低酸素誘導性因子に関連した病状を治療するためのメルファレンのＮ−オキシドと誘導体
【解決手段】 本発明は、Ｎ−オキシド及びその誘導体である化合物に関するものであり、また、ＨＩＦ関連疾患を治療するためのそれらの使用にも関する。これらの化合物は以下のように設計された一般的な化合式を有しており、ＨＩＦに関連した様々な疾患を治療するために使用される、化学式（Ｉ）においてＲはアルキル、アリル、アラキル（ａｒａｋｙｌ）、或いは例えばＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、Ｃ６Ｈ５ＯＣＨ２ＣＨ２−、Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）３ＯＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ−などのそれらの誘導体、若しくは化学式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び（ＩＶ）のいずれか１つである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−オキシド及びその誘導体の化合物、組成物、及び処方に関するものであり、特に低酸素誘導性因子の阻害剤としてのそれらの効果により、病状を治療するのに有用であるＮ−オキシド及びその誘導体に関するものである。本発明は、治療を必要としている患者を、そのような化合物、組成物、及び処方を含む薬学的な処方で治療する方法を含む。本発明の特に有用な観点は、ＶＥＧＦに関連した疾患に影響を与えるＶＥＧＦ形成を阻害する、本発明の化合物、組成物、及び処方の能力である。
【背景技術】
【０００２】
クロランブシル誘導体は、以前、米国特許番号第５，６０２，２７８号（‘２７８特許）に記載されており、開示された全体の内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。この‘２７８特許は、低酸素環境下でのクロランブシルとそのＮ−オキシド誘導体の使用方法を記載しており、より具体的には、そのような反応性条件を作るヒドララジンとの組み合わせにおけるクロランブシルに関して記載している。しかしながら、低酸素誘導性因子と関連した一連の疾患の治療における腫瘍状態の複雑さとＮ−オキシド誘導体の価値は、‘２７８特許では十分に評価されていなかった。
【０００３】
多数の人が、この因子が低酸素腫瘍細胞に対する選択的な毒性を提供するかどうかを決定するために、クロランブシルのＮ−オキシド誘導体の研究を行った。いくつかの研究では、この誘導体は低酸素下で選択的な毒にはならないため、クロランブシルのＮ−オキシドは抗腫瘍因子としては無効であると報告された。他の研究では、クロランブシルのＮ−オキシドは、クロランブシルの価値を超える低酸素選択性の増強を示さないと報告された。しかしながら、‘２７８特許はクロランブシルとその転位産物は、低酸素環境を作るヒドララジンとともに投与した場合、効果的であったことを実証した。
【０００４】
本発明は、本発明の化合物を含む薬学的な処方に関するものである。前記処方は、そのような化合物の１若しくはそれ以上とともに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、水溶液、アジュバント、或いは様々な病状を治療するのに有用である別の化合物の１若しくはそれ以上も有するものである。
【０００５】
本発明は、そのような化合物の使用を有する治療の方法も含む。前記方法は、その様な化合物とともに、他の治療方法を用いる工程も有するものである。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００６】
本発明の１観点は、Ｎ−オキシド及びその誘導体である窒素マスタード化合物に関連するものである。これらの化合物は、以下に記載した一般式を有し、様々な目的に対して用いられる。
【０００７】
【化４】
【０００８】
ここにおいて、Ｒはアルキル、アリル、アラルキル、若しくは例えばＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、Ｃ６Ｈ５ＯＣＨ２ＣＨ２−、Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）３ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、若しくは以下のいずれか１つ、
【０００９】
【化５】
【００１０】
【化６】
【００１１】
【化７】
【００１２】
などのそれらの誘導体である。
【００１３】
本発明は、上記の化合物の塩類にも関するものである。前記塩類は、上記に記載した式を一般的に有し、前記塩類は、ＨＣＬ、アセテート、ＴＦＡ、トシレート、若しくはピクリン酸塩のいずれかであり、ここにおいてＲは上述したものである。
【００１４】
本発明の別の観点としては、ＨＩＦ、特にＨＩＦ−１αを阻害することによる疾患の治療である。本発明の化合物、組成物、若しくは処方で治療される疾患のごくわずかは、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）若しくは新血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）に関連した疾患を含む。治療されるＨＩＦに関連した疾患は、脈絡及び網膜新血管形成、年齢関連性黄斑変性症、関節疾患、炎症、神経変性疾患、及び虚血性再灌流（ｎｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）損傷を含む。
【００１５】
本発明の別の観点は、そのような化合物を含む薬学的組成物に関するものである。前記組成物は、そのような化合物の１若しくはそれ以上とともに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、水溶液、アジュバント、若しくは様々な病状を治療するのに有用な別の化合物の１若しくはそれ以上も有するものである。
【００１６】
本発明は、そのような化合物の使用を有する医療方法を含む。前記方法は、そのような化合物の使用とともに、他の医療方法も有するものである。
【００１７】
‘２７８特許は、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏのクロランブシルのＮ−オキシド誘導体（ＣＨＬＮ−Ｏ）と、クロランブシルのヒドロキシルアミン誘導体のＮ−オキシド誘導体（ＣＨＬ−ＨＤ）の結果を記載していた。両方の化合物は、低酸素下で酵素の減少を伴ったより大きな毒性を有していた。その様な生物学的活性は、他の報告された結果を考慮しても、それらの分子構造を考慮しても、予想外であった。さらに、ＣＨＬＮ−ＮとＣＨＬ−ＨＤの両方は、安定であり、最小ｉｎ ｖｉｖｏ毒性を生産した。この驚くべきｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏ活性と最小ｉｎ ｖｉｖｏ毒性は、図１に示された一般的な式の化合物が低酸素腫瘍細胞を治療するための薬学的な処方に有用であることを示していた。しかしながら、腫瘍の比較的小さな部分は、ある所定時間、低酸素状況下にある。さらに、報告された唯一のｉｎ ｖｉｖｏデータは、クロランブシル誘導性４［ｐ−（Ｎ−２−クロロエトキシ Ｎ−２ クロロエチルアミノ）フェニル］ブタン酸に関連していた。さらに、そこで議論されていたクロランブシル誘導体の、ＨＩＦ、血管新生、解糖、赤血球新生（ｅｎｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）、アポトーシス、ＶＥＧＦ若しくはＨＩＦに対する影響はほとんど理解されていなかった。
【００１８】
低酸素の領域がある固形腫瘍は、最も攻撃的で治療が困難な腫瘍であるとして長く認識されていた。低酸素に対する細胞性反応は、解糖の増加、アポトーシスの阻害、及び血管新生と転移の増加を含み、これは、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βサブユニットのヘテロ二量体である、低酸素誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）転写因子を通じて仲介される。ＨＩＦ−１αのレベルはＨＩＦ−１の活性を制御すると示され、ヒト腫瘍の範囲で過剰発現しているので、ＨＩＦ−１αは化学療法の魅力的な標的である。
【００１９】
ＰＸ−４７８（Ｓ−２−アミノ−３−［４’−Ｎ，Ｎ，−ｂｉｓ（２−クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシドジヒドロクロライド）、若しくはメルファランＮ−オキシド、及びそれらの誘導体は、ＨＩＦ−１αタンパク質の低酸素誘導性増加を著しく減少するが、ＨＩＦ−１βには影響を及ぼさず、ＨＩＦ−１トランス活性化を阻害し、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞とヒト大腸癌ＨＴ−２９細胞の両方における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）などの下流標的遺伝子の発現を減少する。ＨＩＦ−１αの分解を制御する活性フォン・ヒッペル・リンドウタンパク質（ｐＶＨＬ）が欠損している、ヒト腎臓細胞癌（ＲＣＣ４細胞）、及び活性ｐＶＨＬが再導入されたＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞は、ＰＸ−４７８がｐＶＨＬ経路非依存的に働くことを示すために使用された。従って、ＰＸ−４７８は、ＨＩＦ−１経路の第１の特異的な阻害剤の１つであり、ＨＩＦ阻害因子の有望な新しい種類である。
【００２０】
ＨＩＦ−１は、酸素制御ＨＩＦ−１α若しくはＨＩＦ−２αと、恒常的に発現したＨＩＦ−１βとのヘテロ二量体であり、それは解糖、赤血球形成、アポトーシス耐性、及び血管新生促進に関与する広範囲の遺伝子の転写を活性化する。
【００２１】
ＨＩＦ−１の活性は、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αサブユニットのレベルで主に制御されているように見える。酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）における特異的プロリン残基（ヒトＨＩＦ−１αにおけるＰｒｏ５６４及びＰｒｏ４０２）がプロリル４−ヒドロキシラーゼ（水酸化酵素）ファミリーによってヒドロキシル化されている場合、正常酸素圧条件下のＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αのレベルは非常に低く維持されている。これは、フォン・ヒッペル・リンドウ（ｐＶＨＬ）タンパク質がＨＩＦ−１αのＯＤＤに結合することを可能にし、それはＨＩＦ−１αをユビキチン化し、最終的にはそのプロテオソーム分解を生じさせるＥ３ユビキチンリガーゼを活性化する複合体の補充をもたらすものである。プロリル４−ヒドロキシラーゼは、Ｏ２、Ｆｅ２＋、及び２−オキソグルタル酸若しくはアスコルビン酸に対して絶対条件を示す。従って、低酸素下（<５％酸素）では、プロリルヒドロキシラーゼは阻害され、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルは増加し、恒常的に発現したＨＩＦ−１βサブユニットを結合し複合体を形成し、次にＨＩＦ−１応答性遺伝子のプロモーター領域中の低酸素反応性因子（ＨＲＥ）ＤＮＡ配列に結合し、それらの転写を活性化する。
【００２２】
腫瘍抑制因子ｐ５３を含む他の経路でもＨＩＦ−１α分解を制御し、この腫瘍因子ｐ５３はＨＩＦ−１αに結合し、別のＥ３ユビキチンリガーゼであるＭＤＭ２の補充による両方のタンパク質の分解を生じる。分子シャペロンである熱ショックタンパク質−９０（ＨＳＰ９０）阻害剤ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）は、ＨＩＦ−１αタンパク質の低酸素誘導性増加を阻害するため、ＨＳＰ９０タンパク質はＨＩＦ−１α分解に関わっている可能性がある。
【００２３】
とりわけ、インスリン、インスリン様増殖因子１及び２、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子２、インターロイキン１β、腫瘍壊死因子α、トランスフォーミング成長因子β１、及び血小板由来成長因子を含む増殖因子及びサイトカインは、正常酸素圧条件下でＨＩＦ−１αのレベルを安定化及び増加することができる。これらの因子は、正確なメカニズムはまだ明らかではないが、例えばマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）やフォスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路などの共通の細胞キナーゼ経路を介してＨＩＦ−１αを安定化する。さらに、タンパク質安定化のみでは正常酸素圧条件下でＨＩＦ−１を活性化するためには不十分である。完全な活性化は、（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を介した）翻訳後タンパク質リン酸化、ＨＳＰ９０によって仲介される核輸送、ＨＩＦ−１βとの二量体化、ＤＮＡ結合、及び例えばＣｒｅｂ結合タンパク質（ＣＢＰ）／ｐ３００（ヒトＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３上のアスパラギニルヒドロキシル化によって仲介される）、ＳＲＣ−１及びＴＩＦ２などの転写性補助因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）の補充、を必要とする。ＨＩＦ−１αとｐＶＨＬと相互作用する転写リプレッサーであるＦＩＨ（ＨＩＦ−１阻害因子）も最近記載されていた。しかしながら、転写後タンパク質リン酸化と活性化は、ＨＩＦ−１αが安定化され、細胞内で適切なレベルを達成した場合にのみ生じることができる。多くの研究により、レドックス依存性過程がＨＩＦ−１複合体の安定化と活性化の両方に関連していることが示唆された。我々は最近、小レドックスタンパク質チオレドキシン−１が、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルを増加し、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生の増加、さらには血管新生の増加を導くことを報告した。レドックス不活性変異チオレドキシン−１は、ＨＩＦ−１αタンパク質、ＶＥＧＦ、及び血管新生を減少した。さらに文献１を通じて、因子−１（文献１）がＳＲＣ−１、ＴＩＦ２及びＣＢＰ／ｐ３００の補充を増強したと示され、減少したチオレドキシンは低酸素細胞の核へ転座し、ＨＩＦ−１αへのレドックスシグナルを伝達するというモデルが提案された。
【００２４】
ＨＩＦ−１αタンパク質は、広範囲にわたるヒト原発性腫瘍に見られるが、正常組織においては非常に低いレベルである。ＨＩＦ−１αの癌に対する重要性は、ＨＩＦ−１αレベルの上昇を導くＶＨＬ遺伝子の両対立遺伝子の機能損失と共に、腎臓細胞癌、クロム親和性細胞腫、及び中枢神経系のヘミングリア芽腫（ｈｅｍｉｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）などの腫瘍が高確率で発生することよって示されている。また、散発性腎臓細胞癌のほとんどのケースは、ＶＨＬ遺伝子機能の早期損失と、ＨＩＦ−１αレベルの増加と関連している。腎臓癌に由来する無傷ＶＨＬ遺伝子を細胞へ再導入すると、ＨＩＦ−１αは正常酸素圧レベルまで回復し、腫瘍形成能が減少する。ＨＩＦ−１αレベルはまた、変異を有する癌細胞を増加し、若しくはＰＴＥＮを欠落させる。いくつかの腫瘍で発現したＨＩＦ−２αも、マクロファージに関連した骨髄及び腫瘍において見出される。
【００２５】
低酸素に対する腫瘍の成長反応の調節におけるＨＩＦ−１αの役割に起因して、それは抗腫瘍薬剤の開発において重要な標的となっている。米国特許第５，６０２，２７８号には、ＰＸ−４７８（Ｓ−２−アミノ−３−［４’−Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシドジヒドロクロライド）が、低酸素環境下で選択的に活性化される潜在的な因子として記載されている。しかし、４［ｐ−（Ｎ−２−クロロエトキシＮ−２クロロエチルアミノ）フェニル］ブタン酸は、還元性環境（例えば、還元酵素の存在下）において選択的に低酸素細胞を殺すことが示されていた。我々は、還元酵素の非存在下でのその抗腫瘍作用に起因する、ＨＩＦ−１αに対するＰＸ−４７８の影響とその下流標的を研究した。我々は、ＰＸ−４７８処理はＨＩＦ−１αタンパク質の減少（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方）、及びその後に続くＨＩＦ−１複合体のトランス活性化を減少し、チオレドキシン還元酵素の阻害を介していると思われる下流標的のレベルの減少を導くことを示した。我々の研究によって、ＰＸ−４７８の活性は、ＶＨＬ経路から独立していることも示された。これらの研究は、ＨＩＦのＰＸ−４７８阻害が還元酵素を必要としないことを示していた。従って、ＰＸ−４７８は、ＨＩＦ経路の最初の阻害剤の１つであり、有望な新しい抗腫瘍因子であることを意味している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
方法
細胞培養、及び低酸素処理
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞、及びＨＴ−２９大腸癌細胞は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ヒト腎臓細胞癌ＲＣＣ４細胞、及び野生型フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）遺伝子を形質移入したＲＣＣ４／ＶＨＬは、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｒａｔｃｌｉｆｆｅから入手した。細胞は、３７℃で、湿度９５％、空気５％のＣＯ２インキュベーターにおいて、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ＲＣＣ４及びＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞には適している）を添加した培地で培養した。低酸素にさらすために、培養フラスコを様々な時間、３７℃で、５％ＣＯ２／７４％Ｎ２／２１％アルゴンを含有する混合ガスと共に湿度チェンバー内でインキュベートした。酸素レベルは、酸素センサー（製品番号：Ｏｘ１１０、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ、レッドフィールド、ニューヨーク州）を用いてガス層において１％に保った。実験の最後で、細胞は氷冷リン酸緩衝液ｐＨ７．５（ＰＢＳ）で２回洗浄した。ＶＥＧＦレベルを測定するために、各フラスコからの１ｍｌ培養液を処理後取り除き、−８０℃で貯蔵した。
【００２７】
細胞増殖及び生存アッセイ
増殖阻害アッセイは、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイを用いて以前記載されたように実行した。低酸素条件下での分析のため、プレートを薬剤存在下で１％酸素で１６時間インキュベートし、次に２０％酸素で７２時間の残りの時間、インキュベートした。
【００２８】
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ
約１０７細胞は、２００μｌの溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５）、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、０．１ｍＭ バナジン酸ナトリウム、１％ ＮＰ４０、及び０．２％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で１時間４℃で溶解した。溶解液は遠心分離（１５分、４℃、１０，０００ｘｇ）し、上清を回収した。２０μｌの一定分量をタンパク質濃度の分析のために除去し、前記溶解液は必要になるまで−８０℃で貯蔵した。細胞溶解液中のＶＥＧＦは、ｐｇ（ＶＥＧＦタンパク質）／ｍｇ（総タンパク質）として表し、回収された培養液中のＶＥＧＦは、ｐｇ（ＶＥＧＦタンパク質）／ｍｇ（同じフラスコからの細胞中で測定された総細胞タンパク質）で表した。細胞溶解液におけるヒトＶＥＧＦと、培養液に分泌されたＶＥＧＦの量は、製造元取り扱い説明書に従って、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１２１アイソフォームを測定するＥＬＩＳＡキット（ヒトＶＥＧＦ−ＥＬＩＳＡ；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて決定した。血しょう中のマウスＶＥＧＦの量は、製造元取り扱い説明書に従って、マウスＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１２１アイソフォームを測定するＥＬＩＳＡキット（マウスＶＥＧＦ−ＥＬＩＳＡ；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。
【００２９】
免疫ブロッティング法
核及び細胞質抽出物は、製造元取り扱い説明書に従って、ＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓを用いて調整した。ウェスタンブロッティング法は、マウス抗ヒトＨＩＦ−１α（１μｇ／ｍｌ）；マウス抗ヒトＨＩＦ−１β（１μｇ／ｍｌ）；マウス抗ヒトｉＮＯＳ（５μｇ／ｍｌ）；及びヤギ抗ヒトｌａｍｉｎ Ａ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、以前記載したように実行した。抗マウス、若しくは抗ヤギ西洋ワサビペルオキシダーゼ−共役二次抗体は１：５０００の希釈率で用い、化学発光によって検出され、ブロットはＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて定量した。
【００３０】
ＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ測定
Ｔｒｉｚｏｌ抽出法を用いて調製された１５μｇ総ＲＮＡは、１．５％アガロース−ホルムアルデヒドゲルを用いた電気泳動によって分離され、ナイロンメンブレンに転写した。ＲＮＡは、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ＵＶ クロスリンカーを用いてメンブレンにクロスリンク（架橋結合）した。ヒトＨＩＦ−１αに対する完全長プローブ（ランダムプライマー標識システム（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルされている）は、ＵＬＴＲＡｈｙｂ ハイブリダイゼーションバッファーを用いてメンブレンにハイブリダイズし、製造元プロトコールに従って洗浄工程を行った。ブロットはＭＤ Ｓｔｏｒｍ ８６０ホスフォイメージャーを用いて画像化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて定量化した。１８Ｓ ｒＲＮＡに対する完全長ｃＤＮＡプローブは、添加対照として用いた。
【００３１】
低酸素反応性因子レポーターアッセイ
ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）からの低酸素反応性因子（ＨＲＥ）を含むｐＧＬ３ホタルルシフェラーゼ レポータープラスミドは、Ｄｒ．Ｉａｎ Ｓｔｒａｔｆｏｒｄより寄贈された。プラスミドＤＮＡは商業用キットを用いて調整した。空ｐＧＬ３対照プラスミド、及び形質移入（トランスフェクション）効率に対する対象で用いられたプラスミドを含むｐＲＬ−ＣＭＶ ウミシイタケルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａから入手した。細胞は、製造元取扱説明書に従って、ＬｉｐｏＴＡＸＩ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ほ乳類形質移入試薬：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、テキサス州）を用いて、５μｇのＨＩＦ−１レポータープラスミド、若しくはｐＧＬ３対照プラスミド、及び０．０２５μｇのｐＲＬ−ＣＭＶ ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（形質移入効率のための対照として）で形質移入した。２４時間後、細胞を以前に記載したように低酸素にさらした。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性は、製造元取扱説明書に従って、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（デュアルルシフェラーゼレポートアッセイ系）を用いて測定した。
【００３２】
免疫染色化学
ＭＦＣ−７及びＭｉａＰａＣａ細胞（０．２ｍｌマトリゲル中に１０７）をｓｃｉｄマウスの横腹に注入した。腫瘍が０．５ｇに到達した時、マウス（１グループに４匹）を１００ｍｇ／ｋｇ ＰＸ−４７８若しくは溶媒対照を（腹腔内注入によって）処理した。４時間後、１ｍｌの血液を各マウスから採取し、マウスは屠殺し、腫瘍を除去し、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、パラフィンで包埋した。切片を、自動化免疫染色装置システムを用いてＨＩＦ−１α（１０μｇ／ｍｌ）若しくはＶＥＧＦ（７μｇ／ｍｌ）に対する抗体で染色した。ＨＩＦ−１α染色の強度は、ＳｉｍｐｌｅＰＣＩプログラムを用いて測定した。
【００３３】
チオレドキシン還元酵素アッセイ
総細胞溶解液は、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡで記載したように調整した。チオレドキシン還元酵素活性は、Ｂｅｒｇｇｅｎら（１９９９年）が記載したように測定した。簡潔には、０．２ｍｌの一定分量の新鮮アデノシン２’，５’−二リン酸共役アガロースビーズ（ＡＤＰアガロース）（Ｓｉｇｍａ）を、０．２ｍｌの一定分量の上清と１時間、４℃で混合し、内因性チオレドキシンと他の小分子量還元剤を除去した。前記ビーズは次に、２ｘ１ｍｌの、０．１Ｍ ＮａＣｌで１０００ｘｇの再遠心分離によって洗浄し、チオレドキシン還元酵素は、０．５ｍｌの１．０Ｍ ＫＣＬで溶出した。チオレドキシン還元酵素活性は次に、基質として５μＭ ヒトリコンビナントチオレドキシン、及び最終電子受容体として酸化型インシュリンを用いて、３３９ｎｍでＮＡＤＰＨの酸化として測定した。活性は、上清タンパク質のミリグラム当たり、１分間に酸化されるナノモルＮＡＤＰＨとして表した。
【００３４】
免疫組織化学
ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞（１マウス当たりマトリゲル中に１０７細胞）を、エストロゲンペレットを移植されたｓｃｉｄマウスの横腹に皮下的に注入した。腫瘍は０．５ｇまで成長した。次にマウスの腹腔内に、溶媒単独、若しくは１２０ｍｇ／ｋｇ ＰＸ−４７８を入れた。４時間後、腫瘍を切除し、ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した。切片は、自動化免疫染色装置システムを用いて、ＨＩＦ−１α（１０μｇ／ｍｇ；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ）、若しくはＶＥＧＦ（７μｇ／ｍｌ）に対する抗体で染色した。染色は、ＳｉｍｐｌｅＰＣＩ分析ソフトウェアを用いて定量化した。
【００３５】
考察
ＰＸ−４７８は低酸素及び正常酸素圧で阻害作用を示す
ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞及びヒト大腸癌ＨＴ−２９細胞は、正常酸素圧（２０％酸素）若しくは低酸素（１％酸素）条件下、様々な濃度のＰＸ−２７８で、１６時間処理した。次に細胞を薬剤を含まない温かい培地で３回洗浄し、７２時間の残りの時間インキュベートした。次にＭＴＴアッセイを行って、増殖阻害作用を決定した。データは、二組ずつ３回の実験から平均±ＳＥで表した。ＰＸ−４７８は、低酸素（１％酸素）及び正常酸素圧（２０％酸素）条件下で増殖阻害作用を示し（ｐ＝<０．０１）、正常酸素圧条件下での増殖阻害作用に対して低酸素条件下の増殖阻害作用の比は、ＭＣＦ−７で１．２５、ＨＴ−２０細胞で１．２であった。以下の表１は、これらの結果を示している；
【００３６】
【表１】
【００３７】
ＰＸ−４７８はＨＩＦ−１αタンパク質を阻害する
ＨＩＦ−１αは、低酸素に対する細胞性反応の重要な調節要素である。従って我々は、ＰＸ−４７８のＨＩＦ−１αタンパク質レベルに対する影響を検討した。図２Ａに示したように、ＰＣ−３前立腺癌細胞、ＭＣＦ−７乳癌細胞、及びＨＴ−２９大腸癌細胞をＰＸ−４７８存在下、低酸素（１％酸素）に１６時間さらした。細胞核抽出物を調製し、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルをウェスタンブロッティング法を用いて測定した。図２に示したように結果は、添加対照としてのｌａｍｉｎ Ａを含む典型的なウェスタンブロットを示した。図２において、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞及びＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞は、ＰＸ−４７８存在下で正常酸素圧（２０％酸素）若しくは低酸素（１％酸素）で１６時間処理した。細胞核抽出物を調製し、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βタンパク質のレベルをウェスタンブロッティング法を用いて測定した。ブロットは３回の実験の代表である。Ｌａｍｉｎ Ａは、添加対照として用いた。データは、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ．で表し、（●）はＰＣ−３前立腺癌細胞、（○）はＭＦＣ−７乳癌細胞、及び（▼）はＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞を示している。図２Ａに示されたように、ＰＸ−４７８は、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７（図２Ａに示した）及びヒト大腸癌細胞ＨＴ−２９（図２Ｂに示した）における低酸素（１％酸素）誘導性ＨＩＦ−１αタンパク質を阻害し、各細胞のＩＣ５０値はそれぞれ３．５±２．０、及び１７．８±５μＭである。ＨＩＦ−１αタンパク質レベルは、以前に報告されたように、正常酸素圧（２０％酸素）下においては非常に低かったので、影響は見られなかった。しかしながら、正常酸素圧において検出可能なレベルのＨＩＦ−１αタンパク質を示したヒト膵臓癌ＰＣ−３細胞において、ＩＣ５０値は２．５±１．２μＭであった（図示せず）。この細胞株では、低酸素条件下でも同程度のＩＣ５０値が得られた（２．１±２．０μＭ）。
【００３８】
図３Ａ及び３Ｂに示したように、ＰＸ−４７８は、あらゆる細胞株において、ＨＩＦ−１β（図３Ａ及び３Ｂ）若しくはＨＩＦ−１α ｍＲＮＡレベル（図示せず）に対して影響を及ぼさなかった。
【００３９】
ＰＸ−４７８は低酸素誘導性ＨＩＦ−１トランス活性化を阻害する
ＨＩＦ−１トランス活性化は、ＰＧＫからのＨＲＥの複数コピーの制御下で、ルシフェラーゼをコンストラクト発現している一過性形質移入細胞によって測定した。図４Ａは、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞、及び図４Ｂは、ＨＴ−２９ヒト大腸癌（Ｂ）細胞を図示しており、各細胞は、様々な濃度のＰＸ−４７８の存在下、正常酸素圧（２０％酸素）若しくは低酸素（１％酸素）で１６時間処理した。次にＨＩＦ−１トランス活性化は、ＰＧＫからのＨＲＥのいくつかのコピーの制御下で、コンストラクト発現しているホタルルシフェラーゼを用いて測定した。ウミシイタケルシフェラーゼは、形質移入効率の対照として同時形質移入した。データは、３回の実験の平均±ＳＥで表した。＊は、同条件下において、未処理対照から有意な変化があったことを示している（ｐ＝<０．００１）。図４Ｂで示したように、ＨＴ−２９細胞は、図４Ａに示されたようなＭＣＦ−７細胞と比較して、ＨＩＦ−１のトランス活性化の有意な増加が見られた（ＭＣＦ−７細胞が１０．１±１．９倍に対して、ＨＴ−２９細胞１３．９±１．５倍である）（ｐ＝<０．００１）。しかしながら、ＰＸ−４７８は、１０μＭ及び２５μＭのＰＸ−４７８で１６時間処理した後、両方の細胞株における低酸素誘導性のＨＩＦ−１トランス活性化を有意に減少した（ｐ＝<０．００１）。低酸素誘導性トランス活性化の阻害に対するＩＣ５０値は、ＭＣＦ−７細胞では２０．５±１．４μＭ、ＨＴ−２９細胞では２３．１±１．８μＭであった。ＨＩＦ−１トランス活性化は、正常酸素圧下では非常に低く、両細胞株をＰＸ−４７８で処理しても影響がなかった。
【００４０】
ＰＸ−４７８は低酸素誘導性ＶＥＧＦ産生を阻害する
図５Ａ及び５Ｂにそれぞれ示したように、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞及びＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞を、ＰＸ−４７８存在下で、正常酸素圧（２０％酸素：黒符号）若しくは低酸素（１％酸素：白符号）で１６時間処理した。次に、丸で表示された細胞溶解液中のＶＥＧＦレベル、若しくは三角で表示された培養液中のＶＥＧＦレベルをＥＬＩＳＡを用いて測定した。データは、３回の実験の平均±ＳＥで表した。＊は、同条件下（正常酸素圧、若しくは低酸素）で未処理対照から有意な差があることを示している（ｐ＝<０．００１）。ＰＸ−４７８は、１０μＭ ＰＸ−４７８で１６時間処理した後、ＭＣＦ−７細胞（図５Ａ）及びＨＴ−２９細胞（図５Ｂ）の両方における低酸素誘導性ＶＥＧＦタンパク質レベルを有意に減少した（ｐ＝<０．０１）。ＩＣ５０値は、ＭＣＦ−７細胞及びＨＴ−２９細胞において、細胞溶解液中のＶＥＧＦに対してはそれぞれ１７．１±４．０μＭ及び１３．５±４．０μＭ、培養液中に分泌されたＶＥＧＦに対してはそれぞれ３．８±２．０μＭ及び１１．５±２．５μＭであった。培養液中に分泌されたＶＥＧＦのレベルは、ＭＣＦ−７細胞において、１０μＭ ＰＸ−４７８で処理した後、正常酸素圧レベルまで減少した。しかしながら、ＭＣＦ−７細胞の細胞溶解液中のＶＥＧＦレベルだけでなく、ＨＴ−２９の細胞溶解液と培養液中に分泌されたＶＥＧＦレベルは、２５μＭ ＰＸ−４７８で処理した後も正常酸素圧レベルにまで戻らなかった。興味深いことに、ＰＸ−４７８は、両細胞株の正常酸素圧におけるＶＥＧＦレベルには影響を及ぼさなかった。
【００４１】
ＨＩＦ−１αタンパク質はＰＸ−４７８除去後４時間まで阻害され続ける
ＰＸ−４７８で細胞を処理した後、どのくらいの時間でＨＩＦ−１αタンパク質が阻害され続けるかを検討するために、図６に示したように、ＭＣＦ−７細胞をＰＸ−４７８で１６時間処理し、次に薬剤を洗い流し、ＨＩＦ−１αの回復を測定した。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を１６時間低酸素（１％酸素、Ｈ）にさらし、次に２５μＭ ＰＸ−４７８に最大４時間まで処理した。細胞核抽出物は表示された時間で調製し、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルを測定するためにウェスタンブロッティング法を行った。正常酸素圧（２０％酸素、Ｎ）下で１６時間処理した後のＨＩＦ−１αタンパク質のレベルも対照として示した。ＨＩＦ−１αタンパク質レベルは薬剤の除去から４時間以内に処理前レベルにまで回復した。
【００４２】
ＰＸ−４７８はＨＩＦ−１αタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する
ＭＣＦ−７細胞をｓｃｉｄマウスの横腹で異種移植片として増殖した。異種移植片が０．３ｇに到達した時、マウスを溶媒対照若しくは１００ｍｇ／ｋｇ ＰＸ−４７８（図７Ａ及び７Ｂにそれぞれ図示した）で処理した。４時間後、腫瘍を除去し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルを免疫組織化学法を用いて測定した（Ａ及びＢ）。（Ｃ）ＨＩＦ−１α染色強度は、Ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＩソフトウェアを用いて定量化した。＊は、対照から有意な差があることを示している（ｐ＝<０．０１）。データは、平均±ＳＥで表した。図７Ａ及び７Ｂに示したように、ｓｃｉｄマウスの横腹で異種移植片として増殖したＭＣＦ−７細胞の処理によって、ＰＸ−４７８処理の４時間後、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルが有意に減少した（ｐ＝<０．００５）ことが示された。ＰＸ−４７８処理細胞中の局在化における染色残存核、及びＨＩＦ−１αのレベルは、図７Ｃに示された未処理対照と比較してＰＸ−４７８処理マウスにおいて５０％減少していた。
【００４３】
ＰＸ−４７８はＶＨＬ非依存性経路を介してＨＩＦ−１αを阻害する
図８において、ヒト腎臓癌ＲＣＣ４細胞及びＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞を、正常酸素圧（２０％酸素）若しくは低酸素（１％酸素）条件下で、様々な濃度のＰＸ−４７８で１６時間処理した。図８Ａは、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルを核抽出物中で測定した結果を示している。Ｌａｍｉｎ Ａは添加対照として用いた。図８Ｂは、ＰＧＫからのＨＲＥの複数コピーの制御下で、コントラクト発現しているルシフェラーゼを用いてＨＩＦ−１トランス活性化を測定した結果を示している。ウミシイタケルシフェラーゼを形質移入効率を正確にするために同時形質移入した。データは、平均±ＳＥで表した。＊は、同条件下の未処理サンプルから有意な差があることを示している（ｐ＝<０．０１）。ＶＨＬ遺伝子を欠いたヒト腎臓癌細胞（ＲＣＣ４）、及びＶＨＬ遺伝子が置換されているＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞は、ＰＸ−４７８によるＨＩＦ−１αの阻害メカニズムを検討するために用いた。ＲＣＣ４細胞は、正常酸素圧下でも高レベルのＨＩＦ−１αタンパク質を発現しており、一方、ＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞は、図８Ａに示したように、正常酸素圧下で低レベルのＨＩＦ−１αタンパク質を発現していた。ＰＸ−４７８は、正常酸素圧（ＩＣ５０＝５．１±２．０μＭ）及び低酸素（ＩＣ５０＝１６．９±１．９μＭ）の両方の条件下で、ＲＣＣ４細胞中のＨＩＦ−１αタンパク質を阻害し、これはＰＸ−４７８がＶＨＬ経路に非依存的にＨＩＦ−１αを減少することを示唆している。ＰＸ−４７８は、ＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞中の低酸素誘導性ＨＩＦ−１αも阻害し、ＩＣ５０値は１８．１±４．０μＭであった。
【００４４】
図８Ｂに示したように正常酸素圧、及び低酸素の両方の条件下でＲＣＣ４細胞中のＨＩＦ−１のトランス活性化も有意に阻害され、ＩＣ５０値はそれぞれ１２．５±２．５μＭ、及び１０．１±１．２μＭであり、これはＰＸ−４７８がＶＨＬ経路とは非依存的に働くことを確証するものである。ＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞は、低酸素誘導性ＨＩＦ−１トランス活性の阻害に対してＩＣ５０値は１３．５±１．３μＭであったが、ＭＣＦ−７細胞及びＨＴ−２９細胞と同様に、ＰＸ−４７８に対して同様な反応を示した。また、ＰＸ−４７８は、非常に低レベルではあるが、正常酸素圧におけるトランス活性化には影響を及ぼさなかった。
【００４５】
ＰＸ−４７８はチオレドキシン還元酵素を阻害する
我々の以前の研究によって、チオレドキシンを介したレドックスシグナル伝達の阻害は、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルを減少し、ＨＩＦ−１下流標的であるＶＥＧＦ及びｉＮＯＳのレベルの減少を導くＨＩＦ−１トランス活性化を減少することが可能であると示された。従って我々は、０若しくは１０μＭ ＰＸ−４７８の存在下で、正常酸素圧（２０％酸素、Ｎ）若しくは低酸素（１％酸素、Ｈ）で１６時間さらしたＨＴ−２９細胞における、チオレドキシン還元酵素活性に対するＰＸ−４７８の影響を検討した。細胞を溶解し、チオレドキシン還元酵素活性を測定した。＊は、正常酸素条件下の未処理対照から有意な差があることを示している。ＢＬＤは以下のアッセイの検出限界を表示している。データは、二組ずつ少なくとも２回の実験から平均±ＳＥで表した。１０μＭ ＰＸ−４７８でのＭＦＣ−７細胞の処理は、正常酸素圧においてチオレドキシン還元酵素活性を４０％も有意に減少した（ｐ＝<０．００１）。低酸素でも同程度までチオレドキシン還元酵素活性を有意に減少したが、チオレドキシン還元酵素活性は、低酸素条件下での１０μＭ ＰＸ−４７８での処理の後、アッセイの検出限界以下まで減少した。
【００４６】
低酸素誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）は、腫瘍の発展と進行において主要な役割を担っていると言える。理論に縛られることは望まないが、なぜならＨＩＦ−１は、有害な環境下で、及び放射線療法や化学療法などに反応して、細胞の生存を可能にするために重要な役割を担っているタンパク質産物をコード化している、４０以上の標的遺伝子の発現を調節しているからである。これらは、腫瘍血管新生で必須であるＶＥＧＦ、腫瘍細胞生存を促進するインシュリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、グルコース輸送体１及び２、及びアルドラーゼＡ及びＣ、ヘキソキナーゼ１及び３、ラクターゼ、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）Ａ及びＰＧＫなどの解糖系酵素をコード化している遺伝子を含む。多くのヒト腫瘍では、腫瘍内低酸素、及び重要な発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子に影響を及ぼす遺伝的変化を原因としてＨＩＦ−１αタンパク質の過剰発現が見られた。また、ＨＩＦ−１αの過剰発現は、治療の失敗と死亡率に相関している。しかしながら、ＨＩＦ−１活性の損失は、腫瘍成長、血管新生、及び異種移植片のエネルギー代謝において非常にマイナスの影響を及ぼす。従って、ＨＩＦ−１の阻害は正常細胞を超えて腫瘍細胞の選択的な死滅を導くことが可能であるので、ＨＩＦ−１の阻害は癌治療法に対して有望な新規アプローチとなることを意味している。
【００４７】
我々は、ＰＸ−４７８が、正常酸素圧条件下でより、低酸素条件下の細胞増殖を有意な程度で阻害することを示した。低酸素は一般的に放射線療法及び化学療法の両方に対して抵抗性を引き起こすので、これは重要な発見である。従って我々は、ＨＩＦ経路に対するＰＸ−４７８の影響を検討した。ＰＸ−４７８は、ＨＩＦ−１αタンパク質を阻害し、その結果ＨＩＦ−１トランス活性化、及び下流標的遺伝子ＶＥＧＦの発現の減少を導いた。ＰＸ−４７８はさらに、毒性のない投与量でｉｎ ｖｉｖｏにおいてＨＩＦ−１αを減少した。興味深いことに、この阻害作用は、ＨＩＦ−１α安定化を制御しているとして最もよく研究されているＶＨＬ経路とは非依存的に生じることが示された。腎臓癌の８０％以上がＶＨＬの不活性化変異、若しくはＶＨＬの完全欠損を示しているので、これは重要な発見である。しかしながら、Ｐ５３腫瘍抑制経路、及びＰＩ３ＫやＭＡＰＫ経路を介した腫瘍シグナル伝達を含む多数の他の要素が、ＨＩＦ−１αタンパク質に影響を及ぼすことが示されていた。
【００４８】
興味深いことに、最近のいくつかの研究によって、ＶＨＬ非依存的な方法によるＨＩＦ−１経路の間接的な阻害が報告された。これらは、ＬＹ２９４００２を用いたＰＩ３Ｋの阻害、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）を用いた分子シャペロンＨＳＰ９０の阻害、及びＰＸ−１２やプレウロチン（ｐｌｅｕｒｏｔｉｎ）によるレドックスシグナル伝達の阻害を含む。実は、チオレドキシン還元酵素活性は、本研究において、ＨＩＦ−１α阻害とよく相関したＰＸ−４７８の濃度で著しく減少されることが示された。
【００４９】
チオレドキシン還元酵素は、レドックスタンパク質チオレドキシン（Ｔｒｘ−１）のＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒するセレノシステイン含有フラボタンパク質である。従って、チオレドキシンの活性はチオレドキシン還元酵素に依存している。Ｔｒｘ−１の過剰発現は、活動的な腫瘍成長、アポトーシスの阻害、及び最近の研究よりＨＩＦ−１経路を介した血管新生の増加、と連結していた。そのレドックス活性を介して、Ｔｒｘ−１は、例えばアポトーシスシグナル調節キナーゼ−１（ＡＳＫ−１）、及びプロテインキナーゼＣ、α、δ、ε、ζなどの酵素の活性を制御しており、ＤＮＡ結合、及びＮＦ−κＢ、グルココルチコイド受容体、ｐ５３を含む転写因子のトランス活性化活性を増加する。ヒトＴｒｘ−１を形質移入したマウスＷＥＨＩ７．２リンパ腫細胞は免疫不全ｓｃｉｄマウスにおいて、ベクターのみを形質移入した細胞を比較して、より素早く増殖し、自発的な薬剤誘導性アポトーシスをあまりしない腫瘍を形成した。レドックス不活性変異Ｔｒｘ−１は、優性阻害（ドミナントネガティブ）として働き、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞及びＷＥＨＩ７．２細胞の増殖を阻害する。多くの癌においてＴｒｘ−１発現が増加している。より最近では、増加したＴｒｘ−１レベルは、胃癌における減少したアポトーシスと患者の生存率に、及び非小細胞肺癌における減少した患者生存率に相関していた。
【００５０】
しかしながら、Ｔｒｘ−１シグナル伝達がＨＩＦ−１経路にどのように影響を及ぼすかという正確なメカニズムは、未だ明確ではない。以前の研究では、Ｔｒｘ−１が、二重作用ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼ及びレドックス制御タンパク質であるレドックス−因子−１（Ｒｅｆ‐１）を介したＨＩＦ−１トランス活性と同様に、ＨＩＦ−１αタンパク質安定性にも影響を及ぼすと示唆された。Ｔｒｘ−１は、Ｒｅｆ−１を直接還元し、転写コアクチベーター複合体Ｃｒｅｂ結合タンパク質（ＣＢＰ）／ｐ３００の、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインへの結合を促進し、ＨＩＦ−１トランス活性化の増加を導く。しかしながら、このプロセスの阻害は、少なくとも部分的には説明できたが、本研究で観察されたＨＩＦ−１αトランス活性化の阻害に対する、Ｔｒｘ−１の阻害で見られたＨＩＦ−１αタンパク質レベルの減少を説明はしていない。
【００５１】
最近の研究によって、Ｔｒｘ−１は、腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮに結合及び阻害し、ＡＫＴを介したＰＩ３Ｋ経路の活性化を導くことが示された。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は、ＨＩＦの安定化及び活性化に関与している、及びＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２もＶＨＬ非依存的な方法でＨＩＦ−１αタンパク質を減少する、という発見の観点から、Ｔｒｘ−１は、この経路を介してＨＩＦ−１αに影響を及ぼすことが可能である。しかし最近の研究によって、これは細胞タイプ依存性であり、ＨＩＦ活性化の下流に若しくはパラレルな経路に位置していると示唆された。我々は最近この可能性を検討している。
【００５２】
要約すると、我々は、ＰＸ−４７８が、低酸素誘導性ＨＩＦ−１αタンパク質、ＨＩＦ−１トランス活性化、及び下流標的ＶＥＧＦの発現を阻害する新規抗癌因子であることを示した。阻害作用は薬剤除去後４時間まで続いた。ＰＸ−４７８は、ＶＨＬ非依存的な方法で、恐らくチオレドキシン還元酵素の阻害を介して働く。ＰＸ−４７８はｉｎ ｖｉｖｏでＨＩＦ−１αタンパク質も減少した。従って、ＰＸ−４７８は正常細胞を超えてがん細胞の選択的な死滅を導く可能性がある有望な抗癌因子であることを意味している。
【００５３】
最近、いくつかの薬剤はＨＩＦ−１複合体を間接的に阻害することが報告された。上述したように、ＨＳＰ９０阻害剤ゲルダナマイシンは、ｐＶＨＬ非依存性メカニズムによってＨＩＦ−１αタンパク質を阻害することが報告された。高処理スクリーニングアプローチを用いて、多くのカンプトテシン類縁体が、ＨＩＦ−１αタンパク質とトランス活性化の阻害剤として同定された。しかし、これらの化合物が、特異的なＨＩＦ−１阻害剤というよりはむしろトポイソメラーゼＩ阻害を介した一般的な転写を単純に阻害するかどうかは明らかではない。ＤＸ−２−１（カルボマイシン誘導体）も、同じスクリーニングを用いて同定されたが、ＨＩＦ−１を加えた多数の転写因子に影響を及ぼすと知られている。我々は、ＨＩＦ−１αタンパク質、ＨＩＦ−１トランス活性化、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの低酸素誘導性ＶＥＧＦ産生とｉｎ ｖｉｖｏでの低酸素誘導性ＨＩＦ−１αタンパク質産生の阻害剤として、チオレドキシン−１レドックスシステムの２つの阻害剤であるＰＸ−１２及びプレウロチン（ｐｌｅｕｒｏｔｉｎ）も同定した。
【００５４】
ＰＸ−４７８は、Ｐａｎｃ−１ヒト膵臓癌（図１０に示した）、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（図１１に示した）、ヒト前立腺癌（図１２に示した）、及びＨＴ−２９大腸癌細胞（図１３に示した）に対して影響を及ぼした。
【００５５】
図１４は、ＨＴ−２９腫瘍異種移植片ＨＩＦ−１αに対するＰＸ−４７８の影響を説明したものである。
【００５６】
図１５は、血漿ＶＥＧＦレベルに対するＰＸ−４７８の影響を説明したものである。
本発明は、このような化合物を含む薬学的組成物にも関するものである。前記組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、水溶液、アジュバンド、若しくは治療を必要とする患者を治療するために有用である別の化合物の１若しくはそれ以上と共に、このような化合物の１若しくはそれ以上を有するものである。適切な組成物は、静脈内注入として投与された前記化合物の１若しくはそれ以上を含む緩衝溶液も含む。本発明は、このような化合物の使用を有する医学的な治療方法を含む。前記方法は、放射線療法若しくは化学療法などの、特定な疾患を治療するために有用な他の治療方法と共にこのような化合物を用いる工程も有している。
【００５７】
好ましい実施例を詳細に記載したが、添付した特許請求の範囲の本質若しくは範囲から逸脱することなく、様々な変更がこれらの実施例に対してなされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
以下に続く図面の簡単な説明と本発明の詳細な説明によって、本発明の様々な観点と用途が当業者に明らかになるであろう。
【図１】図１は、本発明による化合物を図示したものである。
【図１Ａ】図１Ａは、ＰＸ−４７８ Ｎ−オキシド及びＰＸ−４７８ Ｎ−オキシド塩酸塩の化学構造を図示したものである。
【図２】図２は、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図３】図３は、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−１βタンパク質レベルに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図４Ａ】図４は、ＨＩＦ−１トランス活性化に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものであり、図４Ａは、ＭＣ−７ヒト乳癌におけるＨＩＦ−１トランス活性化を図示したものである。
【図４Ｂ】図４は、ＨＩＦ−１トランス活性化に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものであり、図４Ｂは、ＨＴ−２９ヒト大腸癌におけるトランス活性化を図示したものである。
【図５】図５は、ＶＥＧＦに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図６】図６は、阻害後のＨＩＦ−１αタンパク質の回復を図示したものである。
【図７】図７は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図８Ａ】図８は、ＰＸ−４７８の影響に対するＶＨＬの影響を図示したものであり、図８Ａは、核抽出物におけるＨＩＦ−１αタンパク質レベルを図示したものである。
【図８Ｂ】図８は、ＰＸ−４７８の影響に対するＶＨＬの影響を図示したものであり、図８Ｂは、ＰＧＫからのＨＲＥの複数コピーの制御下でのＨＩＦ−１トランス活性化を図示したものである。
【図９】図９は、チオレドキシン還元酵素に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１０】図１０は、Ｐａｎｃ−１ヒト膵臓癌に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１１】図１１は、ＭＣＦ−７ヒト乳癌に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１２】図１２は、ＰＣ−３ヒト前立腺癌に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１３】図１３は、ＨＴ−２９大腸癌に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１４】図１４は、ＨＴ−２９腫瘍異種移植片のＨＩＦ−１αに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１５】図１５は、血漿ＶＥＧＦレベルに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−オキシド及びその誘導体の化合物、組成物、及び処方に関するものであり、特に低酸素誘導性因子の阻害剤としてのそれらの効果により、病状を治療するのに有用であるＮ−オキシド及びその誘導体に関するものである。本発明は、治療を必要としている患者を、そのような化合物、組成物、及び処方を含む薬学的な処方で治療する方法を含む。本発明の特に有用な観点は、ＶＥＧＦに関連した疾患に影響を与えるＶＥＧＦ形成を阻害する、本発明の化合物、組成物、及び処方の能力である。
【背景技術】
【０００２】
クロランブシル誘導体は、以前、米国特許番号第５，６０２，２７８号（‘２７８特許）に記載されており、開示された全体の内容はこの参照により本明細書に組み込まれる。この‘２７８特許は、低酸素環境下でのクロランブシルとそのＮ−オキシド誘導体の使用方法を記載しており、より具体的には、そのような反応性条件を作るヒドララジンとの組み合わせにおけるクロランブシルに関して記載している。しかしながら、低酸素誘導性因子と関連した一連の疾患の治療における腫瘍状態の複雑さとＮ−オキシド誘導体の価値は、‘２７８特許では十分に評価されていなかった。
【０００３】
多数の人が、この因子が低酸素腫瘍細胞に対する選択的な毒性を提供するかどうかを決定するために、クロランブシルのＮ−オキシド誘導体の研究を行った。いくつかの研究では、この誘導体は低酸素下で選択的な毒にはならないため、クロランブシルのＮ−オキシドは抗腫瘍因子としては無効であると報告された。他の研究では、クロランブシルのＮ−オキシドは、クロランブシルの価値を超える低酸素選択性の増強を示さないと報告された。しかしながら、‘２７８特許はクロランブシルとその転位産物は、低酸素環境を作るヒドララジンとともに投与した場合、効果的であったことを実証した。
【０００４】
本発明は、本発明の化合物を含む薬学的な処方に関するものである。前記処方は、そのような化合物の１若しくはそれ以上とともに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、水溶液、アジュバント、或いは様々な病状を治療するのに有用である別の化合物の１若しくはそれ以上も有するものである。
【０００５】
本発明は、そのような化合物の使用を有する治療の方法も含む。前記方法は、その様な化合物とともに、他の治療方法を用いる工程も有するものである。
【発明の開示】
【発明の効果】
【０００６】
本発明の１観点は、Ｎ−オキシド及びその誘導体である窒素マスタード化合物に関連するものである。これらの化合物は、以下に記載した一般式を有し、様々な目的に対して用いられる。
【０００７】
【化４】
【０００８】
ここにおいて、Ｒはアルキル、アリル、アラルキル、若しくは例えばＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−、Ｃ６Ｈ５ＯＣＨ２ＣＨ２−、Ｃ６Ｈ５ＣＨ２−、ＣＨ３（ＣＨ２）３ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、若しくは以下のいずれか１つ、
【０００９】
【化５】
【００１０】
【化６】
【００１１】
【化７】
【００１２】
などのそれらの誘導体である。
【００１３】
本発明は、上記の化合物の塩類にも関するものである。前記塩類は、上記に記載した式を一般的に有し、前記塩類は、ＨＣＬ、アセテート、ＴＦＡ、トシレート、若しくはピクリン酸塩のいずれかであり、ここにおいてＲは上述したものである。
【００１４】
本発明の別の観点としては、ＨＩＦ、特にＨＩＦ−１αを阻害することによる疾患の治療である。本発明の化合物、組成物、若しくは処方で治療される疾患のごくわずかは、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）若しくは新血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）に関連した疾患を含む。治療されるＨＩＦに関連した疾患は、脈絡及び網膜新血管形成、年齢関連性黄斑変性症、関節疾患、炎症、神経変性疾患、及び虚血性再灌流（ｎｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）損傷を含む。
【００１５】
本発明の別の観点は、そのような化合物を含む薬学的組成物に関するものである。前記組成物は、そのような化合物の１若しくはそれ以上とともに、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、水溶液、アジュバント、若しくは様々な病状を治療するのに有用な別の化合物の１若しくはそれ以上も有するものである。
【００１６】
本発明は、そのような化合物の使用を有する医療方法を含む。前記方法は、そのような化合物の使用とともに、他の医療方法も有するものである。
【００１７】
‘２７８特許は、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏのクロランブシルのＮ−オキシド誘導体（ＣＨＬＮ−Ｏ）と、クロランブシルのヒドロキシルアミン誘導体のＮ−オキシド誘導体（ＣＨＬ−ＨＤ）の結果を記載していた。両方の化合物は、低酸素下で酵素の減少を伴ったより大きな毒性を有していた。その様な生物学的活性は、他の報告された結果を考慮しても、それらの分子構造を考慮しても、予想外であった。さらに、ＣＨＬＮ−ＮとＣＨＬ−ＨＤの両方は、安定であり、最小ｉｎ ｖｉｖｏ毒性を生産した。この驚くべきｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏ活性と最小ｉｎ ｖｉｖｏ毒性は、図１に示された一般的な式の化合物が低酸素腫瘍細胞を治療するための薬学的な処方に有用であることを示していた。しかしながら、腫瘍の比較的小さな部分は、ある所定時間、低酸素状況下にある。さらに、報告された唯一のｉｎ ｖｉｖｏデータは、クロランブシル誘導性４［ｐ−（Ｎ−２−クロロエトキシ Ｎ−２ クロロエチルアミノ）フェニル］ブタン酸に関連していた。さらに、そこで議論されていたクロランブシル誘導体の、ＨＩＦ、血管新生、解糖、赤血球新生（ｅｎｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）、アポトーシス、ＶＥＧＦ若しくはＨＩＦに対する影響はほとんど理解されていなかった。
【００１８】
低酸素の領域がある固形腫瘍は、最も攻撃的で治療が困難な腫瘍であるとして長く認識されていた。低酸素に対する細胞性反応は、解糖の増加、アポトーシスの阻害、及び血管新生と転移の増加を含み、これは、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βサブユニットのヘテロ二量体である、低酸素誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）転写因子を通じて仲介される。ＨＩＦ−１αのレベルはＨＩＦ−１の活性を制御すると示され、ヒト腫瘍の範囲で過剰発現しているので、ＨＩＦ−１αは化学療法の魅力的な標的である。
【００１９】
ＰＸ−４７８（Ｓ−２−アミノ−３−［４’−Ｎ，Ｎ，−ｂｉｓ（２−クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシドジヒドロクロライド）、若しくはメルファランＮ−オキシド、及びそれらの誘導体は、ＨＩＦ−１αタンパク質の低酸素誘導性増加を著しく減少するが、ＨＩＦ−１βには影響を及ぼさず、ＨＩＦ−１トランス活性化を阻害し、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞とヒト大腸癌ＨＴ−２９細胞の両方における血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）と誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）などの下流標的遺伝子の発現を減少する。ＨＩＦ−１αの分解を制御する活性フォン・ヒッペル・リンドウタンパク質（ｐＶＨＬ）が欠損している、ヒト腎臓細胞癌（ＲＣＣ４細胞）、及び活性ｐＶＨＬが再導入されたＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞は、ＰＸ−４７８がｐＶＨＬ経路非依存的に働くことを示すために使用された。従って、ＰＸ−４７８は、ＨＩＦ−１経路の第１の特異的な阻害剤の１つであり、ＨＩＦ阻害因子の有望な新しい種類である。
【００２０】
ＨＩＦ−１は、酸素制御ＨＩＦ−１α若しくはＨＩＦ−２αと、恒常的に発現したＨＩＦ−１βとのヘテロ二量体であり、それは解糖、赤血球形成、アポトーシス耐性、及び血管新生促進に関与する広範囲の遺伝子の転写を活性化する。
【００２１】
ＨＩＦ−１の活性は、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αサブユニットのレベルで主に制御されているように見える。酸素依存性分解ドメイン（ＯＤＤ）における特異的プロリン残基（ヒトＨＩＦ−１αにおけるＰｒｏ５６４及びＰｒｏ４０２）がプロリル４−ヒドロキシラーゼ（水酸化酵素）ファミリーによってヒドロキシル化されている場合、正常酸素圧条件下のＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αのレベルは非常に低く維持されている。これは、フォン・ヒッペル・リンドウ（ｐＶＨＬ）タンパク質がＨＩＦ−１αのＯＤＤに結合することを可能にし、それはＨＩＦ−１αをユビキチン化し、最終的にはそのプロテオソーム分解を生じさせるＥ３ユビキチンリガーゼを活性化する複合体の補充をもたらすものである。プロリル４−ヒドロキシラーゼは、Ｏ２、Ｆｅ２＋、及び２−オキソグルタル酸若しくはアスコルビン酸に対して絶対条件を示す。従って、低酸素下（<５％酸素）では、プロリルヒドロキシラーゼは阻害され、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルは増加し、恒常的に発現したＨＩＦ−１βサブユニットを結合し複合体を形成し、次にＨＩＦ−１応答性遺伝子のプロモーター領域中の低酸素反応性因子（ＨＲＥ）ＤＮＡ配列に結合し、それらの転写を活性化する。
【００２２】
腫瘍抑制因子ｐ５３を含む他の経路でもＨＩＦ−１α分解を制御し、この腫瘍因子ｐ５３はＨＩＦ−１αに結合し、別のＥ３ユビキチンリガーゼであるＭＤＭ２の補充による両方のタンパク質の分解を生じる。分子シャペロンである熱ショックタンパク質−９０（ＨＳＰ９０）阻害剤ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）は、ＨＩＦ−１αタンパク質の低酸素誘導性増加を阻害するため、ＨＳＰ９０タンパク質はＨＩＦ−１α分解に関わっている可能性がある。
【００２３】
とりわけ、インスリン、インスリン様増殖因子１及び２、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子２、インターロイキン１β、腫瘍壊死因子α、トランスフォーミング成長因子β１、及び血小板由来成長因子を含む増殖因子及びサイトカインは、正常酸素圧条件下でＨＩＦ−１αのレベルを安定化及び増加することができる。これらの因子は、正確なメカニズムはまだ明らかではないが、例えばマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）やフォスファチジルイノシトール−３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ経路などの共通の細胞キナーゼ経路を介してＨＩＦ−１αを安定化する。さらに、タンパク質安定化のみでは正常酸素圧条件下でＨＩＦ−１を活性化するためには不十分である。完全な活性化は、（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を介した）翻訳後タンパク質リン酸化、ＨＳＰ９０によって仲介される核輸送、ＨＩＦ−１βとの二量体化、ＤＮＡ結合、及び例えばＣｒｅｂ結合タンパク質（ＣＢＰ）／ｐ３００（ヒトＨＩＦ−１αのＡｓｎ８０３上のアスパラギニルヒドロキシル化によって仲介される）、ＳＲＣ−１及びＴＩＦ２などの転写性補助因子（ｃｏ−ｆａｃｔｏｒ）の補充、を必要とする。ＨＩＦ−１αとｐＶＨＬと相互作用する転写リプレッサーであるＦＩＨ（ＨＩＦ−１阻害因子）も最近記載されていた。しかしながら、転写後タンパク質リン酸化と活性化は、ＨＩＦ−１αが安定化され、細胞内で適切なレベルを達成した場合にのみ生じることができる。多くの研究により、レドックス依存性過程がＨＩＦ−１複合体の安定化と活性化の両方に関連していることが示唆された。我々は最近、小レドックスタンパク質チオレドキシン−１が、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルを増加し、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の産生の増加、さらには血管新生の増加を導くことを報告した。レドックス不活性変異チオレドキシン−１は、ＨＩＦ−１αタンパク質、ＶＥＧＦ、及び血管新生を減少した。さらに文献１を通じて、因子−１（文献１）がＳＲＣ−１、ＴＩＦ２及びＣＢＰ／ｐ３００の補充を増強したと示され、減少したチオレドキシンは低酸素細胞の核へ転座し、ＨＩＦ−１αへのレドックスシグナルを伝達するというモデルが提案された。
【００２４】
ＨＩＦ−１αタンパク質は、広範囲にわたるヒト原発性腫瘍に見られるが、正常組織においては非常に低いレベルである。ＨＩＦ−１αの癌に対する重要性は、ＨＩＦ−１αレベルの上昇を導くＶＨＬ遺伝子の両対立遺伝子の機能損失と共に、腎臓細胞癌、クロム親和性細胞腫、及び中枢神経系のヘミングリア芽腫（ｈｅｍｉｎｇｉｏｂｌａｓｔｏｍａ）などの腫瘍が高確率で発生することよって示されている。また、散発性腎臓細胞癌のほとんどのケースは、ＶＨＬ遺伝子機能の早期損失と、ＨＩＦ−１αレベルの増加と関連している。腎臓癌に由来する無傷ＶＨＬ遺伝子を細胞へ再導入すると、ＨＩＦ−１αは正常酸素圧レベルまで回復し、腫瘍形成能が減少する。ＨＩＦ−１αレベルはまた、変異を有する癌細胞を増加し、若しくはＰＴＥＮを欠落させる。いくつかの腫瘍で発現したＨＩＦ−２αも、マクロファージに関連した骨髄及び腫瘍において見出される。
【００２５】
低酸素に対する腫瘍の成長反応の調節におけるＨＩＦ−１αの役割に起因して、それは抗腫瘍薬剤の開発において重要な標的となっている。米国特許第５，６０２，２７８号には、ＰＸ−４７８（Ｓ−２−アミノ−３−［４’−Ｎ，Ｎ−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシドジヒドロクロライド）が、低酸素環境下で選択的に活性化される潜在的な因子として記載されている。しかし、４［ｐ−（Ｎ−２−クロロエトキシＮ−２クロロエチルアミノ）フェニル］ブタン酸は、還元性環境（例えば、還元酵素の存在下）において選択的に低酸素細胞を殺すことが示されていた。我々は、還元酵素の非存在下でのその抗腫瘍作用に起因する、ＨＩＦ−１αに対するＰＸ−４７８の影響とその下流標的を研究した。我々は、ＰＸ−４７８処理はＨＩＦ−１αタンパク質の減少（ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方）、及びその後に続くＨＩＦ−１複合体のトランス活性化を減少し、チオレドキシン還元酵素の阻害を介していると思われる下流標的のレベルの減少を導くことを示した。我々の研究によって、ＰＸ−４７８の活性は、ＶＨＬ経路から独立していることも示された。これらの研究は、ＨＩＦのＰＸ−４７８阻害が還元酵素を必要としないことを示していた。従って、ＰＸ−４７８は、ＨＩＦ経路の最初の阻害剤の１つであり、有望な新しい抗腫瘍因子であることを意味している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
方法
細胞培養、及び低酸素処理
ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞、及びＨＴ−２９大腸癌細胞は、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｙｐｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。ヒト腎臓細胞癌ＲＣＣ４細胞、及び野生型フォン・ヒッペル・リンドウ（ＶＨＬ）遺伝子を形質移入したＲＣＣ４／ＶＨＬは、Ｄｒ．Ｐｅｔｅｒ Ｒａｔｃｌｉｆｆｅから入手した。細胞は、３７℃で、湿度９５％、空気５％のＣＯ２インキュベーターにおいて、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清、１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（ＲＣＣ４及びＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞には適している）を添加した培地で培養した。低酸素にさらすために、培養フラスコを様々な時間、３７℃で、５％ＣＯ２／７４％Ｎ２／２１％アルゴンを含有する混合ガスと共に湿度チェンバー内でインキュベートした。酸素レベルは、酸素センサー（製品番号：Ｏｘ１１０、Ｂｉｏｓｐｈｅｒｉｘ、レッドフィールド、ニューヨーク州）を用いてガス層において１％に保った。実験の最後で、細胞は氷冷リン酸緩衝液ｐＨ７．５（ＰＢＳ）で２回洗浄した。ＶＥＧＦレベルを測定するために、各フラスコからの１ｍｌ培養液を処理後取り除き、−８０℃で貯蔵した。
【００２７】
細胞増殖及び生存アッセイ
増殖阻害アッセイは、３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイを用いて以前記載されたように実行した。低酸素条件下での分析のため、プレートを薬剤存在下で１％酸素で１６時間インキュベートし、次に２０％酸素で７２時間の残りの時間、インキュベートした。
【００２８】
ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡ
約１０７細胞は、２００μｌの溶解バッファー（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ７．５）、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、２μｇ／ｍｌ ロイペプチン、０．１ｍＭ バナジン酸ナトリウム、１％ ＮＰ４０、及び０．２％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で１時間４℃で溶解した。溶解液は遠心分離（１５分、４℃、１０，０００ｘｇ）し、上清を回収した。２０μｌの一定分量をタンパク質濃度の分析のために除去し、前記溶解液は必要になるまで−８０℃で貯蔵した。細胞溶解液中のＶＥＧＦは、ｐｇ（ＶＥＧＦタンパク質）／ｍｇ（総タンパク質）として表し、回収された培養液中のＶＥＧＦは、ｐｇ（ＶＥＧＦタンパク質）／ｍｇ（同じフラスコからの細胞中で測定された総細胞タンパク質）で表した。細胞溶解液におけるヒトＶＥＧＦと、培養液に分泌されたＶＥＧＦの量は、製造元取り扱い説明書に従って、ＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１２１アイソフォームを測定するＥＬＩＳＡキット（ヒトＶＥＧＦ−ＥＬＩＳＡ；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス、ミネソタ州）を用いて決定した。血しょう中のマウスＶＥＧＦの量は、製造元取り扱い説明書に従って、マウスＶＥＧＦ１６５及びＶＥＧＦ１２１アイソフォームを測定するＥＬＩＳＡキット（マウスＶＥＧＦ−ＥＬＩＳＡ；Ｒ&Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。
【００２９】
免疫ブロッティング法
核及び細胞質抽出物は、製造元取り扱い説明書に従って、ＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔｓを用いて調整した。ウェスタンブロッティング法は、マウス抗ヒトＨＩＦ−１α（１μｇ／ｍｌ）；マウス抗ヒトＨＩＦ−１β（１μｇ／ｍｌ）；マウス抗ヒトｉＮＯＳ（５μｇ／ｍｌ）；及びヤギ抗ヒトｌａｍｉｎ Ａ（０．５μｇ／ｍｌ）を用いて、以前記載したように実行した。抗マウス、若しくは抗ヤギ西洋ワサビペルオキシダーゼ−共役二次抗体は１：５０００の希釈率で用い、化学発光によって検出され、ブロットはＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて定量した。
【００３０】
ＨＩＦ−１α ｍＲＮＡ測定
Ｔｒｉｚｏｌ抽出法を用いて調製された１５μｇ総ＲＮＡは、１．５％アガロース−ホルムアルデヒドゲルを用いた電気泳動によって分離され、ナイロンメンブレンに転写した。ＲＮＡは、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ ＵＶ クロスリンカーを用いてメンブレンにクロスリンク（架橋結合）した。ヒトＨＩＦ−１αに対する完全長プローブ（ランダムプライマー標識システム（Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでラベルされている）は、ＵＬＴＲＡｈｙｂ ハイブリダイゼーションバッファーを用いてメンブレンにハイブリダイズし、製造元プロトコールに従って洗浄工程を行った。ブロットはＭＤ Ｓｔｏｒｍ ８６０ホスフォイメージャーを用いて画像化し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを用いて定量化した。１８Ｓ ｒＲＮＡに対する完全長ｃＤＮＡプローブは、添加対照として用いた。
【００３１】
低酸素反応性因子レポーターアッセイ
ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）からの低酸素反応性因子（ＨＲＥ）を含むｐＧＬ３ホタルルシフェラーゼ レポータープラスミドは、Ｄｒ．Ｉａｎ Ｓｔｒａｔｆｏｒｄより寄贈された。プラスミドＤＮＡは商業用キットを用いて調整した。空ｐＧＬ３対照プラスミド、及び形質移入（トランスフェクション）効率に対する対象で用いられたプラスミドを含むｐＲＬ−ＣＭＶ ウミシイタケルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａから入手した。細胞は、製造元取扱説明書に従って、ＬｉｐｏＴＡＸＩ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（ほ乳類形質移入試薬：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、テキサス州）を用いて、５μｇのＨＩＦ−１レポータープラスミド、若しくはｐＧＬ３対照プラスミド、及び０．０２５μｇのｐＲＬ−ＣＭＶ ウミシイタケルシフェラーゼプラスミド（形質移入効率のための対照として）で形質移入した。２４時間後、細胞を以前に記載したように低酸素にさらした。ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性は、製造元取扱説明書に従って、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（デュアルルシフェラーゼレポートアッセイ系）を用いて測定した。
【００３２】
免疫染色化学
ＭＦＣ−７及びＭｉａＰａＣａ細胞（０．２ｍｌマトリゲル中に１０７）をｓｃｉｄマウスの横腹に注入した。腫瘍が０．５ｇに到達した時、マウス（１グループに４匹）を１００ｍｇ／ｋｇ ＰＸ−４７８若しくは溶媒対照を（腹腔内注入によって）処理した。４時間後、１ｍｌの血液を各マウスから採取し、マウスは屠殺し、腫瘍を除去し、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、パラフィンで包埋した。切片を、自動化免疫染色装置システムを用いてＨＩＦ−１α（１０μｇ／ｍｌ）若しくはＶＥＧＦ（７μｇ／ｍｌ）に対する抗体で染色した。ＨＩＦ−１α染色の強度は、ＳｉｍｐｌｅＰＣＩプログラムを用いて測定した。
【００３３】
チオレドキシン還元酵素アッセイ
総細胞溶解液は、ＶＥＧＦ ＥＬＩＳＡで記載したように調整した。チオレドキシン還元酵素活性は、Ｂｅｒｇｇｅｎら（１９９９年）が記載したように測定した。簡潔には、０．２ｍｌの一定分量の新鮮アデノシン２’，５’−二リン酸共役アガロースビーズ（ＡＤＰアガロース）（Ｓｉｇｍａ）を、０．２ｍｌの一定分量の上清と１時間、４℃で混合し、内因性チオレドキシンと他の小分子量還元剤を除去した。前記ビーズは次に、２ｘ１ｍｌの、０．１Ｍ ＮａＣｌで１０００ｘｇの再遠心分離によって洗浄し、チオレドキシン還元酵素は、０．５ｍｌの１．０Ｍ ＫＣＬで溶出した。チオレドキシン還元酵素活性は次に、基質として５μＭ ヒトリコンビナントチオレドキシン、及び最終電子受容体として酸化型インシュリンを用いて、３３９ｎｍでＮＡＤＰＨの酸化として測定した。活性は、上清タンパク質のミリグラム当たり、１分間に酸化されるナノモルＮＡＤＰＨとして表した。
【００３４】
免疫組織化学
ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞（１マウス当たりマトリゲル中に１０７細胞）を、エストロゲンペレットを移植されたｓｃｉｄマウスの横腹に皮下的に注入した。腫瘍は０．５ｇまで成長した。次にマウスの腹腔内に、溶媒単独、若しくは１２０ｍｇ／ｋｇ ＰＸ−４７８を入れた。４時間後、腫瘍を切除し、ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した。切片は、自動化免疫染色装置システムを用いて、ＨＩＦ−１α（１０μｇ／ｍｇ；Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｓ）、若しくはＶＥＧＦ（７μｇ／ｍｌ）に対する抗体で染色した。染色は、ＳｉｍｐｌｅＰＣＩ分析ソフトウェアを用いて定量化した。
【００３５】
考察
ＰＸ−４７８は低酸素及び正常酸素圧で阻害作用を示す
ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞及びヒト大腸癌ＨＴ−２９細胞は、正常酸素圧（２０％酸素）若しくは低酸素（１％酸素）条件下、様々な濃度のＰＸ−２７８で、１６時間処理した。次に細胞を薬剤を含まない温かい培地で３回洗浄し、７２時間の残りの時間インキュベートした。次にＭＴＴアッセイを行って、増殖阻害作用を決定した。データは、二組ずつ３回の実験から平均±ＳＥで表した。ＰＸ−４７８は、低酸素（１％酸素）及び正常酸素圧（２０％酸素）条件下で増殖阻害作用を示し（ｐ＝<０．０１）、正常酸素圧条件下での増殖阻害作用に対して低酸素条件下の増殖阻害作用の比は、ＭＣＦ−７で１．２５、ＨＴ−２０細胞で１．２であった。以下の表１は、これらの結果を示している；
【００３６】
【表１】
【００３７】
ＰＸ−４７８はＨＩＦ−１αタンパク質を阻害する
ＨＩＦ−１αは、低酸素に対する細胞性反応の重要な調節要素である。従って我々は、ＰＸ−４７８のＨＩＦ−１αタンパク質レベルに対する影響を検討した。図２Ａに示したように、ＰＣ−３前立腺癌細胞、ＭＣＦ−７乳癌細胞、及びＨＴ−２９大腸癌細胞をＰＸ−４７８存在下、低酸素（１％酸素）に１６時間さらした。細胞核抽出物を調製し、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルをウェスタンブロッティング法を用いて測定した。図２に示したように結果は、添加対照としてのｌａｍｉｎ Ａを含む典型的なウェスタンブロットを示した。図２において、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞及びＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞は、ＰＸ−４７８存在下で正常酸素圧（２０％酸素）若しくは低酸素（１％酸素）で１６時間処理した。細胞核抽出物を調製し、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−１βタンパク質のレベルをウェスタンブロッティング法を用いて測定した。ブロットは３回の実験の代表である。Ｌａｍｉｎ Ａは、添加対照として用いた。データは、３回の実験の平均±Ｓ．Ｅ．で表し、（●）はＰＣ−３前立腺癌細胞、（○）はＭＦＣ−７乳癌細胞、及び（▼）はＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞を示している。図２Ａに示されたように、ＰＸ−４７８は、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ−７（図２Ａに示した）及びヒト大腸癌細胞ＨＴ−２９（図２Ｂに示した）における低酸素（１％酸素）誘導性ＨＩＦ−１αタンパク質を阻害し、各細胞のＩＣ５０値はそれぞれ３．５±２．０、及び１７．８±５μＭである。ＨＩＦ−１αタンパク質レベルは、以前に報告されたように、正常酸素圧（２０％酸素）下においては非常に低かったので、影響は見られなかった。しかしながら、正常酸素圧において検出可能なレベルのＨＩＦ−１αタンパク質を示したヒト膵臓癌ＰＣ−３細胞において、ＩＣ５０値は２．５±１．２μＭであった（図示せず）。この細胞株では、低酸素条件下でも同程度のＩＣ５０値が得られた（２．１±２．０μＭ）。
【００３８】
図３Ａ及び３Ｂに示したように、ＰＸ−４７８は、あらゆる細胞株において、ＨＩＦ−１β（図３Ａ及び３Ｂ）若しくはＨＩＦ−１α ｍＲＮＡレベル（図示せず）に対して影響を及ぼさなかった。
【００３９】
ＰＸ−４７８は低酸素誘導性ＨＩＦ−１トランス活性化を阻害する
ＨＩＦ−１トランス活性化は、ＰＧＫからのＨＲＥの複数コピーの制御下で、ルシフェラーゼをコンストラクト発現している一過性形質移入細胞によって測定した。図４Ａは、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞、及び図４Ｂは、ＨＴ−２９ヒト大腸癌（Ｂ）細胞を図示しており、各細胞は、様々な濃度のＰＸ−４７８の存在下、正常酸素圧（２０％酸素）若しくは低酸素（１％酸素）で１６時間処理した。次にＨＩＦ−１トランス活性化は、ＰＧＫからのＨＲＥのいくつかのコピーの制御下で、コンストラクト発現しているホタルルシフェラーゼを用いて測定した。ウミシイタケルシフェラーゼは、形質移入効率の対照として同時形質移入した。データは、３回の実験の平均±ＳＥで表した。＊は、同条件下において、未処理対照から有意な変化があったことを示している（ｐ＝<０．００１）。図４Ｂで示したように、ＨＴ−２９細胞は、図４Ａに示されたようなＭＣＦ−７細胞と比較して、ＨＩＦ−１のトランス活性化の有意な増加が見られた（ＭＣＦ−７細胞が１０．１±１．９倍に対して、ＨＴ−２９細胞１３．９±１．５倍である）（ｐ＝<０．００１）。しかしながら、ＰＸ−４７８は、１０μＭ及び２５μＭのＰＸ−４７８で１６時間処理した後、両方の細胞株における低酸素誘導性のＨＩＦ−１トランス活性化を有意に減少した（ｐ＝<０．００１）。低酸素誘導性トランス活性化の阻害に対するＩＣ５０値は、ＭＣＦ−７細胞では２０．５±１．４μＭ、ＨＴ−２９細胞では２３．１±１．８μＭであった。ＨＩＦ−１トランス活性化は、正常酸素圧下では非常に低く、両細胞株をＰＸ−４７８で処理しても影響がなかった。
【００４０】
ＰＸ−４７８は低酸素誘導性ＶＥＧＦ産生を阻害する
図５Ａ及び５Ｂにそれぞれ示したように、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞及びＨＴ−２９ヒト大腸癌細胞を、ＰＸ−４７８存在下で、正常酸素圧（２０％酸素：黒符号）若しくは低酸素（１％酸素：白符号）で１６時間処理した。次に、丸で表示された細胞溶解液中のＶＥＧＦレベル、若しくは三角で表示された培養液中のＶＥＧＦレベルをＥＬＩＳＡを用いて測定した。データは、３回の実験の平均±ＳＥで表した。＊は、同条件下（正常酸素圧、若しくは低酸素）で未処理対照から有意な差があることを示している（ｐ＝<０．００１）。ＰＸ−４７８は、１０μＭ ＰＸ−４７８で１６時間処理した後、ＭＣＦ−７細胞（図５Ａ）及びＨＴ−２９細胞（図５Ｂ）の両方における低酸素誘導性ＶＥＧＦタンパク質レベルを有意に減少した（ｐ＝<０．０１）。ＩＣ５０値は、ＭＣＦ−７細胞及びＨＴ−２９細胞において、細胞溶解液中のＶＥＧＦに対してはそれぞれ１７．１±４．０μＭ及び１３．５±４．０μＭ、培養液中に分泌されたＶＥＧＦに対してはそれぞれ３．８±２．０μＭ及び１１．５±２．５μＭであった。培養液中に分泌されたＶＥＧＦのレベルは、ＭＣＦ−７細胞において、１０μＭ ＰＸ−４７８で処理した後、正常酸素圧レベルまで減少した。しかしながら、ＭＣＦ−７細胞の細胞溶解液中のＶＥＧＦレベルだけでなく、ＨＴ−２９の細胞溶解液と培養液中に分泌されたＶＥＧＦレベルは、２５μＭ ＰＸ−４７８で処理した後も正常酸素圧レベルにまで戻らなかった。興味深いことに、ＰＸ−４７８は、両細胞株の正常酸素圧におけるＶＥＧＦレベルには影響を及ぼさなかった。
【００４１】
ＨＩＦ−１αタンパク質はＰＸ−４７８除去後４時間まで阻害され続ける
ＰＸ−４７８で細胞を処理した後、どのくらいの時間でＨＩＦ−１αタンパク質が阻害され続けるかを検討するために、図６に示したように、ＭＣＦ−７細胞をＰＸ−４７８で１６時間処理し、次に薬剤を洗い流し、ＨＩＦ−１αの回復を測定した。ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞を１６時間低酸素（１％酸素、Ｈ）にさらし、次に２５μＭ ＰＸ−４７８に最大４時間まで処理した。細胞核抽出物は表示された時間で調製し、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルを測定するためにウェスタンブロッティング法を行った。正常酸素圧（２０％酸素、Ｎ）下で１６時間処理した後のＨＩＦ−１αタンパク質のレベルも対照として示した。ＨＩＦ−１αタンパク質レベルは薬剤の除去から４時間以内に処理前レベルにまで回復した。
【００４２】
ＰＸ−４７８はＨＩＦ−１αタンパク質をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する
ＭＣＦ−７細胞をｓｃｉｄマウスの横腹で異種移植片として増殖した。異種移植片が０．３ｇに到達した時、マウスを溶媒対照若しくは１００ｍｇ／ｋｇ ＰＸ−４７８（図７Ａ及び７Ｂにそれぞれ図示した）で処理した。４時間後、腫瘍を除去し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルを免疫組織化学法を用いて測定した（Ａ及びＢ）。（Ｃ）ＨＩＦ−１α染色強度は、Ｓｉｍｐｌｅ ＰＣＩソフトウェアを用いて定量化した。＊は、対照から有意な差があることを示している（ｐ＝<０．０１）。データは、平均±ＳＥで表した。図７Ａ及び７Ｂに示したように、ｓｃｉｄマウスの横腹で異種移植片として増殖したＭＣＦ−７細胞の処理によって、ＰＸ−４７８処理の４時間後、ＨＩＦ−１αタンパク質のレベルが有意に減少した（ｐ＝<０．００５）ことが示された。ＰＸ−４７８処理細胞中の局在化における染色残存核、及びＨＩＦ−１αのレベルは、図７Ｃに示された未処理対照と比較してＰＸ−４７８処理マウスにおいて５０％減少していた。
【００４３】
ＰＸ−４７８はＶＨＬ非依存性経路を介してＨＩＦ−１αを阻害する
図８において、ヒト腎臓癌ＲＣＣ４細胞及びＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞を、正常酸素圧（２０％酸素）若しくは低酸素（１％酸素）条件下で、様々な濃度のＰＸ−４７８で１６時間処理した。図８Ａは、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルを核抽出物中で測定した結果を示している。Ｌａｍｉｎ Ａは添加対照として用いた。図８Ｂは、ＰＧＫからのＨＲＥの複数コピーの制御下で、コントラクト発現しているルシフェラーゼを用いてＨＩＦ−１トランス活性化を測定した結果を示している。ウミシイタケルシフェラーゼを形質移入効率を正確にするために同時形質移入した。データは、平均±ＳＥで表した。＊は、同条件下の未処理サンプルから有意な差があることを示している（ｐ＝<０．０１）。ＶＨＬ遺伝子を欠いたヒト腎臓癌細胞（ＲＣＣ４）、及びＶＨＬ遺伝子が置換されているＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞は、ＰＸ−４７８によるＨＩＦ−１αの阻害メカニズムを検討するために用いた。ＲＣＣ４細胞は、正常酸素圧下でも高レベルのＨＩＦ−１αタンパク質を発現しており、一方、ＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞は、図８Ａに示したように、正常酸素圧下で低レベルのＨＩＦ−１αタンパク質を発現していた。ＰＸ−４７８は、正常酸素圧（ＩＣ５０＝５．１±２．０μＭ）及び低酸素（ＩＣ５０＝１６．９±１．９μＭ）の両方の条件下で、ＲＣＣ４細胞中のＨＩＦ−１αタンパク質を阻害し、これはＰＸ−４７８がＶＨＬ経路に非依存的にＨＩＦ−１αを減少することを示唆している。ＰＸ−４７８は、ＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞中の低酸素誘導性ＨＩＦ−１αも阻害し、ＩＣ５０値は１８．１±４．０μＭであった。
【００４４】
図８Ｂに示したように正常酸素圧、及び低酸素の両方の条件下でＲＣＣ４細胞中のＨＩＦ−１のトランス活性化も有意に阻害され、ＩＣ５０値はそれぞれ１２．５±２．５μＭ、及び１０．１±１．２μＭであり、これはＰＸ−４７８がＶＨＬ経路とは非依存的に働くことを確証するものである。ＲＣＣ４／ＶＨＬ細胞は、低酸素誘導性ＨＩＦ−１トランス活性の阻害に対してＩＣ５０値は１３．５±１．３μＭであったが、ＭＣＦ−７細胞及びＨＴ−２９細胞と同様に、ＰＸ−４７８に対して同様な反応を示した。また、ＰＸ−４７８は、非常に低レベルではあるが、正常酸素圧におけるトランス活性化には影響を及ぼさなかった。
【００４５】
ＰＸ−４７８はチオレドキシン還元酵素を阻害する
我々の以前の研究によって、チオレドキシンを介したレドックスシグナル伝達の阻害は、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルを減少し、ＨＩＦ−１下流標的であるＶＥＧＦ及びｉＮＯＳのレベルの減少を導くＨＩＦ−１トランス活性化を減少することが可能であると示された。従って我々は、０若しくは１０μＭ ＰＸ−４７８の存在下で、正常酸素圧（２０％酸素、Ｎ）若しくは低酸素（１％酸素、Ｈ）で１６時間さらしたＨＴ−２９細胞における、チオレドキシン還元酵素活性に対するＰＸ−４７８の影響を検討した。細胞を溶解し、チオレドキシン還元酵素活性を測定した。＊は、正常酸素条件下の未処理対照から有意な差があることを示している。ＢＬＤは以下のアッセイの検出限界を表示している。データは、二組ずつ少なくとも２回の実験から平均±ＳＥで表した。１０μＭ ＰＸ−４７８でのＭＦＣ−７細胞の処理は、正常酸素圧においてチオレドキシン還元酵素活性を４０％も有意に減少した（ｐ＝<０．００１）。低酸素でも同程度までチオレドキシン還元酵素活性を有意に減少したが、チオレドキシン還元酵素活性は、低酸素条件下での１０μＭ ＰＸ−４７８での処理の後、アッセイの検出限界以下まで減少した。
【００４６】
低酸素誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）は、腫瘍の発展と進行において主要な役割を担っていると言える。理論に縛られることは望まないが、なぜならＨＩＦ−１は、有害な環境下で、及び放射線療法や化学療法などに反応して、細胞の生存を可能にするために重要な役割を担っているタンパク質産物をコード化している、４０以上の標的遺伝子の発現を調節しているからである。これらは、腫瘍血管新生で必須であるＶＥＧＦ、腫瘍細胞生存を促進するインシュリン様成長因子２（ＩＧＦ２）、グルコース輸送体１及び２、及びアルドラーゼＡ及びＣ、ヘキソキナーゼ１及び３、ラクターゼ、デヒドロゲナーゼ（脱水素酵素）Ａ及びＰＧＫなどの解糖系酵素をコード化している遺伝子を含む。多くのヒト腫瘍では、腫瘍内低酸素、及び重要な発癌遺伝子及び腫瘍抑制遺伝子に影響を及ぼす遺伝的変化を原因としてＨＩＦ−１αタンパク質の過剰発現が見られた。また、ＨＩＦ−１αの過剰発現は、治療の失敗と死亡率に相関している。しかしながら、ＨＩＦ−１活性の損失は、腫瘍成長、血管新生、及び異種移植片のエネルギー代謝において非常にマイナスの影響を及ぼす。従って、ＨＩＦ−１の阻害は正常細胞を超えて腫瘍細胞の選択的な死滅を導くことが可能であるので、ＨＩＦ−１の阻害は癌治療法に対して有望な新規アプローチとなることを意味している。
【００４７】
我々は、ＰＸ−４７８が、正常酸素圧条件下でより、低酸素条件下の細胞増殖を有意な程度で阻害することを示した。低酸素は一般的に放射線療法及び化学療法の両方に対して抵抗性を引き起こすので、これは重要な発見である。従って我々は、ＨＩＦ経路に対するＰＸ−４７８の影響を検討した。ＰＸ−４７８は、ＨＩＦ−１αタンパク質を阻害し、その結果ＨＩＦ−１トランス活性化、及び下流標的遺伝子ＶＥＧＦの発現の減少を導いた。ＰＸ−４７８はさらに、毒性のない投与量でｉｎ ｖｉｖｏにおいてＨＩＦ−１αを減少した。興味深いことに、この阻害作用は、ＨＩＦ−１α安定化を制御しているとして最もよく研究されているＶＨＬ経路とは非依存的に生じることが示された。腎臓癌の８０％以上がＶＨＬの不活性化変異、若しくはＶＨＬの完全欠損を示しているので、これは重要な発見である。しかしながら、Ｐ５３腫瘍抑制経路、及びＰＩ３ＫやＭＡＰＫ経路を介した腫瘍シグナル伝達を含む多数の他の要素が、ＨＩＦ−１αタンパク質に影響を及ぼすことが示されていた。
【００４８】
興味深いことに、最近のいくつかの研究によって、ＶＨＬ非依存的な方法によるＨＩＦ−１経路の間接的な阻害が報告された。これらは、ＬＹ２９４００２を用いたＰＩ３Ｋの阻害、ゲルダナマイシン（ｇｅｌｄａｎａｍｙｃｉｎ）を用いた分子シャペロンＨＳＰ９０の阻害、及びＰＸ−１２やプレウロチン（ｐｌｅｕｒｏｔｉｎ）によるレドックスシグナル伝達の阻害を含む。実は、チオレドキシン還元酵素活性は、本研究において、ＨＩＦ−１α阻害とよく相関したＰＸ−４７８の濃度で著しく減少されることが示された。
【００４９】
チオレドキシン還元酵素は、レドックスタンパク質チオレドキシン（Ｔｒｘ−１）のＮＡＤＰＨ依存性還元を触媒するセレノシステイン含有フラボタンパク質である。従って、チオレドキシンの活性はチオレドキシン還元酵素に依存している。Ｔｒｘ−１の過剰発現は、活動的な腫瘍成長、アポトーシスの阻害、及び最近の研究よりＨＩＦ−１経路を介した血管新生の増加、と連結していた。そのレドックス活性を介して、Ｔｒｘ−１は、例えばアポトーシスシグナル調節キナーゼ−１（ＡＳＫ−１）、及びプロテインキナーゼＣ、α、δ、ε、ζなどの酵素の活性を制御しており、ＤＮＡ結合、及びＮＦ−κＢ、グルココルチコイド受容体、ｐ５３を含む転写因子のトランス活性化活性を増加する。ヒトＴｒｘ−１を形質移入したマウスＷＥＨＩ７．２リンパ腫細胞は免疫不全ｓｃｉｄマウスにおいて、ベクターのみを形質移入した細胞を比較して、より素早く増殖し、自発的な薬剤誘導性アポトーシスをあまりしない腫瘍を形成した。レドックス不活性変異Ｔｒｘ−１は、優性阻害（ドミナントネガティブ）として働き、ヒト乳癌ＭＣＦ−７細胞及びＷＥＨＩ７．２細胞の増殖を阻害する。多くの癌においてＴｒｘ−１発現が増加している。より最近では、増加したＴｒｘ−１レベルは、胃癌における減少したアポトーシスと患者の生存率に、及び非小細胞肺癌における減少した患者生存率に相関していた。
【００５０】
しかしながら、Ｔｒｘ−１シグナル伝達がＨＩＦ−１経路にどのように影響を及ぼすかという正確なメカニズムは、未だ明確ではない。以前の研究では、Ｔｒｘ−１が、二重作用ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼ及びレドックス制御タンパク質であるレドックス−因子−１（Ｒｅｆ‐１）を介したＨＩＦ−１トランス活性と同様に、ＨＩＦ−１αタンパク質安定性にも影響を及ぼすと示唆された。Ｔｒｘ−１は、Ｒｅｆ−１を直接還元し、転写コアクチベーター複合体Ｃｒｅｂ結合タンパク質（ＣＢＰ）／ｐ３００の、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインへの結合を促進し、ＨＩＦ−１トランス活性化の増加を導く。しかしながら、このプロセスの阻害は、少なくとも部分的には説明できたが、本研究で観察されたＨＩＦ−１αトランス活性化の阻害に対する、Ｔｒｘ−１の阻害で見られたＨＩＦ−１αタンパク質レベルの減少を説明はしていない。
【００５１】
最近の研究によって、Ｔｒｘ−１は、腫瘍抑制タンパク質ＰＴＥＮに結合及び阻害し、ＡＫＴを介したＰＩ３Ｋ経路の活性化を導くことが示された。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は、ＨＩＦの安定化及び活性化に関与している、及びＰＩ３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２もＶＨＬ非依存的な方法でＨＩＦ−１αタンパク質を減少する、という発見の観点から、Ｔｒｘ−１は、この経路を介してＨＩＦ−１αに影響を及ぼすことが可能である。しかし最近の研究によって、これは細胞タイプ依存性であり、ＨＩＦ活性化の下流に若しくはパラレルな経路に位置していると示唆された。我々は最近この可能性を検討している。
【００５２】
要約すると、我々は、ＰＸ−４７８が、低酸素誘導性ＨＩＦ−１αタンパク質、ＨＩＦ−１トランス活性化、及び下流標的ＶＥＧＦの発現を阻害する新規抗癌因子であることを示した。阻害作用は薬剤除去後４時間まで続いた。ＰＸ−４７８は、ＶＨＬ非依存的な方法で、恐らくチオレドキシン還元酵素の阻害を介して働く。ＰＸ−４７８はｉｎ ｖｉｖｏでＨＩＦ−１αタンパク質も減少した。従って、ＰＸ−４７８は正常細胞を超えてがん細胞の選択的な死滅を導く可能性がある有望な抗癌因子であることを意味している。
【００５３】
最近、いくつかの薬剤はＨＩＦ−１複合体を間接的に阻害することが報告された。上述したように、ＨＳＰ９０阻害剤ゲルダナマイシンは、ｐＶＨＬ非依存性メカニズムによってＨＩＦ−１αタンパク質を阻害することが報告された。高処理スクリーニングアプローチを用いて、多くのカンプトテシン類縁体が、ＨＩＦ−１αタンパク質とトランス活性化の阻害剤として同定された。しかし、これらの化合物が、特異的なＨＩＦ−１阻害剤というよりはむしろトポイソメラーゼＩ阻害を介した一般的な転写を単純に阻害するかどうかは明らかではない。ＤＸ−２−１（カルボマイシン誘導体）も、同じスクリーニングを用いて同定されたが、ＨＩＦ−１を加えた多数の転写因子に影響を及ぼすと知られている。我々は、ＨＩＦ−１αタンパク質、ＨＩＦ−１トランス活性化、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでの低酸素誘導性ＶＥＧＦ産生とｉｎ ｖｉｖｏでの低酸素誘導性ＨＩＦ−１αタンパク質産生の阻害剤として、チオレドキシン−１レドックスシステムの２つの阻害剤であるＰＸ−１２及びプレウロチン（ｐｌｅｕｒｏｔｉｎ）も同定した。
【００５４】
ＰＸ−４７８は、Ｐａｎｃ−１ヒト膵臓癌（図１０に示した）、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞（図１１に示した）、ヒト前立腺癌（図１２に示した）、及びＨＴ−２９大腸癌細胞（図１３に示した）に対して影響を及ぼした。
【００５５】
図１４は、ＨＴ−２９腫瘍異種移植片ＨＩＦ−１αに対するＰＸ−４７８の影響を説明したものである。
【００５６】
図１５は、血漿ＶＥＧＦレベルに対するＰＸ−４７８の影響を説明したものである。
本発明は、このような化合物を含む薬学的組成物にも関するものである。前記組成物は、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、水溶液、アジュバンド、若しくは治療を必要とする患者を治療するために有用である別の化合物の１若しくはそれ以上と共に、このような化合物の１若しくはそれ以上を有するものである。適切な組成物は、静脈内注入として投与された前記化合物の１若しくはそれ以上を含む緩衝溶液も含む。本発明は、このような化合物の使用を有する医学的な治療方法を含む。前記方法は、放射線療法若しくは化学療法などの、特定な疾患を治療するために有用な他の治療方法と共にこのような化合物を用いる工程も有している。
【００５７】
好ましい実施例を詳細に記載したが、添付した特許請求の範囲の本質若しくは範囲から逸脱することなく、様々な変更がこれらの実施例に対してなされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
以下に続く図面の簡単な説明と本発明の詳細な説明によって、本発明の様々な観点と用途が当業者に明らかになるであろう。
【図１】図１は、本発明による化合物を図示したものである。
【図１Ａ】図１Ａは、ＰＸ−４７８ Ｎ−オキシド及びＰＸ−４７８ Ｎ−オキシド塩酸塩の化学構造を図示したものである。
【図２】図２は、ＨＩＦ−１αタンパク質レベルに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図３】図３は、ＨＩＦ−１α及びＨＩＦ−１βタンパク質レベルに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図４Ａ】図４は、ＨＩＦ−１トランス活性化に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものであり、図４Ａは、ＭＣ−７ヒト乳癌におけるＨＩＦ−１トランス活性化を図示したものである。
【図４Ｂ】図４は、ＨＩＦ−１トランス活性化に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものであり、図４Ｂは、ＨＴ−２９ヒト大腸癌におけるトランス活性化を図示したものである。
【図５】図５は、ＶＥＧＦに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図６】図６は、阻害後のＨＩＦ−１αタンパク質の回復を図示したものである。
【図７】図７は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図８Ａ】図８は、ＰＸ−４７８の影響に対するＶＨＬの影響を図示したものであり、図８Ａは、核抽出物におけるＨＩＦ−１αタンパク質レベルを図示したものである。
【図８Ｂ】図８は、ＰＸ−４７８の影響に対するＶＨＬの影響を図示したものであり、図８Ｂは、ＰＧＫからのＨＲＥの複数コピーの制御下でのＨＩＦ−１トランス活性化を図示したものである。
【図９】図９は、チオレドキシン還元酵素に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１０】図１０は、Ｐａｎｃ−１ヒト膵臓癌に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１１】図１１は、ＭＣＦ−７ヒト乳癌に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１２】図１２は、ＰＣ−３ヒト前立腺癌に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１３】図１３は、ＨＴ−２９大腸癌に対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１４】図１４は、ＨＴ−２９腫瘍異種移植片のＨＩＦ−１αに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【図１５】図１５は、血漿ＶＥＧＦレベルに対するＰＸ−４７８の影響を図示したものである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学式を有する化合物、及び薬学的に許容可能な担体若しくは希釈剤を有する薬学的組成物であって、前記化合物は：
【化１】
であり；
ここで、
Ｒはアルキル、アリル、若しくはそれらの誘導体である化合物、若しくは、
【化２】
のいずれかである、薬学的組成物。
【請求項２】
請求項１の薬学的組成物において、
前記化合物は、化学式
【化３】
を有するものである。
【請求項３】
別の医薬品に加えた請求項１若しくは２の薬学的組成物。
【請求項４】
請求項１若しくは２の薬学的組成物において、
前記化合物は、名称（Ｓ−２−アミノ−３−［４’−Ｎ，Ｎ，−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシドジヒドロクロライド）である。
【請求項５】
ＨＩＦ−１αを阻害するための薬物を製造するための請求項１若しくは２の化合物の使用。
【請求項６】
血管新生増殖を阻害するための薬物を製造するための請求項１若しくは２の化合物の使用。
【請求項７】
ＶＥＧＦ形成を阻害するための薬物を製造するための請求項１若しくは２の化合物の使用。
【請求項８】
腫瘍形成を阻害するための薬物を製造するための請求項１若しくは２の化合物の使用。
【請求項９】
正常酸素圧若しくは低酸素条件下で細胞を治療するための薬物の製造用の請求項１若しくは２の化合物の使用。
【請求項１】
以下の化学式を有する化合物、及び薬学的に許容可能な担体若しくは希釈剤を有する薬学的組成物であって、前記化合物は：
【化１】
であり；
ここで、
Ｒはアルキル、アリル、若しくはそれらの誘導体である化合物、若しくは、
【化２】
のいずれかである、薬学的組成物。
【請求項２】
請求項１の薬学的組成物において、
前記化合物は、化学式
【化３】
を有するものである。
【請求項３】
別の医薬品に加えた請求項１若しくは２の薬学的組成物。
【請求項４】
請求項１若しくは２の薬学的組成物において、
前記化合物は、名称（Ｓ−２−アミノ−３−［４’−Ｎ，Ｎ，−ビス（２−クロロエチル）アミノ］フェニルプロピオン酸Ｎ−オキシドジヒドロクロライド）である。
【請求項５】
ＨＩＦ−１αを阻害するための薬物を製造するための請求項１若しくは２の化合物の使用。
【請求項６】
血管新生増殖を阻害するための薬物を製造するための請求項１若しくは２の化合物の使用。
【請求項７】
ＶＥＧＦ形成を阻害するための薬物を製造するための請求項１若しくは２の化合物の使用。
【請求項８】
腫瘍形成を阻害するための薬物を製造するための請求項１若しくは２の化合物の使用。
【請求項９】
正常酸素圧若しくは低酸素条件下で細胞を治療するための薬物の製造用の請求項１若しくは２の化合物の使用。
【図１】
【図１Ａ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１Ａ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８Ａ】
【図８Ｂ】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００６−５０８１２４（Ｐ２００６−５０８１２４Ａ）
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５１７３８（Ｐ２００４−５５１７３８）
【出願日】平成１５年１１月３日（２００３．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３５２２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４３３５９
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０５１６５０３３）プロルックス ファーマシューティカルズ コーポレーション (1)
【出願人】（５０５１６７５３２）アリゾナ ボード オブ リージェンツ、アクティング オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティ オブ アリゾナ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月９日（２００６．３．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月３日（２００３．１１．３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３５２２６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４３３５９
【国際公開日】平成１６年５月２７日（２００４．５．２７）
【出願人】（５０５１６５０３３）プロルックス ファーマシューティカルズ コーポレーション (1)
【出願人】（５０５１６７５３２）アリゾナ ボード オブ リージェンツ、アクティング オン ビハーフ オブ ザ ユニバーシティ オブ アリゾナ (2)
【Ｆターム（参考）】
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