照。
【００２０】
本発明の化合物は、好ましくは、薬学的に許容できる担体、希釈剤又は賦形剤を用いて医薬組成物として製剤化され、様々な経路によって投与される。好ましくは、かかる組成物は、経口又は静脈内投与用である。かかる医薬組成物及びそれを調製する方法は、当該技術分野において周知である。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ：ＴＨＥ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ ＯＦ ＰＨＡＲＭＡＣＹ（Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏら編，第１９版，Ｍａｃｋ ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，１９９５）を参照。
【００２１】
実際に投与される化合物は、治療される症状、選択される投与経路、投与される実際の化合物（１又は複数）、個々の患者の年齢、体重及び応答、並びに患者の病徴の重篤度を含む関連状況に基づいて、医師により決定される。１日当たりの投与量は、通常、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内に入る。ある場合には、前述の範囲の下限を下回る投与量レベルであっても十分な量を超えている場合もあり、他の場合には、更に多い投与量が用いられる場合もある。
【００２２】
式Ｉの化合物、又はその塩は、当該技術分野において既知である様々な手順、並びに以下のスキーム、調製例、及び実施例に記載される手順により調製することができる。式Ｉの化合物又はその薬学的に許容できる塩を調製するために、記載される経路の各々についての特定の合成工程を様々な方法で組み合わせてもよい。
【００２３】
置換基は、特に指示しない限り、既に定義した通りである。試薬及び出発物質は、概して、当業者が容易に入手可能なものである。他の試薬及び出発物質は、有機化学及び複素環化学の標準的な技術、既知の構造的に類似している化合物の合成に類似する技術、並びに任意の新規手順を含む以下の調製例及び実施例に記載される手順によって作製することができる。以下の調製例及び実施例の命名は、ＣｈｅｍＤｒａｗ（登録商標）Ｕｌｔｒａ１０．０におけるＳｔｒｕｃｔ＝Ｎａｍｅ命名機能を使用して行う。
【００２４】
本明細書で使用するとき、以下の用語は、指定される意味を有する：「Ｅｔ２Ｏ」は、ジエチルエーテルを指し；「ＤＭＦ」は、ジメチルホルムアミドを指し；「ＤＭＳＯ」は、ジメチルスルホキシドを指し；「ＤＭＡＣ」は、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを指し；「ＮＭＰ」はＮ−メチルピロリジンを指し；「ＭｅＯＨ」は、メタノールを指し；「ｂｏｃ」又は「ｔ−ｂｏｃ」は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルを指し；「ＩＣ５０」は、ある剤が可能である最大阻害反応の５０％を生じさせる前記剤の濃度を指す。
【００２５】
【化２】
【００２６】
式Ｉの化合物は、スキームに図示されている反応に従って調製することができる。
【００２７】
工程１では、芳香族求核置換（ＳＮＡｒ）においてジハロ置換フタラジン（１）（Ｘ＝Ｃｌ又はＢｒ）と４−アミノｂｏｃで保護されたピペリジン（２）とを反応させて式（３）のハロピペリジルフタラジンを得る。この反応は、有機又は無機塩基の存在下において、ＤＭＦ、ＤＭＡＣ又はＮＭＰ等の二極性の非プロトン性溶媒中にて進行する。好ましくは、前記反応は５０〜１４０℃の温度で、炭酸カリウムの存在下において、ＮＭＰ中にて起こる。
【００２８】
工程２では、式（３）のハロピペリジルフタラジンとピラゾールボロン酸エステル又は酸（４）とのスズキクロスカップリング反応が生じる。例えば、ハロピペリジルフタラジン（３）は、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム等のパラジウム触媒、及び重炭酸ナトリウム等の無機塩基の存在下で、１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−ボロン酸ピナコールエステルと組み合わせられる。前記反応はトルエン／エタノール／水の溶媒混合物中にて進行して、式（５）のピラゾリルフタラジンが得られる。
【００２９】
工程３は、式（６）のアミノピペリジニルフタラジンを得るためにジエチルエーテル又はジオキサン中ＨＣｌ等の酸性条件下で行われる単なるｂｏｃ脱保護である。窒素及び酸素保護基を導入及び除去する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ，ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９９年）を参照）。
【００３０】
工程４では、式（６）のアミノピペリジニルフタラジンをアシル化して、式Ｉのピペリジニルアミドを得る。１つの方法では、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基の存在下で、ジクロロメタン等の不活性溶媒中にて、アミンを適切に置換された塩化ベンゾイルと反応させる。或いは、適切に置換された安息香酸を使用して、アミドを形成させる。アミンとの反応に続いて、ペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィン酸塩を使用して、活性エステルを形成させる。前記反応は、トリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン等の有機塩基の存在下において、約−１０〜１００℃の温度で、ＤＭＦ／ＤＭＳＯの溶媒混合物中にて進行する。
【００３１】
調製例１
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
【化３】
Ｎ−メチルピロリジン（２００ｍＬ）中炭酸カリウム（２１．２３ｇ、１５３．６ｍｍｏｌ）、１，４−ジクロロフタラジン（２６ｇ、１２８ｍｍｏｌ）及びメチル−ピペリジン−４−イルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（３０．０１ｇ、１３４．４ｍｍｏｌ）の混合物を８０℃で一晩加熱する。前記反応混合物を水に注ぎ、ジクロロメタンで抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。ジエチルエーテルを添加し、生じた固体（出発物質の不純物に由来する４−クロロフタラジン−１−オール）を濾し取る。濾液を濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）によって精製して、白色の固体（１７．６６ｇ、３７％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（３７Ｃｌ）３７７．０（Ｍ＋１）。
【００３２】
調製例２
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イルカルバメート
【化４】
ピペリジン−４−イル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルを使用して、調製例１に記載された手順に本質的に従って表題化合物を調製する。反応混合物を冷却し、水（５００ｍＬ）に注ぐ。酢酸エチルで抽出し、水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で溶媒を除去して、黄色の固体（３６ｇ、９７％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３６３．０（Ｍ＋１）。
【００３３】
調製例３
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメート
【化５】
トルエン（５０ｍＬ）、エタノール（１７ｍＬ）及び水（１７ｍＬ）の混合物を含むフラスコに、炭酸ナトリウム（３．８２ｇ、３６．０９ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（６．８ｇ、１８．０４ｍｍｏｌ）及び１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−ボロン酸ピナコールエステル（５．６３ｇ、２７．１ｍｍｏｌ）を入れる。窒素ガスで１０分間混合物を脱気する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．４ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を７４℃で一晩加熱する。混合物を周囲温度に冷却し、ジクロロメタンで希釈する。有機部分をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：ＭｅＯＨ中２Ｍ ＮＨ３＝２０：５：１）によって精製して、黄色の発泡体（５．３３ｇ、７０％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４２３．２（Ｍ＋１）。
【００３４】
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメートを調製するための代替手順：調製例４〜６
【００３５】
調製例４
１，４−ジブロモフタラジン
【化６】
圧力管に五臭化リン（２４．５ｇ、５４．１ｍｍｏｌ）及び２，３−ジヒドロ−フタラジン−１，４−ジオン（５．００ｇ、３０．８ｍｍｏｌ）を充填する。前記管を密閉し、１４０℃で６〜７時間加熱する。一晩冷却する。圧力を作用させて前記管を慎重に開ける。固体を削り取り（Ｃｈｉｓｅｌ ｏｕｔ）、氷水へ注ぐ。氷水中で撹拌し、生じる固体を吸引濾過によって回収する。真空オーブンにおいて乾燥させて、最終生成物（８．３１ｇ、９３％）を得る。ＥＳ／ＭＳ（７９Ｂｒ，８１Ｂｒ）ｍ／ｚ ２８８．８（Ｍ＋）。Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．１９６５，４３，２７０８を参照されたい。
【００３６】
調製例５
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−ブロモフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
【化７】
１，４−ジブロモフタラジン（０．７０ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルピロリドン（７．０ｍＬ）、炭酸カリウム（３９５ｍｇ、２．８６ｍｍｏｌ）及びメチル−ピペリジン−４−イル−カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（５３２ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を合わせる。８０℃で一晩加熱する。冷却し、水に注ぐ。固体を回収し、周囲温度で一晩真空オーブンにおいて乾燥させて、最終生成物（０．９６ｇ、９５％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ（８１Ｂｒ）４２１．０（Ｍ＋１）。
【００３７】
調製例６
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメート
【化８】
反応管にｔｅｒｔ−ブチル１−（４−ブロモフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート（５００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）、１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−ボロン酸ピナコールエステル（３７０ｍｇ、１．８ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（２５２ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）、トルエン（３．７５ｍＬ）、エタノール（１．２５ｍＬ）及び水（１．２５ｍＬ）を充填する。１０分間窒素で反応混合物を脱気する。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（１３７．１ｍｇ、１１８．７μｍｏｌ）を添加する。更に１０分間、反応混合物を窒素でバブリングする。反応バイアルに蓋をし、９０℃で一晩加熱する。反応物を冷却し、シリカゲルパッドを通して濾過し、５％のＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２で溶出する。この画分を減圧下で濃縮する。生じる残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＭｅＯＨ中の２％の２Ｎ ＮＨ３：ＣＨ２Ｃｌ２）を用いて精製して、最終生成物（３４５．６ｍｇ、６９％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４２３．２（Ｍ＋１）。
【００３８】
調製例７
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−（１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート
【化９】
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル（メチル）カルバメート及び１Ｈ−ピラゾール−３−ボロン酸ピナコールエステルを使用して、調製例３に記載された手順に本質的に従って表題化合物を調製し、５８０ｍｇ（６７％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ４０９．２（Ｍ＋１）。
【００３９】
調製例８
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イルカルバメート
【化１０】
ｔｅｒｔ−ブチル１−（４−クロロフタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イルカルバメートを使用して、調製例３に記載された手順に本質的に従って表題化合物を調製し、５．９２ｇ（９４％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３０８．８（Ｍ＋）。
【００４０】
調製例９
Ｎ−メチル−１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−アミン
【化１１】
ｔｅｒｔ−ブチルメチル（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）カルバメート（７．７７ｇ、１８．３９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させる。過剰量のジエチルエーテル（２０ｍＬ、８０ｍｍｏｌ）中１Ｍ塩化水素を溶液に添加し、２時間周囲温度で撹拌する。減圧下で濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ジクロロメタン：ＭｅＯＨ中２Ｍ ＮＨ３＝１０：１）によって精製して、黄色の発泡体（５．８３ｇ、９８％）として表題化合物を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ３２３．２（Ｍ＋１）。
【００４１】
ジオキサン中４Ｍ ＨＣｌを使用して適切にｔ−Ｂｏｃ保護されているアミンを脱保護することを除いて、調製例９に記載された手順に本質的に従って以下の表中の中間体を調製する。
【表１】
【実施例】
【００４２】
実施例１
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド
【化１２】
Ｎ−メチル−１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−アミン（２．８ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（３．３６ｍＬ、２６．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）溶液を４−フルオロ−２−（トリフルオロメチル）ベンゾイル塩化物（２．１４ｍＬ、１０．４２ｍｍｏｌ）で処理する。周囲温度で３時間撹拌する。減圧下で反応混合物を濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：ＭｅＯＨ中２ＭのＮＨ３＝２０：５：１）によって精製して、黄色の発泡体として遊離塩基（３．８３ｇ、８６％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５１３．０（Ｍ＋１）。
【００４３】
実施例１ａ
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド塩酸塩
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド（７．１３ｇ、１３．９１ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解させ、過剰量のジエチルエーテル（３０ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）中１Ｎ ＨＣｌを添加する。減圧下で溶媒を除去して、表題化合物（７．０５ｇ、９２％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５１３．０（Ｍ＋１）。ＮＭＲは、アミド回転異性体の２：１混合物であることを示した。多数の回転異性体；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．３４（ｍ，１Ｈ），８．２６（ｍ，２Ｈ），７．９５（ｍ，１Ｈ），７．７５（ｍ，１Ｈ），７．６４（ｍ，２Ｈ），７．５５（ｍ，１Ｈ），６．７２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），５．１５（ｂｒ，１Ｈ），４．７１（ｍ，１Ｈ），４．２２（ｍ，２Ｈ），３．８４（ｓ，３Ｈ），３．４８（ｍ，２Ｈ），２．６５（ｓ，３Ｈ），２．１９（ｍ，２Ｈ），１．８９（ｍ，２Ｈ）。少数の回転異性体；１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ ８．２７（ｍ，１Ｈ），８．２４（ｍ，２Ｈ），７．９４（ｍ，１Ｈ），７．７３（ｍ，１Ｈ），７．６３（ｍ，３Ｈ），６．７０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２Ｈｚ），５．１５（ｂｒ，１Ｈ），４．７１（ｍ，１Ｈ），４．０７（ｍ，２Ｈ），３．８１（ｓ，３Ｈ），３．１６（ｍ，２Ｈ），２．９２（ｓ，３Ｈ），１．９０（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｍ ２Ｈ）。
【００４４】
適切なピペリジニルフタラジン及び置換塩化ベンゾイルを用いて、実施例１及び１ａに記載された手順に本質的に従って、以下の表中のアミドを調製する。
【表２−１】
【表２−２】
【表２−３】
【００４５】
実施例１４
４−クロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（メチルスルホニル）ベンズアミド塩酸塩
【化１３】
Ｎ−メチル−１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−アミン（１００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、４−クロロ−２−（メチルスルホニル）安息香酸（８７ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、及びジイソプロピルエチルアミン（０．２６ｍＬ、１．５ｍｍｏｌ）を６０℃でＤＭＦ：ＤＭＳＯ＝４：１（２ｍＬ）に溶解させる。０℃に冷却し、ＤＭＦ：ＤＭＳＯ＝１：１（１ｍＬ）中のペンタフルオロフェニルジフェニルホスフィン酸塩（２５０ｍｇ、０．６５ｍｍｏｌ）を溶液に添加する。混合物を６０℃で一晩撹拌する。反応混合物を周囲温度に冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で濃縮する。生じる残渣をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル：ＭｅＯＨ中２Ｍ ＮＨ３＝２０：５：１）によって精製して、生成物を得る。単離された生成物に過剰量のジエチルエーテル（１ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）中１Ｎ ＨＣｌを添加し、溶媒を除去して、表題化合物（１５０ｍｇ、８４％）を得る。ＥＳ／ＭＳ ｍ／ｚ ５３９．０（Ｍ＋１）。
【００４６】
適切なピペリジニルフタラジン及び置換安息香酸を用いて、実施例１４に記載された手順に本質的に従って、以下の表中のアミドを調製する。
【表３−１】
【表３−２】
【００４７】
ヘッジホッグは、以下の癌の生存因子として意味づけられてきた：基底細胞癌；上部消化管癌（食道、胃、膵臓及び胆管）；前立腺癌；乳癌；小細胞肺癌；非小細胞肺癌；Ｂ細胞リンパ腫；多発性骨髄腫；胃癌；卵巣癌；結腸直腸癌；肝臓癌；黒色腫；頭頸部癌；中皮腫；軟部組織肉腫；骨肉腫；白血病；睾丸癌；腎臓癌；及び脳腫瘍。
【００４８】
ヘッジホッグ経路の要素は、癌治療の潜在的創薬標的であると主張されてきた。髄芽腫腫瘍から確立されたＤａｏｙ細胞株（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１８６）は、Ｈｈリガンドに反応する。これら細胞を体外から添加されたＳｈｈ条件培地で処理すると、Ｈｈシグナル伝達経路が活性化され、Ｇｌｉ１の発現が増加する。イキシア（Ｖｅｒａｔｒｕｍ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）から単離されたアルカロイドであるシクロパミンは、弱いヘッジホッグアンタゴニストであり、Ｓｈｈ刺激に応答してＧｌｉ１の発現を抑制することが示されている。最近の研究によれば、シクロパミンが培養髄芽腫細胞及び同種移植片の増殖を阻害することが示唆されている。このＤａｏｙ細胞モデル系を用いて、ヘッジホッグシグナル伝達経路の強力な阻害剤を同定することができる。本発明の化合物は、ヘッジホッグアンタゴニストであるため、前述の種類の腫瘍の治療に好適である。
【００４９】
生物活性ＩＣ５０の測定：Ｄａｏｙ細胞におけるＧｌｉ１の阻害を測定するための機能アッセイ
以下のアッセイプロトコル及びその結果は、本発明の化合物及び方法の有用性並びに有効性を更に示す。機能アッセイは、本発明の化合物がＳｈｈシグナル伝達阻害能を示すことを支持する。以下のアッセイで用いられるリガンド、溶媒、及び試薬は全て、商業的供給元から容易に入手可能であるか、又は当業者により容易に調製され得る。
【００５０】
生物活性は、Ｄａｏｙ神経細胞性癌細胞における機能アッセイを用いて測定され、ｂＤＮＡ（分岐デオキシリボ核酸）アッセイ系（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を用いて、Ｇｌｉ１リボ核酸の量を測定する。Ｇｌｉは、最初に神経膠芽腫細胞株で発見され、Ｓｈｈシグナル伝達により活性化されるジンクフィンガータンパク質をコードする。最大反応は、２４時間、条件培地（組換えＳｈｈを安定的に発現するヒト胚腎臓、ＨＥＫ２９３細胞）でＤａｏｙ細胞におけるＧｌｉ１転写を誘導し、次いで刺激されたＧｌｉ１転写量を測定することにより得られる。最小反応は、２４時間、条件培地（組換えＳｈｈを安定的に発現するヒト胚腎臓、ＨＥＫ２９３細胞）で刺激されたＤａｏｙ細胞中にて、対照化合物で阻害されたＧｌｉ１転写量である。
【００５１】
ｂＤＮＡアッセイ系は、標的リボ核酸（転写物）を増幅させるために、分岐鎖ＤＮＡ技術を利用する。前記技術は、標的転写物と複合体としてハイブリダイズして、ハイブリダイゼーションシグナルを増幅させる、標的転写物の特異性を決定する３種の合成ハイブリッド短Ｇｌｉ１特異的ｃＤＮＡプローブ［キャプチャエキステンダ（ＣＥ）、ラベルエキステンダ（ＬＥ）、及びブロッカ（ＢＬ）］を用いる。増幅工程中、化学発光基質を添加することにより、発光を用いる検出が可能になる。
【００５２】
０．１ｎＭ 非必須アミノ酸及び１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含む１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えた最小必須培地（ＭＥＭ）を含有するＤａｏｙ増殖培地中にて、組織培養用Ｔ２２５−フラスコ内で、コンフルエントになるまでＤａｏｙ細胞を増殖させる。トリプシンエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いてＴ−２２５フラスコから細胞を取り出し、遠心分離し、培地に再懸濁させ、次いで計数する。
【００５３】
次いで、Ｄａｏｙ細胞を、５０，０００細胞／ウェルで、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル透明組織培養プレート内の増殖培地に播種し、３７℃、５％二酸化炭素（ＣＯ２）下で一晩インキュベートする。細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、次いで１００μＬのＳｈｈ条件培地（Ｓｈｈ−ＣＭ）を添加して、Ｇｌｉ１発現量を刺激する。対照増殖培地（０．１％ ＦＢＳ／ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地））を用いて最大刺激に達するまでＳｈｈ−ＣＭを希釈する。次いで、Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞を、約１μＭ〜０．１ｎＭの範囲の様々な濃度のヘッジホッグ阻害剤で処理する。３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間、試験化合物をインキュベートする。
【００５４】
Ｇｌｉ１転写物の測定は、製造業者（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．）により記載されている通り、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ２．０ Ｇｌｉ１アッセイを用いて実施する。プロテイナーゼＫを含む希釈溶解混合物（ＤＬＭ）緩衝液を調製する。化合物と共に２４時間インキュベートした後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、１８０μＬのＤＬＭを前記細胞に添加する。溶解緩衝液を含む細胞プレートをシールし、５５℃で３０〜４５分間放置する。次いで、得られる細胞溶解物を５回すりつぶす。製造業者の指示に従ってプローブをＤＬＭで希釈し、次いで２０μＬのワーキングプローブセットを、８０μＬのＤａｏｙ溶解物と共にｂＤＮＡアッセイプレートに添加することにより、Ｇｌｉ１プローブを含むワーキングプローブセットを作製する。プレートをシールし、５５℃で一晩インキュベートする。次いで、製造業者の指示に従ってｂＤＮＡプレートを処理する。発光を検出するＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｅｎｖｉｓｉｏｎリーダーを用いてプレートを読み取ることにより、シグナルを定量する。発光シグナルは、サンプル中に存在する標的転写物の量に正比例する。
【００５５】
機能アッセイから得られた発光シグナルデータを用いて、インビトロアッセイのＩＣ５０を算出する。データは、最大対照値（Ｓｈｈ−ＣＭで処理したＤａｏｙ細胞）及び最小対照値（Ｓｈｈ−ＣＭ、及び抑制濃度の対照化合物である１μＭのＮ−（３−（１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−イル）−４−クロロフェニル）−３，５−ジメトキシベンズアミドで処理したＤａｏｙ細胞）に基づいて算出される。４つのパラメーターのロジスティック曲線適合を用いて、ＡｃｔｉｖｉｔｙＢａｓｅソフトウェアプログラムバージョン５．３、式２０５（Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０，２００８，Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ及びＮＩＨ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｅｎｔｅｒ）を用いてＩＣ５０値を求める。
【００５６】
記載されたプロトコルに従うと、本明細書で例証される化合物は、４０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。例えば、実施例１ａの化合物は、上記アッセイにおいて約２．４ｎＭのＩＣ５０を有し、標準誤差は０．５（ｎ＝７、幾何平均及び幾何学標準誤差として計算される）である。これらの結果は、本発明の化合物が強力なヘッジホッグアンタゴニストであり、したがって、抗癌剤として有用であるという証拠を提供する。
【００５７】
ＣＹＰ３Ａ４阻害アッセイ
ヒト肝臓ミクロソーム調製物を試験阻害剤（最終濃度０．０５ｍｇ／ｍＬのタンパク質、１００ｍＭ ＮａＰＯ４中１０μＭ阻害剤、ｐＨ７．４緩衝液）に添加し、混合することによって、インキュベーションサンプルを調製する。３７℃で約５分間、サンプルをプレインキュベートする。プレインキュベート期間後、酵素基質としてＮＡＤＰＨ及びミダゾラムを含有する溶液（最終濃度１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、５μＭミダゾラム）を添加して反応を開始させる。ＮＡＤＰＨ溶液を添加した後、約３７℃で３分間サンプルをインキュベートする。インキュベート期間後、５０μＬのメタノール（及びクロマトグラフィー用の内部標準）を添加することにより前記反応をクエンチし、前記サンプルを十分混合する。反応をクエンチした後、約５℃で１５分間、約４０００ｒｐｍにて混合物を遠心分離し、ＬＣ／ＭＳ分析によって分析する。
【００５８】
短い従来のＣ１８カラムにて勾配溶出法でＨＰＬＣ／ＭＳを使用してサンプルを分析する（ロード用移動相−１％の酢酸を含む９５／５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、移動相Ｂ−１％の酢酸を含む８０／２０ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、移動相Ｃ−１％の酢酸を含む５／９５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、すすぎ用移動相−７５／２５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（ｖ／ｖ））。
【００５９】
陽性条件下でターボイオンスプレーを用いて、質量３４２．１（１−ＯＨ−ミダゾラム）及び３４６．１（α−ヒドロキシミダゾラム−ｄ４内部標準）で選択イオン検出（ＳＩＭ）用の質量スペクトル分析機にサンプルを注入する。１０μＭの濃度の阻害剤の存在下における１−ＯＨミダゾラムの形成阻害率（％）としてデータを報告する。
【００６０】
記載されたプロトコルに従うと、実施例１ａは１３．５％のＣＹＰ３Ａ４阻害を示す。低い可逆的ＣＹＰ３Ａ４阻害能を示す実施例１ａ等の化合物は、患者における投薬量を変化させたり、投薬を中止する必要性を生じさせたりし得る他の医薬との負の相互作用の可能性が低い。したがって、かかる化合物は望ましく、改善された安全性プロファイルを有する。
【００６１】
インビトロにおけるＣＹＰ３Ａの機序に基づく阻害
この相互作用の速度定数ｋｉｎａｃｔ及びＫＩを得るために、ＣＹＰ３Ａの機序に基づく阻害剤として実施例１ａの化合物を評価する。（Ｋｉｎａｃｔは不活性酵素複合体形成の最高速度定数である。ＫＩは最大不活性化濃度の半分の濃度である）。２段階のインビトロインキュベーション（阻害剤に酵素を不活化させる不活化反応、及びプローブとしてミダゾラムの１’−ヒドロキシル化を使用して、ミクロゾームタンパク質の残存活性を評価する活性アッセイ）において、前記化合物をヒト肝ミクロソーム（ＣＹＰ３Ａ４活性が高発現するヒト肝ミクロソームのプール）と共にインキュベートする。
【００６２】
１ｍＭ ＮＡＤＰＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、還元型）が存在しない又は存在する状態における、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．４）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有する不活性化反応物（最終体積１００μＬ）と０．７５μＭ〜２４μＭの濃度の試験化合物との反応物を、トリプリケートで３７℃にて３分間プレインキュベートする。高ＣＹＰ３Ａ活性ミクロソームプール（ＣｅｌｌｚＤｉｒｅｃｔ、Ａｕｓｔｉｎ ＴＸ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を添加することにより、不活化反応を開始させる。複合の時点（０、２．５、５、１０及び３０分）で、不活化反応混合物の５μＬのアリコートを採取し、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ及びミダゾラム（１００μＭ）を含有する予熱（３７℃）ＣＹＰ３Ａ４活性アッセイインキュベーション系（９５μＬ）で１／２０に希釈する。この活性アッセイ混合物を、最終タンパク濃度０．０２５ｍｇ／ｍＬ及び１／２０の阻害剤濃度で、更に１分間インキュベート（３７℃）した後、５０μＬのＭｅＯＨを添加することにより反応を停止させる。サンプルを混合し、変性タンパク質を１０分間４０００ｒｐｍで遠心分離することにより除去する。
【００６３】
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ ４μヒドロ−ＲＰカラムにて勾配溶出法でＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、１’−ＯＨミダゾラムの形成を分析する。（移動相Ａ−５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む９５／５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、移動相Ｂ−５ｍＭ酢酸アンモニウムを含む５／９５ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ）、ニードル洗浄用溶媒Ａ−９０／１０ アセトニトリル／Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ（ｖ／ｖ）中０．４％のトリフルオロ酢酸、ニードル洗浄用溶媒Ｂ−５０／５０ Ｍｉｌｌｉ−Ｑ（登録商標）Ｈ２Ｏ／メタノール（ｖ／ｖ））。陽性条件下でターボイオンスプレーを用いて、質量３４２．０（１−ＯＨ−ミダゾラム）及び３４７．０（α−ヒドロキシミダゾラム−ｄ３内部標準）で選択反応検出のためにＳｃｉｅｘ ＡＰＩ ４０００にサンプルを注入する。
【００６４】
ミクロソームインキュベーション物における１’−ＯＨミダゾラムの形成減少（ＣＹＰ３Ａ４活性）を、各試験化合物濃度についてプレインキュベーション時間の関数として、残存ＣＹＰ３Ａ４活性の対数パーセントとしてプロットする。データに以下の等式を適合させるためにＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌを使用して、不活化の動力学的パラメーターを決定する：
等式１：阻害率（ｔ）＝１００（ｔ＝０）×ｅ（−λｔ）
（式中、λは、以下の通り定義される
等式２：λ＝（ｋｉｎａｃｔ×Ｉ）／（ＫＩ＋Ｉ））。
【００６５】
実施例１ａの化合物の活性減少は、１１％〜２２％までの範囲であり、濃度依存性ではない。したがって、等式２からｋｉｎａｃｔ及びＫＩの値を決定することはできない。これらのデータに基づいて、実施例１ａの化合物はＣＹＰ３Ａ４の機序に基づく阻害剤ではない。機序に基づく不可逆的なＣＹＰ３Ａ４阻害能の低い又は示さない実施例１ａ等の化合物は、患者における投薬量を変化させたり、投薬を中止する必要性を生じさせたりし得る他の医薬との負の相互作用の可能性が低い。したがって、かかる化合物は望ましく、改善された安全性プロファイルを有する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
（式中、
Ｒ１は、水素又はメチルであり；
Ｒ２は、水素又はメチルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７は、独立して、水素、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、メチルスルホニル、又はトリフルオロメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも３つは水素である）
の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項２】
Ｒ１がメチルである、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項３】
Ｒ２がメチルである、請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項４】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、独立して、水素、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルである請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項５】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、独立して、水素、フルオロ、又はトリフルオロメチルである請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項６】
Ｒ４、Ｒ６及びＲ７が水素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項７】
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミドである請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項８】
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド塩酸塩である請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤と共に、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【請求項１０】
哺乳動物における脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される癌を治療する方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項１１】
治療において使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項１２】
癌の治療において使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項１】
式
【化１】
（式中、
Ｒ１は、水素又はメチルであり；
Ｒ２は、水素又はメチルであり；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６又はＲ７は、独立して、水素、フルオロ、クロロ、シアノ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ジフルオロメトキシ、メチルスルホニル、又はトリフルオロメチルスルホニルであるが、但し、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうちの少なくとも３つは水素である）
の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項２】
Ｒ１がメチルである、請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項３】
Ｒ２がメチルである、請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項４】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、独立して、水素、フルオロ、クロロ、トリフルオロメチル、又はメチルスルホニルである請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項５】
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、独立して、水素、フルオロ、又はトリフルオロメチルである請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項６】
Ｒ４、Ｒ６及びＲ７が水素である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項７】
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミドである請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項８】
４−フルオロ−Ｎ−メチル−Ｎ−（１−（４−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フタラジン−１−イル）ピペリジン−４−イル）−２−（トリフルオロメチル）ベンズアミド塩酸塩である請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
薬学的に許容できる担体、希釈剤、又は賦形剤と共に、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩を含む医薬組成物。
【請求項１０】
哺乳動物における脳癌、基底細胞癌、食道癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）、膵癌、胆道癌、前立腺癌、乳癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、肝癌、腎癌、黒色腫、頭頸部癌、中皮腫、軟部組織肉腫、骨肉腫、白血病及び睾丸癌から成る群から選択される癌を治療する方法であって、前記哺乳動物に有効量の請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項１１】
治療において使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【請求項１２】
癌の治療において使用するための請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物又はその薬学的に許容できる塩。
【公表番号】特表２０１２−５３０７０５（Ｐ２０１２−５３０７０５Ａ）
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５１６１７８（Ｐ２０１２−５１６１７８）
【出願日】平成２２年６月１５日（２０１０．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８５６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４７９１７
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年１２月６日（２０１２．１２．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年６月１５日（２０１０．６．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３８５６８
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１４７９１７
【国際公開日】平成２２年１２月２３日（２０１０．１２．２３）
【出願人】（５９４１９７８７２）イーライ リリー アンド カンパニー (301)
【Ｆターム（参考）】
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