低表面エネルギー化合物でコーティングしたエレクトロスプレーエミッタ
【課題】 蒸留水など大きな表面張力を持つ溶液でも安定したエレクトロスプレーを可能にする。
【解決手段】本発明は、本体が入口孔、出口孔、それらをつなぐチャンネルからなり、少なくとも出口先端外壁の溶液と接しうる部分が低表面エネルギー化合物でコーティングされているエレクトロスプレーエミッタであり、スプレーを補助するガスを一切使用せずに毎分マイクロリットルからナノリットルの低流速域で安定なエレクトロスプレーである。本エミッタは電気非伝導性であるので、陰イオン測定で起こりやすい放電の危険性がなく陽イオン・陰イオンどちらの測定でも安定したエレクトロスプレーが可能である。エミッタと液体クロマトグラフィーなどの分析機器とを接続するラインの内壁を低表面エネルギー化合物でコーティングすることにより分析対象化合物の吸着による損失を防ぐ。
【解決手段】本発明は、本体が入口孔、出口孔、それらをつなぐチャンネルからなり、少なくとも出口先端外壁の溶液と接しうる部分が低表面エネルギー化合物でコーティングされているエレクトロスプレーエミッタであり、スプレーを補助するガスを一切使用せずに毎分マイクロリットルからナノリットルの低流速域で安定なエレクトロスプレーである。本エミッタは電気非伝導性であるので、陰イオン測定で起こりやすい放電の危険性がなく陽イオン・陰イオンどちらの測定でも安定したエレクトロスプレーが可能である。エミッタと液体クロマトグラフィーなどの分析機器とを接続するラインの内壁を低表面エネルギー化合物でコーティングすることにより分析対象化合物の吸着による損失を防ぐ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エレクトロスプレーエミッタ、その製造法、分析装置とエレクトロスプレーエミッタをつなぐ管状コネクタ、それらの使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、エレクトロスプレーイオン化（ESI）質量分析法（MS）は、生体分子、薬剤、合成高分子などの分析に広く用いられている（N. Ceck, et al., Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 362-387）。特にプロテオミクスやメタボロミクスの分野においては、ESI-MSの高感度化とキャピラリー高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）との良好な接続性が必要なことから、１μｌ／ｍｉｎ以下の低流速での安定したＥＳＩが要求される。このような流速でのスプレーには先端を細く引き先端径が非常に小さいエミッタが用いられている。エミッタは、通常、ガラス、溶融シリカ、ステンレス製でステンレス製以外のものは金属や伝導性ポリマーで被覆したものと被覆されていないものがある（D. Gale, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 1017-1021; M. Emmett, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994, 5, 605-613; G. Valaskovic, et al., Anal. Chem. 1995, 67, 3802-3805; M. Wilm, et al., Anal. Chem. 1996, 68, 1-8; E. Maziarz III, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000, 11, 659-663; and Y. Ishihama, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, 913-918）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これら既存エミッタを使用した多くの経験から、先端ですぐに詰まってしまい使用不能になる、逆相HPLCにおいてグラジェント溶出の初期に水を多く含む溶出液のスプレーが不安定で自動分析の途中でスプレーが停止してしまう等の問題点が指摘されてきた。その結果、プロテオミクスやメタボロミクスに要求されるハイスループット分析を容易に達成できない状況が発生していた。
【０００４】
これらの問題の原因は相互に関連しており、おもにエミッタ出口先端の外側壁表面(γS)と水溶液(γL)の大きな表面エネルギーに起因する。エレクトロスプレーは、次のような過程で起こる。まずエミッタ内を流れる溶液と対極の間に高電圧を印加することにより分極が起こり、エミッタ出口先端から溶出する液滴表面に対極と反対符号の電荷が発生する。このため液滴は静電力により対極に引っ張られて先端の丸い円錐状を呈する。対極方向への静電力と液滴表面の同符号電荷間のクーロン反発力が溶液の表面張力より大きくなると液滴先端から分子のイオン化のもとになる表面荷電した微小液滴が多数射出する。この状態の液滴は先端が鋭く飛び出したコーン状を呈しTayler コーンと呼ばれる（後述する文献１の総説とそれに引用されている文献）。エミッタ素材の表面エネルギーが大きいと（ガラスではγS〜１００ｍＮ／ｍ）エミッタ先端外壁と接する液滴基部の直径が大きくなるので大きな液滴が形成される。エミッタ内の溶液との接電部位で分極により発生する電荷量は一定であるので、液滴が大きくなるとその表面電荷密度が下がる。このため、水溶液など大きな表面張力（γL＝７３ｍＮ／ｍ）を持つ溶液のスプレーが困難になる。小さい液滴を形成しやすくするために、従来の技術では、非常に小さい先端径のエミッタが必要であった。
【課題を解決するための手段及び効果】
【０００５】
本発明者は、前述の問題点を解析した結果、エミッタの少なくとも出口先端部分を低表面エネルギー化合物で被覆することによりこれらの問題を回避できることを見出した。
【０００６】
したがって、本発明は、エミッタ本体が入口孔、出口孔、それらをつなぐチャンネルからなり、少なくとも出口先端外壁の一部が低表面エネルギー化合物でコーティングされているエレクトロスプレーエミッタを提供する。この目的に使用できる低表面エネルギー化合物は、たとえばパーフルオロポリオキセタン（PFPO）などのフッ素化ポリマーがある。エミッタ本体は、溶融シリカ、ガラスセラミックス、アルミノシリケートガラス、ポリプロピレンあるいはステンレス鋼で作製できる。エミッタ本体は、出口孔のほうに先細りであることが望ましい。先端外側壁だけでなくエミッタ本体チャンネル内壁も低表面エネルギー化合物で被覆できる。
【０００７】
本発明は、エミッタ本体が入口孔、出口孔、それらをつなぐチャネル、出口先端の少なくとも外壁の一部の低表面エネルギー化合物でのコーティングを有するエレクトロスプレーエミッタの製造法にも関する。
【０００８】
本発明により、スプレーを補助するガスを一切使用せずに毎分マイクロリットルからナノリットルの低流速域で、エミッタは蒸留水を含め大きな表面張力を持つ溶液でも安定したエレクトロスプレーを可能にする。エミッタ先端が非電気伝導性であるため電気的な放電の危険性を回避でき、従来から放電を起しやすい事が知られている陰イオン測定でも安定なエレクトロスプレーを可能にする。さらに、本発明のエレクトロスプレーエミッタは、以下の特長により長寿命を実現できた。（１）スプレー効率が著しく改善されたため、従来エミッタのようにエミッタ先端内腔を細く引く必要がなくなった。（２）エミッタ本体チャンネルをコーティングすることにより非特異的吸着を低減した。その結果、本発明のエレクトロスプレーエミッタは、少なくとも５００時間以上という従来エミッタでは不可能な長寿命を達成した。
【０００９】
エミッタと分析機器（たとえば、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、超臨界クロマトグラフィー、ミクロ流体装置など）とを接続するチャンネル内での分析物質の損失を防ぐため、接続流路内壁を低表面エネルギー化合物でコーティングすることが可能である。
【００１０】
したがって、本発明は、さらにエレクトロスプレーエミッタと分析機器をつなぐ管状流路に関する。管状流路本体は、入口孔、出口孔、それらをつなぐチャンネル、チャンネル内壁の少なくとも一部に低表面エネルギー化合物コーティングを有する。この用途に適した低表面エネルギー化合物は前述と同様である。本発明の管状流路を用いることにより、疎水性化合物の回収率が改善される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
最適な実施形態を示すことにより本発明を詳細に説明する。ただし、これらの実施形態はあくまで本発明の実施例であり、本発明の内容をこれら実施例に含まれるものに限定するものではない。
【００１２】
＜エレクトロスプレーエミッタ＞
図１（ｂ）は本発明のエレクトロスプレーエミッタの望ましい一実施例を示す。エレクトロスプレーエミッタは入口孔２、出口孔３と入口孔２と出口孔３とをつなぐチャンネル４（導管）からなる。本発明において、エミッタ出口先端外壁部分の低表面エネルギー化合物でのコーティングは効率よいエレクトロスプレーに必須である。したがって、図１（ｂ）のエミッタの出口外壁１ｂ、さらに望ましくは１ａにコーティングされている。
【００１３】
本発明において、エミッタ先端外壁に加えて他の部位を低表面エネルギー化合物でコーティングしてもよい。エミッタ出口先端でのコーティングに加えて、チャンネル４の内壁４ａの少なくとも出口先端内壁あるいは内壁前面を低表面エネルギー化合物でコーティングできる。望ましい実施例においては、チャンネル４の内壁４ａ全面がコーティングされている。たとえば、図１（ｄ）と図１（ｅ）のエミッタにおいて、出口先端外壁１ｂに加えチャンネル４の内壁４ａ全面がコーティングされている。図１（ｆ）のエミッタでは、内壁のコーティングは出口先端の一部に限られている。ＰＦＰＯコーティングは無色透明で見ることができない。
【００１４】
ここで用いる用語「低表面エネルギー」は、たとえば、２０ｍＮ／ｍ以下、好ましくは５〜２０ｍＮ／ｍ、さらに好ましくは６〜１２ｍＮ／ｍの範囲の固体表面の単位表面積あたりのエネルギー（液体表面の表面張力に対応する）と定義する。本特許で用いる低表面エネルギー物質は、それが適当な低表面エネルギーを有し、かつエレクトロスプレーの効率を損なわずにエミッタ本体をコーティング可能な物質であるならば、特定の物質に限定されるものではない。このような低表面エネルギー物質として適当なものは、たとえば、フルオロポリマーやフッ素化化合物がある。好ましいフルオロポリマーやフッ素化化合物として、パーフルオロポリオキセタン、パーフルオロウレタン、フルオロポリマーエラストーマ、ポリテトラフルオロエチレン、フルオロアルキルモノシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルジシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルポリシラン、またはエポキシ、水酸基、アクリレート、イソシアネートなどの官能基を有するパーフルオロオクタールやパーフルオロポリエーテルなどがある。これらのうちもっとも好ましい物質は、パーフルオロポリオキセタン（ＰＦＰＯ）である。ＰＦＰＯは、通常室温で１２ｍＮ／ｍの臨界表面張力を有する。
【００１５】
エミッタ本体は溶融シリカキャピラリーで作製できる。しかし、エレクトロスプレーエミッタとして利用しうる材質であるならば、いかなる制限もなく使用できる。たとえば、ガラス、ガラスセラミックス、アルミノシリケートガラス、ポリプロピレン、あるいはステンレススチールなどが挙げられる。先端部分のポリイミド被覆を剥いで先細り加工していないキャピラリーでもＰＦＰＯコーティングすることにより、蒸留水をエレクトロスプレーすることが可能になる。
【００１６】
より安定したスプレーとＭＳの測定感度を上げるためには、先端先細り加工することが望ましい(たとえば、以下の文献を参照 D. Gale, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 1017-1021; M. Emmett, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994, 5, 605-613; G. Valaskovic, et al., Anal. Chem. 1995, 67, 3802-3805; M. Wilm, et al, Anal. Chem. 1996, 68, 1-8)。したがって、図１（ｂ）に示すように、エミッタ本体１の外壁は出口孔３に向かって先細りになっている。先細りの形状は、徐々に先端に向かって細くなるのではなく、図１（ｂ）の先端１ｂのように先端から適当な長さ（２〜５ｍｍが望ましい）だけ均一に細い外壁の先端形が望ましく、スプレーの安定性において優れている。従来からキャピラリーＨＰＬＣに用いられている〜０．１μｌ／ｍｉｎ以上の流速では、内腔をそのままで外壁のみ先細りにするこのエミッタの形態は目詰まりを避けるために実用的である。ナノスプレーのようにさらに低流速でのＥＳＩでは、エミッタ本体の外側及び内側が、出口孔に向かって次第に細くなっていることが望ましい。この場合は、先細り加工のないエミッタではあるものに比べスプレー効率が悪い。
【００１７】
市販されているレーザーキャピラリープラーを用いれば、外壁と内腔ともに先細りのキャピラリーを作製できる(M. Wilm, et al., Anal. Chem. 1996, 68, 1-8)。このような先端先細りキャピラリーは、たとえばNew Objective (Cambridge, MT)から購入可能である。一方、エミッタの先細り加工は、フッ素酸(HF)処理で行うことができる(D. Gale, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 1017-1021)。一般に市販の溶融シリカキャピラリーは強度を高めるためポリイミド被覆されているので、適当な長さ（本実施例では３〜５ｃｍ）に切断後、一端のポリイミドを適当な長さ例えば７ｍｍを焼いて剥す。この端をＨＦ溶液（以下の例では４６％）に浸し緩徐に攪拌しながら適当な時間エッチングする。必要時間は、キャピラリーの内径、外径に依存するが、外径１５０μｍ／内径２０μｍのキャピラリーでは、室温で約２０分が適当である。エッチングのあいだにポリイミド被覆と露出したシリカとの境界にＨＦ溶液滴ができてその部分のエッチングだけが速く進行するので、液滴が発生すると可及的に空気や窒素ガスなどで除去する必要がある。キャピラリーをプラーで引く方法と比べるとＨＦによるエッチングでは、内腔をそのままにして外壁を先細り加工できる。これは、目詰まり防止に重要であるが、特にハイスループット分析では目詰まり防止によるエミッタの長寿命化は必須である。キャピラリーにその内腔の大きさに適した流速で液体（水が好ましく、内径２０μｍのキャピラリーでは２００ｎｌ／ｍｉｎが適当である）を流し内腔壁とＨＦの接触を妨げると内壁のエッチングを回避できる。空気や不活性ガス（窒素ガスが望ましい）もこの用途に利用可能である。エッチング後、キャピラリー内腔を水で洗浄して窒素ガスを流して乾燥させ４０°Ｃで静置してさらに乾燥させる。
【００１８】
エミッタの長さ、内径、外径などの規格に、特に制限はない。エミッタを使用する用途によって熟練者により種々の規格のエミッタを作製できる。典型的なエミッタの規格は、長さ３０〜１００ｍｍ位で、外径と内径はそれぞれ１５０〜３７５μｍと１０〜５０μｍ位である。
【００１９】
＜エレクトロスプレーエミッタの作成法＞
本発明は、上述したエミッタの製造法を提供する。この方法により、入口孔、出口孔とそれらをつなぐチャンネルからなり、少なくとも出口先端外壁部分が低表面エネルギー物質でコーティングされたエレクトロスプレーエミッタを作製することができる。たとえば一実施例においては、適当な溶媒に溶解した低表面エネルギー化合物にエミッタの一部分を浸し、その後溶媒を乾燥させて、コーティング剤をエミッタ壁に付着させる。
【００２０】
さらに具体的に述べれば、本発明のエレクトロスプレーエミッタは次の方法で作製することができる。前記の方法でエッチングにより先端外壁を先細り加工したキャピラリー（エミッタ）あるいはNew Objectives社から購入したプラーにより引いて先細り加工したキャピラリー（エミッタ）の加工した部分をパーフルオロヘキサンに溶解した適当な濃度（たとえば０．００１〜０．１％ ｗ／ｖ）のＰＦＰＯに、〜１分から１０分浸した。いずれの規格のキャピラリーもコーティング可能であるが、キャピラリーＨＰＬＣとの接続の用途にはスプレー効率と目詰まりを避けるという観点から１０〜５０μｍの内径のものが望ましい。エッチングにより先端外壁を先細り加工した長さ５ｃｍ、内径１０〜５０μｍのキャピラリーでは、単にＰＦＰＯ溶液に浸すだけで内壁前面と先端の浸した外壁部分がコーティングされた。一方、プラーにより引いて先細り加工したキャピラリーでは本体部分が同じ内径のキャピラリーでも内壁のコーティングは先端の一部に限られた。もし必要ならば、ポンプあるいは手動でシリンジからＰＦＰＯ溶液をキャピラリーに通すことにより内壁全面をコーティングできる。たとえば０．１％など比較的高濃度のＰＦＰＯに浸した場合は、先端部分がコーティング剤で閉塞されないように空気や窒素ガスなどの不活性ガスをチャネルにながす必要があるが、さらに低濃度のＰＦＰＯ溶液を使用したときは必ずしもこの処理が必要とは限らない。ＰＦＰＯ処理したキャピラリーは６０℃で６０分間以上静置してコーティングを安定化させた後にＥＳＩ／ＭＳに使用可能である。以下の実施例においては、一晩静置したエミッタを用いた。０．１％ＰＦＰＯでコーティングした場合のコーティングの厚さは約１０ｎｍである。本発明のエレクトロスプレーエミッタの実施例を図１（ｂ）〜（ｆ）に示す。ＰＦＰＯコーティングは無色透明であるので、ポリイミド被覆をはがしてコーティングした部分の内腔を流れる気泡などを目視できる。
【００２１】
図２（ａ）と図２（ｂ）とは、種々の濃度のＰＦＰＯコーティングしたエミッタ外壁表面の水に対する接触角の変化を示す。ＰＦＰＯコーティングしたときとしていないときの接触角の比は、ＰＦＰＯ濃度の上昇ともに増加し、０．０１％付近で頭打ちして約２．０８の最大値（接触角１２２°に対応）に達する。乾燥過程でのコーティング剤による先端閉塞を避けるためコーティングに用いるＰＦＰＯ濃度は、０．１％以下が望ましい。エミッタの内径と外径に依存するが、エレクトロスプレーの効率が最適になるようなＰＦＰＯ濃度を用いなければならない。
【００２２】
＜エミッタと分析装置を接続する管状配管（管状コネクタ）＞
本発明はまた非特異的吸着などによるサンプルの損失を防ぐのために有効な、エミッタと分析機器を接続する管状配管（キャピラリー、チュービング、接続ラインなど）を提供する。そのような管状配管は、入口孔、出口孔とそれらをつなぐチャンネルからなり、チャンネル内壁の少なくとも一部が低表面エネルギー物質でコーティングされている。内壁全体がコーティングされているほうが望ましい。良好な低表面エネルギーコーティング剤は、たとえばフルオロポリマーやフッ素化化合物である。望ましいフルオロポリマーやフッ素化化合物は上述した。もっとも好ましいコーティング剤は、パーフルオロポリオキセタンである。管状配管の材質は、従来からの溶融シリカが望ましい。
【００２３】
管状配管内壁のコーティング法は、前述した方法に準拠する。すなわち、管状配管のチャンネルを通して低表面エネルギー化合物溶液を送液する。熟練者であればこの分野の専門知識を用い、いかなるサイズの管状配管でもコーティング処理することができる。このような管状配管使用することによりエミッタと液体クロマトグラフなどの分析装置の間での疎水性サンプルの損失を防ぐことができる。
【００２４】
以下に、本発明の主旨を実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明の用途を実施例の範囲に制限するものではない。
【実施例】
【００２５】
（実施例１：ＰＦＰＯでキャピラリーのチャネル内壁をコーティングする方法）
ポリイミド被覆溶融シリカキャピラリーは、キャピラリーＨＰＬＣの接続のための標準的な配管系として繁用されている。その内壁は、イオン性や疎水性化合物を非特異的に吸着する性質をもつことが以前から知られているので、配管を通過している間にこれらの分析対象化合物が損失する可能性がある。溶融シリカキャピラリーチャンネル内壁をＰＦＰＯコーティングすることにより、このようなサンプルの損失を減少させうる。適当な濃度（０．１〜０．００１％、さらに望ましくは０．００５〜０．０２％）のＰＦＰＯ／パーフルオロヘキサン溶液をポンプあるいは手動でミクロシリンジからチャネル内に流し、窒素ガスでフラッシュした。その後に６０℃、６０分間静置して、さらに４０℃で一晩乾燥させた。
【００２６】
（実施例２：蒸留水あるいは水含量が高い溶媒を用いた時のエミッタの性能）
ハイスループット・プロテオミクスやメタボロミクスで繁用されるグラジェント溶出逆相ＨＰＬＣにおいて、グラジェント初期には水を多く含有する溶媒（たとえば、２％アセトニトリル、０．１％蟻酸を含む水溶液）で平衡化されたカラムから試料が溶出される。このような条件でも高電圧印加後すぐにイオン化効率の良い安定なコーンジェットモード(Cloupeau, M.; Prunet-Foch, B., J. Electrostat. 1989, 22, 135-159)でのエレクトロスプレーが始まらなければならない。本発明のエレクトロスプレーエミッタがこのような条件を満たす性能を有するかどうか調べた。エッチングによる先端先細り加工して内腔に先細りがないＰＦＰＯコーティングエミッタを用いて、目視によるスプレー状態の観察とイオントラップ質量分析計ＬＣＱ(ThermoFinnigan, CA)で質量電荷比（ｍ／ｚ）が１５０〜２０００の全イオン電流（ＴＩＣ）の安定性を記録することにより、蒸留水のスプレー効率を調べた。本実施例と以下の実施例においては、ＨＰＬＣとの接続性のよいＬＣＱを用いたが、他の質量分析計を用いることもできる。ただし、エミッタの規格や、ＭＳの測定パラメータ、など細かい実験条件を使用するＭＳの特性により最適化する必要がある。エッチングによる先端先細り加工した内径２０μｍ／外径１５０μｍのＰＦＰＯコーティングエミッタにシリンジポンプから、内径０．１〜０．２ｍｍのカラムを用いるキャピラリーＨＰＬＣで通常使用される〜０．８μｌ／ｍｉｎの流速で、蒸留水を送液し実験した。印加電圧は１．８ｋＶで２０分間ＴＩＣをＬＣＱで記録した。印加電圧は、エミッタのサイズやスプレーする溶液の表面張力によっても異なるが、１．２〜２．０ｋＶが典型的な最適電圧である。エミッタはｘｙｚ方向に位置を微調整できるｘｙｚステージ（ＡＭＲ，Ｔｏｋｙｏ）に装着して、エミッタ先端と対極の距離はイオン化の状態をみて３ｍｍを目安に適宜増減した。このようにして、図３（ａ）に示すようにＰＦＰＯコーティングされたエミッタは蒸留水を効率良く安定にスプレーすることが示された。
【００２７】
質量分析計の汚染を防ぐため、分析ごとのカラム洗浄時やサンプル注入後の素通り画分など不要な溶出液を導入しないように、これらの操作時にＥＳＩ印加電圧を切りスプレーを停止しておくことが肝要である。電圧を切っている間にエミッタ出口先端にはいろいろな大きさの液滴ができて、従来型のエミッタでは、次の分析のために電圧を印加してもスプレーが始まらないことがしばしばある。このような状況を模倣するため、シリンジポンプをスタートさせ蒸留水を送り始め、種々の大きさの液滴が先端にできるのを待って一定時間おくれて（０分，０．５分，１分，１．５分，２分，２．５分）電圧を印加する実験を行った。エッチングによる先端先細り加工した内径２０μｍ／外径１５０μｍのＰＦＰＯコーティングエミッタを用いた。待ち時間にできる液滴の大きさにかかわらず迅速に安定したスプレーが開始されることが明らかになった（図３（ｃ））。これらの結果、本発明のＰＦＰＯコーティングエミッタは、高含水量溶媒をよく用いるハイスループットＨＰＬＣ／ＭＳやフローインジェクション分析に対応できることが証明された。
【００２８】
図４（ａ）は、０．１ｐｍｏｌの還元アルキル化牛血清アルブミンのトリプシン消化物を逆相Ｍａｇｉｃ Ｃ１８ カラム（０．２×５０ｍｍ，Michrom BioResources,Inc.）で分離してオンラインでＬＣＱに導入して得た陽イオンベースピーククロマトグラム（各溶出時間に対して溶出される最強度のシグナルをプロットしたイオンクロマトグラム）を示す。カラムは、溶媒Ａ（２％アセトニトリルと０．１％蟻酸を含む水溶液）で平衡化し、溶媒Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％蒸留水、０．１％蟻酸）２〜６０％、２０分間の直線濃度勾配で展開した。流速は１μｌ／ｍｉｎである。Ｍａｇｉｃ２００２ポンプ（Michrom BioResources,Inc.）の流速は５０μｌ／ｍｉｎに設定して、キャピラリーカラムへの流速はＭａｇｉｃ可変スプリッタ（Michrom BioResources,Inc.）で制御した。エッチングによる先端先細り加工した内径２０μｍ／外径１５０μｍのＰＦＰＯコーティングエミッタをカラム出口のステンレスフィティングに直接接続して、流路内での拡散によるピーク幅の広がりを防ぎ分離能の向上に努めた。１．７ｋＶのＥＳＩ電圧をカラム出口ステンレスフィッティングを介して印加した。その直後から水が主体の溶媒Ａから安定したスプレーが始まり、グラジエントの最後まで続いた（図４（ａ））。図４（ｂ）は、図４（ａ）に星印で示した１１．３分にベースピークとして溶出されるｍ／ｚ ６５３イオンを含むフルスキャンスペクトル、図４（ｃ）はそのタンデムマススペクトル（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルを示す。記録した全溶出時間にわたりＰＦＰＯ由来のシグナルは検出されなかった。検出感度は、従来型のプラーにより引き金属コートしたエミッタと同程度であるが、遅れて溶出される疎水性ペプチドの強度が強い傾向が見られた。ＰＦＰＯコーティングエミッタは頑丈で、臨床組織検体などの組織から粗抽出して二次元電気泳動やＨＰＬＣで分離した蛋白質のトリプシン消化物の逆相ＨＰＬＣ／ＭＳ分析において少なくとも５００時間の耐用性が認められた。
【００２９】
図４（ａ）と同様の分析をインジェクタとカラムを接続するキャピラリー内壁がＰＦＰＯコーティングされた時（図４（ｄ））とされない時（図４（ｅ））で比較した。ＰＦＰＯコーティングキャピラリーを使用したときのほうが、遅れて溶出される疎水性ペプチドの強度が強い傾向が見られた。
【００３０】
次に、本発明のエレクトロスプレーエミッタを用いて、蛋白質のＥＳＩマススペクトルに対する有機溶媒の影響について調べた。牛心臓シトクロムｃ（１μＭ）溶液はＥＳＩにより一群の多価陽イオンとしてイオン化される。蛋白質に対する変性作用が次のように強くなるほど（１０ｍＭ蟻酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．２）＜０．１％蟻酸水溶液（ｐＨ２．７３）＜０．１％蟻酸を含む４６％アセトニトリル／水）、最大強度を示すピークのｍ／ｚ値が１７６６．３，１３７４．２，８８３．８（これらはそれぞれ＋７，＋９，＋１４価イオンに対応する）と小さい値へシフトする。すでに報告されているように、この様な変化は蛋白質の構造変化によりアミノ酸のイオン化可能な側鎖が溶媒に露出する程度を反映している(S. Chowdhury, et al., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9012-9013.)。すなわち、変性作用が強く構造変化が大きいほどイオン化可能な側鎖が溶媒に露出する確率が大きくなり、高次の多価イオンを生成しやすい。水溶液から安定したスプレーが可能な本発明のエレクトロスプレーエミッタを用いることにより、水溶液中に存在する自然なコンフォメーションの蛋白質を直接気相にイオン化できるので、溶液中の蛋白質のコンフォメーションや変性―フォールディング平衡の研究にＥＳＩ／ＭＳを応用しやすくなる。さらに、最近、蛋白質を酵素消化せずに直接断片化して超高分解能フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析計で測定して構造決定をする方法が注目されている。従来型エミッタでは、安定なエレクトロスプレーを補助するために蛋白質水溶液に有機溶媒を添加することが多かった。多くの蛋白質は有機溶媒の変性作用により沈殿するので、水溶液を安定してスプレーできる本発明のエレクトロスプレーエミッタは、蛋白質をそのまま用いるＥＳＩ／ＭＳにも有効に利用できる。
【００３１】
（実施例３：陰イオン測定における本発明のエレクトロスプレーエミッタの特性）
陽イオン測定と比べると、陰イオン測定ではコロナ放電やアーク放電が起こりやすいことが知られている(Ceck, N. B.; Enke, C. G., Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 362-387)。特に、従来型の先端を金属コーティングしたエミッタでは、その危険性が高い。放電により陰イオンのスプレーが不安定になると、長時間安定なスプレーが要求されるＨＰＬＣや他の分離手段との接続が困難になる。ごく最近になって、伝導性ポリマーであるポリアニリンで先端をコーティングしたナノエレクトロスプレーエミッタは、放電しにくく陰イオン測定で少なくとも１時間の連続測定に耐えることが報告されている(P. Bigwarfe, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, 2266-2272)。ＰＦＰＯコーティングエミッタの先端は非電気伝導性であるので、放電の可能性が著しく低い。したがって、陽イオン測定と同様に陰イオン測定でも安定なエレクトロスプレーを提供する。陰イオン測定での本発明のエレクトロスプレーエミッタの有用性を以下にペプチド、セラミド、リン脂質、プロスタグランディン（ＰＧ）の測定結果をしめして例証する。
【００３２】
溶媒Ａ７容と溶媒Ｂ３容の混合液に０．１μＭのアンギオテンシンＩＩを溶解して、エッチングにより先細り加工してＰＦＰＯコーティングした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタにシリンジポンプをもちいて流速０．４μｌ／ｍｉｎで送液した。ＥＳＩは１．８ｋＶの電圧を印加して開始した。陰イオンと陽イオン測定それぞれでチューニングをして、別個にデータを採取した。アンギオテンシンＩＩには１個の酸性アミノ酸残基と２個の塩基性アミノ酸残基があり、計算上の等電点は７．８１である。したがって測定に用いた０．１％蟻酸溶液中（ｐＨ２．７３）ではほとんど陽イオンとして存在するので陰イオンを生成しにくい条件であるが、負電圧をアンギオテンシンＩＩ溶液に印加してＥＳＩで陰イオンを生成させるとｍ／ｚ １０４４．６の豊富な１価［Ｍ-Ｈ］-イオンが検出された。一方、陽イオン測定では、ｍ／ｚ ５２４の２価［Ｍ＋２Ｈ］2+イオンが主に検出された（図６（ａ）と図６（ｂ））。ベースピークの強度は陽イオン測定のほうが陰イオン測定より８．４倍大きいが、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比は両者で差は無かった。これは、陰イオン測定では化学的ノイズや夾雑物ピークが少ないことと一致している。これらの結果は、陰イオン測定が有用な燐酸化ペプチド解析を目指したプロテオミックスに、ＰＦＰＯコーティングエミッタを応用できることを示唆している。
【００３３】
次にペプチド分析よりは低極性の溶媒を用いた、脂質の一種であるセラミドの３種類の分子種混合物の分析例を示す。陽・陰イオン測定を交互に切替ながら連続して測定し、それぞれを積算して一度の測定で両イオン測定データを得る方法（alternate polarity switching）を用いた(M. Ito, et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 43674-43681; Tojo, H. Japan Patent Publication 2003-028849). N-Lignoceroyl-4-sphingenine (S), N-lignoceroyl-sphinganine (Sa), and N-stearoyl-4-hydroxy-sphinganine (P)（それぞれ０．１μＭ）を５ｍＭ蟻酸アンモニウムを含むヘキサン／２−プロパノール／エタノール；５：４：１（ｖ／ｖ／ｖ）に溶解して、シリンジポンプで内径５０μｍ／外径１５０μｍエッチングにより先細り加工したＰＦＰＯコーティングエミッタへ流速〜２μｌ／ｍｉｎで流して測定した。ＥＳＩの印加電圧は、１．４ｋＶである。陽陰イオン切替測定で両イオン測定とも良好なスプレーが得られた。ベースピークの強度は陽イオン測定のほうが陰イオン測定より２０倍大きいが、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比は陰イオン測定のほうが若干良い。ｍ／ｚ ６５２．５，６５０．３，５８４．４であるＳａ，Ｓ，Ｐの［Ｍ＋Ｈ］+イオンと、それらより２質量単位だけ小さい対応する［Ｍ-Ｈ］-イオンが検出された（図６（ｃ）と図６（ｄ））。陽イオン測定のｍ／ｚ ６３２．４のピークはＳから水分子が解離したものに由来し、４−スフィンゲニンを骨格とするセラミドに特徴的である。この測定の溶媒にはセラミドのイオン化効率を促進するため５ｍＭ蟻酸アンモニウムを含むので陰イオン測定では蟻酸付加体が主に検出されるが、イオントラップに入る前のイオン光学系で約２０Ｖ程度の電圧をかけると蟻酸付加体形成が抑制されて図６（ｄ）のようにＭＳ／ＭＳで構造情報が得やすいセラミドの［Ｍ-Ｈ］-が生成する。
【００３４】
プロテオミクスにおける質量分析では、化学的性質の比較的似かよったペプチドを対象にするが、メタボロミクスでは、疎水性度やプロトン親和性などの化学的性質が多岐にわたる非常に多くの中間代謝産物を分析する必要がある。このため、クロマトグラフィーで分離された個々の化合物それぞれに対して最適なＥＳＩ条件で分析が行われれば理想的である。しかし、現状ではそれは難しく、最初の試みとして一回のクロマトグラフィーで陰陽両イオン測定ができれば、構造解析の効率化をすることができる。そのような試みの例として、マウス気管支洗浄液から抽出した主要な肺サーファクタント・ジパルミトイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）の陽陰イオン交互切替測定による順相ＨＰＬＣ／ ＥＳＩ−ＭＳ分析結果を示す。肺胞ＤＰＰＣ濃度は肺胞蛋白症で増加する (G. Hook, et al., Toxicol. Pathol. 1991, 19, 482-513), 逆に重症ショック時の成人呼吸窮迫症候群(W. Seeger, et al., Lung 1990, 168, 891-902 (Suppl))や肺移植後の拒絶反応(J. Hohlfeld, et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 158, 706-712)などの重症肺疾患で減少する。したがって、その分析は、集中治療医学など臨床的に重要である。順相ＬｉｃｈｒｏＳｐｈｅｒｅ Ｓｉ−１００（１×１５０ｍｍ）カラムを図６（ｃ）、（ｄ）のセラミド分析と同様のＰＦＰＯコーティングエミッタに接続して分析した。右気管支洗浄液から既報(M. Ito, et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 43674-43681)にしたがって抽出した脂質の一部を、溶媒Ｃ（ヘキサン／２−プロパノール／エタノール（４：５：１ ｖ／ｖ））で平衡化したカラムに注入した。カラムは、溶媒Ｄ（溶媒Ｃ／１Ｍ蟻酸アンモニウム水溶液／蒸留水（１００：２．２４：９．７６ ｖ／ｖ／ｖ）の直線グラジエント（２ 分間に０から１００％、その後３０分間１００％で維持）で展開した。流速５０μｌ／ｍｉｎのカラム溶出液をティーで２方向に分岐して、エミッタには〜１．５μｌ／ｍｉｎを流してイオン化し、ＬＣＱにより陽陰イオン交互切替測定フルスキャンスペクトルとどちらかの極性のデータ依存的ＭＳ／ＭＳスペクトルを一回のクロマトグラフィーで得た。ＤＰＰＣは、４級アンモニウムイオンを持つのでＥＳＩにより豊富な［Ｍ＋Ｈ］+イオンを生じるが、［Ｍ-Ｈ］-イオンはほとんど生成しない。代わりに溶媒に含まれる蟻酸付加体がおもなＤＰＰＣの陰イオンとして生成される（図７（ｂ）、（ｃ））。ＤＰＰＣの［Ｍ＋Ｈ］+（ｍ／ｚ ７３４）あるいは［Ｍ＋ＨＣＯＯ］-（ｍ／ｚ ７７８）のイオンクロマトグラムは保持時間４６．８分に単一ピークとして溶出された（図７（ａ））。両イオンのフルスキャンスペクトルのＳ／Ｎ比はほぼ同様であった。マウス気管支洗浄液は、２つの飽和アシル基を持つＤＰＰＣが主成分であるが，次のような不飽和アシル基を持つ分子種も存在する：Ｃ１６：０／Ｃ１８：１（ｍ／ｚ ７６０），Ｃ１６：０／Ｃ１８：２（ｍ／ｚ ７５８），Ｃ１６：０／Ｃ２２：６（ｍ／ｚ ８０６），Ｃ１６：０：Ｃ１６：１（ｍ／ｚ ７３２），Ｃ１６：０／Ｃ２０：４（ｍ／ｚ ７８２）。ここで、括弧内のｍ／ｚ値は陽イオン測定の値を示し、この順にピーク強度が低くなる。Ｃｎ：ｍはジアシルホスファチジルコリンの一つのアシル基が炭素数ｎと二重結合数ｍを持つことを示す。陰イオン測定のｍ／ｚ値は、蟻酸付加体であるため陽イオン測定の値より４４大きかった。
【００３５】
（実施例４）
つぎに本発明のエレクトロスプレーチップを水系溶媒のキャピラリー逆相ＨＰＬＣに接続してイオントラップ型質量分析計で陰イオン測定した例を示す。従来の金属コーティングエミッタを用いると、放電による障害が起こりやすい実験条件である。生理活性脂質プロスタグランディンＤ2（ＰＧＤ2）とその生理活性代謝産物ＰＧＪ2、１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2をそれぞれ０．５ｐｍｏｌづつ含有した混合物を分析した。後二者は、ＰＧＤ2からそれぞれ水１分子と２分子が脱離して生じる。１５％アセトニトリルを含有する溶媒でカラムを平衡化した後、１．７ｋＶの電圧を印加直後からスプレーが始まり４５％アセトニトリルで終わる濃度勾配溶出中一貫して安定したイオン化が得られた（図８（ａ））。コーティングしたポリマーに由来するピークは見られなかった。ＰＧＤ2とＰＧＪ2の［Ｍ-Ｈ］-イオンのＭＳ2プロダクトイオンスペクトルでは、脱水により生じるｍ／ｚ ３３３と３１５イオンとＣ１４−Ｃ１５間の結合の開裂後脱水が起こり生じるｍ／ｚ ２３３イオンが主なピークである。これらの結果は、高速原子衝撃ＭＳで得られた結果と一致していた(Zirrolli, J. A., et.al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1990, 1, 325-335.)。１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2の［Ｍ-Ｈ］-イオンのＭＳ2プロダクトイオンスペクトルではＣＯ2が脱離して生じるｍ／ｚ ２７１イオンピーク以外に構造決定に有用なイオンは見られない(Hankin, J. A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 1997, 340, 317-330.)。しかし、このイオンをもう一度衝突解離させるＭＳ3スキャンを行うとｍ／ｚ ２７１イオンは、ｃｈａｒｇｅ ｒｅｍｏｔｅ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎを起しＣ−Ｃ結合で開裂した多数のピークが認められる。同様に、ＰＧＤ2の［Ｍ-Ｈ］-イオン（ｍ／ｚ ３５１）をから始めｍ／ｚ ３３３、ｍ／ｚ ２７１の順で３回衝突解離させるＭＳ4スキャンを行うと１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2のＭＳ3スキャンで得られるものと同様のスペクトルが得られ、ＰＧＤ2の解離の道筋が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によりエミッタは、スプレーを補助するガスを一切使用せずに毎分マイクロリットルからナノリットルの低流速域で、蒸留水を含め大きな表面張力を持つ溶液でも安定したエレクトロスプレーを可能にする。エミッタ先端が非電気伝導性であるため電気的な放電の危険性を回避でき、従来から放電を起こしやすい事が知られている陰イオン測定でも安定なエレクトロスプレーを可能にする。これらのエミッタの特長により、ハイスループット・プロテオミックスやメタボロミックスで繁用される逆相HPLCにおいて水を多く含有する初期平衡化溶媒使用時でも安定エレクトロスプレーが補償される。また、水溶液中の蛋白質の性質（たとえば、蛋白質間相互作用、蛋白質―リガンド相互作用、蛋白質のコンフォメーション変化、蛋白質のフォルディング-アンフォルディング平衡など）をＥＳＩ／ＭＳで調べる実験でも安定したスプレーを提供できる。さらに、本発明のエレクトロスプレーエミッタは、測定中に蛋白質が沈殿せずに安定して存在できる水溶液中に溶解した蛋白質を直接分解してＥＳＩ／超高分解能フーリエ変換イオンサイクロトロンＭＳで測定する実験にも安定したスプレーを提供できる。陰イオン測定でも安定したスプレーを提供できる本発明のエミッタは、メタボロミックス(S. Takagi, et al., J. Clin. Invest 2003, 112, 1372-1382) や薬物動態プロファイリングなどＥＳＩの応用分野を広げうる。
【００３７】
本発明は、また非特異的吸着などによるサンプルの損失を減少させるために有効な、エミッタと分析機器を接続する管状配管（キャピラリー、チュービング、接続ラインなど）を提供する。本発明による低表面エネルギー化合物によるチャンネルのコーティングは、分析機器の接続のためのチャンネルやミクロ流体装置のミクロチャンネルのコーティングにも応用できる。
【００３８】
本発明は、以上に記載した事項に基づいて実施可能であるが、参考のため以下に参考文献を列記する。
1.Ceck, N. B.; Enke, C. G. Practical implications of some recent studies in elec trospray ionization fundamentals. Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 362-387.
2.Gale, D. C.; Smith, R. D. Small volume and low flow-rate electrospray ioniza tion mass spectrometry of aqueous samples. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 10171021.
3.Emmett, M. R.; Caprioli, R. M.Micro-electrospray mass spectrometry: ultra-high -sensitivity analysis of peptides and proteins. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 199 4, 5, 605613.
4.Valaskovic, G. A.; Kelleher, N. L.; Little, D. P.; Aaserud, D. J. McLafferty, F. W. Attomole-sensitivity electrospray source for large-molecule mass spectro metry. Anal. Chem. 1995, 67, 38023805.
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6.Maziarz III, E. P.; Lorenz, S. A.; White, T. P.; Wood, T. D. Polyaniline: A co nductive polymer coating for durable nanospray emitters. J. Am. Soc. Mass Spec trom. 2000, 11, 659663.
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13.Tojo, H.; Japan Patent 2003028849, July, 2001
14.Hook, G. E. Alveolar proteinosis and phospholipidoses of the lungs. Toxicol. Pathol. 1991, 19, 482513.
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Takagi, S., Tojo, H., Tomita, S., Sano, S., Itami, S., Hara, M., Inoue, S., Horie, K., Kondoh, G., Hosokawa, K., Gonzalez, F. J., Takeda, J. Alteration of the 4-sphingenine scaffolds of ceramides in keratinocyte-specific Arnt-deficient mice affects skin barrier function. J. Clin. Invest. 2003, 112, 1372-1382.
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１（ａ）（ｂ）（ｃ）】（ａ）はエミッタの表面張力がエミッタ先端出口で形成される液滴の大きさに与える影響を示す図であって、γは表面張力、下添え文字Ｓ，Ｌ，ＳＬはそれぞれ溶融シリカと空気、溶液と空気、溶融シリカと溶液との界面をあらわす。（ｂ）は本発明のエミッタの一実施例における、エミッタ長軸方向の断面図、（ｃ）は（ｂ）のＣ−Ｃ線で切断したエミッタ本体の断面図を示す。
【図１（ｄ）（ｅ）（ｆ）】先端先細り加工した後、ＰＦＰＯでコーティングした溶融シリカキャピラリーエミッタの実施例を示す図であって、（ｄ）は先端外壁をフッ素酸処理（エッチング）した長さ５ｃｍ、内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタと、その出口先端部分の拡大図、（ｅ）は先端外壁をフッ素酸処理した長さ５ｃｍ、内径２０μｍ／外径３６０μｍのエミッタ、（ｆ）は New Objective, MT, USA.から購入したもので、プラーで引いて先細り加工処理した長さ５．２ｃｍ、内径５０μｍ／外径３６０μｍで、出口先端内径が１５μｍのエミッタを示す。（ｆ）の内壁のコーティングは出口先端の一部のみ可能であるが、長さ５ｃｍ、内径１５μｍの溶融シリカキャピラリー素管は内壁全面を容易にコーティングできる。
【図２】（ａ）は種々の濃度のＰＦＰＯでコーティングした溶融シリカキャピラリー外表面の接触角を示すグラフであって、縦軸はＰＦＰＯでコーティングしたものとしないものの接触角の比を示す。（ｂ）は無処理および０．００１％、０．０１％ＰＦＰＯでコーティングした溶融シリカキャピラリーに載せた１μｌの水滴の形状を示す写真である。
【図３】蒸留水をエレクトロスプレーする時のＰＦＰＯコーティングエミッタの性能を示すグラフであって、（ａ）はＰＦＰＯコーティングエミッタから蒸留水をスプレーしたときの安定性を示すグラフであり、（ｂ）は大きな表面張力を持つ蒸留水のエレクトロスプレーの迅速な開始。ｍ／ｚ＝１５０〜２０００のイオンから発生する全イオン電流（ＴＩＣ）と電圧印加からの時間の関係を示すグラフである。エミッタ先端に形成される種々の大きさの液滴からスプレーが始まった時の効率を比較するために、水を送液するシリンジポンプの運転開始から０．５分おきに順次２．５分まで遅れて電圧を印加してエレトロスプレーを開始が可能なことを示す。
【図４（ａ）（ｂ）（ｃ）】エッチング後ＰＦＰＯコーティングした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタを使用し、Ｓ−Ｓ結合を還元・アルキル化した牛血清アルブミン（０．１ｐｍｏｌ）のトリプシン消化物のＭＳ解析をした際の結果を示すグラフであって、（ａ）が陽イオン測定で得られた全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラム、（ｂ）が（ａ）の星印で示された保持時間１１．３分に溶出されるペプチド（ｍ／ｚ６５３．５）のフルスキャンＭＳスペクトル、（ｃ）がｍ／ｚ６５３．５、衝突エネルギー３５％の［Ｍ＋２Ｈ］2+イオンのフルスキャンタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）スペクトル、をそれぞれ示すグラフである。
【図４（ｄ）（ｅ）】エッチング後ＰＦＰＯコーティングした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタを使用し、Ｓ−Ｓ結合を還元・アルキル化した牛血清アルブミン（０．１ｐｍｏｌ）のトリプシン消化物のＭＳ解析をした際の結果を示すグラフであって、（ｄ）と（ｅ）とはインジェクタからカラム入口までを接続する配管に使用する溶融シリカの内壁をＰＦＰＯでコートしたときとしないときとのベースピーククロマトグラムの比較、をそれぞれ示すグラフである。
【図５】エッチング後ＰＦＰＯコートした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタを使用し、表示された添加物を含む蒸留水に溶解したシトクロムｃ（１μＭ）の陽イオンフルスキャンマススペクトル（２０回積算）を示すグラフである。
【図６】アンギオテンシンＩＩ（０．１μＭ）の陽イオン（ａ）と陰イオン（ｂ）マススペクトルおよびセラミドの陽イオン（ｃ）と陰イオン（ｄ）のマススペクトルを示すグラフであって、セラミドはN-Lignoceroyl-4-sphingenine, N-lignoceroyl-sphinganine, N-stearoyl-4-hydroxy-sphinganineの混合物（それぞれ０．１μＭ）であり、陽イオン・陰イオン交互に切り替えて測定した場合のグラフである。
【図７】マウス気管支洗浄液中ホスファチジルコリンの陽・陰イオン測定交互切替法を用いたＨＰＬＣ／ＥＳＩ-ＭＳによる分析結果を示すグラフであって、（ａ）がジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）の［Ｍ＋Ｈ］+（ｍ／ｚ ７３４．４）と［Ｍ＋ＨＣＯＯ］-（ｍ／ｚ ７７８．５）イオンのイオンクロマトグラム、（ｂ）及び（ｃ）が、保持時間４６．８分付近に溶出される気管支洗浄液中ホスファチジルコリンの陽イオン及び陰イオンのマススペクトルを示すグラフである。この条件の陰イオン測定では、脱プロトン型イオン［Ｍ-Ｈ］-より４６質量単位大きい蟻酸付加体が主に検出される。
【図８】水／アセトニトリルを溶媒としたキャピラリーＨＰＬＣ／イオントラップＭＳによるプロスタグランディンの陰イオンを測定した際の結果を示すグラフであって、（ａ）がベースピーククロマトグラム（ｍ／ｚ ２００〜４５０）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）が、それぞれＰＧＤ2、ＰＧＪ2、１５−ｄｅｏｘｙ−Δ12,14−ＰＧＪ2のフルスキャンＭＳスペクトルを示すグラフである。なお、エッチング後ＰＦＰＯコートした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタを使用し、ＥＳＩ電圧は１．７ｋＶとし、使用したＨＰＬＣ装置は図４と同一である。また、インジェクタとカラムをつなぐキャピラリーの内壁はＰＦＰＯでコーティングしている。さらに、あらかじめ溶媒Ａ１０μｌを吸引したミクロシリンジにＰＧＤ2，ＰＧＪ2，１５−ｄｅｏｘｙ−Δ12,14−ＰＧＪ2それぞれ０．５ｐｍｏｌを含む混合溶液１μｌをとり、Ｖａｌｃｏ製１０ポートバルブに接続したＣ−１８トラップカラム（０．３×５ｍｍ）に注入した。分離用カラムは、流速〜１．５μｌ／ｍｉｎとして、１５％溶媒Ｂで平衡化後、１分間は溶媒Ｂ１５〜３０％続いて２０分間溶媒Ｂ３０〜４５％の直線濃度勾配で展開した。
【図９（ａ）（ｂ）（ｃ）】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はそれぞれＰＧＤ2，ＰＧＪ2，１５−ｄｅｏｘｙ−Δ12,14−ＰＧＪ2のオンラインＭＳ2プロダクトイオンスペクトルを示すグラフである。なお、ＭＳ2のスキャンには、３２−４０％の衝突エネルギーを使用。
【図９（ｄ）】１５−ｄｅｏｘｙ−Δ12,14−ＰＧＪ2及びＰＧＤ2のオンラインＭＳ3とＭＳ4プロダクトイオンスペクトルとを示すグラフであって、ｍ／ｚ ３１５→２７１イオンのＭＳ3スキャンで開裂（上図）、ＰＧＤ2アニオンをｍ／ｚ ３５１→３１５→２１７のＭＳ4スキャンで順次開裂（下図）した際の結果を示すグラフである。なお、ＭＳ3、ＭＳ4のスキャンには、３２−４０％の衝突エネルギーを使用。
【符号の説明】
【００４０】
１ エミッタ本体（キャピラリー）
１ａ ポリイミドを剥し露出させた溶融シリカをPFPOでコーティングした部位
１ｂ エミッタ出口先端外壁の先細り部分
２ 入口孔
３ 出口孔
４ チャンネル
４ａ 壁
５ Taylerコーンを形成する前のエミッタ出口先端の液滴
６ 対極
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エレクトロスプレーエミッタ、その製造法、分析装置とエレクトロスプレーエミッタをつなぐ管状コネクタ、それらの使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、エレクトロスプレーイオン化（ESI）質量分析法（MS）は、生体分子、薬剤、合成高分子などの分析に広く用いられている（N. Ceck, et al., Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 362-387）。特にプロテオミクスやメタボロミクスの分野においては、ESI-MSの高感度化とキャピラリー高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）との良好な接続性が必要なことから、１μｌ／ｍｉｎ以下の低流速での安定したＥＳＩが要求される。このような流速でのスプレーには先端を細く引き先端径が非常に小さいエミッタが用いられている。エミッタは、通常、ガラス、溶融シリカ、ステンレス製でステンレス製以外のものは金属や伝導性ポリマーで被覆したものと被覆されていないものがある（D. Gale, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 1017-1021; M. Emmett, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994, 5, 605-613; G. Valaskovic, et al., Anal. Chem. 1995, 67, 3802-3805; M. Wilm, et al., Anal. Chem. 1996, 68, 1-8; E. Maziarz III, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000, 11, 659-663; and Y. Ishihama, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, 913-918）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
これら既存エミッタを使用した多くの経験から、先端ですぐに詰まってしまい使用不能になる、逆相HPLCにおいてグラジェント溶出の初期に水を多く含む溶出液のスプレーが不安定で自動分析の途中でスプレーが停止してしまう等の問題点が指摘されてきた。その結果、プロテオミクスやメタボロミクスに要求されるハイスループット分析を容易に達成できない状況が発生していた。
【０００４】
これらの問題の原因は相互に関連しており、おもにエミッタ出口先端の外側壁表面(γS)と水溶液(γL)の大きな表面エネルギーに起因する。エレクトロスプレーは、次のような過程で起こる。まずエミッタ内を流れる溶液と対極の間に高電圧を印加することにより分極が起こり、エミッタ出口先端から溶出する液滴表面に対極と反対符号の電荷が発生する。このため液滴は静電力により対極に引っ張られて先端の丸い円錐状を呈する。対極方向への静電力と液滴表面の同符号電荷間のクーロン反発力が溶液の表面張力より大きくなると液滴先端から分子のイオン化のもとになる表面荷電した微小液滴が多数射出する。この状態の液滴は先端が鋭く飛び出したコーン状を呈しTayler コーンと呼ばれる（後述する文献１の総説とそれに引用されている文献）。エミッタ素材の表面エネルギーが大きいと（ガラスではγS〜１００ｍＮ／ｍ）エミッタ先端外壁と接する液滴基部の直径が大きくなるので大きな液滴が形成される。エミッタ内の溶液との接電部位で分極により発生する電荷量は一定であるので、液滴が大きくなるとその表面電荷密度が下がる。このため、水溶液など大きな表面張力（γL＝７３ｍＮ／ｍ）を持つ溶液のスプレーが困難になる。小さい液滴を形成しやすくするために、従来の技術では、非常に小さい先端径のエミッタが必要であった。
【課題を解決するための手段及び効果】
【０００５】
本発明者は、前述の問題点を解析した結果、エミッタの少なくとも出口先端部分を低表面エネルギー化合物で被覆することによりこれらの問題を回避できることを見出した。
【０００６】
したがって、本発明は、エミッタ本体が入口孔、出口孔、それらをつなぐチャンネルからなり、少なくとも出口先端外壁の一部が低表面エネルギー化合物でコーティングされているエレクトロスプレーエミッタを提供する。この目的に使用できる低表面エネルギー化合物は、たとえばパーフルオロポリオキセタン（PFPO）などのフッ素化ポリマーがある。エミッタ本体は、溶融シリカ、ガラスセラミックス、アルミノシリケートガラス、ポリプロピレンあるいはステンレス鋼で作製できる。エミッタ本体は、出口孔のほうに先細りであることが望ましい。先端外側壁だけでなくエミッタ本体チャンネル内壁も低表面エネルギー化合物で被覆できる。
【０００７】
本発明は、エミッタ本体が入口孔、出口孔、それらをつなぐチャネル、出口先端の少なくとも外壁の一部の低表面エネルギー化合物でのコーティングを有するエレクトロスプレーエミッタの製造法にも関する。
【０００８】
本発明により、スプレーを補助するガスを一切使用せずに毎分マイクロリットルからナノリットルの低流速域で、エミッタは蒸留水を含め大きな表面張力を持つ溶液でも安定したエレクトロスプレーを可能にする。エミッタ先端が非電気伝導性であるため電気的な放電の危険性を回避でき、従来から放電を起しやすい事が知られている陰イオン測定でも安定なエレクトロスプレーを可能にする。さらに、本発明のエレクトロスプレーエミッタは、以下の特長により長寿命を実現できた。（１）スプレー効率が著しく改善されたため、従来エミッタのようにエミッタ先端内腔を細く引く必要がなくなった。（２）エミッタ本体チャンネルをコーティングすることにより非特異的吸着を低減した。その結果、本発明のエレクトロスプレーエミッタは、少なくとも５００時間以上という従来エミッタでは不可能な長寿命を達成した。
【０００９】
エミッタと分析機器（たとえば、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、超臨界クロマトグラフィー、ミクロ流体装置など）とを接続するチャンネル内での分析物質の損失を防ぐため、接続流路内壁を低表面エネルギー化合物でコーティングすることが可能である。
【００１０】
したがって、本発明は、さらにエレクトロスプレーエミッタと分析機器をつなぐ管状流路に関する。管状流路本体は、入口孔、出口孔、それらをつなぐチャンネル、チャンネル内壁の少なくとも一部に低表面エネルギー化合物コーティングを有する。この用途に適した低表面エネルギー化合物は前述と同様である。本発明の管状流路を用いることにより、疎水性化合物の回収率が改善される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
最適な実施形態を示すことにより本発明を詳細に説明する。ただし、これらの実施形態はあくまで本発明の実施例であり、本発明の内容をこれら実施例に含まれるものに限定するものではない。
【００１２】
＜エレクトロスプレーエミッタ＞
図１（ｂ）は本発明のエレクトロスプレーエミッタの望ましい一実施例を示す。エレクトロスプレーエミッタは入口孔２、出口孔３と入口孔２と出口孔３とをつなぐチャンネル４（導管）からなる。本発明において、エミッタ出口先端外壁部分の低表面エネルギー化合物でのコーティングは効率よいエレクトロスプレーに必須である。したがって、図１（ｂ）のエミッタの出口外壁１ｂ、さらに望ましくは１ａにコーティングされている。
【００１３】
本発明において、エミッタ先端外壁に加えて他の部位を低表面エネルギー化合物でコーティングしてもよい。エミッタ出口先端でのコーティングに加えて、チャンネル４の内壁４ａの少なくとも出口先端内壁あるいは内壁前面を低表面エネルギー化合物でコーティングできる。望ましい実施例においては、チャンネル４の内壁４ａ全面がコーティングされている。たとえば、図１（ｄ）と図１（ｅ）のエミッタにおいて、出口先端外壁１ｂに加えチャンネル４の内壁４ａ全面がコーティングされている。図１（ｆ）のエミッタでは、内壁のコーティングは出口先端の一部に限られている。ＰＦＰＯコーティングは無色透明で見ることができない。
【００１４】
ここで用いる用語「低表面エネルギー」は、たとえば、２０ｍＮ／ｍ以下、好ましくは５〜２０ｍＮ／ｍ、さらに好ましくは６〜１２ｍＮ／ｍの範囲の固体表面の単位表面積あたりのエネルギー（液体表面の表面張力に対応する）と定義する。本特許で用いる低表面エネルギー物質は、それが適当な低表面エネルギーを有し、かつエレクトロスプレーの効率を損なわずにエミッタ本体をコーティング可能な物質であるならば、特定の物質に限定されるものではない。このような低表面エネルギー物質として適当なものは、たとえば、フルオロポリマーやフッ素化化合物がある。好ましいフルオロポリマーやフッ素化化合物として、パーフルオロポリオキセタン、パーフルオロウレタン、フルオロポリマーエラストーマ、ポリテトラフルオロエチレン、フルオロアルキルモノシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルジシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルポリシラン、またはエポキシ、水酸基、アクリレート、イソシアネートなどの官能基を有するパーフルオロオクタールやパーフルオロポリエーテルなどがある。これらのうちもっとも好ましい物質は、パーフルオロポリオキセタン（ＰＦＰＯ）である。ＰＦＰＯは、通常室温で１２ｍＮ／ｍの臨界表面張力を有する。
【００１５】
エミッタ本体は溶融シリカキャピラリーで作製できる。しかし、エレクトロスプレーエミッタとして利用しうる材質であるならば、いかなる制限もなく使用できる。たとえば、ガラス、ガラスセラミックス、アルミノシリケートガラス、ポリプロピレン、あるいはステンレススチールなどが挙げられる。先端部分のポリイミド被覆を剥いで先細り加工していないキャピラリーでもＰＦＰＯコーティングすることにより、蒸留水をエレクトロスプレーすることが可能になる。
【００１６】
より安定したスプレーとＭＳの測定感度を上げるためには、先端先細り加工することが望ましい(たとえば、以下の文献を参照 D. Gale, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 1017-1021; M. Emmett, et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1994, 5, 605-613; G. Valaskovic, et al., Anal. Chem. 1995, 67, 3802-3805; M. Wilm, et al, Anal. Chem. 1996, 68, 1-8)。したがって、図１（ｂ）に示すように、エミッタ本体１の外壁は出口孔３に向かって先細りになっている。先細りの形状は、徐々に先端に向かって細くなるのではなく、図１（ｂ）の先端１ｂのように先端から適当な長さ（２〜５ｍｍが望ましい）だけ均一に細い外壁の先端形が望ましく、スプレーの安定性において優れている。従来からキャピラリーＨＰＬＣに用いられている〜０．１μｌ／ｍｉｎ以上の流速では、内腔をそのままで外壁のみ先細りにするこのエミッタの形態は目詰まりを避けるために実用的である。ナノスプレーのようにさらに低流速でのＥＳＩでは、エミッタ本体の外側及び内側が、出口孔に向かって次第に細くなっていることが望ましい。この場合は、先細り加工のないエミッタではあるものに比べスプレー効率が悪い。
【００１７】
市販されているレーザーキャピラリープラーを用いれば、外壁と内腔ともに先細りのキャピラリーを作製できる(M. Wilm, et al., Anal. Chem. 1996, 68, 1-8)。このような先端先細りキャピラリーは、たとえばNew Objective (Cambridge, MT)から購入可能である。一方、エミッタの先細り加工は、フッ素酸(HF)処理で行うことができる(D. Gale, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993, 7, 1017-1021)。一般に市販の溶融シリカキャピラリーは強度を高めるためポリイミド被覆されているので、適当な長さ（本実施例では３〜５ｃｍ）に切断後、一端のポリイミドを適当な長さ例えば７ｍｍを焼いて剥す。この端をＨＦ溶液（以下の例では４６％）に浸し緩徐に攪拌しながら適当な時間エッチングする。必要時間は、キャピラリーの内径、外径に依存するが、外径１５０μｍ／内径２０μｍのキャピラリーでは、室温で約２０分が適当である。エッチングのあいだにポリイミド被覆と露出したシリカとの境界にＨＦ溶液滴ができてその部分のエッチングだけが速く進行するので、液滴が発生すると可及的に空気や窒素ガスなどで除去する必要がある。キャピラリーをプラーで引く方法と比べるとＨＦによるエッチングでは、内腔をそのままにして外壁を先細り加工できる。これは、目詰まり防止に重要であるが、特にハイスループット分析では目詰まり防止によるエミッタの長寿命化は必須である。キャピラリーにその内腔の大きさに適した流速で液体（水が好ましく、内径２０μｍのキャピラリーでは２００ｎｌ／ｍｉｎが適当である）を流し内腔壁とＨＦの接触を妨げると内壁のエッチングを回避できる。空気や不活性ガス（窒素ガスが望ましい）もこの用途に利用可能である。エッチング後、キャピラリー内腔を水で洗浄して窒素ガスを流して乾燥させ４０°Ｃで静置してさらに乾燥させる。
【００１８】
エミッタの長さ、内径、外径などの規格に、特に制限はない。エミッタを使用する用途によって熟練者により種々の規格のエミッタを作製できる。典型的なエミッタの規格は、長さ３０〜１００ｍｍ位で、外径と内径はそれぞれ１５０〜３７５μｍと１０〜５０μｍ位である。
【００１９】
＜エレクトロスプレーエミッタの作成法＞
本発明は、上述したエミッタの製造法を提供する。この方法により、入口孔、出口孔とそれらをつなぐチャンネルからなり、少なくとも出口先端外壁部分が低表面エネルギー物質でコーティングされたエレクトロスプレーエミッタを作製することができる。たとえば一実施例においては、適当な溶媒に溶解した低表面エネルギー化合物にエミッタの一部分を浸し、その後溶媒を乾燥させて、コーティング剤をエミッタ壁に付着させる。
【００２０】
さらに具体的に述べれば、本発明のエレクトロスプレーエミッタは次の方法で作製することができる。前記の方法でエッチングにより先端外壁を先細り加工したキャピラリー（エミッタ）あるいはNew Objectives社から購入したプラーにより引いて先細り加工したキャピラリー（エミッタ）の加工した部分をパーフルオロヘキサンに溶解した適当な濃度（たとえば０．００１〜０．１％ ｗ／ｖ）のＰＦＰＯに、〜１分から１０分浸した。いずれの規格のキャピラリーもコーティング可能であるが、キャピラリーＨＰＬＣとの接続の用途にはスプレー効率と目詰まりを避けるという観点から１０〜５０μｍの内径のものが望ましい。エッチングにより先端外壁を先細り加工した長さ５ｃｍ、内径１０〜５０μｍのキャピラリーでは、単にＰＦＰＯ溶液に浸すだけで内壁前面と先端の浸した外壁部分がコーティングされた。一方、プラーにより引いて先細り加工したキャピラリーでは本体部分が同じ内径のキャピラリーでも内壁のコーティングは先端の一部に限られた。もし必要ならば、ポンプあるいは手動でシリンジからＰＦＰＯ溶液をキャピラリーに通すことにより内壁全面をコーティングできる。たとえば０．１％など比較的高濃度のＰＦＰＯに浸した場合は、先端部分がコーティング剤で閉塞されないように空気や窒素ガスなどの不活性ガスをチャネルにながす必要があるが、さらに低濃度のＰＦＰＯ溶液を使用したときは必ずしもこの処理が必要とは限らない。ＰＦＰＯ処理したキャピラリーは６０℃で６０分間以上静置してコーティングを安定化させた後にＥＳＩ／ＭＳに使用可能である。以下の実施例においては、一晩静置したエミッタを用いた。０．１％ＰＦＰＯでコーティングした場合のコーティングの厚さは約１０ｎｍである。本発明のエレクトロスプレーエミッタの実施例を図１（ｂ）〜（ｆ）に示す。ＰＦＰＯコーティングは無色透明であるので、ポリイミド被覆をはがしてコーティングした部分の内腔を流れる気泡などを目視できる。
【００２１】
図２（ａ）と図２（ｂ）とは、種々の濃度のＰＦＰＯコーティングしたエミッタ外壁表面の水に対する接触角の変化を示す。ＰＦＰＯコーティングしたときとしていないときの接触角の比は、ＰＦＰＯ濃度の上昇ともに増加し、０．０１％付近で頭打ちして約２．０８の最大値（接触角１２２°に対応）に達する。乾燥過程でのコーティング剤による先端閉塞を避けるためコーティングに用いるＰＦＰＯ濃度は、０．１％以下が望ましい。エミッタの内径と外径に依存するが、エレクトロスプレーの効率が最適になるようなＰＦＰＯ濃度を用いなければならない。
【００２２】
＜エミッタと分析装置を接続する管状配管（管状コネクタ）＞
本発明はまた非特異的吸着などによるサンプルの損失を防ぐのために有効な、エミッタと分析機器を接続する管状配管（キャピラリー、チュービング、接続ラインなど）を提供する。そのような管状配管は、入口孔、出口孔とそれらをつなぐチャンネルからなり、チャンネル内壁の少なくとも一部が低表面エネルギー物質でコーティングされている。内壁全体がコーティングされているほうが望ましい。良好な低表面エネルギーコーティング剤は、たとえばフルオロポリマーやフッ素化化合物である。望ましいフルオロポリマーやフッ素化化合物は上述した。もっとも好ましいコーティング剤は、パーフルオロポリオキセタンである。管状配管の材質は、従来からの溶融シリカが望ましい。
【００２３】
管状配管内壁のコーティング法は、前述した方法に準拠する。すなわち、管状配管のチャンネルを通して低表面エネルギー化合物溶液を送液する。熟練者であればこの分野の専門知識を用い、いかなるサイズの管状配管でもコーティング処理することができる。このような管状配管使用することによりエミッタと液体クロマトグラフなどの分析装置の間での疎水性サンプルの損失を防ぐことができる。
【００２４】
以下に、本発明の主旨を実施例を用いてさらに詳細に説明するが、本発明の用途を実施例の範囲に制限するものではない。
【実施例】
【００２５】
（実施例１：ＰＦＰＯでキャピラリーのチャネル内壁をコーティングする方法）
ポリイミド被覆溶融シリカキャピラリーは、キャピラリーＨＰＬＣの接続のための標準的な配管系として繁用されている。その内壁は、イオン性や疎水性化合物を非特異的に吸着する性質をもつことが以前から知られているので、配管を通過している間にこれらの分析対象化合物が損失する可能性がある。溶融シリカキャピラリーチャンネル内壁をＰＦＰＯコーティングすることにより、このようなサンプルの損失を減少させうる。適当な濃度（０．１〜０．００１％、さらに望ましくは０．００５〜０．０２％）のＰＦＰＯ／パーフルオロヘキサン溶液をポンプあるいは手動でミクロシリンジからチャネル内に流し、窒素ガスでフラッシュした。その後に６０℃、６０分間静置して、さらに４０℃で一晩乾燥させた。
【００２６】
（実施例２：蒸留水あるいは水含量が高い溶媒を用いた時のエミッタの性能）
ハイスループット・プロテオミクスやメタボロミクスで繁用されるグラジェント溶出逆相ＨＰＬＣにおいて、グラジェント初期には水を多く含有する溶媒（たとえば、２％アセトニトリル、０．１％蟻酸を含む水溶液）で平衡化されたカラムから試料が溶出される。このような条件でも高電圧印加後すぐにイオン化効率の良い安定なコーンジェットモード(Cloupeau, M.; Prunet-Foch, B., J. Electrostat. 1989, 22, 135-159)でのエレクトロスプレーが始まらなければならない。本発明のエレクトロスプレーエミッタがこのような条件を満たす性能を有するかどうか調べた。エッチングによる先端先細り加工して内腔に先細りがないＰＦＰＯコーティングエミッタを用いて、目視によるスプレー状態の観察とイオントラップ質量分析計ＬＣＱ(ThermoFinnigan, CA)で質量電荷比（ｍ／ｚ）が１５０〜２０００の全イオン電流（ＴＩＣ）の安定性を記録することにより、蒸留水のスプレー効率を調べた。本実施例と以下の実施例においては、ＨＰＬＣとの接続性のよいＬＣＱを用いたが、他の質量分析計を用いることもできる。ただし、エミッタの規格や、ＭＳの測定パラメータ、など細かい実験条件を使用するＭＳの特性により最適化する必要がある。エッチングによる先端先細り加工した内径２０μｍ／外径１５０μｍのＰＦＰＯコーティングエミッタにシリンジポンプから、内径０．１〜０．２ｍｍのカラムを用いるキャピラリーＨＰＬＣで通常使用される〜０．８μｌ／ｍｉｎの流速で、蒸留水を送液し実験した。印加電圧は１．８ｋＶで２０分間ＴＩＣをＬＣＱで記録した。印加電圧は、エミッタのサイズやスプレーする溶液の表面張力によっても異なるが、１．２〜２．０ｋＶが典型的な最適電圧である。エミッタはｘｙｚ方向に位置を微調整できるｘｙｚステージ（ＡＭＲ，Ｔｏｋｙｏ）に装着して、エミッタ先端と対極の距離はイオン化の状態をみて３ｍｍを目安に適宜増減した。このようにして、図３（ａ）に示すようにＰＦＰＯコーティングされたエミッタは蒸留水を効率良く安定にスプレーすることが示された。
【００２７】
質量分析計の汚染を防ぐため、分析ごとのカラム洗浄時やサンプル注入後の素通り画分など不要な溶出液を導入しないように、これらの操作時にＥＳＩ印加電圧を切りスプレーを停止しておくことが肝要である。電圧を切っている間にエミッタ出口先端にはいろいろな大きさの液滴ができて、従来型のエミッタでは、次の分析のために電圧を印加してもスプレーが始まらないことがしばしばある。このような状況を模倣するため、シリンジポンプをスタートさせ蒸留水を送り始め、種々の大きさの液滴が先端にできるのを待って一定時間おくれて（０分，０．５分，１分，１．５分，２分，２．５分）電圧を印加する実験を行った。エッチングによる先端先細り加工した内径２０μｍ／外径１５０μｍのＰＦＰＯコーティングエミッタを用いた。待ち時間にできる液滴の大きさにかかわらず迅速に安定したスプレーが開始されることが明らかになった（図３（ｃ））。これらの結果、本発明のＰＦＰＯコーティングエミッタは、高含水量溶媒をよく用いるハイスループットＨＰＬＣ／ＭＳやフローインジェクション分析に対応できることが証明された。
【００２８】
図４（ａ）は、０．１ｐｍｏｌの還元アルキル化牛血清アルブミンのトリプシン消化物を逆相Ｍａｇｉｃ Ｃ１８ カラム（０．２×５０ｍｍ，Michrom BioResources,Inc.）で分離してオンラインでＬＣＱに導入して得た陽イオンベースピーククロマトグラム（各溶出時間に対して溶出される最強度のシグナルをプロットしたイオンクロマトグラム）を示す。カラムは、溶媒Ａ（２％アセトニトリルと０．１％蟻酸を含む水溶液）で平衡化し、溶媒Ｂ（９０％アセトニトリル、１０％蒸留水、０．１％蟻酸）２〜６０％、２０分間の直線濃度勾配で展開した。流速は１μｌ／ｍｉｎである。Ｍａｇｉｃ２００２ポンプ（Michrom BioResources,Inc.）の流速は５０μｌ／ｍｉｎに設定して、キャピラリーカラムへの流速はＭａｇｉｃ可変スプリッタ（Michrom BioResources,Inc.）で制御した。エッチングによる先端先細り加工した内径２０μｍ／外径１５０μｍのＰＦＰＯコーティングエミッタをカラム出口のステンレスフィティングに直接接続して、流路内での拡散によるピーク幅の広がりを防ぎ分離能の向上に努めた。１．７ｋＶのＥＳＩ電圧をカラム出口ステンレスフィッティングを介して印加した。その直後から水が主体の溶媒Ａから安定したスプレーが始まり、グラジエントの最後まで続いた（図４（ａ））。図４（ｂ）は、図４（ａ）に星印で示した１１．３分にベースピークとして溶出されるｍ／ｚ ６５３イオンを含むフルスキャンスペクトル、図４（ｃ）はそのタンデムマススペクトル（ＭＳ／ＭＳ）スペクトルを示す。記録した全溶出時間にわたりＰＦＰＯ由来のシグナルは検出されなかった。検出感度は、従来型のプラーにより引き金属コートしたエミッタと同程度であるが、遅れて溶出される疎水性ペプチドの強度が強い傾向が見られた。ＰＦＰＯコーティングエミッタは頑丈で、臨床組織検体などの組織から粗抽出して二次元電気泳動やＨＰＬＣで分離した蛋白質のトリプシン消化物の逆相ＨＰＬＣ／ＭＳ分析において少なくとも５００時間の耐用性が認められた。
【００２９】
図４（ａ）と同様の分析をインジェクタとカラムを接続するキャピラリー内壁がＰＦＰＯコーティングされた時（図４（ｄ））とされない時（図４（ｅ））で比較した。ＰＦＰＯコーティングキャピラリーを使用したときのほうが、遅れて溶出される疎水性ペプチドの強度が強い傾向が見られた。
【００３０】
次に、本発明のエレクトロスプレーエミッタを用いて、蛋白質のＥＳＩマススペクトルに対する有機溶媒の影響について調べた。牛心臓シトクロムｃ（１μＭ）溶液はＥＳＩにより一群の多価陽イオンとしてイオン化される。蛋白質に対する変性作用が次のように強くなるほど（１０ｍＭ蟻酸アンモニウム水溶液（ｐＨ４．２）＜０．１％蟻酸水溶液（ｐＨ２．７３）＜０．１％蟻酸を含む４６％アセトニトリル／水）、最大強度を示すピークのｍ／ｚ値が１７６６．３，１３７４．２，８８３．８（これらはそれぞれ＋７，＋９，＋１４価イオンに対応する）と小さい値へシフトする。すでに報告されているように、この様な変化は蛋白質の構造変化によりアミノ酸のイオン化可能な側鎖が溶媒に露出する程度を反映している(S. Chowdhury, et al., J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9012-9013.)。すなわち、変性作用が強く構造変化が大きいほどイオン化可能な側鎖が溶媒に露出する確率が大きくなり、高次の多価イオンを生成しやすい。水溶液から安定したスプレーが可能な本発明のエレクトロスプレーエミッタを用いることにより、水溶液中に存在する自然なコンフォメーションの蛋白質を直接気相にイオン化できるので、溶液中の蛋白質のコンフォメーションや変性―フォールディング平衡の研究にＥＳＩ／ＭＳを応用しやすくなる。さらに、最近、蛋白質を酵素消化せずに直接断片化して超高分解能フーリエ変換イオンサイクロトロン質量分析計で測定して構造決定をする方法が注目されている。従来型エミッタでは、安定なエレクトロスプレーを補助するために蛋白質水溶液に有機溶媒を添加することが多かった。多くの蛋白質は有機溶媒の変性作用により沈殿するので、水溶液を安定してスプレーできる本発明のエレクトロスプレーエミッタは、蛋白質をそのまま用いるＥＳＩ／ＭＳにも有効に利用できる。
【００３１】
（実施例３：陰イオン測定における本発明のエレクトロスプレーエミッタの特性）
陽イオン測定と比べると、陰イオン測定ではコロナ放電やアーク放電が起こりやすいことが知られている(Ceck, N. B.; Enke, C. G., Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 362-387)。特に、従来型の先端を金属コーティングしたエミッタでは、その危険性が高い。放電により陰イオンのスプレーが不安定になると、長時間安定なスプレーが要求されるＨＰＬＣや他の分離手段との接続が困難になる。ごく最近になって、伝導性ポリマーであるポリアニリンで先端をコーティングしたナノエレクトロスプレーエミッタは、放電しにくく陰イオン測定で少なくとも１時間の連続測定に耐えることが報告されている(P. Bigwarfe, et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2002, 16, 2266-2272)。ＰＦＰＯコーティングエミッタの先端は非電気伝導性であるので、放電の可能性が著しく低い。したがって、陽イオン測定と同様に陰イオン測定でも安定なエレクトロスプレーを提供する。陰イオン測定での本発明のエレクトロスプレーエミッタの有用性を以下にペプチド、セラミド、リン脂質、プロスタグランディン（ＰＧ）の測定結果をしめして例証する。
【００３２】
溶媒Ａ７容と溶媒Ｂ３容の混合液に０．１μＭのアンギオテンシンＩＩを溶解して、エッチングにより先細り加工してＰＦＰＯコーティングした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタにシリンジポンプをもちいて流速０．４μｌ／ｍｉｎで送液した。ＥＳＩは１．８ｋＶの電圧を印加して開始した。陰イオンと陽イオン測定それぞれでチューニングをして、別個にデータを採取した。アンギオテンシンＩＩには１個の酸性アミノ酸残基と２個の塩基性アミノ酸残基があり、計算上の等電点は７．８１である。したがって測定に用いた０．１％蟻酸溶液中（ｐＨ２．７３）ではほとんど陽イオンとして存在するので陰イオンを生成しにくい条件であるが、負電圧をアンギオテンシンＩＩ溶液に印加してＥＳＩで陰イオンを生成させるとｍ／ｚ １０４４．６の豊富な１価［Ｍ-Ｈ］-イオンが検出された。一方、陽イオン測定では、ｍ／ｚ ５２４の２価［Ｍ＋２Ｈ］2+イオンが主に検出された（図６（ａ）と図６（ｂ））。ベースピークの強度は陽イオン測定のほうが陰イオン測定より８．４倍大きいが、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比は両者で差は無かった。これは、陰イオン測定では化学的ノイズや夾雑物ピークが少ないことと一致している。これらの結果は、陰イオン測定が有用な燐酸化ペプチド解析を目指したプロテオミックスに、ＰＦＰＯコーティングエミッタを応用できることを示唆している。
【００３３】
次にペプチド分析よりは低極性の溶媒を用いた、脂質の一種であるセラミドの３種類の分子種混合物の分析例を示す。陽・陰イオン測定を交互に切替ながら連続して測定し、それぞれを積算して一度の測定で両イオン測定データを得る方法（alternate polarity switching）を用いた(M. Ito, et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 43674-43681; Tojo, H. Japan Patent Publication 2003-028849). N-Lignoceroyl-4-sphingenine (S), N-lignoceroyl-sphinganine (Sa), and N-stearoyl-4-hydroxy-sphinganine (P)（それぞれ０．１μＭ）を５ｍＭ蟻酸アンモニウムを含むヘキサン／２−プロパノール／エタノール；５：４：１（ｖ／ｖ／ｖ）に溶解して、シリンジポンプで内径５０μｍ／外径１５０μｍエッチングにより先細り加工したＰＦＰＯコーティングエミッタへ流速〜２μｌ／ｍｉｎで流して測定した。ＥＳＩの印加電圧は、１．４ｋＶである。陽陰イオン切替測定で両イオン測定とも良好なスプレーが得られた。ベースピークの強度は陽イオン測定のほうが陰イオン測定より２０倍大きいが、シグナル／ノイズ（Ｓ／Ｎ）比は陰イオン測定のほうが若干良い。ｍ／ｚ ６５２．５，６５０．３，５８４．４であるＳａ，Ｓ，Ｐの［Ｍ＋Ｈ］+イオンと、それらより２質量単位だけ小さい対応する［Ｍ-Ｈ］-イオンが検出された（図６（ｃ）と図６（ｄ））。陽イオン測定のｍ／ｚ ６３２．４のピークはＳから水分子が解離したものに由来し、４−スフィンゲニンを骨格とするセラミドに特徴的である。この測定の溶媒にはセラミドのイオン化効率を促進するため５ｍＭ蟻酸アンモニウムを含むので陰イオン測定では蟻酸付加体が主に検出されるが、イオントラップに入る前のイオン光学系で約２０Ｖ程度の電圧をかけると蟻酸付加体形成が抑制されて図６（ｄ）のようにＭＳ／ＭＳで構造情報が得やすいセラミドの［Ｍ-Ｈ］-が生成する。
【００３４】
プロテオミクスにおける質量分析では、化学的性質の比較的似かよったペプチドを対象にするが、メタボロミクスでは、疎水性度やプロトン親和性などの化学的性質が多岐にわたる非常に多くの中間代謝産物を分析する必要がある。このため、クロマトグラフィーで分離された個々の化合物それぞれに対して最適なＥＳＩ条件で分析が行われれば理想的である。しかし、現状ではそれは難しく、最初の試みとして一回のクロマトグラフィーで陰陽両イオン測定ができれば、構造解析の効率化をすることができる。そのような試みの例として、マウス気管支洗浄液から抽出した主要な肺サーファクタント・ジパルミトイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）の陽陰イオン交互切替測定による順相ＨＰＬＣ／ ＥＳＩ−ＭＳ分析結果を示す。肺胞ＤＰＰＣ濃度は肺胞蛋白症で増加する (G. Hook, et al., Toxicol. Pathol. 1991, 19, 482-513), 逆に重症ショック時の成人呼吸窮迫症候群(W. Seeger, et al., Lung 1990, 168, 891-902 (Suppl))や肺移植後の拒絶反応(J. Hohlfeld, et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998, 158, 706-712)などの重症肺疾患で減少する。したがって、その分析は、集中治療医学など臨床的に重要である。順相ＬｉｃｈｒｏＳｐｈｅｒｅ Ｓｉ−１００（１×１５０ｍｍ）カラムを図６（ｃ）、（ｄ）のセラミド分析と同様のＰＦＰＯコーティングエミッタに接続して分析した。右気管支洗浄液から既報(M. Ito, et al., J. Biol. Chem. 2002, 277, 43674-43681)にしたがって抽出した脂質の一部を、溶媒Ｃ（ヘキサン／２−プロパノール／エタノール（４：５：１ ｖ／ｖ））で平衡化したカラムに注入した。カラムは、溶媒Ｄ（溶媒Ｃ／１Ｍ蟻酸アンモニウム水溶液／蒸留水（１００：２．２４：９．７６ ｖ／ｖ／ｖ）の直線グラジエント（２ 分間に０から１００％、その後３０分間１００％で維持）で展開した。流速５０μｌ／ｍｉｎのカラム溶出液をティーで２方向に分岐して、エミッタには〜１．５μｌ／ｍｉｎを流してイオン化し、ＬＣＱにより陽陰イオン交互切替測定フルスキャンスペクトルとどちらかの極性のデータ依存的ＭＳ／ＭＳスペクトルを一回のクロマトグラフィーで得た。ＤＰＰＣは、４級アンモニウムイオンを持つのでＥＳＩにより豊富な［Ｍ＋Ｈ］+イオンを生じるが、［Ｍ-Ｈ］-イオンはほとんど生成しない。代わりに溶媒に含まれる蟻酸付加体がおもなＤＰＰＣの陰イオンとして生成される（図７（ｂ）、（ｃ））。ＤＰＰＣの［Ｍ＋Ｈ］+（ｍ／ｚ ７３４）あるいは［Ｍ＋ＨＣＯＯ］-（ｍ／ｚ ７７８）のイオンクロマトグラムは保持時間４６．８分に単一ピークとして溶出された（図７（ａ））。両イオンのフルスキャンスペクトルのＳ／Ｎ比はほぼ同様であった。マウス気管支洗浄液は、２つの飽和アシル基を持つＤＰＰＣが主成分であるが，次のような不飽和アシル基を持つ分子種も存在する：Ｃ１６：０／Ｃ１８：１（ｍ／ｚ ７６０），Ｃ１６：０／Ｃ１８：２（ｍ／ｚ ７５８），Ｃ１６：０／Ｃ２２：６（ｍ／ｚ ８０６），Ｃ１６：０：Ｃ１６：１（ｍ／ｚ ７３２），Ｃ１６：０／Ｃ２０：４（ｍ／ｚ ７８２）。ここで、括弧内のｍ／ｚ値は陽イオン測定の値を示し、この順にピーク強度が低くなる。Ｃｎ：ｍはジアシルホスファチジルコリンの一つのアシル基が炭素数ｎと二重結合数ｍを持つことを示す。陰イオン測定のｍ／ｚ値は、蟻酸付加体であるため陽イオン測定の値より４４大きかった。
【００３５】
（実施例４）
つぎに本発明のエレクトロスプレーチップを水系溶媒のキャピラリー逆相ＨＰＬＣに接続してイオントラップ型質量分析計で陰イオン測定した例を示す。従来の金属コーティングエミッタを用いると、放電による障害が起こりやすい実験条件である。生理活性脂質プロスタグランディンＤ2（ＰＧＤ2）とその生理活性代謝産物ＰＧＪ2、１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2をそれぞれ０．５ｐｍｏｌづつ含有した混合物を分析した。後二者は、ＰＧＤ2からそれぞれ水１分子と２分子が脱離して生じる。１５％アセトニトリルを含有する溶媒でカラムを平衡化した後、１．７ｋＶの電圧を印加直後からスプレーが始まり４５％アセトニトリルで終わる濃度勾配溶出中一貫して安定したイオン化が得られた（図８（ａ））。コーティングしたポリマーに由来するピークは見られなかった。ＰＧＤ2とＰＧＪ2の［Ｍ-Ｈ］-イオンのＭＳ2プロダクトイオンスペクトルでは、脱水により生じるｍ／ｚ ３３３と３１５イオンとＣ１４−Ｃ１５間の結合の開裂後脱水が起こり生じるｍ／ｚ ２３３イオンが主なピークである。これらの結果は、高速原子衝撃ＭＳで得られた結果と一致していた(Zirrolli, J. A., et.al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 1990, 1, 325-335.)。１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2の［Ｍ-Ｈ］-イオンのＭＳ2プロダクトイオンスペクトルではＣＯ2が脱離して生じるｍ／ｚ ２７１イオンピーク以外に構造決定に有用なイオンは見られない(Hankin, J. A., et al., Arch. Biochem. Biophys. 1997, 340, 317-330.)。しかし、このイオンをもう一度衝突解離させるＭＳ3スキャンを行うとｍ／ｚ ２７１イオンは、ｃｈａｒｇｅ ｒｅｍｏｔｅ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎを起しＣ−Ｃ結合で開裂した多数のピークが認められる。同様に、ＰＧＤ2の［Ｍ-Ｈ］-イオン（ｍ／ｚ ３５１）をから始めｍ／ｚ ３３３、ｍ／ｚ ２７１の順で３回衝突解離させるＭＳ4スキャンを行うと１５−デオキシ−Δ12,14−ＰＧＪ2のＭＳ3スキャンで得られるものと同様のスペクトルが得られ、ＰＧＤ2の解離の道筋が明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によりエミッタは、スプレーを補助するガスを一切使用せずに毎分マイクロリットルからナノリットルの低流速域で、蒸留水を含め大きな表面張力を持つ溶液でも安定したエレクトロスプレーを可能にする。エミッタ先端が非電気伝導性であるため電気的な放電の危険性を回避でき、従来から放電を起こしやすい事が知られている陰イオン測定でも安定なエレクトロスプレーを可能にする。これらのエミッタの特長により、ハイスループット・プロテオミックスやメタボロミックスで繁用される逆相HPLCにおいて水を多く含有する初期平衡化溶媒使用時でも安定エレクトロスプレーが補償される。また、水溶液中の蛋白質の性質（たとえば、蛋白質間相互作用、蛋白質―リガンド相互作用、蛋白質のコンフォメーション変化、蛋白質のフォルディング-アンフォルディング平衡など）をＥＳＩ／ＭＳで調べる実験でも安定したスプレーを提供できる。さらに、本発明のエレクトロスプレーエミッタは、測定中に蛋白質が沈殿せずに安定して存在できる水溶液中に溶解した蛋白質を直接分解してＥＳＩ／超高分解能フーリエ変換イオンサイクロトロンＭＳで測定する実験にも安定したスプレーを提供できる。陰イオン測定でも安定したスプレーを提供できる本発明のエミッタは、メタボロミックス(S. Takagi, et al., J. Clin. Invest 2003, 112, 1372-1382) や薬物動態プロファイリングなどＥＳＩの応用分野を広げうる。
【００３７】
本発明は、また非特異的吸着などによるサンプルの損失を減少させるために有効な、エミッタと分析機器を接続する管状配管（キャピラリー、チュービング、接続ラインなど）を提供する。本発明による低表面エネルギー化合物によるチャンネルのコーティングは、分析機器の接続のためのチャンネルやミクロ流体装置のミクロチャンネルのコーティングにも応用できる。
【００３８】
本発明は、以上に記載した事項に基づいて実施可能であるが、参考のため以下に参考文献を列記する。
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13.Tojo, H.; Japan Patent 2003028849, July, 2001
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Takagi, S., Tojo, H., Tomita, S., Sano, S., Itami, S., Hara, M., Inoue, S., Horie, K., Kondoh, G., Hosokawa, K., Gonzalez, F. J., Takeda, J. Alteration of the 4-sphingenine scaffolds of ceramides in keratinocyte-specific Arnt-deficient mice affects skin barrier function. J. Clin. Invest. 2003, 112, 1372-1382.
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１（ａ）（ｂ）（ｃ）】（ａ）はエミッタの表面張力がエミッタ先端出口で形成される液滴の大きさに与える影響を示す図であって、γは表面張力、下添え文字Ｓ，Ｌ，ＳＬはそれぞれ溶融シリカと空気、溶液と空気、溶融シリカと溶液との界面をあらわす。（ｂ）は本発明のエミッタの一実施例における、エミッタ長軸方向の断面図、（ｃ）は（ｂ）のＣ−Ｃ線で切断したエミッタ本体の断面図を示す。
【図１（ｄ）（ｅ）（ｆ）】先端先細り加工した後、ＰＦＰＯでコーティングした溶融シリカキャピラリーエミッタの実施例を示す図であって、（ｄ）は先端外壁をフッ素酸処理（エッチング）した長さ５ｃｍ、内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタと、その出口先端部分の拡大図、（ｅ）は先端外壁をフッ素酸処理した長さ５ｃｍ、内径２０μｍ／外径３６０μｍのエミッタ、（ｆ）は New Objective, MT, USA.から購入したもので、プラーで引いて先細り加工処理した長さ５．２ｃｍ、内径５０μｍ／外径３６０μｍで、出口先端内径が１５μｍのエミッタを示す。（ｆ）の内壁のコーティングは出口先端の一部のみ可能であるが、長さ５ｃｍ、内径１５μｍの溶融シリカキャピラリー素管は内壁全面を容易にコーティングできる。
【図２】（ａ）は種々の濃度のＰＦＰＯでコーティングした溶融シリカキャピラリー外表面の接触角を示すグラフであって、縦軸はＰＦＰＯでコーティングしたものとしないものの接触角の比を示す。（ｂ）は無処理および０．００１％、０．０１％ＰＦＰＯでコーティングした溶融シリカキャピラリーに載せた１μｌの水滴の形状を示す写真である。
【図３】蒸留水をエレクトロスプレーする時のＰＦＰＯコーティングエミッタの性能を示すグラフであって、（ａ）はＰＦＰＯコーティングエミッタから蒸留水をスプレーしたときの安定性を示すグラフであり、（ｂ）は大きな表面張力を持つ蒸留水のエレクトロスプレーの迅速な開始。ｍ／ｚ＝１５０〜２０００のイオンから発生する全イオン電流（ＴＩＣ）と電圧印加からの時間の関係を示すグラフである。エミッタ先端に形成される種々の大きさの液滴からスプレーが始まった時の効率を比較するために、水を送液するシリンジポンプの運転開始から０．５分おきに順次２．５分まで遅れて電圧を印加してエレトロスプレーを開始が可能なことを示す。
【図４（ａ）（ｂ）（ｃ）】エッチング後ＰＦＰＯコーティングした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタを使用し、Ｓ−Ｓ結合を還元・アルキル化した牛血清アルブミン（０．１ｐｍｏｌ）のトリプシン消化物のＭＳ解析をした際の結果を示すグラフであって、（ａ）が陽イオン測定で得られた全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラム、（ｂ）が（ａ）の星印で示された保持時間１１．３分に溶出されるペプチド（ｍ／ｚ６５３．５）のフルスキャンＭＳスペクトル、（ｃ）がｍ／ｚ６５３．５、衝突エネルギー３５％の［Ｍ＋２Ｈ］2+イオンのフルスキャンタンデムマス（ＭＳ／ＭＳ）スペクトル、をそれぞれ示すグラフである。
【図４（ｄ）（ｅ）】エッチング後ＰＦＰＯコーティングした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタを使用し、Ｓ−Ｓ結合を還元・アルキル化した牛血清アルブミン（０．１ｐｍｏｌ）のトリプシン消化物のＭＳ解析をした際の結果を示すグラフであって、（ｄ）と（ｅ）とはインジェクタからカラム入口までを接続する配管に使用する溶融シリカの内壁をＰＦＰＯでコートしたときとしないときとのベースピーククロマトグラムの比較、をそれぞれ示すグラフである。
【図５】エッチング後ＰＦＰＯコートした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタを使用し、表示された添加物を含む蒸留水に溶解したシトクロムｃ（１μＭ）の陽イオンフルスキャンマススペクトル（２０回積算）を示すグラフである。
【図６】アンギオテンシンＩＩ（０．１μＭ）の陽イオン（ａ）と陰イオン（ｂ）マススペクトルおよびセラミドの陽イオン（ｃ）と陰イオン（ｄ）のマススペクトルを示すグラフであって、セラミドはN-Lignoceroyl-4-sphingenine, N-lignoceroyl-sphinganine, N-stearoyl-4-hydroxy-sphinganineの混合物（それぞれ０．１μＭ）であり、陽イオン・陰イオン交互に切り替えて測定した場合のグラフである。
【図７】マウス気管支洗浄液中ホスファチジルコリンの陽・陰イオン測定交互切替法を用いたＨＰＬＣ／ＥＳＩ-ＭＳによる分析結果を示すグラフであって、（ａ）がジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）の［Ｍ＋Ｈ］+（ｍ／ｚ ７３４．４）と［Ｍ＋ＨＣＯＯ］-（ｍ／ｚ ７７８．５）イオンのイオンクロマトグラム、（ｂ）及び（ｃ）が、保持時間４６．８分付近に溶出される気管支洗浄液中ホスファチジルコリンの陽イオン及び陰イオンのマススペクトルを示すグラフである。この条件の陰イオン測定では、脱プロトン型イオン［Ｍ-Ｈ］-より４６質量単位大きい蟻酸付加体が主に検出される。
【図８】水／アセトニトリルを溶媒としたキャピラリーＨＰＬＣ／イオントラップＭＳによるプロスタグランディンの陰イオンを測定した際の結果を示すグラフであって、（ａ）がベースピーククロマトグラム（ｍ／ｚ ２００〜４５０）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）が、それぞれＰＧＤ2、ＰＧＪ2、１５−ｄｅｏｘｙ−Δ12,14−ＰＧＪ2のフルスキャンＭＳスペクトルを示すグラフである。なお、エッチング後ＰＦＰＯコートした内径２０μｍ／外径１５０μｍのエミッタを使用し、ＥＳＩ電圧は１．７ｋＶとし、使用したＨＰＬＣ装置は図４と同一である。また、インジェクタとカラムをつなぐキャピラリーの内壁はＰＦＰＯでコーティングしている。さらに、あらかじめ溶媒Ａ１０μｌを吸引したミクロシリンジにＰＧＤ2，ＰＧＪ2，１５−ｄｅｏｘｙ−Δ12,14−ＰＧＪ2それぞれ０．５ｐｍｏｌを含む混合溶液１μｌをとり、Ｖａｌｃｏ製１０ポートバルブに接続したＣ−１８トラップカラム（０．３×５ｍｍ）に注入した。分離用カラムは、流速〜１．５μｌ／ｍｉｎとして、１５％溶媒Ｂで平衡化後、１分間は溶媒Ｂ１５〜３０％続いて２０分間溶媒Ｂ３０〜４５％の直線濃度勾配で展開した。
【図９（ａ）（ｂ）（ｃ）】（ａ）、（ｂ）、（ｃ）はそれぞれＰＧＤ2，ＰＧＪ2，１５−ｄｅｏｘｙ−Δ12,14−ＰＧＪ2のオンラインＭＳ2プロダクトイオンスペクトルを示すグラフである。なお、ＭＳ2のスキャンには、３２−４０％の衝突エネルギーを使用。
【図９（ｄ）】１５−ｄｅｏｘｙ−Δ12,14−ＰＧＪ2及びＰＧＤ2のオンラインＭＳ3とＭＳ4プロダクトイオンスペクトルとを示すグラフであって、ｍ／ｚ ３１５→２７１イオンのＭＳ3スキャンで開裂（上図）、ＰＧＤ2アニオンをｍ／ｚ ３５１→３１５→２１７のＭＳ4スキャンで順次開裂（下図）した際の結果を示すグラフである。なお、ＭＳ3、ＭＳ4のスキャンには、３２−４０％の衝突エネルギーを使用。
【符号の説明】
【００４０】
１ エミッタ本体（キャピラリー）
１ａ ポリイミドを剥し露出させた溶融シリカをPFPOでコーティングした部位
１ｂ エミッタ出口先端外壁の先細り部分
２ 入口孔
３ 出口孔
４ チャンネル
４ａ 壁
５ Taylerコーンを形成する前のエミッタ出口先端の液滴
６ 対極
【特許請求の範囲】
【請求項１】
入口孔と、出口孔と、前記入口孔と前記出口孔とを連通している導管とを有したエミッタ本体と、
前記エミッタ本体の少なくとも出口先端の外側表面に低表面エネルギー化合物で形成された被覆物とを備えていることを特徴とするエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項２】
前記低表面エネルギー化合物が、フルオロポリマー又はフッ化化合物であることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項３】
前記フルオロポリマー又は前記フッ化化合物が、パーフルオロポリオキセタン、パーフルオロウレタン、フルオロポリマーエラストーマ、ポリテトラフルオロエチレン、フルオロアルキルモノシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルジシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルポリシラン、又は、エポキシ、水酸基、アクリレート、若しくはイソシアネートの官能基を有するパーフルオロオクタール若しくはパーフルオロポリエーテルであることを特徴とする請求項２記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項４】
前記低表面エネルギー化合物がパーフルオロポリオキセタンであることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項５】
前記被覆物が透明又は半透明であることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項６】
前記エミッタ本体が、溶融シリカ、ガラスセラミックス、アルミノシリケートガラス、ポリプロピレン又はステンレス鋼であることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項７】
前記エミッタ本体が、出口孔に向かって次第に細くなっていることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項８】
前記エミッタ本体の外側及び内側が、出口孔に向かって次第に細くなっていることを特徴とする請求項４記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項９】
前記エミッタ本体の内側が、さらに請求項２に記載の前記低表面エネルギー化合物で被覆されていることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項１０】
前記出口孔の内径が１０〜５０μｍであることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項１１】
エレクトロスプレーエミッタの製造方法であって、
前記エレクトロスプレーエミッタが、入口孔と、出口孔と、前記入口孔と前記出口孔とを連通している経路とを有したエミッタ本体とを備えたものであり、
前記エミッタ本体の少なくとも出口先端の外側表面に低表面エネルギー化合物の被覆物を形成することを特徴とするエレクトロスプレーエミッタの製造方法。
【請求項１２】
入口孔と、出口孔と、前記入口孔と前記出口孔との間を連通している導管とを有した管状コネクタ本体と、
前記エミッタ本体の少なくとも出口先端の内側表面に低表面エネルギー化合物で形成された被覆物とを備え、
エレクトロスプレーエミッタと分析装置とを接続する管状コネクタ。
【請求項１３】
前記低表面エネルギー化合物が、フルオロポリマー又はフッ化化合物であることを特徴とする請求項１２記載の管状コネクタ。
【請求項１４】
前記フルオロポリマー又は前記フッ化化合物が、パーフルオロポリオキセタン、パーフルオロウレタン、フルオロポリマーエラストーマ、ポリテトラフルオロエチレン、フルオロアルキルモノシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルジシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルポリシラン、又は、エポキシ、水酸基、アクリレート、若しくはイソシアネートの官能基を有するパーフルオロオクタール若しくはパーフルオロポリエーテルであることを特徴とする請求項１３記載の管状コネクタ。
【請求項１５】
前記低表面エネルギー化合物がパーフルオロポリオキセタンであることを特徴とする請求項１２記載の管状コネクタ。
【請求項１】
入口孔と、出口孔と、前記入口孔と前記出口孔とを連通している導管とを有したエミッタ本体と、
前記エミッタ本体の少なくとも出口先端の外側表面に低表面エネルギー化合物で形成された被覆物とを備えていることを特徴とするエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項２】
前記低表面エネルギー化合物が、フルオロポリマー又はフッ化化合物であることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項３】
前記フルオロポリマー又は前記フッ化化合物が、パーフルオロポリオキセタン、パーフルオロウレタン、フルオロポリマーエラストーマ、ポリテトラフルオロエチレン、フルオロアルキルモノシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルジシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルポリシラン、又は、エポキシ、水酸基、アクリレート、若しくはイソシアネートの官能基を有するパーフルオロオクタール若しくはパーフルオロポリエーテルであることを特徴とする請求項２記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項４】
前記低表面エネルギー化合物がパーフルオロポリオキセタンであることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項５】
前記被覆物が透明又は半透明であることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項６】
前記エミッタ本体が、溶融シリカ、ガラスセラミックス、アルミノシリケートガラス、ポリプロピレン又はステンレス鋼であることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項７】
前記エミッタ本体が、出口孔に向かって次第に細くなっていることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項８】
前記エミッタ本体の外側及び内側が、出口孔に向かって次第に細くなっていることを特徴とする請求項４記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項９】
前記エミッタ本体の内側が、さらに請求項２に記載の前記低表面エネルギー化合物で被覆されていることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項１０】
前記出口孔の内径が１０〜５０μｍであることを特徴とする請求項１記載のエレクトロスプレーエミッタ。
【請求項１１】
エレクトロスプレーエミッタの製造方法であって、
前記エレクトロスプレーエミッタが、入口孔と、出口孔と、前記入口孔と前記出口孔とを連通している経路とを有したエミッタ本体とを備えたものであり、
前記エミッタ本体の少なくとも出口先端の外側表面に低表面エネルギー化合物の被覆物を形成することを特徴とするエレクトロスプレーエミッタの製造方法。
【請求項１２】
入口孔と、出口孔と、前記入口孔と前記出口孔との間を連通している導管とを有した管状コネクタ本体と、
前記エミッタ本体の少なくとも出口先端の内側表面に低表面エネルギー化合物で形成された被覆物とを備え、
エレクトロスプレーエミッタと分析装置とを接続する管状コネクタ。
【請求項１３】
前記低表面エネルギー化合物が、フルオロポリマー又はフッ化化合物であることを特徴とする請求項１２記載の管状コネクタ。
【請求項１４】
前記フルオロポリマー又は前記フッ化化合物が、パーフルオロポリオキセタン、パーフルオロウレタン、フルオロポリマーエラストーマ、ポリテトラフルオロエチレン、フルオロアルキルモノシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルジシラン、ポリメリックパーフルオロエーテルポリシラン、又は、エポキシ、水酸基、アクリレート、若しくはイソシアネートの官能基を有するパーフルオロオクタール若しくはパーフルオロポリエーテルであることを特徴とする請求項１３記載の管状コネクタ。
【請求項１５】
前記低表面エネルギー化合物がパーフルオロポリオキセタンであることを特徴とする請求項１２記載の管状コネクタ。
【図１（ａ）（ｂ）（ｃ）】
【図１（ｄ）（ｅ）（ｆ）】
【図２】
【図３】
【図４（ａ）（ｂ）（ｃ）】
【図４（ｄ）（ｅ）】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９（ａ）（ｂ）（ｃ）】
【図９（ｄ）】
【図１（ｄ）（ｅ）（ｆ）】
【図２】
【図３】
【図４（ａ）（ｂ）（ｃ）】
【図４（ｄ）（ｅ）】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９（ａ）（ｂ）（ｃ）】
【図９（ｄ）】
【公表番号】特表２００６−５２４４１８（Ｐ２００６−５２４４１８Ａ）
【公表日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５０７６５４（Ｐ２００６−５０７６５４）
【出願日】平成１６年３月３日（２００４．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２６８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７９３６４
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（５９６０４８４１１）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月２６日（２００６．１０．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年３月３日（２００４．３．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００２６８３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０７９３６４
【国際公開日】平成１６年９月１６日（２００４．９．１６）
【出願人】（５９６０４８４１１）
【Ｆターム（参考）】
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