光学活性キラルアミンの調製方法
本発明は、例えば医薬製品の合成における中間体として使用できる光学的に純粋な二級アミンの製造に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、光学活性キラルアミンの調製方法に関する。
【０００２】
キラルアミンは医薬、農業化学および化学工業において重要な役割を果している。それらは屡々、セファロスポリンまたはピロリジン誘導体のような種々の生理学的に活性な、例えば医薬的に活性な物質を製造するための中間体またはシントン（synthon）として使用される。キラルアミンの多くの種々の応用においては、（Ｒ）エナンチオマーまたは（Ｓ）エナンチオマーの何れか特定の光学活性形態だけが、望ましい生理学的活性を有している。従って、光学活性形態のキラルアミンを調製する方法を提供するための明瞭な必要性が存在している。
【０００３】
これらの必要性は、キラルカルボン酸助剤の添加を介して、ジアステレオマー塩の結晶化によりキラルアミンを調製することによって部分的に満たされる（Breuer et al., Angewandte Chemie (2004) 116, 806-843）。他の化学的方法は、Ｃ＝Ｎ二重結合を備えたプロキラル前駆体を還元することによるエナンチオ選択的合成を使用する。
【０００４】
更に、プロテアーゼ、アミダーゼまたはリパーゼのような種々の酵素を使用して、ラセミ体を立体選択的に開裂することが知られている（Bornscheuer and Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim）。また、特定のトランスアミナーゼ、即ち、α−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを含むα−トランスアミナーゼが、光学的に純粋なアミノ酸の調製に適していることも知られている（Bartsch et al., Appl. Environm. Microbiol. (1996) 62, 3794-3799, Cho et al., Biotechnol. Bioeng. (2003) 83, 226-234, JP 011 53084 A2 (1998), JP 633 04986 A2 (1988), EP 0 248 357 A2 and Ziehr et al., Biotechnol. Bioeng. (1987) 29, 482-487）。しかし、これら先行技術の方法は種々の欠点を伴っている。酵素的プロセスは、古典的な方法とは対照的に、通常は好ましい温和な条件を用いて合理的な立体選択性を達成するが、それらは通常、その基質特異性、エナンチオ選択性および／または変換速度が工業的に適用可能なプロセスとして充分には高くない酵素を使用する。更に、光学活性アミンの調製にトランスアミナーゼを使用することの最も顕著な欠点の一つは、頻繁に観察される基質阻害および生成物阻害の現象によって代表される。従って、本発明の一つの目的は、光学活性キラルアミンを調製するための改善された方法、特に、改善された基質特異性、改善されたエナンチオ選択性を備え、特に遊離体（educt）の１００％までの変換を可能にする方法を提供することである。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、下記のａ）〜ｃ）を含んでなる光学活性キラルアミンの調製方法を提供することによって、本発明の基礎にある技術的問題を解決するものである：ａ）アミノ受容体およびアミノ供与体を提供すること；ｂ）該アミノ受容体およびアミノ供与体をトランスアミナーゼ、特に（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼと反応させることと；ｃ）望ましい光学活性キラルアミンおよびα−ケトン副生成物を得ること。本発明の好ましい実施形態に従えば、工程ｃ）で得た光学活性キラルアミンは、後続の更なる任意工程において、工程ｃ）で得た反応混合物から単離および精製される。
【０００６】
本発明の反応は、原理的には下記のスキームに従う：
【化１】
【０００７】
従って、本発明は、アミノ供与体からアミノ受容体へのアミノ基のトランスアミノ化のために、少なくとも一つのトランスアミナーゼを使用することによって、キラルアミンの非対称合成のための方法を提供する。使用される特定のトランスアミナーゼのエナンチオ選択性に依存して、望ましい光学コンフィギュレーションの光学活性キラルアミン、即ち、（Ｒ）もしくは（Ｓ）エナンチオマーが得られる。こうして、本発明の一つの実施形態を使用することにより、非対称合成のための（Ｓ）選択的トランスアミナーゼは、キラルアミンの望ましい（Ｓ）エナンチオマーを発生するのに対して、本発明のもう一つの実施形態を使用すると、（Ｒ）選択的トランスアミナーゼは望ましい（Ｒ）エナンチオマーを発生する。望ましい光学活性アミンに加えて、この反応は、使用したアミノ供与体からのケトン副生成物、特にα−ケトン副生成物、並びに潜在的には未変換のアミノ受容体およびアミノ供与体をもたらす。
【０００８】
本発明の関係において、トランスアミナーゼは、アミノ基の転移を触媒するピリドキサールリン酸依存性の酵素である。トランスアミナーゼは、Ｅ．Ｃ．２．６．１．Ｘに分類される。本発明の特に好ましい実施形態において、トランスアミナーゼは、（Ｒ）−または（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼであり、特に好ましい実施形態においてはω−トランスアミナーゼである。
【０００９】
本発明の関係において、ω−トランスアミナーゼは、好ましくは分類コードＥ．Ｃ．２．６．１．１８をもった酵素である。これらのアミノトランスアミナーゼは、それらが基質として主にアミンを使用することを特徴とする。これらの酵素は更に、ω−トランスアミナーゼ触媒反応の１より大きい平行定数を示すことを特徴とする。本発明に従って使用され得るω−トランスアミナーゼは、例えば、Iwasaki et al., Biotechnol. Lett. (2003) 25, 1843-1846, Shin et al., Biotechnol. Bioeng. (1997) 55, 348-358, Shin and Kim, Book of Abstracts, 217th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., March 21-25, (1999) 180, Shin and Kim, Biosc. Biotechnol. Biochem. (2001) 65, 1782-1788 and Shin and Kim, Biotechnol. Bioeng. (1998) 60, 534-540に記載されている。
【００１０】
こうして、本発明の好ましい実施形態において、トランスアミナーゼ、特に、本方法に使用されるω−トランスアミナーゼは、特に、Vibrio fluvialis、特にＪＳ１７株から得られたω−トランスアミナーゼである。更に好ましい実施形態において、該トランスアミナーゼは、Alcaligenes denitrificans、特にＹ２ｋ−２株由来のものである。更に好ましい実施形態において、該トランスアミナーゼは、Klebsiella pneumoniae、特にＹＳ２Ｆ株由来のものである。更に好ましい実施形態において、該トランスアミナーゼは、Bacillus thuringiensis、特にＪＳ６４株由来のものである。株の名称については、上記のShin and Kim, 1998を参照されたい。勿論、本発明はまた、トランスアミナーゼ（特にω−トランスアミナーゼ）、トランスアミナーゼ（特にω−トランスアミナーゼ）を含有する微生物もしくは細胞のような生物の抽出物、またはトランスアミナーゼ（特にω−トランスアミナーゼ）を含んでなる生きたもしくは死んだ細胞もしくは微生物自身の用語の下でも理解される。このような微生物もしくは細胞、または抽出物もしくはトランスアミナーゼ酵素は、固定化された形態または非固定化形態で使用されてよい。トランスアミナーゼ、特にω−トランスアミナーゼはまた、組換えにより製造された天然に存在するかまたは遺伝子的に修飾されたトランスアミナーゼ、特にω−トランスアミナーゼであってよく、これは上記で述べた生物またはその均等物の一つに含まれる核酸配列、またはその誘導体により部分的または完全にコードされる。
【００１１】
本発明の関係において、光学活性キラルアミンの用語は、エナンチオマー的に活性なキラルアミンの用語と同じ主題に関する。これらの用語は、特に、望ましくないエナンチオマーを実質的に含まないか、更に好ましい実施形態では望ましくないエナンチオマーを含まない調製品に関する。従って、光学活性キラルアミンは、実質的に、一方のエナンチオマーを過剰に含んでなるか、または一方のエナンチオマーのみからなるものである。
【００１２】
特に、本発明の関連において、光学活性キラルアミンは少なくとも７０％、特に９０％以上、最大では＞９９％の光学純度を有する。
【００１３】
本発明において、光学純度は、一方のエナンチオマーの他方のエナンチオマーに対する過剰％で与えられる。従って、％での光学純度は、（Ｒ）エナンチオマー濃度と（Ｓ）エナンチオマー濃度の差と、両エナンチオマー濃度の合計との商である［％でのＡの光学純度＝（［Ａ］−［Ｂ］）：（［Ａ］＋［Ｂ］）×１００であり、ここでのＡおよびＢは（Ｒ）および（Ｓ）エナンチオマーの濃度である。逆も同様］。
【００１４】
本発明において、アミノ受容体は、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、特に１００％の変換率で、望ましいキラルアミンに変換されることが好ましい。光学純度および変換率を解析するための濃度は、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、または光学法もしくは蛍光法を用いて決定することができる。
【００１５】
本発明において、アミノ受容体は、トランスアミナーゼ、特にω−トランスアミナーゼによってアミノ供与体から転移されるアミノ基を受容することができる分子である。本発明の特に好ましい実施形態において、アミノ受容体はケトン官能基を含んでいる。本発明の特に好ましい実施形態において、アミノ受容体は、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、アセトフェノン、２−ケトグルタレート、３−オキシブチレート、２−ブタノン、３−オキソピロリジン（３−ＯＰ）、３−ピリジルメチルケトン（３−ＰＭＫ）、３−オキソ酪酸エチルエステル（３−ＯＢＥＥ）、３−オキソペンタン酸メチルエステル（３−ＯＰＭＥ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピペリジノン、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピロリジン（Ｂ３ＯＰ）、３−オキソ−ピペリジン、アルキル−３−オキソ−ブタノエート、メトキシアセトンおよび１−オキソテトラロンからなる群から選択される。
【００１６】
特に好ましい実施形態において、アミノ受容体はＢ３ＯＰである。
【００１７】
本発明において、アミノ供与体は、トランスアミナーゼ、特にω−トランスアミナーゼを使用してアミノ基をアミノ受容体へと提供できる分子である。特定の好ましい実施形態において、アミノ供与体はアミンまたはアミノ酸である。
【００１８】
特に好ましい実施形態において、アミノ供与体は、β−アラニン、アラニン、特にＤ，Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニンもしくはＤ−アラニン、α−メチルベンジルアミン（α−ＭＢＡ）、グルタメート、フェニルアラニン、グリシン、３−アミノブチレート、イソプロピルアミン、２−アミノブタン、γ−アミノブチレート、およびそれらの何れかの塩、例えば塩化物からなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、得られたケトン生成物は、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、グリオキシル酸、その塩、アセトフェノン、２−ケトグルタレート、アセトン、３−オキソブチレート、２−ブタノン、３−オキソピロリジン（３−ＯＰ）、３−ピリジルメチルケトン（３−ＰＭＫ）、３−オキソ酪酸エチルエステル（３−ＯＢＥＥ）、３−オキソペンタン酸メチルエステル（３−ＯＰＭＥ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピペリジノンおよびＮ−１−ｂｏｃ−３−オキソピロリジン（Ｂ３ＯＰ）、またはこれらの何れかの塩、例えば塩化物であってよい。
【００１９】
特に好ましい実施形態において、アミノ供与体はアラニン、特にＬ−アラニンである。
【００２０】
更に好ましい実施形態において、本発明は、光学活性キラルアミンを調製する方法に関し、該キラルアミンは光学活性アミノ基を有する一群のアミン、特にアルキル基、分岐アルキル基、またはアリールアルキル基を備えたアミンから選択される。特に、これらのアミン（特に単環式または二環式のアミン）は、特に５員もしくは６員の環式、またはＳ−置換、Ｏ−置換もしくはＮ−置換のへテロ環式炭化水素または芳香族アミン、特にアルキル置換もしくはアルコキシ置換芳香族アミンである。好ましい実施形態において、得られるキラルアミンは、フェニルアラニン、アラニン、３−アミノピペリジン、アルキル−３−アミノ−ブタノエート、３−アミノピロリジン（３−ＡＰ）、３−ピリジル−１−エチルアミン（３−ＰＥＡ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−アミノピロリジン（Ｂ３ＡＰ）、３−アミノ酪酸エチルエステル（３−ＡＢＥＥ）、３−アミノペンタン酸メチルエステル（３−ＡＰＭＥ）、α−メチルベンジルアミン（α−ＭＢＡ）、１−アミノテトラリン、α−メチル−４−（３−ピリジル）−ブタンアミン、グルタメート、β−アミノブチレート、ｓｅｃ−ブチルアミン、メトキシイソプロピルアミン、３−アミノピロリジンの誘導体、１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジン、セファロスポリン、およびセファロスポリンの誘導体からなる群から選択される。
【００２１】
従って、特に好ましい実施形態において、本発明は、３ＯＰを、（Ｓ）−もしくは（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｓ）もしくは（Ｒ）−３ＡＰを得ることを予測している。
【００２２】
更に好ましい実施形態において、本発明は、３−ＰＭＫを、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｒ）−もしくは（Ｓ）３−ＰＥＡを得ることを予測している。
【００２３】
更に好ましい実施形態において、本発明は、３−ＯＢＥＥを、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ＡＢＥＥを得ることを予測している。
【００２４】
更に好ましい実施形態において、本発明は、３−ＯＰＭＥを、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ＡＰＭＥを得ることを予測している。
【００２５】
更に好ましい実施形態において、本発明は、Ｂ３ＯＰを、（Ｒ）もしくは（Ｓ）選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体、特にアラニンと反応させて、光学活性の（Ｒ）もしくは（Ｓ）Ｂ３ＡＰを得ることを予測している。
【００２６】
更に好ましい実施形態において、本発明は、光学活性のＢ３ＡＰおよびピルベートを得るための、トランスアミナーゼの存在下での、Ｂ３ＯＰとアミノ供与体、特にアラニンとの間の反応に関し、ここでの反応は、５．０〜９．５、好ましくは６．０〜７．０、特に６．０〜６．９のｐＨにおいて、３０〜７０分、特に４０〜６５分、特に５０〜６０分の間行われる。
【００２７】
特に好ましい実施形態において、前記トランスアミナーゼは、（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼである。更なる好ましい実施形態において、前記トランスアミナーゼは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼである。
【００２８】
好ましい実施形態において、前記Ｂ３ＯＰのアミノ供与体、特にアラニンとの反応は、少なくとも一つのピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）の存在下で行われる。更なる好ましい実施形態において、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼの存在下での前記Ｂ３ＯＰとアミノ供与体、特にアラニンとの反応は、ＰＤＣの作用によりピルベートから形成されたアセトアルデヒドを除去するために、反応混合物中にガス状窒素を同時に導入しながら行われる。
【００２９】
更なる好ましい実施形態において、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼの存在下での前記Ｂ３ＯＰとアミノ供与体、特にアラニンとの反応は、ＰＤＣの作用により形成されたピルベートから得られたアセトアルデヒドを除去するために、少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の存在下で行われる。
【００３０】
更なる好ましい実施形態において、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼの存在下でのＢ３ＯＰとアミノ供与体、特にアラニンとの反応は、同時にガス状窒素を反応混合物中に導入しながら行われ、ここではＰＤＣの作用により形成されたピルベートから得られたアセトアルデヒドを除去するために、少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼが前記反応混合物中に存在せしめられる。
【００３１】
本発明の更なる好ましい実施形態において、本発明は、アセトフェノンを、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｒ）もしくは（Ｓ）α−ＭＢＡを得ることを予測している。
【００３２】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、アミノ受容体として、特に単環式もしくは二環式のオキソ基を含有する５〜６員の環状、またはＳ−、Ｏ−もしくはＮ−置換のヘテロ環炭化水素もしくは芳香族、特にアルキル−もしくはアルコキシ−置換芳香族を、アミノ供与体および（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼと反応させて、光学活性アミン、特に単環式もしくは二環式の、特に５〜６員の環状、またはＳ−、Ｏ−もしくはＮ−置換のヘテロ環炭化水素もしくは芳香族アミン、特にアルキル−もしくはアルコキシ−置換芳香族アミンを、特に（Ｓ）もしくは（Ｒ）形態で得ることを予測している。
【００３３】
本発明の特に好ましい実施形態においては、アミノ受容体およびアミノ供与体が水性媒質、例えば生理学的緩衝液中においてトランスアミナーゼと反応される。特に好ましい実施形態において、アミノ基転移反応は、５．０〜９．５または５．０〜９．０、特に７〜８．５．の範囲のｐＨにおいて行われる。本発明は、特に好ましい実施形態において、アミノ受容体およびアミノ供与体を、６．０〜７．０、好ましくは６．０〜６．９のｐＨ値において反応させることを予測している。
【００３４】
特に好ましい実施形態において、当該反応は、１０〜６５℃、好ましくは２０〜５０℃、特に１８〜２５℃、好ましくは室温または３４℃〜３９℃の温度範囲、特に３７℃で行われる。本発明の更なる好ましい実施形態において、アミノ受容体およびアミノ供与体 は、１：５０〜１：２００、特に１：５０〜１：１００、特に１：１００、特に１：１〜１：５、特に１：１〜１：２のモル比で提供される。本発明の好ましい実施形態において、酵素活性は１〜２０．０００μｍｏｌ／ｍｉｎであってよい。
【００３５】
更なる好ましい実施形態において、当該反応は３０〜７０分、好ましくは４０〜６５分、特に５０〜６０分の時間行われる。
【００３６】
特に好ましい実施形態において、本発明は、上記に従う光学活性キラルアミンの調製方法に関し、これに従えば第一の工程ａ）において、アミノ受容体およびアミノ供与体が準備され、第二の工程ｂ）において、アミノ受容体およびアミノ供与体は少なくとも一つののω−トランスアミナーゼと反応させられ、第三の工程ｃ）においては、光学的に純粋なキラルアミンおよびα−ケトン副生成物を得、ここで更なる工程ｄ）において、工程ｃ）で得られたケトン副生成物、特にα−ケトン副生成物が、得られた反応混合物から除去され、特に、酵素との反応によって除去されるが、これは特にデカルボキシラーゼ、シンターゼまたはデヒドロゲナーゼからなる群から選択される酵素を使用した酵素的開裂によるることを意味する。
【００３７】
特に好ましい実施形態において、工程ｃ）で得られたケトン生成物、特にピルベートは、例えばSaccharomyces cerevisiae、Zymomonas mobilis またはZymobacter palmae由来のピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）との反応によって除去され、それによって好ましくはアセトアルデヒドおよびＣＯ２を産生する。
【００３８】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用によって除去され、またそれによって形成されたアセトアルデヒドは、例えば化学的、酵素的または物理的処理によって除去される方法に関する。
【００３９】
更になる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用によって除去され、またそれにより形成されたアセトアルデヒドが、例えばガス状窒素を反応混合物中に供給することによって除去され、好ましくは前記ガス状窒素を連続的に前記反応混合物中に供給して、前記アセトアルデヒドを反応混合物から除去する方法に関する。
【００４０】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用により除去され、またそれにより形成されたアセトアルデヒドが、該アセトアルデヒドを少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と反応されて、前記アセトアルデヒドが反応混合物から除去され、それをエタノールに変換される方法に関する。
【００４１】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートが、ＰＤＣの作用によって除去され、またそれによって形成されたアセトアルデヒドが、前記反応混合物に減圧を加えることによって除去される方法に関する。
【００４２】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用により除去され、またそれにより形成されたアセトアルデヒドが化学反応により除去される方法に関する。
【００４３】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用により除去され、またそれにより形成されたアセトアルデヒドが、前記反応混合物中にガス状窒素を供給すること、好ましくは、前記ガス状窒素を連続的に前記反応混合物中に供給することによって除去され、加えて、前記アセトアルデヒドが少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と反応されて、前記アセトアルデヒドが前記反応混合物から除去され且つそれがエタノールに変換される方法に関する。
【００４４】
更なる好ましい実施形態においては、工程ｃ）で得られたケトン生成物、特にピルベートが、例えば大腸菌（Escherichia coli）由来のラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）との反応により除去され、それによって好ましくはＬ−ラクテートを生じる。
【００４５】
更なる好ましい実施形態において、工程ｃ）で得られたケトン生成物、特にピルベートは、例えば大腸菌（Escherichia coli）由来のラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）との反応により除去され、それによって好ましくはＬ−ラクテートを生じる。
【００４６】
更なる好ましい実施形態において、工程ｃ）で得られたケトン生成物、特にピルベートは、アセトラクターゼシンターゼとの反応により除去され、それにより好ましくはアセトラクテートを産生する。
【００４７】
本発明の更に好ましい実施形態において、工程ｃ）において得られたケトン生成物、特にピルベートは、反応混合物から連続的に除去される。
【００４８】
これらの特に好ましい実施形態は、本発明の副生成物としてのケトン生成物が平衡反応から除去されるので、特に高い変換率を得る利点を提供する。該反応は生成物の方向に向けて駆動され、それにより高い立体選択性で、望ましい生成物への非常に高い変換率を提供する。
【００４９】
本発明はまた、特に、３−アミノピロリジン誘導体、セファロスポリン、セファロスポリンの誘導体、ヘテロ環状ホウ素酸、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ドーパ）、α−メチルドーパ、Ｄ−フェニルグリシン、β−ヒドロキシフェニルグリシン、ホスフィノトリチン（phosphinothricine）、ピリミド誘導体 およびピロリドン誘導体からなる群から選択される生理学的に活性な化合物もしくはそれらの前駆体、および／またはその製造における中間体の調製方法であって、上記で特定した本発明の方法の何れかが用いられる方法に関する。本発明の関係において、生理学的に活性な化合物とは、植物、動物、ヒト、酵母、またはプロトゾア、バクテリアもしくはウイルスのような微生物の何れかにおいて生理学的に活性な、即ち、当該生物の代謝と相互作用する化合物である。
【００５０】
本発明の更に好ましい実施形態は、従属請求項の主題である。
【００５１】
以下の実施例および添付の図面において、本発明を更に詳細に説明する。
【００５２】
添付の図面は、本発明を例示するものである。
【００５３】
実施例１：Ｂ３ＡＰの不斉合成
Ｂ３ＡＰの不斉合成は、１．５ｍLの反応管内で行われた。アミン受容体としてのＢ３ＯＰは、５ｍＭ（７，５μｍｏｌ）の濃度で使用された。使用されたアミノ供与体であるＬ−アラニンの濃度は５ｍＭであった。使用した試薬および反応条件は、下記の表Ｉから明らかである。
【００５４】
表１：アラニンからＢ３ＯＰへのアミへとアミノ基を転移させるために（Ｓ）−ωトランスアミナーゼを使用した、不斉（Ｓ）−Ｂ３ＡＰ合成のための反応条件
【表１】
【００５５】
使用した緩衝液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７であった。ＴＡ７は、ビブリオ・フルヴィアリス（Vibrio fluvialis）由来のω−トランスアミナーゼ（Juelich Fine Chemicals, Germany）を意味する。ＴＡ８は、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans）由来のωトランスアミナーゼ（Julich Fine Chemicals, Germany）を意味する。ラクテートデヒドロゲナーゼとしては、大腸菌（Escherichia coli）の抽出物を使用した。ＮＡＤＨは、１０ｍＭの最終濃度まで添加された。ピルベートデカルボキシラーゼの濃度は変化された。１．５単位（２０μＬ）および１５単位（２００μＬ）のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ１）を使用した。２単位（３．４μＬ）および２０単位（３４μＬ）の、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）のピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ２）を使用した。
【００５６】
表２：Ｂ３ＡＰの不斉合成のためにＴＡ８を使用して得られた変換率および光学純度。計算はＧＣ分析に基づいて行った。
【表２】
【００５７】
次に、上記の表２を参照すると、ω−トランスアミナーゼＴＡ８を使用した６回のランの各々において、得られた（Ｓ）−Ｂ３ＡＰについての非常に高度の光学純度を達成できたことが明らかである。また、ＴＡ７またはＴＡ８の何れを使用するかとは独立に、反応の平衡が影響されなければ、変換の程度は中程度に過ぎなかった（ラン１）。１０〜５０倍過剰のアラニンを使用することは、変換率を僅かに改善するに過ぎなかった。ラン３，４，５および６において、ピルベートを意味するケトン生成物は、トランスアミノ化反応の間、平衡反応から除去された。大腸菌由来のラクテートデヒドロゲナーゼと共にＴＡ８を使用すること（ラン６）は、極めて改善された変換率を導く一方で、エナンチオ選択性を維持し、更には改善した。ザイモモナス・モビリス由来のピルベートデデカルボキシラーゼ（ラン３〜５）によって与えられるエナンチオ選択性についても、本質的に同じ有効性が維持される。しかし、２４時間反応されたときは、ＰＤＣ１は変換率を僅かに増大させたに過ぎず、ＰＤＣ２は変換率を温和に増大させた（ラン４）のに対して、７２時間の反応においては、変換率は劇的に改善された。全ての反応は、７２時間行われたラン５を除き、２４時間行われた。
【００５８】
図は、表１に従って行われた反応の薄層クロマトグラムを示している。「Ａ」は、アルカリゲネス・デニトリフィカンス由来のω−トランスアミナーゼを示しているのに対して、「Ｖ」は、ビブリオ・フルヴィアリス由来のω−トランスアミナーゼを示している。「Ｋ」は、Ｔａ７またはＴＡ８を単独で使用したラン１を示している（ラン１）。ＰＤＣ１は、サッカロマイセス・セレビシエのデカルボキシラーゼを用いたランを示し（ラン３）、ＬＤＨは、大腸菌由来のラクテートデヒドロゲナーゼを用いたランを示し（ラン６）、またＰＤＣ２は、ザイモモナス・モビリス由来のピルベートデカルボキシラーゼ（２４時間後および７２時間後）を用いたランを示している（ラン４および５）。こうして、これらの結果は、プロキラルケトンＢ３ＯＰからの（Ｓ）−Ｂ３ＡＰの生成が、非常に高いエナンチオ選択性で実施できたことを明瞭に示している。しかし、調製プロセスにおいてω−トランスアミナーゼを単独の酵素として使用することは、温和な変換を導く。この温和な変換率は、特にラクテートデヒドロゲナーゼまたはピルベートデカルボキシラーゼを使用して、平衡状態からピルベートを除去することによって一般に改善することができた。ピルベートデカルボキシラーゼを使用することは、特に、補因子循環（ＮＳＤＨ）が必要でないという利点を有する。それは更に、有利なことにＰＤＣを用いたピルベートの酵素的除去を提供し、それによって生成物阻害（生成物ケトン）を除去または回避し、反応平衡を右側に引っ張って、より高い変換率（理想的な場合は１００％）を達成する追加の利点を提供する。
【００５９】
実施例２：（Ｓ）−αＭＢＡのアセトフェノンへの変換反応におけるω−トランスアミナーゼ活性のｐＨ依存性
この合成は、石英キュベット内において、５０μＬの１００ｍＭピルベート、４単位／ｍＬのω−ＴＡビブリオ・フルビアリス（V. fluvialis：以下ではＶｆｌともいう）（１２μＬ）および３８８μＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ）を用い、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．４のｐＨ変動を用いて、０．２段階で実行された。該反応は、アミノ供与体として５０μＬの１００ｍＭ（Ｓ）−αＭＢＡを用いて開始され、２５０〜２６０ｎｍでの吸収の増大が測定された。この吸収の増大は、形成されたアセトフェノンによるものである。他の基質は、吸収に対して微々たる寄与しか有していないので、反応の速度はアセトフェノンの吸収を測定することによって決定することができる。ｐＨ７．４に達した値が１００％に設定され、他のｐＨ値についての相対的活性は、図２から明らかなようにして計算された。図２は、与えられたｐＨ値に従属した、V. fluvialis・ω−ＴＡの相対的活性を示している。
【００６０】
図２は、６．０、６．２、または６．４のようなより低いｐＨ値において、未だかなりの活性が存在すること、例えばｐＨ６．０では１１％の活性が存在することを示している。従って、この結果は、低ｐＨでも有意なトランスアミナーゼ活性を得ることが可能であり、基質を低ｐＨで反応させることを可能にすること、またより高いｐＨ値に対して感受性であるＰＤＣを使用することによって変換率を増大させることが可能であることを示している。
【００６１】
実施例３：異なるｐＨ値でのＢ３ＡＰの不斉合成
この実施例では、ピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）の存在下および不存在下での、アラニンおよびＢ３ＯＰからのＢ３ＡＰの不斉合成が示される。
【００６２】
各ｐＨ値６．０、６．４および７．０について、３回の実験ランが行われた。ラン１はザイモモナス・モビリスのＰＤＣ（野生型細胞抽出物）を使用し、ラン２は、ザイモモナス・パルマエ（大腸菌中での組換え）を使用し、ラン３はＰＤＣを伴わずにトランスアミナーゼだけを使用した対象であった。比較可能な結果を得るために、両方のＰＤＣの活性が、アルコールデヒドロゲナーゼ検定を用いてｐＨ６で決定され、また同じ量のＰＤＣ活性が上記で特定されたランにおいて使用された。
【００６３】
表３は、使用された物質の容積をμＬで与えている。各反応ランは、６．０、６．４および７．０のｐＨ値において３回行われた。ｐＨ値は、Ｂ３ＯＰ基質溶液の緩衝剤によって調節された。ＰＤＣの活性は、ｐＨ７において約２．５単位／ｍＬであった。また、基質濃度および酵素濃度は下記の表３から明らかである。１０分、３０分、６０分および１２０分後に、１００μＬのサンプルを採取し、１００μＬの１Ｍ・ＮａＯＨの添加により反応を停止させた。Ｂ３ＡＰ濃度の定量はＣＥ（キャピラリー電気泳動）を使用して行われた。
【表３】
【００６４】
下記の表４は、異なるＰＤＣについて、異なるｐＨ値での変換率を示している。ＰＤＣの使用が変換率を増大させることが明らかである。Ｚ．ｐａｌｍａｅ（Ｚｐａ）は、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ（Ｚｍｏ）由来のＰＤＣよりも幾分高い変換率を生じることも明らかである。また、より低いｐＨ値、例えば６．０または６．４では、ＰＤＣを用いるランにおいて顕著な変換率増大が観察され、これはＰＤＣを含まない対照では見られないことも明らかである。全ての反応ランにおいて、１２０分後に変換率が減少することを観察することができるであろう。
【表４】
【００６５】
実施例４：不斉合成反応の種々の反応体の存在下でのＢ３ＡＰの安定性
種々の反応体の存在下におけるＢ３ＡＰの安定性を示すために、下記の表５に列記した種々の物質の存在下での１ｍＭのＢ３ＡＰのインキュベーションを、反応管内で３時間行った。
【００６６】
この実施例は、６および７のｐＨ（リン酸ナトリウム緩衝液）において実施された。物質を反応させた直後に、第一のサンプルＴ０を採取し、３時間後にもう一つのサンプルＴ１を採取した。抽出の後に、ＣＥにより、内部標準（αＭＢＡ）を用いてアミン濃度を決定した。得られた濃度の差から、Ｂ３ＡＰ濃度の減少％を計算した（図３参照）。
【表５】
【００６７】
図３から、異なる反応体は、Ｂ３ＡＰＰ濃度に有意に影響しないことが明らかである（ラン１〜９）。反応ラン１１〜１３は、アセトアルデヒドの影響を示している。ラン１１からは、トランスアミナーゼの不存在下ではＢ３ＡＰ濃度の低下がないのに対して、トランスアミナーゼおよびアセトアルデヒドの存在下では、Ｂ３ＡＰ濃度の強い低下が観察され得ることが明らかである。アセトアルデヒドは、トランスアミナーゼ反応において、ピルベートのようなアミノ受容体として機能し、明らかにＢ３ＡＰ濃度の減少を導く。
【００６８】
実施例５：アミノ受容体であるピルベートおよびアセトアルデヒドとの、Ｂ３ＡＰの反応
この実施例では、基質Ｂ３ＡＰおよびピルベートについて、並びにＢ３ＡＰおよびアセトアルデヒドについての、V. fluvialis およびA. denitrificansのω−ＴＡのトランスアミナーゼ活性が示される。
【００６９】
２ｍＭのＢ３ＡＰを、２ｍＭのピルベートまたは２ｍＭのアセトアルデヒドと反応させた（２単位／μＬのトランスアミナーゼに対応して、０．５μＬの反応容積当たり３６μＬのAlcaligenes denitrificans (Ade)または６μＬのVibrio fluvialis (Vfl)-トランスアミナーゼを３０分間反応させた）。図４はその結果を示している。従って、両方の酵素によって、ピルベートおよびアセトアルデヒドの両方を用いて、何等の有意な差を伴わずに、Ｂ３ＡＰはＢ３ＯＰに変換された。
【００７０】
実施例６：ｐＨ６の減圧下でのＢ３ＡＰの不斉合成
この実施例では、不斉合成反応のための反応混合物に減圧が適用されて、Ｂ３ＡＰが形成された。対照として、同じ反応を正規圧においてＰＤＣなしで行った。
【００７１】
反応条件：
最終容積：１．５ｍＬ
５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６
３００μＬのVibrio fluvialis-トランスアミナーゼ
６０μＬのＺｐａ−ＰＤＣ（ｐＨ７での８単位／ｍＬに対応する）
５ｍＭのＢ３ＯＰ
１０ｍＭのＤ，Ｌ−アラニン
０．１ｍＭのＴＰＰ、ＰＬＰ
５ｍＭのＭｇＣｌ２
減圧は、ロータリーエバポレータを使用して適用された（１５０ｍＢａｒ）。測定は、ＣＥを使用して行った。
【００７２】
図５は、種々の圧力についての、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの経時的な変換を示している。この変換は、適用される圧力から殆ど独立であることが明らかである。１５０ｍｂａｒの圧力での変換は、到達した最大変換率に関しては、１０００ｍばｒの圧力での変換と同様であった。
【００７３】
実施例７：種々のピルベートデカルボキシラーゼの比較
この実施例では、三つの異なるピルベートデカルボキシラーゼを使用した。この反応条件は、７のｐＨを使用した場合を除き、実施例６のものに対応している。Z. mobilis、Z. palmae由来のＰＤＣ、並びにバイオキャタリティクス社から得たＰＤＣ（カタログ番号ＰＤＣ−１０１）を使用した。ＡＤＨ検定におけるＰＤＣの活性は同一であった（１．６単位／ｍＬ）。
【００７４】
図６は、三つの全てのＰＤＣは本質的に同等の変換をもたらすことを示している。
【００７５】
実施例８：Ｂ３ＯＰの３ＡＰへの変換に対する、酵素および共基質の濃度の影響
この実施例では、アラニンをアミノ供与体として使用したＢ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換に対する、ＰＤＣの濃度の影響が示される。更に、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換に対するアラニン濃度の影響が示される。
【００７６】
反応条件は、７のｐＨが使用されたことを除き、また他に言及しなければZymobacter palmae由来のＴＡが使用されたことを除き、実施例６に与えられている。
【００７７】
図７から明らかなように、ＰＤＣなしの反応では、アラニン濃度の５ｍＭから２５ｍＭへの５倍の増大は、２倍の変換率をもたらす（２時間後、５．３％に対して１２％）。ＰＤＣの存在においては、５倍アラニン過剰での変換率は２倍に増加する（９０分後に、１７％に対して３０％）。通常のアラニン濃度において、ＰＤＣの量が１．６単位／ｍＬから５０単位／ｍＬにまで増大する場合、変換率もまた増大するが、倍率は＜２に過ぎない（４０分後、１７％に対して２９％）。
【００７８】
更なる実験ランでは、６および７のｐＨにおいて、アラニン過剰およびＰＤＣ過剰の組合せによる影響が示された。該反応はｐＨ６においてより速い一方、４９％の変換率に達した後には、Ｂ３ＡＰ濃度もまたより速く減少する。ｐＨ７においては、変換率は５６％まで増大した。
【００７９】
実施例９：Ｂ３ＡＰの不斉合成に対するアラニン濃度の影響
四つの反応において、５ｍＭ、２５ｍＭ、１１０ｍＭ、３００ｍＭおよび５００ｍＭのアラニン濃度が使用された。各ランについて、ＰＤＣを伴わない一つの対照およびＰＤＣを伴った一つの反応が行われた。ｐＨ値は７．０に調節された。サンプルは、３時間の反応時間について半時間ごとに採取された。図８に与えられた変換のための反応時間は、５ｍＭについて４０分、２５ｍＭについて６０分、１１０〜５００ｍＭについて９０分であった。
【００８０】
図８は、増大したアラニン濃度における不斉Ｂ３ＡＰ合成の変換を示している。
【００８１】
図８は、変換率が６０〜７０％に達し得ることを明瞭に示している。アラニン濃度を２５ｍＭから１１０ｍＭに増大させることは、Ｂ３ＯＰからＢ３ＡＰへの変換に対して顕著な影響を有すること、および更に５００ｍＭにまで増大させることは、変換率に対して僅かにしか影響しないことが明らかである。変換率に対するＰＤＣの影響は、アラニン濃度を増大させるに伴って減少する。
【００８２】
対照反応のデータから、Ｂ３ＡＰ合成の平衡常数は次のように計算される：
［Ｂ３ＡＰ］＝［Ｐｙｒ］
［Ｂ３ＯＰ］＝Ｃ０，Ｂ３ＯＰ−［Ｂ３ＡＰ］
［Ａｌａ］＝Ｃ０，Ａｌａ−［Ｂ３ＡＰ］
従って、測定されたＢ３ＡＰ濃度を使用して、平衡常数は次のように計算された：
【表６】
【００８３】
表６は、計算された値を示している。従って、Ｂ３ＡＰとの反応についての平衡常数は、３．１×１０−３である。従って、基質Ｂ３ＯＰは、他のケトンとは対照的に、不斉合成のための適切な基質である。
【００８４】
実施例１０：Ｂ３ＡＰの不斉合成に対するＰＬＰの影響
この実施例では、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換に対するＰＬＰ（ピリドキサール−５’−リン酸）の影響が示される。以下の三つの反応ランが試験された。
【００８５】
ａ） 更なるＰＬＰの添加なしで、０．１ｍＭのＰＬＰを使用するラン１
ｂ） ラン２では、反応の最中に、反応媒質中のＰＬＰの存在に起因する黄色の発色が消失したら直ちにＰＬＰを追加した。この目的のために、１〜２μＬの飽和ＰＬＰ溶液を添加し、それによって強い黄色の発色を再度達成する。この僅かな容積の増大を介してのアミン濃度に対する影響は１％未満と看做され、従って無視することができる。
【００８６】
ｃ）ＰＬＰは存在せず、またＰＬＰは追加されない。
【００８７】
反応条件：１ｍＬの最終容積、３７μＬのＶｆｌ−トランスアミナーゼ、５ｍＭのＢ３ＯＰ、リン酸緩衝液ｐＨ７．０。Ｌ−アラニン濃度は１１０ｍＭであった。測定はＣＥにより行われ、α−ＭＢＡが内部標準として使用された。
【００８８】
図９は、経時的な変換を示している。ランａ）と比較したときに、ランｂ）でのＰＬＰ添加に起因した最大変換に対する有意な影響はないように見える。ＰＬＰを伴わない反応は更に遅いように思えるが、それは他の反応と同じ変換率に達した。ランｂ）におけるＰＬＰの追加は、対照ランと比較したときに、アミン濃度における僅かに大きな減少を生じた。
【００８９】
実施例１１：窒素の添加によるアセトアルデヒドの除去を伴った、Ｂ３ＡＰの不斉合成
以下の実施例は、アセトアルデヒドの除去により、Ｂ３ＡＰの不斉合成の変換率を改善するための一つの方法を詳述している。
【００９０】
反応条件：
基質
５ｍＭのＢ３ＯＰ
５００ｍＭのＬ−アラニン
３２Ｕ／ｍＬのＺｐａ−ＰＤＣ
３７Ｕ／ｍＬのＶｆｌ−トランスアミナーゼ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０
０．１ｍＭのＰＬＰおよびＴＰＰ（チアミン二リン酸）
５ｍＭのＭｇＣｌ２
反応溶液は有意な量のタンパク質を含んでいたので、発泡する強い傾向があった。該発泡を抑制するために、０．６μＬの消泡剤Ａ濃縮物（シグマ社、シリコーンポリマー）を当該反応ランに添加した。該濃縮物は泡の発生を大幅に抑制したが、それを完全に阻止することはできなかった。前記消泡剤濃縮物が酵素を阻害するのを排除するために、窒素の添加を伴わない対照ランに消泡剤Ａを補充した。
【００９１】
乾燥窒素の添加は反応油応益からの水の蒸発を導くので、窒素は湿潤化された。
【００９２】
図１０は、計算された相対的なＢ３ＡＰ変換率を示している。消泡剤Ａを伴い且つ窒素を添加しない対照（Ｎ２−対照：Ｖｆｌ−ＴＡ、Ｚｐａ−ＰＤＣ、消泡剤、窒素Ｎ２なし）は、消泡剤Ａを伴わない反応ラン（Ｖｆｌ−ＴＡ、Ｚｐａ−ＰＤＣ）に正確に対応した。従って、酵素は消泡剤濃縮物の添加によって影響されない。窒素で処理されたラン（ランＮ２：Ｖｆｌ−ＴＡ、Ｚｐａ−ＰＤＣ、消泡剤、Ｎ２）は、６０、９０および１８０分後に増大した変換を示した。
【００９３】
実施例１２：種々の条件下での不斉Ｂ３ＡＰ合成
反応条件
最終容積：１ｍＬ
３７μＬのＶｆｌ−トランスアミナーゼ
３２単位／ｍＬのＺｐａ−ＰＤＣもしくは生体触媒ＰＤＣ、または３．２単位／ｍＬのＺｍｏ−ＰＤＣ
５ｍＭのＢ３ＯＰ
５００ｍＭのＬ−アラニン
補因子、０．１ｍＭのＰＬＰおよびＴＰＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２
ｐＨ７、リン酸ナトリウム
図１０は、Ｖｆｌ−トランスアミナーゼを各ＰＤＣと組合せる上記で特定した反応ランについての、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換を示している。
【００９４】
図１０において、Ｎ２で指定されたランは、Ｎ２で処理されたＶｆｌ−トランスアミナーゼおよびＺｐａ−ＰＤＣ、並びに消泡剤Ａを含んだランである。Ｎ２対照は、窒素処理を伴わない、Ｖｆｌ−トランスアミナーゼ、Ｚｐａ−ＰＤＣおよび消泡剤Ａを含んだサンプルである。反応溶液中に供給された窒素の存在に起因して、Ｎ２対照からＮ２サンプルには、変換の有意な増大が存在することが明らかである。従って、ガス形態で窒素を反応媒質中に供給することは、Ｂ３ＯＰからＢ３ＡＰへの変換を有意に増大させる。
【００９５】
実施例１３：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の存在下でのＢ３ＡＰの不斉合成
ＰＤＣ反応により生成したアセトアルデヒドを反応混合物から除去するために、ＡＤＨを使用して、アセトアルデヒドをエタノールに変換することができる。
【００９６】
反応条件
１１０ｍＭのＬ−アラニン
５ｍＭのＢ３ＯＰ
３７μＬ／ｍＬのＶｆｌ−トランスアミナーゼ
３２単位／ｍＬのＺｐａ−ＰＤＣ
０．１ｍＭのＰＬＰおよびＴＰＰ
５ｍＭのＭｇＣｌ２
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７
以下の反応ランが示される：
反応ラン１：ＰＤＣおよびトランスアミナーゼとの反応
反応ラン２：５ｍＭのエタノール（最終濃度）およびＮＡＤＨを添加した、ＰＤＣおよびトランスアミナーゼとの反応
反応ラン３：ＰＤＣ、ＡＤＨおよびＮＡＤＨとの反応
使用したＡＤＨは、５０〜１００単位／ｍＬの活性をもったSaccharomyces cerevisae由来のＡＤＨであった。ＰＤＣ活性は３２単位／ｍＬであった。
【００９７】
反応の開始時に、アブソリュートエタノールを５ｍＭの最終濃度で反応ラン２に添加した。反応の開始時に、５ｍＭのＮＡＤＨ最終濃度に対応して、５μｍｏｌのＮＡＤＨを反応ラン２および３に添加した。各１０分後に、２．４μｍｏｌの更に追加のＮＡＤＨ（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．５中の、４μＬの０．６Ｍ・ＮＡＤＨ溶液）を添加した。このＮＡＤＨ溶液は氷中に保存され、使用の直前に調製された。
【００９８】
この結果は、図１１および表５に与えられる。ＡＤＨの効果が明瞭に示されている。変換率は約９０％にまで増大する。ＡＤＨおよび５ｍＭエタノールを伴わない対照ラン２は、対照ラン１から僅かに偏移したに過ぎない。従って、ＡＤＨの添加は、Ｂ３ＯＰからのＢ３ＡＰの不斉合成における変換率を大幅に増大させる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、薄層クロマトグラムを示している。
【図２】図２は、ｐＨ値から独立した、V. fluvialis・ω−ＴＡの相対的活性を示している。
【図３】図３は、種々の基質と共にインキュベーションするためのＢ３ＡＰ濃度の相対的低下を示している。
【図４】図４は、ピルベートおよびアセトアルデヒドの存在下でのＢ３ＡＰ変換の相対低低下を示している。
【図５】図５は、種々の圧力についての、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの経時的な変換を示している。
【図６】図６は、種々のＰＤＣ’ｓの存在下での、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの相対的な変換を示している。
【図７】図７は、不斉Ｂ３ＡＰ合成に対する、増大したアラニン濃度および増大したＰＤＣ濃度の効果を示している。
【図８】図８は、増大したアラニン濃度における、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換を示している。
【図９】図９は、ＰＬＰに依存した、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの相対的な変換を示している。
【図１０】図１０は、Ｎ２圧に依存した、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの相対的な変換を示している。
【図１１】図１１は、ＡＤＨの存在下での、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの相対的な変換を示している。
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、光学活性キラルアミンの調製方法に関する。
【０００２】
キラルアミンは医薬、農業化学および化学工業において重要な役割を果している。それらは屡々、セファロスポリンまたはピロリジン誘導体のような種々の生理学的に活性な、例えば医薬的に活性な物質を製造するための中間体またはシントン（synthon）として使用される。キラルアミンの多くの種々の応用においては、（Ｒ）エナンチオマーまたは（Ｓ）エナンチオマーの何れか特定の光学活性形態だけが、望ましい生理学的活性を有している。従って、光学活性形態のキラルアミンを調製する方法を提供するための明瞭な必要性が存在している。
【０００３】
これらの必要性は、キラルカルボン酸助剤の添加を介して、ジアステレオマー塩の結晶化によりキラルアミンを調製することによって部分的に満たされる（Breuer et al., Angewandte Chemie (2004) 116, 806-843）。他の化学的方法は、Ｃ＝Ｎ二重結合を備えたプロキラル前駆体を還元することによるエナンチオ選択的合成を使用する。
【０００４】
更に、プロテアーゼ、アミダーゼまたはリパーゼのような種々の酵素を使用して、ラセミ体を立体選択的に開裂することが知られている（Bornscheuer and Kazlauskas, Hydrolases in Organic Synthesis (2005), Wiley-VCH Weinheim）。また、特定のトランスアミナーゼ、即ち、α−アミノ酸アミノトランスフェラーゼを含むα−トランスアミナーゼが、光学的に純粋なアミノ酸の調製に適していることも知られている（Bartsch et al., Appl. Environm. Microbiol. (1996) 62, 3794-3799, Cho et al., Biotechnol. Bioeng. (2003) 83, 226-234, JP 011 53084 A2 (1998), JP 633 04986 A2 (1988), EP 0 248 357 A2 and Ziehr et al., Biotechnol. Bioeng. (1987) 29, 482-487）。しかし、これら先行技術の方法は種々の欠点を伴っている。酵素的プロセスは、古典的な方法とは対照的に、通常は好ましい温和な条件を用いて合理的な立体選択性を達成するが、それらは通常、その基質特異性、エナンチオ選択性および／または変換速度が工業的に適用可能なプロセスとして充分には高くない酵素を使用する。更に、光学活性アミンの調製にトランスアミナーゼを使用することの最も顕著な欠点の一つは、頻繁に観察される基質阻害および生成物阻害の現象によって代表される。従って、本発明の一つの目的は、光学活性キラルアミンを調製するための改善された方法、特に、改善された基質特異性、改善されたエナンチオ選択性を備え、特に遊離体（educt）の１００％までの変換を可能にする方法を提供することである。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、下記のａ）〜ｃ）を含んでなる光学活性キラルアミンの調製方法を提供することによって、本発明の基礎にある技術的問題を解決するものである：ａ）アミノ受容体およびアミノ供与体を提供すること；ｂ）該アミノ受容体およびアミノ供与体をトランスアミナーゼ、特に（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼと反応させることと；ｃ）望ましい光学活性キラルアミンおよびα−ケトン副生成物を得ること。本発明の好ましい実施形態に従えば、工程ｃ）で得た光学活性キラルアミンは、後続の更なる任意工程において、工程ｃ）で得た反応混合物から単離および精製される。
【０００６】
本発明の反応は、原理的には下記のスキームに従う：
【化１】
【０００７】
従って、本発明は、アミノ供与体からアミノ受容体へのアミノ基のトランスアミノ化のために、少なくとも一つのトランスアミナーゼを使用することによって、キラルアミンの非対称合成のための方法を提供する。使用される特定のトランスアミナーゼのエナンチオ選択性に依存して、望ましい光学コンフィギュレーションの光学活性キラルアミン、即ち、（Ｒ）もしくは（Ｓ）エナンチオマーが得られる。こうして、本発明の一つの実施形態を使用することにより、非対称合成のための（Ｓ）選択的トランスアミナーゼは、キラルアミンの望ましい（Ｓ）エナンチオマーを発生するのに対して、本発明のもう一つの実施形態を使用すると、（Ｒ）選択的トランスアミナーゼは望ましい（Ｒ）エナンチオマーを発生する。望ましい光学活性アミンに加えて、この反応は、使用したアミノ供与体からのケトン副生成物、特にα−ケトン副生成物、並びに潜在的には未変換のアミノ受容体およびアミノ供与体をもたらす。
【０００８】
本発明の関係において、トランスアミナーゼは、アミノ基の転移を触媒するピリドキサールリン酸依存性の酵素である。トランスアミナーゼは、Ｅ．Ｃ．２．６．１．Ｘに分類される。本発明の特に好ましい実施形態において、トランスアミナーゼは、（Ｒ）−または（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼであり、特に好ましい実施形態においてはω−トランスアミナーゼである。
【０００９】
本発明の関係において、ω−トランスアミナーゼは、好ましくは分類コードＥ．Ｃ．２．６．１．１８をもった酵素である。これらのアミノトランスアミナーゼは、それらが基質として主にアミンを使用することを特徴とする。これらの酵素は更に、ω−トランスアミナーゼ触媒反応の１より大きい平行定数を示すことを特徴とする。本発明に従って使用され得るω−トランスアミナーゼは、例えば、Iwasaki et al., Biotechnol. Lett. (2003) 25, 1843-1846, Shin et al., Biotechnol. Bioeng. (1997) 55, 348-358, Shin and Kim, Book of Abstracts, 217th ACS National Meeting, Anaheim, Calif., March 21-25, (1999) 180, Shin and Kim, Biosc. Biotechnol. Biochem. (2001) 65, 1782-1788 and Shin and Kim, Biotechnol. Bioeng. (1998) 60, 534-540に記載されている。
【００１０】
こうして、本発明の好ましい実施形態において、トランスアミナーゼ、特に、本方法に使用されるω−トランスアミナーゼは、特に、Vibrio fluvialis、特にＪＳ１７株から得られたω−トランスアミナーゼである。更に好ましい実施形態において、該トランスアミナーゼは、Alcaligenes denitrificans、特にＹ２ｋ−２株由来のものである。更に好ましい実施形態において、該トランスアミナーゼは、Klebsiella pneumoniae、特にＹＳ２Ｆ株由来のものである。更に好ましい実施形態において、該トランスアミナーゼは、Bacillus thuringiensis、特にＪＳ６４株由来のものである。株の名称については、上記のShin and Kim, 1998を参照されたい。勿論、本発明はまた、トランスアミナーゼ（特にω−トランスアミナーゼ）、トランスアミナーゼ（特にω−トランスアミナーゼ）を含有する微生物もしくは細胞のような生物の抽出物、またはトランスアミナーゼ（特にω−トランスアミナーゼ）を含んでなる生きたもしくは死んだ細胞もしくは微生物自身の用語の下でも理解される。このような微生物もしくは細胞、または抽出物もしくはトランスアミナーゼ酵素は、固定化された形態または非固定化形態で使用されてよい。トランスアミナーゼ、特にω−トランスアミナーゼはまた、組換えにより製造された天然に存在するかまたは遺伝子的に修飾されたトランスアミナーゼ、特にω−トランスアミナーゼであってよく、これは上記で述べた生物またはその均等物の一つに含まれる核酸配列、またはその誘導体により部分的または完全にコードされる。
【００１１】
本発明の関係において、光学活性キラルアミンの用語は、エナンチオマー的に活性なキラルアミンの用語と同じ主題に関する。これらの用語は、特に、望ましくないエナンチオマーを実質的に含まないか、更に好ましい実施形態では望ましくないエナンチオマーを含まない調製品に関する。従って、光学活性キラルアミンは、実質的に、一方のエナンチオマーを過剰に含んでなるか、または一方のエナンチオマーのみからなるものである。
【００１２】
特に、本発明の関連において、光学活性キラルアミンは少なくとも７０％、特に９０％以上、最大では＞９９％の光学純度を有する。
【００１３】
本発明において、光学純度は、一方のエナンチオマーの他方のエナンチオマーに対する過剰％で与えられる。従って、％での光学純度は、（Ｒ）エナンチオマー濃度と（Ｓ）エナンチオマー濃度の差と、両エナンチオマー濃度の合計との商である［％でのＡの光学純度＝（［Ａ］−［Ｂ］）：（［Ａ］＋［Ｂ］）×１００であり、ここでのＡおよびＢは（Ｒ）および（Ｓ）エナンチオマーの濃度である。逆も同様］。
【００１４】
本発明において、アミノ受容体は、少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、特に１００％の変換率で、望ましいキラルアミンに変換されることが好ましい。光学純度および変換率を解析するための濃度は、例えば、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、または光学法もしくは蛍光法を用いて決定することができる。
【００１５】
本発明において、アミノ受容体は、トランスアミナーゼ、特にω−トランスアミナーゼによってアミノ供与体から転移されるアミノ基を受容することができる分子である。本発明の特に好ましい実施形態において、アミノ受容体はケトン官能基を含んでいる。本発明の特に好ましい実施形態において、アミノ受容体は、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、アセトフェノン、２−ケトグルタレート、３−オキシブチレート、２−ブタノン、３−オキソピロリジン（３−ＯＰ）、３−ピリジルメチルケトン（３−ＰＭＫ）、３−オキソ酪酸エチルエステル（３−ＯＢＥＥ）、３−オキソペンタン酸メチルエステル（３−ＯＰＭＥ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピペリジノン、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピロリジン（Ｂ３ＯＰ）、３−オキソ−ピペリジン、アルキル−３−オキソ−ブタノエート、メトキシアセトンおよび１−オキソテトラロンからなる群から選択される。
【００１６】
特に好ましい実施形態において、アミノ受容体はＢ３ＯＰである。
【００１７】
本発明において、アミノ供与体は、トランスアミナーゼ、特にω−トランスアミナーゼを使用してアミノ基をアミノ受容体へと提供できる分子である。特定の好ましい実施形態において、アミノ供与体はアミンまたはアミノ酸である。
【００１８】
特に好ましい実施形態において、アミノ供与体は、β−アラニン、アラニン、特にＤ，Ｌ−アラニン、Ｌ−アラニンもしくはＤ−アラニン、α−メチルベンジルアミン（α−ＭＢＡ）、グルタメート、フェニルアラニン、グリシン、３−アミノブチレート、イソプロピルアミン、２−アミノブタン、γ−アミノブチレート、およびそれらの何れかの塩、例えば塩化物からなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、得られたケトン生成物は、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、グリオキシル酸、その塩、アセトフェノン、２−ケトグルタレート、アセトン、３−オキソブチレート、２−ブタノン、３−オキソピロリジン（３−ＯＰ）、３−ピリジルメチルケトン（３−ＰＭＫ）、３−オキソ酪酸エチルエステル（３−ＯＢＥＥ）、３−オキソペンタン酸メチルエステル（３−ＯＰＭＥ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピペリジノンおよびＮ−１−ｂｏｃ−３−オキソピロリジン（Ｂ３ＯＰ）、またはこれらの何れかの塩、例えば塩化物であってよい。
【００１９】
特に好ましい実施形態において、アミノ供与体はアラニン、特にＬ−アラニンである。
【００２０】
更に好ましい実施形態において、本発明は、光学活性キラルアミンを調製する方法に関し、該キラルアミンは光学活性アミノ基を有する一群のアミン、特にアルキル基、分岐アルキル基、またはアリールアルキル基を備えたアミンから選択される。特に、これらのアミン（特に単環式または二環式のアミン）は、特に５員もしくは６員の環式、またはＳ−置換、Ｏ−置換もしくはＮ−置換のへテロ環式炭化水素または芳香族アミン、特にアルキル置換もしくはアルコキシ置換芳香族アミンである。好ましい実施形態において、得られるキラルアミンは、フェニルアラニン、アラニン、３−アミノピペリジン、アルキル−３−アミノ−ブタノエート、３−アミノピロリジン（３−ＡＰ）、３−ピリジル−１−エチルアミン（３−ＰＥＡ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−アミノピロリジン（Ｂ３ＡＰ）、３−アミノ酪酸エチルエステル（３−ＡＢＥＥ）、３−アミノペンタン酸メチルエステル（３−ＡＰＭＥ）、α−メチルベンジルアミン（α−ＭＢＡ）、１−アミノテトラリン、α−メチル−４−（３−ピリジル）−ブタンアミン、グルタメート、β−アミノブチレート、ｓｅｃ−ブチルアミン、メトキシイソプロピルアミン、３−アミノピロリジンの誘導体、１−Ｎ−Ｂｏｃ−３−アミノピペリジン、セファロスポリン、およびセファロスポリンの誘導体からなる群から選択される。
【００２１】
従って、特に好ましい実施形態において、本発明は、３ＯＰを、（Ｓ）−もしくは（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｓ）もしくは（Ｒ）−３ＡＰを得ることを予測している。
【００２２】
更に好ましい実施形態において、本発明は、３−ＰＭＫを、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｒ）−もしくは（Ｓ）３−ＰＥＡを得ることを予測している。
【００２３】
更に好ましい実施形態において、本発明は、３−ＯＢＥＥを、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ＡＢＥＥを得ることを予測している。
【００２４】
更に好ましい実施形態において、本発明は、３−ＯＰＭＥを、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｒ）もしくは（Ｓ）３−ＡＰＭＥを得ることを予測している。
【００２５】
更に好ましい実施形態において、本発明は、Ｂ３ＯＰを、（Ｒ）もしくは（Ｓ）選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体、特にアラニンと反応させて、光学活性の（Ｒ）もしくは（Ｓ）Ｂ３ＡＰを得ることを予測している。
【００２６】
更に好ましい実施形態において、本発明は、光学活性のＢ３ＡＰおよびピルベートを得るための、トランスアミナーゼの存在下での、Ｂ３ＯＰとアミノ供与体、特にアラニンとの間の反応に関し、ここでの反応は、５．０〜９．５、好ましくは６．０〜７．０、特に６．０〜６．９のｐＨにおいて、３０〜７０分、特に４０〜６５分、特に５０〜６０分の間行われる。
【００２７】
特に好ましい実施形態において、前記トランスアミナーゼは、（Ｒ）−選択的トランスアミナーゼである。更なる好ましい実施形態において、前記トランスアミナーゼは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼである。
【００２８】
好ましい実施形態において、前記Ｂ３ＯＰのアミノ供与体、特にアラニンとの反応は、少なくとも一つのピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）の存在下で行われる。更なる好ましい実施形態において、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼの存在下での前記Ｂ３ＯＰとアミノ供与体、特にアラニンとの反応は、ＰＤＣの作用によりピルベートから形成されたアセトアルデヒドを除去するために、反応混合物中にガス状窒素を同時に導入しながら行われる。
【００２９】
更なる好ましい実施形態において、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼの存在下での前記Ｂ３ＯＰとアミノ供与体、特にアラニンとの反応は、ＰＤＣの作用により形成されたピルベートから得られたアセトアルデヒドを除去するために、少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の存在下で行われる。
【００３０】
更なる好ましい実施形態において、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼの存在下でのＢ３ＯＰとアミノ供与体、特にアラニンとの反応は、同時にガス状窒素を反応混合物中に導入しながら行われ、ここではＰＤＣの作用により形成されたピルベートから得られたアセトアルデヒドを除去するために、少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼが前記反応混合物中に存在せしめられる。
【００３１】
本発明の更なる好ましい実施形態において、本発明は、アセトフェノンを、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼおよびアミノ供与体と反応させて、光学活性の（Ｒ）もしくは（Ｓ）α−ＭＢＡを得ることを予測している。
【００３２】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、アミノ受容体として、特に単環式もしくは二環式のオキソ基を含有する５〜６員の環状、またはＳ−、Ｏ−もしくはＮ−置換のヘテロ環炭化水素もしくは芳香族、特にアルキル−もしくはアルコキシ−置換芳香族を、アミノ供与体および（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼと反応させて、光学活性アミン、特に単環式もしくは二環式の、特に５〜６員の環状、またはＳ−、Ｏ−もしくはＮ−置換のヘテロ環炭化水素もしくは芳香族アミン、特にアルキル−もしくはアルコキシ−置換芳香族アミンを、特に（Ｓ）もしくは（Ｒ）形態で得ることを予測している。
【００３３】
本発明の特に好ましい実施形態においては、アミノ受容体およびアミノ供与体が水性媒質、例えば生理学的緩衝液中においてトランスアミナーゼと反応される。特に好ましい実施形態において、アミノ基転移反応は、５．０〜９．５または５．０〜９．０、特に７〜８．５．の範囲のｐＨにおいて行われる。本発明は、特に好ましい実施形態において、アミノ受容体およびアミノ供与体を、６．０〜７．０、好ましくは６．０〜６．９のｐＨ値において反応させることを予測している。
【００３４】
特に好ましい実施形態において、当該反応は、１０〜６５℃、好ましくは２０〜５０℃、特に１８〜２５℃、好ましくは室温または３４℃〜３９℃の温度範囲、特に３７℃で行われる。本発明の更なる好ましい実施形態において、アミノ受容体およびアミノ供与体 は、１：５０〜１：２００、特に１：５０〜１：１００、特に１：１００、特に１：１〜１：５、特に１：１〜１：２のモル比で提供される。本発明の好ましい実施形態において、酵素活性は１〜２０．０００μｍｏｌ／ｍｉｎであってよい。
【００３５】
更なる好ましい実施形態において、当該反応は３０〜７０分、好ましくは４０〜６５分、特に５０〜６０分の時間行われる。
【００３６】
特に好ましい実施形態において、本発明は、上記に従う光学活性キラルアミンの調製方法に関し、これに従えば第一の工程ａ）において、アミノ受容体およびアミノ供与体が準備され、第二の工程ｂ）において、アミノ受容体およびアミノ供与体は少なくとも一つののω−トランスアミナーゼと反応させられ、第三の工程ｃ）においては、光学的に純粋なキラルアミンおよびα−ケトン副生成物を得、ここで更なる工程ｄ）において、工程ｃ）で得られたケトン副生成物、特にα−ケトン副生成物が、得られた反応混合物から除去され、特に、酵素との反応によって除去されるが、これは特にデカルボキシラーゼ、シンターゼまたはデヒドロゲナーゼからなる群から選択される酵素を使用した酵素的開裂によるることを意味する。
【００３７】
特に好ましい実施形態において、工程ｃ）で得られたケトン生成物、特にピルベートは、例えばSaccharomyces cerevisiae、Zymomonas mobilis またはZymobacter palmae由来のピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）との反応によって除去され、それによって好ましくはアセトアルデヒドおよびＣＯ２を産生する。
【００３８】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用によって除去され、またそれによって形成されたアセトアルデヒドは、例えば化学的、酵素的または物理的処理によって除去される方法に関する。
【００３９】
更になる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用によって除去され、またそれにより形成されたアセトアルデヒドが、例えばガス状窒素を反応混合物中に供給することによって除去され、好ましくは前記ガス状窒素を連続的に前記反応混合物中に供給して、前記アセトアルデヒドを反応混合物から除去する方法に関する。
【００４０】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用により除去され、またそれにより形成されたアセトアルデヒドが、該アセトアルデヒドを少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と反応されて、前記アセトアルデヒドが反応混合物から除去され、それをエタノールに変換される方法に関する。
【００４１】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートが、ＰＤＣの作用によって除去され、またそれによって形成されたアセトアルデヒドが、前記反応混合物に減圧を加えることによって除去される方法に関する。
【００４２】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用により除去され、またそれにより形成されたアセトアルデヒドが化学反応により除去される方法に関する。
【００４３】
更なる好ましい実施形態において、本発明は、得られたケトン生成物、特にピルベートがＰＤＣの作用により除去され、またそれにより形成されたアセトアルデヒドが、前記反応混合物中にガス状窒素を供給すること、好ましくは、前記ガス状窒素を連続的に前記反応混合物中に供給することによって除去され、加えて、前記アセトアルデヒドが少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）と反応されて、前記アセトアルデヒドが前記反応混合物から除去され且つそれがエタノールに変換される方法に関する。
【００４４】
更なる好ましい実施形態においては、工程ｃ）で得られたケトン生成物、特にピルベートが、例えば大腸菌（Escherichia coli）由来のラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）との反応により除去され、それによって好ましくはＬ−ラクテートを生じる。
【００４５】
更なる好ましい実施形態において、工程ｃ）で得られたケトン生成物、特にピルベートは、例えば大腸菌（Escherichia coli）由来のラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）との反応により除去され、それによって好ましくはＬ−ラクテートを生じる。
【００４６】
更なる好ましい実施形態において、工程ｃ）で得られたケトン生成物、特にピルベートは、アセトラクターゼシンターゼとの反応により除去され、それにより好ましくはアセトラクテートを産生する。
【００４７】
本発明の更に好ましい実施形態において、工程ｃ）において得られたケトン生成物、特にピルベートは、反応混合物から連続的に除去される。
【００４８】
これらの特に好ましい実施形態は、本発明の副生成物としてのケトン生成物が平衡反応から除去されるので、特に高い変換率を得る利点を提供する。該反応は生成物の方向に向けて駆動され、それにより高い立体選択性で、望ましい生成物への非常に高い変換率を提供する。
【００４９】
本発明はまた、特に、３−アミノピロリジン誘導体、セファロスポリン、セファロスポリンの誘導体、ヘテロ環状ホウ素酸、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ドーパ）、α−メチルドーパ、Ｄ−フェニルグリシン、β−ヒドロキシフェニルグリシン、ホスフィノトリチン（phosphinothricine）、ピリミド誘導体 およびピロリドン誘導体からなる群から選択される生理学的に活性な化合物もしくはそれらの前駆体、および／またはその製造における中間体の調製方法であって、上記で特定した本発明の方法の何れかが用いられる方法に関する。本発明の関係において、生理学的に活性な化合物とは、植物、動物、ヒト、酵母、またはプロトゾア、バクテリアもしくはウイルスのような微生物の何れかにおいて生理学的に活性な、即ち、当該生物の代謝と相互作用する化合物である。
【００５０】
本発明の更に好ましい実施形態は、従属請求項の主題である。
【００５１】
以下の実施例および添付の図面において、本発明を更に詳細に説明する。
【００５２】
添付の図面は、本発明を例示するものである。
【００５３】
実施例１：Ｂ３ＡＰの不斉合成
Ｂ３ＡＰの不斉合成は、１．５ｍLの反応管内で行われた。アミン受容体としてのＢ３ＯＰは、５ｍＭ（７，５μｍｏｌ）の濃度で使用された。使用されたアミノ供与体であるＬ−アラニンの濃度は５ｍＭであった。使用した試薬および反応条件は、下記の表Ｉから明らかである。
【００５４】
表１：アラニンからＢ３ＯＰへのアミへとアミノ基を転移させるために（Ｓ）−ωトランスアミナーゼを使用した、不斉（Ｓ）−Ｂ３ＡＰ合成のための反応条件
【表１】
【００５５】
使用した緩衝液は、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７であった。ＴＡ７は、ビブリオ・フルヴィアリス（Vibrio fluvialis）由来のω−トランスアミナーゼ（Juelich Fine Chemicals, Germany）を意味する。ＴＡ８は、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Alcaligenes denitrificans）由来のωトランスアミナーゼ（Julich Fine Chemicals, Germany）を意味する。ラクテートデヒドロゲナーゼとしては、大腸菌（Escherichia coli）の抽出物を使用した。ＮＡＤＨは、１０ｍＭの最終濃度まで添加された。ピルベートデカルボキシラーゼの濃度は変化された。１．５単位（２０μＬ）および１５単位（２００μＬ）のサッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ１）を使用した。２単位（３．４μＬ）および２０単位（３４μＬ）の、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）のピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ２）を使用した。
【００５６】
表２：Ｂ３ＡＰの不斉合成のためにＴＡ８を使用して得られた変換率および光学純度。計算はＧＣ分析に基づいて行った。
【表２】
【００５７】
次に、上記の表２を参照すると、ω−トランスアミナーゼＴＡ８を使用した６回のランの各々において、得られた（Ｓ）−Ｂ３ＡＰについての非常に高度の光学純度を達成できたことが明らかである。また、ＴＡ７またはＴＡ８の何れを使用するかとは独立に、反応の平衡が影響されなければ、変換の程度は中程度に過ぎなかった（ラン１）。１０〜５０倍過剰のアラニンを使用することは、変換率を僅かに改善するに過ぎなかった。ラン３，４，５および６において、ピルベートを意味するケトン生成物は、トランスアミノ化反応の間、平衡反応から除去された。大腸菌由来のラクテートデヒドロゲナーゼと共にＴＡ８を使用すること（ラン６）は、極めて改善された変換率を導く一方で、エナンチオ選択性を維持し、更には改善した。ザイモモナス・モビリス由来のピルベートデデカルボキシラーゼ（ラン３〜５）によって与えられるエナンチオ選択性についても、本質的に同じ有効性が維持される。しかし、２４時間反応されたときは、ＰＤＣ１は変換率を僅かに増大させたに過ぎず、ＰＤＣ２は変換率を温和に増大させた（ラン４）のに対して、７２時間の反応においては、変換率は劇的に改善された。全ての反応は、７２時間行われたラン５を除き、２４時間行われた。
【００５８】
図は、表１に従って行われた反応の薄層クロマトグラムを示している。「Ａ」は、アルカリゲネス・デニトリフィカンス由来のω−トランスアミナーゼを示しているのに対して、「Ｖ」は、ビブリオ・フルヴィアリス由来のω−トランスアミナーゼを示している。「Ｋ」は、Ｔａ７またはＴＡ８を単独で使用したラン１を示している（ラン１）。ＰＤＣ１は、サッカロマイセス・セレビシエのデカルボキシラーゼを用いたランを示し（ラン３）、ＬＤＨは、大腸菌由来のラクテートデヒドロゲナーゼを用いたランを示し（ラン６）、またＰＤＣ２は、ザイモモナス・モビリス由来のピルベートデカルボキシラーゼ（２４時間後および７２時間後）を用いたランを示している（ラン４および５）。こうして、これらの結果は、プロキラルケトンＢ３ＯＰからの（Ｓ）−Ｂ３ＡＰの生成が、非常に高いエナンチオ選択性で実施できたことを明瞭に示している。しかし、調製プロセスにおいてω−トランスアミナーゼを単独の酵素として使用することは、温和な変換を導く。この温和な変換率は、特にラクテートデヒドロゲナーゼまたはピルベートデカルボキシラーゼを使用して、平衡状態からピルベートを除去することによって一般に改善することができた。ピルベートデカルボキシラーゼを使用することは、特に、補因子循環（ＮＳＤＨ）が必要でないという利点を有する。それは更に、有利なことにＰＤＣを用いたピルベートの酵素的除去を提供し、それによって生成物阻害（生成物ケトン）を除去または回避し、反応平衡を右側に引っ張って、より高い変換率（理想的な場合は１００％）を達成する追加の利点を提供する。
【００５９】
実施例２：（Ｓ）−αＭＢＡのアセトフェノンへの変換反応におけるω−トランスアミナーゼ活性のｐＨ依存性
この合成は、石英キュベット内において、５０μＬの１００ｍＭピルベート、４単位／ｍＬのω−ＴＡビブリオ・フルビアリス（V. fluvialis：以下ではＶｆｌともいう）（１２μＬ）および３８８μＬのリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ）を用い、ｐＨ６．０〜ｐＨ７．４のｐＨ変動を用いて、０．２段階で実行された。該反応は、アミノ供与体として５０μＬの１００ｍＭ（Ｓ）−αＭＢＡを用いて開始され、２５０〜２６０ｎｍでの吸収の増大が測定された。この吸収の増大は、形成されたアセトフェノンによるものである。他の基質は、吸収に対して微々たる寄与しか有していないので、反応の速度はアセトフェノンの吸収を測定することによって決定することができる。ｐＨ７．４に達した値が１００％に設定され、他のｐＨ値についての相対的活性は、図２から明らかなようにして計算された。図２は、与えられたｐＨ値に従属した、V. fluvialis・ω−ＴＡの相対的活性を示している。
【００６０】
図２は、６．０、６．２、または６．４のようなより低いｐＨ値において、未だかなりの活性が存在すること、例えばｐＨ６．０では１１％の活性が存在することを示している。従って、この結果は、低ｐＨでも有意なトランスアミナーゼ活性を得ることが可能であり、基質を低ｐＨで反応させることを可能にすること、またより高いｐＨ値に対して感受性であるＰＤＣを使用することによって変換率を増大させることが可能であることを示している。
【００６１】
実施例３：異なるｐＨ値でのＢ３ＡＰの不斉合成
この実施例では、ピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）の存在下および不存在下での、アラニンおよびＢ３ＯＰからのＢ３ＡＰの不斉合成が示される。
【００６２】
各ｐＨ値６．０、６．４および７．０について、３回の実験ランが行われた。ラン１はザイモモナス・モビリスのＰＤＣ（野生型細胞抽出物）を使用し、ラン２は、ザイモモナス・パルマエ（大腸菌中での組換え）を使用し、ラン３はＰＤＣを伴わずにトランスアミナーゼだけを使用した対象であった。比較可能な結果を得るために、両方のＰＤＣの活性が、アルコールデヒドロゲナーゼ検定を用いてｐＨ６で決定され、また同じ量のＰＤＣ活性が上記で特定されたランにおいて使用された。
【００６３】
表３は、使用された物質の容積をμＬで与えている。各反応ランは、６．０、６．４および７．０のｐＨ値において３回行われた。ｐＨ値は、Ｂ３ＯＰ基質溶液の緩衝剤によって調節された。ＰＤＣの活性は、ｐＨ７において約２．５単位／ｍＬであった。また、基質濃度および酵素濃度は下記の表３から明らかである。１０分、３０分、６０分および１２０分後に、１００μＬのサンプルを採取し、１００μＬの１Ｍ・ＮａＯＨの添加により反応を停止させた。Ｂ３ＡＰ濃度の定量はＣＥ（キャピラリー電気泳動）を使用して行われた。
【表３】
【００６４】
下記の表４は、異なるＰＤＣについて、異なるｐＨ値での変換率を示している。ＰＤＣの使用が変換率を増大させることが明らかである。Ｚ．ｐａｌｍａｅ（Ｚｐａ）は、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ（Ｚｍｏ）由来のＰＤＣよりも幾分高い変換率を生じることも明らかである。また、より低いｐＨ値、例えば６．０または６．４では、ＰＤＣを用いるランにおいて顕著な変換率増大が観察され、これはＰＤＣを含まない対照では見られないことも明らかである。全ての反応ランにおいて、１２０分後に変換率が減少することを観察することができるであろう。
【表４】
【００６５】
実施例４：不斉合成反応の種々の反応体の存在下でのＢ３ＡＰの安定性
種々の反応体の存在下におけるＢ３ＡＰの安定性を示すために、下記の表５に列記した種々の物質の存在下での１ｍＭのＢ３ＡＰのインキュベーションを、反応管内で３時間行った。
【００６６】
この実施例は、６および７のｐＨ（リン酸ナトリウム緩衝液）において実施された。物質を反応させた直後に、第一のサンプルＴ０を採取し、３時間後にもう一つのサンプルＴ１を採取した。抽出の後に、ＣＥにより、内部標準（αＭＢＡ）を用いてアミン濃度を決定した。得られた濃度の差から、Ｂ３ＡＰ濃度の減少％を計算した（図３参照）。
【表５】
【００６７】
図３から、異なる反応体は、Ｂ３ＡＰＰ濃度に有意に影響しないことが明らかである（ラン１〜９）。反応ラン１１〜１３は、アセトアルデヒドの影響を示している。ラン１１からは、トランスアミナーゼの不存在下ではＢ３ＡＰ濃度の低下がないのに対して、トランスアミナーゼおよびアセトアルデヒドの存在下では、Ｂ３ＡＰ濃度の強い低下が観察され得ることが明らかである。アセトアルデヒドは、トランスアミナーゼ反応において、ピルベートのようなアミノ受容体として機能し、明らかにＢ３ＡＰ濃度の減少を導く。
【００６８】
実施例５：アミノ受容体であるピルベートおよびアセトアルデヒドとの、Ｂ３ＡＰの反応
この実施例では、基質Ｂ３ＡＰおよびピルベートについて、並びにＢ３ＡＰおよびアセトアルデヒドについての、V. fluvialis およびA. denitrificansのω−ＴＡのトランスアミナーゼ活性が示される。
【００６９】
２ｍＭのＢ３ＡＰを、２ｍＭのピルベートまたは２ｍＭのアセトアルデヒドと反応させた（２単位／μＬのトランスアミナーゼに対応して、０．５μＬの反応容積当たり３６μＬのAlcaligenes denitrificans (Ade)または６μＬのVibrio fluvialis (Vfl)-トランスアミナーゼを３０分間反応させた）。図４はその結果を示している。従って、両方の酵素によって、ピルベートおよびアセトアルデヒドの両方を用いて、何等の有意な差を伴わずに、Ｂ３ＡＰはＢ３ＯＰに変換された。
【００７０】
実施例６：ｐＨ６の減圧下でのＢ３ＡＰの不斉合成
この実施例では、不斉合成反応のための反応混合物に減圧が適用されて、Ｂ３ＡＰが形成された。対照として、同じ反応を正規圧においてＰＤＣなしで行った。
【００７１】
反応条件：
最終容積：１．５ｍＬ
５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６
３００μＬのVibrio fluvialis-トランスアミナーゼ
６０μＬのＺｐａ−ＰＤＣ（ｐＨ７での８単位／ｍＬに対応する）
５ｍＭのＢ３ＯＰ
１０ｍＭのＤ，Ｌ−アラニン
０．１ｍＭのＴＰＰ、ＰＬＰ
５ｍＭのＭｇＣｌ２
減圧は、ロータリーエバポレータを使用して適用された（１５０ｍＢａｒ）。測定は、ＣＥを使用して行った。
【００７２】
図５は、種々の圧力についての、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの経時的な変換を示している。この変換は、適用される圧力から殆ど独立であることが明らかである。１５０ｍｂａｒの圧力での変換は、到達した最大変換率に関しては、１０００ｍばｒの圧力での変換と同様であった。
【００７３】
実施例７：種々のピルベートデカルボキシラーゼの比較
この実施例では、三つの異なるピルベートデカルボキシラーゼを使用した。この反応条件は、７のｐＨを使用した場合を除き、実施例６のものに対応している。Z. mobilis、Z. palmae由来のＰＤＣ、並びにバイオキャタリティクス社から得たＰＤＣ（カタログ番号ＰＤＣ−１０１）を使用した。ＡＤＨ検定におけるＰＤＣの活性は同一であった（１．６単位／ｍＬ）。
【００７４】
図６は、三つの全てのＰＤＣは本質的に同等の変換をもたらすことを示している。
【００７５】
実施例８：Ｂ３ＯＰの３ＡＰへの変換に対する、酵素および共基質の濃度の影響
この実施例では、アラニンをアミノ供与体として使用したＢ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換に対する、ＰＤＣの濃度の影響が示される。更に、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換に対するアラニン濃度の影響が示される。
【００７６】
反応条件は、７のｐＨが使用されたことを除き、また他に言及しなければZymobacter palmae由来のＴＡが使用されたことを除き、実施例６に与えられている。
【００７７】
図７から明らかなように、ＰＤＣなしの反応では、アラニン濃度の５ｍＭから２５ｍＭへの５倍の増大は、２倍の変換率をもたらす（２時間後、５．３％に対して１２％）。ＰＤＣの存在においては、５倍アラニン過剰での変換率は２倍に増加する（９０分後に、１７％に対して３０％）。通常のアラニン濃度において、ＰＤＣの量が１．６単位／ｍＬから５０単位／ｍＬにまで増大する場合、変換率もまた増大するが、倍率は＜２に過ぎない（４０分後、１７％に対して２９％）。
【００７８】
更なる実験ランでは、６および７のｐＨにおいて、アラニン過剰およびＰＤＣ過剰の組合せによる影響が示された。該反応はｐＨ６においてより速い一方、４９％の変換率に達した後には、Ｂ３ＡＰ濃度もまたより速く減少する。ｐＨ７においては、変換率は５６％まで増大した。
【００７９】
実施例９：Ｂ３ＡＰの不斉合成に対するアラニン濃度の影響
四つの反応において、５ｍＭ、２５ｍＭ、１１０ｍＭ、３００ｍＭおよび５００ｍＭのアラニン濃度が使用された。各ランについて、ＰＤＣを伴わない一つの対照およびＰＤＣを伴った一つの反応が行われた。ｐＨ値は７．０に調節された。サンプルは、３時間の反応時間について半時間ごとに採取された。図８に与えられた変換のための反応時間は、５ｍＭについて４０分、２５ｍＭについて６０分、１１０〜５００ｍＭについて９０分であった。
【００８０】
図８は、増大したアラニン濃度における不斉Ｂ３ＡＰ合成の変換を示している。
【００８１】
図８は、変換率が６０〜７０％に達し得ることを明瞭に示している。アラニン濃度を２５ｍＭから１１０ｍＭに増大させることは、Ｂ３ＯＰからＢ３ＡＰへの変換に対して顕著な影響を有すること、および更に５００ｍＭにまで増大させることは、変換率に対して僅かにしか影響しないことが明らかである。変換率に対するＰＤＣの影響は、アラニン濃度を増大させるに伴って減少する。
【００８２】
対照反応のデータから、Ｂ３ＡＰ合成の平衡常数は次のように計算される：
［Ｂ３ＡＰ］＝［Ｐｙｒ］
［Ｂ３ＯＰ］＝Ｃ０，Ｂ３ＯＰ−［Ｂ３ＡＰ］
［Ａｌａ］＝Ｃ０，Ａｌａ−［Ｂ３ＡＰ］
従って、測定されたＢ３ＡＰ濃度を使用して、平衡常数は次のように計算された：
【表６】
【００８３】
表６は、計算された値を示している。従って、Ｂ３ＡＰとの反応についての平衡常数は、３．１×１０−３である。従って、基質Ｂ３ＯＰは、他のケトンとは対照的に、不斉合成のための適切な基質である。
【００８４】
実施例１０：Ｂ３ＡＰの不斉合成に対するＰＬＰの影響
この実施例では、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換に対するＰＬＰ（ピリドキサール−５’−リン酸）の影響が示される。以下の三つの反応ランが試験された。
【００８５】
ａ） 更なるＰＬＰの添加なしで、０．１ｍＭのＰＬＰを使用するラン１
ｂ） ラン２では、反応の最中に、反応媒質中のＰＬＰの存在に起因する黄色の発色が消失したら直ちにＰＬＰを追加した。この目的のために、１〜２μＬの飽和ＰＬＰ溶液を添加し、それによって強い黄色の発色を再度達成する。この僅かな容積の増大を介してのアミン濃度に対する影響は１％未満と看做され、従って無視することができる。
【００８６】
ｃ）ＰＬＰは存在せず、またＰＬＰは追加されない。
【００８７】
反応条件：１ｍＬの最終容積、３７μＬのＶｆｌ−トランスアミナーゼ、５ｍＭのＢ３ＯＰ、リン酸緩衝液ｐＨ７．０。Ｌ−アラニン濃度は１１０ｍＭであった。測定はＣＥにより行われ、α−ＭＢＡが内部標準として使用された。
【００８８】
図９は、経時的な変換を示している。ランａ）と比較したときに、ランｂ）でのＰＬＰ添加に起因した最大変換に対する有意な影響はないように見える。ＰＬＰを伴わない反応は更に遅いように思えるが、それは他の反応と同じ変換率に達した。ランｂ）におけるＰＬＰの追加は、対照ランと比較したときに、アミン濃度における僅かに大きな減少を生じた。
【００８９】
実施例１１：窒素の添加によるアセトアルデヒドの除去を伴った、Ｂ３ＡＰの不斉合成
以下の実施例は、アセトアルデヒドの除去により、Ｂ３ＡＰの不斉合成の変換率を改善するための一つの方法を詳述している。
【００９０】
反応条件：
基質
５ｍＭのＢ３ＯＰ
５００ｍＭのＬ−アラニン
３２Ｕ／ｍＬのＺｐａ−ＰＤＣ
３７Ｕ／ｍＬのＶｆｌ−トランスアミナーゼ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．０
０．１ｍＭのＰＬＰおよびＴＰＰ（チアミン二リン酸）
５ｍＭのＭｇＣｌ２
反応溶液は有意な量のタンパク質を含んでいたので、発泡する強い傾向があった。該発泡を抑制するために、０．６μＬの消泡剤Ａ濃縮物（シグマ社、シリコーンポリマー）を当該反応ランに添加した。該濃縮物は泡の発生を大幅に抑制したが、それを完全に阻止することはできなかった。前記消泡剤濃縮物が酵素を阻害するのを排除するために、窒素の添加を伴わない対照ランに消泡剤Ａを補充した。
【００９１】
乾燥窒素の添加は反応油応益からの水の蒸発を導くので、窒素は湿潤化された。
【００９２】
図１０は、計算された相対的なＢ３ＡＰ変換率を示している。消泡剤Ａを伴い且つ窒素を添加しない対照（Ｎ２−対照：Ｖｆｌ−ＴＡ、Ｚｐａ−ＰＤＣ、消泡剤、窒素Ｎ２なし）は、消泡剤Ａを伴わない反応ラン（Ｖｆｌ−ＴＡ、Ｚｐａ−ＰＤＣ）に正確に対応した。従って、酵素は消泡剤濃縮物の添加によって影響されない。窒素で処理されたラン（ランＮ２：Ｖｆｌ−ＴＡ、Ｚｐａ−ＰＤＣ、消泡剤、Ｎ２）は、６０、９０および１８０分後に増大した変換を示した。
【００９３】
実施例１２：種々の条件下での不斉Ｂ３ＡＰ合成
反応条件
最終容積：１ｍＬ
３７μＬのＶｆｌ−トランスアミナーゼ
３２単位／ｍＬのＺｐａ−ＰＤＣもしくは生体触媒ＰＤＣ、または３．２単位／ｍＬのＺｍｏ−ＰＤＣ
５ｍＭのＢ３ＯＰ
５００ｍＭのＬ−アラニン
補因子、０．１ｍＭのＰＬＰおよびＴＰＰ、５ｍＭのＭｇＣｌ２
ｐＨ７、リン酸ナトリウム
図１０は、Ｖｆｌ−トランスアミナーゼを各ＰＤＣと組合せる上記で特定した反応ランについての、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換を示している。
【００９４】
図１０において、Ｎ２で指定されたランは、Ｎ２で処理されたＶｆｌ−トランスアミナーゼおよびＺｐａ−ＰＤＣ、並びに消泡剤Ａを含んだランである。Ｎ２対照は、窒素処理を伴わない、Ｖｆｌ−トランスアミナーゼ、Ｚｐａ−ＰＤＣおよび消泡剤Ａを含んだサンプルである。反応溶液中に供給された窒素の存在に起因して、Ｎ２対照からＮ２サンプルには、変換の有意な増大が存在することが明らかである。従って、ガス形態で窒素を反応媒質中に供給することは、Ｂ３ＯＰからＢ３ＡＰへの変換を有意に増大させる。
【００９５】
実施例１３：アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）の存在下でのＢ３ＡＰの不斉合成
ＰＤＣ反応により生成したアセトアルデヒドを反応混合物から除去するために、ＡＤＨを使用して、アセトアルデヒドをエタノールに変換することができる。
【００９６】
反応条件
１１０ｍＭのＬ−アラニン
５ｍＭのＢ３ＯＰ
３７μＬ／ｍＬのＶｆｌ−トランスアミナーゼ
３２単位／ｍＬのＺｐａ−ＰＤＣ
０．１ｍＭのＰＬＰおよびＴＰＰ
５ｍＭのＭｇＣｌ２
リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７
以下の反応ランが示される：
反応ラン１：ＰＤＣおよびトランスアミナーゼとの反応
反応ラン２：５ｍＭのエタノール（最終濃度）およびＮＡＤＨを添加した、ＰＤＣおよびトランスアミナーゼとの反応
反応ラン３：ＰＤＣ、ＡＤＨおよびＮＡＤＨとの反応
使用したＡＤＨは、５０〜１００単位／ｍＬの活性をもったSaccharomyces cerevisae由来のＡＤＨであった。ＰＤＣ活性は３２単位／ｍＬであった。
【００９７】
反応の開始時に、アブソリュートエタノールを５ｍＭの最終濃度で反応ラン２に添加した。反応の開始時に、５ｍＭのＮＡＤＨ最終濃度に対応して、５μｍｏｌのＮＡＤＨを反応ラン２および３に添加した。各１０分後に、２．４μｍｏｌの更に追加のＮＡＤＨ（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．５中の、４μＬの０．６Ｍ・ＮＡＤＨ溶液）を添加した。このＮＡＤＨ溶液は氷中に保存され、使用の直前に調製された。
【００９８】
この結果は、図１１および表５に与えられる。ＡＤＨの効果が明瞭に示されている。変換率は約９０％にまで増大する。ＡＤＨおよび５ｍＭエタノールを伴わない対照ラン２は、対照ラン１から僅かに偏移したに過ぎない。従って、ＡＤＨの添加は、Ｂ３ＯＰからのＢ３ＡＰの不斉合成における変換率を大幅に増大させる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】図１は、薄層クロマトグラムを示している。
【図２】図２は、ｐＨ値から独立した、V. fluvialis・ω−ＴＡの相対的活性を示している。
【図３】図３は、種々の基質と共にインキュベーションするためのＢ３ＡＰ濃度の相対的低下を示している。
【図４】図４は、ピルベートおよびアセトアルデヒドの存在下でのＢ３ＡＰ変換の相対低低下を示している。
【図５】図５は、種々の圧力についての、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの経時的な変換を示している。
【図６】図６は、種々のＰＤＣ’ｓの存在下での、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの相対的な変換を示している。
【図７】図７は、不斉Ｂ３ＡＰ合成に対する、増大したアラニン濃度および増大したＰＤＣ濃度の効果を示している。
【図８】図８は、増大したアラニン濃度における、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの変換を示している。
【図９】図９は、ＰＬＰに依存した、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの相対的な変換を示している。
【図１０】図１０は、Ｎ２圧に依存した、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの相対的な変換を示している。
【図１１】図１１は、ＡＤＨの存在下での、Ｂ３ＯＰのＢ３ＡＰへの相対的な変換を示している。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学活性キラルアミンの調製方法であって：
ａ）アミノ受容体およびアミノ供与体を準備することと；
ｂ）該アミノ受容体およびアミノ供与体をトランスアミナーゼと反応させることと；
ｃ）望ましい光学活性キラルアミンおよびケトン副生成物を得ること
を含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記トランスアミナーゼが、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼである方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記アミノ受容体が、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、アセトフェノン、２−ケトグルタレート、３−オキソブチレート、２−ブタノン、３−オキソピロリジン（３−ＯＰ）、３−ピリジルメチルケトン（３−ＰＭＫ）、３−オキソ酪酸エチルエステル（３−ＯＢＥＥ）、３−オキソペンタン酸メチルエステル（３−ＯＰＭＥ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピペリジノン、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピロリジン（Ｂ３ＯＰ）、３−オキソ−ピペリジン、アルキル−３−オキソ−ブタノエート、メトキシアセトン、および１−オキソテトラロンからなる群から選択される方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記アミノ供与体が、アミンもしくはアミノ酸からなる群から、特にβ−アラニン、アラニン、α−メチルベンジルアミン（α−ＭＢＡ）、グルタメート、フェニルアラニンおよびγ−アミノブチレート、グリシン、３−アミノブチレート、イソプロピルアミン、２−アミノブタン、およびそれら何れか一つの塩、例えば塩化物から選択される方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、得られたアミンがアミン、特に単環式もしくは二環式アミン、特に５員もしくは６員の環式、またはＳ−置換、Ｏ−置換もしくはＮ−置換のへテロ環式炭化水素または芳香族アミン、特にアルキル置換もしくはアルコキシ置換芳香族アミンである方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、得られたアミンが、フェニルアラニン、アラニン、３−アミノピペリジン、アルキル−３−アミノ−ブタノエート、３−アミノピロリジン（３−ＡＰ）、３−ピリジル−１−エチルアミン（３−ＰＥＡ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−アミノピロリジン（Ｂ３ＡＰ）、３−アミノ酪酸エチルエステル（３−ＡＢＥＥ）、３−アミノペンタン酸メチルエステル（３−ＡＰＭＥ）、α−メチルベンジルアミン（α−ＭＢＡ）、１−アミノテトラリン、α−メチル−４−（３−ピリジル）−ブタンアミン、グルタメート、β−アミノブチレート、ｓｅｃ−ブチルアミン、メトキシイソプロピルアミン、３−アミノピロリジンの誘導体、１−Ｎ−ｂｏｃ−３−アミノピペリジン、セファロスポリンおよびセファロスポリンの誘導体からなる群から選択される方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記ω−トランスアミナーゼが、Vibrio fluvialis、Alcaligenes denitrificans、Klebsiella pneumoniae、またはBacillus thuringiensis由来である方法。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、工程ｃ）で得られる前記ケトン副生成物がピルベートである方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、工程ｃ）で得られる前記ケトン副生成物が、更なる処理工程ｄ）において、少なくとも一つの酵素との反応によって前記反応混合物から除去される方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、工程ｄ）で使用される前記酵素がデカルボキシラーゼである方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、工程ｄ）で使用される前記酵素がシンターゼである方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法であって、工程ｄ）で使用される前記酵素がデヒドロゲナーゼである方法。
【請求項１３】
請求項９または１０の何れか１項に記載の方法であって、前記酵素がピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）である方法。
【請求項１４】
請求項９または１２の何れか１項に記載の方法であって、前記酵素がラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）である方法。
【請求項１５】
請求項９または１１の何れか１項に記載の方法であって、前記酵素がアセトラクテートシンターゼである方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、前記ＰＤＣの作用によって形成された前記アセトアルデヒドが除去される方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記アセトアルデヒドが少なくとも一つの酵素との反応により除去される方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記酵素がアルコールデヒドロゲナーゼである方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、ガス状窒素を前記反応混合物中に供給することによって、前記アセトアルデヒドが除去される方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、前記反応混合物に減圧を適用することによって、前記アセトアルデヒドが除去される方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、前記アセトアルデヒドが化学的方法により除去される方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法であって、工程ｃ）またはｄ）で得られた前記光学活性キラルアミンが、工程ｃ）またはｄ）で得られた前記反応混合物から除去される方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法であって、前記方法は、５．０〜９．５、好ましくは６．０〜７．０、好ましくは６．０〜６．９のｐＨを有する反応混合物中で行われる方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法であって、前記方法は、４０〜７０分の反応時間の間行われる方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４の何れか１項に記載の方法であって、前記アミノ受容体がＢ３ＯＰである方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５の何れか１項に記載の方法であって、前記アミノ供与体がアラニンである方法。
【請求項２７】
請求項１３、２５または２６の何れか１項に記載の方法であって、前記ＰＤＣの反応により形成されたアセトアルデヒドが、ガス状窒素（Ｎ２）を前記反応混合物中に供給することによって除去される方法。
【請求項２８】
請求項１３、２５または２６の何れか１項に記載の方法であって、前記反応は、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼおよび少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼの存在下で行われる方法。
【請求項２９】
請求項１３、２５または２６の何れか１項に記載の方法であって、前記反応は、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼ、および少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼの存在下で、更にガス状窒素（Ｎ２）の存在下で行われる方法。
【請求項３０】
３−アミノピロリドン誘導体、セファロスポリン、セファロスポリンの誘導体、ヘテロ環状ホウ素酸、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ドーパ）、α−メチルドーパ、Ｄ−フェニルグリシン、β−ヒドロキシフェニルグリシン、ホスフィノトリチン（phosphinothricine）、ピリミド誘導体およびピロリドン誘導体からなる群から選択される生理学的に活性な化合物の製造方法であって、請求項１〜２９の何れか１項に記載の方法が使用される方法。
【請求項１】
光学活性キラルアミンの調製方法であって：
ａ）アミノ受容体およびアミノ供与体を準備することと；
ｂ）該アミノ受容体およびアミノ供与体をトランスアミナーゼと反応させることと；
ｃ）望ましい光学活性キラルアミンおよびケトン副生成物を得ること
を含んでなる方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記トランスアミナーゼが、（Ｒ）−もしくは（Ｓ）−選択的トランスアミナーゼである方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記アミノ受容体が、フェニルピルビン酸、その塩、ピルビン酸、その塩、アセトフェノン、２−ケトグルタレート、３−オキソブチレート、２−ブタノン、３−オキソピロリジン（３−ＯＰ）、３−ピリジルメチルケトン（３−ＰＭＫ）、３−オキソ酪酸エチルエステル（３−ＯＢＥＥ）、３−オキソペンタン酸メチルエステル（３−ＯＰＭＥ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピペリジノン、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−オキソピロリジン（Ｂ３ＯＰ）、３−オキソ−ピペリジン、アルキル−３−オキソ−ブタノエート、メトキシアセトン、および１−オキソテトラロンからなる群から選択される方法。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の方法であって、前記アミノ供与体が、アミンもしくはアミノ酸からなる群から、特にβ−アラニン、アラニン、α−メチルベンジルアミン（α−ＭＢＡ）、グルタメート、フェニルアラニンおよびγ−アミノブチレート、グリシン、３−アミノブチレート、イソプロピルアミン、２−アミノブタン、およびそれら何れか一つの塩、例えば塩化物から選択される方法。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の方法であって、得られたアミンがアミン、特に単環式もしくは二環式アミン、特に５員もしくは６員の環式、またはＳ−置換、Ｏ−置換もしくはＮ−置換のへテロ環式炭化水素または芳香族アミン、特にアルキル置換もしくはアルコキシ置換芳香族アミンである方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の方法であって、得られたアミンが、フェニルアラニン、アラニン、３−アミノピペリジン、アルキル−３−アミノ−ブタノエート、３−アミノピロリジン（３−ＡＰ）、３−ピリジル−１−エチルアミン（３−ＰＥＡ）、Ｎ−１−ｂｏｃ−３−アミノピロリジン（Ｂ３ＡＰ）、３−アミノ酪酸エチルエステル（３−ＡＢＥＥ）、３−アミノペンタン酸メチルエステル（３−ＡＰＭＥ）、α−メチルベンジルアミン（α−ＭＢＡ）、１−アミノテトラリン、α−メチル−４−（３−ピリジル）−ブタンアミン、グルタメート、β−アミノブチレート、ｓｅｃ−ブチルアミン、メトキシイソプロピルアミン、３−アミノピロリジンの誘導体、１−Ｎ−ｂｏｃ−３−アミノピペリジン、セファロスポリンおよびセファロスポリンの誘導体からなる群から選択される方法。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、前記ω−トランスアミナーゼが、Vibrio fluvialis、Alcaligenes denitrificans、Klebsiella pneumoniae、またはBacillus thuringiensis由来である方法。
【請求項８】
請求項１〜６の何れか１項に記載の方法であって、工程ｃ）で得られる前記ケトン副生成物がピルベートである方法。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の方法であって、工程ｃ）で得られる前記ケトン副生成物が、更なる処理工程ｄ）において、少なくとも一つの酵素との反応によって前記反応混合物から除去される方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、工程ｄ）で使用される前記酵素がデカルボキシラーゼである方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、工程ｄ）で使用される前記酵素がシンターゼである方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法であって、工程ｄ）で使用される前記酵素がデヒドロゲナーゼである方法。
【請求項１３】
請求項９または１０の何れか１項に記載の方法であって、前記酵素がピルベートデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）である方法。
【請求項１４】
請求項９または１２の何れか１項に記載の方法であって、前記酵素がラクテートデヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）である方法。
【請求項１５】
請求項９または１１の何れか１項に記載の方法であって、前記酵素がアセトラクテートシンターゼである方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、前記ＰＤＣの作用によって形成された前記アセトアルデヒドが除去される方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記アセトアルデヒドが少なくとも一つの酵素との反応により除去される方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法であって、前記酵素がアルコールデヒドロゲナーゼである方法。
【請求項１９】
請求項１６に記載の方法であって、ガス状窒素を前記反応混合物中に供給することによって、前記アセトアルデヒドが除去される方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法であって、前記反応混合物に減圧を適用することによって、前記アセトアルデヒドが除去される方法。
【請求項２１】
請求項１６に記載の方法であって、前記アセトアルデヒドが化学的方法により除去される方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１の何れか１項に記載の方法であって、工程ｃ）またはｄ）で得られた前記光学活性キラルアミンが、工程ｃ）またはｄ）で得られた前記反応混合物から除去される方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れか１項に記載の方法であって、前記方法は、５．０〜９．５、好ましくは６．０〜７．０、好ましくは６．０〜６．９のｐＨを有する反応混合物中で行われる方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３の何れか１項に記載の方法であって、前記方法は、４０〜７０分の反応時間の間行われる方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４の何れか１項に記載の方法であって、前記アミノ受容体がＢ３ＯＰである方法。
【請求項２６】
請求項１〜２５の何れか１項に記載の方法であって、前記アミノ供与体がアラニンである方法。
【請求項２７】
請求項１３、２５または２６の何れか１項に記載の方法であって、前記ＰＤＣの反応により形成されたアセトアルデヒドが、ガス状窒素（Ｎ２）を前記反応混合物中に供給することによって除去される方法。
【請求項２８】
請求項１３、２５または２６の何れか１項に記載の方法であって、前記反応は、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼおよび少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼの存在下で行われる方法。
【請求項２９】
請求項１３、２５または２６の何れか１項に記載の方法であって、前記反応は、少なくとも一つのピルベートデカルボキシラーゼ、および少なくとも一つのアルコールデヒドロゲナーゼの存在下で、更にガス状窒素（Ｎ２）の存在下で行われる方法。
【請求項３０】
３−アミノピロリドン誘導体、セファロスポリン、セファロスポリンの誘導体、ヘテロ環状ホウ素酸、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ドーパ）、α−メチルドーパ、Ｄ−フェニルグリシン、β−ヒドロキシフェニルグリシン、ホスフィノトリチン（phosphinothricine）、ピリミド誘導体およびピロリドン誘導体からなる群から選択される生理学的に活性な化合物の製造方法であって、請求項１〜２９の何れか１項に記載の方法が使用される方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００９−５２６５３１（Ｐ２００９−５２６５３１Ａ）
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５５４６５９（Ｐ２００８−５５４６５９）
【出願日】平成１９年２月１３日（２００７．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００１２２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９３３７２
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０２１７７１７４）ロンザ・アーゲー (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年７月２３日（２００９．７．２３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月１３日（２００７．２．１３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００１２２２
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０９３３７２
【国際公開日】平成１９年８月２３日（２００７．８．２３）
【出願人】（５０２１７７１７４）ロンザ・アーゲー (3)
【Ｆターム（参考）】
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