光測定装置
【課題】試料の動的な光解析方法を迅速に効率良く行なう光測定装置を提供する。
【解決手段】レーザ光源１と、対物レンズ１０と、光検出器２と、試料容器２２と、光学素子と、偏芯回転ミラー４０と偏芯回転ミラー４０を回転させるモーター４１とにより構成されるビーム走査機構９と、制御信号を発生し、ビーム走査機構９の駆動制御を行なうビーム走査機構制御部とを備え、試料容器に保持された溶液中の生物学的試料の物理的性質について複数種類の測定項目に対応した測定を行なう光測定装置であって、ＦＩＤＡ測定を行なう場合は、偏芯回転ミラー４０を回転させてレーザ光の集光スポットを前記試料容器に保持された溶液内のフォーカス位置で略楕円状に光走査し、ＦＣＳ測定を行なう場合は、光軸を通った光が対物レンズを光軸に沿って通過する向きに偏芯回転ミラーのミラー面を固定し、光軸を通った光により溶液内でコンフォーカル照明を行う。
【解決手段】レーザ光源１と、対物レンズ１０と、光検出器２と、試料容器２２と、光学素子と、偏芯回転ミラー４０と偏芯回転ミラー４０を回転させるモーター４１とにより構成されるビーム走査機構９と、制御信号を発生し、ビーム走査機構９の駆動制御を行なうビーム走査機構制御部とを備え、試料容器に保持された溶液中の生物学的試料の物理的性質について複数種類の測定項目に対応した測定を行なう光測定装置であって、ＦＩＤＡ測定を行なう場合は、偏芯回転ミラー４０を回転させてレーザ光の集光スポットを前記試料容器に保持された溶液内のフォーカス位置で略楕円状に光走査し、ＦＣＳ測定を行なう場合は、光軸を通った光が対物レンズを光軸に沿って通過する向きに偏芯回転ミラーのミラー面を固定し、光軸を通った光により溶液内でコンフォーカル照明を行う。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の分子に蛍光物質を標識した生物学的な試料溶液中に光を照射し、蛍光物質から発せられた蛍光の強度の時間的な変化を解析して、試料分子の統計的な性質を求めることで、試料分子の反応や反応による状態変化を測定する光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の光を用いた測定技術の進歩に伴い、生体の細胞内外に極めて小さな光スポットを形成し、細胞内外の分子の挙動を動的に調べる方法が注目されている。例えば、蛍光物質を細胞内のターゲットとする生体分子に標識し、蛍光物質から発せられる蛍光の強度の時間的な変化を解析することにより、分子の溶液中での振舞いを高感度に捉えることができる。
【０００３】
このような解析方法として、蛍光相関分光解析法（Fluorescence Correlation Spectroscopy : FCS）や蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Distribution Analysis : FIDA）等が良く用いられている。
【０００４】
ＦＣＳでは、測定したい分子に蛍光物質を標識し、マイクロプレートなど試料容器内に収納する。そして試料容器の試料槽の中にレーザ光を微小な光スポットとして照射して、蛍光物質を励起する。このとき蛍光物質から発せられる蛍光の強度は時間と共にゆらぐ。これは、媒質中の蛍光分子がブラウン運動をしているためである。蛍光分子のブラウン運動の拡散速度は、分子の化学反応や結合反応などにより変化する。従って、蛍光分子の拡散速度は、標識した蛍光分子の見かけの大きさの変化や媒質の温度の変化に伴って変化する。
【０００５】
そこでこの分子の溶液内での化学反応や結合反応などによるブラウン運動の速度の変化を、蛍光の光強度の時系列信号の統計的な変化として捉えて相関解析を行なうことで、分子や微粒子の並進拡散係数や、平均の分子数などを測定することができる。そして、測定結果として分子の化学反応や結合反応などを動的に捉えることができる。
【０００６】
ＦＣＳについては、たとえば非特許文献１、２に解説が掲載され、特許文献１、２、３にＦＣＳに関する技術が開示されている。
【０００７】
ＦＩＤＡでは、ＦＣＳと同様に測定したい分子に蛍光物質を標識し、マイクロプレートなど試料容器の試料槽の中にレーザ光を微小な光スポットとして照射して、蛍光物質を励起する。そして、単位時間当たりに蛍光物質から発せられる蛍光の光強度を測定し、これの統計分布を解析する。単位時間に検出される蛍光の光子の数の統計分布を解析することによって、蛍光分子の明るさと濃度、即ち、対象とする分子の数と明るさについての情報を得ることができる。この明るさに関する情報を用いることにより、化学反応や結合反応などによる蛍光標識された分子の見かけの大きさの変化を高感度で検出することができる。
【０００８】
さらに偏光を用いたＦＩＤＡ-Polarization（Fluorescence Intensity Distribution Analysis-Polarization）も行なうことができ、回転ブラウン運動を行なう分子の数や分子の見かけの大きさの変化を調べることができる。
【０００９】
さらにＦＩＤＡでは、溶液中で光の照射領域を積極的に移動させて、試料中のできるだけ広い領域で測定を行ない、１回当たりの測定時間を短縮させることもできる。なお、ＦＩＤＡは光強度の統計分布を求めるためにＦＣＳに比べて光照射領域を大きめにとる必要がある。
【００１０】
ＦＩＤＡについては、Ｐｅｅｔ Ｋａｓｋ，Ｋａｕｐｏ Ｐａｌｏ，ＤｉｒｋＵｌｌｍａ ｎｎ ａｎｄ Ｋａｒｓｔｅｎ Ｇａｌｌ ＰＮＡｓ Ｎｏｖ２３， １９９９，ｖｏｌ． ９６，Ｎｏ．２４，ｐ．１３７５６−１３７６１，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａ ｌ Ｖｏｌ．７９，（２０００）ｐ．２８５８−２８６６，米国特許第６，３７６，８４３ 号に記述されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、生物試料の動的特性を光学的に調べるに際し、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを同時に、または順次測定しようとする場合、煩雑で手間がかかると共に、広い作業スペースも必要 となっていた。ＦＣＳを用いる場合とＦＩＤＡを用いる場合とでは、測定装置内に配置され る光学素子などの組み合わせが異なるために、それぞれの測定を行う毎に光学素子を入れ替 えたり、あるいは測定に特化した異なる複数の測定装置を設けて並行した測定を行なわなければならない。
【００１２】
更に１つの測定装置で、ＦＣＳやＦＩＤＡといった異なる測定項目について測定を行なおうとする場合、レンズやフィルタなどの光学素子を入れ替えた後に、再び光軸の調整を行なう必要があり、煩雑であると共に手間と時間を要していた。
【００１３】
本発明は係る事情に鑑みてなされたものであって、同一の測定装置で異なる測定項目についての測定を行う場合であっても、測定装置の基本構成を変えることなく、種々の試料の動的な光解析を迅速にかつ効率良く行なうことができる光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明における光測定装置は、レーザ光源と、対物レンズと、光検出器と、試料容器と、光学素子と、前記レーザ光源と前記試料容器との間の光路上に配置され、偏芯回転ミラーと 前記偏芯回転ミラーを回転させるモーターとにより構成されるビーム走査機構と、制御信号を発生し、前記ビーム走査機構の駆動制御を行なうビーム走査機構制御部と、を備え、前記試料容器に保持された溶液中の生物学的試料の物理的性質について複数種類の測定項目に対応した測定を行なう光測定装置であって、前記ビーム走査機構は前記ビーム走査機構制御部より前記制御信号を受信して、ＦＩＤＡ(Fluorescence Intensity Distribution Analysis) 測定を行なう場合は、前記偏芯回転ミラーを回転させてレーザ光の集光スポットを前記試料容器に保持された溶液内のフォーカス位置で略楕円状に光走査し、ＦＣＳ(Fluorescence Co rrelation Spectroscopy)測定を行なう場合は、光軸を通った光が前記対物レンズを光軸に沿って通過する向きに前記偏芯回転ミラーのミラー面を固定し、前記光軸を通った光が前記 溶液内でコンフォーカル照明を行う。
【発明の効果】
【００１５】
従って、本発明の光測定装置によれば、測定装置の基本構成を変えることなく、さまざまな試料の動的な光解析を迅速にかつ効率良く行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】光測定装置の基本的な構成を示す図。
【図２】ビームシフタを示す図。
【図３】ダイクロイックミラー保持部材を示す図。
【図４】液浸水の自動給排液機構を示す図。
【図５】ピンホールホルダー等を示すフロー図。
【図６】バリア・フィルタ支持基板とバリア・フィルタ回転機構を示す図。
【図７】測定中の光検出器の状態を示す図。
【図８】問題を解決する方法を示す図。
【図９】問題を解決する他の方法を示す図。
【図１０】第１の実施の形態の変形例を示す図。
【図１１】測定中の光検出器の状態を示す図。
【図１２】問題を解決する方法を示す図。
【図１３】問題を解決する他の方法を示す図。
【図１４】第１の実施の形態の他の変形例を示す図。
【図１５】フェルール型光学素子の構成を示す図。
【図１６】フェルール型光学素子の断面図。
【図１７】フェルール型光学素子の他の実施例を示す図。
【図１８Ａ】ビーム走査機構の切り替え方法を説明する図。
【図１８Ｂ】ビーム走査機構の切り替え方法を説明する図。
【図１９Ａ】ビーム走査機構の他の切り替え方法を説明する図。
【図１９Ｂ】ビーム走査機構の他の切り替え方法を説明する図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［第１の実施の形態］
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１８】
図１は光測定装置の基本的な構成図である。
【００１９】
本発明による光測定装置は、主な構成部として、光源部１５、光量モニタ機構７、ビーム走査機構９、対物レンズ１０、液浸水供給機構１１、試料保持機構１８、光検出部１６及び信号処理部１７を備えている。
【００２０】
以下、光測定装置の詳細の構成と動作について説明する。
【００２１】
光源部１５には、レーザ光源１、シャッター２３、ビーム径可変機構５、回転式ＮＤフィルタ３６、ビームシフタ１０２、ミラー１００及びダイクロイックミラー３が設けられている。
【００２２】
光源部１５には３種類のレーザ光源１が載置されている。本実施の形態では、ヘリウムネオン・レーザ（発振出力１ｍＷ、波長：５４３ｎｍ）、 ヘリウムネオン・レーザ（発振出力２ｍＷ、波長：６３３ｎｍ）、およびアルゴン・レーザ（発振出力１０ｍＷ、波長：４８８ｎｍ）が設けられている。
【００２３】
光源として用いるレーザはパルスレーザであっても良い。例えば、ＣＷモード同期アルゴンイオン・レーザを用いると、波長５１４．５ｎｍ、平均出力１００ｍＷ、パルス幅２００ピコ秒のレーザパルスを得ることができる。
【００２４】
また、音響光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦ）を搭載したマルチラインのレーザも載置可能である。マルチラインのレーザには、複数の波長のレーザ光が含まれているため、ＡＯＴＦによって発振波長の切り替えを行なうように構成することで、載置するレーザの台数を減少することができる。
【００２５】
各レーザ光源１の出射端近傍にはシャッター２３がそれぞれ設置されており、シャッター２３はそれぞれ電子制御により開閉される機構（図示せず）になっている。出射されたレーザ光はレンズを組み合わせたビーム径可変機構５でビーム直径を拡大され、平行光にされる。ビーム径可変機構５を構成するレンズの組み合わせを変えることで、焦点距離を変えて射出ビーム直径を調整することができる。
【００２６】
それぞれ平行光とされたレーザ光は各々の光路に用意された回転式ＮＤ（Neutral Density）フィルタ３６、ビームシフタ１０２を通過した後、ミラー１００、ダイクロイックミラー３で選択的に反射、または透過される。そして、３つのレーザ光源１からの光路は１つの光路にまとめられる。３つの光路を同一の光路にまとめる操作は、ビームシフタ１０２を調整することで行われる。
【００２７】
ビーム走査機構９にはビーム走査機構制御部９９が接続されている。ビーム走査機構制御部９９は制御信号を発し、ビーム走査機構９の配置及び動作を制御する。即ち、ビーム走査機構９の稼動／非稼動状態を切替える。さらにビーム走査機構９を構成する偏芯回転ミラー４０の回転角をＦＩＤＡ測定、ＦＣＳ測定などの測定条件に対応して制御する。
【００２８】
図２は、ビームシフタ１０２を示す図である。ビームシフタ１０２は、所定の厚さを持つガラス板が２軸の自由度で動く構造を備えている。ビームシフタ１０２の調整は、後に示す光量モニタ機構７の光検出器５３の検知出力が最大になるようにガラス板を２軸を中心として回転することにより行なう。またこの調整は、光検出器５３の検知出力をコンピュータ１４に入力して、コンピュータ１４からの制御出力に基づいて、ガラス板の２軸を駆動することでも可能である（駆動機構は図示していない）。
【００２９】
ビームシフタ１０２の調整によってレーザ光源１からのレーザビームは１つのビームにされ、ミラー４で方向を曲げられ、偏光素子ホルダー２８に到達する。偏光素子ホルダー２８はスライド式の板状構造となっており、通常２箇所の円形の偏光素子保持枠が設けられている。一方の保持枠に円形の偏光素子が配置されており、もう一方は空隙になっている。そして、この偏光素子ホルダー２８に取り付けられた偏光素子ホルダー駆動部３９によって偏光素子ホルダー２８をスライドさせることにより、必要に応じて偏光素子が光路上に設置されるようになっている。
【００３０】
この偏光素子ホルダー駆動部３９によるスライド調整は、ステッピングモータを用いた制御装置により行なわれる（図示せず）。光測定装置を用いて偏光測定を行なう場合は、偏光素子ホルダー２８に偏光素子が設置され、光路上に偏光素子が載置される。偏光測定を行わない場合は光路上には偏光素子は存しない。なお、偏光素子ホルダー２８は円板状であっても良い。あるいは円板の周囲に複数の偏光素子を載置し、偏光素子ホルダー２８を回転させることで、偏光素子を切り替えて用いても良い。
【００３１】
偏光素子ホルダー２８に配置する偏光素子には、例えばシート状の偏光板を用いることができる。しかし偏光板に限ることなく、例えばグラントムソン・プリズム（Ｇｌａｎ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｐｒｉｓｍ）などの消光比の高い偏光素子を用いると、さらに精度の高い偏光測定を行なうことができる。
【００３２】
レーザビームは、偏光素子ホルダー２８を通過後、円板状のハーフミラー６に入射する。そして、レーザビームの一部はハーフミラー６で反射されて光量モニタ機構７に入る。光量モニタ機構７はレンズ５１、ピンホール２２０、光検出器５３を備え、レーザビームはこれらの光学素子を通って光検出器５３の受光面に集光する。光検出器５３は半導体光検出器を用いる。
【００３３】
光検出器５３の検知出力は、コンピュータ１４に入力され、コンピュータ１４は、この値に基づいて、あらかじめ設定した光源出力光強度になるように、レーザ駆動電源（図示しない）の駆動電流を制御する。あるいは回転式ＮＤフィルタ３６をコンピュータ１４が制御（図示しない）することで、レーザ光源１からの光出力強度を調整することもできる。
【００３４】
ハーフミラー６を通過したレーザビームは偏芯回転ミラー４０に達する。このとき偏芯回転ミラー４０は回転に伴って反射光の方向が中心軸の周りに回転運動するように傾いて調整されている。そのため、レーザビームは対物レンズ１０の光軸に対して、ある傾き角を持って入射する。偏芯回転ミラー４０をモータ４１で回転させることで、対物レンズ１０を通過した光ビームの集光スポットは試料内で略楕円状に走査される。なお、集光スポットを走査させるのは、ＦＩＤＡ測定を行なう場合であり、ＦＣＳ測定を行なう場合には集光スポットは固定される。具体的には、ビーム走査機構制御部９９から制御信号が発生し、ビーム走査機構９を稼動状態として偏芯回転ミラー４０を測定条件に対応した所定の角度だけ回転させ、停止させる。これにより、光源から発せられたレーザ光は光軸に沿って進み、対物レンズを通って、試料内でコンフォーカル照明を行う。
【００３５】
即ち、ＦＩＤＡ測定を行なう場合は、モータ４１を回転させ、それに伴って偏芯回転ミラー４０が回転運動を行ない、光軸を通った光は対物レンズを通って溶液内のフォーカス位置で略楕円を描きながら試料を光照射する。
【００３６】
ＦＣＳ測定を行なう場合は、コンピュータ制御によりモータ４１を停止し、偏芯回転ミラー４０を適切な位置で固定する。このとき、偏芯回転ミラー４０のミラー面の向きは光軸を通った光が対物レンズを光軸に沿って通過する向きに設定されるようにあらかじめモータ４１の停止位置はビーム走査機構制御部９９により、決められている。
【００３７】
また、ＦＣＳ測定の場合に、偏芯回転ミラー４０とは別の、光軸に対して偏芯していないミラー９０に切り替えるようにしても良い。
【００３８】
レーザ光は続いて切り替え式ダイクロイックミラー１０１で反射され、対物レンズ１０に入射する。対物レンズ１０として、例えば×４０水浸対物レンズ（ＮＡ１．１５）を用いる。対物レンズ１０は補正環が無いドライタイプを用いても良いし、あるいは液浸タイプで補正環を具備しているものを用いてもよい。
【００３９】
この切り替え式ダイクロイックミラー１０１は円板状のガラス板の表面に多層膜コーティングを施して、透過、反射のスペクトル特性が最適になるように製作されている。切り替え式ダイクロイックミラー１０１としては円板状に限らず、プリズムタイプのものを用いても良い。また切り替え式ダイクロイックミラー１０１は裏面反射によるノイズ光が信号光に混入するのを防ぐため、基板となるガラスの厚さを最適に調整してあるものを用いる。
【００４０】
この切り替え式ダイクロイックミラー１０１は光源としてのレーザ光と試料から発せられた蛍光信号を分離する役割がある。測定に用いる波長を変更するときは、透過、反射特性の異なる複数個のダイクロイックミラー１０１の内から最適なものを選択して切り替えて用いる。
【００４１】
図３は、ダイクロイックミラーの切り替えに使用するダイクロイックミラー保持部材を示す図である。
【００４２】
図３に示すダイクロイックミラー保持部材５８は、複数の円形のダイクロイックミラー１０１が横方向に一列に搭載されたスライド式の構造であるが、レボルバーやターレットに搭載された回転式のものを用いても良い。ダイクロイックミラー保持部材５８はアルミニュームのような金属を用いる。ここでダイクロイックミラー１０１の形状は円形に限らず、正方形や長方形でも良い。また、切り替え式ダイクロイックミラー１０１の代わりに音響光学素子（ＡＯＴＦ）を用いて、透過光と反射光の波長を選択しても良い。
【００４３】
試料を収容する試料容器にはマイクロプレート２０（９６，３８４穴など）を用いる。マイクロプレート２０は樹脂、あるいはガラス製であり、図１に示すように同一形状のウェル２２（試料を収容する溝）が多数並んで配列されている。マイクロプレート２０のウェル２２部分の底面は、ガラス、アクリル樹脂などの光学的に透明な材質で形成されており、対物レンズ１０を通過した光が殆んど減衰することなく、ウェル２２内に収容された試料に入射するようになっている。
【００４４】
図４は、液浸タイプの対物レンズを用いるときに必要な液浸水の自動給排液機構２１を示す図である。試料ステージ１９にマイクロプレート２０を載置し、クリップなどの固定具でマイクロプレート２０を試料ステージ１９に固定する。
【００４５】
対物レンズ１０はマイクロプレート２０の底面に向かうように倒立させて配置する。対物レンズ１０先端部に給液ボトル５６に浸されたチューブ１０３を介して先端部のノズル１０４により液浸水を滴下し、対物レンズ１０の先端部とマイクロプレート２０底面の間を液浸水で満たす。液浸水がこぼれたり、あふれたりした場合は対物レンズ１０の周囲に配設された液浸水保持プレート５５で保持する。
【００４６】
一方、測定中に対物レンズ１０の上面に保持された液浸水が無くなった場合、この情報をコンピュータ１４にフィードバックして、給液ボトル５６内の液浸水をポンプ駆動により自動的に対物レンズ１０先端部に給液する。測定終了後、自然に液浸水は乾燥するが、必要以上に給液されたものは、廃液ボトル５７に自然に落下するようになっている。またはノズル１０４により吸引し、切替機構（不図示）により切り替えて、廃液ボトル５７へ導入する廃液機構とすることも可能である。
【００４７】
なお、自動給排液機構２１による給排液は水に限らず、オイルでも良い。マイクロプレート２０を試料容器として用いて観察、測定する場合は通常、数多くのウェル２２内に試料を収容し、試料ステージ１９を駆動して位置調整を行ない、それぞれの試料について測定、あるいは観察を行なう。
【００４８】
試料ステージ１９にはＸ軸、Ｙ軸方向に沿ってステッピングモータ（図示しない）が取り付けられており、マイクロプレート２０を精密に水平方向（Ｘ−Ｙ軸方向）に移動させることができる。そして試料ステージ１９をＸＹ平面内で作動させて、マイクロプレート２０を移動調整しながら、順次測定を繰り返し行なう。
【００４９】
また対物レンズ１０の周囲には対物レンズＺ軸保持機構４３が具備されており、コンピュータの指令により、対物レンズＺ軸保持機構４３を光軸方向（Ｚ軸方向）に移動させる。すなわち、ウエル２２内でのレーザ光のフォーカス位置を光軸方向に沿って上下動させることができる。
【００５０】
レーザ光は対物レンズ１０を通って集光されたあと、試料を収容したマイクロプレート２０のウェル２２内で極めて微小な光スポットを形成する。レーザ光の集光位置は水平方向（Ｘ−Ｙ軸方向）についてはウエルの中央部分、垂直方向（Ｚ軸）については、試料内のほぼ中央部分となっている。このとき、ウェル２２内で得られるレーザ光の共焦点領域の大きさは直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円筒状の光スポットとなる。
【００５１】
試料に直接ラベルして用いる蛍光物質はそれぞれローダミン・グリーン（ＲｈＧ）、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ６４７であり、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）は波長４８８ｎｍのアルゴンレーザで励起し、ＴＡＭＲＡは波長５４３ｎｍのヘリウム・ネオンレーザで励起し、Ａｌｅｘａ６４７は波長６３３ｎｍのヘリウム・ネオンレーザで励起する。
【００５２】
対物レンズ１０で集光されたレーザ光はウエル２２内で試料内の蛍光分子を励起し、蛍光分子から蛍光が発せられる。この蛍光は再び信号光として対物レンズ１０に取り込まれ、続いて切り替え式ダイクロイックミラー１０１に到達する。信号光の波長は入射レーザ光の波長より長く、そのため切り替え式ダイクロイックミラー１０１を透過して、反射プリズム２００で反射され、レンズ２１０でレンズ２１０の後方に配置されたピンホール２２０のピンホール面に集光される。
【００５３】
対物レンズ１０の焦点位置と共役な光軸上の位置にピンホール２２０が位置決めされるようにピンホールホルダー５０が配置されている。ピンホールホルダー５０は、図５（ａ）に示すようにピンホール直径が異なる複数のピンホールが一列に並んだスライド式になっており、必要な共焦点領域（光スポット領域）の大きさに合わせて、最適なピンホールが配置されるように調整される。あるいは図５（ｂ）に示すように切り欠きを有する板状部材を２枚、切り欠き部が互いに向かい合うように配置し、板状部材の互いの間隔を変化させ、中央部にできる矩形の枠の大きさを連続的に変化させる構成であってもよい。
【００５４】
ピンホール２２０の手前にバリア・フィルタ４５が配置されている。バリア・フィルタ４５は蛍光の発光スペクトルに合わせて、透過光のスペクトルが調整されるようになっている。すなわち、バンドパスフィルタとなっており、信号光となる蛍光の発光スペクトルの波長域の光のみが通過する。これにより、試料容器内で発生する散乱光やウェル２２の壁などから反射して入射光路に戻ってくる入射光の一部などのノイズ光をカットすることができる。蛍光の波長とバックグラウンド光の波長が異なるためノイズ光を遮断できる。なお、バリアフィルタ４５として、音響光学素子によるビームスプリッター（ＡＯＢＳ）を用いても良い。
【００５５】
レンズ２１０の焦点面とピンホール２２０の開口面とが一致するように配置されている。このピンホール２２０には光位置検出器とピンホール駆動装置が取り付けられており（図示しない）、ピンホール２２０はピンホール駆動装置により、Ｘ−Ｙ−Ｚ軸方向に位置調整できるようになっている。従って、レンズ２１０の焦点面にピンホール２２０の開口面を一致させることができる。
【００５６】
また、ピンホール２２０の位置はバリア・フィルタ４５の切り替え、あるいは音響光学素子によるビームスプリッター（ＡＯＢＳ）の切り替えに対して、デフォルト位置に自動的に戻る機構を有している。このピンホール２２０により、ウェル内に形成された光の共焦点領域外からのバックグラウンド光が除去される。
【００５７】
図６は、バリア・フィルタ支持基板５０１とバリア・フィルタ回転機構を示す図である。バリア・フィルタは円板状になっており、図に示すように円板状のバリア・フィルタ支持基板５０１の円周に沿って配置されている。バリア・フィルタ支持基板５０１は、その中心軸の周りに回転するが、このとき、所定位置にあるバリア・フィルタの中心軸は光軸と一致する。
【００５８】
バリア・フィルタ支持基板５０１の中心に回転軸５０２が取り付けられており、この回転軸５０２にはギア５０３−１が取り付けられている。ステッピングモータ５０４の回転軸５０８にはギア５０３−２が取り付けられている。ギア５０３−１とギア５０３−２とのギア比に従って、ステッピングモータ５０４の回転がバリア・フィルタ支持基板５０１に伝えられる。
【００５９】
一方、バリア・フィルタ支持基板５０１の円周面の一角に回転支持板５０５が取り付けられており、フィルタホイール支持台５０６に取り付けられた非接触位置検出器５０７の検出部分５０７−１の溝の間を通過するように構成されている。なお、回転支持板５０５は光学的に不透明な材質、例えば黒色塗布したアルミニューム板を用いる。
【００６０】
非接触位置検出器５０７の溝構造部分５０７−１は赤外発光ダイオードと赤外線光検出器とが互いに向き合って配置されている。検出部分５０７−１の溝の間を回転支持板５０５が通過したときは赤外線が遮られるため、回転支持板５０５が通過したことを検出することができる。なお、この位置はバリア・フィルタ支持基板５０１の初期位置として規定されている。
【００６１】
バリア・フィルタ支持基板５０１が回転した角度は、この回転支持板５０５が初期位置にあるときからのステッピングモータ５０４の回転角により一義的に決められる。即ち、現在の各バリア・フィルタの位置が確定する。従って、各バリア・フィルタの切り替えはステッピングモータ５０４の回転を制御することによって行なわれる。
【００６２】
ここで、非接触位置検出器５０７が回転支持板５０５を検出する方法には光を用いる方法の他に、静電容量の変化を利用する方法や、磁気を用いる方法などがあり、いずれの方法を用いてもよい。なお、バリア・フィルタ支持基板５０１の回転軸はフィルタホイール支持台５０６に回動自在に取り付けられている。
【００６３】
ピンホール２２０を通過した信号光はコリメートレンズ５９により平行光とされてダイクロイックミラー／偏光ビームスプリッター３８により、互いに垂直な２方向に分離される。ダイクロイックミラー／偏光ビームスプリッター３８は、ダイクロイックミラーと偏光ビームスプリッターとを切り替える機構を備えている。この切り替え機構には、例えば、図６に示したような回転機構を用いても良い。２種類の蛍光物質を用いて相互相関測定を行なう場合は、ダイクロイックミラーが自動的に選択されるようになっており、異なる蛍光物質の発光のスペクトに合わせて、反射光、および透過光のスペクトルを規定する。偏光測定を行う場合は、偏光ビームスプリッターが自動的に選択されるようになっており、反射光、および透過光で異なる偏光成分を分離する。分離されたそれぞれの信号光はバンドパスフィルタ６４でそれぞれの励起レーザ光の波長の光を選択的に遮断して、信号光のＳ／Ｎ比を向上させる。
【００６４】
バンドパスフィルタ６４を通過した信号光はレンズ１２により集光されて、光検出器２の受光面に到達する。それぞれの光検出器２には光位置検出器と光検出器駆動装置が取り付けられており、光検出器２の受光面は光検出器駆動装置により、Ｘ−Ｙ−Ｚ軸方向に沿って位置調整できるようになっている。光検出器２は例えばアバランシェ・フォトダイオード（略称：ＡＰＤ）、あるいは光電子増倍管などの微弱光検出器を用いる。光位置検出器は半導体光位置検出器を用いる。
【００６５】
次に、光検出器２の位置調整方法について説明する。
【００６６】
図７は、実際に測定を行っているときの光検出器の状態を示す図である。光検出器２が適正に光を受光するためには、受光面が焦点位置にあり、かつ受光面内の所定位置に光が照射されていることが必要である。しかし、ダイクロイックミラー１０１、バンドパスフィルタ６４の切り替えによってレンズ１２で信号光が集光される位置がシフトする。
【００６７】
図８は、この問題を解決する一方法を示す図である。光学素子を切り替えた後の非測定時において、レンズ１２により信号光が集光する位置近傍に、光位置検出器を挿入する。光位置検出器は光が当たった位置を座標（Ｘ、Ｙ）の情報として出力する。この座標位置が光検出器２の受光面の所定位置になるように、光検出器駆動装置が光検出器２を駆動する。そして、光位置検出器を外に移動する。
【００６８】
図９は、この問題を解決する他の方法を示す図である。この方法では、光位置検出器は使用しない。光検出器駆動装置が光検出器２を移動して、光検出器２自身で信号をモニタし、受光強度が一番強くなる位置に位置決めする。この方法は、光学素子を切り替えることによる集光位置のシフト量が僅かな場合、集光位置が光検出器２の受光面内に収まっている場合に適用することができる。
【００６９】
光検出器２で受光される信号光は微弱光であり、フォトン・パルス信号となっている。光検出器２によって、このフォトン・パルス信号は電気信号（光電流パルス信号）に変換され、増幅されて信号処理装置８に送られる。信号処理装置８によって、この電気パルス信号は波形整形され、ｏｎ−ｏｆｆ電圧パルスとされて、コンピュータ１４に導かれる。この電圧パルスはコンピュータ１４のメモリ（図示しない）に記憶され、続いて相関分光解析、光強度分布解析などの演算が行なわれる。これによって得られた蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数、相互相関関数、あるいは光強度分布関数などがコンピュータ１４により計算される。そして、コンピュータ１４の画面上に測定結果（グラフ、またはデータ）が提示され、あるいはコンピュータ１４のメモリ（図示しない）に記憶される。
【００７０】
次にコンピュータ１４による制御動作について説明すると、コンピュータ１４は測定に用いるレーザ光源１を選択し、電源を投入する。また、シャッター駆動電源（図示しない）に働きかけ、必要に応じて、シャッター２３を開閉する。さらに光量モニタ機構７の光検出器５３の出力をモニタして、レーザ光源１の出力光強度が所望のレベルになるように、モータ（不図示）の駆動電流を調整する。これによってモータに取り付けられている円盤状の回転式ＮＤフィルタ３６を必要な角度だけ回転させる。
【００７１】
回転式ＮＤフィルタ３６は円周方向に沿って変化する透過率分布を備えているため、回転によってレーザ光の強度を変化させることができる。なお、回転式ＮＤフィルタ３６は円盤状ではなく、板の長手方向に沿って段階的に透過率が変化する板状のものを用いても良い。板状のＮＤフィルタを用いる場合はスライドして透過光強度を変化させる。位置を制御する方法として、一般的にはＰＩＤ制御（Proportional:比例,Integral:積 分,Differential:微分）を用いるが、その他の制御手法、例えば単純ｏｎ／ｏｆｆ制御により行なってもよい。
【００７２】
本発明による測定装置では、高い開口数の対物レンズ（ＮＡ１．１５）を用いているために、螢光色素分子で標識された細胞内ＤＮＡ、細胞膜などの組織を構成する分子の特性も調べることができる。またＬＢ（Langmuir- Blodgett）膜の揺動運動などについても測定することができる。
【００７３】
また本発明による測定装置を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET）を求め、たんぱく質の結合や解離などの状態をリアルタイムで知ることができる。さらに、細胞内カルシウムイオン濃度の定量測定を行なうこともできる。また生体高分子のさまざまな部位間の距離や生体高分子の三次元，四次元構造及びその動的変化も測定することができる。
【００７４】
また、細胞内でカルモジュリン（Calmodulin）にカルシウムイオン（Ｃａ2+）が結合すると活性化されて、カルモジュリンは構造変化を起こす。カルモジュリンの異なる部位にそれぞれ異なる蛍光物質を用いて標識し、一方の螢光物質を励起して、蛍光共鳴エネルギー移動によって得られる、他方の蛍光物質からの蛍光を測定することにより、細胞内でのカルモジュリンの構造変化を知ることができる。
【００７５】
またタンパク質の両端に異なる２種類の蛍光タンパク質、例えば藍色蛍光タンパク質（CFP: cyan fluorescent protein）と黄色蛍光タンパク質（YFP: yellow fluorescent protein）を標識し、タンパク質のリン酸化を測定することができる。タンパク質がリン酸化することによってタンパク質の構造に変化が起こる。この構造変化により双方の蛍光タンパク質が極めて接近する（１０ナノメートル程度以下）とＦＲＥＴが起こる。このＦＲＥＴを測定することによりタンパク質のリン酸化を明らかにすることができる。
【００７６】
また測定装置をそのまま用いて、試料にレーザ光を照射し、試料から発せられる散乱光の強度ゆらぎを測定して相関分光解析を行なうことにより、試料の並進拡散速度などの物理的な性質や結合反応など、種々の反応による形態変化を測定することもできる。さらに試料から発せられるリン光やラマン散乱光についても同様に測定することができる。
【００７７】
〔変形例１〕
図１０は、第１の実施の形態の変形例１を示す図である。この変形例１では測定装置を光源部、測定装置本体部、受光部にそれぞれユニット化し、シングルモード光ファイバー２４、８０を用いて各ユニットを光接続し、測定装置の小型化を図ったものである。光源部と受光部にシングルモード光ファイバー２４，マルチモード光ファイバー８０を用いて光を伝送する以外は、第１の実施の形態と同様の構成である。従って、第１の実施の形態と同一の部位には同一の符号を付して、基本的な装置構成、及び動作については記述を省略する。
【００７８】
測定装置本体から分離した光源部１５に光源１を配置する。各光源１から出射されるレーザビームを光ファイバー受光端子４９に照射する。光ファイバー受光端子４９の受光面でレーザビームを受光し、シングルモード光ファイバー２４を介してレーザビームを効率良く他端に設けたＦＣコネクタ（図示しない）まで導く。なお、シングルモード光ファイバー２４の出力端とコリメートレンズ２５間の距離は、コリメートレンズ２５の焦点距離と一致している。
【００７９】
シングルモード光ファイバー２４を用いて光源から発したレーザ光を測定装置本体に伝送することにより、光源部１５の配置を自由に行なうことができる。特に光源１として出力光強度の大きいレーザを用いる場合、レーザ本体が大型になり、また冷却機構をレーザ本体には取り付けなければならないこともある。この場合、光源１のみを切り離して光源部１５として分離し、シングルモード光ファイバー２４で測定装置に導くことで、設置空間の有効利用や測定装置の小型化に対応できる。さらに光学調整（レーザビームのカップリング）を行なう場合、シングルモード光ファイバー２４の前後で行なえば良いので、切り分けて行なうことができる。
【００８０】
また検出光学系１６では、信号光をマルチモード光ファイバー８０で受光するような構成をとる。マルチモード光ファイバー８０は光検出器２に接続されている。マルチモード光ファイバー８０を用いることで、装置内の光検出器２の配置を自由に行なうことができる。また測定装置を小型化できる。
【００８１】
次に、マルチモード光ファイバー８０の受光位置調整方法について説明する。
【００８２】
図１１は、実際に測定を行っているときの光検出器２の状態を示す図である。光検出器２が適正に光を受光するためには、マルチモード光ファイバー８０の受光面が焦点位置にあり、かつ受光面内の所定位置に光が照射されていることが必要である。しかし、ダイクロイックミラー１０１、バンドパスフィルタ６４の切り替えによってレンズ１２で信号光が集光される位置がシフトする。
【００８３】
図１２は、この問題を解決する一方法を示す図である。光学素子を切り替えた後の非測定時において、レンズ１２により信号光が集光する位置近傍に、光位置検出器を挿入する。光位置検出器は光が当たった位置を座標（Ｘ、Ｙ）の情報として出力する。この座標位置がマルチモード光ファイバー８０の受光面の所定位置になるように、受光面駆動装置がマルチモード光ファイバー８０の受光面を駆動する。そして、光位置検出器を外に移動する。
【００８４】
図１３は、この問題を解決する他の方法を示す図である。この方法では、光位置検出器は使用しない。受光面駆動装置がマルチモード光ファイバー８０の受光面をを移動して、光検出器２自身で信号をモニタし、受光強度が一番強くなる位置に位置決めする。この方法は、光学素子を切り替えることによる集光位置のシフト量が僅かな場合、集光位置がマルチモード光ファイバー８０の受光面内に収まっている場合に適用することができる。
【００８５】
〔変形例２〕
図１４は、第１の実施の形態の変形例２を示す図である。この変形例２では、変形例１と同様に測定装置本体と光源部を分離した装置構成であり、変形例１と同様の構成である。従って、第１の実施の形態と同一の部位には同一の符号を付して、基本的な装置構成、及び動作については記述を省略する。
【００８６】
複数のレーザ光源１を含む光源部１５から測定装置本体への光導入部には、フェルール型光学素子４８を用いる。フェルール型光学素子４８は固体であり、入射光を受光して出射光を射出する。これにより測定装置本体の位置で等価的に点光源を生成することができる。
【００８７】
図１５は、フェルール型光学素子４８の構成を示す図である。フェルール型光学素子４８は、平行光ビームを集光レンズ７１で光導波路部分７３の端面に集光し、光導波路部分７３に光を通し、コリメートレンズ７２を通して、出射光を平行光とする。すなわち、フェルール型光学素子４８を出射したレーザ光は平行ビームとなる。
【００８８】
図１４に示すように、レーザ光源１から出たビームは合成されて測定装置本体に具備された光入力ポートに設置されたフェルール型光学素子４８から導入される。フェルール型光学素子４８から出射したビームは質の高いコリメート光となって、ビームエキスパンド機能により拡幅され、ダイクロイックミラー８２に導かれ、対物レンズ１０を介して試料を励起照射する。
【００８９】
フェルール型光学素子４８からの出射ビーム径は光導波路部分７３の直径がモードフィールド径となっているので、点光源とみなすことができる。従って、フェルール型光学素子４８のコリメートレンズ７２から出射される光ビームはコリメート光となる。また、フェルール型光学素子４８のコリメートレンズ７２の焦点距離を変えることにより、出射光を所望のビーム径として得ることができる。
【００９０】
また、フェルール型光学素子４８を用いることにより、複数のレーザ光源から発せられた光ビームを合成したときに各波長のビームを一つにまとめ、小型の光学系を構成することもできる。このとき、出射光はモードフィールド径から出た出射光となり、これをコリメートすることにより、高品質のガウシアンビームを得ることができる。
【００９１】
また、変形例１と同様に、光学調整（レーザビームのカップリング）を行なう場合、光ファイバーの前後で行なえば良いので、切り分けて行なうことができる。さらに、本実施例ではファイバ（導波路）を伝播する距離が短いので、ビームの偏光の回転を抑えることができる。
【００９２】
図１６はフェルール型光学素子４８の断面図である。フェルール型光学素子４８のほぼ中央に光透過性の優れたケイ酸塩ガラスからなる光導波路部分６１を有し、その周辺を屈折率の大きな材質６２（例えばＳｉＯ２−ＴｉＯ２−ＣａＯ−Ｎａ２Ｏ）で覆い、さらに全体を保護部材６３で覆っている。
【００９３】
光導波路部分６１の材質は、石英でもよい。光導波路部分６１の断面寸法は直径２〜５マイクロメートルほどであり、使用する波長の光をシングルモードで伝播するモードフィールド径になっていることが望ましい。その周辺を覆う屈折率の大きな材質６２は断面直径１００〜２００マイクロメートルくらいである。さらにそれらの周囲を覆う保護部材６３は外形直径１．２５〜２．５ｍｍ程度となっている。保護部材６３の材質は例えばアルミナ、ジルコニアなどのセラミック、あるいは金属（例えばアルミニウム）でもよい。
【００９４】
このフェルール型光学素子４８は光透過性を良くするため、円柱状の両端面は鏡面に研磨されている。このフェルール型光学素子４８の長さは１から１００ｍｍとなっている。長さは小型化を目的とするときは長さ１０ｍｍほどとする。フェルール型光学素子４８の光導波路部分７３の長さは１から１００ｍｍとなっている。さらに望ましくは１０から３０ｍｍ、より望ましくは１５から２５ｍｍとする。
【００９５】
このフェルール型光学素子４８は単なる部品として、装置に組み込んで使用してもよいが、ほかの光学系と調整が必要であり、図１５のように、集光レンズ７１と組み合わせて使用すると効果的であり、さらに光導波路部分７３から出射した光は固有のＮＡを持つ拡散光となるため、コリメートレンズ７２と組み合わせて調整する。
【００９６】
フェルール型光学素子４８の集光レンズ７１の焦点位置にフェルール型光学素子４８の光導波路部分７３端面を一致させ、コリメートレンズ７２の焦点位置にフェルール型光学素子４８の出射側端面を合わせ込む。それぞれの焦点距離を選択することにより、フェルール型光学素子４８はビーム径を拡大するビームエキスパンダと同様の機能を発揮する。
【００９７】
図１７は、フェルール型光学素子４８の他の実施例を示す図である。図１７のフェルール型光学素子４８はフェルール型光学素子４８と異なり、端面は入射面、出射面ともにフェルール型光学素子４８の光導波路部分７３の光軸に対して傾き角度を設け、両端面が平行になるように表面を研磨している。光軸に対する傾き角度は８２度である。即ち、光軸に対して垂直な面に対する傾き角は８度である。フェルール型光学素子４８の端面をこのように傾けることにより、フェルール型光学素子４８の光導波路部分７３の端面での鏡面反射光が光源に戻り光となって、光源の光強度安定性を低下させることを防ぐことができる。
【００９８】
フェルール型光学素子４９の端面の光軸に対する傾き角は８度に限ることはない。フェルール型光学素子４９の光導波路部分７３の端面の有効な傾き角の範囲は、光軸に対して０度から１０度である。より望ましくは光軸に対して６度から１０度、さらに望ましくは７度から９度である。
【００９９】
さらに、フェルール型光学素子４８も偏光維持特性をもつ構造を採用することにより、偏光を用いても、その偏光特性を出射後も維持することができる。
【０１００】
レーザ光を拡大し、平行ビームとするために、通常はビームエキスパンダーなどが用いられていたが、本発明によるビーム整形光学素子を用いることにより、収差などを軽減することができる。また、光学系が簡単になり、光軸調整などの手間や時間を低減することができる。
【０１０１】
次に、本光測定装置の動作について説明する。この動作は、コンピュータ１４が自動的に装置を制御する。
【０１０２】
１．ユーザが測定装置の起動をコンピュータ１４に入力すると、コンピュータ１４は、測定装置のメイン電源を投入する。
【０１０３】
２．ユーザが測定項目を設定すると、コンピュータ１４は、予め定められたテーブルに従い、測定装置内の各光学素子の組み合わせを選定する。また、コンピュータ１４は、使用するレーザを選定する。
【０１０４】
３．コンピュータ１４は、光位置検出器の電源をＯＮする。以降は、測定装置の動作プログラムに従って、光位置検出器の電源のオン、オフを制御する。
【０１０５】
４．コンピュータ１４は、試料ステージを初期位置に移動する。
【０１０６】
５．コンピュータ１４は、各光学素子を原点位置に移動する。コンピュータ１４は、光位置検出器の出力信号をモニタしながら、各種光学素子や試料ステージなどの出力最大値によって原点位置を割り出し、これから外れていた場合、ステッピング・モータを駆動調整して原点位置に合わせる。
【０１０７】
６．ユーザは、試料容器としてマイクロプレートに試料をセットする。そして、このマイクロプレートを試料ステージに載置する。
【０１０８】
７．コンピュータ１４は、対物レンズのＸＹ位置を調整する。即ち、コンピュータ１４は、試料ステージを移動させ、対物レンズが測定対象のウェルの直下に位置するように試料ステージの水平位置を調整する。
【０１０９】
８．コンピュータ１４は、液浸水供給機構電源をＯＮとして、対物レンズの上面に液浸水を満たす。
【０１１０】
９．コンピュータ１４は、測定に用いるレーザ電源をＯＮする。そして、対物レンズを通してウエル内の試料溶液内にフォーカスを合わせて光源からの光を照射する。
【０１１１】
１０．コンピュータ１４は、シャッターの初期設定を行う。
【０１１２】
１１．コンピュータ１４は、対物レンズのフォーカス位置を調整する。即ち、対物レンズＺ軸調整機構を調整し、光スポットの試料内での位置を調整する。
【０１１３】
１２．測定項目に応じて、偏光素子のＯＮ／ＯＦＦ、光走査機構電源のＯＮ／ＯＦＦを制御する。
【０１１４】
１３．コンピュータ１４は、光検出装置による各光学素子の位置調整を行う。試料から発せられる蛍光信号を光検出器で検出しながら、信号光が通過する光路内の光学素子を光軸方向、Ｘ−Ｙ軸方向（水平方向）にそれぞれ位置調整し、各光学素子の配置を最適化する。
【０１１５】
１４．コンピュータ１４は、光源光の強度を調整する。試料から発せられる蛍光信号を光検出器で検出しながら、レーザ光源の駆動電流を調整する。
【０１１６】
１５．光学素子全ての位置調整が終了すると、コンピュータ１４は指令により、光位置検出器の電源を切る。
【０１１７】
１６、コンピュータ１４は、測定を開始する。
【０１１８】
１７．コンピュータ１４は、測定が終了するとレーザ電源をＯＦＦする。
【０１１９】
１８．コンピュータ１４は、メイン電源をＯＦＦする。
【０１２０】
以上のようにして、本実施の形態に係る測定装置では、自動で測定を進めることができる。なお、試料ステージを駆動して、マイクロプレートの平面位置（Ｘ−Ｙ方向）を移動し、次に測定を行なうマイクロプレートのウェル内の試料に位置合わせを行なうが、このとき、光位置検出器の電源をＯＮし、光検出器の位置調整を再度実施する。また、必要に応じてオペレーターが手動で各光学素子の位置調整を行なっても良い。
【０１２１】
次に、ＦＣＳ測定とＦＩＤＡ測定の切り替えに伴う、測定装置内部の光学素子の切り替え動作について説明する。測定の切り替えに伴って切り替えられる主な光学素子は、ビーム走査機構９である。
【０１２２】
図１８Ａ、図１８Ｂは、ビーム走査機構の切り替え方法を説明する図である。
【０１２３】
図１８Ａは、ＦＣＳ測定でのビーム走査機構９を示す図である。点線で表す光軸に対して、４５度の角度でミラー９０が挿入される。この配置では、レーザビームは、対物レンズ１０の光軸上で焦点を結ぶ。対物レンズ１０の使い方として、その光学的な特性（明るさ、収差）を最も有効に使うためには、光軸上に焦点を設けることが望ましい。
【０１２４】
図１８Ｂは、ＦＩＤＡ測定でのビーム走査機構９を示す図である。一点鎖線で表す光軸に対して、４５度から少し傾きをもった角度で偏芯回転ミラー４０が設置される。この偏芯回転ミラー４０は、モータ４１と接続されており、モータ４１の回転軸と偏芯回転ミラー４０のミラー面とは垂直ではない。モータ４１の回転運動により、レーザビームの焦点は対物レンズ１０の光軸を中心として回転運動する。
【０１２５】
図１９A、図１９Bは、ビーム走査機構の他の切り替え方法を説明する図である。図１９Aは、ＦＣＳ測定でのビーム走査機構９を示す図である。この構成は、ＦＣＳ測定とＦＩＤＡ測定を図１８Bと同様のビーム走査機構９の構成で共用するものである。但し、図１８Bに示す形態と異なり、モータ４１と回転軸とが、４５度ではない角度で取り付けられている。そのため、偏芯回転ミラー４０が一周回転する間に、偏芯回転ミラー４０が光軸に対して、図１８Aと同一の配置となる回転角度が存在する。図１９Aは、この状態を示している。そこで、この回転角度を記憶しておき、ＦＣＳ測定に切り替えられたときは、この回転角度になるように偏芯回転ミラー４０を回転させる。
【０１２６】
図１９Bは、ＦＩＤＡ測定でのビーム走査機構９を示す図である。このビーム走査機構９は、図１９Aと同じ構成である。上記偏芯回転ミラー４０をそのまま回転させると、図に示すように、レーザビームの焦点は対物レンズ１０の光軸の周囲を回転する。
【０１２７】
続いて、ＦＣＳ測定に切り替えたときの、本光測定装置の動作について説明する。この動作は、コンピュータ１４が自動的に装置を制御する。
【０１２８】
１．ユーザが測定装置の起動をコンピュータ１４に入力すると、コンピュータ１４は、測定装置のメイン電源を投入
２．ユーザがＦＣＳ測定を設定すると、コンピュータ１４は、予め定められたテーブルに従い、測定装置内の各光学素子の組み合わせを選定。使用するレーザを選定する。
【０１２９】
３．コンピュータ１４は、光位置検出器の電源をＯＮする。以降は、測定装置の動作プログラムにより、光位置検出器の電源のオン、オフを制御する。
【０１３０】
４．コンピュータ１４は、試料ステージを初期位置に移動する。
【０１３１】
５．光位置検出器による各光学素子位置調整。試料から発せられる蛍光信号を光強度モニタ 用の光検出器で検出しながら、信号光が通過する光路内の光学素子を光軸方向、Ｘ−Ｙ軸方 向（水平方向）にそれぞれ位置調整し、各光学素子の配置を最適化する。
【０１３２】
６．ユーザは、試料容器としてマイクロプレートに試料をセットする。そして、このマイクロプレートを試料ステージに載置する。
【０１３３】
７．コンピュータ１４は、液浸水供給機構電源をＯＮとして、対物レンズの上面に液浸水を満たす。
【０１３４】
８．コンピュータ１４は、測定に用いるレーザ電源をＯＮする。光源からの光は、対物レンズを通してウエル内の試料溶液内にフォーカスを合わせる。
【０１３５】
９．コンピュータ１４は、光走査機構の電源をＯＦＦする。光走査機構を停止させ、光ビームが試料内での所望の位置に来るように調整する。
【０１３６】
１０．コンピュータ１４は、光源光の強度を調整する。試料から発せられる蛍光信号を光 検出器で検出しながら、レーザ光源の駆動電流を調整する。
【０１３７】
１１．コンピュータ１４は、関連する光学素子、ダイクロイックミラー１０１、バリアフィルタ６４、ピンホール５２など関連する光学素子全ての位置調整が終了すると、コンピュ ータ１４は指令により、光位置検出器の電源を切る。
【０１３８】
１２、コンピュータ１４は、測定を開始する。
【０１３９】
１３．コンピュータ１４は、測定が終了するとレーザ電源をＯＦＦする。
【０１４０】
１４．コンピュータ１４は、メイン電源をＯＦＦする。
【０１４１】
続いて、ＦＩＤＡ測定に切り替えたときの、本光測定装置の動作について説明する。この動作は、ＦＣＳ測定の動作と同様であるので、主として異なる動作について記載する。
【０１４２】
１．ユーザが測定装置の起動をコンピュータ１４に入力すると、コンピュータ１４は、測定装置のメイン電源を投入
２．ユーザがＦＩＤＡ測定を設定すると、コンピュータ１４は、予め定められたテーブルに従い、測定装置内の各光学素子の組み合わせを選定。使用するレーザを選定する。この際、ＦＩＤＡ偏光測定が選択されていた場合は、偏光素子ホルダ２８を動作させて、偏光板を光路中に挿入する。
【０１４３】
３．乃至８．はＦＣＳ測定時と同一。
【０１４４】
９．コンピュータ１４は、光走査機構の電源をＯＮし、光ビームが試料内での所望の位置で走査するように調整する。
【０１４５】
１０．乃至１４．は、ＦＣＳ測定時と同一
以上説明した、実施の形態によれば測定装置の基本構成を変えることなく、また、光学素子の切り替えなどによるだけで、さまざまな試料の動的な光解析方法を迅速に、しかも効率良く行なうことができる。
【０１４６】
なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明は測定装置の基本構成を変えることなく、種々の試料の動的な光解析方法を迅速にかつ効率良く行なうことができる光測定装置を製造する産業に広く利用することができる。
【符号の説明】
【０１４８】
１…レーザ光源、２…光検出器、３…ダイクロイックミラー、７…光量モニタ機構、９…ビーム走査機構、１１…液浸水供給機構、１４…コンピュータ、１５…光源部、１６…光検出部、２０…マイクロプレート、２４…シングルモード光ファイバー、２８…偏光素子ホルダー、３６…回転式NDフィルタ、４０…偏芯回転ミラー、４１…モータ、４５…バリアフィルタ、４７…シングルモード光ファイバー、４８…フェルール型光学素子、８０…マルチモード光ファイバー、９０…ミラー、１０２…ビームシフタ。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、所望の分子に蛍光物質を標識した生物学的な試料溶液中に光を照射し、蛍光物質から発せられた蛍光の強度の時間的な変化を解析して、試料分子の統計的な性質を求めることで、試料分子の反応や反応による状態変化を測定する光測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年の光を用いた測定技術の進歩に伴い、生体の細胞内外に極めて小さな光スポットを形成し、細胞内外の分子の挙動を動的に調べる方法が注目されている。例えば、蛍光物質を細胞内のターゲットとする生体分子に標識し、蛍光物質から発せられる蛍光の強度の時間的な変化を解析することにより、分子の溶液中での振舞いを高感度に捉えることができる。
【０００３】
このような解析方法として、蛍光相関分光解析法（Fluorescence Correlation Spectroscopy : FCS）や蛍光強度分布解析法（Fluorescence Intensity Distribution Analysis : FIDA）等が良く用いられている。
【０００４】
ＦＣＳでは、測定したい分子に蛍光物質を標識し、マイクロプレートなど試料容器内に収納する。そして試料容器の試料槽の中にレーザ光を微小な光スポットとして照射して、蛍光物質を励起する。このとき蛍光物質から発せられる蛍光の強度は時間と共にゆらぐ。これは、媒質中の蛍光分子がブラウン運動をしているためである。蛍光分子のブラウン運動の拡散速度は、分子の化学反応や結合反応などにより変化する。従って、蛍光分子の拡散速度は、標識した蛍光分子の見かけの大きさの変化や媒質の温度の変化に伴って変化する。
【０００５】
そこでこの分子の溶液内での化学反応や結合反応などによるブラウン運動の速度の変化を、蛍光の光強度の時系列信号の統計的な変化として捉えて相関解析を行なうことで、分子や微粒子の並進拡散係数や、平均の分子数などを測定することができる。そして、測定結果として分子の化学反応や結合反応などを動的に捉えることができる。
【０００６】
ＦＣＳについては、たとえば非特許文献１、２に解説が掲載され、特許文献１、２、３にＦＣＳに関する技術が開示されている。
【０００７】
ＦＩＤＡでは、ＦＣＳと同様に測定したい分子に蛍光物質を標識し、マイクロプレートなど試料容器の試料槽の中にレーザ光を微小な光スポットとして照射して、蛍光物質を励起する。そして、単位時間当たりに蛍光物質から発せられる蛍光の光強度を測定し、これの統計分布を解析する。単位時間に検出される蛍光の光子の数の統計分布を解析することによって、蛍光分子の明るさと濃度、即ち、対象とする分子の数と明るさについての情報を得ることができる。この明るさに関する情報を用いることにより、化学反応や結合反応などによる蛍光標識された分子の見かけの大きさの変化を高感度で検出することができる。
【０００８】
さらに偏光を用いたＦＩＤＡ-Polarization（Fluorescence Intensity Distribution Analysis-Polarization）も行なうことができ、回転ブラウン運動を行なう分子の数や分子の見かけの大きさの変化を調べることができる。
【０００９】
さらにＦＩＤＡでは、溶液中で光の照射領域を積極的に移動させて、試料中のできるだけ広い領域で測定を行ない、１回当たりの測定時間を短縮させることもできる。なお、ＦＩＤＡは光強度の統計分布を求めるためにＦＣＳに比べて光照射領域を大きめにとる必要がある。
【００１０】
ＦＩＤＡについては、Ｐｅｅｔ Ｋａｓｋ，Ｋａｕｐｏ Ｐａｌｏ，ＤｉｒｋＵｌｌｍａ ｎｎ ａｎｄ Ｋａｒｓｔｅｎ Ｇａｌｌ ＰＮＡｓ Ｎｏｖ２３， １９９９，ｖｏｌ． ９６，Ｎｏ．２４，ｐ．１３７５６−１３７６１，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａ ｌ Ｖｏｌ．７９，（２０００）ｐ．２８５８−２８６６，米国特許第６，３７６，８４３ 号に記述されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、生物試料の動的特性を光学的に調べるに際し、ＦＣＳ、ＦＩＤＡを同時に、または順次測定しようとする場合、煩雑で手間がかかると共に、広い作業スペースも必要 となっていた。ＦＣＳを用いる場合とＦＩＤＡを用いる場合とでは、測定装置内に配置され る光学素子などの組み合わせが異なるために、それぞれの測定を行う毎に光学素子を入れ替 えたり、あるいは測定に特化した異なる複数の測定装置を設けて並行した測定を行なわなければならない。
【００１２】
更に１つの測定装置で、ＦＣＳやＦＩＤＡといった異なる測定項目について測定を行なおうとする場合、レンズやフィルタなどの光学素子を入れ替えた後に、再び光軸の調整を行なう必要があり、煩雑であると共に手間と時間を要していた。
【００１３】
本発明は係る事情に鑑みてなされたものであって、同一の測定装置で異なる測定項目についての測定を行う場合であっても、測定装置の基本構成を変えることなく、種々の試料の動的な光解析を迅速にかつ効率良く行なうことができる光測定装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明における光測定装置は、レーザ光源と、対物レンズと、光検出器と、試料容器と、光学素子と、前記レーザ光源と前記試料容器との間の光路上に配置され、偏芯回転ミラーと 前記偏芯回転ミラーを回転させるモーターとにより構成されるビーム走査機構と、制御信号を発生し、前記ビーム走査機構の駆動制御を行なうビーム走査機構制御部と、を備え、前記試料容器に保持された溶液中の生物学的試料の物理的性質について複数種類の測定項目に対応した測定を行なう光測定装置であって、前記ビーム走査機構は前記ビーム走査機構制御部より前記制御信号を受信して、ＦＩＤＡ(Fluorescence Intensity Distribution Analysis) 測定を行なう場合は、前記偏芯回転ミラーを回転させてレーザ光の集光スポットを前記試料容器に保持された溶液内のフォーカス位置で略楕円状に光走査し、ＦＣＳ(Fluorescence Co rrelation Spectroscopy)測定を行なう場合は、光軸を通った光が前記対物レンズを光軸に沿って通過する向きに前記偏芯回転ミラーのミラー面を固定し、前記光軸を通った光が前記 溶液内でコンフォーカル照明を行う。
【発明の効果】
【００１５】
従って、本発明の光測定装置によれば、測定装置の基本構成を変えることなく、さまざまな試料の動的な光解析を迅速にかつ効率良く行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】光測定装置の基本的な構成を示す図。
【図２】ビームシフタを示す図。
【図３】ダイクロイックミラー保持部材を示す図。
【図４】液浸水の自動給排液機構を示す図。
【図５】ピンホールホルダー等を示すフロー図。
【図６】バリア・フィルタ支持基板とバリア・フィルタ回転機構を示す図。
【図７】測定中の光検出器の状態を示す図。
【図８】問題を解決する方法を示す図。
【図９】問題を解決する他の方法を示す図。
【図１０】第１の実施の形態の変形例を示す図。
【図１１】測定中の光検出器の状態を示す図。
【図１２】問題を解決する方法を示す図。
【図１３】問題を解決する他の方法を示す図。
【図１４】第１の実施の形態の他の変形例を示す図。
【図１５】フェルール型光学素子の構成を示す図。
【図１６】フェルール型光学素子の断面図。
【図１７】フェルール型光学素子の他の実施例を示す図。
【図１８Ａ】ビーム走査機構の切り替え方法を説明する図。
【図１８Ｂ】ビーム走査機構の切り替え方法を説明する図。
【図１９Ａ】ビーム走査機構の他の切り替え方法を説明する図。
【図１９Ｂ】ビーム走査機構の他の切り替え方法を説明する図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［第１の実施の形態］
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を詳細に説明する。
【００１８】
図１は光測定装置の基本的な構成図である。
【００１９】
本発明による光測定装置は、主な構成部として、光源部１５、光量モニタ機構７、ビーム走査機構９、対物レンズ１０、液浸水供給機構１１、試料保持機構１８、光検出部１６及び信号処理部１７を備えている。
【００２０】
以下、光測定装置の詳細の構成と動作について説明する。
【００２１】
光源部１５には、レーザ光源１、シャッター２３、ビーム径可変機構５、回転式ＮＤフィルタ３６、ビームシフタ１０２、ミラー１００及びダイクロイックミラー３が設けられている。
【００２２】
光源部１５には３種類のレーザ光源１が載置されている。本実施の形態では、ヘリウムネオン・レーザ（発振出力１ｍＷ、波長：５４３ｎｍ）、 ヘリウムネオン・レーザ（発振出力２ｍＷ、波長：６３３ｎｍ）、およびアルゴン・レーザ（発振出力１０ｍＷ、波長：４８８ｎｍ）が設けられている。
【００２３】
光源として用いるレーザはパルスレーザであっても良い。例えば、ＣＷモード同期アルゴンイオン・レーザを用いると、波長５１４．５ｎｍ、平均出力１００ｍＷ、パルス幅２００ピコ秒のレーザパルスを得ることができる。
【００２４】
また、音響光学チューナブルフィルタ（ＡＯＴＦ）を搭載したマルチラインのレーザも載置可能である。マルチラインのレーザには、複数の波長のレーザ光が含まれているため、ＡＯＴＦによって発振波長の切り替えを行なうように構成することで、載置するレーザの台数を減少することができる。
【００２５】
各レーザ光源１の出射端近傍にはシャッター２３がそれぞれ設置されており、シャッター２３はそれぞれ電子制御により開閉される機構（図示せず）になっている。出射されたレーザ光はレンズを組み合わせたビーム径可変機構５でビーム直径を拡大され、平行光にされる。ビーム径可変機構５を構成するレンズの組み合わせを変えることで、焦点距離を変えて射出ビーム直径を調整することができる。
【００２６】
それぞれ平行光とされたレーザ光は各々の光路に用意された回転式ＮＤ（Neutral Density）フィルタ３６、ビームシフタ１０２を通過した後、ミラー１００、ダイクロイックミラー３で選択的に反射、または透過される。そして、３つのレーザ光源１からの光路は１つの光路にまとめられる。３つの光路を同一の光路にまとめる操作は、ビームシフタ１０２を調整することで行われる。
【００２７】
ビーム走査機構９にはビーム走査機構制御部９９が接続されている。ビーム走査機構制御部９９は制御信号を発し、ビーム走査機構９の配置及び動作を制御する。即ち、ビーム走査機構９の稼動／非稼動状態を切替える。さらにビーム走査機構９を構成する偏芯回転ミラー４０の回転角をＦＩＤＡ測定、ＦＣＳ測定などの測定条件に対応して制御する。
【００２８】
図２は、ビームシフタ１０２を示す図である。ビームシフタ１０２は、所定の厚さを持つガラス板が２軸の自由度で動く構造を備えている。ビームシフタ１０２の調整は、後に示す光量モニタ機構７の光検出器５３の検知出力が最大になるようにガラス板を２軸を中心として回転することにより行なう。またこの調整は、光検出器５３の検知出力をコンピュータ１４に入力して、コンピュータ１４からの制御出力に基づいて、ガラス板の２軸を駆動することでも可能である（駆動機構は図示していない）。
【００２９】
ビームシフタ１０２の調整によってレーザ光源１からのレーザビームは１つのビームにされ、ミラー４で方向を曲げられ、偏光素子ホルダー２８に到達する。偏光素子ホルダー２８はスライド式の板状構造となっており、通常２箇所の円形の偏光素子保持枠が設けられている。一方の保持枠に円形の偏光素子が配置されており、もう一方は空隙になっている。そして、この偏光素子ホルダー２８に取り付けられた偏光素子ホルダー駆動部３９によって偏光素子ホルダー２８をスライドさせることにより、必要に応じて偏光素子が光路上に設置されるようになっている。
【００３０】
この偏光素子ホルダー駆動部３９によるスライド調整は、ステッピングモータを用いた制御装置により行なわれる（図示せず）。光測定装置を用いて偏光測定を行なう場合は、偏光素子ホルダー２８に偏光素子が設置され、光路上に偏光素子が載置される。偏光測定を行わない場合は光路上には偏光素子は存しない。なお、偏光素子ホルダー２８は円板状であっても良い。あるいは円板の周囲に複数の偏光素子を載置し、偏光素子ホルダー２８を回転させることで、偏光素子を切り替えて用いても良い。
【００３１】
偏光素子ホルダー２８に配置する偏光素子には、例えばシート状の偏光板を用いることができる。しかし偏光板に限ることなく、例えばグラントムソン・プリズム（Ｇｌａｎ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ Ｐｒｉｓｍ）などの消光比の高い偏光素子を用いると、さらに精度の高い偏光測定を行なうことができる。
【００３２】
レーザビームは、偏光素子ホルダー２８を通過後、円板状のハーフミラー６に入射する。そして、レーザビームの一部はハーフミラー６で反射されて光量モニタ機構７に入る。光量モニタ機構７はレンズ５１、ピンホール２２０、光検出器５３を備え、レーザビームはこれらの光学素子を通って光検出器５３の受光面に集光する。光検出器５３は半導体光検出器を用いる。
【００３３】
光検出器５３の検知出力は、コンピュータ１４に入力され、コンピュータ１４は、この値に基づいて、あらかじめ設定した光源出力光強度になるように、レーザ駆動電源（図示しない）の駆動電流を制御する。あるいは回転式ＮＤフィルタ３６をコンピュータ１４が制御（図示しない）することで、レーザ光源１からの光出力強度を調整することもできる。
【００３４】
ハーフミラー６を通過したレーザビームは偏芯回転ミラー４０に達する。このとき偏芯回転ミラー４０は回転に伴って反射光の方向が中心軸の周りに回転運動するように傾いて調整されている。そのため、レーザビームは対物レンズ１０の光軸に対して、ある傾き角を持って入射する。偏芯回転ミラー４０をモータ４１で回転させることで、対物レンズ１０を通過した光ビームの集光スポットは試料内で略楕円状に走査される。なお、集光スポットを走査させるのは、ＦＩＤＡ測定を行なう場合であり、ＦＣＳ測定を行なう場合には集光スポットは固定される。具体的には、ビーム走査機構制御部９９から制御信号が発生し、ビーム走査機構９を稼動状態として偏芯回転ミラー４０を測定条件に対応した所定の角度だけ回転させ、停止させる。これにより、光源から発せられたレーザ光は光軸に沿って進み、対物レンズを通って、試料内でコンフォーカル照明を行う。
【００３５】
即ち、ＦＩＤＡ測定を行なう場合は、モータ４１を回転させ、それに伴って偏芯回転ミラー４０が回転運動を行ない、光軸を通った光は対物レンズを通って溶液内のフォーカス位置で略楕円を描きながら試料を光照射する。
【００３６】
ＦＣＳ測定を行なう場合は、コンピュータ制御によりモータ４１を停止し、偏芯回転ミラー４０を適切な位置で固定する。このとき、偏芯回転ミラー４０のミラー面の向きは光軸を通った光が対物レンズを光軸に沿って通過する向きに設定されるようにあらかじめモータ４１の停止位置はビーム走査機構制御部９９により、決められている。
【００３７】
また、ＦＣＳ測定の場合に、偏芯回転ミラー４０とは別の、光軸に対して偏芯していないミラー９０に切り替えるようにしても良い。
【００３８】
レーザ光は続いて切り替え式ダイクロイックミラー１０１で反射され、対物レンズ１０に入射する。対物レンズ１０として、例えば×４０水浸対物レンズ（ＮＡ１．１５）を用いる。対物レンズ１０は補正環が無いドライタイプを用いても良いし、あるいは液浸タイプで補正環を具備しているものを用いてもよい。
【００３９】
この切り替え式ダイクロイックミラー１０１は円板状のガラス板の表面に多層膜コーティングを施して、透過、反射のスペクトル特性が最適になるように製作されている。切り替え式ダイクロイックミラー１０１としては円板状に限らず、プリズムタイプのものを用いても良い。また切り替え式ダイクロイックミラー１０１は裏面反射によるノイズ光が信号光に混入するのを防ぐため、基板となるガラスの厚さを最適に調整してあるものを用いる。
【００４０】
この切り替え式ダイクロイックミラー１０１は光源としてのレーザ光と試料から発せられた蛍光信号を分離する役割がある。測定に用いる波長を変更するときは、透過、反射特性の異なる複数個のダイクロイックミラー１０１の内から最適なものを選択して切り替えて用いる。
【００４１】
図３は、ダイクロイックミラーの切り替えに使用するダイクロイックミラー保持部材を示す図である。
【００４２】
図３に示すダイクロイックミラー保持部材５８は、複数の円形のダイクロイックミラー１０１が横方向に一列に搭載されたスライド式の構造であるが、レボルバーやターレットに搭載された回転式のものを用いても良い。ダイクロイックミラー保持部材５８はアルミニュームのような金属を用いる。ここでダイクロイックミラー１０１の形状は円形に限らず、正方形や長方形でも良い。また、切り替え式ダイクロイックミラー１０１の代わりに音響光学素子（ＡＯＴＦ）を用いて、透過光と反射光の波長を選択しても良い。
【００４３】
試料を収容する試料容器にはマイクロプレート２０（９６，３８４穴など）を用いる。マイクロプレート２０は樹脂、あるいはガラス製であり、図１に示すように同一形状のウェル２２（試料を収容する溝）が多数並んで配列されている。マイクロプレート２０のウェル２２部分の底面は、ガラス、アクリル樹脂などの光学的に透明な材質で形成されており、対物レンズ１０を通過した光が殆んど減衰することなく、ウェル２２内に収容された試料に入射するようになっている。
【００４４】
図４は、液浸タイプの対物レンズを用いるときに必要な液浸水の自動給排液機構２１を示す図である。試料ステージ１９にマイクロプレート２０を載置し、クリップなどの固定具でマイクロプレート２０を試料ステージ１９に固定する。
【００４５】
対物レンズ１０はマイクロプレート２０の底面に向かうように倒立させて配置する。対物レンズ１０先端部に給液ボトル５６に浸されたチューブ１０３を介して先端部のノズル１０４により液浸水を滴下し、対物レンズ１０の先端部とマイクロプレート２０底面の間を液浸水で満たす。液浸水がこぼれたり、あふれたりした場合は対物レンズ１０の周囲に配設された液浸水保持プレート５５で保持する。
【００４６】
一方、測定中に対物レンズ１０の上面に保持された液浸水が無くなった場合、この情報をコンピュータ１４にフィードバックして、給液ボトル５６内の液浸水をポンプ駆動により自動的に対物レンズ１０先端部に給液する。測定終了後、自然に液浸水は乾燥するが、必要以上に給液されたものは、廃液ボトル５７に自然に落下するようになっている。またはノズル１０４により吸引し、切替機構（不図示）により切り替えて、廃液ボトル５７へ導入する廃液機構とすることも可能である。
【００４７】
なお、自動給排液機構２１による給排液は水に限らず、オイルでも良い。マイクロプレート２０を試料容器として用いて観察、測定する場合は通常、数多くのウェル２２内に試料を収容し、試料ステージ１９を駆動して位置調整を行ない、それぞれの試料について測定、あるいは観察を行なう。
【００４８】
試料ステージ１９にはＸ軸、Ｙ軸方向に沿ってステッピングモータ（図示しない）が取り付けられており、マイクロプレート２０を精密に水平方向（Ｘ−Ｙ軸方向）に移動させることができる。そして試料ステージ１９をＸＹ平面内で作動させて、マイクロプレート２０を移動調整しながら、順次測定を繰り返し行なう。
【００４９】
また対物レンズ１０の周囲には対物レンズＺ軸保持機構４３が具備されており、コンピュータの指令により、対物レンズＺ軸保持機構４３を光軸方向（Ｚ軸方向）に移動させる。すなわち、ウエル２２内でのレーザ光のフォーカス位置を光軸方向に沿って上下動させることができる。
【００５０】
レーザ光は対物レンズ１０を通って集光されたあと、試料を収容したマイクロプレート２０のウェル２２内で極めて微小な光スポットを形成する。レーザ光の集光位置は水平方向（Ｘ−Ｙ軸方向）についてはウエルの中央部分、垂直方向（Ｚ軸）については、試料内のほぼ中央部分となっている。このとき、ウェル２２内で得られるレーザ光の共焦点領域の大きさは直径０．６μｍ程度、長さ２μｍ程度の略円筒状の光スポットとなる。
【００５１】
試料に直接ラベルして用いる蛍光物質はそれぞれローダミン・グリーン（ＲｈＧ）、ＴＡＭＲＡ、Ａｌｅｘａ６４７であり、ローダミン・グリーン（ＲｈＧ）は波長４８８ｎｍのアルゴンレーザで励起し、ＴＡＭＲＡは波長５４３ｎｍのヘリウム・ネオンレーザで励起し、Ａｌｅｘａ６４７は波長６３３ｎｍのヘリウム・ネオンレーザで励起する。
【００５２】
対物レンズ１０で集光されたレーザ光はウエル２２内で試料内の蛍光分子を励起し、蛍光分子から蛍光が発せられる。この蛍光は再び信号光として対物レンズ１０に取り込まれ、続いて切り替え式ダイクロイックミラー１０１に到達する。信号光の波長は入射レーザ光の波長より長く、そのため切り替え式ダイクロイックミラー１０１を透過して、反射プリズム２００で反射され、レンズ２１０でレンズ２１０の後方に配置されたピンホール２２０のピンホール面に集光される。
【００５３】
対物レンズ１０の焦点位置と共役な光軸上の位置にピンホール２２０が位置決めされるようにピンホールホルダー５０が配置されている。ピンホールホルダー５０は、図５（ａ）に示すようにピンホール直径が異なる複数のピンホールが一列に並んだスライド式になっており、必要な共焦点領域（光スポット領域）の大きさに合わせて、最適なピンホールが配置されるように調整される。あるいは図５（ｂ）に示すように切り欠きを有する板状部材を２枚、切り欠き部が互いに向かい合うように配置し、板状部材の互いの間隔を変化させ、中央部にできる矩形の枠の大きさを連続的に変化させる構成であってもよい。
【００５４】
ピンホール２２０の手前にバリア・フィルタ４５が配置されている。バリア・フィルタ４５は蛍光の発光スペクトルに合わせて、透過光のスペクトルが調整されるようになっている。すなわち、バンドパスフィルタとなっており、信号光となる蛍光の発光スペクトルの波長域の光のみが通過する。これにより、試料容器内で発生する散乱光やウェル２２の壁などから反射して入射光路に戻ってくる入射光の一部などのノイズ光をカットすることができる。蛍光の波長とバックグラウンド光の波長が異なるためノイズ光を遮断できる。なお、バリアフィルタ４５として、音響光学素子によるビームスプリッター（ＡＯＢＳ）を用いても良い。
【００５５】
レンズ２１０の焦点面とピンホール２２０の開口面とが一致するように配置されている。このピンホール２２０には光位置検出器とピンホール駆動装置が取り付けられており（図示しない）、ピンホール２２０はピンホール駆動装置により、Ｘ−Ｙ−Ｚ軸方向に位置調整できるようになっている。従って、レンズ２１０の焦点面にピンホール２２０の開口面を一致させることができる。
【００５６】
また、ピンホール２２０の位置はバリア・フィルタ４５の切り替え、あるいは音響光学素子によるビームスプリッター（ＡＯＢＳ）の切り替えに対して、デフォルト位置に自動的に戻る機構を有している。このピンホール２２０により、ウェル内に形成された光の共焦点領域外からのバックグラウンド光が除去される。
【００５７】
図６は、バリア・フィルタ支持基板５０１とバリア・フィルタ回転機構を示す図である。バリア・フィルタは円板状になっており、図に示すように円板状のバリア・フィルタ支持基板５０１の円周に沿って配置されている。バリア・フィルタ支持基板５０１は、その中心軸の周りに回転するが、このとき、所定位置にあるバリア・フィルタの中心軸は光軸と一致する。
【００５８】
バリア・フィルタ支持基板５０１の中心に回転軸５０２が取り付けられており、この回転軸５０２にはギア５０３−１が取り付けられている。ステッピングモータ５０４の回転軸５０８にはギア５０３−２が取り付けられている。ギア５０３−１とギア５０３−２とのギア比に従って、ステッピングモータ５０４の回転がバリア・フィルタ支持基板５０１に伝えられる。
【００５９】
一方、バリア・フィルタ支持基板５０１の円周面の一角に回転支持板５０５が取り付けられており、フィルタホイール支持台５０６に取り付けられた非接触位置検出器５０７の検出部分５０７−１の溝の間を通過するように構成されている。なお、回転支持板５０５は光学的に不透明な材質、例えば黒色塗布したアルミニューム板を用いる。
【００６０】
非接触位置検出器５０７の溝構造部分５０７−１は赤外発光ダイオードと赤外線光検出器とが互いに向き合って配置されている。検出部分５０７−１の溝の間を回転支持板５０５が通過したときは赤外線が遮られるため、回転支持板５０５が通過したことを検出することができる。なお、この位置はバリア・フィルタ支持基板５０１の初期位置として規定されている。
【００６１】
バリア・フィルタ支持基板５０１が回転した角度は、この回転支持板５０５が初期位置にあるときからのステッピングモータ５０４の回転角により一義的に決められる。即ち、現在の各バリア・フィルタの位置が確定する。従って、各バリア・フィルタの切り替えはステッピングモータ５０４の回転を制御することによって行なわれる。
【００６２】
ここで、非接触位置検出器５０７が回転支持板５０５を検出する方法には光を用いる方法の他に、静電容量の変化を利用する方法や、磁気を用いる方法などがあり、いずれの方法を用いてもよい。なお、バリア・フィルタ支持基板５０１の回転軸はフィルタホイール支持台５０６に回動自在に取り付けられている。
【００６３】
ピンホール２２０を通過した信号光はコリメートレンズ５９により平行光とされてダイクロイックミラー／偏光ビームスプリッター３８により、互いに垂直な２方向に分離される。ダイクロイックミラー／偏光ビームスプリッター３８は、ダイクロイックミラーと偏光ビームスプリッターとを切り替える機構を備えている。この切り替え機構には、例えば、図６に示したような回転機構を用いても良い。２種類の蛍光物質を用いて相互相関測定を行なう場合は、ダイクロイックミラーが自動的に選択されるようになっており、異なる蛍光物質の発光のスペクトに合わせて、反射光、および透過光のスペクトルを規定する。偏光測定を行う場合は、偏光ビームスプリッターが自動的に選択されるようになっており、反射光、および透過光で異なる偏光成分を分離する。分離されたそれぞれの信号光はバンドパスフィルタ６４でそれぞれの励起レーザ光の波長の光を選択的に遮断して、信号光のＳ／Ｎ比を向上させる。
【００６４】
バンドパスフィルタ６４を通過した信号光はレンズ１２により集光されて、光検出器２の受光面に到達する。それぞれの光検出器２には光位置検出器と光検出器駆動装置が取り付けられており、光検出器２の受光面は光検出器駆動装置により、Ｘ−Ｙ−Ｚ軸方向に沿って位置調整できるようになっている。光検出器２は例えばアバランシェ・フォトダイオード（略称：ＡＰＤ）、あるいは光電子増倍管などの微弱光検出器を用いる。光位置検出器は半導体光位置検出器を用いる。
【００６５】
次に、光検出器２の位置調整方法について説明する。
【００６６】
図７は、実際に測定を行っているときの光検出器の状態を示す図である。光検出器２が適正に光を受光するためには、受光面が焦点位置にあり、かつ受光面内の所定位置に光が照射されていることが必要である。しかし、ダイクロイックミラー１０１、バンドパスフィルタ６４の切り替えによってレンズ１２で信号光が集光される位置がシフトする。
【００６７】
図８は、この問題を解決する一方法を示す図である。光学素子を切り替えた後の非測定時において、レンズ１２により信号光が集光する位置近傍に、光位置検出器を挿入する。光位置検出器は光が当たった位置を座標（Ｘ、Ｙ）の情報として出力する。この座標位置が光検出器２の受光面の所定位置になるように、光検出器駆動装置が光検出器２を駆動する。そして、光位置検出器を外に移動する。
【００６８】
図９は、この問題を解決する他の方法を示す図である。この方法では、光位置検出器は使用しない。光検出器駆動装置が光検出器２を移動して、光検出器２自身で信号をモニタし、受光強度が一番強くなる位置に位置決めする。この方法は、光学素子を切り替えることによる集光位置のシフト量が僅かな場合、集光位置が光検出器２の受光面内に収まっている場合に適用することができる。
【００６９】
光検出器２で受光される信号光は微弱光であり、フォトン・パルス信号となっている。光検出器２によって、このフォトン・パルス信号は電気信号（光電流パルス信号）に変換され、増幅されて信号処理装置８に送られる。信号処理装置８によって、この電気パルス信号は波形整形され、ｏｎ−ｏｆｆ電圧パルスとされて、コンピュータ１４に導かれる。この電圧パルスはコンピュータ１４のメモリ（図示しない）に記憶され、続いて相関分光解析、光強度分布解析などの演算が行なわれる。これによって得られた蛍光の強度ゆらぎの自己相関関数、相互相関関数、あるいは光強度分布関数などがコンピュータ１４により計算される。そして、コンピュータ１４の画面上に測定結果（グラフ、またはデータ）が提示され、あるいはコンピュータ１４のメモリ（図示しない）に記憶される。
【００７０】
次にコンピュータ１４による制御動作について説明すると、コンピュータ１４は測定に用いるレーザ光源１を選択し、電源を投入する。また、シャッター駆動電源（図示しない）に働きかけ、必要に応じて、シャッター２３を開閉する。さらに光量モニタ機構７の光検出器５３の出力をモニタして、レーザ光源１の出力光強度が所望のレベルになるように、モータ（不図示）の駆動電流を調整する。これによってモータに取り付けられている円盤状の回転式ＮＤフィルタ３６を必要な角度だけ回転させる。
【００７１】
回転式ＮＤフィルタ３６は円周方向に沿って変化する透過率分布を備えているため、回転によってレーザ光の強度を変化させることができる。なお、回転式ＮＤフィルタ３６は円盤状ではなく、板の長手方向に沿って段階的に透過率が変化する板状のものを用いても良い。板状のＮＤフィルタを用いる場合はスライドして透過光強度を変化させる。位置を制御する方法として、一般的にはＰＩＤ制御（Proportional:比例,Integral:積 分,Differential:微分）を用いるが、その他の制御手法、例えば単純ｏｎ／ｏｆｆ制御により行なってもよい。
【００７２】
本発明による測定装置では、高い開口数の対物レンズ（ＮＡ１．１５）を用いているために、螢光色素分子で標識された細胞内ＤＮＡ、細胞膜などの組織を構成する分子の特性も調べることができる。またＬＢ（Langmuir- Blodgett）膜の揺動運動などについても測定することができる。
【００７３】
また本発明による測定装置を用いて、蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET）を求め、たんぱく質の結合や解離などの状態をリアルタイムで知ることができる。さらに、細胞内カルシウムイオン濃度の定量測定を行なうこともできる。また生体高分子のさまざまな部位間の距離や生体高分子の三次元，四次元構造及びその動的変化も測定することができる。
【００７４】
また、細胞内でカルモジュリン（Calmodulin）にカルシウムイオン（Ｃａ2+）が結合すると活性化されて、カルモジュリンは構造変化を起こす。カルモジュリンの異なる部位にそれぞれ異なる蛍光物質を用いて標識し、一方の螢光物質を励起して、蛍光共鳴エネルギー移動によって得られる、他方の蛍光物質からの蛍光を測定することにより、細胞内でのカルモジュリンの構造変化を知ることができる。
【００７５】
またタンパク質の両端に異なる２種類の蛍光タンパク質、例えば藍色蛍光タンパク質（CFP: cyan fluorescent protein）と黄色蛍光タンパク質（YFP: yellow fluorescent protein）を標識し、タンパク質のリン酸化を測定することができる。タンパク質がリン酸化することによってタンパク質の構造に変化が起こる。この構造変化により双方の蛍光タンパク質が極めて接近する（１０ナノメートル程度以下）とＦＲＥＴが起こる。このＦＲＥＴを測定することによりタンパク質のリン酸化を明らかにすることができる。
【００７６】
また測定装置をそのまま用いて、試料にレーザ光を照射し、試料から発せられる散乱光の強度ゆらぎを測定して相関分光解析を行なうことにより、試料の並進拡散速度などの物理的な性質や結合反応など、種々の反応による形態変化を測定することもできる。さらに試料から発せられるリン光やラマン散乱光についても同様に測定することができる。
【００７７】
〔変形例１〕
図１０は、第１の実施の形態の変形例１を示す図である。この変形例１では測定装置を光源部、測定装置本体部、受光部にそれぞれユニット化し、シングルモード光ファイバー２４、８０を用いて各ユニットを光接続し、測定装置の小型化を図ったものである。光源部と受光部にシングルモード光ファイバー２４，マルチモード光ファイバー８０を用いて光を伝送する以外は、第１の実施の形態と同様の構成である。従って、第１の実施の形態と同一の部位には同一の符号を付して、基本的な装置構成、及び動作については記述を省略する。
【００７８】
測定装置本体から分離した光源部１５に光源１を配置する。各光源１から出射されるレーザビームを光ファイバー受光端子４９に照射する。光ファイバー受光端子４９の受光面でレーザビームを受光し、シングルモード光ファイバー２４を介してレーザビームを効率良く他端に設けたＦＣコネクタ（図示しない）まで導く。なお、シングルモード光ファイバー２４の出力端とコリメートレンズ２５間の距離は、コリメートレンズ２５の焦点距離と一致している。
【００７９】
シングルモード光ファイバー２４を用いて光源から発したレーザ光を測定装置本体に伝送することにより、光源部１５の配置を自由に行なうことができる。特に光源１として出力光強度の大きいレーザを用いる場合、レーザ本体が大型になり、また冷却機構をレーザ本体には取り付けなければならないこともある。この場合、光源１のみを切り離して光源部１５として分離し、シングルモード光ファイバー２４で測定装置に導くことで、設置空間の有効利用や測定装置の小型化に対応できる。さらに光学調整（レーザビームのカップリング）を行なう場合、シングルモード光ファイバー２４の前後で行なえば良いので、切り分けて行なうことができる。
【００８０】
また検出光学系１６では、信号光をマルチモード光ファイバー８０で受光するような構成をとる。マルチモード光ファイバー８０は光検出器２に接続されている。マルチモード光ファイバー８０を用いることで、装置内の光検出器２の配置を自由に行なうことができる。また測定装置を小型化できる。
【００８１】
次に、マルチモード光ファイバー８０の受光位置調整方法について説明する。
【００８２】
図１１は、実際に測定を行っているときの光検出器２の状態を示す図である。光検出器２が適正に光を受光するためには、マルチモード光ファイバー８０の受光面が焦点位置にあり、かつ受光面内の所定位置に光が照射されていることが必要である。しかし、ダイクロイックミラー１０１、バンドパスフィルタ６４の切り替えによってレンズ１２で信号光が集光される位置がシフトする。
【００８３】
図１２は、この問題を解決する一方法を示す図である。光学素子を切り替えた後の非測定時において、レンズ１２により信号光が集光する位置近傍に、光位置検出器を挿入する。光位置検出器は光が当たった位置を座標（Ｘ、Ｙ）の情報として出力する。この座標位置がマルチモード光ファイバー８０の受光面の所定位置になるように、受光面駆動装置がマルチモード光ファイバー８０の受光面を駆動する。そして、光位置検出器を外に移動する。
【００８４】
図１３は、この問題を解決する他の方法を示す図である。この方法では、光位置検出器は使用しない。受光面駆動装置がマルチモード光ファイバー８０の受光面をを移動して、光検出器２自身で信号をモニタし、受光強度が一番強くなる位置に位置決めする。この方法は、光学素子を切り替えることによる集光位置のシフト量が僅かな場合、集光位置がマルチモード光ファイバー８０の受光面内に収まっている場合に適用することができる。
【００８５】
〔変形例２〕
図１４は、第１の実施の形態の変形例２を示す図である。この変形例２では、変形例１と同様に測定装置本体と光源部を分離した装置構成であり、変形例１と同様の構成である。従って、第１の実施の形態と同一の部位には同一の符号を付して、基本的な装置構成、及び動作については記述を省略する。
【００８６】
複数のレーザ光源１を含む光源部１５から測定装置本体への光導入部には、フェルール型光学素子４８を用いる。フェルール型光学素子４８は固体であり、入射光を受光して出射光を射出する。これにより測定装置本体の位置で等価的に点光源を生成することができる。
【００８７】
図１５は、フェルール型光学素子４８の構成を示す図である。フェルール型光学素子４８は、平行光ビームを集光レンズ７１で光導波路部分７３の端面に集光し、光導波路部分７３に光を通し、コリメートレンズ７２を通して、出射光を平行光とする。すなわち、フェルール型光学素子４８を出射したレーザ光は平行ビームとなる。
【００８８】
図１４に示すように、レーザ光源１から出たビームは合成されて測定装置本体に具備された光入力ポートに設置されたフェルール型光学素子４８から導入される。フェルール型光学素子４８から出射したビームは質の高いコリメート光となって、ビームエキスパンド機能により拡幅され、ダイクロイックミラー８２に導かれ、対物レンズ１０を介して試料を励起照射する。
【００８９】
フェルール型光学素子４８からの出射ビーム径は光導波路部分７３の直径がモードフィールド径となっているので、点光源とみなすことができる。従って、フェルール型光学素子４８のコリメートレンズ７２から出射される光ビームはコリメート光となる。また、フェルール型光学素子４８のコリメートレンズ７２の焦点距離を変えることにより、出射光を所望のビーム径として得ることができる。
【００９０】
また、フェルール型光学素子４８を用いることにより、複数のレーザ光源から発せられた光ビームを合成したときに各波長のビームを一つにまとめ、小型の光学系を構成することもできる。このとき、出射光はモードフィールド径から出た出射光となり、これをコリメートすることにより、高品質のガウシアンビームを得ることができる。
【００９１】
また、変形例１と同様に、光学調整（レーザビームのカップリング）を行なう場合、光ファイバーの前後で行なえば良いので、切り分けて行なうことができる。さらに、本実施例ではファイバ（導波路）を伝播する距離が短いので、ビームの偏光の回転を抑えることができる。
【００９２】
図１６はフェルール型光学素子４８の断面図である。フェルール型光学素子４８のほぼ中央に光透過性の優れたケイ酸塩ガラスからなる光導波路部分６１を有し、その周辺を屈折率の大きな材質６２（例えばＳｉＯ２−ＴｉＯ２−ＣａＯ−Ｎａ２Ｏ）で覆い、さらに全体を保護部材６３で覆っている。
【００９３】
光導波路部分６１の材質は、石英でもよい。光導波路部分６１の断面寸法は直径２〜５マイクロメートルほどであり、使用する波長の光をシングルモードで伝播するモードフィールド径になっていることが望ましい。その周辺を覆う屈折率の大きな材質６２は断面直径１００〜２００マイクロメートルくらいである。さらにそれらの周囲を覆う保護部材６３は外形直径１．２５〜２．５ｍｍ程度となっている。保護部材６３の材質は例えばアルミナ、ジルコニアなどのセラミック、あるいは金属（例えばアルミニウム）でもよい。
【００９４】
このフェルール型光学素子４８は光透過性を良くするため、円柱状の両端面は鏡面に研磨されている。このフェルール型光学素子４８の長さは１から１００ｍｍとなっている。長さは小型化を目的とするときは長さ１０ｍｍほどとする。フェルール型光学素子４８の光導波路部分７３の長さは１から１００ｍｍとなっている。さらに望ましくは１０から３０ｍｍ、より望ましくは１５から２５ｍｍとする。
【００９５】
このフェルール型光学素子４８は単なる部品として、装置に組み込んで使用してもよいが、ほかの光学系と調整が必要であり、図１５のように、集光レンズ７１と組み合わせて使用すると効果的であり、さらに光導波路部分７３から出射した光は固有のＮＡを持つ拡散光となるため、コリメートレンズ７２と組み合わせて調整する。
【００９６】
フェルール型光学素子４８の集光レンズ７１の焦点位置にフェルール型光学素子４８の光導波路部分７３端面を一致させ、コリメートレンズ７２の焦点位置にフェルール型光学素子４８の出射側端面を合わせ込む。それぞれの焦点距離を選択することにより、フェルール型光学素子４８はビーム径を拡大するビームエキスパンダと同様の機能を発揮する。
【００９７】
図１７は、フェルール型光学素子４８の他の実施例を示す図である。図１７のフェルール型光学素子４８はフェルール型光学素子４８と異なり、端面は入射面、出射面ともにフェルール型光学素子４８の光導波路部分７３の光軸に対して傾き角度を設け、両端面が平行になるように表面を研磨している。光軸に対する傾き角度は８２度である。即ち、光軸に対して垂直な面に対する傾き角は８度である。フェルール型光学素子４８の端面をこのように傾けることにより、フェルール型光学素子４８の光導波路部分７３の端面での鏡面反射光が光源に戻り光となって、光源の光強度安定性を低下させることを防ぐことができる。
【００９８】
フェルール型光学素子４９の端面の光軸に対する傾き角は８度に限ることはない。フェルール型光学素子４９の光導波路部分７３の端面の有効な傾き角の範囲は、光軸に対して０度から１０度である。より望ましくは光軸に対して６度から１０度、さらに望ましくは７度から９度である。
【００９９】
さらに、フェルール型光学素子４８も偏光維持特性をもつ構造を採用することにより、偏光を用いても、その偏光特性を出射後も維持することができる。
【０１００】
レーザ光を拡大し、平行ビームとするために、通常はビームエキスパンダーなどが用いられていたが、本発明によるビーム整形光学素子を用いることにより、収差などを軽減することができる。また、光学系が簡単になり、光軸調整などの手間や時間を低減することができる。
【０１０１】
次に、本光測定装置の動作について説明する。この動作は、コンピュータ１４が自動的に装置を制御する。
【０１０２】
１．ユーザが測定装置の起動をコンピュータ１４に入力すると、コンピュータ１４は、測定装置のメイン電源を投入する。
【０１０３】
２．ユーザが測定項目を設定すると、コンピュータ１４は、予め定められたテーブルに従い、測定装置内の各光学素子の組み合わせを選定する。また、コンピュータ１４は、使用するレーザを選定する。
【０１０４】
３．コンピュータ１４は、光位置検出器の電源をＯＮする。以降は、測定装置の動作プログラムに従って、光位置検出器の電源のオン、オフを制御する。
【０１０５】
４．コンピュータ１４は、試料ステージを初期位置に移動する。
【０１０６】
５．コンピュータ１４は、各光学素子を原点位置に移動する。コンピュータ１４は、光位置検出器の出力信号をモニタしながら、各種光学素子や試料ステージなどの出力最大値によって原点位置を割り出し、これから外れていた場合、ステッピング・モータを駆動調整して原点位置に合わせる。
【０１０７】
６．ユーザは、試料容器としてマイクロプレートに試料をセットする。そして、このマイクロプレートを試料ステージに載置する。
【０１０８】
７．コンピュータ１４は、対物レンズのＸＹ位置を調整する。即ち、コンピュータ１４は、試料ステージを移動させ、対物レンズが測定対象のウェルの直下に位置するように試料ステージの水平位置を調整する。
【０１０９】
８．コンピュータ１４は、液浸水供給機構電源をＯＮとして、対物レンズの上面に液浸水を満たす。
【０１１０】
９．コンピュータ１４は、測定に用いるレーザ電源をＯＮする。そして、対物レンズを通してウエル内の試料溶液内にフォーカスを合わせて光源からの光を照射する。
【０１１１】
１０．コンピュータ１４は、シャッターの初期設定を行う。
【０１１２】
１１．コンピュータ１４は、対物レンズのフォーカス位置を調整する。即ち、対物レンズＺ軸調整機構を調整し、光スポットの試料内での位置を調整する。
【０１１３】
１２．測定項目に応じて、偏光素子のＯＮ／ＯＦＦ、光走査機構電源のＯＮ／ＯＦＦを制御する。
【０１１４】
１３．コンピュータ１４は、光検出装置による各光学素子の位置調整を行う。試料から発せられる蛍光信号を光検出器で検出しながら、信号光が通過する光路内の光学素子を光軸方向、Ｘ−Ｙ軸方向（水平方向）にそれぞれ位置調整し、各光学素子の配置を最適化する。
【０１１５】
１４．コンピュータ１４は、光源光の強度を調整する。試料から発せられる蛍光信号を光検出器で検出しながら、レーザ光源の駆動電流を調整する。
【０１１６】
１５．光学素子全ての位置調整が終了すると、コンピュータ１４は指令により、光位置検出器の電源を切る。
【０１１７】
１６、コンピュータ１４は、測定を開始する。
【０１１８】
１７．コンピュータ１４は、測定が終了するとレーザ電源をＯＦＦする。
【０１１９】
１８．コンピュータ１４は、メイン電源をＯＦＦする。
【０１２０】
以上のようにして、本実施の形態に係る測定装置では、自動で測定を進めることができる。なお、試料ステージを駆動して、マイクロプレートの平面位置（Ｘ−Ｙ方向）を移動し、次に測定を行なうマイクロプレートのウェル内の試料に位置合わせを行なうが、このとき、光位置検出器の電源をＯＮし、光検出器の位置調整を再度実施する。また、必要に応じてオペレーターが手動で各光学素子の位置調整を行なっても良い。
【０１２１】
次に、ＦＣＳ測定とＦＩＤＡ測定の切り替えに伴う、測定装置内部の光学素子の切り替え動作について説明する。測定の切り替えに伴って切り替えられる主な光学素子は、ビーム走査機構９である。
【０１２２】
図１８Ａ、図１８Ｂは、ビーム走査機構の切り替え方法を説明する図である。
【０１２３】
図１８Ａは、ＦＣＳ測定でのビーム走査機構９を示す図である。点線で表す光軸に対して、４５度の角度でミラー９０が挿入される。この配置では、レーザビームは、対物レンズ１０の光軸上で焦点を結ぶ。対物レンズ１０の使い方として、その光学的な特性（明るさ、収差）を最も有効に使うためには、光軸上に焦点を設けることが望ましい。
【０１２４】
図１８Ｂは、ＦＩＤＡ測定でのビーム走査機構９を示す図である。一点鎖線で表す光軸に対して、４５度から少し傾きをもった角度で偏芯回転ミラー４０が設置される。この偏芯回転ミラー４０は、モータ４１と接続されており、モータ４１の回転軸と偏芯回転ミラー４０のミラー面とは垂直ではない。モータ４１の回転運動により、レーザビームの焦点は対物レンズ１０の光軸を中心として回転運動する。
【０１２５】
図１９A、図１９Bは、ビーム走査機構の他の切り替え方法を説明する図である。図１９Aは、ＦＣＳ測定でのビーム走査機構９を示す図である。この構成は、ＦＣＳ測定とＦＩＤＡ測定を図１８Bと同様のビーム走査機構９の構成で共用するものである。但し、図１８Bに示す形態と異なり、モータ４１と回転軸とが、４５度ではない角度で取り付けられている。そのため、偏芯回転ミラー４０が一周回転する間に、偏芯回転ミラー４０が光軸に対して、図１８Aと同一の配置となる回転角度が存在する。図１９Aは、この状態を示している。そこで、この回転角度を記憶しておき、ＦＣＳ測定に切り替えられたときは、この回転角度になるように偏芯回転ミラー４０を回転させる。
【０１２６】
図１９Bは、ＦＩＤＡ測定でのビーム走査機構９を示す図である。このビーム走査機構９は、図１９Aと同じ構成である。上記偏芯回転ミラー４０をそのまま回転させると、図に示すように、レーザビームの焦点は対物レンズ１０の光軸の周囲を回転する。
【０１２７】
続いて、ＦＣＳ測定に切り替えたときの、本光測定装置の動作について説明する。この動作は、コンピュータ１４が自動的に装置を制御する。
【０１２８】
１．ユーザが測定装置の起動をコンピュータ１４に入力すると、コンピュータ１４は、測定装置のメイン電源を投入
２．ユーザがＦＣＳ測定を設定すると、コンピュータ１４は、予め定められたテーブルに従い、測定装置内の各光学素子の組み合わせを選定。使用するレーザを選定する。
【０１２９】
３．コンピュータ１４は、光位置検出器の電源をＯＮする。以降は、測定装置の動作プログラムにより、光位置検出器の電源のオン、オフを制御する。
【０１３０】
４．コンピュータ１４は、試料ステージを初期位置に移動する。
【０１３１】
５．光位置検出器による各光学素子位置調整。試料から発せられる蛍光信号を光強度モニタ 用の光検出器で検出しながら、信号光が通過する光路内の光学素子を光軸方向、Ｘ−Ｙ軸方 向（水平方向）にそれぞれ位置調整し、各光学素子の配置を最適化する。
【０１３２】
６．ユーザは、試料容器としてマイクロプレートに試料をセットする。そして、このマイクロプレートを試料ステージに載置する。
【０１３３】
７．コンピュータ１４は、液浸水供給機構電源をＯＮとして、対物レンズの上面に液浸水を満たす。
【０１３４】
８．コンピュータ１４は、測定に用いるレーザ電源をＯＮする。光源からの光は、対物レンズを通してウエル内の試料溶液内にフォーカスを合わせる。
【０１３５】
９．コンピュータ１４は、光走査機構の電源をＯＦＦする。光走査機構を停止させ、光ビームが試料内での所望の位置に来るように調整する。
【０１３６】
１０．コンピュータ１４は、光源光の強度を調整する。試料から発せられる蛍光信号を光 検出器で検出しながら、レーザ光源の駆動電流を調整する。
【０１３７】
１１．コンピュータ１４は、関連する光学素子、ダイクロイックミラー１０１、バリアフィルタ６４、ピンホール５２など関連する光学素子全ての位置調整が終了すると、コンピュ ータ１４は指令により、光位置検出器の電源を切る。
【０１３８】
１２、コンピュータ１４は、測定を開始する。
【０１３９】
１３．コンピュータ１４は、測定が終了するとレーザ電源をＯＦＦする。
【０１４０】
１４．コンピュータ１４は、メイン電源をＯＦＦする。
【０１４１】
続いて、ＦＩＤＡ測定に切り替えたときの、本光測定装置の動作について説明する。この動作は、ＦＣＳ測定の動作と同様であるので、主として異なる動作について記載する。
【０１４２】
１．ユーザが測定装置の起動をコンピュータ１４に入力すると、コンピュータ１４は、測定装置のメイン電源を投入
２．ユーザがＦＩＤＡ測定を設定すると、コンピュータ１４は、予め定められたテーブルに従い、測定装置内の各光学素子の組み合わせを選定。使用するレーザを選定する。この際、ＦＩＤＡ偏光測定が選択されていた場合は、偏光素子ホルダ２８を動作させて、偏光板を光路中に挿入する。
【０１４３】
３．乃至８．はＦＣＳ測定時と同一。
【０１４４】
９．コンピュータ１４は、光走査機構の電源をＯＮし、光ビームが試料内での所望の位置で走査するように調整する。
【０１４５】
１０．乃至１４．は、ＦＣＳ測定時と同一
以上説明した、実施の形態によれば測定装置の基本構成を変えることなく、また、光学素子の切り替えなどによるだけで、さまざまな試料の動的な光解析方法を迅速に、しかも効率良く行なうことができる。
【０１４６】
なお、この発明は、上記実施形態そのままに限定されるものではなく、実施段階ではその要旨を逸脱しない範囲で構成要素を変形して具体化できる。また、上記実施形態に開示されている複数の構成要素の適宜な組み合せにより種々の発明を形成できる。例えば、実施形態に示される全構成要素から幾つかの構成要素を削除してもよい。更に、異なる実施形態に亘る構成要素を適宜組み合せてもよい。
【産業上の利用可能性】
【０１４７】
本発明は測定装置の基本構成を変えることなく、種々の試料の動的な光解析方法を迅速にかつ効率良く行なうことができる光測定装置を製造する産業に広く利用することができる。
【符号の説明】
【０１４８】
１…レーザ光源、２…光検出器、３…ダイクロイックミラー、７…光量モニタ機構、９…ビーム走査機構、１１…液浸水供給機構、１４…コンピュータ、１５…光源部、１６…光検出部、２０…マイクロプレート、２４…シングルモード光ファイバー、２８…偏光素子ホルダー、３６…回転式NDフィルタ、４０…偏芯回転ミラー、４１…モータ、４５…バリアフィルタ、４７…シングルモード光ファイバー、４８…フェルール型光学素子、８０…マルチモード光ファイバー、９０…ミラー、１０２…ビームシフタ。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザ光源と、対物レンズと、光検出器と、試料容器と、光学素子と、前記レーザ光源と前記試料容器との間の光路上に配置され、偏芯回転ミラーと前記偏芯回転ミラーを回転させるモーターとにより構成されるビーム走査機構と、制御信号を発生し、前記ビーム走査機構の駆動制御を行なうビーム走査機構制御部と、を備え、前記試料容器に保持された溶液中の生物学的試料の物理的性質について複数種類の測定項目に対応した測定を行なう光測定装置であって、
前記ビーム走査機構は前記ビーム走査機構制御部より前記制御信号を受信して、
ＦＩＤＡ(Fluorescence Intensity Distribution Analysis)測定を行なう場合は、前記偏芯回転ミラーを回転させてレーザ光の集光スポットを前記試料容器に保持された溶液内のフォーカス位置で略楕円状に光走査し、
ＦＣＳ(Fluorescence Correlation Spectroscopy)測定を行なう場合は、光軸を通った光が前記対物レンズを光軸に沿って通過する向きに前記偏芯回転ミラーのミラー面を固定し、前記光軸を通った光が前記溶液内でコンフォーカル照明を行うことを特徴とする光測定装置。
【請求項２】
前記光学素子は濃淡フィルタ、または波長選択素子、またはミラー、または偏光素子であることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
【請求項３】
前記光検出器で得られる光信号は生物学的試料に由来する光学的信号の強度、あるいはその時間的な変化であることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
【請求項４】
光信号の強度のゆらぎの相関分光解析を行なうことを特徴とする請求項３に記載の光測定装置。
【請求項５】
前記試料容器は少なくとも底面の一部が光透過性材料から成ることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
【請求項６】
前記試料容器はマイクロプレートであることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
【請求項１】
レーザ光源と、対物レンズと、光検出器と、試料容器と、光学素子と、前記レーザ光源と前記試料容器との間の光路上に配置され、偏芯回転ミラーと前記偏芯回転ミラーを回転させるモーターとにより構成されるビーム走査機構と、制御信号を発生し、前記ビーム走査機構の駆動制御を行なうビーム走査機構制御部と、を備え、前記試料容器に保持された溶液中の生物学的試料の物理的性質について複数種類の測定項目に対応した測定を行なう光測定装置であって、
前記ビーム走査機構は前記ビーム走査機構制御部より前記制御信号を受信して、
ＦＩＤＡ(Fluorescence Intensity Distribution Analysis)測定を行なう場合は、前記偏芯回転ミラーを回転させてレーザ光の集光スポットを前記試料容器に保持された溶液内のフォーカス位置で略楕円状に光走査し、
ＦＣＳ(Fluorescence Correlation Spectroscopy)測定を行なう場合は、光軸を通った光が前記対物レンズを光軸に沿って通過する向きに前記偏芯回転ミラーのミラー面を固定し、前記光軸を通った光が前記溶液内でコンフォーカル照明を行うことを特徴とする光測定装置。
【請求項２】
前記光学素子は濃淡フィルタ、または波長選択素子、またはミラー、または偏光素子であることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
【請求項３】
前記光検出器で得られる光信号は生物学的試料に由来する光学的信号の強度、あるいはその時間的な変化であることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
【請求項４】
光信号の強度のゆらぎの相関分光解析を行なうことを特徴とする請求項３に記載の光測定装置。
【請求項５】
前記試料容器は少なくとも底面の一部が光透過性材料から成ることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
【請求項６】
前記試料容器はマイクロプレートであることを特徴とする請求項１に記載の光測定装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９Ａ】
【図１９Ｂ】
【公開番号】特開２０１２−１９８２３６（Ｐ２０１２−１９８２３６Ａ）
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−１３０４０６（Ｐ２０１２−１３０４０６）
【出願日】平成２４年６月８日（２０１２．６．８）
【分割の表示】特願２００７−５２５９６３（Ｐ２００７−５２５９６３）の分割
【原出願日】平成１８年７月１２日（２００６．７．１２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年１０月１８日（２０１２．１０．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２４年６月８日（２０１２．６．８）
【分割の表示】特願２００７−５２５９６３（Ｐ２００７−５２５９６３）の分割
【原出願日】平成１８年７月１２日（２００６．７．１２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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