光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩およびそのエステルの製造方法
【課題】光学活性ビフェニルアラニン化合物またはそのエステルを、高い光学純度で、安価で、簡便な操作により製造できる方法の提供。
【解決手段】ビフェニルアラニンエステル化合物を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩と未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を分離することを特徴とする、光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩および光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物の製造方法。
【解決手段】ビフェニルアラニンエステル化合物を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩と未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を分離することを特徴とする、光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩および光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬等の中間体として有用な光学活性なビフェニルアラニン構造を有する化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性なビフェニルアラニン構造を有する化合物は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤等の医薬の中間体として有用である（特許文献１、２参照）。
【０００３】
光学活性ビフェニルアラニンの製造方法としては、（１）Ｄ−Ｂｏｃ−チロシンメチルエステルのトリフレート化、スズキカップリング、エステルの加水分解による方法（特許文献３参照）、（２）不斉水素化による光学活性Ｂｏｃ−ビフェニルアラニンの合成（非特許文献１および特許文献２参照）が知られている。しかしながら、（１）の方法は、トリフレート化の試剤が高価である、スズキカップリングで使用する触媒のパラジウムが高価である、生成物からの残留パラジウムの除去が困難である、Ｄ−ビフェニルアラニンを得ようとした場合、原料であるＤ−チロシンが高価である点で、工業的に有利な方法とはいえない。また、（２）の方法は不斉水素化で使用する触媒および不斉源が高価という問題があった。
【０００４】
一方、光学活性なアミノ酸誘導体を製造する方法として、Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）アラニンエステルのラセミ体を、酵素を用いて不斉加水分解する方法が知られている（特許文献４参照）。その他にも、酵素を用いる不斉加水分解により、光学活性なアミノ酸または光学活性なフェニルアラニン誘導体を製造することが知られている（非特許文献２〜５、特許文献５参照）。
【０００５】
また、ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エステルをｐＨコントロール試薬としての弱塩基の存在下で、プロテアーゼを用いて加水分解して、Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸およびＮ−置換−Ｄ−アミノ酸エステルを得ることが知られている（特許文献６参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−２２８１８７号公報
【特許文献２】特開２００３−２６１５２２号公報
【特許文献３】米国特許第５２１７９９６号明細書
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００４／０５５１９５号パンフレット
【特許文献５】スペイン特許出願公開第５４７９１３号
【特許文献６】特開平９−２０６０８９号公報
【非特許文献１】キラリティ(Chirality)、１９９６年、第８巻、第２号、ｐ．１７３−１８８
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・ケミカル・テクノロジー・アンド・バイオテクノロジー(J. Chem. Technol. Biotechnol.)、１９９４年、第５９巻、第１号、ｐ．６１−６５
【非特許文献３】アイティーイー・レターズ・オン・バッテリーズ、ニュー・テクノロジーズ・アンド・メディシン(ITE Letters on Batteries, New Technologies & Medicine)、アイティーイー−ホーワ・インコーポレイティッド(ITE-Hohwa Inc.)、２００４年、第５巻、第４号、ｐ．３７７−３８０、
【非特許文献４】エナンチオマー(Enantiomer)、２００２年、第７巻、第１号、ｐ１−３
【非特許文献５】バイオテクノロジー・レターズ(Biotechnol. Lett.)、１９９１年、第１３巻、第５号、ｐ．３１７−３２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、光学活性なビフェニルアラニン構造を有する化合物を、高い光学純度で、安価で、簡便な操作により製造することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意検討した結果、ビフェニルアラニンエステルを、特定の条件下で、特定の酵素を用いて加水分解することにより、光学活性ビフェニルアラニンまたはその塩およびそのエステルを高い光学純度で、安価で、簡便な操作により製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の通りである。
【０００９】
［１］式（１）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２はアミノ基の保護基を示し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基またはニトロ基を示す。）
で表されるビフェニルアラニンエステル化合物（以下、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）ともいう）を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した式（２）
【００１２】
【化２】
【００１３】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物（以下、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）ともいう）またはその塩と式（３）
【００１４】
【化３】
【００１５】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（以下、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）ともいう）を分離することを特徴とする、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩および光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）の製造方法。
［２］アルカリがアルカリ金属水酸化物である、上記［１］記載の方法。
［３］アミノ酸がグリシンである、上記［１］記載の方法。
［４］アミノスルホン酸がタウリンである、上記［１］記載の方法。
［５］加水分解がアルカリ金属水酸化物とアミノ酸の存在下で行われる、上記［１］記載の方法。
［６］加水分解がアルカリ金属水酸化物とグリシンの存在下で行われる、上記［１］記載の方法。
［７］加水分解がアルカリ金属水酸化物とアミノスルホン酸の存在下で行われる、上記［１］記載の方法。
［８］加水分解がアルカリ金属水酸化物とタウリンの存在下で行われる、上記［１］記載の方法。
［９］プロテアーゼがBacillus licheniformis由来のものである、上記［１］記載の方法。
［１０］Ｒ１がアルキル基である、上記［１］記載の方法。
［１１］Ｒ１がメチルまたはエチルである、上記［１］記載の方法。
［１２］Ｒ２がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである、上記［１］記載の方法。
［１３］Ｒ３およびＲ４が水素原子である、上記［１］記載の方法。
［１４］加水分解が、ｐＨを６．０〜１３の範囲に維持しながら行われる、上記［１］記載の方法。
［１５］加水分解が、ｐＨを６．０〜１０の範囲に維持しながら行われる、上記［１］記載の方法。
［１６］加水分解が、有機溶媒と水の混合溶媒中で行われる、上記［１］記載の方法。
［１７］有機溶媒が、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルおよびトルエンから選ばれる少なくとも１種である、上記［１６］記載の方法。
［１８］有機溶媒がｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルである、上記［１６］記載の方法。
［１９］加水分解が３０〜６０℃で行われる、上記［１］記載の方法。
［２０］加水分解が３５〜５５℃で行われる、上記［１］記載の方法。
［２１］光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩をエステル化して、式（２’）
【００１６】
【化４】
【００１７】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（以下、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）ともいう）を得る工程；
光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）をラセミ化して、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を得る工程；
を包含することを特徴とする、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）の製造方法。
［２２］ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩と未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を分離する工程；
光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩をエステル化して、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）を得る工程；
光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）をラセミ化して、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を得る工程；
を包含する、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）の回収方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の製造方法によれば、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリ（以下、苛性アルカリともいう）の存在下で、(ii)苛性アルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)苛性アルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解することにより、Ｌ体が優先的に加水分解されるので、Ｌ体の光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩とＤ体の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を高い光学純度で、簡便な操作により製造することができる。特にBacillus licheniformis由来のプロテアーゼを使用することが、エナンチオ選択性に優れる点で好ましい。
本発明の製造方法は、安価な原料から製造することのできるビフェニルアラニンエステル化合物（１）を使用するため、工業的に有利な製造方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書において使用する置換基の定義を以下に説明する。
「アルキル基」としては、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が挙げられ、好ましくはメチルまたはエチルである。
【００２０】
「アルケニル基」としては、炭素数２〜６の直鎖または分枝のアルケニル基、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル等が挙げられ、好ましくは、ビニルまたはアリルである。
【００２１】
「シクロアルキル基」としては、炭素数３〜８のシクロアルキル基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられ、好ましくはシクロペンチルまたはシクロヘキシルである。
【００２２】
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、好ましくはフッ素原子、塩素原子または臭素原子である。
【００２３】
「ハロアルキル基」とは、上記定義の「ハロゲン原子」で置換された上記定義の「アルキル基」である。当該ハロゲン原子の置換数は特に限定されないが、１〜３個が好ましい。「ハロアルキル基」としては、例えば、クロロメチル、ブロモメチル、フルオロメチル、ジクロロメチル、ジブロモメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル、トリフルオロメチル、２，２−ジクロロエチル、２，２，２−トリクロロエチル等が挙げられ、好ましくはトリフルオロメチルである。
【００２４】
「アルコキシ基」としては、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等が挙げられ、好ましくはメトキシまたはエトキシである。
【００２５】
「置換基を有していてもよいアリール基」の「アリール基」としては、炭素数６〜１４のアリール基、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル等が挙げられ、好ましくはフェニルである。
当該アリール基は置換可能な位置に置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、ハロゲン原子（上記で定義したものと同じものが例示される）、アルキル基（上記で定義したものと同じものが例示される）、ハロアルキル基（上記で定義したものと同じものが例示される）、ヒドロキシ基、アルコキシ基（上記で定義したものと同じものが例示される）、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。当該置換基の数は特に限定されないが、１〜３個が好ましい。置換基の数が２個以上の場合、それらの置換基は同一または異なっていてもよい。
【００２６】
「置換基を有していてもよいアラルキル基」の「アラルキル基」は、上記定義の「アリール基」で置換された上記定義の「アルキル基」である。当該アリール基の置換数は特に限定されないが、１〜３個が好ましい。「アラルキル基」としては、例えば、ベンジル、フェネチル、１−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、ベンズヒドリル、トリチル等が挙げられ、好ましくはベンジルである。
当該アラルキル基は置換可能な位置に置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、ハロゲン原子（上記で定義したものと同じものが例示される）、アルキル基（上記で定義したものと同じものが例示される）、ハロアルキル基（上記で定義したものと同じものが例示される）、ヒドロキシ基、アルコキシ基（上記で定義したものと同じものが例示される）、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。当該置換基の数は特に限定されないが、１〜３個が好ましい。置換基の数が２個以上の場合、それらの置換基は同一または異なっていてもよい。
【００２７】
Ｒ２で示される「アミノ基の保護基」としては、アミノ基の保護基として用いられる自体公知の保護基を特に制限なく使用することができる。そのような保護基としては、−ＣＯ２Ｒ５（式中、Ｒ５はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基または９−フルオレニルメチル基を示す。）、−ＣＯＲ６（式中、Ｒ６は水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示す。）、置換基を有していてもよいアラルキル基等が挙げられる。「アミノ基の保護基」として、具体的には、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル等が挙げられる。
【００２８】
Ｒ１は、好ましくはアルキル基であり、より好ましくはメチルまたはエチルである。
Ｒ２は、好ましくは−ＣＯ２Ｒ５（式中、Ｒ５は前記と同義である。）であり、より好ましくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。
Ｒ３およびＲ４は、好ましくは共に水素原子である。
【００２９】
本発明の製造方法において用いられる原料である、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）は、例えば、次の方法で製造することができる。
【００３０】
【化５】
【００３１】
（式中、各記号は前記と同義である。）
【００３２】
工程１
化合物（４）とヒダントイン（５）を、塩基の存在下で反応させることにより、化合物（６）を得ることができる。
ヒダントイン（５）の使用量は、化合物（４）１モルに対して、通常１〜３モル、好ましくは１．０５〜２モルである。
塩基としては、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、ピペリジン、トリエチルアミン等が挙げられる。
塩基の使用量は、化合物（４）１モルに対して、通常０．１〜１０モル、好ましくは０．５〜２モルである。
反応溶媒としては、酢酸、無水酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等が挙げられる。
反応温度は、通常３０〜２００℃であり、好ましくは１００〜２００℃である。反応時間は、通常１〜２４時間であり、好ましくは３〜１０時間である。
【００３３】
工程２
化合物（６）を還元することにより、化合物（７）を得ることができる。
還元は、好ましくは、接触水素添加により行うことができる。
接触水素添加で使用する触媒としては、例えば、パラジウム−炭素、水酸化パラジウム−炭素、白金−炭素、ロジウム−炭素、ルテニウム−炭素、展開ニッケル等が挙げられる。
触媒の使用量は、化合物（６）１ｇに対して、金属量として、Ｐｄ等の貴金属の場合は、通常０．０００５〜０．０５ｇ、好ましくは０．００５〜０．０２ｇであり、展開ニッケルの場合は、通常０．１〜２ｇ、好ましくは０．２〜１ｇである。
反応溶媒としては、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン等のエーテル類；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類；酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチル等のエステル類；酢酸、プロピオン酸等の有機酸；水；これらの混合溶媒が挙げられる。
接触水素添加は、常圧または加圧条件下で行うことができる。
反応温度は、通常２０〜１００℃であり、好ましくは４０〜７０℃である。反応時間は、通常１〜２４時間であり、好ましくは３〜１０時間である。
【００３４】
工程３
化合物（７）を加水分解することにより、化合物（８）を得ることができる。
加水分解は、通常、溶媒中、塩基で処理することにより行われる。
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
塩基の使用量は、化合物（７）１モルに対して、通常２〜１０モル、好ましくは３〜８モルである。
反応溶媒としては、メタノール、エタノール、エチレングリコール等のアルコール類；テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン等のエーテル類；水；これらの混合溶媒等が挙げられる。
反応温度は、通常８０〜２００℃であり、好ましくは１００〜１７０℃である。反応時間は、通常１〜２４時間であり、好ましくは３〜１０時間である。
【００３５】
工程４
化合物（８）を、アミノ基の保護およびカルボキシル基のエステル化反応に供することにより、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を得ることができる。アミノ基の保護とカルボキシル基のエステル化は常法に従って行うことができる。アミノ基の保護とカルボキシル基のエステル化の順序は特に限定されず、任意の順序で行うことができる。
【００３６】
ビフェニルアラニンエステル化合物（１）には、α位の炭素原子を不斉中心とする２種の光学異性体（Ｌ体とＤ体）が存在するが、本発明の方法に用いられるビフェニルアラニンエステル化合物（１）は、これらの光学異性体を等量含むラセミ体であっても、一方の光学異性体を過剰に（任意の割合で）含む混合物であってもよい。好ましくはラセミ体である。
【００３７】
このようにして得られたビフェニルアラニンエステル化合物（１）を、本発明では、(i)苛性アルカリの存在下で、(ii)苛性アルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)苛性アルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解する。当該プロテアーゼを用いて加水分解すると、Ｌ体が優先的に加水分解される。
【００３８】
Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼとしては、エナンチオ選択性に優れることから、Bacillus licheniformis由来のプロテアーゼが好ましい。Bacillus licheniformis由来のプロテアーゼの具体例としては、サブチリシン（subtilisin)を含有するBacillus licheniformis由来のプロテアーゼが挙げられ、好ましくはアルカラーゼ（ノボザイム社)、特に好ましくはアルカラーゼ2.4L（ノボザイム社)である。
【００３９】
上記プロテアーゼの純度あるいは形態については特に制限されるものではなく、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、それらの処理物等の種々の形態で用いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物等をいう。さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素を例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に固定化したものを使用してもよい。
【００４０】
上記プロテアーゼの使用量は、特に限定されないが、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）１ｇに対して、精製酵素に換算して、通常０．００１〜０．５ｇ、好ましくは０．００１〜０．１ｇである。
【００４１】
上記プロテアーゼによる加水分解は、プロテアーゼの種類にもよるが、好ましくはｐＨを６．０〜１３、より好ましくはｐＨ６．０〜１０、さらに好ましくは６．０〜９．５に維持しながら行われる。上記のｐＨ範囲で加水分解を行うことにより、光学純度の高い生成物を得ることができる。
【００４２】
また、上記加水分解は、通常、水中、或いは有機溶媒と水の混合溶媒中で行われ、光学純度の高い生成物が得られることから、有機溶媒と水の混合溶媒中で行われることが好ましい。
【００４３】
ｐＨを上記範囲とする方法としては、例えば、苛性アルカリ水溶液；リン酸緩衝液（リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム）、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム、酢酸カリウム）等の緩衝液；緩衝液存在下での苛性アルカリ水溶液；アミノ酸存在下での苛性アルカリ水溶液；アミノスルホン酸存在下での苛性アルカリ水溶液；等が挙げられる。アルカリ水溶液や緩衝液は溶媒も兼ねる。
【００４４】
本発明において、アミノ酸とは、１分子中にアミノ基（置換アミノ基や環状構造となった置換アミノ基も含む）とカルボキシル基の両方を有する有機化合物（アミノ基の水素原子が側鎖部分と環状構造となったイミノ酸も含む）であり、α−アミノ酸だけでなく、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸等も含まれる。α−アミノ酸の具体例としては、グリシン、アラニン、α−アミノ酪酸、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、システイン、スレオニン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン、グルタミン等の中性アミノ酸；アルパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸；リジン、トリプトファン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン等の塩基性アミノ酸等が挙げられる。β−アミノ酸の具体例としては、β−アラニン、β−アミノ酪酸等が挙げられる。γ−アミノ酸の具体例としては、γ−アミノ酪酸等が挙げられる。δ−アミノ酸の具体例としては、５−アミノ吉草酸等が挙げられる。
【００４５】
本発明において、アミノスルホン酸とは、上記アミノ酸におけるカルボキシル基の代わりにスルホ基を有する有機化合物であり、具体例としては、タウリン、Ｎ−メチルタウリン、２−（４−モルホリニル）エタンスルホン酸等が挙げられる。
【００４６】
本発明では、ｐＨを上記範囲とする方法として、経済性および環境に好ましくない廃棄物削減の点から、(i)苛性アルカリ水溶液を使用する方法、(ii)アミノ酸存在下で苛性アルカリ水溶液を使用する方法、または(iii)アミノスルホン酸存在下で苛性アルカリ水溶液を使用する方法を採用する。なお、(ii)および(iii)の方法では、アミノ酸またはアミノスルホン酸が緩衝剤の役割を果たす。本発明では、(ii)および(iii)の方法が特に好ましい。
【００４７】
上記の方法において、苛性アルカリは、好ましくはアルカリ金属水酸化物であり、特に好ましくは水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムである。また、アミノ酸は、好ましくはグリシンであり、アミノスルホン酸は、好ましくはタウリンである。
【００４８】
苛性アルカリ水溶液の濃度は、特に限定されないが通常２〜３０％、好ましくは３〜１５％、より好ましくは３〜１３％である。アルカリ水溶液の濃度を上記の範囲とすることにより、より容易に光学純度の高い生成物が得られる。
【００４９】
緩衝液の濃度は、通常０．０５〜０．８Ｍ、好ましくは０．１〜０．８Ｍ、より好ましくは０．１〜０．５Ｍである。緩衝液の濃度を上記の範囲とすることにより、光学純度の高い生成物が得られる。
【００５０】
緩衝液の使用量は、濃度にもよるがビフェニルアラニンエステル（１）１ｇに対して、通常２〜１００ｍＬ、好ましくは２〜１０ｍＬである。緩衝液の使用量がこの範囲外であると、加水分解で生成した塩が析出したり、反応のコントロールが困難になったり、また溶媒の増加による生産性が低下する虞がある。
【００５１】
苛性アルカリ水溶液の使用量は、ビフェニルアラニンエステル（１）に対して、通常０．４５〜０．７当量、好ましくは０．４８〜０．６５当量である。アルカリの使用量がこの範囲外であると、適切なｐＨ範囲の維持が困難となり、反応が停止したり、アルカリによる自然加水分解が進行する虞がある。
【００５２】
アミノ酸またはアミノスルホン酸の使用量は、ビフェニルアラニンエステル（１）１モルに対して、通常０．０５〜１．０モル、好ましくは０．１〜０．５モル、より好ましくは０．１〜０．３モルである。アミノ酸またはアミノスルホン酸の使用量を上記の範囲とすることにより、酵素反応に必要なｐＨ範囲の維持が容易になり、円滑に反応を進行させることが可能になる。
【００５３】
有機溶媒としては、疎水性有機溶媒、親水性有機溶媒が挙げられる。
疎水性有機溶媒としては、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類等が挙げられる。親水性有機溶媒としては、テトラヒドロフラン等のエーテル類；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；アセトン等のケトン類；アセトニトリル等のニトリル類等が挙げられる。これらの有機溶媒は単独でまたは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
有機溶媒は、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルまたはトルエンであり、特に好ましくはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルである。
【００５４】
有機溶媒の使用量は、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）１ｇに対して、通常１〜５０ｍＬ、好ましくは１〜５ｍＬである。有機溶媒の使用量がこの範囲外であると、原料と生成物が析出して反応速度が低下したり、生産性が低下する虞がある。
【００５５】
加水分解は、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼ、苛性アルカリおよび溶媒、必要によりアミノ酸またはアミノスルホン酸を混合することにより行われる。
これらの添加順序は特に限定されず、例えば、
(i)有機溶媒に溶解したビフェニルアラニンエステル化合物（１）を苛性アルカリ水溶液または緩衝液に添加し、次いで上記プロテアーゼを添加する、
(ii)有機溶媒に溶解したビフェニルアラニンエステル化合物（１）に苛性アルカリ水溶液または緩衝液を添加し、次いで上記プロテアーゼを添加する、
(iii)有機溶媒に溶解したビフェニルアラニンエステル化合物（１）に上記プロテアーゼ（必要により水も）を添加し、次いで苛性アルカリを添加（好ましくは滴下）する、
(iv)有機溶媒に溶解したビフェニルアラニンエステル化合物（１）に上記プロテアーゼおよびアミノ酸またはアミノスルホン酸（必要により水も）を添加し、次いで苛性アルカリ水溶液を添加（好ましくは滴下）する、
等の手法が挙げられる。
【００５６】
上記プロテアーゼは、必要により反応中に追加してもよい。また、反応中に反応液のｐＨが上記範囲より低下した場合には、適当なｐＨ調整剤を用いて反応液のｐＨを上記範囲に維持する。
ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム等の苛性アルカリまたはその水溶液が挙げられる。
【００５７】
加水分解の反応温度は、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは３５〜５５℃、特に好ましくは４０〜４５℃である。反応温度が上記範囲外であると、酵素の安定性が低下したり、反応速度が低下する虞がある。
加水分解の反応時間は、通常３〜２４時間、好ましくは４〜１５時間である。
【００５８】
反応後の反応混合物を水層と有機層に分液することにより、加水分解により生成した光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）（Ｌ体）の塩と未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）（Ｄ体）を分離することができる。このとき、水層に光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩が、有機層に光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）が含有される。
加水分解において、疎水性有機溶媒と水の混合溶媒を用いた場合は、得られた反応混合物をそのまま分液してもよい。
加水分解において、疎水性有機溶媒を用いなかった場合、あるいは疎水性有機溶媒および／または水の使用量が少ないためそのままでは分液できない場合は、適当な量の疎水性有機溶媒および／または水を添加した後に分液すればよい。
疎水性有機溶媒としては、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類；ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチル等のエステル類等が挙げられる。
分液操作時には、水層のｐＨを通常６．５〜１２、好ましくは７．５〜１１に調整する。
【００５９】
得られた水層から、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩は以下の方法により得ることができる。
１）水層から溶媒を留去することにより、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等）の粗生成物を得ることができる。
【００６０】
２）水層に無機塩と有機溶媒を加えて抽出し、有機溶媒を留去することにより、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩を単離することができる。
ここで、無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等が挙げられ、経済性および光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩の溶解度の観点から、塩化カリウムもしくは塩化ナトリウムが好ましい。無機塩の使用量は、抽出率等の観点から、水層中に含まれる光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩１００ｇに対して、好ましくは３０ｇ〜１００ｇである。
有機溶媒としては、トルエン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル等の溶媒が挙げられ、中でも、トルエン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルが好ましい。
有機溶媒の使用量は、水層中に含まれる光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩１００ｇに対して、通常６０ｇ〜１３０ｇ、好ましくは８０ｇ〜１２０ｇである。
なお、抽出が十分でない場合は、酸を加えてｐＨを中性ないし弱酸性に調整してもよい。
抽出は、通常１０〜５０℃で行う。
【００６１】
３）水層を酸性（通常ｐＨ１〜７、好ましくはｐＨ１〜４）にした後、有機溶媒で抽出し、有機溶媒を留去することにより、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）を単離することができる。有機溶媒としては、上記の抽出で使用する有機溶媒と同様のものが挙げられる。
【００６２】
得られた光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩は、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の一般的な方法により精製することができる。なお、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩は、必要に応じて、酸により、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）に変換してもよい。
【００６３】
一方、有機層から溶媒を留去することにより、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を単離することができる。さらに分液操作で分離した水層を有機溶媒で抽出することにより、水層中の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を回収することができる。この抽出操作における水層のｐＨは、通常６．５〜１２、好ましくは７．５〜１１である。有機溶媒としては、前記の疎水性有機溶媒として例示したものを使用することができる。
得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）は、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の一般的な方法により精製することができる。
【００６４】
単離した光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を、常法に従って加水分解することにより、Ｒ１が水素原子である化合物（光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の光学異性体（Ｄ体））またはその塩を製造することができる。
【００６５】
また、単離した光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩および光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）のアミノ基の保護基を、常法に従って脱保護することにより、Ｒ２が水素原子である化合物をそれぞれ製造することができる。
【００６６】
本発明の方法により製造される光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩および光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤等の医薬を製造するための中間体として有用である。例えば、特開平６−２２８１８７号公報に記載の方法を用いて、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩または光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）から、当該公報に記載されたＮ−ホスホノメチル−ビアリール置換ジペプチド誘導体を製造することができる。
【００６７】
光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）が所望の化合物である場合は、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩を、エステル化して光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）を得、次いでラセミ化してビフェニルアラニン化合物（１）に変換することにより、上記の加水分解に再利用することができる。以下、その方法を説明する。
【００６８】
【化６】
【００６９】
（式中、各記号は前記と同義である。）
【００７０】
エステル化
光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩をエステル化して、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）を得る。
このエステル化では、上記加水分解終了後の抽出にて得られた光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩の有機溶媒の溶液が、そのまま使用できる。
エステル化は常法に従って行うことができ、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類と酸による方法；硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等の硫酸エステルと塩基による方法；Ｒ１ＯＨとＤＣＣ等の縮合剤による方法；ヨウ化メチル、ブロモエタン、塩化ベンジル等のアルキルハライドと塩基による方法；等が挙げられ、中でも、副生物および簡便性の観点から、硫酸エステルと塩基による方法が好ましい。
【００７１】
以下、塩基と硫酸ジメチルによる方法について説明する。
塩基としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ジイソプロピルエチルアミン、２，６−ジメチルピリジン、トリエチルアミン、ピリジン等が挙げられ、中でも、炭酸水素ナトリウムが好ましい。
塩基の使用量は、溶液中の光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩１モルに対して、通常０．３〜１．２倍モル量である。
硫酸エステルとしては、反応性および後処理の観点から、硫酸ジメチルが好ましい。
硫酸エステルの使用量は、溶液中の光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩に対して、通常１．２〜２．５倍モル量である、好ましくは１．６〜２．０倍モル量である。
エステル化の手順としては、反応性の観点から、塩基と光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩を含む溶液に、硫酸エステルを滴下することが好ましい。
エステル化の温度は、通常３０〜５０℃である。反応時間は、試薬量、反応温度等にもよるが、通常１〜１０時間である。反応の終了はＨＰＬＣ分析により確認できる。
【００７２】
反応終了後、トリエチルアミン等のアミンを加えて、３０〜５０℃の温度で２〜５時間攪拌することにより、残存する硫酸エステルを分解させる。アミンの使用量は、使用した硫酸エステルに対して１０モル％程度でよい。
次いで、反応液を分液し、有機層を脱水する。脱水は、無水硫酸マグネシウム、無水硫酸ナトリウム、モレキュラーシーブス等の脱水剤を用いてもよいが、操作性の観点から、水と共沸する溶媒（例えば、トルエン等）で共沸脱水する方法が好ましい。
共沸する溶媒の使用量は、十分に脱水できる量であればよいが、溶液量に対して、通常５０〜１００重量％である。
次のラセミ化には、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）溶液中の水分量が５００ｐｐｍ以下であることが好ましく、従って、脱水を十分に行うことが好ましい。
このようにして得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）の溶液は、そのまま次のラセミ化に使用できる。あるいは一般的な方法により、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）を単離してから使用してもよい。
【００７３】
ラセミ化
エステル化により得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）をラセミ化して、ビフェニルアラニン化合物（１）に変換する。
ラセミ化は、通常、溶媒中で塩基を用いて行われる。
溶媒として、エステル化で得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）の溶液に、さらに、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類を加えることが、ラセミ化促進の観点から好ましい。
アルコール類の使用量は、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）の重量に対して、通常８０〜１２０％重量である。
塩基としては、ナトリウムメトキサイド、ナトリウムエトキサイド、カリウムtert−ブトキサイド等のアルカリ金属アルコラート；水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物等が挙げられ、中でも、取り扱いの観点から、アルカリ金属アルコラートが好ましく、経済性の観点から、ナトリウムメトキサイドが特に好ましい。
塩基の使用量は、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）に対して、８０〜１２０モル％である。
ラセミ化の温度は、通常３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃である。反応時間は、試薬の使用量、温度にもよるが、通常１０分〜６時間である。ラセミ化反応の終了はＨＰＬＣで確認することができる。
【００７４】
ラセミ化終了後、反応液に酢酸等の酸を加えて、エステルの分解を抑制することが好ましい。ここで、酸の使用量は、ラセミ化に使用した塩基に対して、通常１．１〜１．３倍モル量である。
ラセミ化終了後の後処理は、常法に従って行われる。
【００７５】
このようにして得られたビフェニルアラニンエステル化合物（１）の溶液は、酵素による加水分解にそのまま供してもよいし、濃縮後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル等の別の有機溶媒に溶解し、加水分解に供してもよい。
【００７６】
なお、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩が所望の化合物である場合は、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を、ラセミ化してビフェニルアラニン化合物（１）に変換することにより、上記の加水分解に再利用することができる。
このラセミ化は、加水分解終了後の抽出にて得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）の有機溶媒の溶液を用いて、上記のラセミ化方法と同様の方法により行うことができる。
【実施例】
【００７７】
以下に製造例、実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７８】
以下の実施例においてpH7.0のリン酸緩衝液およびpH8.0のリン酸緩衝液は次の方法で調製したものを使用した。
pH7.0のリン酸緩衝液
リン酸水素二カリウム17.25 g (0.099 mol)を水900 mLに溶解し、リン酸でpH7.0に調整し、水を加えて全量1 Lにした水溶液
pH8.0のリン酸緩衝液
リン酸水素二ナトリウム7.38 ｇ (0.052 mol)およびリン酸二水素ナトリウム二水和物5.46 g (0.035 mol)を水195 mLに溶解し、20%水酸化ナトリウム水溶液でpH8.0に調整した水溶液
【００７９】
光学活性体の光学純度（エナンチオマー過剰率）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により決定した。
ＨＰＬＣ分析条件
カラム； キラルパック AD-RH（ダイセル化学工業株式会社）(4.5 mmφ x 15 cm、5mm)
移動層； A液； 0.1%リン酸水溶液
B液； アセトニトリル
溶離条件； B液40%(15分)−30分−80%(0分)グラジエント
カラム温度； 40℃
流速； 1.0 mL/分
検出器； UV(254 nm)
保持時間； L-N-Boc-ビフェニルアラニン； 10分
D-N-Boc-ビフェニルアラニン； 13分
L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル； 27分
D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル； 30分
【００８０】
【化７】
【００８１】
製造例１
DL-ビフェニルアラニン(12)
4-ビフェニルアルデヒド(9)(100.0 g, 0.549 mol)、ヒダントイン(82.4 g, 0.823 mol)および酢酸アンモニウム（63.5 g, 0.824 mol)を酢酸(360 mL)中で5時間加熱還流した。水(360 mL)を加えた後、室温に冷却し、結晶を濾取し、イソプロパノール-水(1:1, 400 mL)で洗浄することによりヒダントイン体(10)(143.14 g, 収率98.7%)を得た。
【００８２】
ヒダントイン体(10)(60.2 g)、テトラヒドロフラン(THF)(540 mL)および水（60 mL)の混合物に5%パラジウム−炭素(50%含水、2.7 g)を加え、0.5 MPaの水素雰囲気下、60℃で3時間撹拌した。触媒を濾過により除いた後、濾液を濃縮して還元体(11)(60.63 g、収率100%）を得た。
【００８３】
還元体(11)(59.7 g, 0.224 mol)、エチレングリコール(300 mL)および水(10 mL)の混合物に水酸化ナトリウム(36.65 g)を加え、130-140℃で5時間撹拌した。室温に冷却後、水(130 mL)を加え、濃塩酸(85 g)と水(99 g)からなる塩酸水溶液を加え、混合物のpHを6.9とした。得られた結晶を濾取し、水(300 mL)で洗浄後、メタノール(300 mL)で洗浄し、乾燥して、DL-ビフェニルアラニン(12)(53.25 g, 収率98.4%）を得た。
【００８４】
製造例２
DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル(13)
DL-ビフェニルアラニン(12)(20.0 g, 0.0829 mol)を10%水酸化ナトリウム(116 g, 0.29mol)水溶液に加えた。THF(50 mL)を加えた後、30℃でジ-tert-ブチルジカーボネート(23.5 g, 0.108 mol)のTHF（20 mL)溶液を1時間かけて滴下した。さらに、テトラブチルアンモニウムブロミド(0.20 g, 0.62 mmol)を加えた後、30℃でジメチル硫酸(12.5 g, 0.099 mol)を滴下した。室温で16時間撹拌後、ジメチル硫酸(5.4 g, 0.0428 mol)を加え、35℃で4.5時間撹拌し、さらにジメチル硫酸(2.93 g, 0.0232 mol)を加え、35℃で2.5時間撹拌した。
tert-ブチルメチルエーテル(MTBE) (40 mL)および水(100 mL)を加えた後、分液して水層を除去し、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのMTBE溶液104.1 gを得た。
HPLCで定量した結果、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの含量は29.4 gであり、DL-ビフェニルアラニンからの収率は99.8%であった。
こうして得られたDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのMTBE溶液のうち78.1 gを濃縮乾固し、残渣をイソプロパノール(9 mL)とヘプタン(80 mL)から再結晶して、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル(19.1 g)を無色結晶として得た（再結晶収率86.6%)。
1H-NMR (CDCl3); 1.42 (9H, s), 3.09 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.16 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.74 (3H, s), 4.55-4.70 (1H, m), 4.90-5.08 (1H, m), 7.20 (2H, d, J=8 Hz), 7.33 (1H, t, J=8 Hz), 7.43 (2H, t, J=8 Hz), 7.52 (2H, d, J=8 Hz), 7.57 (2H, d, J=8 Hz).
【００８５】
実施例１（水酸化カリウム滴下法）
DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル221.08g(0.622mol)をMTBE 467.76gに溶かした溶液に、水99.49gとアルカラーゼ2.4L FG（Bacillus licheniformis由来）（ノボザイム社）55.26gを添加し40℃で攪拌した。そこに5%水酸化カリウム水溶液369.8g(0.317mol)を滴下しながら、40℃で22時間攪拌した。この時の反応液のpHの範囲は6.82から9.58であった。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.2%eeであった。
【００８６】
実施例２（タウリン添加法）
DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル25.0g(70.3mmol)をMTBE 41.14gに溶かした溶液に、水11.25gとタウリン1.76g(14.1mmol)およびアルカラーゼ2.4L FG（Bacillus licheniformis由来）（ノボザイム社）4.50gを添加し40℃で攪拌した。そこに5%水酸化カリウム水溶液47.28g(40.67mmol)を滴下しながら40℃で17時間攪拌した。この時の反応液のpHの範囲は6.30から8.16であった。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.4%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は99.9%eeであった。
反応液を5分間静置後、分液し、有機層Ａ35.72gと水層Ａ83.46gを得た。その水層にトルエン37.5gを加えて、40℃で30分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層Ｂ42.80gと水層Ｂ76.80gを得た。有機層Ａと有機層Ｂを合一し、水58gと炭酸ナトリウム1.49gを加えて、40℃で30分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層Ｃ76.07gを得た。得られた有機層Ｃ76.07gを50℃に保温しながら濃縮を行い、63.2gを留去した。
その濃縮残12.87gにメタノール75mLを加えて、40℃に保温しながら、水18.75gを加えた。D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの種晶2mgを加えて、40℃で30分間撹拌した。そこに水12.5gを30分間かけて滴下し、40℃にて1時間保温した。次に20℃まで冷却し、濾過した。得られた結晶をメタノール8.75gと水3.75gを混合した溶液で洗浄した。
その結晶を減圧乾燥することにより、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの白色結晶10.94gを得た。D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの収率はDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルに対して43.8%であった。
【００８７】
実施例３（グリシン添加法）
DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル6.38g(18.0mmol)をMTBE 10.50gに溶かした溶液に、水2.88gとグリシン0.27g(3.6mmol)およびアルカラーゼ2.4L FG（Bacillus licheniformis由来）（ノボザイム社）1.53gを添加し40℃で攪拌した。そこに5%水酸化カリウム水溶液11.0g(9.90mmol)を滴下しながら40℃で18時間攪拌した。この時の反応液のpHの範囲は6.53から8.90であった。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.5%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は99.4%eeであった。
【００８８】
実施例４（酵素加水分解後のＬ体の再利用）
(i) L-N-Boc-ビフェニルアラニンのメチル化
実施例２(タウリン添加法)と同様の方法で得られた、L-N-Boc-ビフェニルアラニン50.0g(0.146mol)に相当するL-N-Boc-ビフェニルアラニンカリウム塩を含んだ水溶液328.54gにトルエン50gと食塩37.5gを加えて、40℃にて20分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層156.23gを得た。その有機層に炭酸水素ナトリウム12.27g(0.146mol)を加えて、40℃で撹拌した。そこに硫酸ジメチル33.15g(0.263mol)を2時間かけて滴下し、40℃で1時間撹拌した。反応液を分析したところ、残っているL-N-Boc-ビフェニルアラニンはLC分析において検出限界以下であった。
その反応液にトリエチルアミン2.95g(0.029mol)を加えて40℃で3時間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層114.04gを得た。そこにトルエン86.72gを加えて、50℃に保温しながら濃縮を行い、57.92gを留去した。そこにトルエン7.39gを加えてトルエン溶液150.23gを得た。得られたトルエン溶液を定量すると、L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの収率はL-N-Boc-ビフェニルアラニンに対して96.2%であった。また、カールフィッシャー水分測定器にて測定を行うと、得られたトルエン溶液の水分含量は204ppmであった。
【００８９】
(ii) L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのラセミ化
L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル50g(0.141mol)を含んだトルエン溶液150.23gにメタノール50gを加えて40℃にて撹拌した。そこに28% ナトリウムメチラートメタノール溶液27.20g(0.141mol)を1時間かけて滴下し、40℃で1時間撹拌した。
反応液を分析すると、L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は0.02%ee、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのLC面百値は89.3%であった。
その反応溶液に酢酸10.16g(0.169mol)を15分間かけて滴下し、40℃で30分間撹拌した。
次に水50gを加えて、40℃で5分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層151.90gを得た。有機層に水45gを炭酸水素ナトリウム2.37g(0.028mol)を加えて、40℃で50分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層147.67gを得た。得られた溶液をLCにて定量すると、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの収率はL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルに対して89.7%であった。
その溶液を54〜56℃に保温しながら濃縮を行い、62.67gを留去した。そこにMTBE75gを加えて、52℃に保温しながら濃縮を行い、74.23gを留去した。そこにMTBE75gを加えて、52℃に保温しながら濃縮を行い、84.71gを留去した。そこにMTBE51.46gを加え127.52gの溶液を得た。得られた溶液をLCにて定量すると、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの収率はL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルに対して89.5%であった。またMTBE溶液中のトルエンの含量は18.5%であった。
【００９０】
(iii) D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの製造
上記で得られたMTBE溶液に対して、実施例２(タウリン添加法)と同じ条件で酵素加水分解を行ったところ、反応液中のD-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.4％、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100％であった。
【００９１】
メチル化およびラセミ化におけるLC分析(HPLC)は以下の条件で行った。
HPLC分析条件
カラム; SUMIPAX A212 ODS (住化分析センター) (φ: 6mm×Ｌ:15cm)
移動層; A液; 25mM リン酸水素ニカリウム水溶液(リン酸にてpHを6.8に調整)
B液; アセトニトリル
溶離条件; B液40%(5分)−20分−80%(5分)グラジエント
カラム温度; 40℃
流速; 1.0mL/分
検出器; UV(254nm)
保持時間; L-N-Boc-ビフェニルアラニン; 7分
L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル; 24分
【００９２】
参考例１
pH7.0の0.1Mリン酸緩衝液10 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 118 mg (0.33 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG (Bacillus licheniformis由来)（ノボザイム社） 0.4 mLを添加し、pH6.82〜7.0で40℃で8.5時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.7%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９３】
参考例２
pH7.0の0.4Mリン酸緩衝液5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 0.59g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 2 mLを添加し、pH6.57〜7.0で40℃で7.5時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は96.7%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９４】
参考例３
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 0.59 g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 2 mLを添加し、40℃で7.5時間撹拌した。その時点で水層のpHは6.78であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.1に調整後、さらに40℃で4時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.8%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９５】
参考例４
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液1.3 mLに水3.7 mL、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル0.59 g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 2 mLを添加し、40℃で7.5時間撹拌した。その時点で水層のpHは6.50であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.0に調整後、さらに40℃で4時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.5%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９６】
参考例５
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 0.59 g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 1 mLを添加し、40℃で2.5時間撹拌した。この時点で水層のpHは6.85であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.03に調整後、さらに40℃で2.5時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.9%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９７】
参考例６
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 0.59 g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 0.06 mLを添加し、40℃で2.5時間撹拌した。この時点で水層のpHは6.90であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.0に調整後、さらに40℃で2.5時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.8%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９８】
参考例７
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液8.5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 1.0 g (2.81 mmol)をトルエン2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 0.1 mLを添加し、40℃で3時間撹拌した。この時点で水層のpHは7.43であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.1に調整後、さらに40℃で3.5時間撹拌した。この時点で水層のpHは7.18であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.0に調整後、さらに40℃で3時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は96.9%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９９】
参考例８
水65 mLにリン酸水素二ナトリウム2.5 g (0.0176 mol)およびリン酸二水素ナトリウム二水和物1.8 g(0.0115 mol)を溶かし、20%水酸化ナトリウム水溶液1.86 mLを加えてpHを8.12に調整した。
この水溶液にDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのMTBE溶液45.4 g [DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 16.6 g (0.0457 mol)を含む]を加え、アルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 2.5 mLを加えて、20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを7.44〜8.45に保ちながら40℃で10時間撹拌した。
反応液を分液し、得られた水層をトルエン30 mLで抽出した。有機層を合わせ、3%炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのトルエン溶液(69.29 g)を得た。
HPLCで分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの含量は8.36 gであり、光学純度は99.9%eeであった。DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルからの収率は50%であった。
水層中のL-N-Boc-ビフェニルアラニンの含量は7.57 gであり、光学純度は100.0%eeであった。DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルからの収率は47.5%であった。
D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル
1H-NMR (CDCl3); 1.42 (9H, s), 3.09 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.16 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.74 (3H, s), 4.55-4.70 (1H, m), 4.90-5.08 (1H, m), 7.20 (2H, d, J=8 Hz), 7.33 (1H, t, J=8 Hz), 7.43 (2H, t, J=8 Hz), 7.52 (2H, d, J=8 Hz), 7.57 (2H, d, J=8 Hz).
L-N-Boc-ビフェニルアラニン
1H-NMR(CDCl3)；1.48 (9H, s)、3.12 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.24 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 4.55-4.70 (1H, m), 4.90-4.99 (1H, m), 7.26 (2H, d, J=8 Hz), 7.33 (1H, t, J=8 Hz), 7.42 (2H, t, J=8 Hz), 7.53 (2H, d, J=8 Hz), 7.56 (2H, d, J=8 Hz).
【０１００】
各実施例において、Ｄ体およびＬ体の絶対配置は、前述のキラルカラムを使用するHPLCにおける標準品との保持時間の比較により確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の製造方法によれば、光学活性なビフェニルアラニン構造を有する化合物を、安価な原料から、高い光学純度で簡便な操作により製造することができるので、当該製造方法は工業的に非常に有利な製造方法である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬等の中間体として有用な光学活性なビフェニルアラニン構造を有する化合物の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
光学活性なビフェニルアラニン構造を有する化合物は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤等の医薬の中間体として有用である（特許文献１、２参照）。
【０００３】
光学活性ビフェニルアラニンの製造方法としては、（１）Ｄ−Ｂｏｃ−チロシンメチルエステルのトリフレート化、スズキカップリング、エステルの加水分解による方法（特許文献３参照）、（２）不斉水素化による光学活性Ｂｏｃ−ビフェニルアラニンの合成（非特許文献１および特許文献２参照）が知られている。しかしながら、（１）の方法は、トリフレート化の試剤が高価である、スズキカップリングで使用する触媒のパラジウムが高価である、生成物からの残留パラジウムの除去が困難である、Ｄ−ビフェニルアラニンを得ようとした場合、原料であるＤ−チロシンが高価である点で、工業的に有利な方法とはいえない。また、（２）の方法は不斉水素化で使用する触媒および不斉源が高価という問題があった。
【０００４】
一方、光学活性なアミノ酸誘導体を製造する方法として、Ｎ−（２，６−ジメチルフェニル）アラニンエステルのラセミ体を、酵素を用いて不斉加水分解する方法が知られている（特許文献４参照）。その他にも、酵素を用いる不斉加水分解により、光学活性なアミノ酸または光学活性なフェニルアラニン誘導体を製造することが知られている（非特許文献２〜５、特許文献５参照）。
【０００５】
また、ラセミ型Ｎ−置換−ＤＬ−アミノ酸エステルをｐＨコントロール試薬としての弱塩基の存在下で、プロテアーゼを用いて加水分解して、Ｎ−置換−Ｌ−アミノ酸およびＮ−置換−Ｄ−アミノ酸エステルを得ることが知られている（特許文献６参照）。
【０００６】
【特許文献１】特開平６−２２８１８７号公報
【特許文献２】特開２００３−２６１５２２号公報
【特許文献３】米国特許第５２１７９９６号明細書
【特許文献４】国際公開第ＷＯ２００４／０５５１９５号パンフレット
【特許文献５】スペイン特許出願公開第５４７９１３号
【特許文献６】特開平９−２０６０８９号公報
【非特許文献１】キラリティ(Chirality)、１９９６年、第８巻、第２号、ｐ．１７３−１８８
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・ケミカル・テクノロジー・アンド・バイオテクノロジー(J. Chem. Technol. Biotechnol.)、１９９４年、第５９巻、第１号、ｐ．６１−６５
【非特許文献３】アイティーイー・レターズ・オン・バッテリーズ、ニュー・テクノロジーズ・アンド・メディシン(ITE Letters on Batteries, New Technologies & Medicine)、アイティーイー−ホーワ・インコーポレイティッド(ITE-Hohwa Inc.)、２００４年、第５巻、第４号、ｐ．３７７−３８０、
【非特許文献４】エナンチオマー(Enantiomer)、２００２年、第７巻、第１号、ｐ１−３
【非特許文献５】バイオテクノロジー・レターズ(Biotechnol. Lett.)、１９９１年、第１３巻、第５号、ｐ．３１７−３２２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、光学活性なビフェニルアラニン構造を有する化合物を、高い光学純度で、安価で、簡便な操作により製造することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の課題を解決するために、鋭意検討した結果、ビフェニルアラニンエステルを、特定の条件下で、特定の酵素を用いて加水分解することにより、光学活性ビフェニルアラニンまたはその塩およびそのエステルを高い光学純度で、安価で、簡便な操作により製造することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は以下の通りである。
【０００９】
［１］式（１）
【００１０】
【化１】
【００１１】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２はアミノ基の保護基を示し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基またはニトロ基を示す。）
で表されるビフェニルアラニンエステル化合物（以下、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）ともいう）を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した式（２）
【００１２】
【化２】
【００１３】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物（以下、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）ともいう）またはその塩と式（３）
【００１４】
【化３】
【００１５】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（以下、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）ともいう）を分離することを特徴とする、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩および光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）の製造方法。
［２］アルカリがアルカリ金属水酸化物である、上記［１］記載の方法。
［３］アミノ酸がグリシンである、上記［１］記載の方法。
［４］アミノスルホン酸がタウリンである、上記［１］記載の方法。
［５］加水分解がアルカリ金属水酸化物とアミノ酸の存在下で行われる、上記［１］記載の方法。
［６］加水分解がアルカリ金属水酸化物とグリシンの存在下で行われる、上記［１］記載の方法。
［７］加水分解がアルカリ金属水酸化物とアミノスルホン酸の存在下で行われる、上記［１］記載の方法。
［８］加水分解がアルカリ金属水酸化物とタウリンの存在下で行われる、上記［１］記載の方法。
［９］プロテアーゼがBacillus licheniformis由来のものである、上記［１］記載の方法。
［１０］Ｒ１がアルキル基である、上記［１］記載の方法。
［１１］Ｒ１がメチルまたはエチルである、上記［１］記載の方法。
［１２］Ｒ２がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである、上記［１］記載の方法。
［１３］Ｒ３およびＲ４が水素原子である、上記［１］記載の方法。
［１４］加水分解が、ｐＨを６．０〜１３の範囲に維持しながら行われる、上記［１］記載の方法。
［１５］加水分解が、ｐＨを６．０〜１０の範囲に維持しながら行われる、上記［１］記載の方法。
［１６］加水分解が、有機溶媒と水の混合溶媒中で行われる、上記［１］記載の方法。
［１７］有機溶媒が、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルおよびトルエンから選ばれる少なくとも１種である、上記［１６］記載の方法。
［１８］有機溶媒がｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルである、上記［１６］記載の方法。
［１９］加水分解が３０〜６０℃で行われる、上記［１］記載の方法。
［２０］加水分解が３５〜５５℃で行われる、上記［１］記載の方法。
［２１］光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩をエステル化して、式（２’）
【００１６】
【化４】
【００１７】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（以下、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）ともいう）を得る工程；
光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）をラセミ化して、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を得る工程；
を包含することを特徴とする、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）の製造方法。
［２２］ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩と未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を分離する工程；
光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩をエステル化して、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）を得る工程；
光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）をラセミ化して、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を得る工程；
を包含する、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）の回収方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の製造方法によれば、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリ（以下、苛性アルカリともいう）の存在下で、(ii)苛性アルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)苛性アルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解することにより、Ｌ体が優先的に加水分解されるので、Ｌ体の光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩とＤ体の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を高い光学純度で、簡便な操作により製造することができる。特にBacillus licheniformis由来のプロテアーゼを使用することが、エナンチオ選択性に優れる点で好ましい。
本発明の製造方法は、安価な原料から製造することのできるビフェニルアラニンエステル化合物（１）を使用するため、工業的に有利な製造方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書において使用する置換基の定義を以下に説明する。
「アルキル基」としては、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシル等が挙げられ、好ましくはメチルまたはエチルである。
【００２０】
「アルケニル基」としては、炭素数２〜６の直鎖または分枝のアルケニル基、例えば、ビニル、アリル、１−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル等が挙げられ、好ましくは、ビニルまたはアリルである。
【００２１】
「シクロアルキル基」としては、炭素数３〜８のシクロアルキル基、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられ、好ましくはシクロペンチルまたはシクロヘキシルである。
【００２２】
「ハロゲン原子」としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、好ましくはフッ素原子、塩素原子または臭素原子である。
【００２３】
「ハロアルキル基」とは、上記定義の「ハロゲン原子」で置換された上記定義の「アルキル基」である。当該ハロゲン原子の置換数は特に限定されないが、１〜３個が好ましい。「ハロアルキル基」としては、例えば、クロロメチル、ブロモメチル、フルオロメチル、ジクロロメチル、ジブロモメチル、ジフルオロメチル、トリクロロメチル、トリブロモメチル、トリフルオロメチル、２，２−ジクロロエチル、２，２，２−トリクロロエチル等が挙げられ、好ましくはトリフルオロメチルである。
【００２４】
「アルコキシ基」としては、炭素数１〜６の直鎖または分枝のアルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等が挙げられ、好ましくはメトキシまたはエトキシである。
【００２５】
「置換基を有していてもよいアリール基」の「アリール基」としては、炭素数６〜１４のアリール基、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル等が挙げられ、好ましくはフェニルである。
当該アリール基は置換可能な位置に置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、ハロゲン原子（上記で定義したものと同じものが例示される）、アルキル基（上記で定義したものと同じものが例示される）、ハロアルキル基（上記で定義したものと同じものが例示される）、ヒドロキシ基、アルコキシ基（上記で定義したものと同じものが例示される）、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。当該置換基の数は特に限定されないが、１〜３個が好ましい。置換基の数が２個以上の場合、それらの置換基は同一または異なっていてもよい。
【００２６】
「置換基を有していてもよいアラルキル基」の「アラルキル基」は、上記定義の「アリール基」で置換された上記定義の「アルキル基」である。当該アリール基の置換数は特に限定されないが、１〜３個が好ましい。「アラルキル基」としては、例えば、ベンジル、フェネチル、１−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、２−フェニルプロピル、３−フェニルプロピル、１−ナフチルメチル、２−ナフチルメチル、ベンズヒドリル、トリチル等が挙げられ、好ましくはベンジルである。
当該アラルキル基は置換可能な位置に置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、ハロゲン原子（上記で定義したものと同じものが例示される）、アルキル基（上記で定義したものと同じものが例示される）、ハロアルキル基（上記で定義したものと同じものが例示される）、ヒドロキシ基、アルコキシ基（上記で定義したものと同じものが例示される）、シアノ基、ニトロ基等が挙げられる。当該置換基の数は特に限定されないが、１〜３個が好ましい。置換基の数が２個以上の場合、それらの置換基は同一または異なっていてもよい。
【００２７】
Ｒ２で示される「アミノ基の保護基」としては、アミノ基の保護基として用いられる自体公知の保護基を特に制限なく使用することができる。そのような保護基としては、−ＣＯ２Ｒ５（式中、Ｒ５はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいアラルキル基または９−フルオレニルメチル基を示す。）、−ＣＯＲ６（式中、Ｒ６は水素原子、アルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示す。）、置換基を有していてもよいアラルキル基等が挙げられる。「アミノ基の保護基」として、具体的には、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル、ホルミル、アセチル、ベンゾイル、ベンジル、ベンズヒドリル、トリチル等が挙げられる。
【００２８】
Ｒ１は、好ましくはアルキル基であり、より好ましくはメチルまたはエチルである。
Ｒ２は、好ましくは−ＣＯ２Ｒ５（式中、Ｒ５は前記と同義である。）であり、より好ましくはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである。
Ｒ３およびＲ４は、好ましくは共に水素原子である。
【００２９】
本発明の製造方法において用いられる原料である、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）は、例えば、次の方法で製造することができる。
【００３０】
【化５】
【００３１】
（式中、各記号は前記と同義である。）
【００３２】
工程１
化合物（４）とヒダントイン（５）を、塩基の存在下で反応させることにより、化合物（６）を得ることができる。
ヒダントイン（５）の使用量は、化合物（４）１モルに対して、通常１〜３モル、好ましくは１．０５〜２モルである。
塩基としては、酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウム、ピペリジン、トリエチルアミン等が挙げられる。
塩基の使用量は、化合物（４）１モルに対して、通常０．１〜１０モル、好ましくは０．５〜２モルである。
反応溶媒としては、酢酸、無水酢酸、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド等が挙げられる。
反応温度は、通常３０〜２００℃であり、好ましくは１００〜２００℃である。反応時間は、通常１〜２４時間であり、好ましくは３〜１０時間である。
【００３３】
工程２
化合物（６）を還元することにより、化合物（７）を得ることができる。
還元は、好ましくは、接触水素添加により行うことができる。
接触水素添加で使用する触媒としては、例えば、パラジウム−炭素、水酸化パラジウム−炭素、白金−炭素、ロジウム−炭素、ルテニウム−炭素、展開ニッケル等が挙げられる。
触媒の使用量は、化合物（６）１ｇに対して、金属量として、Ｐｄ等の貴金属の場合は、通常０．０００５〜０．０５ｇ、好ましくは０．００５〜０．０２ｇであり、展開ニッケルの場合は、通常０．１〜２ｇ、好ましくは０．２〜１ｇである。
反応溶媒としては、テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン等のエーテル類；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類；酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチル等のエステル類；酢酸、プロピオン酸等の有機酸；水；これらの混合溶媒が挙げられる。
接触水素添加は、常圧または加圧条件下で行うことができる。
反応温度は、通常２０〜１００℃であり、好ましくは４０〜７０℃である。反応時間は、通常１〜２４時間であり、好ましくは３〜１０時間である。
【００３４】
工程３
化合物（７）を加水分解することにより、化合物（８）を得ることができる。
加水分解は、通常、溶媒中、塩基で処理することにより行われる。
塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化バリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム等が挙げられる。
塩基の使用量は、化合物（７）１モルに対して、通常２〜１０モル、好ましくは３〜８モルである。
反応溶媒としては、メタノール、エタノール、エチレングリコール等のアルコール類；テトラヒドロフラン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、１，２−ジメトキシエタン、１，４−ジオキサン等のエーテル類；水；これらの混合溶媒等が挙げられる。
反応温度は、通常８０〜２００℃であり、好ましくは１００〜１７０℃である。反応時間は、通常１〜２４時間であり、好ましくは３〜１０時間である。
【００３５】
工程４
化合物（８）を、アミノ基の保護およびカルボキシル基のエステル化反応に供することにより、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）を得ることができる。アミノ基の保護とカルボキシル基のエステル化は常法に従って行うことができる。アミノ基の保護とカルボキシル基のエステル化の順序は特に限定されず、任意の順序で行うことができる。
【００３６】
ビフェニルアラニンエステル化合物（１）には、α位の炭素原子を不斉中心とする２種の光学異性体（Ｌ体とＤ体）が存在するが、本発明の方法に用いられるビフェニルアラニンエステル化合物（１）は、これらの光学異性体を等量含むラセミ体であっても、一方の光学異性体を過剰に（任意の割合で）含む混合物であってもよい。好ましくはラセミ体である。
【００３７】
このようにして得られたビフェニルアラニンエステル化合物（１）を、本発明では、(i)苛性アルカリの存在下で、(ii)苛性アルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)苛性アルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解する。当該プロテアーゼを用いて加水分解すると、Ｌ体が優先的に加水分解される。
【００３８】
Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼとしては、エナンチオ選択性に優れることから、Bacillus licheniformis由来のプロテアーゼが好ましい。Bacillus licheniformis由来のプロテアーゼの具体例としては、サブチリシン（subtilisin)を含有するBacillus licheniformis由来のプロテアーゼが挙げられ、好ましくはアルカラーゼ（ノボザイム社)、特に好ましくはアルカラーゼ2.4L（ノボザイム社)である。
【００３９】
上記プロテアーゼの純度あるいは形態については特に制限されるものではなく、精製酵素、粗酵素、微生物培養物、菌体、それらの処理物等の種々の形態で用いることができる。ここで処理物とは、例えば、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体抽出物等をいう。さらに、上記のような種々の純度あるいは形態の酵素を例えば、シリカゲルやセラミックス等の無機担体、セルロース、イオン交換樹脂等に固定化したものを使用してもよい。
【００４０】
上記プロテアーゼの使用量は、特に限定されないが、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）１ｇに対して、精製酵素に換算して、通常０．００１〜０．５ｇ、好ましくは０．００１〜０．１ｇである。
【００４１】
上記プロテアーゼによる加水分解は、プロテアーゼの種類にもよるが、好ましくはｐＨを６．０〜１３、より好ましくはｐＨ６．０〜１０、さらに好ましくは６．０〜９．５に維持しながら行われる。上記のｐＨ範囲で加水分解を行うことにより、光学純度の高い生成物を得ることができる。
【００４２】
また、上記加水分解は、通常、水中、或いは有機溶媒と水の混合溶媒中で行われ、光学純度の高い生成物が得られることから、有機溶媒と水の混合溶媒中で行われることが好ましい。
【００４３】
ｐＨを上記範囲とする方法としては、例えば、苛性アルカリ水溶液；リン酸緩衝液（リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム）、酢酸緩衝液（酢酸ナトリウム、酢酸カリウム）等の緩衝液；緩衝液存在下での苛性アルカリ水溶液；アミノ酸存在下での苛性アルカリ水溶液；アミノスルホン酸存在下での苛性アルカリ水溶液；等が挙げられる。アルカリ水溶液や緩衝液は溶媒も兼ねる。
【００４４】
本発明において、アミノ酸とは、１分子中にアミノ基（置換アミノ基や環状構造となった置換アミノ基も含む）とカルボキシル基の両方を有する有機化合物（アミノ基の水素原子が側鎖部分と環状構造となったイミノ酸も含む）であり、α−アミノ酸だけでなく、β−アミノ酸、γ−アミノ酸、δ−アミノ酸等も含まれる。α−アミノ酸の具体例としては、グリシン、アラニン、α−アミノ酪酸、ロイシン、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、システイン、スレオニン、セリン、プロリン、ヒドロキシプロリン、アスパラギン、グルタミン等の中性アミノ酸；アルパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸；リジン、トリプトファン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン、ヒドロキシリジン等の塩基性アミノ酸等が挙げられる。β−アミノ酸の具体例としては、β−アラニン、β−アミノ酪酸等が挙げられる。γ−アミノ酸の具体例としては、γ−アミノ酪酸等が挙げられる。δ−アミノ酸の具体例としては、５−アミノ吉草酸等が挙げられる。
【００４５】
本発明において、アミノスルホン酸とは、上記アミノ酸におけるカルボキシル基の代わりにスルホ基を有する有機化合物であり、具体例としては、タウリン、Ｎ−メチルタウリン、２−（４−モルホリニル）エタンスルホン酸等が挙げられる。
【００４６】
本発明では、ｐＨを上記範囲とする方法として、経済性および環境に好ましくない廃棄物削減の点から、(i)苛性アルカリ水溶液を使用する方法、(ii)アミノ酸存在下で苛性アルカリ水溶液を使用する方法、または(iii)アミノスルホン酸存在下で苛性アルカリ水溶液を使用する方法を採用する。なお、(ii)および(iii)の方法では、アミノ酸またはアミノスルホン酸が緩衝剤の役割を果たす。本発明では、(ii)および(iii)の方法が特に好ましい。
【００４７】
上記の方法において、苛性アルカリは、好ましくはアルカリ金属水酸化物であり、特に好ましくは水酸化カリウムまたは水酸化ナトリウムである。また、アミノ酸は、好ましくはグリシンであり、アミノスルホン酸は、好ましくはタウリンである。
【００４８】
苛性アルカリ水溶液の濃度は、特に限定されないが通常２〜３０％、好ましくは３〜１５％、より好ましくは３〜１３％である。アルカリ水溶液の濃度を上記の範囲とすることにより、より容易に光学純度の高い生成物が得られる。
【００４９】
緩衝液の濃度は、通常０．０５〜０．８Ｍ、好ましくは０．１〜０．８Ｍ、より好ましくは０．１〜０．５Ｍである。緩衝液の濃度を上記の範囲とすることにより、光学純度の高い生成物が得られる。
【００５０】
緩衝液の使用量は、濃度にもよるがビフェニルアラニンエステル（１）１ｇに対して、通常２〜１００ｍＬ、好ましくは２〜１０ｍＬである。緩衝液の使用量がこの範囲外であると、加水分解で生成した塩が析出したり、反応のコントロールが困難になったり、また溶媒の増加による生産性が低下する虞がある。
【００５１】
苛性アルカリ水溶液の使用量は、ビフェニルアラニンエステル（１）に対して、通常０．４５〜０．７当量、好ましくは０．４８〜０．６５当量である。アルカリの使用量がこの範囲外であると、適切なｐＨ範囲の維持が困難となり、反応が停止したり、アルカリによる自然加水分解が進行する虞がある。
【００５２】
アミノ酸またはアミノスルホン酸の使用量は、ビフェニルアラニンエステル（１）１モルに対して、通常０．０５〜１．０モル、好ましくは０．１〜０．５モル、より好ましくは０．１〜０．３モルである。アミノ酸またはアミノスルホン酸の使用量を上記の範囲とすることにより、酵素反応に必要なｐＨ範囲の維持が容易になり、円滑に反応を進行させることが可能になる。
【００５３】
有機溶媒としては、疎水性有機溶媒、親水性有機溶媒が挙げられる。
疎水性有機溶媒としては、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類等が挙げられる。親水性有機溶媒としては、テトラヒドロフラン等のエーテル類；メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類；アセトン等のケトン類；アセトニトリル等のニトリル類等が挙げられる。これらの有機溶媒は単独でまたは２種以上を組み合わせて用いてもよい。
有機溶媒は、好ましくはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルまたはトルエンであり、特に好ましくはｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルである。
【００５４】
有機溶媒の使用量は、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）１ｇに対して、通常１〜５０ｍＬ、好ましくは１〜５ｍＬである。有機溶媒の使用量がこの範囲外であると、原料と生成物が析出して反応速度が低下したり、生産性が低下する虞がある。
【００５５】
加水分解は、ビフェニルアラニンエステル化合物（１）、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼ、苛性アルカリおよび溶媒、必要によりアミノ酸またはアミノスルホン酸を混合することにより行われる。
これらの添加順序は特に限定されず、例えば、
(i)有機溶媒に溶解したビフェニルアラニンエステル化合物（１）を苛性アルカリ水溶液または緩衝液に添加し、次いで上記プロテアーゼを添加する、
(ii)有機溶媒に溶解したビフェニルアラニンエステル化合物（１）に苛性アルカリ水溶液または緩衝液を添加し、次いで上記プロテアーゼを添加する、
(iii)有機溶媒に溶解したビフェニルアラニンエステル化合物（１）に上記プロテアーゼ（必要により水も）を添加し、次いで苛性アルカリを添加（好ましくは滴下）する、
(iv)有機溶媒に溶解したビフェニルアラニンエステル化合物（１）に上記プロテアーゼおよびアミノ酸またはアミノスルホン酸（必要により水も）を添加し、次いで苛性アルカリ水溶液を添加（好ましくは滴下）する、
等の手法が挙げられる。
【００５６】
上記プロテアーゼは、必要により反応中に追加してもよい。また、反応中に反応液のｐＨが上記範囲より低下した場合には、適当なｐＨ調整剤を用いて反応液のｐＨを上記範囲に維持する。
ｐＨ調整剤としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム等の苛性アルカリまたはその水溶液が挙げられる。
【００５７】
加水分解の反応温度は、好ましくは３０〜６０℃、より好ましくは３５〜５５℃、特に好ましくは４０〜４５℃である。反応温度が上記範囲外であると、酵素の安定性が低下したり、反応速度が低下する虞がある。
加水分解の反応時間は、通常３〜２４時間、好ましくは４〜１５時間である。
【００５８】
反応後の反応混合物を水層と有機層に分液することにより、加水分解により生成した光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）（Ｌ体）の塩と未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）（Ｄ体）を分離することができる。このとき、水層に光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩が、有機層に光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）が含有される。
加水分解において、疎水性有機溶媒と水の混合溶媒を用いた場合は、得られた反応混合物をそのまま分液してもよい。
加水分解において、疎水性有機溶媒を用いなかった場合、あるいは疎水性有機溶媒および／または水の使用量が少ないためそのままでは分液できない場合は、適当な量の疎水性有機溶媒および／または水を添加した後に分液すればよい。
疎水性有機溶媒としては、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、ジイソプロピルエーテル等のエーテル類；トルエン、ヘキサン、シクロヘキサン、ヘプタン等の炭化水素類；ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；酢酸エチル、酢酸メチル、酢酸ブチル等のエステル類等が挙げられる。
分液操作時には、水層のｐＨを通常６．５〜１２、好ましくは７．５〜１１に調整する。
【００５９】
得られた水層から、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩は以下の方法により得ることができる。
１）水層から溶媒を留去することにより、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩（アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等）の粗生成物を得ることができる。
【００６０】
２）水層に無機塩と有機溶媒を加えて抽出し、有機溶媒を留去することにより、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩を単離することができる。
ここで、無機塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム等が挙げられ、経済性および光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩の溶解度の観点から、塩化カリウムもしくは塩化ナトリウムが好ましい。無機塩の使用量は、抽出率等の観点から、水層中に含まれる光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩１００ｇに対して、好ましくは３０ｇ〜１００ｇである。
有機溶媒としては、トルエン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、酢酸エチル等の溶媒が挙げられ、中でも、トルエン、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルが好ましい。
有機溶媒の使用量は、水層中に含まれる光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩１００ｇに対して、通常６０ｇ〜１３０ｇ、好ましくは８０ｇ〜１２０ｇである。
なお、抽出が十分でない場合は、酸を加えてｐＨを中性ないし弱酸性に調整してもよい。
抽出は、通常１０〜５０℃で行う。
【００６１】
３）水層を酸性（通常ｐＨ１〜７、好ましくはｐＨ１〜４）にした後、有機溶媒で抽出し、有機溶媒を留去することにより、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）を単離することができる。有機溶媒としては、上記の抽出で使用する有機溶媒と同様のものが挙げられる。
【００６２】
得られた光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩は、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の一般的な方法により精製することができる。なお、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の塩は、必要に応じて、酸により、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）に変換してもよい。
【００６３】
一方、有機層から溶媒を留去することにより、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を単離することができる。さらに分液操作で分離した水層を有機溶媒で抽出することにより、水層中の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を回収することができる。この抽出操作における水層のｐＨは、通常６．５〜１２、好ましくは７．５〜１１である。有機溶媒としては、前記の疎水性有機溶媒として例示したものを使用することができる。
得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）は、再結晶、カラムクロマトグラフィー等の一般的な方法により精製することができる。
【００６４】
単離した光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を、常法に従って加水分解することにより、Ｒ１が水素原子である化合物（光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）の光学異性体（Ｄ体））またはその塩を製造することができる。
【００６５】
また、単離した光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩および光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）のアミノ基の保護基を、常法に従って脱保護することにより、Ｒ２が水素原子である化合物をそれぞれ製造することができる。
【００６６】
本発明の方法により製造される光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩および光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）は、中性エンドペプチダーゼ阻害剤等の医薬を製造するための中間体として有用である。例えば、特開平６−２２８１８７号公報に記載の方法を用いて、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩または光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）から、当該公報に記載されたＮ−ホスホノメチル−ビアリール置換ジペプチド誘導体を製造することができる。
【００６７】
光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）が所望の化合物である場合は、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩を、エステル化して光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）を得、次いでラセミ化してビフェニルアラニン化合物（１）に変換することにより、上記の加水分解に再利用することができる。以下、その方法を説明する。
【００６８】
【化６】
【００６９】
（式中、各記号は前記と同義である。）
【００７０】
エステル化
光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩をエステル化して、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）を得る。
このエステル化では、上記加水分解終了後の抽出にて得られた光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩の有機溶媒の溶液が、そのまま使用できる。
エステル化は常法に従って行うことができ、例えば、メタノール、エタノール等のアルコール類と酸による方法；硫酸ジメチル、硫酸ジエチル等の硫酸エステルと塩基による方法；Ｒ１ＯＨとＤＣＣ等の縮合剤による方法；ヨウ化メチル、ブロモエタン、塩化ベンジル等のアルキルハライドと塩基による方法；等が挙げられ、中でも、副生物および簡便性の観点から、硫酸エステルと塩基による方法が好ましい。
【００７１】
以下、塩基と硫酸ジメチルによる方法について説明する。
塩基としては、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸カリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、ジイソプロピルエチルアミン、２，６−ジメチルピリジン、トリエチルアミン、ピリジン等が挙げられ、中でも、炭酸水素ナトリウムが好ましい。
塩基の使用量は、溶液中の光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩１モルに対して、通常０．３〜１．２倍モル量である。
硫酸エステルとしては、反応性および後処理の観点から、硫酸ジメチルが好ましい。
硫酸エステルの使用量は、溶液中の光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩に対して、通常１．２〜２．５倍モル量である、好ましくは１．６〜２．０倍モル量である。
エステル化の手順としては、反応性の観点から、塩基と光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩を含む溶液に、硫酸エステルを滴下することが好ましい。
エステル化の温度は、通常３０〜５０℃である。反応時間は、試薬量、反応温度等にもよるが、通常１〜１０時間である。反応の終了はＨＰＬＣ分析により確認できる。
【００７２】
反応終了後、トリエチルアミン等のアミンを加えて、３０〜５０℃の温度で２〜５時間攪拌することにより、残存する硫酸エステルを分解させる。アミンの使用量は、使用した硫酸エステルに対して１０モル％程度でよい。
次いで、反応液を分液し、有機層を脱水する。脱水は、無水硫酸マグネシウム、無水硫酸ナトリウム、モレキュラーシーブス等の脱水剤を用いてもよいが、操作性の観点から、水と共沸する溶媒（例えば、トルエン等）で共沸脱水する方法が好ましい。
共沸する溶媒の使用量は、十分に脱水できる量であればよいが、溶液量に対して、通常５０〜１００重量％である。
次のラセミ化には、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）溶液中の水分量が５００ｐｐｍ以下であることが好ましく、従って、脱水を十分に行うことが好ましい。
このようにして得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）の溶液は、そのまま次のラセミ化に使用できる。あるいは一般的な方法により、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）を単離してから使用してもよい。
【００７３】
ラセミ化
エステル化により得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）をラセミ化して、ビフェニルアラニン化合物（１）に変換する。
ラセミ化は、通常、溶媒中で塩基を用いて行われる。
溶媒として、エステル化で得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）の溶液に、さらに、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール類を加えることが、ラセミ化促進の観点から好ましい。
アルコール類の使用量は、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）の重量に対して、通常８０〜１２０％重量である。
塩基としては、ナトリウムメトキサイド、ナトリウムエトキサイド、カリウムtert−ブトキサイド等のアルカリ金属アルコラート；水素化ナトリウム、水素化カリウム等のアルカリ金属水素化物等が挙げられ、中でも、取り扱いの観点から、アルカリ金属アルコラートが好ましく、経済性の観点から、ナトリウムメトキサイドが特に好ましい。
塩基の使用量は、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（２’）に対して、８０〜１２０モル％である。
ラセミ化の温度は、通常３０〜５０℃、好ましくは３５〜４５℃である。反応時間は、試薬の使用量、温度にもよるが、通常１０分〜６時間である。ラセミ化反応の終了はＨＰＬＣで確認することができる。
【００７４】
ラセミ化終了後、反応液に酢酸等の酸を加えて、エステルの分解を抑制することが好ましい。ここで、酸の使用量は、ラセミ化に使用した塩基に対して、通常１．１〜１．３倍モル量である。
ラセミ化終了後の後処理は、常法に従って行われる。
【００７５】
このようにして得られたビフェニルアラニンエステル化合物（１）の溶液は、酵素による加水分解にそのまま供してもよいし、濃縮後、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル等の別の有機溶媒に溶解し、加水分解に供してもよい。
【００７６】
なお、光学活性ビフェニルアラニン化合物（２）またはその塩が所望の化合物である場合は、光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）を、ラセミ化してビフェニルアラニン化合物（１）に変換することにより、上記の加水分解に再利用することができる。
このラセミ化は、加水分解終了後の抽出にて得られた光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物（３）の有機溶媒の溶液を用いて、上記のラセミ化方法と同様の方法により行うことができる。
【実施例】
【００７７】
以下に製造例、実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００７８】
以下の実施例においてpH7.0のリン酸緩衝液およびpH8.0のリン酸緩衝液は次の方法で調製したものを使用した。
pH7.0のリン酸緩衝液
リン酸水素二カリウム17.25 g (0.099 mol)を水900 mLに溶解し、リン酸でpH7.0に調整し、水を加えて全量1 Lにした水溶液
pH8.0のリン酸緩衝液
リン酸水素二ナトリウム7.38 ｇ (0.052 mol)およびリン酸二水素ナトリウム二水和物5.46 g (0.035 mol)を水195 mLに溶解し、20%水酸化ナトリウム水溶液でpH8.0に調整した水溶液
【００７９】
光学活性体の光学純度（エナンチオマー過剰率）は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析により決定した。
ＨＰＬＣ分析条件
カラム； キラルパック AD-RH（ダイセル化学工業株式会社）(4.5 mmφ x 15 cm、5mm)
移動層； A液； 0.1%リン酸水溶液
B液； アセトニトリル
溶離条件； B液40%(15分)−30分−80%(0分)グラジエント
カラム温度； 40℃
流速； 1.0 mL/分
検出器； UV(254 nm)
保持時間； L-N-Boc-ビフェニルアラニン； 10分
D-N-Boc-ビフェニルアラニン； 13分
L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル； 27分
D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル； 30分
【００８０】
【化７】
【００８１】
製造例１
DL-ビフェニルアラニン(12)
4-ビフェニルアルデヒド(9)(100.0 g, 0.549 mol)、ヒダントイン(82.4 g, 0.823 mol)および酢酸アンモニウム（63.5 g, 0.824 mol)を酢酸(360 mL)中で5時間加熱還流した。水(360 mL)を加えた後、室温に冷却し、結晶を濾取し、イソプロパノール-水(1:1, 400 mL)で洗浄することによりヒダントイン体(10)(143.14 g, 収率98.7%)を得た。
【００８２】
ヒダントイン体(10)(60.2 g)、テトラヒドロフラン(THF)(540 mL)および水（60 mL)の混合物に5%パラジウム−炭素(50%含水、2.7 g)を加え、0.5 MPaの水素雰囲気下、60℃で3時間撹拌した。触媒を濾過により除いた後、濾液を濃縮して還元体(11)(60.63 g、収率100%）を得た。
【００８３】
還元体(11)(59.7 g, 0.224 mol)、エチレングリコール(300 mL)および水(10 mL)の混合物に水酸化ナトリウム(36.65 g)を加え、130-140℃で5時間撹拌した。室温に冷却後、水(130 mL)を加え、濃塩酸(85 g)と水(99 g)からなる塩酸水溶液を加え、混合物のpHを6.9とした。得られた結晶を濾取し、水(300 mL)で洗浄後、メタノール(300 mL)で洗浄し、乾燥して、DL-ビフェニルアラニン(12)(53.25 g, 収率98.4%）を得た。
【００８４】
製造例２
DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル(13)
DL-ビフェニルアラニン(12)(20.0 g, 0.0829 mol)を10%水酸化ナトリウム(116 g, 0.29mol)水溶液に加えた。THF(50 mL)を加えた後、30℃でジ-tert-ブチルジカーボネート(23.5 g, 0.108 mol)のTHF（20 mL)溶液を1時間かけて滴下した。さらに、テトラブチルアンモニウムブロミド(0.20 g, 0.62 mmol)を加えた後、30℃でジメチル硫酸(12.5 g, 0.099 mol)を滴下した。室温で16時間撹拌後、ジメチル硫酸(5.4 g, 0.0428 mol)を加え、35℃で4.5時間撹拌し、さらにジメチル硫酸(2.93 g, 0.0232 mol)を加え、35℃で2.5時間撹拌した。
tert-ブチルメチルエーテル(MTBE) (40 mL)および水(100 mL)を加えた後、分液して水層を除去し、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのMTBE溶液104.1 gを得た。
HPLCで定量した結果、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの含量は29.4 gであり、DL-ビフェニルアラニンからの収率は99.8%であった。
こうして得られたDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのMTBE溶液のうち78.1 gを濃縮乾固し、残渣をイソプロパノール(9 mL)とヘプタン(80 mL)から再結晶して、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル(19.1 g)を無色結晶として得た（再結晶収率86.6%)。
1H-NMR (CDCl3); 1.42 (9H, s), 3.09 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.16 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.74 (3H, s), 4.55-4.70 (1H, m), 4.90-5.08 (1H, m), 7.20 (2H, d, J=8 Hz), 7.33 (1H, t, J=8 Hz), 7.43 (2H, t, J=8 Hz), 7.52 (2H, d, J=8 Hz), 7.57 (2H, d, J=8 Hz).
【００８５】
実施例１（水酸化カリウム滴下法）
DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル221.08g(0.622mol)をMTBE 467.76gに溶かした溶液に、水99.49gとアルカラーゼ2.4L FG（Bacillus licheniformis由来）（ノボザイム社）55.26gを添加し40℃で攪拌した。そこに5%水酸化カリウム水溶液369.8g(0.317mol)を滴下しながら、40℃で22時間攪拌した。この時の反応液のpHの範囲は6.82から9.58であった。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.2%eeであった。
【００８６】
実施例２（タウリン添加法）
DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル25.0g(70.3mmol)をMTBE 41.14gに溶かした溶液に、水11.25gとタウリン1.76g(14.1mmol)およびアルカラーゼ2.4L FG（Bacillus licheniformis由来）（ノボザイム社）4.50gを添加し40℃で攪拌した。そこに5%水酸化カリウム水溶液47.28g(40.67mmol)を滴下しながら40℃で17時間攪拌した。この時の反応液のpHの範囲は6.30から8.16であった。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.4%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は99.9%eeであった。
反応液を5分間静置後、分液し、有機層Ａ35.72gと水層Ａ83.46gを得た。その水層にトルエン37.5gを加えて、40℃で30分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層Ｂ42.80gと水層Ｂ76.80gを得た。有機層Ａと有機層Ｂを合一し、水58gと炭酸ナトリウム1.49gを加えて、40℃で30分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層Ｃ76.07gを得た。得られた有機層Ｃ76.07gを50℃に保温しながら濃縮を行い、63.2gを留去した。
その濃縮残12.87gにメタノール75mLを加えて、40℃に保温しながら、水18.75gを加えた。D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの種晶2mgを加えて、40℃で30分間撹拌した。そこに水12.5gを30分間かけて滴下し、40℃にて1時間保温した。次に20℃まで冷却し、濾過した。得られた結晶をメタノール8.75gと水3.75gを混合した溶液で洗浄した。
その結晶を減圧乾燥することにより、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの白色結晶10.94gを得た。D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの収率はDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルに対して43.8%であった。
【００８７】
実施例３（グリシン添加法）
DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル6.38g(18.0mmol)をMTBE 10.50gに溶かした溶液に、水2.88gとグリシン0.27g(3.6mmol)およびアルカラーゼ2.4L FG（Bacillus licheniformis由来）（ノボザイム社）1.53gを添加し40℃で攪拌した。そこに5%水酸化カリウム水溶液11.0g(9.90mmol)を滴下しながら40℃で18時間攪拌した。この時の反応液のpHの範囲は6.53から8.90であった。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.5%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は99.4%eeであった。
【００８８】
実施例４（酵素加水分解後のＬ体の再利用）
(i) L-N-Boc-ビフェニルアラニンのメチル化
実施例２(タウリン添加法)と同様の方法で得られた、L-N-Boc-ビフェニルアラニン50.0g(0.146mol)に相当するL-N-Boc-ビフェニルアラニンカリウム塩を含んだ水溶液328.54gにトルエン50gと食塩37.5gを加えて、40℃にて20分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層156.23gを得た。その有機層に炭酸水素ナトリウム12.27g(0.146mol)を加えて、40℃で撹拌した。そこに硫酸ジメチル33.15g(0.263mol)を2時間かけて滴下し、40℃で1時間撹拌した。反応液を分析したところ、残っているL-N-Boc-ビフェニルアラニンはLC分析において検出限界以下であった。
その反応液にトリエチルアミン2.95g(0.029mol)を加えて40℃で3時間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層114.04gを得た。そこにトルエン86.72gを加えて、50℃に保温しながら濃縮を行い、57.92gを留去した。そこにトルエン7.39gを加えてトルエン溶液150.23gを得た。得られたトルエン溶液を定量すると、L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの収率はL-N-Boc-ビフェニルアラニンに対して96.2%であった。また、カールフィッシャー水分測定器にて測定を行うと、得られたトルエン溶液の水分含量は204ppmであった。
【００８９】
(ii) L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのラセミ化
L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル50g(0.141mol)を含んだトルエン溶液150.23gにメタノール50gを加えて40℃にて撹拌した。そこに28% ナトリウムメチラートメタノール溶液27.20g(0.141mol)を1時間かけて滴下し、40℃で1時間撹拌した。
反応液を分析すると、L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は0.02%ee、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのLC面百値は89.3%であった。
その反応溶液に酢酸10.16g(0.169mol)を15分間かけて滴下し、40℃で30分間撹拌した。
次に水50gを加えて、40℃で5分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層151.90gを得た。有機層に水45gを炭酸水素ナトリウム2.37g(0.028mol)を加えて、40℃で50分間撹拌した。5分間静置後、分液し、有機層147.67gを得た。得られた溶液をLCにて定量すると、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの収率はL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルに対して89.7%であった。
その溶液を54〜56℃に保温しながら濃縮を行い、62.67gを留去した。そこにMTBE75gを加えて、52℃に保温しながら濃縮を行い、74.23gを留去した。そこにMTBE75gを加えて、52℃に保温しながら濃縮を行い、84.71gを留去した。そこにMTBE51.46gを加え127.52gの溶液を得た。得られた溶液をLCにて定量すると、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの収率はL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルに対して89.5%であった。またMTBE溶液中のトルエンの含量は18.5%であった。
【００９０】
(iii) D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの製造
上記で得られたMTBE溶液に対して、実施例２(タウリン添加法)と同じ条件で酵素加水分解を行ったところ、反応液中のD-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.4％、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100％であった。
【００９１】
メチル化およびラセミ化におけるLC分析(HPLC)は以下の条件で行った。
HPLC分析条件
カラム; SUMIPAX A212 ODS (住化分析センター) (φ: 6mm×Ｌ:15cm)
移動層; A液; 25mM リン酸水素ニカリウム水溶液(リン酸にてpHを6.8に調整)
B液; アセトニトリル
溶離条件; B液40%(5分)−20分−80%(5分)グラジエント
カラム温度; 40℃
流速; 1.0mL/分
検出器; UV(254nm)
保持時間; L-N-Boc-ビフェニルアラニン; 7分
L-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル; 24分
【００９２】
参考例１
pH7.0の0.1Mリン酸緩衝液10 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 118 mg (0.33 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG (Bacillus licheniformis由来)（ノボザイム社） 0.4 mLを添加し、pH6.82〜7.0で40℃で8.5時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.7%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９３】
参考例２
pH7.0の0.4Mリン酸緩衝液5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 0.59g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 2 mLを添加し、pH6.57〜7.0で40℃で7.5時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は96.7%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９４】
参考例３
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 0.59 g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 2 mLを添加し、40℃で7.5時間撹拌した。その時点で水層のpHは6.78であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.1に調整後、さらに40℃で4時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.8%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９５】
参考例４
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液1.3 mLに水3.7 mL、DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル0.59 g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 2 mLを添加し、40℃で7.5時間撹拌した。その時点で水層のpHは6.50であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.0に調整後、さらに40℃で4時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.5%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９６】
参考例５
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 0.59 g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 1 mLを添加し、40℃で2.5時間撹拌した。この時点で水層のpHは6.85であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.03に調整後、さらに40℃で2.5時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.9%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９７】
参考例６
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 0.59 g (1.66 mmol)をMTBE 2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 0.06 mLを添加し、40℃で2.5時間撹拌した。この時点で水層のpHは6.90であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.0に調整後、さらに40℃で2.5時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は99.8%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９８】
参考例７
pH8.0の0.4Mリン酸緩衝液8.5 mLにDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 1.0 g (2.81 mmol)をトルエン2 mLに溶かした溶液を加えた。そこにアルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 0.1 mLを添加し、40℃で3時間撹拌した。この時点で水層のpHは7.43であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.1に調整後、さらに40℃で3.5時間撹拌した。この時点で水層のpHは7.18であった。20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを8.0に調整後、さらに40℃で3時間撹拌した。
反応液を分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの光学純度は96.9%ee、L-N-Boc-ビフェニルアラニンの光学純度は100.0%eeであった。
【００９９】
参考例８
水65 mLにリン酸水素二ナトリウム2.5 g (0.0176 mol)およびリン酸二水素ナトリウム二水和物1.8 g(0.0115 mol)を溶かし、20%水酸化ナトリウム水溶液1.86 mLを加えてpHを8.12に調整した。
この水溶液にDL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのMTBE溶液45.4 g [DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル 16.6 g (0.0457 mol)を含む]を加え、アルカラーゼ2.4L FG（ノボザイム社) 2.5 mLを加えて、20%水酸化ナトリウム水溶液で水層のpHを7.44〜8.45に保ちながら40℃で10時間撹拌した。
反応液を分液し、得られた水層をトルエン30 mLで抽出した。有機層を合わせ、3%炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルのトルエン溶液(69.29 g)を得た。
HPLCで分析したところ、D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルの含量は8.36 gであり、光学純度は99.9%eeであった。DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルからの収率は50%であった。
水層中のL-N-Boc-ビフェニルアラニンの含量は7.57 gであり、光学純度は100.0%eeであった。DL-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステルからの収率は47.5%であった。
D-N-Boc-ビフェニルアラニンメチルエステル
1H-NMR (CDCl3); 1.42 (9H, s), 3.09 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.16 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.74 (3H, s), 4.55-4.70 (1H, m), 4.90-5.08 (1H, m), 7.20 (2H, d, J=8 Hz), 7.33 (1H, t, J=8 Hz), 7.43 (2H, t, J=8 Hz), 7.52 (2H, d, J=8 Hz), 7.57 (2H, d, J=8 Hz).
L-N-Boc-ビフェニルアラニン
1H-NMR(CDCl3)；1.48 (9H, s)、3.12 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 3.24 (1H, dd, J=5, 14 Hz), 4.55-4.70 (1H, m), 4.90-4.99 (1H, m), 7.26 (2H, d, J=8 Hz), 7.33 (1H, t, J=8 Hz), 7.42 (2H, t, J=8 Hz), 7.53 (2H, d, J=8 Hz), 7.56 (2H, d, J=8 Hz).
【０１００】
各実施例において、Ｄ体およびＬ体の絶対配置は、前述のキラルカラムを使用するHPLCにおける標準品との保持時間の比較により確認した。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明の製造方法によれば、光学活性なビフェニルアラニン構造を有する化合物を、安価な原料から、高い光学純度で簡便な操作により製造することができるので、当該製造方法は工業的に非常に有利な製造方法である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（１）
【化１】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２はアミノ基の保護基を示し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基またはニトロ基を示す。）
で表されるビフェニルアラニンエステル化合物を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した式（２）
【化２】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩と式（３）
【化３】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を分離することを特徴とする、式（２）で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩および式（３）で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物の製造方法。
【請求項２】
アルカリがアルカリ金属水酸化物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸がグリシンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
アミノスルホン酸がタウリンである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
加水分解がアルカリ金属水酸化物とアミノ酸の存在下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
加水分解がアルカリ金属水酸化物とグリシンの存在下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
加水分解がアルカリ金属水酸化物とアミノスルホン酸の存在下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
加水分解がアルカリ金属水酸化物とタウリンの存在下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
プロテアーゼがBacillus licheniformis由来のものである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１がアルキル基である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１がメチルまたはエチルである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ２がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ３およびＲ４が水素原子である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
加水分解が、ｐＨを６．０〜１３の範囲に維持しながら行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
加水分解が、ｐＨを６．０〜１０の範囲に維持しながら行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
加水分解が、有機溶媒と水の混合溶媒中で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
有機溶媒が、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルおよびトルエンから選ばれる少なくとも１種である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
有機溶媒がｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
加水分解が３０〜６０℃で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
加水分解が３５〜５５℃で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
式（２）
【化４】
（式中、
Ｒ２はアミノ基の保護基を示し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基またはニトロ基を示す。）
で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩をエステル化して、式（２’）
【化５】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を得る工程；
式（２’）で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物をラセミ化して、式（１）
【化６】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表されるビフェニルアラニンエステル化合物を得る工程；
を包含することを特徴とする、式（１）で表されるビフェニルアラニンエステル化合物の製造方法。
【請求項２２】
式（１）
【化７】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２はアミノ基の保護基を示し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基またはニトロ基を示す。）
で表されるビフェニルアラニンエステル化合物を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した式（２）
【化８】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩と式（３）
【化９】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を分離する工程；
式（２）で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩をエステル化して、式（２’）
【化１０】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を得る工程；
式（２’）で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物をラセミ化して、式（１）で表されるビフェニルアラニンエステル化合物を得る工程；
を包含する、式（１）で表されるビフェニルアラニンエステル化合物の回収方法。
【請求項１】
式（１）
【化１】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２はアミノ基の保護基を示し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基またはニトロ基を示す。）
で表されるビフェニルアラニンエステル化合物を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した式（２）
【化２】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩と式（３）
【化３】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を分離することを特徴とする、式（２）で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩および式（３）で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物の製造方法。
【請求項２】
アルカリがアルカリ金属水酸化物である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
アミノ酸がグリシンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
アミノスルホン酸がタウリンである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
加水分解がアルカリ金属水酸化物とアミノ酸の存在下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
加水分解がアルカリ金属水酸化物とグリシンの存在下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項７】
加水分解がアルカリ金属水酸化物とアミノスルホン酸の存在下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
加水分解がアルカリ金属水酸化物とタウリンの存在下で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項９】
プロテアーゼがBacillus licheniformis由来のものである、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１がアルキル基である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ１がメチルまたはエチルである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ２がｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルである、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ３およびＲ４が水素原子である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
加水分解が、ｐＨを６．０〜１３の範囲に維持しながら行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
加水分解が、ｐＨを６．０〜１０の範囲に維持しながら行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
加水分解が、有機溶媒と水の混合溶媒中で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
有機溶媒が、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルおよびトルエンから選ばれる少なくとも１種である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
有機溶媒がｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテルである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
加水分解が３０〜６０℃で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
加水分解が３５〜５５℃で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
式（２）
【化４】
（式中、
Ｒ２はアミノ基の保護基を示し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基またはニトロ基を示す。）
で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩をエステル化して、式（２’）
【化５】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を得る工程；
式（２’）で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物をラセミ化して、式（１）
【化６】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表されるビフェニルアラニンエステル化合物を得る工程；
を包含することを特徴とする、式（１）で表されるビフェニルアラニンエステル化合物の製造方法。
【請求項２２】
式（１）
【化７】
（式中、
Ｒ１はアルキル基、ハロアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基または置換基を有していてもよいアラルキル基を示し、
Ｒ２はアミノ基の保護基を示し、
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、ハロアルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、シアノ基またはニトロ基を示す。）
で表されるビフェニルアラニンエステル化合物を、(i)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリの存在下で、(ii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノ酸の存在下で、または(iii)アルカリ金属水酸化物およびアルカリ土類金属水酸化物から選ばれる一種以上のアルカリとアミノスルホン酸の存在下で、Bacillus属に属する微生物由来のプロテアーゼを用いて加水分解して、生成した式（２）
【化８】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩と式（３）
【化９】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される未反応の光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を分離する工程；
式（２）で表される光学活性ビフェニルアラニン化合物またはその塩をエステル化して、式（２’）
【化１０】
（式中、各記号は前記と同義である。）
で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物を得る工程；
式（２’）で表される光学活性ビフェニルアラニンエステル化合物をラセミ化して、式（１）で表されるビフェニルアラニンエステル化合物を得る工程；
を包含する、式（１）で表されるビフェニルアラニンエステル化合物の回収方法。
【公開番号】特開２００７−２１７４０２（Ｐ２００７−２１７４０２Ａ）
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−３４０５１３（Ｐ２００６−３４０５１３）
【出願日】平成１８年１２月１８日（２００６．１２．１８）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年８月３０日（２００７．８．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１２月１８日（２００６．１２．１８）
【出願人】（０００００２０９３）住友化学株式会社 (8,981)
【Ｆターム（参考）】
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