体内リズム障害用医薬およびそのスクリーニング法
【課題】脳深部にあるリズム中枢である視交叉上核に存在する、体内リズムを調節している重要分子を究明し、体内リズム障害用医薬およびそのスクリーニング法を提供する。
【解決手段】 本発明では、視交叉上核の背内側部の時計細胞中に特異的に発現するＲＧＳ１６が細胞時計によって制御され、著明な２４時間リズムを刻んでいることを明らかにした。このＲＧＳ１６はＧαiに特異的に結合し、アデニル酸シクラーゼ活性をリズミックに調節しており、この結果は、朝特異的に高いcAMPのリズムとなって現れ、これが、ＰＫＡ系と、ＭＥＫ系の両経路を介して、核内での朝のＣＲＥ活性の急激な増大となり、これが、E-box/D-boxで制御される時計遺伝子のコアフィードバックループの転写タイミングを早めている。ＲＧＳ１６，ＲＧＳ１６に影響を与え若しくは受ける物質を有する細胞若しくは組織を用いて、体内リズム障害用医薬のスクリーニングが可能になった。
【解決手段】 本発明では、視交叉上核の背内側部の時計細胞中に特異的に発現するＲＧＳ１６が細胞時計によって制御され、著明な２４時間リズムを刻んでいることを明らかにした。このＲＧＳ１６はＧαiに特異的に結合し、アデニル酸シクラーゼ活性をリズミックに調節しており、この結果は、朝特異的に高いcAMPのリズムとなって現れ、これが、ＰＫＡ系と、ＭＥＫ系の両経路を介して、核内での朝のＣＲＥ活性の急激な増大となり、これが、E-box/D-boxで制御される時計遺伝子のコアフィードバックループの転写タイミングを早めている。ＲＧＳ１６，ＲＧＳ１６に影響を与え若しくは受ける物質を有する細胞若しくは組織を用いて、体内リズム障害用医薬のスクリーニングが可能になった。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体内リズム障害用医薬およびそのスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類は昼夜の明暗変化を感知して、生体の生理機能が２４時間周期のリズム（日内リズム）を持っていることが知られている。
たとえば、非特許文献１に開示されるように、皮膚に日内リズムがあり、皮膚の生理機能に影響を与えていることが最近明らかになってきた。
また、中枢の視交叉上核においても、これら遺伝子発現の日内リズムが存在しており、ここでは、自律的に視覚からの明暗刺激なしで日内リズムが形成されると考えられている。つまり、脳深部にある視交叉上核の時計遺伝子の発現は、日周リズムを形成し、その指令によって中枢や末梢の体内リズムが形成されると考えられている。体内リズムは生物の活動全体に影響を与え、昼夜（明暗）における、生物活動を円滑に行うための重要な役割を担っている。一方、睡眠障害が社会生活に悪影響を与えることが問題となっている。
【０００３】
睡眠障害は、高血圧、心臓疾患、糖尿病、肥満、うつ病、痴呆などと関連していることが近年明らかにされた。睡眠障害が体内リズムを狂わせ疾患を誘導するという可能性と、体内リズムの障害が睡眠障害を介して種々の疾患を誘導する、両方向の可能性があるが、実際、双方の流れが相互に連動して起きると考えられる。
実際、脳梗塞などの中枢障害が体内リズムを狂わせるケースや、逆に、家族性睡眠相位相前進症候群のように時計遺伝子変異によって体内リズムが狂い睡眠障害がおきるケースがある。
また、ジェットラグ症候群のように時差が一時的な体内リズムの乱れを惹起し、睡眠障害や消化器障害を誘導する場合もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chronobiol Int, 2002, 19:129-140
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、中枢の体内リズム障害は、多くの場合は睡眠障害を伴って、生活の質（ＱＯＬ）悪化や種々の疾患を誘発する点で問題である。
また、中枢の体内リズム中枢が末梢臓器のリズムを支配している関係上、中枢の日内リズム障害は全身の生物活動に悪影響を与える。
ホルモンや神経伝達物質などのアゴニストがＧ蛋白質と共役する細胞膜７回貫通型受容体GPCRに結合すると、ＧαからＧＤＰが放出され、代わりに細胞内のＧＴＰが結合する。この交換反応によってＧＴＰの結合したＧαはそのコンフォメーションを変え、受容体から離れるとともに、ＧＴＰ結合型ＧαとＧβγの両者が、酵素やイオンチャンネルなどの効果器の機能を調節することができる、活性型のＧ蛋白質である。活性型から不活性型への復帰は、ＧαがもつＧＴＰaseの作用によりＧαに結合したＧＴＰがＧＤＰとなり、Ｇβγと再会合して３量体Ｇ蛋白質に戻ることによる。
【０００６】
本発明の目的は、脳深部にあるリズム中枢である視交叉上核に存在する、体内リズムを調節している重要分子の発見に基づき、体内リズム障害用医薬およびそのスクリーニング法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の説明において用いられる略語の意味は、以下の通りである。
AC： adenylate cyclase（EC 4.6.1.1）アデニル酸シクラーゼ。アデニル酸シクラーゼはATPの3’,5’-cyclic AMP (cAMP)とピロリン酸への変換を触媒する酵素。
BMAL1：brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT)-like1蛋白。時計遺伝子の一つで、DNAに結合するbasic-helix-loop-helix構造を持つ。CLOCK蛋白と二量体を形成する。
CLOCK：Circadian Locomotor Output Cycles Kaput蛋白。時計遺伝子の一つで、DNAに結合するbasic-helix-loop-helix構造を持つ。BMAL1蛋白と二量体を形成する。
cFos：癌原遺伝子の一つで最初期遺伝子の一つ。
CRE：cyclic AMP responseive element cAMP-応答配列、cAMPに応答するDNA配列。
CREB：cyclic AMP responseive element site binding protein CRE結合蛋白。転写因子の一つ。
DBP： albumin D-site binding protein アルブミンプロモーターのD部位に結合する蛋白質として単離された転写因子の一つ。
E4BP4：adenovirus E4 promoter binding protein 転写因子の一つで、Nuclear factor, interleukin 3 regulated （Nfil3）とも呼ばれ、DBPと競合的にDNAに結合する。
ERK：Extracellular signal-regulated kinases でプロテインキナーゼの一つ
Ｇα：G蛋白質のαサブユニットのこと
Ｇβγ：G蛋白質のβγサブユニットのこと
GDP：Guanosine diphosphate で、核酸の一つ
GPCR：G protein-coupled receptorsでG蛋白共役型受容体
GTP：Guanosine-5'-triphosphate でプリンヌクレオチド。
GTPase：GTPを加水分解する酵素
Per1：mammalian period protein 1. 哺乳類時計遺伝子でショウジョウバエperiod遺伝子のホモログの一つ。
ＰＫＡ： protein kinase A
近年、Ｇ蛋白質シグナル伝達系の新たな調節因子として、一群のＲＧＳ（Regulator of G-protein signaling）の存在が明かとなった。このＲＧＳファミリーは。シグナル伝達系を負に制御する因子として最初に線虫と酵母において発見されたが、その後高等動物での解析も進み、現在では２０以上の分子種が同定されている。このファミリーには保存された約１２０アミノ酸残基からなるＲＧＳドメインが存在し、この領域を介してＧＴＰ結合型Ｇαと結合することが報告されている。ＲＧＳの個々のＧαに対する特異性はある程度見出されており、ＲＧＳはＧαのもつＧＴＰaseを活性化する。つまりシグナル伝達系を負に制御することが報告されている。
【０００８】
ここで、本発明者達は、脳深部にあるリズム中枢である視交叉上核に存在する、体内リズムを調節している重要分子を探索したところ、上述のＲＧＳファミリーの一つであるＲＧＳ１６が日内リズム調節に重要な働きをしていることを見出した。
すなわち、ＲＧＳ１６をノックアウトすると、行動リズムの周期が延びたのである。ＲＧＳ１６は、視交叉上核背内側部の時計細胞において、Ｇαiを介したＧＰＣＲによるシグナルを抑制し、正確な２４時間リズムの形成に重要な役割を担うことを発見した。
【０００９】
以上のことから、ＲＧＳ１６の日内リズム障害は日内リズムを狂わせ、睡眠障害および睡眠障害を介する、高血圧、心臓疾患、糖尿病、肥満、うつ病、痴呆等を誘発する可能性があり、ＲＧＳ１６の日内リズム障害を是正する化合物や天然物はこれら疾患の治療に用いることができると推定される。
【００１０】
本発明の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法は、ＲＧＳ１６遺伝子発現若しくはＲＧＳ１６蛋白質に影響を与える若しくは影響を受ける蛋白質あるいは遺伝子を有する細胞若しくは組織に、スクリーニング用物質を作用させ、ＲＧＳ１６の発現または活性の変化を測定する方法である。
【００１１】
この代表的な方法としては、視交叉上核の時計細胞（自律的に約24時間周期のリズムを刻む細胞）を用いて、培養細胞に化合物または天然物を添加し、ＲＧＳ１６発現をＰＣＲで、発現の変化を測定する方法がある。
また、ＲＧＳ１６シグナル下流の分子、たとえばｃＡＭP量やＥＲＫリン酸化で測定して、ＲＧＳ１６活性に影響をあたえる物質をスクリーニングすることもできる。
【００１２】
また、視交叉上核・背内側部に日内リズム調整に関するGPCRが特異的に存在することがわかった。この領域の組織や細胞を用いて、GPCR下流のシグナル、たとえばERKのリン酸化、ＲＧＳ１６発現量等を指標に、日内リズムを調節するリガンドを効率よくスクリーニングすることができる。
【００１３】
具体的には、視交叉上核・背内側部又は視交叉上核全体の，細胞又はその培養細胞にスクリーニング用物質を添加する方法や、ＲＧＳ１６を有する細胞または組織にスクリーニング用物質を添加する方法がある。
【００１４】
本発明の医薬は、ＲＧＳ１６遺伝子発現若しくはＲＧＳ１６蛋白質に影響を与える若しくは影響を受ける蛋白質あるいは遺伝子の発現または活性を調節する物質を有し、体内リズムに関与する疾患の治療に用いられる、体内リズム障害用医薬である。
【００１５】
本発明の医薬は、睡眠障害および睡眠障害を介する、高血圧、心臓疾患、糖尿病、肥満、うつ病、痴呆等の治療に用いることができる。あるいは睡眠障害に限らず、中枢の日内リズム障害に関連する疾患の治療に用いることができる。
【００１６】
また、ＲＧＳ１６の関与するＧＰＣＲシグナル下流の分子、ＡＣ、ＰＫＡ、ＥＲK，ＣＲＥＢの発現や作用を調節する物質は、同様に睡眠障害および睡眠障害を介する、高血圧、心臓疾患、糖尿病、肥満、うつ病、痴呆等の治療に用いる。あるいは睡眠障害に限らず、中枢の日内リズム障害に関連する疾患の治療効果を期待できるが、これらは、普遍的に全身の細胞に存在しており、当該物質は副作用が懸念される。ＲＧＳ１６は発現されているところが中枢では視交叉上核にほぼ限定されている為に、ＲＧＳ１６の発現や作用を調節する物質は副作用の懸念が少ない。
【００１７】
本発明のノックアウトマウスは、ＲＳＧ１６を欠損させたノックアウトマウスである。
ＲＧＳ１６の機能研究あるいはＲＧＳ１６の働きに影響を与える物質の研究開発にＲＧＳ１６ノックアウトマウスは重要な道具となる。後述する実施例に示すように、ＲＧＳ１６の機能として中枢で日内リズムに関連する機能を担っていることを明らかにした。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、後述する各実施例に示されるように、体内リズム障害用医薬，そのスクリーニング法、およびＲＧＳ１６が欠損したノックアウトマウスを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（ａ），（ｂ）は、実施例１における実験結果を示す図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、実施例２における実験結果を示す図である。
【図３】（ａ）〜（ｄ）は、実施例３における実験結果を示す図である。
【図４】（ａ），（ｂ）は、実施例４における実験結果を示す図である。
【図５】（ａ），（ｂ）は、実施例５における実験結果を示す図である。
【図６】（ａ），（ｂ）は、実施例６における実験結果を示す図である。
【図７】（ａ），（ｂ）は、実施例７における実験結果を示す図である。
【図８】各実施例の結果をまとめた，ＲＧＳ１６が細胞の日内リズムを調節するパスウェイを示す図である。
【図９】通常のマウス（ワイルドタイプ）の一部の配列を示す図である。
【図１０】ノックアウトマス（ミュータント）の一部の配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
−実施例１−
恒常的暗状態のC57BL/6マウスにおける視交叉上核のＲＧＳ１６ ｍＲＮＡ量の２４時間周期の変化を、in situ hybridizationにより測定した。測定数Ｎ＝５である。
図１（ａ）の表部分は、24時間周期で各時間のオートラジオグラムを数値化し、Relative ｍＲＮＡ abundance（ＲＧＳ１６ ｍＲＮＡの相対量）の時間変化を表したものである。ＲＧＳ１６ ｍＲＮＡの相対量は、in situ hybridizationにより最大値を１００として定量的に決定されている。数値は、５つのデータの平均値±ＳＥＭ（標準偏差）として表されている。各時間における代表的なオートラジオグラムが、表の上方に示されている。
図１（ｂ）は、視交叉上核のin situ hybridizationにおけるdigoxigenin-labeled ＲＧＳ１６陽性細胞の分布図を示している。視交叉上核の主要部の細胞中のＲＧＳ１６ ｍRNAは、サーカディアン時間（ＣＴ）０−８（時間）で、強いコントラストを示している。
すなわち、視交叉上核のＲＧＳ１６は、サーカディアン時間（ＣＴ）０−８（時間）で発現が高く、ＣＴ＝１２−２０（時間）で発現が低かった。
以上のことから、ＲＧＳ１６の発現は、視交叉上核で日内リズムを持っていることがわかった。
【００２１】
−実施例２−
実施例２では、E-boxとD-boxとによるＲＧＳ１６の相乗変動を調べた。
図２（ａ）に示すように、ＲＧＳ１６遺伝子の5`端上流領域には、４つのE-boxと１つのD-boxが存在する。
図２（ｂ）に示すように、ＲＧＳ１６上流、−6907から-6628領域に隣接して存在する２つのE-boxは、BMAL/CLOCKでの誘導活性に対して反応性を有している。
この２つのE-boxを、SV40をプロモーターとし、ルシフェラーゼ（luciferase）をレポーターとするベクターpGL3 (Promega Madison, WI) に接続し、BMAL/CLOCKを共発現する（すなわち、それぞれの遺伝子をpcDNA3(Invitoben) ベクターに挿入したコンストラクトを、co-transfectionする）と、強いレポーター遺伝子発現が見られた。この２つのE-boxに変異をいれると、BMAL/CLOCKでの誘導活性は消失した。一方、-4640から-4436領域のE-boxまたは-2577から-2372領域のE-boxを接続してもレポーター遺伝子は発現しなかった。よって、−6907から-6628領域に存在する２つのE-boxが、BMAL/CLOCKによる発現誘導には必要であることがわかった。
また、図２（ｃ）に示すように、ＲＧＳ１６は、ＤＢＰ発現ベクター(Open Biosystems, Huntsville, Al)によって用量依存的に活性化される。ＤＢＰ発現ベクターおよびＥ４ＢＰ４発現ベクター(Open Biosystems, Huntsville, Al)をＲＧＳ１６遺伝子のD-boxを含む上流領域を含むpGL3と共にトランスフェクションを行った。ＲＧＳ１６遺伝子上流領域-1000/-1を含むコンストラクトの場合はDBP蛋白質の共発現によってレポーター発現が亢進し、E4BP4蛋白質によってdose-responseをもってレポーター発現が抑制された。
以上のことから、
１．ＲＧＳ１６発現には、その上流領域の-6907から-6628領域のE-boxが必須である
２．ＲＧＳ１６発現に際し、その上流領域のD-boxに結合するDBP蛋白質はＲＧＳ１６発現を亢進し、E4BP4蛋白質はＲＧＳ１６発現を抑制する
ことがわかった。
【００２２】
−実施例３−
ＲＧＳ１６ノックアウトマウスの生成を行った。
図３（ａ）に示すように、遺伝子構造物を胎児幹細胞株に導入し、ＲＧＳ１６遺伝子を標的にノックアウトしたノックアウトマウスを作成した。
図９，図１０は、通常のマウス（ワイルドタイプ）とノックアウトマス（ミュータント）との一部の配列を示す図である。各図には、置換部分のみを示している。
相同遺伝子組換え（homologous recombination）により、1st〜5thエクソンの蛋白質に翻訳される全領域を含むgenomic regionが削除されて、LacZ−Neoに置換された。
図３（ｂ）は、得られたホモ（ＲＧＳ１６-/-）、ヘテロ（ＲＧＳ１６+/-）のミュータントマウス、および、野生型マウス（ＲＧＳ１６+/+）について、それぞれ遺伝型を確認した結果を示している。
図３（ｃ）に示すように、サーカディアン時間（ＣＴ）４時間と１６時間におけるＲＧＳ１６ノックアウトマウスとワイルドタイプ視交叉上核のＲＧＳ１６ｍＲＮＡ 発現をin situ hybridizationで測定したところ、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）では視交叉上核のＲＧＳ１６ｍＲＮＡ発現が消失していることを確認した。
また、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ヘテロ）の脳の切片において、LacZｍＲＮＡの発現をin situ hybridizationで測定した。図３（ｄ）は、組織化学的反応により得られたLacZｍＲＮＡを、LacZ probeを用いてin situ hybridizationで測定した像を示している（上側の２つの図）。
図３（ｄ）に示すように、視交叉上核に非常に強くLacZｍＲＮＡが検出された。このLacZｍＲＮＡ発現は、ＣＴ４で強く、ＣＴ１６で弱かった。これより、ＲＧＳ１６発現部位が視交叉上核を中心とすること、および、その発現が日内リズムを持つことが確認された。
以上のことから、目的のＲＧＳ１６ノックアウトマウス・ホモ型とヘテロ型が作成出来たことが確認された。
【００２３】
−実施例４−
恒常的暗環境における、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）およびワイルドタイプの視交叉上核におけるp44/42MAPK(MEK)の活性化状態（リン酸化状態）を測定した。
抗Phospho-p44/42MAPKinase (Thr202/Tyr204)血清を用いた免疫組織化染色法を用いた。Avidin-biotin-peroxidase法により可視化した。
図４（ａ），（ｂ）は、p44/42マイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（p44/42MAPK：MEK)の活性化状態の朝での増大が、ホモタイプ（ＲＧＳ１６-/-）のノックアウトマウスで消滅すること示している。
図４（ａ）に示すように、ワイルドタイプの視交叉上核で、活性型（リン酸化）p44/42MAPKが日内リズムをもって変動した。即ち、ワイルドタイプの視交叉上核では、サーカディアン時間ＣＴ０からＣＴ１２で活性型が増加したが、ＲＧＳ１６ノックアウトマウスではその増加は見られなかった。
図４（ｂ）に示すように、ワイルドタイプでは視交叉上核・背側内側部に、ＣＴ２近傍でp44/42MAPK陽性細胞が増加したが、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）ではp44/42MAPK陽性細胞が増加が見られなかった。しかし、ワイルドタイプのサーカディアン時間ＣＴ１６やＣＴ２０で視交叉上核の中央部分において認められるp44/42MAPK陽性細胞は、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）でも同時刻に同じレベルの反応が確認された。
以上のことから、視交叉上核背内側部に存在するp44/42MAPKの活性化リズムは、ＲＧＳ１６によって支配されることが明らかとなった。p44/42MAPKシグナルは、細胞周期や細胞分化などのさまざまな細胞活動に関連していることから、ＲＧＳ１６の日内リズムはp44/42MAPKの活性化を介して、広範な細胞活動を制御していると考えられる。
しかし、同じ視交叉上核でも、光の影響を受けると考えられる中央部には、ＲＧＳ１６の影響を受けないp44/42MAPKシグナルを持つ細胞が存在していた。すなわち、ＲＳＧ１６は、視交叉上核のリズムを先導して形成していると考えられる特別な細胞の活動に日内リズムを与えていると考えられる。
【００２４】
−実施例５−
ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）とワイルドタイプの視交叉上核における、CREによってのみ発現が制御されるcFos mRNAの発現をDigoxigenin-in situ hybridization 法により測定した。
図５（ａ），（ｂ）は、c-Fos mRNAの夜明けにおける強い発現が、ホモタイプ（ＲＧＳ１６-/-）のノックアウトマウスで消滅すること示している。
図５（ａ）に示すように、ワイルドタイプの視交叉上核背内側部において、ＣＴ０近傍にcFos発現の増加を認めた。ＲＧＳ１６ノックアウト（ホモ）ではcFos発現増加を認めなかった。
図５（ｂ）は、視交叉上核のcFos陽性細胞数のサーカディアン時間における推移を示している（平均値±ＳＥＭ、Ｎ＝５）。統計解析（one-way ANOVA, F5,24=11.07, P<0.01）の結果、ワイルドタイプにおける、ＣＴ４のピークはＣＴ８、１２、１６、２０に対して有意な変動が認められた。
以上により、視交叉上核背内側部におけるcFos陽性細胞数は、ＲＧＳ１６の支配を受けて日内リズムを持つことがわかる。cFos は、CRE によって活性が調節され、通常の体内時計の制御因子であるBMAL/CLOCKによっては制御されないので、ＲＧＳ１６の制御は、CREで制御される部位のみで起こることが想定される。よって、視交叉上核背内側部分には、通常の制御部位とは異なる特別な制御部位で、ＲＧＳ１６を介する日内リズムが行われる細胞が存在することを意味する。
【００２５】
−実施例６−
ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ヘテロ）およびワイルドタイプを、１２時間明期、１２時間暗期のサイクルで２週間飼育後、恒常的暗期の環境に移行した状況での自発的運動活性を測定した。
図６（ａ）は、２重プロット自発的運動リズム（Double-plotted locomotor activity rhythm）を示し、図６（ｂ）は、それぞれの遺伝子型マウスの周期を示している。
図６（ａ），（ｂ）に示されるように、日内リズムの周期はＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）はワイルドタイプより４６分長く、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ヘテロ）はワイルドタイプより２０分長かった。つまり、ＲＧＳ１６の遺伝子型の効果は、用量依存的であった。
以上により、ＲＧＳ１６は、中枢の視交叉上核における特別な細胞の状態を制御することによって、中枢の日内リズムを維持していることがわかった。
【００２６】
−実施例７−
ワイルドタイプまたはＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）をPer1プロモーター・ルシフェラーゼトランスジェニックマウスとかけ合わせ、Per1-luc+/-ＲＧＳ１６+/+ と Per1-luc+/-ＲＧＳ１６-/-を作成した。 Per1プロモーター・ルシフェラーゼトランスジェニックマウスはYamaguchi et al. Curr Biol. 2000 Jul 13;10(14):873-6に記載の通りである。これらマウスから視交叉上核(SCN)のスライス器官培養を調製し、SCNスライス器官培養にＭＥＫ特異的リン酸化抑制剤（U0126）またはその不活性異性体U0124を添加し、Per1-ルシフェラーゼの蛍光によって日内リズムを測定した。SCNスライス器官培養はAsai et al., Curr Biol. 2001 Oct 2;11(19):1524-7. に記述の方法を用いた。SCNスライス片を異なる容器で別々に培養し、培地の中に測定薬剤を溶解した。
２週間から３週間培養後に、培地に1mMのルシフェリン（luciferin）を添加し、生物発光（bioiluminescense）をCCDカメラ（Spectra Video SV16KV/CT: Pixel Vision, OR）を顕微鏡(Axiovert 135TV: Carl Zeiss, Jena, Germany)で測定した。生物発光は、20分間隔または1時間間隔で測定した。
図７（ａ），（ｂ）は、スライス片の日内リズムに対するphospholylation inhibitors の影響を示している。
図７（ａ），（ｂ）に示すように、日内リズムの周期は、ワイルドタイプ（ＷＴ，ｗｔで表示）の器官培養にU0124を添加したときは変化ないが、U0126を添加すると1.8時間近く延長した。一方、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）（ＫＯ，ＲＧＳ-/-で表示）ではU0124, U0126を添加しても日内リズムの大きな変動はなかった。
以上のことから、ＲＧＳ１６は、ＭＥＫのリン酸化を介して、視交叉上核細胞の日内リズムを調節していると思われる。
【００２７】
これまでのデータをまとめると、ＲＧＳ１６が細胞の日内リズムを調節するパスウェイは図８に示すようになる。時計遺伝子の一種、ＲＧＳ１６遺伝子は、E-boxとD-boxにより、体内時計の朝にピークのリズムをもって発現され、ＧαiのGTPaseを亢進する。朝に、Ｇαiの不活化はアデニル酸シクラーゼ（adenylate cyclase）を活性化し、cAMPを増加させる。これは、PKAを活性化するとともに、ERKもリン酸化する。活性化されたPKAおよびERKは最終的にCREBをリン酸化する。そして、ＣＲＥを介する遺伝子発現（例えばcFos）が亢進する。また、活性化CREBはPer1遺伝子のプロモーター領域のCREサイトに結合して、Per1遺伝子発現を亢進する。
Per遺伝子、Dbp遺伝子、ＲＧＳ１６遺伝子はCLOCK蛋白質・BMAL1蛋白質ヘテロダイマーによりポジティブに発現制御され、PER蛋白質・CRY蛋白質ヘテロダイマーによりネガティブに発現制御される。このようにCREサイトを介した、シナリオで、膜表面のGPCRはE-boxとD-boxを介して形成される時計遺伝子のコアフィードバック機構（図のピンク背景）により、日内周期の長さを調節している。
【００２８】
以上をまとめると、視交叉上核の背内側部の時計細胞（自律的にリズムを刻む細胞）中に特異的に発現するＲＧＳ１６が細胞時計によって制御され、著明な２４時間リズムを刻むことを明らかにした。このＲＧＳ１６はＧαiに特異的に結合し、アデニル酸シクラーゼ活性をリズミックに調節しており、この結果は、朝特異的に高いcAMPのリズムとなって現れ、これが、ＰＫＡ系と、ＭＥＫ系の両経路を介して、核内での朝のＣＲＥ活性の急激な増大となり、これが、E-box/D-boxで制御される時計遺伝子のコアフィードバックループの転写タイミングを早めている。このような反応は、ＲＧＳノックアウトマウスでは消失しており、これが行動リズム周期の延長となって現れる。体内時計の中枢である視交叉上核では、背内側部の細胞がＧＰＣＲを介する細胞外からのメッセージにより、時計周期を調節している。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、体内リズム障害用医薬の製造や、体内リズム障害用医薬のスクリーニング法として利用することができる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、体内リズム障害用医薬およびそのスクリーニング法に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類は昼夜の明暗変化を感知して、生体の生理機能が２４時間周期のリズム（日内リズム）を持っていることが知られている。
たとえば、非特許文献１に開示されるように、皮膚に日内リズムがあり、皮膚の生理機能に影響を与えていることが最近明らかになってきた。
また、中枢の視交叉上核においても、これら遺伝子発現の日内リズムが存在しており、ここでは、自律的に視覚からの明暗刺激なしで日内リズムが形成されると考えられている。つまり、脳深部にある視交叉上核の時計遺伝子の発現は、日周リズムを形成し、その指令によって中枢や末梢の体内リズムが形成されると考えられている。体内リズムは生物の活動全体に影響を与え、昼夜（明暗）における、生物活動を円滑に行うための重要な役割を担っている。一方、睡眠障害が社会生活に悪影響を与えることが問題となっている。
【０００３】
睡眠障害は、高血圧、心臓疾患、糖尿病、肥満、うつ病、痴呆などと関連していることが近年明らかにされた。睡眠障害が体内リズムを狂わせ疾患を誘導するという可能性と、体内リズムの障害が睡眠障害を介して種々の疾患を誘導する、両方向の可能性があるが、実際、双方の流れが相互に連動して起きると考えられる。
実際、脳梗塞などの中枢障害が体内リズムを狂わせるケースや、逆に、家族性睡眠相位相前進症候群のように時計遺伝子変異によって体内リズムが狂い睡眠障害がおきるケースがある。
また、ジェットラグ症候群のように時差が一時的な体内リズムの乱れを惹起し、睡眠障害や消化器障害を誘導する場合もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Chronobiol Int, 2002, 19:129-140
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、中枢の体内リズム障害は、多くの場合は睡眠障害を伴って、生活の質（ＱＯＬ）悪化や種々の疾患を誘発する点で問題である。
また、中枢の体内リズム中枢が末梢臓器のリズムを支配している関係上、中枢の日内リズム障害は全身の生物活動に悪影響を与える。
ホルモンや神経伝達物質などのアゴニストがＧ蛋白質と共役する細胞膜７回貫通型受容体GPCRに結合すると、ＧαからＧＤＰが放出され、代わりに細胞内のＧＴＰが結合する。この交換反応によってＧＴＰの結合したＧαはそのコンフォメーションを変え、受容体から離れるとともに、ＧＴＰ結合型ＧαとＧβγの両者が、酵素やイオンチャンネルなどの効果器の機能を調節することができる、活性型のＧ蛋白質である。活性型から不活性型への復帰は、ＧαがもつＧＴＰaseの作用によりＧαに結合したＧＴＰがＧＤＰとなり、Ｇβγと再会合して３量体Ｇ蛋白質に戻ることによる。
【０００６】
本発明の目的は、脳深部にあるリズム中枢である視交叉上核に存在する、体内リズムを調節している重要分子の発見に基づき、体内リズム障害用医薬およびそのスクリーニング法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の説明において用いられる略語の意味は、以下の通りである。
AC： adenylate cyclase（EC 4.6.1.1）アデニル酸シクラーゼ。アデニル酸シクラーゼはATPの3’,5’-cyclic AMP (cAMP)とピロリン酸への変換を触媒する酵素。
BMAL1：brain and muscle aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT)-like1蛋白。時計遺伝子の一つで、DNAに結合するbasic-helix-loop-helix構造を持つ。CLOCK蛋白と二量体を形成する。
CLOCK：Circadian Locomotor Output Cycles Kaput蛋白。時計遺伝子の一つで、DNAに結合するbasic-helix-loop-helix構造を持つ。BMAL1蛋白と二量体を形成する。
cFos：癌原遺伝子の一つで最初期遺伝子の一つ。
CRE：cyclic AMP responseive element cAMP-応答配列、cAMPに応答するDNA配列。
CREB：cyclic AMP responseive element site binding protein CRE結合蛋白。転写因子の一つ。
DBP： albumin D-site binding protein アルブミンプロモーターのD部位に結合する蛋白質として単離された転写因子の一つ。
E4BP4：adenovirus E4 promoter binding protein 転写因子の一つで、Nuclear factor, interleukin 3 regulated （Nfil3）とも呼ばれ、DBPと競合的にDNAに結合する。
ERK：Extracellular signal-regulated kinases でプロテインキナーゼの一つ
Ｇα：G蛋白質のαサブユニットのこと
Ｇβγ：G蛋白質のβγサブユニットのこと
GDP：Guanosine diphosphate で、核酸の一つ
GPCR：G protein-coupled receptorsでG蛋白共役型受容体
GTP：Guanosine-5'-triphosphate でプリンヌクレオチド。
GTPase：GTPを加水分解する酵素
Per1：mammalian period protein 1. 哺乳類時計遺伝子でショウジョウバエperiod遺伝子のホモログの一つ。
ＰＫＡ： protein kinase A
近年、Ｇ蛋白質シグナル伝達系の新たな調節因子として、一群のＲＧＳ（Regulator of G-protein signaling）の存在が明かとなった。このＲＧＳファミリーは。シグナル伝達系を負に制御する因子として最初に線虫と酵母において発見されたが、その後高等動物での解析も進み、現在では２０以上の分子種が同定されている。このファミリーには保存された約１２０アミノ酸残基からなるＲＧＳドメインが存在し、この領域を介してＧＴＰ結合型Ｇαと結合することが報告されている。ＲＧＳの個々のＧαに対する特異性はある程度見出されており、ＲＧＳはＧαのもつＧＴＰaseを活性化する。つまりシグナル伝達系を負に制御することが報告されている。
【０００８】
ここで、本発明者達は、脳深部にあるリズム中枢である視交叉上核に存在する、体内リズムを調節している重要分子を探索したところ、上述のＲＧＳファミリーの一つであるＲＧＳ１６が日内リズム調節に重要な働きをしていることを見出した。
すなわち、ＲＧＳ１６をノックアウトすると、行動リズムの周期が延びたのである。ＲＧＳ１６は、視交叉上核背内側部の時計細胞において、Ｇαiを介したＧＰＣＲによるシグナルを抑制し、正確な２４時間リズムの形成に重要な役割を担うことを発見した。
【０００９】
以上のことから、ＲＧＳ１６の日内リズム障害は日内リズムを狂わせ、睡眠障害および睡眠障害を介する、高血圧、心臓疾患、糖尿病、肥満、うつ病、痴呆等を誘発する可能性があり、ＲＧＳ１６の日内リズム障害を是正する化合物や天然物はこれら疾患の治療に用いることができると推定される。
【００１０】
本発明の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法は、ＲＧＳ１６遺伝子発現若しくはＲＧＳ１６蛋白質に影響を与える若しくは影響を受ける蛋白質あるいは遺伝子を有する細胞若しくは組織に、スクリーニング用物質を作用させ、ＲＧＳ１６の発現または活性の変化を測定する方法である。
【００１１】
この代表的な方法としては、視交叉上核の時計細胞（自律的に約24時間周期のリズムを刻む細胞）を用いて、培養細胞に化合物または天然物を添加し、ＲＧＳ１６発現をＰＣＲで、発現の変化を測定する方法がある。
また、ＲＧＳ１６シグナル下流の分子、たとえばｃＡＭP量やＥＲＫリン酸化で測定して、ＲＧＳ１６活性に影響をあたえる物質をスクリーニングすることもできる。
【００１２】
また、視交叉上核・背内側部に日内リズム調整に関するGPCRが特異的に存在することがわかった。この領域の組織や細胞を用いて、GPCR下流のシグナル、たとえばERKのリン酸化、ＲＧＳ１６発現量等を指標に、日内リズムを調節するリガンドを効率よくスクリーニングすることができる。
【００１３】
具体的には、視交叉上核・背内側部又は視交叉上核全体の，細胞又はその培養細胞にスクリーニング用物質を添加する方法や、ＲＧＳ１６を有する細胞または組織にスクリーニング用物質を添加する方法がある。
【００１４】
本発明の医薬は、ＲＧＳ１６遺伝子発現若しくはＲＧＳ１６蛋白質に影響を与える若しくは影響を受ける蛋白質あるいは遺伝子の発現または活性を調節する物質を有し、体内リズムに関与する疾患の治療に用いられる、体内リズム障害用医薬である。
【００１５】
本発明の医薬は、睡眠障害および睡眠障害を介する、高血圧、心臓疾患、糖尿病、肥満、うつ病、痴呆等の治療に用いることができる。あるいは睡眠障害に限らず、中枢の日内リズム障害に関連する疾患の治療に用いることができる。
【００１６】
また、ＲＧＳ１６の関与するＧＰＣＲシグナル下流の分子、ＡＣ、ＰＫＡ、ＥＲK，ＣＲＥＢの発現や作用を調節する物質は、同様に睡眠障害および睡眠障害を介する、高血圧、心臓疾患、糖尿病、肥満、うつ病、痴呆等の治療に用いる。あるいは睡眠障害に限らず、中枢の日内リズム障害に関連する疾患の治療効果を期待できるが、これらは、普遍的に全身の細胞に存在しており、当該物質は副作用が懸念される。ＲＧＳ１６は発現されているところが中枢では視交叉上核にほぼ限定されている為に、ＲＧＳ１６の発現や作用を調節する物質は副作用の懸念が少ない。
【００１７】
本発明のノックアウトマウスは、ＲＳＧ１６を欠損させたノックアウトマウスである。
ＲＧＳ１６の機能研究あるいはＲＧＳ１６の働きに影響を与える物質の研究開発にＲＧＳ１６ノックアウトマウスは重要な道具となる。後述する実施例に示すように、ＲＧＳ１６の機能として中枢で日内リズムに関連する機能を担っていることを明らかにした。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によると、後述する各実施例に示されるように、体内リズム障害用医薬，そのスクリーニング法、およびＲＧＳ１６が欠損したノックアウトマウスを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】（ａ），（ｂ）は、実施例１における実験結果を示す図である。
【図２】（ａ）〜（ｃ）は、実施例２における実験結果を示す図である。
【図３】（ａ）〜（ｄ）は、実施例３における実験結果を示す図である。
【図４】（ａ），（ｂ）は、実施例４における実験結果を示す図である。
【図５】（ａ），（ｂ）は、実施例５における実験結果を示す図である。
【図６】（ａ），（ｂ）は、実施例６における実験結果を示す図である。
【図７】（ａ），（ｂ）は、実施例７における実験結果を示す図である。
【図８】各実施例の結果をまとめた，ＲＧＳ１６が細胞の日内リズムを調節するパスウェイを示す図である。
【図９】通常のマウス（ワイルドタイプ）の一部の配列を示す図である。
【図１０】ノックアウトマス（ミュータント）の一部の配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
−実施例１−
恒常的暗状態のC57BL/6マウスにおける視交叉上核のＲＧＳ１６ ｍＲＮＡ量の２４時間周期の変化を、in situ hybridizationにより測定した。測定数Ｎ＝５である。
図１（ａ）の表部分は、24時間周期で各時間のオートラジオグラムを数値化し、Relative ｍＲＮＡ abundance（ＲＧＳ１６ ｍＲＮＡの相対量）の時間変化を表したものである。ＲＧＳ１６ ｍＲＮＡの相対量は、in situ hybridizationにより最大値を１００として定量的に決定されている。数値は、５つのデータの平均値±ＳＥＭ（標準偏差）として表されている。各時間における代表的なオートラジオグラムが、表の上方に示されている。
図１（ｂ）は、視交叉上核のin situ hybridizationにおけるdigoxigenin-labeled ＲＧＳ１６陽性細胞の分布図を示している。視交叉上核の主要部の細胞中のＲＧＳ１６ ｍRNAは、サーカディアン時間（ＣＴ）０−８（時間）で、強いコントラストを示している。
すなわち、視交叉上核のＲＧＳ１６は、サーカディアン時間（ＣＴ）０−８（時間）で発現が高く、ＣＴ＝１２−２０（時間）で発現が低かった。
以上のことから、ＲＧＳ１６の発現は、視交叉上核で日内リズムを持っていることがわかった。
【００２１】
−実施例２−
実施例２では、E-boxとD-boxとによるＲＧＳ１６の相乗変動を調べた。
図２（ａ）に示すように、ＲＧＳ１６遺伝子の5`端上流領域には、４つのE-boxと１つのD-boxが存在する。
図２（ｂ）に示すように、ＲＧＳ１６上流、−6907から-6628領域に隣接して存在する２つのE-boxは、BMAL/CLOCKでの誘導活性に対して反応性を有している。
この２つのE-boxを、SV40をプロモーターとし、ルシフェラーゼ（luciferase）をレポーターとするベクターpGL3 (Promega Madison, WI) に接続し、BMAL/CLOCKを共発現する（すなわち、それぞれの遺伝子をpcDNA3(Invitoben) ベクターに挿入したコンストラクトを、co-transfectionする）と、強いレポーター遺伝子発現が見られた。この２つのE-boxに変異をいれると、BMAL/CLOCKでの誘導活性は消失した。一方、-4640から-4436領域のE-boxまたは-2577から-2372領域のE-boxを接続してもレポーター遺伝子は発現しなかった。よって、−6907から-6628領域に存在する２つのE-boxが、BMAL/CLOCKによる発現誘導には必要であることがわかった。
また、図２（ｃ）に示すように、ＲＧＳ１６は、ＤＢＰ発現ベクター(Open Biosystems, Huntsville, Al)によって用量依存的に活性化される。ＤＢＰ発現ベクターおよびＥ４ＢＰ４発現ベクター(Open Biosystems, Huntsville, Al)をＲＧＳ１６遺伝子のD-boxを含む上流領域を含むpGL3と共にトランスフェクションを行った。ＲＧＳ１６遺伝子上流領域-1000/-1を含むコンストラクトの場合はDBP蛋白質の共発現によってレポーター発現が亢進し、E4BP4蛋白質によってdose-responseをもってレポーター発現が抑制された。
以上のことから、
１．ＲＧＳ１６発現には、その上流領域の-6907から-6628領域のE-boxが必須である
２．ＲＧＳ１６発現に際し、その上流領域のD-boxに結合するDBP蛋白質はＲＧＳ１６発現を亢進し、E4BP4蛋白質はＲＧＳ１６発現を抑制する
ことがわかった。
【００２２】
−実施例３−
ＲＧＳ１６ノックアウトマウスの生成を行った。
図３（ａ）に示すように、遺伝子構造物を胎児幹細胞株に導入し、ＲＧＳ１６遺伝子を標的にノックアウトしたノックアウトマウスを作成した。
図９，図１０は、通常のマウス（ワイルドタイプ）とノックアウトマス（ミュータント）との一部の配列を示す図である。各図には、置換部分のみを示している。
相同遺伝子組換え（homologous recombination）により、1st〜5thエクソンの蛋白質に翻訳される全領域を含むgenomic regionが削除されて、LacZ−Neoに置換された。
図３（ｂ）は、得られたホモ（ＲＧＳ１６-/-）、ヘテロ（ＲＧＳ１６+/-）のミュータントマウス、および、野生型マウス（ＲＧＳ１６+/+）について、それぞれ遺伝型を確認した結果を示している。
図３（ｃ）に示すように、サーカディアン時間（ＣＴ）４時間と１６時間におけるＲＧＳ１６ノックアウトマウスとワイルドタイプ視交叉上核のＲＧＳ１６ｍＲＮＡ 発現をin situ hybridizationで測定したところ、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）では視交叉上核のＲＧＳ１６ｍＲＮＡ発現が消失していることを確認した。
また、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ヘテロ）の脳の切片において、LacZｍＲＮＡの発現をin situ hybridizationで測定した。図３（ｄ）は、組織化学的反応により得られたLacZｍＲＮＡを、LacZ probeを用いてin situ hybridizationで測定した像を示している（上側の２つの図）。
図３（ｄ）に示すように、視交叉上核に非常に強くLacZｍＲＮＡが検出された。このLacZｍＲＮＡ発現は、ＣＴ４で強く、ＣＴ１６で弱かった。これより、ＲＧＳ１６発現部位が視交叉上核を中心とすること、および、その発現が日内リズムを持つことが確認された。
以上のことから、目的のＲＧＳ１６ノックアウトマウス・ホモ型とヘテロ型が作成出来たことが確認された。
【００２３】
−実施例４−
恒常的暗環境における、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）およびワイルドタイプの視交叉上核におけるp44/42MAPK(MEK)の活性化状態（リン酸化状態）を測定した。
抗Phospho-p44/42MAPKinase (Thr202/Tyr204)血清を用いた免疫組織化染色法を用いた。Avidin-biotin-peroxidase法により可視化した。
図４（ａ），（ｂ）は、p44/42マイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（p44/42MAPK：MEK)の活性化状態の朝での増大が、ホモタイプ（ＲＧＳ１６-/-）のノックアウトマウスで消滅すること示している。
図４（ａ）に示すように、ワイルドタイプの視交叉上核で、活性型（リン酸化）p44/42MAPKが日内リズムをもって変動した。即ち、ワイルドタイプの視交叉上核では、サーカディアン時間ＣＴ０からＣＴ１２で活性型が増加したが、ＲＧＳ１６ノックアウトマウスではその増加は見られなかった。
図４（ｂ）に示すように、ワイルドタイプでは視交叉上核・背側内側部に、ＣＴ２近傍でp44/42MAPK陽性細胞が増加したが、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）ではp44/42MAPK陽性細胞が増加が見られなかった。しかし、ワイルドタイプのサーカディアン時間ＣＴ１６やＣＴ２０で視交叉上核の中央部分において認められるp44/42MAPK陽性細胞は、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）でも同時刻に同じレベルの反応が確認された。
以上のことから、視交叉上核背内側部に存在するp44/42MAPKの活性化リズムは、ＲＧＳ１６によって支配されることが明らかとなった。p44/42MAPKシグナルは、細胞周期や細胞分化などのさまざまな細胞活動に関連していることから、ＲＧＳ１６の日内リズムはp44/42MAPKの活性化を介して、広範な細胞活動を制御していると考えられる。
しかし、同じ視交叉上核でも、光の影響を受けると考えられる中央部には、ＲＧＳ１６の影響を受けないp44/42MAPKシグナルを持つ細胞が存在していた。すなわち、ＲＳＧ１６は、視交叉上核のリズムを先導して形成していると考えられる特別な細胞の活動に日内リズムを与えていると考えられる。
【００２４】
−実施例５−
ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）とワイルドタイプの視交叉上核における、CREによってのみ発現が制御されるcFos mRNAの発現をDigoxigenin-in situ hybridization 法により測定した。
図５（ａ），（ｂ）は、c-Fos mRNAの夜明けにおける強い発現が、ホモタイプ（ＲＧＳ１６-/-）のノックアウトマウスで消滅すること示している。
図５（ａ）に示すように、ワイルドタイプの視交叉上核背内側部において、ＣＴ０近傍にcFos発現の増加を認めた。ＲＧＳ１６ノックアウト（ホモ）ではcFos発現増加を認めなかった。
図５（ｂ）は、視交叉上核のcFos陽性細胞数のサーカディアン時間における推移を示している（平均値±ＳＥＭ、Ｎ＝５）。統計解析（one-way ANOVA, F5,24=11.07, P<0.01）の結果、ワイルドタイプにおける、ＣＴ４のピークはＣＴ８、１２、１６、２０に対して有意な変動が認められた。
以上により、視交叉上核背内側部におけるcFos陽性細胞数は、ＲＧＳ１６の支配を受けて日内リズムを持つことがわかる。cFos は、CRE によって活性が調節され、通常の体内時計の制御因子であるBMAL/CLOCKによっては制御されないので、ＲＧＳ１６の制御は、CREで制御される部位のみで起こることが想定される。よって、視交叉上核背内側部分には、通常の制御部位とは異なる特別な制御部位で、ＲＧＳ１６を介する日内リズムが行われる細胞が存在することを意味する。
【００２５】
−実施例６−
ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ヘテロ）およびワイルドタイプを、１２時間明期、１２時間暗期のサイクルで２週間飼育後、恒常的暗期の環境に移行した状況での自発的運動活性を測定した。
図６（ａ）は、２重プロット自発的運動リズム（Double-plotted locomotor activity rhythm）を示し、図６（ｂ）は、それぞれの遺伝子型マウスの周期を示している。
図６（ａ），（ｂ）に示されるように、日内リズムの周期はＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）はワイルドタイプより４６分長く、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ヘテロ）はワイルドタイプより２０分長かった。つまり、ＲＧＳ１６の遺伝子型の効果は、用量依存的であった。
以上により、ＲＧＳ１６は、中枢の視交叉上核における特別な細胞の状態を制御することによって、中枢の日内リズムを維持していることがわかった。
【００２６】
−実施例７−
ワイルドタイプまたはＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）をPer1プロモーター・ルシフェラーゼトランスジェニックマウスとかけ合わせ、Per1-luc+/-ＲＧＳ１６+/+ と Per1-luc+/-ＲＧＳ１６-/-を作成した。 Per1プロモーター・ルシフェラーゼトランスジェニックマウスはYamaguchi et al. Curr Biol. 2000 Jul 13;10(14):873-6に記載の通りである。これらマウスから視交叉上核(SCN)のスライス器官培養を調製し、SCNスライス器官培養にＭＥＫ特異的リン酸化抑制剤（U0126）またはその不活性異性体U0124を添加し、Per1-ルシフェラーゼの蛍光によって日内リズムを測定した。SCNスライス器官培養はAsai et al., Curr Biol. 2001 Oct 2;11(19):1524-7. に記述の方法を用いた。SCNスライス片を異なる容器で別々に培養し、培地の中に測定薬剤を溶解した。
２週間から３週間培養後に、培地に1mMのルシフェリン（luciferin）を添加し、生物発光（bioiluminescense）をCCDカメラ（Spectra Video SV16KV/CT: Pixel Vision, OR）を顕微鏡(Axiovert 135TV: Carl Zeiss, Jena, Germany)で測定した。生物発光は、20分間隔または1時間間隔で測定した。
図７（ａ），（ｂ）は、スライス片の日内リズムに対するphospholylation inhibitors の影響を示している。
図７（ａ），（ｂ）に示すように、日内リズムの周期は、ワイルドタイプ（ＷＴ，ｗｔで表示）の器官培養にU0124を添加したときは変化ないが、U0126を添加すると1.8時間近く延長した。一方、ＲＧＳ１６ノックアウトマウス（ホモ）（ＫＯ，ＲＧＳ-/-で表示）ではU0124, U0126を添加しても日内リズムの大きな変動はなかった。
以上のことから、ＲＧＳ１６は、ＭＥＫのリン酸化を介して、視交叉上核細胞の日内リズムを調節していると思われる。
【００２７】
これまでのデータをまとめると、ＲＧＳ１６が細胞の日内リズムを調節するパスウェイは図８に示すようになる。時計遺伝子の一種、ＲＧＳ１６遺伝子は、E-boxとD-boxにより、体内時計の朝にピークのリズムをもって発現され、ＧαiのGTPaseを亢進する。朝に、Ｇαiの不活化はアデニル酸シクラーゼ（adenylate cyclase）を活性化し、cAMPを増加させる。これは、PKAを活性化するとともに、ERKもリン酸化する。活性化されたPKAおよびERKは最終的にCREBをリン酸化する。そして、ＣＲＥを介する遺伝子発現（例えばcFos）が亢進する。また、活性化CREBはPer1遺伝子のプロモーター領域のCREサイトに結合して、Per1遺伝子発現を亢進する。
Per遺伝子、Dbp遺伝子、ＲＧＳ１６遺伝子はCLOCK蛋白質・BMAL1蛋白質ヘテロダイマーによりポジティブに発現制御され、PER蛋白質・CRY蛋白質ヘテロダイマーによりネガティブに発現制御される。このようにCREサイトを介した、シナリオで、膜表面のGPCRはE-boxとD-boxを介して形成される時計遺伝子のコアフィードバック機構（図のピンク背景）により、日内周期の長さを調節している。
【００２８】
以上をまとめると、視交叉上核の背内側部の時計細胞（自律的にリズムを刻む細胞）中に特異的に発現するＲＧＳ１６が細胞時計によって制御され、著明な２４時間リズムを刻むことを明らかにした。このＲＧＳ１６はＧαiに特異的に結合し、アデニル酸シクラーゼ活性をリズミックに調節しており、この結果は、朝特異的に高いcAMPのリズムとなって現れ、これが、ＰＫＡ系と、ＭＥＫ系の両経路を介して、核内での朝のＣＲＥ活性の急激な増大となり、これが、E-box/D-boxで制御される時計遺伝子のコアフィードバックループの転写タイミングを早めている。このような反応は、ＲＧＳノックアウトマウスでは消失しており、これが行動リズム周期の延長となって現れる。体内時計の中枢である視交叉上核では、背内側部の細胞がＧＰＣＲを介する細胞外からのメッセージにより、時計周期を調節している。
【産業上の利用可能性】
【００２９】
本発明は、体内リズム障害用医薬の製造や、体内リズム障害用医薬のスクリーニング法として利用することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＧＳ１６遺伝子発現若しくはＲＧＳ１６蛋白質に影響を与える若しくは影響を受ける蛋白質あるいは遺伝子を有する細胞若しくは組織に、スクリーニング用物質を作用させるステップ（ａ）と、
上記ステップ（ａ）の後、ＲＧＳ１６の発現または活性の変化を測定するステップ（ｂ）と、
を含む体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
請求項１記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ａ）では、視交叉上核の時計細胞又はその培養細胞にスクリーニング用物質を添加する。
【請求項３】
請求項１又は２記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ａ）では、ＲＧＳ１６を有する細胞または組織にスクリーニング用物質を添加する。
【請求項４】
請求項３記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ａ）では、視交叉上核・背内側部又は視交叉上核全体の，細胞又はその培養細胞にスクリーニング用物質を添加する。
【請求項５】
請求項１〜４のうちいずれか１つに記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ｂ）では、ＲＧＳ１６発現をＰＣＲで、発現の変化を測定する。
【請求項６】
請求項１〜４のうちいずれか１つに記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ｂ）では、ｃＡＭP量もしくはＥＲＫリン酸化で測定する。
【請求項７】
ＲＧＳ１６遺伝子発現若しくはＲＧＳ１６蛋白質に影響を与える若しくは影響を受ける蛋白質あるいは遺伝子の発現または活性を調節する物質を有し、体内リズムに関与する疾患の治療に用いられる、体内リズム障害用医薬。
【請求項８】
請求項７記載の体内リズム障害用医薬において、
上記疾患は、睡眠障害、睡眠障害を介する，高血圧・心臓疾患・糖尿病・肥満・うつ病・痴呆、中枢の日内リズム障害に関連する疾患から選ばれる少なくとも１つの疾患である。
【請求項９】
請求項７または８記載の体内リズム障害用医薬において、
上記請求項１〜６のうちいずれか１つのスクリーニング方法を用いてスクリーニングされた物質を有効成分として含んでいる。
【請求項１０】
ＲＳＧ１６を欠損させたノックアウトマウス。
【請求項１】
ＲＧＳ１６遺伝子発現若しくはＲＧＳ１６蛋白質に影響を与える若しくは影響を受ける蛋白質あるいは遺伝子を有する細胞若しくは組織に、スクリーニング用物質を作用させるステップ（ａ）と、
上記ステップ（ａ）の後、ＲＧＳ１６の発現または活性の変化を測定するステップ（ｂ）と、
を含む体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法。
【請求項２】
請求項１記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ａ）では、視交叉上核の時計細胞又はその培養細胞にスクリーニング用物質を添加する。
【請求項３】
請求項１又は２記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ａ）では、ＲＧＳ１６を有する細胞または組織にスクリーニング用物質を添加する。
【請求項４】
請求項３記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ａ）では、視交叉上核・背内側部又は視交叉上核全体の，細胞又はその培養細胞にスクリーニング用物質を添加する。
【請求項５】
請求項１〜４のうちいずれか１つに記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ｂ）では、ＲＧＳ１６発現をＰＣＲで、発現の変化を測定する。
【請求項６】
請求項１〜４のうちいずれか１つに記載の体内リズム障害用医薬のスクリーニング方法において、
上記ステップ（ｂ）では、ｃＡＭP量もしくはＥＲＫリン酸化で測定する。
【請求項７】
ＲＧＳ１６遺伝子発現若しくはＲＧＳ１６蛋白質に影響を与える若しくは影響を受ける蛋白質あるいは遺伝子の発現または活性を調節する物質を有し、体内リズムに関与する疾患の治療に用いられる、体内リズム障害用医薬。
【請求項８】
請求項７記載の体内リズム障害用医薬において、
上記疾患は、睡眠障害、睡眠障害を介する，高血圧・心臓疾患・糖尿病・肥満・うつ病・痴呆、中枢の日内リズム障害に関連する疾患から選ばれる少なくとも１つの疾患である。
【請求項９】
請求項７または８記載の体内リズム障害用医薬において、
上記請求項１〜６のうちいずれか１つのスクリーニング方法を用いてスクリーニングされた物質を有効成分として含んでいる。
【請求項１０】
ＲＳＧ１６を欠損させたノックアウトマウス。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【公開番号】特開２０１１−３６１４３（Ｐ２０１１−３６１４３Ａ）
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−１８３８２１（Ｐ２００９−１８３８２１）
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５００２１３６２７）
【出願人】（５０６１８００４０）ファルマフロンティア株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年８月６日（２００９．８．６）
【出願人】（５００２１３６２７）
【出願人】（５０６１８００４０）ファルマフロンティア株式会社 (9)
【Ｆターム（参考）】
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