低温ナチュラルチーズおよびその製造方法
【課題】 原料乳にクリーム等を加える必要がなく、粘度の極めて低いクリームタイプの低温ナチュラルチーズを提供する。
【解決手段】 加熱殺菌した原料乳に４〜１３℃でスターターとレンネットとを加えて生成したカードを分離してなる低温ナチュラルチーズであって、粘度が０．３４〜１．０６Ｐａ・ｓである低温ナチュラルチーズ、および加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却する冷却工程と、４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整するｐＨ調整工程と、４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターとレンネットとを４〜１３℃で加えてカードを生成させるカード生成工程と、生成したカードを４〜１３℃で分離するカード分離工程とを有する、低温ナチュラルチーズの製造方法。
【解決手段】 加熱殺菌した原料乳に４〜１３℃でスターターとレンネットとを加えて生成したカードを分離してなる低温ナチュラルチーズであって、粘度が０．３４〜１．０６Ｐａ・ｓである低温ナチュラルチーズ、および加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却する冷却工程と、４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整するｐＨ調整工程と、４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターとレンネットとを４〜１３℃で加えてカードを生成させるカード生成工程と、生成したカードを４〜１３℃で分離するカード分離工程とを有する、低温ナチュラルチーズの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の低温ナチュラルチーズおよびその製造方法に関し、特に、その粘度が極めて低い、低温ナチュラルチーズおよび低温で活動する乳酸菌を用いて低温条件下でこれを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、チーズはナチュラルチーズとプロセスチーズとに大別されている。ナチュラルチーズは、一般的に、殺菌処理した原料乳を中温に冷却し、乳酸菌等を含む微生物の集団であり発酵の開始のために用いるスターターを接種して所定の酸度に調整した後、凝乳酵素を含む製剤であり原料乳を凝固させるために用いるレンネットを加えて均一に混合し、静置してカード（凝乳）を形成させ、ホエー（乳清）を排除しカードを密にすることにより製造されており、さらに熟成されるものもある。一方、プロセスチーズは、ナチュラルチーズをいったん溶解した後、密封包装し、あるいは乾燥させることにより製造される。
【０００３】
すなわち、ナチュラルチーズは自然のままのチーズといえ、カード形成後の工程の違いによって種々のものを製造することができる。それ故、種々の繊細な風味と個性ある味わいを楽しむことができることから、近年、嗜好の多様化に伴い、ナチュラルチーズの消費量が増加し、ナチュラルチーズの需要が高まっている。
【０００４】
ナチュラルチーズには、エメンタール、エダム、パルミジャーノ・レッジャーノ、コンテ、グリュイエール、チェダーおよびミモレット等に代表される、水分含量が３８％以下であるハードタイプ、ゴーダ、マンゼルバベット、ルブロション、ショーム、サムソーおよびマリボー等に代表される、水分含量が３８〜４６％であるセミハードタイプ、ヴァランセ、プリニー・サン・ピエール、クロタン・ドゥ・シャヴィニョル、サントゥモールおよびピラミッド等に代表される、原料乳が山羊乳であるシェブール、リヴァロ、ラミ・デュ・シャンベルタン、タレッジオ、マンステル、ポン・レヴェックおよびエポワース等に代表される、外皮を塩水や酒等で洗いながら熟成させたウォッシュタイプ、ババリアブルー、ブルーデコース、ゴルゴンゾーラ、ロックフォール、スチルトンおよびカンボゾラ等に代表される、カードに青カビを混入し成型してなる青カビタイプ、サン・タンドレ、カマンベール、ブリヤ・サヴァラン、ブリー・ドゥ・モー、クロミエ、ヌーシャテルおよびバラカ等に代表される、白カビを表面に繁殖させて熟成させてなる白カビタイプ、あるいはモッツァレラ、カッテージチーズ、クリームチーズ、リコッタ、マスカルポーネおよびフロマージュ・ブラン等に代表される、非熟成で軟質のフレッシュタイプ等がある。
【０００５】
このうち、軟質チーズであるフレッシュタイプのナチュラルチーズ（フレッシュチーズ）、中でもクリームチーズは粘度が小さく、食材として広く応用されている。クリームチーズの基本的な製造方法は次のとおりである。まず、甘味を有する牛乳または脱脂乳に対して、全体の脂肪含有量が１０〜１６％となるように甘味を有するクリーム等を混合し、これを低温殺菌し、均質化し、かつ１７〜３３℃まで冷却する。次いで、それに乳酸菌を接種し、十分酸性になって乳漿から凝乳が分離するまで培養し、乳漿から凝乳を分離してなる。このときの凝固プロセスは、少量の凝乳剤を追加することによって任意選択で促進することができる。さらに、例えば遠心分離により乳漿から凝乳を分離した後 、安定剤、塩および他の成分を加える。このようにして製造されたクリームチーズは、現在の同一性の基準下、少なくとも３３％の脂肪および５５％以下の水分を含むことが必要とされている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２７０１０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に開示されたクリームチーズは、脂肪含量が３３％以上となるよう、原料乳にクリーム等を混合して製造されているが、牛乳本来の風味を担保するためには、原料乳にクリーム等を混合せずに製造できることが好ましいといえる。
【０００８】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、原料乳にクリーム等を加える必要がなく、粘度の極めて低いクリームタイプの低温ナチュラルチーズを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、鋭意検討を行った結果、低温条件下、低温で活動する乳酸菌を用いて、原料乳にクリーム等を加える必要なく、粘度の極めて低いクリームタイプのナチュラルチーズを製造することができることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 加熱殺菌した原料乳に４〜１３℃でスターターとレンネットとを加えて生成したカードを分離してなる低温ナチュラルチーズであって、粘度が０．３４〜１．０６Ｐａ・ｓである低温ナチュラルチーズ。
［２］ 以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくともいずれかである、［１］に記載の低温ナチュラルチーズ：
（ａ）脂質含量が１９．４〜３２．５ｗ／ｗ％である；
（ｂ）水分含量が５７〜６５ｗ／ｗ％である；
（ｃ）ブタンジオール含量が９７〜５７３ｍｇ／ｋｇである。
［３］ 前記スターターが４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなる、［１］または［２］に記載の低温ナチュラルチーズ。
［４］ 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉからなる群から選択される１または２以上の乳酸菌である、［３］に記載の低温ナチュラルチーズ。
［５］ 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓである、［３］に記載の低温ナチュラルチーズ。
［６］ 前記原料乳がｐＨを弱酸性に調整された原料乳である、［１］から［５］のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズ。
［７］ 前記カードの分離後に４〜１３℃で熟成してなる、［１］から［６］のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズ。
［８］ 加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却する冷却工程と、４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整するｐＨ調整工程と、４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターとレンネットとを４〜１３℃で加えてカードを生成させるカード生成工程と、生成したカードを４〜１３℃で分離するカード分離工程とを有する、低温ナチュラルチーズの製造方法。
［９］ 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉからなる群から選択される、［８］に記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
［１０］ 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓである、［８］に記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
［１１］ 前記カード分離工程の後に４〜１３℃で熟成させる熟成工程を含む、［８］から［１０］のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、低温条件下、低温で活動する乳酸菌を用いて、原料乳にクリーム等を加える必要なく、粘度の極めて低いクリームタイプの低温ナチュラルチーズを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明における分離容器の構造を示す断面図である。
【図２】本発明における低温ナチュラルチーズのレンネット添加までの製造工程および通常のナチュラルチーズの製造工程を、環境温度変化とともに時系列で示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明に係る低温ナチュラルチーズおよびその製造方法について詳細に説明する。本発明に係る低温ナチュラルチーズは、加熱殺菌した原料乳に４〜１３℃でスターターとレンネットとを加えて生成したカードを分離してなり、かつ粘度が０．３４〜１．０６Ｐａ・ｓである。
【００１４】
本発明において使用可能な原料乳としては、例えば、通常のチーズ製造に用いられる牛乳、水牛乳、羊乳、山羊乳等を挙げることができ、生乳であるか、成分調整乳であるか、あるいは加工乳であるかを問わないが、本実施例においては、牛乳を好適な原料乳として用いている。そのため、牛乳本来の風味を担保することができる。
【００１５】
また、原料乳として加工乳を用いる場合は、本発明に係る低温ナチュラルチーズが製造可能な範囲および乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（昭和２６年１２月２７日厚生省令第５２号；以下、「乳等省令」という。）に定められた範囲で副原料を乳に添加し、加工乳として用いることができる。そのような副原料としては、例えば、クリーム、練乳、脱脂粉乳、全脂粉乳、トータルミルクプロテイン、乳清たん白、カゼインナトリウム、カゼインカルシウム等の乳由来の１または２以上の副原料や、野菜、砂糖、甘味料、寒天、香料等の１または２以上の副原料を挙げることができるが、上述のとおり、本実施例においては、風味を担保する観点から、加工乳ではない牛乳を好適な原料乳として用いている。
【００１６】
原料乳を加熱殺菌する方法としては、当業者により適宜選択可能であって乳等省令に従う方法を用いることができる。そのような加熱殺菌方法としては、６２〜６５℃で少なくとも３０分保持する低温保持殺菌法（ＬＴＬＴ法）、７２〜７８℃で１５秒以上保持する高温短時間殺菌法（ＨＴＳＴ法）、１２０〜１５０℃で１〜５秒保持する超高温加熱処理法（ＵＨＴ法）等を挙げることができる。本実施例においては、ＬＴＬＴ法およびＨＴＳＴ法を好適な加熱殺菌する方法として用いている。
【００１７】
本発明において、例えば乳酸菌の活性を高める等を目的として、原料乳を加熱殺菌後、低温条件下で弱酸性にｐＨ調整して用いることができる。この場合のｐＨ調整剤は特に限定されず、当業者によって適宜選択することができるが、例えば原料乳として牛乳を用いる場合、牛乳のｐＨが６．６〜６．８であることから、クエン酸や乳酸等、あるいはこれらの塩を用いることができる。本実施例においては、乳酸を好適なｐＨ調整剤として用いている。
【００１８】
なお、本発明において「低温」とは、４〜１３℃が好ましく、７〜１０℃がより好ましい。また、「弱酸性」とは、好ましくはｐＨが５．５〜６．５であり、より好ましくはｐＨが５．８〜６．３である。
【００１９】
また、レンネット添加後の凝固の速度やカードの固さによっては、所望により、塩化マグネシウム、炭酸ナトリウム、硫酸カルシウム、塩化カルシウム等の凝固剤を添加することができ、その添加量は、当業者による通常の手法によって適宜選択することができる。本実施例においては、塩化カルシウムを好適な凝固剤として用いている。
【００２０】
本発明に係る低温ナチュラルチーズは、原料乳を加熱殺菌した後、４〜１３℃に冷却し、スターターないしレンネットの添加、カード（凝乳）の生成、カード（凝乳）とホエー（乳清）との分離まで、この４〜１３℃の低温度帯にて行う。こうして、０．３４〜１．０６Ｐａ・Ｓという極めて低粘度のナチュラルチーズを得ることができる。
【００２１】
なお、本発明に係る低温ナチュラルチーズを用いて各種のプロセスチーズを製造することができる。例えば、必要に応じて溶融塩、バターなどを添加して、常法によりクリームチーズを得ることができる。このプロセスチーズは、本発明に係る低温ナチュラルチーズを用いて、あるいはこれに他のナチュラルチーズの少なくとも１種を配合して製造することができる。
【００２２】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの粘度を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものであればよい。そのような粘度計としては、例えば、細管式粘度計、落球式粘度計、回転式粘度計、レオメーター、振動式粘度計等を挙げることができる。本実施例においては、音叉型振動式粘度計を粘度の測定に用いている。
【００２３】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの脂質含量を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができるが、例えば、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、Ｂｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ法、Ｂｒａｇｄｏｎ法、ソックスレー脂肪抽出法等を用いることができる。本実施例においては、ソックスレー脂肪抽出法を脂質含量の測定に用いている。
【００２４】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの水分含量を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができる。そのような水分含量を測定する方法としては、例えば、加熱乾燥法、蒸留法、吸収法、電気水分計法、近赤外分光法、中性子水分計およびカールフィッシャー法を挙げることができる。本実施例においては、加熱乾燥法を採用するハロゲン水分計を水分含量の測定に用いている。
【００２５】
本発明に係る低温ナチュラルチーズのアセトインやブタンジオール等の芳香成分の含量を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができるが、一般には、ヘッドスペースガスクロマトグラフ法が用いられており、本実施例においても同様である。
【００２６】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの酸度を測定する方法として、乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（昭和２６年１２月２７日厚生省令第５２号）に規定する中和滴定法が用いられるが、中和滴定法は特に限定されず、例えば、定量式中和滴定法や電量式中和滴定法等を挙げることができる。本実施例においては定量式中和滴定法を用いている。
【００２７】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの乳酸菌数を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができる。例えば、菌数測定用選択培地や菌数測定用プレート、菌数測定装置等を単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。本実施例においては、乳酸菌実験マニュアル（小崎ら、１９９２）に従い、乳酸菌分離用培地であるＧＹＰ白亜寒天培地を用いて乳酸菌数の測定を行っている。
【００２８】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの各種含有アミノ酸量を測定する方法や測定機器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができる。例えば、エドマン法、酵素蛍光法、高速液体クロマトグラフィー、各種質量分析法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、タンパク質加水分解物標準分析法等を挙げることができる。本実施例においては、タンパク質加水分解物標準分析法を採用した高速アミノ酸分析計を用いている。
【００２９】
本発明で用いることができるスターターとしては、市販の乳酸菌（例えばＣＨＮ−１１；クリスチャンハンセン社）の他、低温度帯を活動範囲とする乳酸菌（以下、「低温活動乳酸菌」という。）を単離し、単独もしくは、例えば市販等の他の乳酸菌とともに用いることができる。本発明における低温活動乳酸菌は、土壌、河川、発酵乳等の環境試料から、乳酸菌分離用培地であるＧＹＰ白亜寒天培地を用いて継代培養することにより単離している。
【００３０】
一般に、細菌を分類同定する方法としては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく系統分類により得られるグループ（クラスター）を指標として、細菌の分類・識別が行われている。すなわち、単離した乳酸菌の同定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を解析し、当業者に周知のアルゴリズムまたはプログラムを用いて、公知のデータベースにて相同性検索を行うことにより同定することができる。
【００３１】
ゲノムＤＮＡの抽出および精製、ＤＮＡの塩基配列決定、プライマーの設計および合成等の分子生物学的実験法や生化学的実験法は、基本的には、通常の実験書の記載に従って行うことができる。そのような実験書として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２００１，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等を挙げることができる。
【００３２】
こうして同定される乳酸菌は、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ウィッセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属、ストレプトコッカス属に属していると考えられる。なお、本実施例においては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉが同定されている。
【００３３】
なお、本発明においては、市販の、公的機関等に寄託または公的データベースに登録された公知の微生物のみならず、秘匿された、あるいは新たに単離された微生物が用いられてもよく、さらに、二種類以上の微生物が用いられてもよい。
【００３４】
次に、本発明に係る低温ナチュラルチーズの製造方法は、主として、
(i)加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却する冷却工程
(ii)４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整するｐＨ調整工程
(iii)４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターとレンネットとを４〜１３℃で加えてカードを生成させるカード生成工程
(iv)生成したカードを４〜１３℃で分離するカード分離工程
以上(i)〜(iv)の工程を有している。
【００３５】
市販のナチュラルチーズの製造方法では、加熱殺菌した原料乳を３０℃前後に冷却して、この温度を保持しつつ、この温度帯で活動する乳酸菌を含むスターターとレンネットとを連続して添加し、一旦４０〜６０℃に加温してカードとホエーとを分離させる方法が一般的であるが、本発明に係る低温ナチュラルチーズの製造方法では、加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却し、この温度を保持しつつ、４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整し、４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターを加え、さらにレンネットを添加し、４〜１３℃でカードとホエーとを分離させる点に特徴がある。
【００３６】
また、本発明に係る低温ナチュラルチーズの製造方法は、
(v)カード分離工程の後に４〜１３℃で熟成させる熟成工程
を含んでもよく、さらに、所望により、原料乳処理、各種濾過、ｐＨ調整、濃縮、乾燥等の任意の工程を追加することができる。
【００３７】
以下、本発明に係るナチュラルチーズおよびその製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００３８】
＜実施例１＞ナチュラルチーズ製造のための菌株の同定
本発明者等は、以下の方法で低温度帯を活動温度範囲とする乳酸菌を単離し、複数の菌株を同定した。
【００３９】
（１）菌株の単離
幌延町の土壌、河川、発酵乳等の環境試料を、薬さじまたは遠沈チューブを用いて採取し、滅菌水で１０倍希釈した。これを段階的に６回繰り返し、各段階の希釈液を得た。これら希釈液１０μＬを、各々、コンラージ棒を用いて乳酸菌分離用寒天培地であるＧＹＰ白亜寒天培地に塗布し、４℃で培養を行った。培養後、このＧＹＰ白亜寒天培地に形成された透明帯から釣菌し、単離を行った。
【００４０】
なお、本実施例で用いたＧＹＰ白亜寒天培地の組成は、以下のとおりである。
【００４１】
（ＧＹＰ白亜寒天培地の組成）培地１Ｌ中
組成（１）；
グルコース １０ｇ
酵母エキス １０ｇ
ペプトン ５ｇ
肉エキス ２ｇ
酢酸ナトリウム三水和物 ２ｇ
塩類溶液 ５ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ８０溶液 １０ｍＬ
蒸留水 １Ｌ
組成（２）；
炭酸カルシウム ５ｇ
寒天 １２ｇ
【００４２】
ＧＹＰ白亜寒天培地は、乳酸菌実験マニュアルに従って調製した（小崎ら、１９９２）。すなわち、上記組成（１）をｐＨ６．８に調整後、組成（２）と混合することにより調製した。なお、組成（１）の塩類溶液１ｍＬ中には、硫酸マグネシウム七水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン四水和物２ｍｇ、硫酸鉄七水和物２ｍｇおよび塩化ナトリウム２ｍｇが含まれ、Ｔｗｅｅｎ８０水溶液は、５０ｍｇ／ｍＬに調製して用いた。また、組成（２）の炭酸カルシウムは、乾熱滅菌器（三洋電機メディカシステム社）を用いて１８０℃で３０分乾燥滅菌したものを用いた。
【００４３】
（２）低温度帯を活動温度範囲とする乳酸菌の同定
本実施例１（１）で単離した乳酸菌からゲノムＤＮＡの抽出を行った。すなわち、培地よりコロニーを分離し、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎＴＭ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏ Ｂｉｏ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡを鋳形としてＰＣＲ法により１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列約１５００ｂｐを増幅した。
【００４４】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と、反応試薬であるＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｒ）（タカラバイオ社）とを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコルに従って行った。ＰＣＲのためのプライマーとして、公知のプライマーである下記一対のプライマー２７Ｆとプライマー１４９２Ｒとを用いて、下記のＰＣＲ条件にて行った。
【００４５】
１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅用プライマー
２７Ｆ ；５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号１）
１４９２Ｒ；５’−ｇｇｔｔｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３’（配列番号２）
＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程 ：９６℃，３０秒
アニーリング過程 ：５８℃，２５秒
エクステンション過程 ：７２℃，２５秒
以上を１サイクルとし、２７サイクル行った。
【００４６】
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。シークエンス反応はサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と、反応試薬であるＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）とを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコルに従って行った。シークエンス反応のためのプライマーとして、上記１６ｓ ｒＤＮＡ増幅用プライマーに加えて、さらに公知のプライマーである下記のプライマー５３０Ｆとプライマー８００Ｒとを用いて、下記のＰＣＲ条件にて行った。
【００４７】
シーケンス反応用プライマー
２７Ｆ ；５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号１）
１４９２Ｒ；５’−ｇｇｔｔｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３’（配列番号２）
５３０Ｆ；５’−ｇｔｇｃｃａｇｃｍｇｃｃｇｃｇｇ−３’（配列番号３）
８００Ｒ；５’−ｔａｃｃａｇｇｇｔａｔｃｔａａｔｃｃ−３’（配列番号４）
＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程 ：９６℃，１０秒
アニーリング過程 ：５０℃，５秒
エクステンション過程 ：６０℃，２４０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００４８】
ＤＮＡシークエンスの解析にはＤＮＡシーケンサーＡＢＩ３７３０ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を決定した。決定した１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列（配列番号５〜１３）について、ＢＬＡＳＴ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｓｅａｒｃｈ（Ａｌｔｓｕｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９７）を用いて日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）における相同性検索を行った。相同性検索の結果、低温度帯を活動温度範囲とする乳酸菌としてＡ〜Ｉの菌株を同定した。これらを表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
＜実施例２＞低温度帯でナチュラルチーズの製造が可能な菌株の選択
実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ〜Ｉおよびこれらを組み合わせから、実際に低温度帯でナチュラルチーズを製造することができるものを選択した。具体的な方法は以下の通りである。
【００５１】
まず、牛乳を原料乳として高温短時間殺菌法（ＨＴＳＴ法）により７２〜７８℃で１５秒間、あるいは低温殺菌法（ＬＴＬＴ法）により６２〜６５℃で３０分間加熱することにより殺菌処理をした後、原料乳を４℃に急冷却し、乳酸を加えて初期ｐＨを６．０に調整した。
【００５２】
次に、実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ〜Ｉをスキムミルク培地（１０％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）ごと、１００００ｒｐｍ，４℃にて１５分間、遠心分離器（コクサン社）を用いて遠心分離を行い、沈渣を回収して凍結乾燥したもの、またはこれらを組み合わせたものをスターターとして、ｐＨ調整後の原料乳に対して１〜３％量となるように添加し、マグネティックスターラー（アズワン社）を用いて均一に分散するよう充分に攪拌した後、４℃または１０℃で７２時間静置させた。続いて、この原料乳に対して０．０１％の塩化カルシウムを添加した後、レンネット（Ｆｒｏｍａｓｅ（Ｒ）−ＤＳＭ ＦＯＯＤ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ；ＤＳＭ社）を原料乳に対して約０．００３％となるように添加し、マグネティックスターラー（アズワン社）短時間でよく撹拌した。レンネットは、一度沸騰させて４℃に冷却した水に溶解させて濾過したものを使用した。原料乳にレンネットを添加した後、速やかに動揺を抑え、４℃または１０℃で６時間ないし８時間静置した。
【００５３】
上記の方法によってカードが生成した場合には、図１に示す分離容器１に生成したカードを含む原料乳ごと流し込んだ。分離容器１は、バット３と脚４で連接されたステンレス篩２の内部をチーズクロス５で被覆されてなり、あらかじめオートクレーブにて滅菌されている。原料乳を流し込んだ分離容器１を、４℃または１０℃に保ったクリーンブース内またはクリーンベンチ内に置き、無菌条件下で約６時間静置することによりカードとホエーとの分離を行った。すなわち、静置した間、自重によりチーズクロス５から滲出したホエーがステンレス篩２の隙間からバット３に落ち、これによりステンレス篩２を被覆するチーズクロス５の上にカードのみが残るため、カードとホエーとを分離することができる。
【００５４】
上記のようにして、ホエーを分離させてカードを密にすることによりナチュラルチーズ（特にこの段階のものはフレッシュチーズと呼ばれている）を得ることができた。本実施例２におけるナチュラルチーズのレンネット添加までの製造工程および通常のナチュラルチーズの製造工程を、環境温度変化とともに時系列で図２に示し、ナチュラルチーズの製造の可否を表２および表３に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
図２において、本実施例２におけるナチュラルチーズのレンネット添加までの製造工程を実線で示し、一般のナチュラルチーズの製造工程を破線で示している。また、本実施例２におけるナチュラルチーズのレンネット添加までの主な工程として、加熱殺菌（図中１）、原料乳のｐＨ調整（図中２）、スターター添加（図中３）およびレンネット添加（図中４）の時間を、一般のナチュラルチーズ製造の主な工程として、加熱殺菌（図中１）、スターター添加（図中３）およびレンネット添加（図中４）の時間を示している。図２に示すように、本実施例２におけるナチュラルチーズのレンネット添加までの製造工程では、通常のナチュラルチーズの製造工程と比較して、低温度下での製造工程であること、原料乳のｐＨ調整が行われていること、およびレンネットを添加する時間が遅いことが分かる。
【００５８】
一方、表２および表３に示すように、実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ〜Ｉはいずれも低温度帯でナチュラルチーズの製造が可能であることが確認され、特に乳酸菌Ａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）またはこれとの組み合わせが好適であることが確認された。以下、この低温度帯で製造されるナチュラルチーズを、「低温ナチュラルチーズ」という。
【００５９】
＜実施例３＞低温ナチュラルチーズの具体的な製造温度の検討
（１）乳酸菌Ａを用いて低温ナチュラルチーズを製造した場合の検討
スターターとして実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）を用い、初期ｐＨを５．５〜６．５とした場合の低温ナチュラルチーズの製造温度を検討した。具体的には、幌延町の酪農家から入手した加熱殺菌後の牛乳を原料乳とし、かつｐＨ５．５〜６．５を牛乳の初期ｐＨとして、ナチュラルチーズの製造温度を各々０，２，３，４，７，１０，１３および１５℃とした場合の検討を行った。
【００６０】
原料乳を冷却してｐＨを測定したところ、ｐＨ６．６〜６．８であった。これに乳酸を加えることにより０．１間隔でｐＨ５．５〜６．５に調整し、初期ｐＨとした。実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａをスキムミルク培地（１０％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）ごと、１００００ｒｐｍ，４℃にて１５分間、遠心分離器（コクサン社）を用いて遠心分離を行い、沈渣を回収して凍結乾燥したものをスターターとして、ｐＨ調整後の原料乳に対して１〜３％量となるように添加し、マグネティックスターラー（アズワン社）を用いて均一に分散するよう充分に撹拌した後、各々、０，２，３，４，７，１０，１３および１５℃で７２時間静置させた。続いて、この原料乳に対して０．０１％の塩化カルシウムを添加した後、レンネット（Ｆｒｏｍａｓｅ（Ｒ）−ＤＳＭ ＦＯＯＤ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ；ＤＳＭ社）を原料乳に対して約０．００３％となるように添加し、マグネティックスターラー（アズワン社）を用いて短時間でよく撹拌した。レンネットは、一度沸騰させて４℃に冷却した水に溶解させて濾過したものを使用した。原料乳にレンネットを添加した後、速やかに動揺を抑え、各々、同温度で６時間ないし８時間静置した。
【００６１】
上記の方法によってカードが生成した場合には、実施例２と同様にして、図１に示す分離容器１を用いて分離して密にすることにより低温ナチュラルチーズを得た。得られたナチュラルチーズは各々、同温度で７日間保存した。一方、カードが生成しない場合でも、そのまま同温度で原料乳を７日間保存した。
【００６２】
（２）市販の乳酸菌を用いて低温ナチュラルチーズを製造した場合の検討
比較例として、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いて、初期ｐＨを６．０とした場合の低温ナチュラルチーズの製造温度の検討を行った。具体的には、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いて、初期ｐＨを６．０とし、かつ製造温度を７℃および１０℃とした他は、本実施例３（１）と同様の手法で行った。
【００６３】
（３）ｐＨの測定
本実施例３（１）および（２）で得られた低温ナチュラルチーズまたは原料乳のｐＨを、ｐＨ測定器（ティアンドデイ社）を用いて測定した。その結果を表４に示す。
【００６４】
【表４】
【００６５】
通常、スターターとして用いた乳酸菌が活動して乳酸発酵がされていれば、製造したナチュラルチーズのｐＨは、産生した乳酸によって初期ｐＨと比較して低下する。表４に示すように、製造温度を０，２および３℃とした場合はｐＨが低下せず、その結果、ナチュラルチーズは製造されなかった。これは、製造温度を０，２および３℃とした場合、乳酸が産生されないと考えられる。そこで、以降の検討においては、製造温度を４℃以上とした。また、スターターとして実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａを用いた場合と、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いた場合との低温ナチュラルチーズのｐＨを、同じ初期ｐＨおよび同じ製造温度で比較した場合、ほとんど同値であることが確認された。
【００６６】
（４）糞便性大腸菌群検査（ＥＣ試験）
本実施例３（１）において、製造温度を４，７，１０，１３および１５℃として製造した低温ナチュラルチーズについて、食品衛生検査指針微生物編１９９０年に従って糞便性大腸菌群検査（ＥＣ試験）を行った。具体的な方法は以下の通りである。前記各々の低温ナチュラルチーズ１ｇずつを滅菌生理食塩水１００ｍＬにそれぞれ懸濁し、よく攪拌した後、１ｍＬずつを分注して１０倍希釈を繰り返し、合計６段階の希釈液を各々調製した。オートクレーブ滅菌を行ったＥＣ培地３ｍＬに、これら６段階の希釈液を０．１ｍＬずつ加え、３７℃で２４〜４８時間、培養を行った。本実施例で用いたＥＣ培地の組成は、以下のとおりである。
【００６７】
（ＥＣ培地の組成）培地１Ｌ中
ペプトン ２０．０ｇ
ラクトース ５．０ｇ
胆汁酸塩 １．５ｇ
リン酸水素二カリウム ４．０ｇ
リン酸二水素カリウム ４．５ｇ
塩化ナトリウム ５．０ｇ
【００６８】
ＥＣ培地は、食品衛生検査指針微生物編１９９０年に従って調製し、ｐＨ６．９に調整して用いた。培養後、ＥＣ培地に発酵管であるダーラム管を入れ、ダーラム管にガスが産生されているものを大腸菌群陽性とした。また、実施例３（２）で比較例として製造した、市販の乳酸菌を用いた低温ナチュラルチーズについても検査を行った。その結果を表５に示す。
【００６９】
【表５】
【００７０】
表５に示すように、製造温度が１３℃であって初期ｐＨが６．１〜６．５の場合の低温ナチュラルチーズおよび製造温度が１５℃の場合の低温ナチュラルチーズからは大腸菌群が検出された。そこで、製造温度を１３℃以下とすることとした。以上より、低温ナチュラルチーズの製造温度は４〜１３℃とすることが好適であることが確認された。また、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いて、初期ｐＨを６．０、製造温度を７℃および１０℃として製造した低温ナチュラルチーズは、大腸菌陰性であることが確認された。
【００７１】
＜実施例４＞低温ナチュラルチーズについての各種検討
実施例３の結果に基づき、製造温度を４〜１３℃とした低温ナチュラルチーズについて、粘度（Ｐａ・Ｓ）、脂質含量（ｗ／ｗ％）、水分含量（ｗ／ｗ％）、芳香成分であるアセトインならびにブタンジオールの含量（いずれもｍｇ／ｋｇ）、酸度（ｗ／ｗ％）、乳酸菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）、各種含有アミノ酸量（ｍｇ／１００ｇ）の測定および味の検討を行った。
【００７２】
（１）乳酸菌Ａを用いた低温ナチュラルチーズの製造
製造温度を、各々、４，７，１０および１３℃とした他は、実施例３（１）と同様の手法で、スターターとして実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）を用いて低温ナチュラルチーズを製造し、実施例３（１）と同様に７日間保存した後、各種検討に供した。
【００７３】
（２）市販の乳酸菌を用いた低温ナチュラルチーズの製造および市販のクリームチーズの準備
実施例３（２）と同様の手法で、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いて低温ナチュラルチーズを製造し、比較例として各種検討に供した。また、市販のクリームチーズＡ（クラフトフィラデルフィアチーズ；森永乳業社）およびクリームチーズＢ（雪印クリームチーズ；雪印乳業社）を準備し、ｐＨを測定した後、同様に比較例として各種検討に供した。なお、市販のクリームチーズＡとクリームチーズＢとのｐＨは、いずれもｐＨ５．５であった。
【００７４】
（３）粘度（Ｐａ・Ｓ）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについて、２０℃条件下、音叉型振動式粘度計（ＳＶ−１０Ａ；エー・アンド・デイ社）を用いて粘度を測定した。なお、本実施例４（１）の低温ナチュラルチーズについては、実施例３（４）において大腸菌群陰性のものについてのみ測定した。その結果を表６に示す。
【００７５】
【表６】
【００７６】
表６に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの粘度は０．３４〜１．０６Ｐａ・Ｓであり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの粘度よりも極めて低値であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの粘度を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの粘度が０．５８および０．６７Ｐａ・Ｓであるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの粘度は０．９０および１．００Ｐａ・Ｓであることから、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方がより低値であることが確認された。
【００７７】
（４）脂質含量（ｗ／ｗ％）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての脂質含量を測定した。脂質含量の測定は財団法人日本冷凍食品検査協会（ＪＦＦＩＣ）札幌検査所に依頼し、ソックスレー脂肪抽出法にて行われた。なお、本実施例４（１）の低温ナチュラルチーズについては、実施例３（４）において大腸菌群陰性のものについてのみ測定した。その結果を表７に示す。
【００７８】
【表７】
【００７９】
表７に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの脂質含量は１９．４〜３２．５ｗ／ｗ％であり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの脂質含量よりも低値であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの脂質含量を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの脂質含量が２３．４および２１．７ｗ／ｗ％であるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの脂質含量は２８．４および２０．４ｗ／ｗ％であることから、ほぼ同値であることが確認された。
【００８０】
（５）水分含量（ｗ／ｗ％）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての水分含量を測定した。水分含量の測定はハロゲン水分計（ＯＨＡＵＳ社）を用いて行った。その結果を表８に示す。
【００８１】
【表８】
【００８２】
表８に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの水分含量は５７〜６８ｗ／ｗ％であり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの水分含量よりも高値であることが確認された。なお、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの水分含量は５７〜６５ｗ／ｗ％であった。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの水分含量を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの水分含量がいずれも６２ｗ／ｗ％であるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの水分含量は６４および６８ｗ／ｗ％であることから、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方が若干低値であることが確認された。
【００８３】
（６）アセトイン含量（ｍｇ／ｋｇ）およびブタンジオール含量（ｍｇ／ｋｇ）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての、芳香成分であるアセトイン含量およびブタンジオール含量をガスクロマトグラフィーにて測定した。具体的には、４ｍＬバイアル瓶にチーズを１ｇ秤量し、これに脱イオン水を１ｍＬ加え、シリコン蓋とプラスチック栓とを閉めて６０℃で２０分間温浴した後、気相（ヘッドスペース）を２ｍＬ量り取り、ガスクロマトグラフ装置（ＧＣ−１４Ａ；島津製作所社）、カラム（Ｊ＆ＷキャピラリーカラムＤＢｗａｘ，内径０．３２ｍｍ×長さ６０ｍ×膜厚０．５０μｍ）およびＦＩＤ法ＶＯＣ分析器（ＧＣ−１４Ｂ；島津製作所社）を用いて分析した。その結果を表９に示す。
【００８４】
【表９】
【００８５】
アセトイン（ＩＵＰＡＣ名；３−ヒドロキシ−２−ブタノン）は、ヨーグルトやバター様の香りを持つ化合物であり、主に発酵食品に芳香成分として含まれている。表９に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズのアセトイン含量は１１０〜８７６ｍｇ／ｋｇであり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢのアセトイン含量の範囲に含まれるが、本実施例４（１）において、製造温度が４℃の場合の低温ナチュラルチーズのアセトイン含量は、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズおよび本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢのアセトイン含量と比較して、極めて高値であることが確認された。
【００８６】
また、ブタンジオールは、乳酸発酵食品において良い乳酸発酵がされているとの指標となる化合物といわれている。表９に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズのブタンジオール含量は９７〜５７３ｍｇ／ｋｇであり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢのブタンジオール含量よりも極めて高値であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとのブタンジオール含量を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、製造温度が１０℃の場合は本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方が若干低値であるものの、製造温度が７℃の場合は本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方が極めて高値であることが確認された。
【００８７】
（７）酸度（ｗ／ｗ％）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての酸度を測定した。酸度の測定法は、財団法人日本冷凍食品検査協会（ＪＦＦＩＣ）札幌検査所に依頼し、乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（昭和２６年１２月２７日厚生省令第５２号）に従って行われた。すなわち、試料を３倍に希釈し、フェノールフタレイン指示薬を添加して、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和滴定を行い、３０秒間微紅色の消失しない点を終点とした。終点における滴定量を読み取り、１００ｇ中の乳酸量を酸度として算出した。その結果を表１０に示す。
【００８８】
【表１０】
【００８９】
表１０に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの酸度は０．６〜１．８ｗ／ｗ％であり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの酸度よりも比較的高値であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの酸度を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの酸度が１．２および１．３ｗ／ｗ％であるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの酸度は１．４および１．２ｗ／ｗ％であることから、ほぼ同値であることが確認された。
【００９０】
（８）乳酸菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての乳酸菌数を測定した。具体的には、乳酸菌実験マニュアル（小崎ら、１９９２）に従い、各々のチーズ１ｇずつを滅菌生理食塩水１００ｍＬにそれぞれ懸濁し、よく攪拌した後、１ｍＬずつを分注して１０倍希釈を繰り返し、合計６段階の希釈液を各々調製した。ＧＹＰ白亜寒天培地にこれら６段階の希釈液を１ｍＬずつ塗沫し、２０℃で３日間培養後、コロニー数をカウントすることにより行った。その結果を表１１に示す。
【００９１】
【表１１】
【００９２】
表１１に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの乳酸菌数は１，１００，０００〜３２，０００，０００であり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの乳酸菌数よりも極めて多数であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの乳酸菌数を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの乳酸菌数が１８，０００，０００および２９，０００，０００であるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの乳酸菌数は１，３００，０００および５，７００，０００であることから、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方が極めて多数であることが確認された。
【００９３】
（９）各種含有アミノ酸量（ｍｇ／１００ｇ）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての各種含有アミノ酸量を測定した。具体的には、各々のチーズを０．１ｇ秤量して６Ｎ ＨＣｌを３ｍｌ加え、１３０℃ ２時間、加水分解を行った。加水分解後の試料について高速アミノ酸分析計（Ｌ−８８００；ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて各種含有アミノ酸量を測定した。その結果を表１２に示す。
【００９４】
【表１２】
【００９５】
表１２に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズのうち、初期ｐＨを６．５、製造温度を７℃とした場合の低温ナチュラルチーズがもっともアミノ酸リッチであることが確認された。
【００９６】
（１０）本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズについて、おいしさの検討をｎ＝１で行った。その結果を表１３に示す。
【００９７】
【表１３】
【００９８】
表１３に示すように、初期ｐＨが５．８ないし５．９であって製造温度が７〜１０℃の場合に相当おいしい低温ナチュラルチーズを製造することができることが確認された。
【００９９】
以上（１）〜（１０）の結果より、一般のクリームチーズと比較した場合、水分含量が多くて脂質含量が低く、かつ粘度が低いチーズは、一般には、味覚に堪えないチーズであると考えられるが、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズは、アセトインやブタンジオールの含量が多く、酸度も高いことから、これまでにないまったく新しいタイプのナチュラルチーズであることが分かる。
【０１００】
以上のような本実施例によれば、低温条件下、低温で活動する乳酸菌を用いて、原料乳にクリーム等を加える必要なく、粘度の極めて低い、これまでにないまったく新しいクリームタイプの低温ナチュラルチーズを製造することができる。
【０１０１】
なお、本発明に係る低温ナチュラルチーズおよびその製造方法は、前述した実施例に限定されるものではなく、適宜変更することができる。
【符号の説明】
【０１０２】
１ 分離容器
２ ステンレス篩
３ バット
４ 脚
５ チーズクロス
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の低温ナチュラルチーズおよびその製造方法に関し、特に、その粘度が極めて低い、低温ナチュラルチーズおよび低温で活動する乳酸菌を用いて低温条件下でこれを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、チーズはナチュラルチーズとプロセスチーズとに大別されている。ナチュラルチーズは、一般的に、殺菌処理した原料乳を中温に冷却し、乳酸菌等を含む微生物の集団であり発酵の開始のために用いるスターターを接種して所定の酸度に調整した後、凝乳酵素を含む製剤であり原料乳を凝固させるために用いるレンネットを加えて均一に混合し、静置してカード（凝乳）を形成させ、ホエー（乳清）を排除しカードを密にすることにより製造されており、さらに熟成されるものもある。一方、プロセスチーズは、ナチュラルチーズをいったん溶解した後、密封包装し、あるいは乾燥させることにより製造される。
【０００３】
すなわち、ナチュラルチーズは自然のままのチーズといえ、カード形成後の工程の違いによって種々のものを製造することができる。それ故、種々の繊細な風味と個性ある味わいを楽しむことができることから、近年、嗜好の多様化に伴い、ナチュラルチーズの消費量が増加し、ナチュラルチーズの需要が高まっている。
【０００４】
ナチュラルチーズには、エメンタール、エダム、パルミジャーノ・レッジャーノ、コンテ、グリュイエール、チェダーおよびミモレット等に代表される、水分含量が３８％以下であるハードタイプ、ゴーダ、マンゼルバベット、ルブロション、ショーム、サムソーおよびマリボー等に代表される、水分含量が３８〜４６％であるセミハードタイプ、ヴァランセ、プリニー・サン・ピエール、クロタン・ドゥ・シャヴィニョル、サントゥモールおよびピラミッド等に代表される、原料乳が山羊乳であるシェブール、リヴァロ、ラミ・デュ・シャンベルタン、タレッジオ、マンステル、ポン・レヴェックおよびエポワース等に代表される、外皮を塩水や酒等で洗いながら熟成させたウォッシュタイプ、ババリアブルー、ブルーデコース、ゴルゴンゾーラ、ロックフォール、スチルトンおよびカンボゾラ等に代表される、カードに青カビを混入し成型してなる青カビタイプ、サン・タンドレ、カマンベール、ブリヤ・サヴァラン、ブリー・ドゥ・モー、クロミエ、ヌーシャテルおよびバラカ等に代表される、白カビを表面に繁殖させて熟成させてなる白カビタイプ、あるいはモッツァレラ、カッテージチーズ、クリームチーズ、リコッタ、マスカルポーネおよびフロマージュ・ブラン等に代表される、非熟成で軟質のフレッシュタイプ等がある。
【０００５】
このうち、軟質チーズであるフレッシュタイプのナチュラルチーズ（フレッシュチーズ）、中でもクリームチーズは粘度が小さく、食材として広く応用されている。クリームチーズの基本的な製造方法は次のとおりである。まず、甘味を有する牛乳または脱脂乳に対して、全体の脂肪含有量が１０〜１６％となるように甘味を有するクリーム等を混合し、これを低温殺菌し、均質化し、かつ１７〜３３℃まで冷却する。次いで、それに乳酸菌を接種し、十分酸性になって乳漿から凝乳が分離するまで培養し、乳漿から凝乳を分離してなる。このときの凝固プロセスは、少量の凝乳剤を追加することによって任意選択で促進することができる。さらに、例えば遠心分離により乳漿から凝乳を分離した後 、安定剤、塩および他の成分を加える。このようにして製造されたクリームチーズは、現在の同一性の基準下、少なくとも３３％の脂肪および５５％以下の水分を含むことが必要とされている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００５−２７０１０６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に開示されたクリームチーズは、脂肪含量が３３％以上となるよう、原料乳にクリーム等を混合して製造されているが、牛乳本来の風味を担保するためには、原料乳にクリーム等を混合せずに製造できることが好ましいといえる。
【０００８】
本発明は、このような問題点を解決するためになされたものであって、原料乳にクリーム等を加える必要がなく、粘度の極めて低いクリームタイプの低温ナチュラルチーズを提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、鋭意検討を行った結果、低温条件下、低温で活動する乳酸菌を用いて、原料乳にクリーム等を加える必要なく、粘度の極めて低いクリームタイプのナチュラルチーズを製造することができることを見出し、本発明に至った。
【００１０】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
［１］ 加熱殺菌した原料乳に４〜１３℃でスターターとレンネットとを加えて生成したカードを分離してなる低温ナチュラルチーズであって、粘度が０．３４〜１．０６Ｐａ・ｓである低温ナチュラルチーズ。
［２］ 以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくともいずれかである、［１］に記載の低温ナチュラルチーズ：
（ａ）脂質含量が１９．４〜３２．５ｗ／ｗ％である；
（ｂ）水分含量が５７〜６５ｗ／ｗ％である；
（ｃ）ブタンジオール含量が９７〜５７３ｍｇ／ｋｇである。
［３］ 前記スターターが４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなる、［１］または［２］に記載の低温ナチュラルチーズ。
［４］ 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉからなる群から選択される１または２以上の乳酸菌である、［３］に記載の低温ナチュラルチーズ。
［５］ 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓである、［３］に記載の低温ナチュラルチーズ。
［６］ 前記原料乳がｐＨを弱酸性に調整された原料乳である、［１］から［５］のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズ。
［７］ 前記カードの分離後に４〜１３℃で熟成してなる、［１］から［６］のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズ。
［８］ 加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却する冷却工程と、４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整するｐＨ調整工程と、４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターとレンネットとを４〜１３℃で加えてカードを生成させるカード生成工程と、生成したカードを４〜１３℃で分離するカード分離工程とを有する、低温ナチュラルチーズの製造方法。
［９］ 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉからなる群から選択される、［８］に記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
［１０］ 前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓである、［８］に記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
［１１］ 前記カード分離工程の後に４〜１３℃で熟成させる熟成工程を含む、［８］から［１０］のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、低温条件下、低温で活動する乳酸菌を用いて、原料乳にクリーム等を加える必要なく、粘度の極めて低いクリームタイプの低温ナチュラルチーズを製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明における分離容器の構造を示す断面図である。
【図２】本発明における低温ナチュラルチーズのレンネット添加までの製造工程および通常のナチュラルチーズの製造工程を、環境温度変化とともに時系列で示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明に係る低温ナチュラルチーズおよびその製造方法について詳細に説明する。本発明に係る低温ナチュラルチーズは、加熱殺菌した原料乳に４〜１３℃でスターターとレンネットとを加えて生成したカードを分離してなり、かつ粘度が０．３４〜１．０６Ｐａ・ｓである。
【００１４】
本発明において使用可能な原料乳としては、例えば、通常のチーズ製造に用いられる牛乳、水牛乳、羊乳、山羊乳等を挙げることができ、生乳であるか、成分調整乳であるか、あるいは加工乳であるかを問わないが、本実施例においては、牛乳を好適な原料乳として用いている。そのため、牛乳本来の風味を担保することができる。
【００１５】
また、原料乳として加工乳を用いる場合は、本発明に係る低温ナチュラルチーズが製造可能な範囲および乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（昭和２６年１２月２７日厚生省令第５２号；以下、「乳等省令」という。）に定められた範囲で副原料を乳に添加し、加工乳として用いることができる。そのような副原料としては、例えば、クリーム、練乳、脱脂粉乳、全脂粉乳、トータルミルクプロテイン、乳清たん白、カゼインナトリウム、カゼインカルシウム等の乳由来の１または２以上の副原料や、野菜、砂糖、甘味料、寒天、香料等の１または２以上の副原料を挙げることができるが、上述のとおり、本実施例においては、風味を担保する観点から、加工乳ではない牛乳を好適な原料乳として用いている。
【００１６】
原料乳を加熱殺菌する方法としては、当業者により適宜選択可能であって乳等省令に従う方法を用いることができる。そのような加熱殺菌方法としては、６２〜６５℃で少なくとも３０分保持する低温保持殺菌法（ＬＴＬＴ法）、７２〜７８℃で１５秒以上保持する高温短時間殺菌法（ＨＴＳＴ法）、１２０〜１５０℃で１〜５秒保持する超高温加熱処理法（ＵＨＴ法）等を挙げることができる。本実施例においては、ＬＴＬＴ法およびＨＴＳＴ法を好適な加熱殺菌する方法として用いている。
【００１７】
本発明において、例えば乳酸菌の活性を高める等を目的として、原料乳を加熱殺菌後、低温条件下で弱酸性にｐＨ調整して用いることができる。この場合のｐＨ調整剤は特に限定されず、当業者によって適宜選択することができるが、例えば原料乳として牛乳を用いる場合、牛乳のｐＨが６．６〜６．８であることから、クエン酸や乳酸等、あるいはこれらの塩を用いることができる。本実施例においては、乳酸を好適なｐＨ調整剤として用いている。
【００１８】
なお、本発明において「低温」とは、４〜１３℃が好ましく、７〜１０℃がより好ましい。また、「弱酸性」とは、好ましくはｐＨが５．５〜６．５であり、より好ましくはｐＨが５．８〜６．３である。
【００１９】
また、レンネット添加後の凝固の速度やカードの固さによっては、所望により、塩化マグネシウム、炭酸ナトリウム、硫酸カルシウム、塩化カルシウム等の凝固剤を添加することができ、その添加量は、当業者による通常の手法によって適宜選択することができる。本実施例においては、塩化カルシウムを好適な凝固剤として用いている。
【００２０】
本発明に係る低温ナチュラルチーズは、原料乳を加熱殺菌した後、４〜１３℃に冷却し、スターターないしレンネットの添加、カード（凝乳）の生成、カード（凝乳）とホエー（乳清）との分離まで、この４〜１３℃の低温度帯にて行う。こうして、０．３４〜１．０６Ｐａ・Ｓという極めて低粘度のナチュラルチーズを得ることができる。
【００２１】
なお、本発明に係る低温ナチュラルチーズを用いて各種のプロセスチーズを製造することができる。例えば、必要に応じて溶融塩、バターなどを添加して、常法によりクリームチーズを得ることができる。このプロセスチーズは、本発明に係る低温ナチュラルチーズを用いて、あるいはこれに他のナチュラルチーズの少なくとも１種を配合して製造することができる。
【００２２】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの粘度を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものであればよい。そのような粘度計としては、例えば、細管式粘度計、落球式粘度計、回転式粘度計、レオメーター、振動式粘度計等を挙げることができる。本実施例においては、音叉型振動式粘度計を粘度の測定に用いている。
【００２３】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの脂質含量を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができるが、例えば、ガスクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、Ｂｌｉｇｈ ＆ Ｄｙｅｒ法、Ｂｒａｇｄｏｎ法、ソックスレー脂肪抽出法等を用いることができる。本実施例においては、ソックスレー脂肪抽出法を脂質含量の測定に用いている。
【００２４】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの水分含量を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができる。そのような水分含量を測定する方法としては、例えば、加熱乾燥法、蒸留法、吸収法、電気水分計法、近赤外分光法、中性子水分計およびカールフィッシャー法を挙げることができる。本実施例においては、加熱乾燥法を採用するハロゲン水分計を水分含量の測定に用いている。
【００２５】
本発明に係る低温ナチュラルチーズのアセトインやブタンジオール等の芳香成分の含量を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができるが、一般には、ヘッドスペースガスクロマトグラフ法が用いられており、本実施例においても同様である。
【００２６】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの酸度を測定する方法として、乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（昭和２６年１２月２７日厚生省令第５２号）に規定する中和滴定法が用いられるが、中和滴定法は特に限定されず、例えば、定量式中和滴定法や電量式中和滴定法等を挙げることができる。本実施例においては定量式中和滴定法を用いている。
【００２７】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの乳酸菌数を測定する方法や測定計器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができる。例えば、菌数測定用選択培地や菌数測定用プレート、菌数測定装置等を単独で、あるいは組み合わせて用いることができる。本実施例においては、乳酸菌実験マニュアル（小崎ら、１９９２）に従い、乳酸菌分離用培地であるＧＹＰ白亜寒天培地を用いて乳酸菌数の測定を行っている。
【００２８】
本発明に係る低温ナチュラルチーズの各種含有アミノ酸量を測定する方法や測定機器は、当業者が適宜選択することができるものを用いることができる。例えば、エドマン法、酵素蛍光法、高速液体クロマトグラフィー、各種質量分析法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法、タンパク質加水分解物標準分析法等を挙げることができる。本実施例においては、タンパク質加水分解物標準分析法を採用した高速アミノ酸分析計を用いている。
【００２９】
本発明で用いることができるスターターとしては、市販の乳酸菌（例えばＣＨＮ−１１；クリスチャンハンセン社）の他、低温度帯を活動範囲とする乳酸菌（以下、「低温活動乳酸菌」という。）を単離し、単独もしくは、例えば市販等の他の乳酸菌とともに用いることができる。本発明における低温活動乳酸菌は、土壌、河川、発酵乳等の環境試料から、乳酸菌分離用培地であるＧＹＰ白亜寒天培地を用いて継代培養することにより単離している。
【００３０】
一般に、細菌を分類同定する方法としては、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく系統分類により得られるグループ（クラスター）を指標として、細菌の分類・識別が行われている。すなわち、単離した乳酸菌の同定は、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列を解析し、当業者に周知のアルゴリズムまたはプログラムを用いて、公知のデータベースにて相同性検索を行うことにより同定することができる。
【００３１】
ゲノムＤＮＡの抽出および精製、ＤＮＡの塩基配列決定、プライマーの設計および合成等の分子生物学的実験法や生化学的実験法は、基本的には、通常の実験書の記載に従って行うことができる。そのような実験書として、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，２００１，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ等を挙げることができる。
【００３２】
こうして同定される乳酸菌は、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロイコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、ウィッセラ属（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ペディオコッカス属（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）、カルノバクテリウム属、ストレプトコッカス属に属していると考えられる。なお、本実施例においては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉが同定されている。
【００３３】
なお、本発明においては、市販の、公的機関等に寄託または公的データベースに登録された公知の微生物のみならず、秘匿された、あるいは新たに単離された微生物が用いられてもよく、さらに、二種類以上の微生物が用いられてもよい。
【００３４】
次に、本発明に係る低温ナチュラルチーズの製造方法は、主として、
(i)加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却する冷却工程
(ii)４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整するｐＨ調整工程
(iii)４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターとレンネットとを４〜１３℃で加えてカードを生成させるカード生成工程
(iv)生成したカードを４〜１３℃で分離するカード分離工程
以上(i)〜(iv)の工程を有している。
【００３５】
市販のナチュラルチーズの製造方法では、加熱殺菌した原料乳を３０℃前後に冷却して、この温度を保持しつつ、この温度帯で活動する乳酸菌を含むスターターとレンネットとを連続して添加し、一旦４０〜６０℃に加温してカードとホエーとを分離させる方法が一般的であるが、本発明に係る低温ナチュラルチーズの製造方法では、加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却し、この温度を保持しつつ、４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整し、４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターを加え、さらにレンネットを添加し、４〜１３℃でカードとホエーとを分離させる点に特徴がある。
【００３６】
また、本発明に係る低温ナチュラルチーズの製造方法は、
(v)カード分離工程の後に４〜１３℃で熟成させる熟成工程
を含んでもよく、さらに、所望により、原料乳処理、各種濾過、ｐＨ調整、濃縮、乾燥等の任意の工程を追加することができる。
【００３７】
以下、本発明に係るナチュラルチーズおよびその製造方法について、実施例に基づいて説明する。なお、本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって示される特徴に限定されない。
【実施例】
【００３８】
＜実施例１＞ナチュラルチーズ製造のための菌株の同定
本発明者等は、以下の方法で低温度帯を活動温度範囲とする乳酸菌を単離し、複数の菌株を同定した。
【００３９】
（１）菌株の単離
幌延町の土壌、河川、発酵乳等の環境試料を、薬さじまたは遠沈チューブを用いて採取し、滅菌水で１０倍希釈した。これを段階的に６回繰り返し、各段階の希釈液を得た。これら希釈液１０μＬを、各々、コンラージ棒を用いて乳酸菌分離用寒天培地であるＧＹＰ白亜寒天培地に塗布し、４℃で培養を行った。培養後、このＧＹＰ白亜寒天培地に形成された透明帯から釣菌し、単離を行った。
【００４０】
なお、本実施例で用いたＧＹＰ白亜寒天培地の組成は、以下のとおりである。
【００４１】
（ＧＹＰ白亜寒天培地の組成）培地１Ｌ中
組成（１）；
グルコース １０ｇ
酵母エキス １０ｇ
ペプトン ５ｇ
肉エキス ２ｇ
酢酸ナトリウム三水和物 ２ｇ
塩類溶液 ５ｍＬ
Ｔｗｅｅｎ８０溶液 １０ｍＬ
蒸留水 １Ｌ
組成（２）；
炭酸カルシウム ５ｇ
寒天 １２ｇ
【００４２】
ＧＹＰ白亜寒天培地は、乳酸菌実験マニュアルに従って調製した（小崎ら、１９９２）。すなわち、上記組成（１）をｐＨ６．８に調整後、組成（２）と混合することにより調製した。なお、組成（１）の塩類溶液１ｍＬ中には、硫酸マグネシウム七水和物４０ｍｇ、硫酸マンガン四水和物２ｍｇ、硫酸鉄七水和物２ｍｇおよび塩化ナトリウム２ｍｇが含まれ、Ｔｗｅｅｎ８０水溶液は、５０ｍｇ／ｍＬに調製して用いた。また、組成（２）の炭酸カルシウムは、乾熱滅菌器（三洋電機メディカシステム社）を用いて１８０℃で３０分乾燥滅菌したものを用いた。
【００４３】
（２）低温度帯を活動温度範囲とする乳酸菌の同定
本実施例１（１）で単離した乳酸菌からゲノムＤＮＡの抽出を行った。すなわち、培地よりコロニーを分離し、ＵｌｔｒａＣｌｅａｎＴＭ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｍｏ Ｂｉｏ社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡを鋳形としてＰＣＲ法により１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列約１５００ｂｐを増幅した。
【００４４】
ＰＣＲは、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と、反応試薬であるＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（Ｒ）（タカラバイオ社）とを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコルに従って行った。ＰＣＲのためのプライマーとして、公知のプライマーである下記一対のプライマー２７Ｆとプライマー１４９２Ｒとを用いて、下記のＰＣＲ条件にて行った。
【００４５】
１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅用プライマー
２７Ｆ ；５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号１）
１４９２Ｒ；５’−ｇｇｔｔｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３’（配列番号２）
＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程 ：９６℃，３０秒
アニーリング過程 ：５８℃，２５秒
エクステンション過程 ：７２℃，２５秒
以上を１サイクルとし、２７サイクル行った。
【００４６】
ＰＣＲ産物はＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。シークエンス反応はサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）と、反応試薬であるＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）とを用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のプロトコルに従って行った。シークエンス反応のためのプライマーとして、上記１６ｓ ｒＤＮＡ増幅用プライマーに加えて、さらに公知のプライマーである下記のプライマー５３０Ｆとプライマー８００Ｒとを用いて、下記のＰＣＲ条件にて行った。
【００４７】
シーケンス反応用プライマー
２７Ｆ ；５’−ａｇａｇｔｔｔｇａｔｃｃｔｇｇｃｔｃａｇ−３’（配列番号１）
１４９２Ｒ；５’−ｇｇｔｔｃｃｔｔｇｔｔａｃｇａｃｔｔ−３’（配列番号２）
５３０Ｆ；５’−ｇｔｇｃｃａｇｃｍｇｃｃｇｃｇｇ−３’（配列番号３）
８００Ｒ；５’−ｔａｃｃａｇｇｇｔａｔｃｔａａｔｃｃ−３’（配列番号４）
＜ＰＣＲ条件＞
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程 ：９６℃，１０秒
アニーリング過程 ：５０℃，５秒
エクステンション過程 ：６０℃，２４０秒
以上を１サイクルとし、２５サイクル行った。
【００４８】
ＤＮＡシークエンスの解析にはＤＮＡシーケンサーＡＢＩ３７３０ＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて塩基配列を決定した。決定した１６Ｓ ｒＤＮＡの塩基配列（配列番号５〜１３）について、ＢＬＡＳＴ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｓｅａｒｃｈ（Ａｌｔｓｕｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．１９９７）を用いて日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ）における相同性検索を行った。相同性検索の結果、低温度帯を活動温度範囲とする乳酸菌としてＡ〜Ｉの菌株を同定した。これらを表１に示す。
【００４９】
【表１】
【００５０】
＜実施例２＞低温度帯でナチュラルチーズの製造が可能な菌株の選択
実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ〜Ｉおよびこれらを組み合わせから、実際に低温度帯でナチュラルチーズを製造することができるものを選択した。具体的な方法は以下の通りである。
【００５１】
まず、牛乳を原料乳として高温短時間殺菌法（ＨＴＳＴ法）により７２〜７８℃で１５秒間、あるいは低温殺菌法（ＬＴＬＴ法）により６２〜６５℃で３０分間加熱することにより殺菌処理をした後、原料乳を４℃に急冷却し、乳酸を加えて初期ｐＨを６．０に調整した。
【００５２】
次に、実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ〜Ｉをスキムミルク培地（１０％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）ごと、１００００ｒｐｍ，４℃にて１５分間、遠心分離器（コクサン社）を用いて遠心分離を行い、沈渣を回収して凍結乾燥したもの、またはこれらを組み合わせたものをスターターとして、ｐＨ調整後の原料乳に対して１〜３％量となるように添加し、マグネティックスターラー（アズワン社）を用いて均一に分散するよう充分に攪拌した後、４℃または１０℃で７２時間静置させた。続いて、この原料乳に対して０．０１％の塩化カルシウムを添加した後、レンネット（Ｆｒｏｍａｓｅ（Ｒ）−ＤＳＭ ＦＯＯＤ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ；ＤＳＭ社）を原料乳に対して約０．００３％となるように添加し、マグネティックスターラー（アズワン社）短時間でよく撹拌した。レンネットは、一度沸騰させて４℃に冷却した水に溶解させて濾過したものを使用した。原料乳にレンネットを添加した後、速やかに動揺を抑え、４℃または１０℃で６時間ないし８時間静置した。
【００５３】
上記の方法によってカードが生成した場合には、図１に示す分離容器１に生成したカードを含む原料乳ごと流し込んだ。分離容器１は、バット３と脚４で連接されたステンレス篩２の内部をチーズクロス５で被覆されてなり、あらかじめオートクレーブにて滅菌されている。原料乳を流し込んだ分離容器１を、４℃または１０℃に保ったクリーンブース内またはクリーンベンチ内に置き、無菌条件下で約６時間静置することによりカードとホエーとの分離を行った。すなわち、静置した間、自重によりチーズクロス５から滲出したホエーがステンレス篩２の隙間からバット３に落ち、これによりステンレス篩２を被覆するチーズクロス５の上にカードのみが残るため、カードとホエーとを分離することができる。
【００５４】
上記のようにして、ホエーを分離させてカードを密にすることによりナチュラルチーズ（特にこの段階のものはフレッシュチーズと呼ばれている）を得ることができた。本実施例２におけるナチュラルチーズのレンネット添加までの製造工程および通常のナチュラルチーズの製造工程を、環境温度変化とともに時系列で図２に示し、ナチュラルチーズの製造の可否を表２および表３に示す。
【００５５】
【表２】
【００５６】
【表３】
【００５７】
図２において、本実施例２におけるナチュラルチーズのレンネット添加までの製造工程を実線で示し、一般のナチュラルチーズの製造工程を破線で示している。また、本実施例２におけるナチュラルチーズのレンネット添加までの主な工程として、加熱殺菌（図中１）、原料乳のｐＨ調整（図中２）、スターター添加（図中３）およびレンネット添加（図中４）の時間を、一般のナチュラルチーズ製造の主な工程として、加熱殺菌（図中１）、スターター添加（図中３）およびレンネット添加（図中４）の時間を示している。図２に示すように、本実施例２におけるナチュラルチーズのレンネット添加までの製造工程では、通常のナチュラルチーズの製造工程と比較して、低温度下での製造工程であること、原料乳のｐＨ調整が行われていること、およびレンネットを添加する時間が遅いことが分かる。
【００５８】
一方、表２および表３に示すように、実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ〜Ｉはいずれも低温度帯でナチュラルチーズの製造が可能であることが確認され、特に乳酸菌Ａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）またはこれとの組み合わせが好適であることが確認された。以下、この低温度帯で製造されるナチュラルチーズを、「低温ナチュラルチーズ」という。
【００５９】
＜実施例３＞低温ナチュラルチーズの具体的な製造温度の検討
（１）乳酸菌Ａを用いて低温ナチュラルチーズを製造した場合の検討
スターターとして実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）を用い、初期ｐＨを５．５〜６．５とした場合の低温ナチュラルチーズの製造温度を検討した。具体的には、幌延町の酪農家から入手した加熱殺菌後の牛乳を原料乳とし、かつｐＨ５．５〜６．５を牛乳の初期ｐＨとして、ナチュラルチーズの製造温度を各々０，２，３，４，７，１０，１３および１５℃とした場合の検討を行った。
【００６０】
原料乳を冷却してｐＨを測定したところ、ｐＨ６．６〜６．８であった。これに乳酸を加えることにより０．１間隔でｐＨ５．５〜６．５に調整し、初期ｐＨとした。実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａをスキムミルク培地（１０％ ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）ごと、１００００ｒｐｍ，４℃にて１５分間、遠心分離器（コクサン社）を用いて遠心分離を行い、沈渣を回収して凍結乾燥したものをスターターとして、ｐＨ調整後の原料乳に対して１〜３％量となるように添加し、マグネティックスターラー（アズワン社）を用いて均一に分散するよう充分に撹拌した後、各々、０，２，３，４，７，１０，１３および１５℃で７２時間静置させた。続いて、この原料乳に対して０．０１％の塩化カルシウムを添加した後、レンネット（Ｆｒｏｍａｓｅ（Ｒ）−ＤＳＭ ＦＯＯＤ Ｓｐｅｃｉａｌｔｉｅｓ；ＤＳＭ社）を原料乳に対して約０．００３％となるように添加し、マグネティックスターラー（アズワン社）を用いて短時間でよく撹拌した。レンネットは、一度沸騰させて４℃に冷却した水に溶解させて濾過したものを使用した。原料乳にレンネットを添加した後、速やかに動揺を抑え、各々、同温度で６時間ないし８時間静置した。
【００６１】
上記の方法によってカードが生成した場合には、実施例２と同様にして、図１に示す分離容器１を用いて分離して密にすることにより低温ナチュラルチーズを得た。得られたナチュラルチーズは各々、同温度で７日間保存した。一方、カードが生成しない場合でも、そのまま同温度で原料乳を７日間保存した。
【００６２】
（２）市販の乳酸菌を用いて低温ナチュラルチーズを製造した場合の検討
比較例として、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いて、初期ｐＨを６．０とした場合の低温ナチュラルチーズの製造温度の検討を行った。具体的には、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いて、初期ｐＨを６．０とし、かつ製造温度を７℃および１０℃とした他は、本実施例３（１）と同様の手法で行った。
【００６３】
（３）ｐＨの測定
本実施例３（１）および（２）で得られた低温ナチュラルチーズまたは原料乳のｐＨを、ｐＨ測定器（ティアンドデイ社）を用いて測定した。その結果を表４に示す。
【００６４】
【表４】
【００６５】
通常、スターターとして用いた乳酸菌が活動して乳酸発酵がされていれば、製造したナチュラルチーズのｐＨは、産生した乳酸によって初期ｐＨと比較して低下する。表４に示すように、製造温度を０，２および３℃とした場合はｐＨが低下せず、その結果、ナチュラルチーズは製造されなかった。これは、製造温度を０，２および３℃とした場合、乳酸が産生されないと考えられる。そこで、以降の検討においては、製造温度を４℃以上とした。また、スターターとして実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａを用いた場合と、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いた場合との低温ナチュラルチーズのｐＨを、同じ初期ｐＨおよび同じ製造温度で比較した場合、ほとんど同値であることが確認された。
【００６６】
（４）糞便性大腸菌群検査（ＥＣ試験）
本実施例３（１）において、製造温度を４，７，１０，１３および１５℃として製造した低温ナチュラルチーズについて、食品衛生検査指針微生物編１９９０年に従って糞便性大腸菌群検査（ＥＣ試験）を行った。具体的な方法は以下の通りである。前記各々の低温ナチュラルチーズ１ｇずつを滅菌生理食塩水１００ｍＬにそれぞれ懸濁し、よく攪拌した後、１ｍＬずつを分注して１０倍希釈を繰り返し、合計６段階の希釈液を各々調製した。オートクレーブ滅菌を行ったＥＣ培地３ｍＬに、これら６段階の希釈液を０．１ｍＬずつ加え、３７℃で２４〜４８時間、培養を行った。本実施例で用いたＥＣ培地の組成は、以下のとおりである。
【００６７】
（ＥＣ培地の組成）培地１Ｌ中
ペプトン ２０．０ｇ
ラクトース ５．０ｇ
胆汁酸塩 １．５ｇ
リン酸水素二カリウム ４．０ｇ
リン酸二水素カリウム ４．５ｇ
塩化ナトリウム ５．０ｇ
【００６８】
ＥＣ培地は、食品衛生検査指針微生物編１９９０年に従って調製し、ｐＨ６．９に調整して用いた。培養後、ＥＣ培地に発酵管であるダーラム管を入れ、ダーラム管にガスが産生されているものを大腸菌群陽性とした。また、実施例３（２）で比較例として製造した、市販の乳酸菌を用いた低温ナチュラルチーズについても検査を行った。その結果を表５に示す。
【００６９】
【表５】
【００７０】
表５に示すように、製造温度が１３℃であって初期ｐＨが６．１〜６．５の場合の低温ナチュラルチーズおよび製造温度が１５℃の場合の低温ナチュラルチーズからは大腸菌群が検出された。そこで、製造温度を１３℃以下とすることとした。以上より、低温ナチュラルチーズの製造温度は４〜１３℃とすることが好適であることが確認された。また、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いて、初期ｐＨを６．０、製造温度を７℃および１０℃として製造した低温ナチュラルチーズは、大腸菌陰性であることが確認された。
【００７１】
＜実施例４＞低温ナチュラルチーズについての各種検討
実施例３の結果に基づき、製造温度を４〜１３℃とした低温ナチュラルチーズについて、粘度（Ｐａ・Ｓ）、脂質含量（ｗ／ｗ％）、水分含量（ｗ／ｗ％）、芳香成分であるアセトインならびにブタンジオールの含量（いずれもｍｇ／ｋｇ）、酸度（ｗ／ｗ％）、乳酸菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）、各種含有アミノ酸量（ｍｇ／１００ｇ）の測定および味の検討を行った。
【００７２】
（１）乳酸菌Ａを用いた低温ナチュラルチーズの製造
製造温度を、各々、４，７，１０および１３℃とした他は、実施例３（１）と同様の手法で、スターターとして実施例１（１）で同定した乳酸菌Ａ（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）を用いて低温ナチュラルチーズを製造し、実施例３（１）と同様に７日間保存した後、各種検討に供した。
【００７３】
（２）市販の乳酸菌を用いた低温ナチュラルチーズの製造および市販のクリームチーズの準備
実施例３（２）と同様の手法で、市販の乳酸菌であるＣＨＮ−１１（クリスチャンハンセン社）を用いて低温ナチュラルチーズを製造し、比較例として各種検討に供した。また、市販のクリームチーズＡ（クラフトフィラデルフィアチーズ；森永乳業社）およびクリームチーズＢ（雪印クリームチーズ；雪印乳業社）を準備し、ｐＨを測定した後、同様に比較例として各種検討に供した。なお、市販のクリームチーズＡとクリームチーズＢとのｐＨは、いずれもｐＨ５．５であった。
【００７４】
（３）粘度（Ｐａ・Ｓ）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについて、２０℃条件下、音叉型振動式粘度計（ＳＶ−１０Ａ；エー・アンド・デイ社）を用いて粘度を測定した。なお、本実施例４（１）の低温ナチュラルチーズについては、実施例３（４）において大腸菌群陰性のものについてのみ測定した。その結果を表６に示す。
【００７５】
【表６】
【００７６】
表６に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの粘度は０．３４〜１．０６Ｐａ・Ｓであり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの粘度よりも極めて低値であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの粘度を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの粘度が０．５８および０．６７Ｐａ・Ｓであるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの粘度は０．９０および１．００Ｐａ・Ｓであることから、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方がより低値であることが確認された。
【００７７】
（４）脂質含量（ｗ／ｗ％）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての脂質含量を測定した。脂質含量の測定は財団法人日本冷凍食品検査協会（ＪＦＦＩＣ）札幌検査所に依頼し、ソックスレー脂肪抽出法にて行われた。なお、本実施例４（１）の低温ナチュラルチーズについては、実施例３（４）において大腸菌群陰性のものについてのみ測定した。その結果を表７に示す。
【００７８】
【表７】
【００７９】
表７に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの脂質含量は１９．４〜３２．５ｗ／ｗ％であり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの脂質含量よりも低値であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの脂質含量を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの脂質含量が２３．４および２１．７ｗ／ｗ％であるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの脂質含量は２８．４および２０．４ｗ／ｗ％であることから、ほぼ同値であることが確認された。
【００８０】
（５）水分含量（ｗ／ｗ％）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての水分含量を測定した。水分含量の測定はハロゲン水分計（ＯＨＡＵＳ社）を用いて行った。その結果を表８に示す。
【００８１】
【表８】
【００８２】
表８に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの水分含量は５７〜６８ｗ／ｗ％であり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの水分含量よりも高値であることが確認された。なお、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの水分含量は５７〜６５ｗ／ｗ％であった。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの水分含量を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの水分含量がいずれも６２ｗ／ｗ％であるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの水分含量は６４および６８ｗ／ｗ％であることから、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方が若干低値であることが確認された。
【００８３】
（６）アセトイン含量（ｍｇ／ｋｇ）およびブタンジオール含量（ｍｇ／ｋｇ）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての、芳香成分であるアセトイン含量およびブタンジオール含量をガスクロマトグラフィーにて測定した。具体的には、４ｍＬバイアル瓶にチーズを１ｇ秤量し、これに脱イオン水を１ｍＬ加え、シリコン蓋とプラスチック栓とを閉めて６０℃で２０分間温浴した後、気相（ヘッドスペース）を２ｍＬ量り取り、ガスクロマトグラフ装置（ＧＣ−１４Ａ；島津製作所社）、カラム（Ｊ＆ＷキャピラリーカラムＤＢｗａｘ，内径０．３２ｍｍ×長さ６０ｍ×膜厚０．５０μｍ）およびＦＩＤ法ＶＯＣ分析器（ＧＣ−１４Ｂ；島津製作所社）を用いて分析した。その結果を表９に示す。
【００８４】
【表９】
【００８５】
アセトイン（ＩＵＰＡＣ名；３−ヒドロキシ−２−ブタノン）は、ヨーグルトやバター様の香りを持つ化合物であり、主に発酵食品に芳香成分として含まれている。表９に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズのアセトイン含量は１１０〜８７６ｍｇ／ｋｇであり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢのアセトイン含量の範囲に含まれるが、本実施例４（１）において、製造温度が４℃の場合の低温ナチュラルチーズのアセトイン含量は、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズおよび本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢのアセトイン含量と比較して、極めて高値であることが確認された。
【００８６】
また、ブタンジオールは、乳酸発酵食品において良い乳酸発酵がされているとの指標となる化合物といわれている。表９に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズのブタンジオール含量は９７〜５７３ｍｇ／ｋｇであり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢのブタンジオール含量よりも極めて高値であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとのブタンジオール含量を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、製造温度が１０℃の場合は本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方が若干低値であるものの、製造温度が７℃の場合は本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方が極めて高値であることが確認された。
【００８７】
（７）酸度（ｗ／ｗ％）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての酸度を測定した。酸度の測定法は、財団法人日本冷凍食品検査協会（ＪＦＦＩＣ）札幌検査所に依頼し、乳及び乳製品の成分規格等に関する省令（昭和２６年１２月２７日厚生省令第５２号）に従って行われた。すなわち、試料を３倍に希釈し、フェノールフタレイン指示薬を添加して、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液で中和滴定を行い、３０秒間微紅色の消失しない点を終点とした。終点における滴定量を読み取り、１００ｇ中の乳酸量を酸度として算出した。その結果を表１０に示す。
【００８８】
【表１０】
【００８９】
表１０に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの酸度は０．６〜１．８ｗ／ｗ％であり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの酸度よりも比較的高値であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの酸度を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの酸度が１．２および１．３ｗ／ｗ％であるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの酸度は１．４および１．２ｗ／ｗ％であることから、ほぼ同値であることが確認された。
【００９０】
（８）乳酸菌数（ｃｆｕ／ｍＬ）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての乳酸菌数を測定した。具体的には、乳酸菌実験マニュアル（小崎ら、１９９２）に従い、各々のチーズ１ｇずつを滅菌生理食塩水１００ｍＬにそれぞれ懸濁し、よく攪拌した後、１ｍＬずつを分注して１０倍希釈を繰り返し、合計６段階の希釈液を各々調製した。ＧＹＰ白亜寒天培地にこれら６段階の希釈液を１ｍＬずつ塗沫し、２０℃で３日間培養後、コロニー数をカウントすることにより行った。その結果を表１１に示す。
【００９１】
【表１１】
【００９２】
表１１に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの乳酸菌数は１，１００，０００〜３２，０００，０００であり、本実施例４（２）で準備した市販のクリームチーズＡおよびクリームチーズＢの乳酸菌数よりも極めて多数であることが確認された。また、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズと、比較例として本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズとの乳酸菌数を、初期ｐＨ６．０および製造温度７℃ないし１０℃で比較した場合、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの乳酸菌数が１８，０００，０００および２９，０００，０００であるのに対し、本実施例４（２）で製造した低温ナチュラルチーズの乳酸菌数は１，３００，０００および５，７００，０００であることから、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズの方が極めて多数であることが確認された。
【００９３】
（９）各種含有アミノ酸量（ｍｇ／１００ｇ）の測定
本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズおよび比較例として本実施例４（２）で製造ないし準備した各々のチーズについての各種含有アミノ酸量を測定した。具体的には、各々のチーズを０．１ｇ秤量して６Ｎ ＨＣｌを３ｍｌ加え、１３０℃ ２時間、加水分解を行った。加水分解後の試料について高速アミノ酸分析計（Ｌ−８８００；ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて各種含有アミノ酸量を測定した。その結果を表１２に示す。
【００９４】
【表１２】
【００９５】
表１２に示すように、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズのうち、初期ｐＨを６．５、製造温度を７℃とした場合の低温ナチュラルチーズがもっともアミノ酸リッチであることが確認された。
【００９６】
（１０）本実施例４（１）で製造した各々の低温ナチュラルチーズについて、おいしさの検討をｎ＝１で行った。その結果を表１３に示す。
【００９７】
【表１３】
【００９８】
表１３に示すように、初期ｐＨが５．８ないし５．９であって製造温度が７〜１０℃の場合に相当おいしい低温ナチュラルチーズを製造することができることが確認された。
【００９９】
以上（１）〜（１０）の結果より、一般のクリームチーズと比較した場合、水分含量が多くて脂質含量が低く、かつ粘度が低いチーズは、一般には、味覚に堪えないチーズであると考えられるが、本実施例４（１）で製造した低温ナチュラルチーズは、アセトインやブタンジオールの含量が多く、酸度も高いことから、これまでにないまったく新しいタイプのナチュラルチーズであることが分かる。
【０１００】
以上のような本実施例によれば、低温条件下、低温で活動する乳酸菌を用いて、原料乳にクリーム等を加える必要なく、粘度の極めて低い、これまでにないまったく新しいクリームタイプの低温ナチュラルチーズを製造することができる。
【０１０１】
なお、本発明に係る低温ナチュラルチーズおよびその製造方法は、前述した実施例に限定されるものではなく、適宜変更することができる。
【符号の説明】
【０１０２】
１ 分離容器
２ ステンレス篩
３ バット
４ 脚
５ チーズクロス
【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱殺菌した原料乳に４〜１３℃でスターターとレンネットとを加えて生成したカードを分離してなる低温ナチュラルチーズであって、粘度が０．３４〜１．０６Ｐａ・ｓである低温ナチュラルチーズ。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくともいずれかである、請求項１に記載の低温ナチュラルチーズ：
（ａ）脂質含量が１９．４〜３２．５ｗ／ｗ％である；
（ｂ）水分含量が５７〜６５ｗ／ｗ％である；
（ｃ）ブタンジオール含量が９７〜５７３ｍｇ／ｋｇである。
【請求項３】
前記スターターが４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなる、請求項１または請求項２に記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項４】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉからなる群から選択される１または２以上の乳酸菌である、請求項３に記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項５】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓである、請求項３に記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項６】
前記原料乳がｐＨを弱酸性に調整された原料乳である、請求項１から請求項５のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項７】
前記カードの分離後に４〜１３℃で熟成してなる、請求項１から請求項６のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項８】
加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却する冷却工程と、４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整するｐＨ調整工程と、４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターとレンネットとを４〜１３℃で加えてカードを生成させるカード生成工程と、生成したカードを４〜１３℃で分離するカード分離工程とを有する、低温ナチュラルチーズの製造方法。
【請求項９】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉからなる群から選択される、請求項８に記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
【請求項１０】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓである、請求項８に記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
【請求項１１】
前記カード分離工程の後に４〜１３℃で熟成させる熟成工程を含む、請求項８から請求項１０のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
【請求項１】
加熱殺菌した原料乳に４〜１３℃でスターターとレンネットとを加えて生成したカードを分離してなる低温ナチュラルチーズであって、粘度が０．３４〜１．０６Ｐａ・ｓである低温ナチュラルチーズ。
【請求項２】
以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の少なくともいずれかである、請求項１に記載の低温ナチュラルチーズ：
（ａ）脂質含量が１９．４〜３２．５ｗ／ｗ％である；
（ｂ）水分含量が５７〜６５ｗ／ｗ％である；
（ｃ）ブタンジオール含量が９７〜５７３ｍｇ／ｋｇである。
【請求項３】
前記スターターが４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなる、請求項１または請求項２に記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項４】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉからなる群から選択される１または２以上の乳酸菌である、請求項３に記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項５】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓである、請求項３に記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項６】
前記原料乳がｐＨを弱酸性に調整された原料乳である、請求項１から請求項５のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項７】
前記カードの分離後に４〜１３℃で熟成してなる、請求項１から請求項６のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズ。
【請求項８】
加熱殺菌した原料乳を４〜１３℃まで冷却する冷却工程と、４〜１３℃でｐＨを弱酸性に調整するｐＨ調整工程と、４〜１３℃を活動温度範囲とする乳酸菌を含んでなるスターターとレンネットとを４〜１３℃で加えてカードを生成させるカード生成工程と、生成したカードを４〜１３℃で分離するカード分離工程とを有する、低温ナチュラルチーズの製造方法。
【請求項９】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｕｃｈｕｅｎｓｉｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｃｉｔｒｅｕｍ、Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｇｅｌｉｄｕｍ、Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ ｓｏｌｉからなる群から選択される、請求項８に記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
【請求項１０】
前記乳酸菌が、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓである、請求項８に記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
【請求項１１】
前記カード分離工程の後に４〜１３℃で熟成させる熟成工程を含む、請求項８から請求項１０のいずれかに記載の低温ナチュラルチーズの製造方法。
【図１】
【図２】
【図２】
【公開番号】特開２０１０−２０７１２９（Ｐ２０１０−２０７１２９Ａ）
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５８１１（Ｐ２００９−５５８１１）
【出願日】平成２１年３月１０日（２００９．３．１０）
【出願人】（５０９０６９５０４）
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年３月１０日（２００９．３．１０）
【出願人】（５０９０６９５０４）
【Ｆターム（参考）】
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