位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法
本発明は、アルコールおよび特定ｐＨ下で生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体で処理して、位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体を高収率で調製する方法に関するものであって、前記方法は、生体内の活性が高く、血中半減期が著しく増加された多様なペプチド薬物の持続型剤形の開発において好ましく用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法に関するのもで、より詳しくは、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体と結合させ、上記結合体を高収率で調製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、安定性が低いため変性しやすく、体内のタンパク質加水分解酵素により分解され、比較的に小さいので腎臓を通して排泄される。よって、活性型のペプチド薬物の特定血中濃度を維持するためには、患者にペプチド薬物を頻繁に投与する必要がある。ところが、ペプチド薬物は通常注射剤として投与されるため、そのような頻繁に投与することは患者に厳しい負担を強いることになる。このような問題点を解決するために、ペプチド薬物の生体膜透過度を増加させ、口腔又は鼻腔による吸入によってペプチド薬物を伝達する方法、タンパク質加水分解酵素による分解を抑制することによってペプチドを安定化させるために、上記酵素に敏感な特定アミノ酸序列（例えば、ジペプチジルペプチダーゼによる力価損失を防ぐためのＧＬＰ−１アミノ酸序列）を変更する方法や、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」または「ペグ」と称する。）のように溶解度の高い非ペプチド性重合体をペプチド表面に化学的に付加させる方法などが開発された。
【０００３】
非ペプチド性重合体として用いられているＰＥＧは、標的ペプチドの特定部位又は多重部位に非特異的に結合して上記ペプチドの分子量を増加させ、腎臓からの消失を抑制し加水分解を防止するのに効果があって、特別な副作用も起こさない。例えば特許文献１は、うっ血性心不全症（Congestive heart failure）の治療剤として用いられるＢ型ナトリウム排泄増加ペプチド（Ｂ‐type natriuretic peptide、 ＢＮＰ）にＰＥＧを結合させ生理活性を持続させることに対して開示しており、特許文献２は、エキセンディン-4（Exendin−４）のリジン残基にＰＥＧを結合させ生体内の持続時間を延長させる方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０６／０７６４７１号
【特許文献２】米国特許第６,９２４,２６４号明細書
【特許文献３】韓国特願第２００８−６９２３４号明細書
【特許文献４】韓国公開特許第２００９−００８１５１号公報
【特許文献５】韓国登録特許第７７５３４３号公報
【特許文献６】韓国登録特許第７２５３１４号公報
【特許文献７】韓国登録特許第７２５３１５号公報
【特許文献８】韓国登録特許第８２４５０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらのような方法は、ＰＥＧの分子量を増加させペプチド薬物の生体内の持続時間を延長することはできるものの、分子量増加によってペプチド薬物の力価が著しく落ちてくる。さらには、ＰＥＧの非特異的結合が生理活性ポリペプチドの活性ドメインを遮って上記ポリペプチドの活性を著しく落とすこともある。
【０００６】
よって、非ペプチド性重合体が、活性に影響を及ぼさない位置特異的な方式で生理活性ポリペプチドにリンクされた、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との結合体を調製する改良方法を開発する必要がある。
【０００７】
本願発明者らは、ｐＨ及び反応溶液中のアルコール含量の調節によって、非ペプチド性重合体が位置特異的にリンクされた生理活性ポリペプチド結合体を高収率で調製できることから本発明を完成した。
【０００８】
従って、本発明の目的は、非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドに位置特異的に結合された生理活性ポリペプチド結合体を高収率で調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために本発明は、特定量のアルコールを含み、非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドのターゲットとする部位に結合するための、特定のｐＨを持つ反応溶液下において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体と反応させるステップ１、および上記ステップ１の反応混合物からアルコールを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体を分離及び精製するステップ２からなる、位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、生理活性ポリペプチドの特定位置に非ペプチド性重合体が結合された生理活性ポリペプチド結合体が高収率で収得できるので、生体内の活性が比較的高く維持され、血中半減期が著しく増加された多様なペプチド薬物の持続型剤型の開発において有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＤＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧの位置異性体(Positional isomer)の精製プロファイルである。
【図２】図２は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図３】図３は、様々なｐＨにおいて、ＣＡ−エキセンディン−４（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）をペグ化して得られるＬｙｓ２７−ペグ化された異性体を示すグラフである。
【図４】図４は、様々なｐＨおよび４５％のエタノール（ＥｔＯＨ）溶液において、ＣＡ−エキセンディン−４をペグ化して得られるＬｙｓ２７−ペグ化された異性体を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐＨ７．５および様々な含量（％）のエタノール溶液において、ＣＡ−エキセンディン−４をペグ化して得られるＬｙｓ２７−ペグ化された異性体を示すグラフである。
【図６】図６は、ｐＨ７．５および様々な含量（％）のイソプロパノール溶液において、ＣＡ−エキセンディン−４をペグ化して得られるＬｙｓ２７−ペグ化された異性体を示すグラフである。
【図７】図７は、ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図８】図８は、ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ２７）−ＰＥＧ異性体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図９】図９は、ペプチドマッピングによるＣＡ−エキセンディン−４のＬｙｓ１２−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図１０】図１０は、ペプチドマッピングによるＣＡ−エキセンディン−４のＬｙｓ２７−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図１１】図１１は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたオキシントモジュリン（Oxyntomodulin）−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図１２】図１２は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−オキシントモジュリン−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図１３】図１３は、ペプチドマッピングによるオキシントモジュリンのＬｙｓ３０−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図１４】図１４は、ＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムを用いたＣＡ−オキシントモジュリン−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体の精製プロファイルである。
【図１５】図１５は、ＣＡ−オキシントモジュリン−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図１６】図１６は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたオキシントモジュリン類似体−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図１７】図１７は、ペプチドマッピングによるオキシントモジュリン類似体のＬｙｓ２７−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図１８】図１８は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−オキシントモジュリン類似体−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図１９】図１９は、ペプチドマッピングによるＣＡ−オキシントモジュリン類似体のＬｙｓ２７−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図２０】図２０は、ＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムを用いたＣＡ−オキシントモジュリン類似体−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体の精製プロファイルである。
【図２１】図２１は、ＣＡ−オキシントモジュリン類似体−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図２２】図２２は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＧＬＰ−１−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図２３】図２３は、ペプチドマッピングによるＧＬＰ−１のＬｙｓ３４−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図２４】図２４は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−ＧＬＰ−１−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図２５】図２５は、ペプチドマッピングによるＣＡ−ＧＬＰ−１のＬｙｓ３４−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図２６】図２６は、ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラムを用いたＣＡ−ＧＬＰ−１−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体の精製プロファイルである。
【図２７】図２７は、ＣＡ−ＧＬＰ−１−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図２８】図２８は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＧＬＰ−２−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図２９】図２９は、ペプチドマッピングによるＧＬＰ−２のＬｙｓ３０−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図３０】図３０は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−ＧＬＰ−２−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図３１】図３１は、ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラムを用いたＣＡ−ＧＬＰ−２−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体の精製プロファイルである。
【図３２】図３２は、イミダゾ−アセチルＧＬＰ−２−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図３３】図３３は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたヒトインスリンＰＥＧ（Ｂ１Ｆ）の位置異性体の精製プロファイルである。
【図３４】図３４は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたヒトインスリンＰＥＧ（Ａ１Ｇ）の位置異性体の精製プロファイルである。
【図３５】図３５は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたヒトインスリンＰＥＧ（Ｂ２９Ｋ）の位置異性体の精製プロファイルである。
【図３６】図３６は、ペプチドマッピングによるヒトインスリンのＡ１Ｇ−ペグ化された異性体、Ｂ１Ｆ−ペグ化された異性体、及びＢ２９Ｋ−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、特定量のアルコールを含み、非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドの目的とする部位に結合するためのｐＨを持つ反応溶液下において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体と反応させるステップ１および上記ステップ１の反応混合物からアルコールを用いたイオン交換クロマトグラフィーによって位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体を分離及び精製するステップ２を含む、位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法を提供する。
【００１４】
本発明による生理活性ポリペプチド結合体は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の一末端が互いに共有結合で繋がっている物質のことを意味する。また、本発明は、特定条件下でポリペプチドと重合体とを繋ぎ、重合体がポリペプチドの目標とする位置に結合されたポリペプチド結合体を分離することを特徴とする。
【００１５】
本願において用いられている「生理活性ポリペプチド又はペプチド」とは、生体内で生理活性を示すことのできるペプチドを指すことであって、例えば、インスリン分泌ペプチド、血液因子、消化促進ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、腸管ホルモン、サイトカイン、酵素、成長因子、神経ペプチド（Neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、視床下部ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウィルスペプチド及び生理活性を持つ非天然型ペプチド誘導体よりなる群から選ばれることもできるが、これに限ることではない。より具体的には、上記生理活性ポリペプチド又はペプチドは、赤血球生成促進因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、アミリン、グルカゴン、インスリン、ソマソスタチン、ＰＹＹ（Peptide YY）、ＮＰＹ（Neuropeptide Y）、ＧＬＰ(Glucagon like peptide)−１、ＧＬＰ−２、エキセンディン−４、オキシントモジュリン、グレリン（Ghrelin）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxytocin）、バソプレシン（Vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、シクレチン（Secretin）、成長ホルモン放出ホルモン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）類、インタフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン(Orexin)、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン放出ペプチド、モチリン（Motilin）、血管作用性小腸ペプチド（Vasoactive Intestinal Peptide；ＶＩＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Atrial NatriureticPeptide；ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Brain NatriureticPeptide；ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-Type NatriureticPeptide；ＣＮＰ）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin Peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin Peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン （Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケパリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子収容体、ウロキナーゼ収容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ抑制剤、チモポエチン（Thymopoietin）、血清胸腺因子（Thymulin；Serum thymic factor（ＦＴＳ））、チモペンチン（Thymopentin）、胸腺ホルモン（Thymosin）、胸腺液性因子（Thymic Humoral Factor）アドレノメデュリン（Adrenomedullin；ＡＭ）、アラタ体抑制ホルモン（Allatostatin）、アミロイドβ-プロテイン断片（Amyloid Beta‐Protein Fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leukokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）及びフューゼオン（Fuzeon）よりなる群から選ばれる。さらに、上記生理活性ポリペプチドは、その前駆物質（precursor）、誘導体（derivative）、断片（fragment）または、変異体（variant）を含む。
【００１６】
本発明において用いられる望ましい生理活性ポリペプチドは、エキセンディン、インスリン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、オキシントモジュリン、グレリン、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、またはこれらの誘導体である。上記誘導体は、例えば、アミノ酸残基の任意のグループの化学的置換（例えば、α‐メチル化またはα−ヒドロキシル化）、除去（例えば、脱アミノ化（deamination）又は炭素欠失（carbon deletion））または、修飾（例えば、Ｎ−メチル化）によって調製することができ、特に、エキセンディン誘導体は、韓国特願第２００８−６９２３４号（特許文献３）の明細書に詳細に記述されている。
【００１７】
一方、本発明において用いられている用語「非ペプチド性重合体」とは、ペプチド結合を除いた共有結合により互いに繋がっている２個以上の反復単位を含む生体適合性重合体のことを指す。
【００１８】
本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸；polylactic acid）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸・グリコール酸；polylactic-glycolicacid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択されることができ、望ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。既に当該分野に知られているこれらの誘導体、または当該分野の技術水準で容易に調製可能な誘導体もまた本発明の範囲に含まれる。本発明において使用可能な非ペプチド性重合体は、生理活性ポリペプチドの分子量を増加させ腎臓からの結合体の消失を防ぐ働きをする。任意の非ペプチド性重合体が、生体内のたんぱく質分解酵素に抵抗性を持つ限り、制限なく用いることができる。上記非ペプチド性重合体の分子量は、０．５ｋＤａ乃至１００ｋＤａ，好ましくは０．５ｋＤａ乃至２０ｋＤａの範囲で、生理活性ポリペプチド：非ペプチド性重合体のモル比は、１：１乃至１：５０の範囲で適宜に選択することができる。
【００１９】
また、本発明において用いられる非ペプチド性重合体は、一末端または両末端に反応基を持つことができる。両末端に反応基を持つ非ペプチド性重合体の場合、持続型製剤としての機能を果たせるようにするための生理活性担体及びタンパク質薬物に結合することもできる。
【００２０】
上記非ペプチド性重合体の一末端または両末端の反応基は、反応性アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、およびスクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）よりなる群から選ばれることが好ましい。上記スクシニミドの例としては、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル、またはスクシンイミジルカーボネートが含まれる。特に、上記非ペプチド性重合体が一末端に反応性アルデヒド基または反応性スクシンイミド基を持つ場合、非特異的反応を最小化し、両末端にて生理活性ポリペプチドおよび生理活性担体と結合するのに効果的である。上記アルデヒド反応基は、低いｐＨにてアミノ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリジン残基に結合してアミン結合を形成することができる。さらに、スクシンイミド反応基は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０においてアミノ末端、またはリジン残基と安定したアミド結合を形成することができる。
【００２１】
また、上記非ペプチド性重合体の両末端反応基は、互い同様または違ってもよい。両末端に反応性ヒドロキシル基を持つポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応によって上記ヒドロキシル基を多様な反応基に活性化できるか、また修飾した反応基を持つ購買可能なポリエチレングリコールを用いることもできる。
【００２２】
本発明のステップ1は、適切な反応溶液下で非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドに位置特異的に結合させ生理活性ポリペプチド結合体を調製することである。
【００２３】
本願に用いられている用語「位置特異的」または「位置特異的に」とは、非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドの特定ターゲットアミノ酸に、望ましくは、リジン残基またはＮ末端のアミンに結合させることを意味する。上記位置特異的結合は、生理的に重要であるアミノ酸残基に非ペプチド性重合体が結合した意図しない結合体の形成を防止することをも指す。例えば、非ペプチド性重合体がエキセンディン−４のＮ末端に結合する場合、エキセンディン−４のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）活性が落ちる反面、非ペプチド性重合体がリジン残基に結合する場合、イン・ビトロ活性が維持された。特に１２番目のリジン残基よりも２７番目のリジン残基に非ペプチド性重合体が結合する場合、より高いイン・ビトロ活性が観察された（実施例１０および表２参照）。
【００２４】
本発明者らは、ステップ１で反応溶液内アルコールの存在および反応溶液のｐＨが、非ペプチド性重合体と生理活性ポリペプチドとの位置特異的結合の重要な因子であることを見つけた。従って、本発明のステップ１では、特定量のアルコールを含み、かつ、特定のｐＨをもつ反応溶液を用いて非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドの特定位置に結合させる。
【００２５】
本発明の具体例において、上記ポリペプチド結合体の特定位置の異性体比は、反応溶液のｐＨによって異なるか、同一のｐＨでアルコールの濃度(％)によって異なることもある。
【００２６】
つまり、本発明の上記ステップ１は、上記ポリペプチドの活性に影響を与えることもなく、目標とする（または、ターゲット）部位に非ペプチド性重合体が結合できるようにするための特定ｐＨにおいて行われる。上記ｐＨ範囲は、生理活性ポリペプチドの種類によって異なり得る。例えば、インスリン分泌ペプチド（例えば、エキセンディン−４）の場合、上記重合体が、１２番目リジン残基に結合した異性体は、低いｐＨの反応溶液から高い比率で観察される反面、上記重合体が、インスリン分泌活性に影響しない２７番目リジン残基に結合した異性体は、高いｐＨの反応溶液から高い比率で観察された（実施例３および図３を参照）。従って、上記非ペプチド性重合体を２７番目リジン残基に、選択的に結合させるために、ｐＨ７．５乃至ｐＨ９．０においてステップ１を行うことが好ましい。
【００２７】
また、本発明の上記ステップ１は、非ペプチド性重合体が上記ポリペプチドの活性に影響しない部位に結合できるようにするために、アルコールを含んでいる反応溶液下で行われる。上記アルコールの例としては、第１級、第２級および第３級アルコール、好ましくは、１乃至１０の炭素数をもつアルコール、より好ましくは、エタノールまたはイソプロパノールを含む。インスリン分泌ペプチド（例えば、エキセンディン−４）の場合、インスリン分泌活性に影響を与えない２７番目リジン残基に非ペプチド性重合体を結合させるために、反応溶液中のアルコールが、反応溶液全体積を基準にして０．１ボリューム％乃至１００ボリューム％、好ましくは、２５ボリューム％乃至９０ボリューム％、より好ましくは、３５ボリューム％乃至６０ボリューム％範囲の量で存在してもよい。
【００２８】
本発明の一具体例において、生理活性ポリペプチドがエキセンディン−４またはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＬｙｓ２７に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。本発明の別の具体例において、生理活性ポリペプチドがカルシトニンの場合、非ペプチド性重合体がＮ末端に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、４．０乃至６．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがオキシントモジュリン、またはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＬｙｓ２７またはＬｙｓ３０に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがヒトインスリンまたはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＢ鎖のＰｈｅ１（１番目のフェニルアラニン）Ｎ末端に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、４．０乃至６．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがヒトインスリンまたはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＡ鎖のＧｌｙ１（１番目のグリシン）Ｎ末端に結合するか、Ｂ鎖のＬｙｓ２９（２９番目のリジン残基）に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがＧＬＰ−１またはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＬｙｓ３４に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがＧＬＰ−２またはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＬｙｓ３０に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。
【００２９】
従って、本発明の好ましい位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体は、ＰＥＧがＬｙｓ２７に結合されたエキセンディン−４結合体、ＰＥＧがＮ末端に結合されたカルシトニン結合体、ＰＥＧがＬｙｓ２７またはＬｙｓ３０に結合されたオキシントモジュリン結合体またはこれの類似体、ＰＥＧがＢ鎖のＰｈｅ１のＮ末端に結合するか、Ａ鎖のＧｌｙ１のＮ末端に結合するか、Ｂ鎖のＬｙｓ２９に結合されたヒトインスリン結合体またはこれの類似体、またはＰＥＧがＬｙｓ３４またはＬｙｓ３０に結合されたＧＬＰ−１またはＧＬＰ−２である。
【００３０】
望ましい一態様として、非ペプチド性重合体および生理活性ポリペプチド間の位置特異的結合をより促すためにペプチド誘導体（または類似体）が用いられてもよい。上記誘導体は望まない結合を防ぐために、他の非ターゲットアミノ酸部位中一部が除去されるか保護されたペプチドである。例えば、インスリン分泌ペプチドの一種であるエキセンディンの場合、Ｎ末端アミノ酸であるヒスチジンのαアミン基を除去したり、上記Ｎ末端アミン基をヒドロキシル基に置換したり、ヒスチジンのＮ末端αアミン基を２つのメチル基に変更させたり、Ｎ末端ヒスチジンのα炭素および上記α炭素に結合しているアミン基を除去してイミダゾアセチル（imidazoacetyl）基だけを残す方法などを用いて調製された、化学式１のデス−アミノ−ヒスチジル（ＤＡ）−エキセンディン−４（Des-amino-histidyl(DA)-exendin-4）、化学式２のβ−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル（ＨＹ）−エキセンディン−４（Beta-hydroxy-imidazopropionyl(HY)-exendin-4）、化学式３のイミダゾアセチル（ＣＡ）−エキセンディン−４（Imidazoacetyl(CA)-exendin-4）、および化学式４のジメチル−ヒスチジル（ＤＭ）−エキセンディン−４（Dimethyl-histidyl(DM)-exendin-4）などと、様々なエキセンディン誘導体が用いられることもできるが、これに制限されることではない。このようなエキセンディン誘導体および調製方法は、大韓民国特許公開第２００９−００８１５１号（特許文献３）に開示されており、これは参考文献として本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
【化１】
【００３２】
【化２】
【００３３】
【化３】
【００３４】
【化４】
【００３５】
上記と同様にして、１番目のアミノ酸がヒスチジンであるオキシントモジュリン、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２もまた化学式１乃至４から選ばれる任意の構造を持つ誘導体として用いられてもよい。
【００３６】
特定の一具体例において、本発明者等は、反応溶液のｐＨおよびアルコールの含量（％）が、非ペプチド性重合体の位置特異的な結合態様に及ぶ影響を調査して、重合体が１２番目リジン残基／２７番目リジン残基に結合されたインスリン分泌ペプチドの比率が特にｐＨおよびエタノールまたはイソプロパノールの量によって異なることを確認した。特に、ｐＨ７．５において３５％乃至５５％、好ましくは約４５％のエタノールまたはイソプロパノールを用いる場合、非ペプチド性重合体が２７番目リジン残基に結合された、より好ましい異性体が多量に得られた。
【００３７】
上記ステップ１において、特定のｐＨおよびアルコールの含量で調節して、目的とする非ペプチド性重合体−生理活性ポリペプチド結合体の比率を高めた後、ステップ２においては、アルコールおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いて、上記目的とする結合体を分離および精製することができる。
【００３８】
ステップ２で用いられたアルコールは精製溶液に存在しており、その特定例としてはステップ１においての定義と同様である。しかし、ステップ１で上記アルコールは、上記ポリペプチドの２次又は３次構造を変化させ、反応性および位置選択性を増加させるべく使用されている反面、ステップ２のアルコールは、イオン交換カラムと上記結合体との間の相互作用を減らして、位置特異的生理活性ポリペプチド結合体の分離および精製を容易にするべく用いられる。上記分離および精製は、当該技術分野の熟練者に知られている様々な方法、好ましくは、イオン交換クロマトグラフィー、より好ましくは、高圧イオン交換クロマトグラフィーを利用して行うことができる。
【００３９】
一方、位置異性体の分離および精製を容易にするために、特定のｐＨにおいてイオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。上記ｐＨは、ステップ１では上記結合体の位置選択性を増加させるために適宜調整される反面、ステップ２において本段階では、アルコールが含まれた精製溶液上において安定してイオン交換カラムに上記結合体を付着および脱着させるために再調整する。ステップ２で用いられる適切なｐＨは約２．０乃至約６．０の範囲でよい。
【００４０】
さらに、本発明の生理活性ポリペプチド結合体は、加えて生理活性担体と結合してもよい。この場合、上記非ペプチド性重合体は、生理活性担体と結合するために両末端を持つ非ペプチド性重合体でなければならない。つまり、生理活性ポリペプチドと共有結合していない非ペプチド性重合体の末端に生理活性担体を共有結合として繋いで、非ペプチド性重合体の両末端が生理活性ポリペプチドおよび生理活性担体と結合された結合体を調製することができる。
【００４１】
前述のように、ステップ２で調製された生理活性ポリペプチド結合体は、さらに生理活性担体と結合することもでき、最終的に生成されたポリペプチド−重合体−担体結合体は、ポリペプチド−重合体結合体とは全く異なる活性、つまり、生理活性ポリペプチドの薬理効果の優れた持続性の延長、治療を望む病巣のような特定部位へのターゲティング、または細胞壊死の誘導等のような卓越な生理活性を示す。
【００４２】
本発明で用いられる用語「生理活性担体」とは、非ペプチド性重合体に生理活性ポリペプチドとともに結合され、上記ポリペプチドの薬理効果のような生理活性を持続させたり、特定部位へのターゲティングだったり、または細胞壊死を誘導させることのできる、天然のポリペプチドとは別の付加的な活性を示す生理活性物質のことを意味する。
【００４３】
本発明で用いられる生理活性担体は、前述の活性を制限なく持つ物質、例えば、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、トランスフェリン、アプタマー、トキシン、ジェラチン、コラーゲン、デキストラン、多糖類、脂肪酸、フィブリノゲン等を含む。好ましくは、上記生理活性担体は、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、およびトランスフェリンから生理活性担体を選ぶことができ、より好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００４４】
本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除く、重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）のことを指す。その重鎖不変領域にヒンジ（hinge）領域をさらに含むこともできる。また、天然型の免疫グロブリンＦｃと実質的に同等または向上された生理的機能を持つ限り、重鎖および軽鎖可変領域を除いて、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、一部また全部の重鎖不変領域１（ＣＨ１）および／または軽鎖不変領域（ＣＬ１）を含む拡張された形態でもよく、リン酸化、硫酸化、アクリル化、糖化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、およびアミド化等によって修飾される免疫グロブリンＦｃ領域を含むことができる。上記免疫グロブリンＦｃの範囲、その調製方法および免疫グロブリンＦｃを非ペプチド性重合体−生理活性ポリペプチド結合体に共有結合させる方法は、韓国登録特許第７７５３４３号公報（特許文献４）、第７２５３１４号公報（特許文献５）、第７２５３１５号（特許文献６）および第８２４５０５号公報（特許文献７）に開示されており、これらは参考文献であって、本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
本発明の方法によると、生理活性ポリペプチドの特定アミノ酸に位置特異的に非ペプチド性重合体を結合させることにとって、付加的結合体の生成を最小化しながら優れた生理活性を持つ、目的とする結合体を高収率で生成することができる。
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明の権利範囲はこれらの実施例により限定するものではない。
【００４７】
（実施例１）
ペグ化されたＤＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の調製および分離
＜１−１＞ペグ化されたＤＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の調製
ペプチド内のＬｙｓをＰＥＧと共有結合させてペグ化されたペプチド結合体を調製するべく、３ｍｇ／ｍＬ濃度のデス−アミノ−ヒスチジル−エキセンディン−４（ＤＡ−エキセンディン−４、ＡＰ社、米国）および３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧ（２つのプロピオンアルデヒド基を持つＰＥＧ、ＩＤＢ社、韓国）を１：３０のモル比に、４℃において１２時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を使用し、これに還元剤であるＮａＣＮＢＨ３を２０ｍＭ添加した。
【００４８】
＜１−２＞位置異性体の分離
上記ステップ＜１−１＞の反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｑ イオン交換クロマトグラフィー（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社、韓国）を利用して下記の条件下にて一時的にモノペグ化された（Mono-pegylated）ペプチドを精製し、これをＳＯＵＲＣＥ Ｓイオン交換クロマトグラフィー（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社、韓国）を利用して下記の条件下にて位置異性体を分離した。この過程で精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした。ペプチドマッピング方法によって溶出されたピークからペグ化した位置を確認した。
【００４９】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５）およびＢ（Ａ+０．５ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→４０％、８０分
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+４５％のエタノール+０．５ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→１００％、４５分
位置異性体の精製プロファイル分析から、Ｌｙｓ１２−ペグ化されたＤＡ−エキセンディン−４のピークが最前に出て、その後方にＬｙｓ２７−ペグ化されたピークが溶出されたことが分かった（図１）。
【００５０】
（実施例２）
ペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の調製および分離
実施例１において、ＤＡ−エキセンディン−４の代わりにイミダゾ−アセチル−エキセンディン−４（ＣＡ−エキセンディン−４、バッヘム（Ｂａｃｈｅｍ）社、米国）を用いることを除いては、実施例１の過程を繰り返してペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体を収得した。位置異性体の精製プロファイル分析から、Ｌｙｓ１２−ペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４のピークが最前に出て、その後方にＬｙｓ２７−ペグ化されたピークが溶出されたことが分かった（図２）。
【００５１】
（実施例３）
反応溶液のｐＨによるペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の比率変化
ｐＨによる特定位置にペグ化されたポリペプチドの比率変化を調べるために、ＣＡ−エキセンディン−４と３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：３０のモル比に、ＣＡ−エキセンディン−４の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させペグ化した。この時、反応溶液として各々１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．０）、１００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）、１００ｍＭのＮａ−Ｐ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａ−Ｐ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、および１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ９．２）の緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。各反応液を実施例１と同様の方法で精製した後、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率を分析した。図３から分かるように、ｐＨが高くなるほどＬｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率が増加することが表れて、最適のｐＨは７．０乃至１０．０である。
【００５２】
（実施例４）
エタノールを含んだ反応溶液のｐＨによるペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の比率変化
エタノールおよびｐＨによる特定位置にペグ化されたポリペプチドの比率変化を調べるために、ＣＡ−エキセンディン−４と３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：３０のモル比に、ＣＡ−エキセンディン−４の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させペグ化した。この時、反応溶液として各々１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．０）／４５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）／４５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＮａ−Ｐ（ｐＨ７．５）／４５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）／４５％ＥｔＯＨ、および１００ｍＭのＮａ−Ｐ（ｐＨ８．５）／４５％ＥｔＯＨの緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加し反応させた。各反応液を実施例１と同様の方法で精製した後、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率を分析した。図４から分かるように、４５％エタノールが含まれた反応液においてｐＨが高くなるほどＬｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率が増加していて、最適のｐＨは７．０乃至９．０と確認された。
【００５３】
（実施例５）
反応溶液内のエタノール濃度によるペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の比率変化
反応溶液内のエタノール濃度による特定位置にペグ化されたポリペプチドの比率変化を調べるために、ＣＡ−エキセンディン−４と３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：３０のモル比に、ＣＡ−エキセンディン−４の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させペグ化した。この時、反応溶液として各々１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／０％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／２５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／３５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／４５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／５５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／７５％ＥｔＯＨ、および１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／９０％ＥｔＯＨの緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加し反応させた。各反応液を実施例１と同様の方法で精製した後、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率を分析した。図５から分かるように、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率は、エタノール含量が約５０％に達するまでは増加する半面、５０％以上では減少していて、最適のエタノール含量は３５％乃至６０％と確認された。
【００５４】
（実施例６）
反応溶液内のイソプロパノール濃度によるペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の比率変化
反応溶液としてエタノールの代わりにイソプロパノールを用いることによって特定位置にペグ化されたポリペプチドの比率変化を調べるために、ＣＡ−エキセンディン−４と３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：３０のモル比に、ＣＡ−エキセンディン−４の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させペグ化した。この時、反応溶液は各々１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／０％イソプロパノール、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／３０％イソプロパノール、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／４５％イソプロパノール、および１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／６０％イソプロパノールの緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。各反応液を実施例１と同様の方法で精製した後、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率を分析した。図６から分かるように、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率は、イソプロパノール含量が約５０％に達するまでは増加する半面、５０％以上では減少していて、最適のイソプロパノール含量は３５％乃至６０％と確認された。
【００５５】
（実施例７）
ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の調製
ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧ結合体とヒト免疫グロブリンＦｃ断片（ハンミ薬品社、韓国）を１：８のモル比に、ペプチド濃度を２０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１６時間反応させてから、上記結合体を断片と結合させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのＫ−Ｐ（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。上記の結合反応後、下記の条件下でＳＯＵＲＣＥ ＰｈｅカラムおよびＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムを利用して２段階で精製した。
【００５６】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅ（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１．５ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配 ０→４０％、８０分
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→４０％、８０分
上記調製された結合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図７から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００５７】
（実施例８）
ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧ結合体のペグ化位置確認
ＣＡ−エキセンディン−４にＰＥＧが結合された位置を確認するために、それぞれのＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ結合体を、たんぱく分解酵素のリジン−Ｃで切断した後、逆相クロマトグラフィーを用いて分析した。
【００５８】
具体的に、それぞれのＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ異性体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後（図８）、精製されたＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ結合体およびＣＡ−エキセンディン−４をトリエチルアミン−塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ；ｐＨ７．５）に溶解してから１０μＬの酵素（０．１ｍｇ／ｍＬ）を加え３７℃にて４時間反応させた。反応終了後、反応混合物を逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ｊｕｐｉｔｅｒ‐Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））により分析した。上記分析結果を図９および図１０に示す。図９から分かるように、Ｌｙｓ１２−ペグ化したＣＡ−エキセンディン−４異性体は♯１と♯２が同時に消えることによって、確認することができ、図１０から分かるように、Ｌｙｓ２７−ペグ化したＣＡ−エキセンディン−４異性体は♯２と♯３が同時に消えることによって、確認することができた。
【００５９】
（実施例９）
Ｎ末端ペグ化時のイソプロパノール濃度によるペグ化収率の確認
メトキシポリエチレングリコール５ＫのＡＬＤ（ＮＯＦ社、日本）をサケカルシトニン（バッヘム社、米国）のＮ末端にペグ化させるために、サケカルシトニンとＰＥＧを１：１のモル比に、サケカルシトニンの濃度を１ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１時間反応させペグ化した。この時反応溶液として各々１００ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．２）／０％イソプロパノール、１００ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．２）／４５％イソプロパノール緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。各反応液からＳＯＵＲＣＥ Ｓカラム（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）を用いて下記の条件下でモノ−ペグ化されたペプチドを精製した。その結果を下記表１に示す。
【００６０】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．５ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭアセテートｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→４０％、６０分
【００６１】
【表１】
【００６２】
上記表１から分かるように、ペグ化されたカルシトニンの収率は、イソプロパノール添加により増加した。
【００６３】
（実施例１０）
ペグ化およびペグ化位置によるエキセンディン−４のイン・ビトロ活性の測定
ペグ化およびペグ化位置によるエキセンディン−４持続型製剤の効力を測定するために、イン・ビトロ活性を測定する方法を利用した。ＧＬＰ−１のイン・ビトロ活性測定は、ＧＬＰ−１収容体をクローニングさせたＣＨＯ細胞株にＧＬＰ−１を処理した後、細胞内のｃＡＭＰの増加可否を測定する方法である。
【００６４】
具体的には、ＧＬＰ−１がクローニングされた細胞株であるＣＨＯ／ＧＬＰ−１ＲにＧＬＰ−１、エキセンディン−４および下記の表２に記載の試験物質を濃度別に処理した。ｃＡＭＰの発生具合を測定して、ＥＣ５０値を互いに比較した。対照群としては、市販されているＢｙｅｔｔａ（バイエッタ、イーライリリー(Eli Lilly）社)を用いた。試験物質の処理によるイン・ビトロ力価（％）を下記表２に示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】
上記表２から分かるように、Ｌｙｓ２７にＰＥＧが修飾された場合、Ｌｙｓ１２にＰＥＧが修飾された場合に比べ、相対的にペプチドの生理活性が少なく影響されることが表れている。
【００６７】
（実施例１１）
ペグ化されたオキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）結合体の調製および分離
＜１１−１＞ペグ化されたオキシントモジュリン結合体（Ｌｙｓ３０）の調製
ペグ化されたオキシントモジュリン結合体を調製するために、オキシントモジュリン（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）および３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：１５のモル比に、オキシントモジュリンの濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて４．５時間反応させてペグ化した。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００６８】
＜１１−２＞位置異性体の分離
上記反応液から ＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、
アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用してＬｙｓ３０−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図１１）。
【００６９】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配０→４０％、２２２分
（実施例１２）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）結合体の調製および分離
前記実施例１１において、オキシントモジュリンの代わりにイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）を用いることと、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含むｐＨ７．５の１００ｍＭ濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液を用いることとを除いては、実施例１１の過程を繰り返してペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）結合体を調製した。
【００７０】
ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを利用して分離した異性体の結果を図１２に示し、Ａｓｐ−Ｎタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング結果を図１３に示す。図１３から分かるようにＰＥＧがＬｙｓ３０に修飾され、♯４：Ａｓｐ（２２）−（３７）部分が消えた。
【００７１】
（実施例１３）
イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体調製
イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン−ＰＥＧ（Ｌｙｓ３０）結合体と免疫グロブリンＦｃ（ハンミ薬品社、韓国）を１：１０のモル比に、全体のたんぱく質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１６時間反応させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応終了後、反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑカラムを用いて下記の条件下で精製した。
【００７２】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→２０％、１００分
Ｌｙｓ３０−ペグ化されたＣＡ−オキシントモジュリンを免疫グロブリンＦｃと結合させた後、ＳＯＵＲＣＥ Ｑで精製して得られたクロマトグラムを図１４に示し、ＣＡ−オキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図１５に示す。図１５から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００７３】
（実施例１４）
ペグ化されたオキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）結合体の調製および分離
＜１４−１＞ペグ化されたオキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをオキシントモジュリン類似体([20Ａｓｐ、２４Ａｌａ、２８Ｓｅｒ]−オキシントモジュリン−[Deletion３０−３７])のリジン残基にペグ化させるために、ＰＥＧおよびオキシントモジュリン類似体（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）を１：１５のモル比に、オキシントモジュリン類似体の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて３．５時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００７４】
＜１４−２＞位置異性体の分離
上記反応液から ＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用してＬｙｓ２７−ペグ化された位置異性体を精製した。精製および分離条件は実施例１１と同様である。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図１６）。精製したモノ−ペグ化されたオキシントモジュリン類似体のリジン選択性をＬｙｓ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図１７）。図１７から分かるようにＰＥＧがＬｙｓ２７に修飾され♯２部分が消えた。
【００７５】
（実施例１５）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）結合体の調製および分離
＜１５−１＞ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体([20Ａｓｐ、２４Ａｌａ、２８Ｓｅｒ]−オキシントモジュリン−[Deletion３０−３７])のリジン残基にペグ化させるために、上記イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）およびＰＥＧを１：１０のモル比に、イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて２．５時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００７６】
＜１５−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用してＬｙｓ２７−ペグ化された位置異性体を精製した。精製および分離条件は実施例１１と同様である。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図１８）。精製したモノ−ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体のリジン選択性をＬｙｓ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図１９）。図１９から分かるように、ＰＥＧがＬｙｓ２７に修飾され♯２部分が消えた。
【００７７】
（実施例１６）
ペグ化された類似体イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）および免疫グロブリンＦｃの結合体調製および分離
上記実施例１５で調製した、Ｌｙｓ２７−ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃを１：１０のモル比に、全体のたんぱく質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１６時間反応させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応終了後、反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑカラムを用いて下記の条件下で精製した。
【００７８】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→２０％、１００分
Ｌｙｓ２７−ペグ化されたＣＡ−オキシントモジュリン類似体を免疫グロブリンＦｃと結合させた後、ＳＯＵＲＣＥ Ｑで精製して得られたクロマトグラムを図２０に示し、ＣＡ−オキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図２１に示す。図２１から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００７９】
（実施例１７）
ペグ化されたＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）結合体の調製および分離
＜１７−１＞ペグ化されたＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをＧＬＰ−１（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）のリジン残基にペグ化させるために、ＧＬＰ−１およびＰＥＧを１：１５のモル比に、ＧＬＰ−１の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて３．５時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００８０】
＜１７−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３４−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図２２）。精製したモノ−ペグ化されたＧＬＰ−１のリジン選択性をＬｙｓ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図２３）。
【００８１】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配０→４０％、１５０分
図２３から分かるように、ＰＥＧがＬｙｓ３４に修飾され♯２部分が消えた。
【００８２】
（実施例１８）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）結合体の調製および分離
＜１８−１＞ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）のリジン残基にペグ化させるために、イミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１およびＰＥＧを１：１０のモル比に、イミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて４時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００８３】
＜１８−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３４−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図２４）。精製したモノ−ペグ化されたＣＡ−ＧＬＰ−１のリジン選択性をＧｌｕ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図２５）。
【００８４】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配３→４０％、１５０分
図２５から分かるように、ＰＥＧがＬｙｓ３４に修飾され♯４部分が消えることが確認できた。
【００８５】
（実施例１９）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）および免疫グロブリンＦｃの結合体調製および分離
上記実施例１８で調製した、Ｌｙｓ３４−ペグ化されたイミダゾ−アセチルＧＬＰ−１−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃを１：８のモル比に、全体のたんぱく質の濃度を５０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１７時間反応させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応終了後、反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラムを用いて下記の条件下で精製した。
【００８６】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+２ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配１００→０％、１００分
Ｌｙｓ３４−ペグ化されたＣＡ−ＧＬＰ−１異性体を免疫グロブリンＦｃと結合させた後、ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅで精製して得られたクロマトグラムを図２６に示し、ＣＡ−ＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図２７に示す。図２７から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００８７】
（実施例２０）
ペグ化されたＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）結合体の調製および分離
＜２０−１＞ペグ化されたＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをＧＬＰ−２（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）のリジン残基にペグ化させるために、ＧＬＰ−２およびＰＥＧを１：１２のモル比に、ＧＬＰ−２の濃度を５ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて３時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００８８】
＜２０−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３０−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図２８）。リジン選択性を、トリプシンタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図２９）。
【００８９】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配３→４０％、１５０分
図２９から分かるように、ＰＥＧがＬｙｓ３０に修飾され♯２部分が消えることが確認できた。
【００９０】
（実施例２１）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）結合体の調製および分離
＜２１−１＞ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）のリジン３０残基にペグ化させるために、イミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２およびＰＥＧを１：２０のモル比に、イミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて６時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００９１】
＜２１−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３０−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図３０）。
【００９２】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配３→４０％、１５０分
（実施例２２）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）および免疫グロブリンＦｃの結合体調製および分離
上記実施例２１で調製した、Ｌｙｓ３０−ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃを１：１５のモル比に、全体のたんぱく質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１６時間反応させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応終了後、上記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラムを用いて下記の条件下で精製した。
【００９３】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+２ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配１００→０％、１００分
Ｌｙｓ３０−ペグ化されたＣＡ−ＧＬＰ−２異性体を免疫グロブリンＦｃと結合させた後、ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅで精製して得られたクロマトグラムを図３１に示し、ＣＡ−ＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図３２に示す。図３２から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００９４】
（実施例２３）
ペグ化されたヒトインスリン（Ｂ１Ｐｈｅ）結合体の調製および分離
＜２３−１＞ペグ化されたヒトインスリン（Ｂ１Ｐｈｅ）結合体の調製
５ＫプロピオンＡＬＤ（１）メトキシＰＥＧ（１つのプロピオンアルデヒド基を持つＰＥＧ、ＮＯＦ社、日本）をヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）内Ｂ鎖の１番目アミノ酸であるフェニルアラニンのＮ末端にペグ化させるために、ＰＥＧおよびヒトインスリンを１：２のモル比に、ヒトインスリンの濃度を２．３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００９５】
＜２３−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３０−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図３３）。溶出されたピークのモノ−ペグ化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認し、Ｇｌｕ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いてリジン選択性を確認した（図３６）。
【００９６】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ２．０+６０％のエタノール）およびＢ（Ａ+０．５ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配０→５０％、８０分
図３６から分かるように、ＰＥＧがＢ１Ｆに修飾され♯２部分が消えた。
（実施例２４）
ペグ化されたヒトインスリン（Ａ１Ｇｌｙ）結合体の調製および分離
＜２４−１＞ペグ化されたヒトインスリン（Ａ１Ｇｌｙ）結合体の調製
５ＫメトキシＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（１）（１つのＳＢＡ反応基を持つＰＥＧ、ＮＯＦ社、日本）をヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）内Ａ鎖の１番目アミノ酸であるグリシンのＮ末端にペグ化させるために、ＰＥＧおよびヒトインスリンを１：４のモル比に、ヒトインスリンの濃度を２ｍｇ／ｍＬにして、２５℃にて３時間反応させた。この時、反応溶液として３５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた。
【００９７】
＜２４−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して位置異性体を精製した。精製過程は実施例２３と同様にして行った。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図３４）。溶出されたピークのモノ−ペグ化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認し、Ｇｌｕ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いてリジン選択性を確認した（図３６）。
【００９８】
図３６から分かるように、ＰＥＧがＡ１Ｇに修飾され♯１部分が消えた。
（実施例２５）
ペグ化されたヒトインスリン（Ｂ２９Ｌｙｓ）結合体の調製および分離
＜２５−１＞ペグ化されたヒトインスリン（Ｂ２９Ｌｙｓ）結合体の調製
５ＫメトキシＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（１）をヒトインスリン内Ｂ鎖の２９番目アミノ酸であるリジン残基にペグ化させるために、ＰＥＧおよびヒトインスリンを１：２のモル比に、ヒトインスリンの濃度を２ｍｇ／ｍＬにして、２５℃にて１時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた。
【００９９】
＜２５−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して位置異性体を精製した。精製過程は実施例２３と同様にして行った。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図３５）。溶出されたピークのモノ−ペグ化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認し、Ｇｌｕ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いてリジン選択性を確認した（図３６）。
【０１００】
図３６から分かるように、ＰＥＧがＢ２９Ｋに修飾され♯４部分が消えた。
【０１０１】
上記具体的な実施例とともに本発明を述べたが、添付の特許請求の範囲により定義された本発明の範囲内において、当分野の熟練者は本発明を多様に変形および変化させることができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法に関するのもで、より詳しくは、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体と結合させ、上記結合体を高収率で調製する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、安定性が低いため変性しやすく、体内のタンパク質加水分解酵素により分解され、比較的に小さいので腎臓を通して排泄される。よって、活性型のペプチド薬物の特定血中濃度を維持するためには、患者にペプチド薬物を頻繁に投与する必要がある。ところが、ペプチド薬物は通常注射剤として投与されるため、そのような頻繁に投与することは患者に厳しい負担を強いることになる。このような問題点を解決するために、ペプチド薬物の生体膜透過度を増加させ、口腔又は鼻腔による吸入によってペプチド薬物を伝達する方法、タンパク質加水分解酵素による分解を抑制することによってペプチドを安定化させるために、上記酵素に敏感な特定アミノ酸序列（例えば、ジペプチジルペプチダーゼによる力価損失を防ぐためのＧＬＰ−１アミノ酸序列）を変更する方法や、ポリエチレングリコール（以下、「ＰＥＧ」または「ペグ」と称する。）のように溶解度の高い非ペプチド性重合体をペプチド表面に化学的に付加させる方法などが開発された。
【０００３】
非ペプチド性重合体として用いられているＰＥＧは、標的ペプチドの特定部位又は多重部位に非特異的に結合して上記ペプチドの分子量を増加させ、腎臓からの消失を抑制し加水分解を防止するのに効果があって、特別な副作用も起こさない。例えば特許文献１は、うっ血性心不全症（Congestive heart failure）の治療剤として用いられるＢ型ナトリウム排泄増加ペプチド（Ｂ‐type natriuretic peptide、 ＢＮＰ）にＰＥＧを結合させ生理活性を持続させることに対して開示しており、特許文献２は、エキセンディン-4（Exendin−４）のリジン残基にＰＥＧを結合させ生体内の持続時間を延長させる方法を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第０６／０７６４７１号
【特許文献２】米国特許第６,９２４,２６４号明細書
【特許文献３】韓国特願第２００８−６９２３４号明細書
【特許文献４】韓国公開特許第２００９−００８１５１号公報
【特許文献５】韓国登録特許第７７５３４３号公報
【特許文献６】韓国登録特許第７２５３１４号公報
【特許文献７】韓国登録特許第７２５３１５号公報
【特許文献８】韓国登録特許第８２４５０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
これらのような方法は、ＰＥＧの分子量を増加させペプチド薬物の生体内の持続時間を延長することはできるものの、分子量増加によってペプチド薬物の力価が著しく落ちてくる。さらには、ＰＥＧの非特異的結合が生理活性ポリペプチドの活性ドメインを遮って上記ポリペプチドの活性を著しく落とすこともある。
【０００６】
よって、非ペプチド性重合体が、活性に影響を及ぼさない位置特異的な方式で生理活性ポリペプチドにリンクされた、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体との結合体を調製する改良方法を開発する必要がある。
【０００７】
本願発明者らは、ｐＨ及び反応溶液中のアルコール含量の調節によって、非ペプチド性重合体が位置特異的にリンクされた生理活性ポリペプチド結合体を高収率で調製できることから本発明を完成した。
【０００８】
従って、本発明の目的は、非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドに位置特異的に結合された生理活性ポリペプチド結合体を高収率で調製する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために本発明は、特定量のアルコールを含み、非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドのターゲットとする部位に結合するための、特定のｐＨを持つ反応溶液下において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体と反応させるステップ１、および上記ステップ１の反応混合物からアルコールを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体を分離及び精製するステップ２からなる、位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法を提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によると、生理活性ポリペプチドの特定位置に非ペプチド性重合体が結合された生理活性ポリペプチド結合体が高収率で収得できるので、生体内の活性が比較的高く維持され、血中半減期が著しく増加された多様なペプチド薬物の持続型剤型の開発において有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＤＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧの位置異性体(Positional isomer)の精製プロファイルである。
【図２】図２は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図３】図３は、様々なｐＨにおいて、ＣＡ−エキセンディン−４（Ｅｘｅｎｄｉｎ−４）をペグ化して得られるＬｙｓ２７−ペグ化された異性体を示すグラフである。
【図４】図４は、様々なｐＨおよび４５％のエタノール（ＥｔＯＨ）溶液において、ＣＡ−エキセンディン−４をペグ化して得られるＬｙｓ２７−ペグ化された異性体を示すグラフである。
【図５】図５は、ｐＨ７．５および様々な含量（％）のエタノール溶液において、ＣＡ−エキセンディン−４をペグ化して得られるＬｙｓ２７−ペグ化された異性体を示すグラフである。
【図６】図６は、ｐＨ７．５および様々な含量（％）のイソプロパノール溶液において、ＣＡ−エキセンディン−４をペグ化して得られるＬｙｓ２７−ペグ化された異性体を示すグラフである。
【図７】図７は、ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図８】図８は、ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ１２およびＬｙｓ２７）−ＰＥＧ異性体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図９】図９は、ペプチドマッピングによるＣＡ−エキセンディン−４のＬｙｓ１２−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図１０】図１０は、ペプチドマッピングによるＣＡ−エキセンディン−４のＬｙｓ２７−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図１１】図１１は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたオキシントモジュリン（Oxyntomodulin）−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図１２】図１２は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−オキシントモジュリン−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図１３】図１３は、ペプチドマッピングによるオキシントモジュリンのＬｙｓ３０−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図１４】図１４は、ＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムを用いたＣＡ−オキシントモジュリン−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体の精製プロファイルである。
【図１５】図１５は、ＣＡ−オキシントモジュリン−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図１６】図１６は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたオキシントモジュリン類似体−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図１７】図１７は、ペプチドマッピングによるオキシントモジュリン類似体のＬｙｓ２７−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図１８】図１８は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−オキシントモジュリン類似体−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図１９】図１９は、ペプチドマッピングによるＣＡ−オキシントモジュリン類似体のＬｙｓ２７−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図２０】図２０は、ＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムを用いたＣＡ−オキシントモジュリン類似体−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体の精製プロファイルである。
【図２１】図２１は、ＣＡ−オキシントモジュリン類似体−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図２２】図２２は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＧＬＰ−１−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図２３】図２３は、ペプチドマッピングによるＧＬＰ−１のＬｙｓ３４−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図２４】図２４は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−ＧＬＰ−１−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図２５】図２５は、ペプチドマッピングによるＣＡ−ＧＬＰ−１のＬｙｓ３４−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図２６】図２６は、ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラムを用いたＣＡ−ＧＬＰ−１−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体の精製プロファイルである。
【図２７】図２７は、ＣＡ−ＧＬＰ−１−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図２８】図２８は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＧＬＰ−２−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図２９】図２９は、ペプチドマッピングによるＧＬＰ−２のＬｙｓ３０−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【図３０】図３０は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたＣＡ−ＧＬＰ−２−ＰＥＧの位置異性体の精製プロファイルである。
【図３１】図３１は、ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラムを用いたＣＡ−ＧＬＰ−２−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体の精製プロファイルである。
【図３２】図３２は、イミダゾ−アセチルＧＬＰ−２−ＰＥＧ及び免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果である。
【図３３】図３３は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたヒトインスリンＰＥＧ（Ｂ１Ｆ）の位置異性体の精製プロファイルである。
【図３４】図３４は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたヒトインスリンＰＥＧ（Ａ１Ｇ）の位置異性体の精製プロファイルである。
【図３５】図３５は、ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを用いたヒトインスリンＰＥＧ（Ｂ２９Ｋ）の位置異性体の精製プロファイルである。
【図３６】図３６は、ペプチドマッピングによるヒトインスリンのＡ１Ｇ−ペグ化された異性体、Ｂ１Ｆ−ペグ化された異性体、及びＢ２９Ｋ−ペグ化された異性体の分析プロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１３】
本発明は、特定量のアルコールを含み、非ペプチド性重合体が生理活性ポリペプチドの目的とする部位に結合するためのｐＨを持つ反応溶液下において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体と反応させるステップ１および上記ステップ１の反応混合物からアルコールを用いたイオン交換クロマトグラフィーによって位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体を分離及び精製するステップ２を含む、位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法を提供する。
【００１４】
本発明による生理活性ポリペプチド結合体は、生理活性ポリペプチドと非ペプチド性重合体の一末端が互いに共有結合で繋がっている物質のことを意味する。また、本発明は、特定条件下でポリペプチドと重合体とを繋ぎ、重合体がポリペプチドの目標とする位置に結合されたポリペプチド結合体を分離することを特徴とする。
【００１５】
本願において用いられている「生理活性ポリペプチド又はペプチド」とは、生体内で生理活性を示すことのできるペプチドを指すことであって、例えば、インスリン分泌ペプチド、血液因子、消化促進ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、腸管ホルモン、サイトカイン、酵素、成長因子、神経ペプチド（Neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、視床下部ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウィルスペプチド及び生理活性を持つ非天然型ペプチド誘導体よりなる群から選ばれることもできるが、これに限ることではない。より具体的には、上記生理活性ポリペプチド又はペプチドは、赤血球生成促進因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、アミリン、グルカゴン、インスリン、ソマソスタチン、ＰＹＹ（Peptide YY）、ＮＰＹ（Neuropeptide Y）、ＧＬＰ(Glucagon like peptide)−１、ＧＬＰ−２、エキセンディン−４、オキシントモジュリン、グレリン（Ghrelin）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxytocin）、バソプレシン（Vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、シクレチン（Secretin）、成長ホルモン放出ホルモン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）類、インタフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン(Orexin)、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン放出ペプチド、モチリン（Motilin）、血管作用性小腸ペプチド（Vasoactive Intestinal Peptide；ＶＩＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Atrial NatriureticPeptide；ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Brain NatriureticPeptide；ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-Type NatriureticPeptide；ＣＮＰ）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin Peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin Peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン （Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケパリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子収容体、ウロキナーゼ収容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ抑制剤、チモポエチン（Thymopoietin）、血清胸腺因子（Thymulin；Serum thymic factor（ＦＴＳ））、チモペンチン（Thymopentin）、胸腺ホルモン（Thymosin）、胸腺液性因子（Thymic Humoral Factor）アドレノメデュリン（Adrenomedullin；ＡＭ）、アラタ体抑制ホルモン（Allatostatin）、アミロイドβ-プロテイン断片（Amyloid Beta‐Protein Fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leukokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）及びフューゼオン（Fuzeon）よりなる群から選ばれる。さらに、上記生理活性ポリペプチドは、その前駆物質（precursor）、誘導体（derivative）、断片（fragment）または、変異体（variant）を含む。
【００１６】
本発明において用いられる望ましい生理活性ポリペプチドは、エキセンディン、インスリン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、オキシントモジュリン、グレリン、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、またはこれらの誘導体である。上記誘導体は、例えば、アミノ酸残基の任意のグループの化学的置換（例えば、α‐メチル化またはα−ヒドロキシル化）、除去（例えば、脱アミノ化（deamination）又は炭素欠失（carbon deletion））または、修飾（例えば、Ｎ−メチル化）によって調製することができ、特に、エキセンディン誘導体は、韓国特願第２００８−６９２３４号（特許文献３）の明細書に詳細に記述されている。
【００１７】
一方、本発明において用いられている用語「非ペプチド性重合体」とは、ペプチド結合を除いた共有結合により互いに繋がっている２個以上の反復単位を含む生体適合性重合体のことを指す。
【００１８】
本発明に使用可能な非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸；polylactic acid）及びＰＬＧＡ（ポリ乳酸・グリコール酸；polylactic-glycolicacid）のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択されることができ、望ましくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。既に当該分野に知られているこれらの誘導体、または当該分野の技術水準で容易に調製可能な誘導体もまた本発明の範囲に含まれる。本発明において使用可能な非ペプチド性重合体は、生理活性ポリペプチドの分子量を増加させ腎臓からの結合体の消失を防ぐ働きをする。任意の非ペプチド性重合体が、生体内のたんぱく質分解酵素に抵抗性を持つ限り、制限なく用いることができる。上記非ペプチド性重合体の分子量は、０．５ｋＤａ乃至１００ｋＤａ，好ましくは０．５ｋＤａ乃至２０ｋＤａの範囲で、生理活性ポリペプチド：非ペプチド性重合体のモル比は、１：１乃至１：５０の範囲で適宜に選択することができる。
【００１９】
また、本発明において用いられる非ペプチド性重合体は、一末端または両末端に反応基を持つことができる。両末端に反応基を持つ非ペプチド性重合体の場合、持続型製剤としての機能を果たせるようにするための生理活性担体及びタンパク質薬物に結合することもできる。
【００２０】
上記非ペプチド性重合体の一末端または両末端の反応基は、反応性アルデヒド基、プロピオンアルデヒド基、ブチルアルデヒド基、マレイミド基、およびスクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）よりなる群から選ばれることが好ましい。上記スクシニミドの例としては、スクシンイミジルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、ヒドロキシスクシンイミジル、スクシンイミジルカルボキシメチル、またはスクシンイミジルカーボネートが含まれる。特に、上記非ペプチド性重合体が一末端に反応性アルデヒド基または反応性スクシンイミド基を持つ場合、非特異的反応を最小化し、両末端にて生理活性ポリペプチドおよび生理活性担体と結合するのに効果的である。上記アルデヒド反応基は、低いｐＨにてアミノ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリジン残基に結合してアミン結合を形成することができる。さらに、スクシンイミド反応基は、ｐＨ７．０〜ｐＨ９．０においてアミノ末端、またはリジン残基と安定したアミド結合を形成することができる。
【００２１】
また、上記非ペプチド性重合体の両末端反応基は、互い同様または違ってもよい。両末端に反応性ヒドロキシル基を持つポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応によって上記ヒドロキシル基を多様な反応基に活性化できるか、また修飾した反応基を持つ購買可能なポリエチレングリコールを用いることもできる。
【００２２】
本発明のステップ1は、適切な反応溶液下で非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドに位置特異的に結合させ生理活性ポリペプチド結合体を調製することである。
【００２３】
本願に用いられている用語「位置特異的」または「位置特異的に」とは、非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドの特定ターゲットアミノ酸に、望ましくは、リジン残基またはＮ末端のアミンに結合させることを意味する。上記位置特異的結合は、生理的に重要であるアミノ酸残基に非ペプチド性重合体が結合した意図しない結合体の形成を防止することをも指す。例えば、非ペプチド性重合体がエキセンディン−４のＮ末端に結合する場合、エキセンディン−４のイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）活性が落ちる反面、非ペプチド性重合体がリジン残基に結合する場合、イン・ビトロ活性が維持された。特に１２番目のリジン残基よりも２７番目のリジン残基に非ペプチド性重合体が結合する場合、より高いイン・ビトロ活性が観察された（実施例１０および表２参照）。
【００２４】
本発明者らは、ステップ１で反応溶液内アルコールの存在および反応溶液のｐＨが、非ペプチド性重合体と生理活性ポリペプチドとの位置特異的結合の重要な因子であることを見つけた。従って、本発明のステップ１では、特定量のアルコールを含み、かつ、特定のｐＨをもつ反応溶液を用いて非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドの特定位置に結合させる。
【００２５】
本発明の具体例において、上記ポリペプチド結合体の特定位置の異性体比は、反応溶液のｐＨによって異なるか、同一のｐＨでアルコールの濃度(％)によって異なることもある。
【００２６】
つまり、本発明の上記ステップ１は、上記ポリペプチドの活性に影響を与えることもなく、目標とする（または、ターゲット）部位に非ペプチド性重合体が結合できるようにするための特定ｐＨにおいて行われる。上記ｐＨ範囲は、生理活性ポリペプチドの種類によって異なり得る。例えば、インスリン分泌ペプチド（例えば、エキセンディン−４）の場合、上記重合体が、１２番目リジン残基に結合した異性体は、低いｐＨの反応溶液から高い比率で観察される反面、上記重合体が、インスリン分泌活性に影響しない２７番目リジン残基に結合した異性体は、高いｐＨの反応溶液から高い比率で観察された（実施例３および図３を参照）。従って、上記非ペプチド性重合体を２７番目リジン残基に、選択的に結合させるために、ｐＨ７．５乃至ｐＨ９．０においてステップ１を行うことが好ましい。
【００２７】
また、本発明の上記ステップ１は、非ペプチド性重合体が上記ポリペプチドの活性に影響しない部位に結合できるようにするために、アルコールを含んでいる反応溶液下で行われる。上記アルコールの例としては、第１級、第２級および第３級アルコール、好ましくは、１乃至１０の炭素数をもつアルコール、より好ましくは、エタノールまたはイソプロパノールを含む。インスリン分泌ペプチド（例えば、エキセンディン−４）の場合、インスリン分泌活性に影響を与えない２７番目リジン残基に非ペプチド性重合体を結合させるために、反応溶液中のアルコールが、反応溶液全体積を基準にして０．１ボリューム％乃至１００ボリューム％、好ましくは、２５ボリューム％乃至９０ボリューム％、より好ましくは、３５ボリューム％乃至６０ボリューム％範囲の量で存在してもよい。
【００２８】
本発明の一具体例において、生理活性ポリペプチドがエキセンディン−４またはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＬｙｓ２７に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。本発明の別の具体例において、生理活性ポリペプチドがカルシトニンの場合、非ペプチド性重合体がＮ末端に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、４．０乃至６．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがオキシントモジュリン、またはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＬｙｓ２７またはＬｙｓ３０に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがヒトインスリンまたはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＢ鎖のＰｈｅ１（１番目のフェニルアラニン）Ｎ末端に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、４．０乃至６．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがヒトインスリンまたはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＡ鎖のＧｌｙ１（１番目のグリシン）Ｎ末端に結合するか、Ｂ鎖のＬｙｓ２９（２９番目のリジン残基）に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがＧＬＰ−１またはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＬｙｓ３４に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。本発明のまた別の具体例において、生理活性ポリペプチドがＧＬＰ−２またはこれの誘導体である場合、非ペプチド性重合体がＬｙｓ３０に結合する比率を高めるために上記ステップ１で用いられたｐＨは、７．０乃至１０．０であってもよい。
【００２９】
従って、本発明の好ましい位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体は、ＰＥＧがＬｙｓ２７に結合されたエキセンディン−４結合体、ＰＥＧがＮ末端に結合されたカルシトニン結合体、ＰＥＧがＬｙｓ２７またはＬｙｓ３０に結合されたオキシントモジュリン結合体またはこれの類似体、ＰＥＧがＢ鎖のＰｈｅ１のＮ末端に結合するか、Ａ鎖のＧｌｙ１のＮ末端に結合するか、Ｂ鎖のＬｙｓ２９に結合されたヒトインスリン結合体またはこれの類似体、またはＰＥＧがＬｙｓ３４またはＬｙｓ３０に結合されたＧＬＰ−１またはＧＬＰ−２である。
【００３０】
望ましい一態様として、非ペプチド性重合体および生理活性ポリペプチド間の位置特異的結合をより促すためにペプチド誘導体（または類似体）が用いられてもよい。上記誘導体は望まない結合を防ぐために、他の非ターゲットアミノ酸部位中一部が除去されるか保護されたペプチドである。例えば、インスリン分泌ペプチドの一種であるエキセンディンの場合、Ｎ末端アミノ酸であるヒスチジンのαアミン基を除去したり、上記Ｎ末端アミン基をヒドロキシル基に置換したり、ヒスチジンのＮ末端αアミン基を２つのメチル基に変更させたり、Ｎ末端ヒスチジンのα炭素および上記α炭素に結合しているアミン基を除去してイミダゾアセチル（imidazoacetyl）基だけを残す方法などを用いて調製された、化学式１のデス−アミノ−ヒスチジル（ＤＡ）−エキセンディン−４（Des-amino-histidyl(DA)-exendin-4）、化学式２のβ−ヒドロキシ−イミダゾプロピオニル（ＨＹ）−エキセンディン−４（Beta-hydroxy-imidazopropionyl(HY)-exendin-4）、化学式３のイミダゾアセチル（ＣＡ）−エキセンディン−４（Imidazoacetyl(CA)-exendin-4）、および化学式４のジメチル−ヒスチジル（ＤＭ）−エキセンディン−４（Dimethyl-histidyl(DM)-exendin-4）などと、様々なエキセンディン誘導体が用いられることもできるが、これに制限されることではない。このようなエキセンディン誘導体および調製方法は、大韓民国特許公開第２００９−００８１５１号（特許文献３）に開示されており、これは参考文献として本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
【化１】
【００３２】
【化２】
【００３３】
【化３】
【００３４】
【化４】
【００３５】
上記と同様にして、１番目のアミノ酸がヒスチジンであるオキシントモジュリン、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２もまた化学式１乃至４から選ばれる任意の構造を持つ誘導体として用いられてもよい。
【００３６】
特定の一具体例において、本発明者等は、反応溶液のｐＨおよびアルコールの含量（％）が、非ペプチド性重合体の位置特異的な結合態様に及ぶ影響を調査して、重合体が１２番目リジン残基／２７番目リジン残基に結合されたインスリン分泌ペプチドの比率が特にｐＨおよびエタノールまたはイソプロパノールの量によって異なることを確認した。特に、ｐＨ７．５において３５％乃至５５％、好ましくは約４５％のエタノールまたはイソプロパノールを用いる場合、非ペプチド性重合体が２７番目リジン残基に結合された、より好ましい異性体が多量に得られた。
【００３７】
上記ステップ１において、特定のｐＨおよびアルコールの含量で調節して、目的とする非ペプチド性重合体−生理活性ポリペプチド結合体の比率を高めた後、ステップ２においては、アルコールおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いて、上記目的とする結合体を分離および精製することができる。
【００３８】
ステップ２で用いられたアルコールは精製溶液に存在しており、その特定例としてはステップ１においての定義と同様である。しかし、ステップ１で上記アルコールは、上記ポリペプチドの２次又は３次構造を変化させ、反応性および位置選択性を増加させるべく使用されている反面、ステップ２のアルコールは、イオン交換カラムと上記結合体との間の相互作用を減らして、位置特異的生理活性ポリペプチド結合体の分離および精製を容易にするべく用いられる。上記分離および精製は、当該技術分野の熟練者に知られている様々な方法、好ましくは、イオン交換クロマトグラフィー、より好ましくは、高圧イオン交換クロマトグラフィーを利用して行うことができる。
【００３９】
一方、位置異性体の分離および精製を容易にするために、特定のｐＨにおいてイオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。上記ｐＨは、ステップ１では上記結合体の位置選択性を増加させるために適宜調整される反面、ステップ２において本段階では、アルコールが含まれた精製溶液上において安定してイオン交換カラムに上記結合体を付着および脱着させるために再調整する。ステップ２で用いられる適切なｐＨは約２．０乃至約６．０の範囲でよい。
【００４０】
さらに、本発明の生理活性ポリペプチド結合体は、加えて生理活性担体と結合してもよい。この場合、上記非ペプチド性重合体は、生理活性担体と結合するために両末端を持つ非ペプチド性重合体でなければならない。つまり、生理活性ポリペプチドと共有結合していない非ペプチド性重合体の末端に生理活性担体を共有結合として繋いで、非ペプチド性重合体の両末端が生理活性ポリペプチドおよび生理活性担体と結合された結合体を調製することができる。
【００４１】
前述のように、ステップ２で調製された生理活性ポリペプチド結合体は、さらに生理活性担体と結合することもでき、最終的に生成されたポリペプチド−重合体−担体結合体は、ポリペプチド−重合体結合体とは全く異なる活性、つまり、生理活性ポリペプチドの薬理効果の優れた持続性の延長、治療を望む病巣のような特定部位へのターゲティング、または細胞壊死の誘導等のような卓越な生理活性を示す。
【００４２】
本発明で用いられる用語「生理活性担体」とは、非ペプチド性重合体に生理活性ポリペプチドとともに結合され、上記ポリペプチドの薬理効果のような生理活性を持続させたり、特定部位へのターゲティングだったり、または細胞壊死を誘導させることのできる、天然のポリペプチドとは別の付加的な活性を示す生理活性物質のことを意味する。
【００４３】
本発明で用いられる生理活性担体は、前述の活性を制限なく持つ物質、例えば、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、トランスフェリン、アプタマー、トキシン、ジェラチン、コラーゲン、デキストラン、多糖類、脂肪酸、フィブリノゲン等を含む。好ましくは、上記生理活性担体は、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、およびトランスフェリンから生理活性担体を選ぶことができ、より好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００４４】
本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域（ＣＬ１）を除く、重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）のことを指す。その重鎖不変領域にヒンジ（hinge）領域をさらに含むこともできる。また、天然型の免疫グロブリンＦｃと実質的に同等または向上された生理的機能を持つ限り、重鎖および軽鎖可変領域を除いて、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、一部また全部の重鎖不変領域１（ＣＨ１）および／または軽鎖不変領域（ＣＬ１）を含む拡張された形態でもよく、リン酸化、硫酸化、アクリル化、糖化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、およびアミド化等によって修飾される免疫グロブリンＦｃ領域を含むことができる。上記免疫グロブリンＦｃの範囲、その調製方法および免疫グロブリンＦｃを非ペプチド性重合体−生理活性ポリペプチド結合体に共有結合させる方法は、韓国登録特許第７７５３４３号公報（特許文献４）、第７２５３１４号公報（特許文献５）、第７２５３１５号（特許文献６）および第８２４５０５号公報（特許文献７）に開示されており、これらは参考文献であって、本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
本発明の方法によると、生理活性ポリペプチドの特定アミノ酸に位置特異的に非ペプチド性重合体を結合させることにとって、付加的結合体の生成を最小化しながら優れた生理活性を持つ、目的とする結合体を高収率で生成することができる。
【００４６】
以下、実施例を挙げて本発明を詳しく説明するが、本発明の権利範囲はこれらの実施例により限定するものではない。
【００４７】
（実施例１）
ペグ化されたＤＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の調製および分離
＜１−１＞ペグ化されたＤＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の調製
ペプチド内のＬｙｓをＰＥＧと共有結合させてペグ化されたペプチド結合体を調製するべく、３ｍｇ／ｍＬ濃度のデス−アミノ−ヒスチジル−エキセンディン−４（ＤＡ−エキセンディン−４、ＡＰ社、米国）および３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧ（２つのプロピオンアルデヒド基を持つＰＥＧ、ＩＤＢ社、韓国）を１：３０のモル比に、４℃において１２時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を使用し、これに還元剤であるＮａＣＮＢＨ３を２０ｍＭ添加した。
【００４８】
＜１−２＞位置異性体の分離
上記ステップ＜１−１＞の反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｑ イオン交換クロマトグラフィー（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社、韓国）を利用して下記の条件下にて一時的にモノペグ化された（Mono-pegylated）ペプチドを精製し、これをＳＯＵＲＣＥ Ｓイオン交換クロマトグラフィー（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社、韓国）を利用して下記の条件下にて位置異性体を分離した。この過程で精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした。ペプチドマッピング方法によって溶出されたピークからペグ化した位置を確認した。
【００４９】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．５）およびＢ（Ａ+０．５ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→４０％、８０分
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+４５％のエタノール+０．５ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→１００％、４５分
位置異性体の精製プロファイル分析から、Ｌｙｓ１２−ペグ化されたＤＡ−エキセンディン−４のピークが最前に出て、その後方にＬｙｓ２７−ペグ化されたピークが溶出されたことが分かった（図１）。
【００５０】
（実施例２）
ペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の調製および分離
実施例１において、ＤＡ−エキセンディン−４の代わりにイミダゾ−アセチル−エキセンディン−４（ＣＡ−エキセンディン−４、バッヘム（Ｂａｃｈｅｍ）社、米国）を用いることを除いては、実施例１の過程を繰り返してペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体を収得した。位置異性体の精製プロファイル分析から、Ｌｙｓ１２−ペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４のピークが最前に出て、その後方にＬｙｓ２７−ペグ化されたピークが溶出されたことが分かった（図２）。
【００５１】
（実施例３）
反応溶液のｐＨによるペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の比率変化
ｐＨによる特定位置にペグ化されたポリペプチドの比率変化を調べるために、ＣＡ−エキセンディン−４と３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：３０のモル比に、ＣＡ−エキセンディン−４の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させペグ化した。この時、反応溶液として各々１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．０）、１００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）、１００ｍＭのＮａ−Ｐ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａ−Ｐ（ｐＨ８．５）、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）、および１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ（ｐＨ９．２）の緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。各反応液を実施例１と同様の方法で精製した後、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率を分析した。図３から分かるように、ｐＨが高くなるほどＬｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率が増加することが表れて、最適のｐＨは７．０乃至１０．０である。
【００５２】
（実施例４）
エタノールを含んだ反応溶液のｐＨによるペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の比率変化
エタノールおよびｐＨによる特定位置にペグ化されたポリペプチドの比率変化を調べるために、ＣＡ−エキセンディン−４と３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：３０のモル比に、ＣＡ−エキセンディン−４の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させペグ化した。この時、反応溶液として各々１００ｍＭのクエン酸（ｐＨ３．０）／４５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）／４５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＮａ−Ｐ（ｐＨ７．５）／４５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）／４５％ＥｔＯＨ、および１００ｍＭのＮａ−Ｐ（ｐＨ８．５）／４５％ＥｔＯＨの緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加し反応させた。各反応液を実施例１と同様の方法で精製した後、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率を分析した。図４から分かるように、４５％エタノールが含まれた反応液においてｐＨが高くなるほどＬｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率が増加していて、最適のｐＨは７．０乃至９．０と確認された。
【００５３】
（実施例５）
反応溶液内のエタノール濃度によるペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の比率変化
反応溶液内のエタノール濃度による特定位置にペグ化されたポリペプチドの比率変化を調べるために、ＣＡ−エキセンディン−４と３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：３０のモル比に、ＣＡ−エキセンディン−４の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させペグ化した。この時、反応溶液として各々１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／０％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／２５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／３５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／４５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／５５％ＥｔＯＨ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／７５％ＥｔＯＨ、および１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／９０％ＥｔＯＨの緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加し反応させた。各反応液を実施例１と同様の方法で精製した後、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率を分析した。図５から分かるように、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率は、エタノール含量が約５０％に達するまでは増加する半面、５０％以上では減少していて、最適のエタノール含量は３５％乃至６０％と確認された。
【００５４】
（実施例６）
反応溶液内のイソプロパノール濃度によるペグ化されたＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）結合体の比率変化
反応溶液としてエタノールの代わりにイソプロパノールを用いることによって特定位置にペグ化されたポリペプチドの比率変化を調べるために、ＣＡ−エキセンディン−４と３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：３０のモル比に、ＣＡ−エキセンディン−４の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させペグ化した。この時、反応溶液は各々１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／０％イソプロパノール、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／３０％イソプロパノール、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／４５％イソプロパノール、および１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）／６０％イソプロパノールの緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。各反応液を実施例１と同様の方法で精製した後、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率を分析した。図６から分かるように、Ｌｙｓ２７−ペグ化された結合体の比率は、イソプロパノール含量が約５０％に達するまでは増加する半面、５０％以上では減少していて、最適のイソプロパノール含量は３５％乃至６０％と確認された。
【００５５】
（実施例７）
ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ結合体の調製
ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧ結合体とヒト免疫グロブリンＦｃ断片（ハンミ薬品社、韓国）を１：８のモル比に、ペプチド濃度を２０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１６時間反応させてから、上記結合体を断片と結合させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのＫ−Ｐ（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。上記の結合反応後、下記の条件下でＳＯＵＲＣＥ ＰｈｅカラムおよびＳＯＵＲＣＥ Ｑカラムを利用して２段階で精製した。
【００５６】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅ（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１．５ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配 ０→４０％、８０分
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→４０％、８０分
上記調製された結合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図７から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００５７】
（実施例８）
ＣＡ−エキセンディン−４（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧ結合体のペグ化位置確認
ＣＡ−エキセンディン−４にＰＥＧが結合された位置を確認するために、それぞれのＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ結合体を、たんぱく分解酵素のリジン−Ｃで切断した後、逆相クロマトグラフィーを用いて分析した。
【００５８】
具体的に、それぞれのＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ異性体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した後（図８）、精製されたＣＡ−エキセンディン−４−ＰＥＧ結合体およびＣＡ−エキセンディン−４をトリエチルアミン−塩酸緩衝液（１０ｍｍｏｌ／Ｌ；ｐＨ７．５）に溶解してから１０μＬの酵素（０．１ｍｇ／ｍＬ）を加え３７℃にて４時間反応させた。反応終了後、反応混合物を逆相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、ｊｕｐｉｔｅｒ‐Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））により分析した。上記分析結果を図９および図１０に示す。図９から分かるように、Ｌｙｓ１２−ペグ化したＣＡ−エキセンディン−４異性体は♯１と♯２が同時に消えることによって、確認することができ、図１０から分かるように、Ｌｙｓ２７−ペグ化したＣＡ−エキセンディン−４異性体は♯２と♯３が同時に消えることによって、確認することができた。
【００５９】
（実施例９）
Ｎ末端ペグ化時のイソプロパノール濃度によるペグ化収率の確認
メトキシポリエチレングリコール５ＫのＡＬＤ（ＮＯＦ社、日本）をサケカルシトニン（バッヘム社、米国）のＮ末端にペグ化させるために、サケカルシトニンとＰＥＧを１：１のモル比に、サケカルシトニンの濃度を１ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１時間反応させペグ化した。この時反応溶液として各々１００ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．２）／０％イソプロパノール、１００ｍＭのＮａＡｃ（ｐＨ５．２）／４５％イソプロパノール緩衝液を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。各反応液からＳＯＵＲＣＥ Ｓカラム（ＸＫ１６ｍＬ、ＧＥヘルスケア社）を用いて下記の条件下でモノ−ペグ化されたペプチドを精製した。その結果を下記表１に示す。
【００６０】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．５ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭアセテートｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→４０％、６０分
【００６１】
【表１】
【００６２】
上記表１から分かるように、ペグ化されたカルシトニンの収率は、イソプロパノール添加により増加した。
【００６３】
（実施例１０）
ペグ化およびペグ化位置によるエキセンディン−４のイン・ビトロ活性の測定
ペグ化およびペグ化位置によるエキセンディン−４持続型製剤の効力を測定するために、イン・ビトロ活性を測定する方法を利用した。ＧＬＰ−１のイン・ビトロ活性測定は、ＧＬＰ−１収容体をクローニングさせたＣＨＯ細胞株にＧＬＰ−１を処理した後、細胞内のｃＡＭＰの増加可否を測定する方法である。
【００６４】
具体的には、ＧＬＰ−１がクローニングされた細胞株であるＣＨＯ／ＧＬＰ−１ＲにＧＬＰ−１、エキセンディン−４および下記の表２に記載の試験物質を濃度別に処理した。ｃＡＭＰの発生具合を測定して、ＥＣ５０値を互いに比較した。対照群としては、市販されているＢｙｅｔｔａ（バイエッタ、イーライリリー(Eli Lilly）社)を用いた。試験物質の処理によるイン・ビトロ力価（％）を下記表２に示す。
【００６５】
【表２】
【００６６】
上記表２から分かるように、Ｌｙｓ２７にＰＥＧが修飾された場合、Ｌｙｓ１２にＰＥＧが修飾された場合に比べ、相対的にペプチドの生理活性が少なく影響されることが表れている。
【００６７】
（実施例１１）
ペグ化されたオキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）結合体の調製および分離
＜１１−１＞ペグ化されたオキシントモジュリン結合体（Ｌｙｓ３０）の調製
ペグ化されたオキシントモジュリン結合体を調製するために、オキシントモジュリン（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）および３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧを１：１５のモル比に、オキシントモジュリンの濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて４．５時間反応させてペグ化した。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００６８】
＜１１−２＞位置異性体の分離
上記反応液から ＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、
アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用してＬｙｓ３０−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図１１）。
【００６９】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配０→４０％、２２２分
（実施例１２）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）結合体の調製および分離
前記実施例１１において、オキシントモジュリンの代わりにイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）を用いることと、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含むｐＨ７．５の１００ｍＭ濃度のＨＥＰＥＳ緩衝液を用いることとを除いては、実施例１１の過程を繰り返してペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）結合体を調製した。
【００７０】
ＳＯＵＲＣＥ Ｓカラムを利用して分離した異性体の結果を図１２に示し、Ａｓｐ−Ｎタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング結果を図１３に示す。図１３から分かるようにＰＥＧがＬｙｓ３０に修飾され、♯４：Ａｓｐ（２２）−（３７）部分が消えた。
【００７１】
（実施例１３）
イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体調製
イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン−ＰＥＧ（Ｌｙｓ３０）結合体と免疫グロブリンＦｃ（ハンミ薬品社、韓国）を１：１０のモル比に、全体のたんぱく質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１６時間反応させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応終了後、反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑカラムを用いて下記の条件下で精製した。
【００７２】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→２０％、１００分
Ｌｙｓ３０−ペグ化されたＣＡ−オキシントモジュリンを免疫グロブリンＦｃと結合させた後、ＳＯＵＲＣＥ Ｑで精製して得られたクロマトグラムを図１４に示し、ＣＡ−オキシントモジュリン（Ｌｙｓ３０）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図１５に示す。図１５から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００７３】
（実施例１４）
ペグ化されたオキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）結合体の調製および分離
＜１４−１＞ペグ化されたオキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをオキシントモジュリン類似体([20Ａｓｐ、２４Ａｌａ、２８Ｓｅｒ]−オキシントモジュリン−[Deletion３０−３７])のリジン残基にペグ化させるために、ＰＥＧおよびオキシントモジュリン類似体（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）を１：１５のモル比に、オキシントモジュリン類似体の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて３．５時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００７４】
＜１４−２＞位置異性体の分離
上記反応液から ＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用してＬｙｓ２７−ペグ化された位置異性体を精製した。精製および分離条件は実施例１１と同様である。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図１６）。精製したモノ−ペグ化されたオキシントモジュリン類似体のリジン選択性をＬｙｓ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図１７）。図１７から分かるようにＰＥＧがＬｙｓ２７に修飾され♯２部分が消えた。
【００７５】
（実施例１５）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）結合体の調製および分離
＜１５−１＞ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体([20Ａｓｐ、２４Ａｌａ、２８Ｓｅｒ]−オキシントモジュリン−[Deletion３０−３７])のリジン残基にペグ化させるために、上記イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体（Ａｎｙｇｅｎ社、韓国）およびＰＥＧを１：１０のモル比に、イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて２．５時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００７６】
＜１５−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用してＬｙｓ２７−ペグ化された位置異性体を精製した。精製および分離条件は実施例１１と同様である。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図１８）。精製したモノ−ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体のリジン選択性をＬｙｓ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図１９）。図１９から分かるように、ＰＥＧがＬｙｓ２７に修飾され♯２部分が消えた。
【００７７】
（実施例１６）
ペグ化された類似体イミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）および免疫グロブリンＦｃの結合体調製および分離
上記実施例１５で調製した、Ｌｙｓ２７−ペグ化されたイミダゾ−アセチル−オキシントモジュリン類似体−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃを１：１０のモル比に、全体のたんぱく質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１６時間反応させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応終了後、反応液をＳＯＵＲＣＥ １５Ｑカラムを用いて下記の条件下で精製した。
【００７８】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｑ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+１ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配０→２０％、１００分
Ｌｙｓ２７−ペグ化されたＣＡ−オキシントモジュリン類似体を免疫グロブリンＦｃと結合させた後、ＳＯＵＲＣＥ Ｑで精製して得られたクロマトグラムを図２０に示し、ＣＡ−オキシントモジュリン類似体（Ｌｙｓ２７）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図２１に示す。図２１から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００７９】
（実施例１７）
ペグ化されたＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）結合体の調製および分離
＜１７−１＞ペグ化されたＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをＧＬＰ−１（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）のリジン残基にペグ化させるために、ＧＬＰ−１およびＰＥＧを１：１５のモル比に、ＧＬＰ−１の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて３．５時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００８０】
＜１７−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３４−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図２２）。精製したモノ−ペグ化されたＧＬＰ−１のリジン選択性をＬｙｓ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図２３）。
【００８１】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配０→４０％、１５０分
図２３から分かるように、ＰＥＧがＬｙｓ３４に修飾され♯２部分が消えた。
【００８２】
（実施例１８）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）結合体の調製および分離
＜１８−１＞ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）のリジン残基にペグ化させるために、イミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１およびＰＥＧを１：１０のモル比に、イミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて４時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００８３】
＜１８−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３４−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて位置異性体の分離を容易にした（図２４）。精製したモノ−ペグ化されたＣＡ−ＧＬＰ−１のリジン選択性をＧｌｕ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図２５）。
【００８４】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配３→４０％、１５０分
図２５から分かるように、ＰＥＧがＬｙｓ３４に修飾され♯４部分が消えることが確認できた。
【００８５】
（実施例１９）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）および免疫グロブリンＦｃの結合体調製および分離
上記実施例１８で調製した、Ｌｙｓ３４−ペグ化されたイミダゾ−アセチルＧＬＰ−１−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃを１：８のモル比に、全体のたんぱく質の濃度を５０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１７時間反応させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応終了後、反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラムを用いて下記の条件下で精製した。
【００８６】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+２ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配１００→０％、１００分
Ｌｙｓ３４−ペグ化されたＣＡ−ＧＬＰ−１異性体を免疫グロブリンＦｃと結合させた後、ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅで精製して得られたクロマトグラムを図２６に示し、ＣＡ−ＧＬＰ−１（Ｌｙｓ３４）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図２７に示す。図２７から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００８７】
（実施例２０）
ペグ化されたＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）結合体の調製および分離
＜２０−１＞ペグ化されたＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをＧＬＰ−２（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）のリジン残基にペグ化させるために、ＧＬＰ−２およびＰＥＧを１：１２のモル比に、ＧＬＰ−２の濃度を５ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて３時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００８８】
＜２０−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３０−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図２８）。リジン選択性を、トリプシンタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いて確認した（図２９）。
【００８９】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配３→４０％、１５０分
図２９から分かるように、ＰＥＧがＬｙｓ３０に修飾され♯２部分が消えることが確認できた。
【００９０】
（実施例２１）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）結合体の調製および分離
＜２１−１＞ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）結合体の調製
３．４ＫプロピオンＡＬＤ（２）ＰＥＧをイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２（Ａｎｙｇｅｎ社，韓国）のリジン３０残基にペグ化させるために、イミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２およびＰＥＧを１：２０のモル比に、イミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２の濃度を３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて６時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００９１】
＜２１−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３０−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図３０）。
【００９２】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ３．０+４５％のエタノール）およびＢ（Ａ+１ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配３→４０％、１５０分
（実施例２２）
ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）および免疫グロブリンＦｃの結合体調製および分離
上記実施例２１で調製した、Ｌｙｓ３０−ペグ化されたイミダゾ−アセチル−ＧＬＰ−２−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃを１：１５のモル比に、全体のたんぱく質の濃度を２０ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１６時間反応させた。この時、反応溶液として１００ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。反応終了後、上記反応液をＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅカラムを用いて下記の条件下で精製した。
【００９３】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）およびＢ（Ａ+２ＭのＮａＣｌ）；Ａの濃度勾配１００→０％、１００分
Ｌｙｓ３０−ペグ化されたＣＡ−ＧＬＰ−２異性体を免疫グロブリンＦｃと結合させた後、ＳＯＵＲＣＥ Ｐｈｅで精製して得られたクロマトグラムを図３１に示し、ＣＡ−ＧＬＰ−２（Ｌｙｓ３０）−ＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃの結合体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図３２に示す。図３２から分かるように、非還元（ＮＲ）条件においては６０Ｋに単一バンドが現れ、還元（Ｒ）条件においては３５Ｋと２５Ｋに２つのバンドが観察された。
【００９４】
（実施例２３）
ペグ化されたヒトインスリン（Ｂ１Ｐｈｅ）結合体の調製および分離
＜２３−１＞ペグ化されたヒトインスリン（Ｂ１Ｐｈｅ）結合体の調製
５ＫプロピオンＡＬＤ（１）メトキシＰＥＧ（１つのプロピオンアルデヒド基を持つＰＥＧ、ＮＯＦ社、日本）をヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）内Ｂ鎖の１番目アミノ酸であるフェニルアラニンのＮ末端にペグ化させるために、ＰＥＧおよびヒトインスリンを１：２のモル比に、ヒトインスリンの濃度を２．３ｍｇ／ｍＬにして、４℃にて１２時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、これに還元剤の２０ｍＭのＮａＣＮＢＨ３を添加した。
【００９５】
＜２３−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して、下記の条件下でＬｙｓ３０−ペグ化された位置異性体を精製した。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図３３）。溶出されたピークのモノ−ペグ化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認し、Ｇｌｕ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いてリジン選択性を確認した（図３６）。
【００９６】
カラム：ＳＯＵＲＣＥ Ｓ
流速 ：２．０ｍＬ／分
溶出液：Ａ（２０ｍＭのＮａ−citrate、ｐＨ２．０+６０％のエタノール）およびＢ（Ａ+０．５ＭのＫＣｌ）；Ａの濃度勾配０→３％、1分、Ｂの濃度勾配０→５０％、８０分
図３６から分かるように、ＰＥＧがＢ１Ｆに修飾され♯２部分が消えた。
（実施例２４）
ペグ化されたヒトインスリン（Ａ１Ｇｌｙ）結合体の調製および分離
＜２４−１＞ペグ化されたヒトインスリン（Ａ１Ｇｌｙ）結合体の調製
５ＫメトキシＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（１）（１つのＳＢＡ反応基を持つＰＥＧ、ＮＯＦ社、日本）をヒトインスリン（Ｓｉｇｍａ）内Ａ鎖の１番目アミノ酸であるグリシンのＮ末端にペグ化させるために、ＰＥＧおよびヒトインスリンを１：４のモル比に、ヒトインスリンの濃度を２ｍｇ／ｍＬにして、２５℃にて３時間反応させた。この時、反応溶液として３５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた。
【００９７】
＜２４−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して位置異性体を精製した。精製過程は実施例２３と同様にして行った。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図３４）。溶出されたピークのモノ−ペグ化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認し、Ｇｌｕ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いてリジン選択性を確認した（図３６）。
【００９８】
図３６から分かるように、ＰＥＧがＡ１Ｇに修飾され♯１部分が消えた。
（実施例２５）
ペグ化されたヒトインスリン（Ｂ２９Ｌｙｓ）結合体の調製および分離
＜２５−１＞ペグ化されたヒトインスリン（Ｂ２９Ｌｙｓ）結合体の調製
５ＫメトキシＰＥＧ−スクシンイミジルブタノエート（１）をヒトインスリン内Ｂ鎖の２９番目アミノ酸であるリジン残基にペグ化させるために、ＰＥＧおよびヒトインスリンを１：２のモル比に、ヒトインスリンの濃度を２ｍｇ／ｍＬにして、２５℃にて１時間反応させた。この時、反応溶液として４５％のイソプロパノールを含む１００ｍＭのＮａ−Ｂｏｒａｔｅ緩衝液（ｐＨ９．０）を用いた。
【００９９】
＜２５−２＞位置異性体の分離
上記反応液からＳＯＵＲＣＥ １５Ｓ（ＸＫ１６ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社）カラムを利用して位置異性体を精製した。精製過程は実施例２３と同様にして行った。この過程で、精製溶液にエタノールを用いて異性体の分離を容易にした（図３５）。溶出されたピークのモノ−ペグ化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で確認し、Ｇｌｕ−Ｃタンパク質加水分解酵素を利用したペプチドマッピング法を用いてリジン選択性を確認した（図３６）。
【０１００】
図３６から分かるように、ＰＥＧがＢ２９Ｋに修飾され♯４部分が消えた。
【０１０１】
上記具体的な実施例とともに本発明を述べたが、添付の特許請求の範囲により定義された本発明の範囲内において、当分野の熟練者は本発明を多様に変形および変化させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定量のアルコールを含み、非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドの目標とする部位に結合させるためのｐＨを持つ反応溶液下において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体と反応させるステップ１および前記ステップ１の反応混合物からアルコールを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより生理活性ポリペプチド結合体を分離及び精製するステップ２を含む、位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項２】
前記生理活性ポリペプチドが、インスリン分泌ペプチド、血液因子、消化促進ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、腸管ホルモン、サイトカイン、酵素、成長因子、ニューロペプチド（Neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、視床下部ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウィルスペプチド及び生理活性を持つ非天然型ペプチド誘導体よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項３】
前記生理活性ポリペプチドが、赤血球生成促進因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、アミリン、グルカゴン、インスリン、ソマソスタチン、ＰＹＹ（Peptide YY）、ＮＰＹ（Neuropeptide Y）、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、エキセンディン−４、オキシントモジュリン、グレリン（Ghrelin）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxytocin）、バソプレシン（Vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、シクレチン（Secretin）、成長ホルモン放出ホルモン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）類、インタフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン(Orexin)、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン放出ペプチド、モチリン（Motilin）、血管作用性小腸ペプチド（Vasoactive Intestinal Peptide；ＶＩＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Atrial NatriureticPeptide；ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Brain NatriureticPeptide；ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-Type NatriureticPeptide；ＣＮＰ）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin Peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin Peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン（Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケパリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子収容体、ウロキナーゼ収容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ抑制剤、チモポエチン（Thymopoietin）、血清胸腺因子（Thymulin；Serum thymic factor（ＦＴＳ））、チモペンチン（Thymopentin）、胸腺ホルモン（Thymosin）、胸腺液性因子（Thymic Humoral Factor）アドレノメデュリン（Adrenomedullin；ＡＭ）、アラタ体抑制ホルモン（Allatostatin）、アミロイドβ-プロテイン断片（Amyloid Beta‐Protein Fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leukokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）及びフューゼオン（Fuzeon）からなる群から選ばれる、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項４】
前記生理活性ポリペプチドが、エキセンディン、インスリン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、オキシントモジュリン、グレリン、カルシトニン、またはこれらの誘導体である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項５】
前記誘導体は、下記の化学式５乃至化学式８
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
から選択されるいずれか１つの構造を持つエキセンディン、オキシントモジュリン、ＧＬＰ−１、またはＧＬＰ−２誘導体である、請求項４に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項６】
前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチレ化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸；polylactic acid）、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸・グリコール酸；polylactic-glycolicacid）、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項７】
前記ステップ１およびステップ２に用いられたアルコールが、１個乃至１０個の炭素数を持つ第１級、第２級、または第３級アルコールである、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項８】
前記アルコールが、エタノール、またはイソプロパノールである、請求項７に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項９】
前記アルコールが、反応溶液の総量を基準に３５ボリューム％乃至６０ボリューム％の量で反応溶液の中に存在する、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１０】
前記生理活性ポリペプチドが、エキセンディン、またはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが７．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１１】
前記生理活性ポリペプチドが、オキシントモジュリンまたはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが７．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１２】
前記生理活性ポリペプチドが、ヒトインスリンまたはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが４．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１３】
前記生理活性ポリペプチドが、ＧＬＰ−１またはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが７．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１４】
前記生理活性ポリペプチドが、ＧＬＰ−２またはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが７．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１５】
前記位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体は、ＰＥＧがＬｙｓ２７に結合されたエキセンディン−４結合体、ＰＥＧがＮ末端に結合されたカルシトニン結合体、ＰＥＧがＬｙｓ２７またはＬｙｓ３０に結合されたオキシントモジュリン結合体、ＰＥＧがＡ鎖のＧｌｙ１のＮ末端に結合またはＢ鎖のＬｙｓ２９に結合されたヒトインスリン結合体、ＰＥＧがＬｙｓ３４またはＬｙｓ３０に結合されたＧＬＰ−１またはＧＬＰ−２結合体またはこれらの類似体である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１】
特定量のアルコールを含み、非ペプチド性重合体を生理活性ポリペプチドの目標とする部位に結合させるためのｐＨを持つ反応溶液下において、生理活性ポリペプチドを非ペプチド性重合体と反応させるステップ１および前記ステップ１の反応混合物からアルコールを用いたイオン交換クロマトグラフィーにより生理活性ポリペプチド結合体を分離及び精製するステップ２を含む、位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項２】
前記生理活性ポリペプチドが、インスリン分泌ペプチド、血液因子、消化促進ホルモン、副腎皮質ホルモン、甲状腺ホルモン、腸管ホルモン、サイトカイン、酵素、成長因子、ニューロペプチド（Neuropeptide）、脳下垂体ホルモン、視床下部ホルモン、抗肥満ペプチド、抗ウィルスペプチド及び生理活性を持つ非天然型ペプチド誘導体よりなる群から選ばれる、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項３】
前記生理活性ポリペプチドが、赤血球生成促進因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、アミリン、グルカゴン、インスリン、ソマソスタチン、ＰＹＹ（Peptide YY）、ＮＰＹ（Neuropeptide Y）、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、エキセンディン−４、オキシントモジュリン、グレリン（Ghrelin）、アンジオテンシン、ブラジキニン、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン（Corticotropin）、エレドイシン（Eledoisin）、ガストリン、レプチン、オキシトシン（Oxytocin）、バソプレシン（Vasopressin）、黄体形成ホルモン、黄体刺激ホルモン、濾胞刺激ホルモン、副甲状腺ホルモン、シクレチン（Secretin）、成長ホルモン放出ホルモン（Sermorelin）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、成長ホルモン放出ペプチド、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）類、インタフェロン（ＩＦＮ）類、インターロイキン（Interleukin）類、プロラクチン放出ペプチド、オレキシン(Orexin)、甲状腺放出ペプチド、コレシストキニン（Cholecystokinin）、ガストリン抑制ペプチド、カルモジュリン、ガストリン放出ペプチド、モチリン（Motilin）、血管作用性小腸ペプチド（Vasoactive Intestinal Peptide；ＶＩＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（Atrial NatriureticPeptide；ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（Brain NatriureticPeptide；ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（C-Type NatriureticPeptide；ＣＮＰ）、ニューロキニン（Neurokinin）Ａ、ニューロメジン（Neuromedin）、レニン（Renin）、エンドセリン（Endothelin）、サラホトキシンペプチド（Sarafotoxin Peptide）、カルソモルフィンペプチド（Carsomorphin Peptide）、デモルフィン（Dermorphin）、ダイノルフィン（Dynorphin）、エンドルフィン（Endorphin）、エンケパリン（Enkepalin）、Ｔ細胞因子、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子収容体、ウロキナーゼ収容体、腫瘍抑制因子、コラゲナーゼ抑制剤、チモポエチン（Thymopoietin）、血清胸腺因子（Thymulin；Serum thymic factor（ＦＴＳ））、チモペンチン（Thymopentin）、胸腺ホルモン（Thymosin）、胸腺液性因子（Thymic Humoral Factor）アドレノメデュリン（Adrenomedullin；ＡＭ）、アラタ体抑制ホルモン（Allatostatin）、アミロイドβ-プロテイン断片（Amyloid Beta‐Protein Fragment）、抗菌性ペプチド、抗酸化剤ペプチド、ボンベシン（Bombesin）、オステオカルシン（Osteocalcin）、ＣＡＲＴペプチド、Ｅ−セレクチン（selectin）、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、ロイコカイン（Leukokine）、クリングル（Kringle）−５、ラミニン（Laminin）、インヒビン（Inhibin）、ガラニン（Galanin）、フィブロネクチン（Fibronectin）、パンクレアスタチン（Pancreastatin）及びフューゼオン（Fuzeon）からなる群から選ばれる、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項４】
前記生理活性ポリペプチドが、エキセンディン、インスリン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、オキシントモジュリン、グレリン、カルシトニン、またはこれらの誘導体である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項５】
前記誘導体は、下記の化学式５乃至化学式８
【化５】
【化６】
【化７】
【化８】
から選択されるいずれか１つの構造を持つエキセンディン、オキシントモジュリン、ＧＬＰ−１、またはＧＬＰ−２誘導体である、請求項４に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項６】
前記非ペプチド性重合体が、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとの共重合体、ポリオキシエチレ化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（ポリ乳酸；polylactic acid）、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸・グリコール酸；polylactic-glycolicacid）、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項７】
前記ステップ１およびステップ２に用いられたアルコールが、１個乃至１０個の炭素数を持つ第１級、第２級、または第３級アルコールである、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項８】
前記アルコールが、エタノール、またはイソプロパノールである、請求項７に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項９】
前記アルコールが、反応溶液の総量を基準に３５ボリューム％乃至６０ボリューム％の量で反応溶液の中に存在する、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１０】
前記生理活性ポリペプチドが、エキセンディン、またはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが７．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１１】
前記生理活性ポリペプチドが、オキシントモジュリンまたはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが７．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１２】
前記生理活性ポリペプチドが、ヒトインスリンまたはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが４．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１３】
前記生理活性ポリペプチドが、ＧＬＰ−１またはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが７．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１４】
前記生理活性ポリペプチドが、ＧＬＰ−２またはこれの誘導体である場合、前記ステップ１で用いられたｐＨが７．０乃至１０．０である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【請求項１５】
前記位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体は、ＰＥＧがＬｙｓ２７に結合されたエキセンディン−４結合体、ＰＥＧがＮ末端に結合されたカルシトニン結合体、ＰＥＧがＬｙｓ２７またはＬｙｓ３０に結合されたオキシントモジュリン結合体、ＰＥＧがＡ鎖のＧｌｙ１のＮ末端に結合またはＢ鎖のＬｙｓ２９に結合されたヒトインスリン結合体、ＰＥＧがＬｙｓ３４またはＬｙｓ３０に結合されたＧＬＰ−１またはＧＬＰ−２結合体またはこれらの類似体である、請求項１に記載の位置特異的な生理活性ポリペプチド結合体の調製方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【公表番号】特表２０１２−５２０８７３（Ｐ２０１２−５２０８７３Ａ）
【公表日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５００７２０（Ｐ２０１２−５００７２０）
【出願日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００１６７４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０７２５６
【国際公開日】平成２２年９月２３日（２０１０．９．２３）
【出願人】（５１０３１６６９３）ハンミ・サイエンス・カンパニー・リミテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月１０日（２０１２．９．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月１８日（２０１０．３．１８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２０１０／００１６７４
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０７２５６
【国際公開日】平成２２年９月２３日（２０１０．９．２３）
【出願人】（５１０３１６６９３）ハンミ・サイエンス・カンパニー・リミテッド (10)
【Ｆターム（参考）】
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