免疫グロブリン融合タンパク質
生物学的活性分子およびこの生物学的活性分子に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインを含む融合タンパク質を開示する。Ｆｃドメインは（ｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４、または（ｉｉ）ＩｇＧ４およびＩｇＤのハイブリッドヒトＦｃドメインである。ハイブリッドＦｃは生物学的活性分子の担体として有用である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッドヒトＦｃ、および前記ハイブリッドヒトＦｃが生物学的活性分子に結合した免疫グロブリン融合タンパク質に関する。具体的に、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラス同士の組み合わせまたはヒトＩｇＤとＩｇＧとの組み合わせに由来するハイブリッドヒトＦｃ、および前記Ｆｃが共有結合を介して生物学的活性分子に結合した融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的活性分子は治療学的に非常に重要である。ところが、これらは、生体内安定性が低いため、治療学的製剤として不利になることもある。これら生物学的活性分子は生体内で多様な酵素によって分解されるため、これらの循環半減期(circulating half-life)または血中半減期(serum half-life)は短い。よって、生物学的活性分子の循環半減期を増加させることが要求される。
【０００３】
タンパク質のサイズ増加が腎臓によるタンパク質除去を妨害するので、その半減期が増加できると知られている(Knauf et al., J. Biol. Chem. 1988. 263:15064-15070)。例えば、ヒトアルブミンに活性タンパク質を結合させることによりタンパク質安定性を増加させるということが報告されている(Kinstler et al., Pharm. Res. 1995. 12: 1883-1888)。ところが、ヒトアルブミンに活性タンパク質を結合させることは滞留時間を若干増加させるだけなので、効果的な活性タンパク質含有薬学的剤形を開発するためにヒトアルブミンを結合させることは適切な方法ではない。
【０００４】
この他に報告された方法はタンパク質の糖化(glycosylation)を調節することである。タンパク質における追加糖化およびタンパク質へのシアル酸導入は、肝におけるタンパク質分解の防止を誘導する。ところが、タンパク質糖化の増加はまたタンパク質の生物活性の減少を同時にもたらす。
【０００５】
タンパク質を安定化し且つ腎臓による除去を防止するために、タンパク質はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合してきた。ＰＥＧへの共有結合は長引く半減期を有する薬物を運搬するのに広く用いられている(Delgado et al., 1992. 9: 249-304)。ところが、サイトカイン(cytokines)またはホルモンにＰＥＧを結合させることは、結合による立体障害(steric hindrance)により受容体結合親和力を減少させる結果を引き起こすと報告されている。
【０００６】
最近、免疫グロブリン（Ｉｇ）を用いて製造された融合タンパク質が研究・開発されている。Ｉｇは血液の主要構成成分である。ヒトＩｇ（ｈＩｇ）は多様な部類、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどを含む(Roitt et al., "Immunology" 1989, Gower Medical Publishing, London, U. K.; New York, N. Y.)。ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）、ヒトＩｇＧ２（ｈＩｇＧ２）、ヒトＩｇＧ３（ｈＩｇＧ３）、およびヒトＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４）として知られている様々な亜型にさらに分類できる。
【０００７】
免疫グロブリンは４つのポリペプチド鎖からなるが、これら２つの重鎖または２つの軽鎖は四量体を形成するためにジスルフィド結合を介して連結されている。各鎖は可変領域および不変領域から構成されている。重鎖の不変領域はイソタイプによって３つの部位または４つの部位（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）にさらに分けられる。重鎖不変領域のＦｃ領域は、Ｉｇイソタイプに応じて、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインを含む。
【０００８】
血中半減期に関連し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は２１日の長い半減期を有するが、他の免疫グロブリンは相対的に１週以下の短い半減期を有する。ＩｇＧのＦｃ領域に融合したキメラタンパク質は増加した安定性および増加した血中半減期を示す(Capon et al., Nature 1989. 337: 525-531)。生物学的活性タンパク質はＣＨ１部位のＮ末端、Ｆｃ部位のＮ末端、またはＩｇＧｓのＣＨ３部位のＣ末端に融合してきた。
【０００９】
初めに、ＩｇＧ融合タンパク質は、ＣＤ４(Capon et al., Nature 1989. 337: 525-531)、ＴＮＦＲ(Mohler et al., J. Immunology 1993. 151: 1548-1561)、ＣＴＬＡ４(Linsley et al., J. Exp. Med. 1991. 173: 721-730)、ＣＤ８６(Morton et al., J. Immunology 1996. 156: 1047-1054)などの細胞表面受容体の細胞外ドメインに付着してきた。また、ＩｇＧドメインに融合してきた幾つかのサイトカインおよび成長ホルモンがある。ところが、細胞表面受容体の細胞外ドメインに融合した場合とは異なり、ＩｇＧに水溶性タンパク質が融合した場合、非融合サイトカインまたは成長因子と比較するとき、生物学的活性を減少させる結果を引き起こす。キメラタンパク質は二量体として存在するが、この二量体は互いに近く存在する２つの活性タンパク質の存在により、受容体のようなそれらの標的分子と相互作用するにおいて立体障害を引き起こす。よって、このような問題は効率的なＦｃ融合タンパク質を製造するために克服されなければならない。
【００１０】
Ｆｃ融合技術の別の限界は意図していない免疫反応である。免疫グロブリンのＦｃドメインも抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ、antibody dependent cell-mediated cytotoxicity）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ、complement-dependent cytotoxicity）などのエフェクター機能を有する。このようなエフェクター機能は、一般に、ＩｇのＦｃ部位とエフェクター細胞上のＦｃＲｓ間の相互作用を介してあるいは補体結合を介して達成される。よって、細胞殺滅、サイトカイン分泌または炎症などの望ましくない反応を減少させるために、Ｆｃのエフェクター機能は抑制されなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
要するに、生物学的活性損失が最小化し且つ望ましくない免疫反応に対する危険性が減少した、改善されたＦｃ融合タンパク質が要求される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヒトＩｇＧサブクラス同士の組み合わせまたはヒトＩｇＤとＩｇＧとの組み合わせから誘導されるハイブリッドＦｃを提供する。ハイブリッドＦｃは、生物学的活性分子に結合する場合、生物学的活性分子の血中半減期を増加させるだけでなく、Ｆｃ−ポリペプチド融合タンパク質をコードするヌクレオチドが発現されるときにポリペプチドの発現水準を高めるという効果がある。
【００１３】
また、本発明は、ハイブリッドＦｃが生物学的活性分子に結合したハイブリッドＦｃ融合ポリペプチドを提供する。融合タンパク質は、場合によっては「生物学的活性分子Ｆｃ融合タンパク質」または簡単に「融合タンパク質」と呼ばれる。融合タンパク質はＦｃと生物学的活性分子との間にリンカーを持つことができる。ＦｃはそのＮ末端で生物学的活性分子のＣ末端と結合できる。
【００１４】
融合タンパク質は、それをコードし且つ融合タンパク質を発現させることが可能なヌクレオチド構造物を製造し、宿主細胞でそれを発現させ、融合タンパク質を収得することにより生産できる。あるいは、融合タンパク質は、Ｆｃをコードするヌクレオチドを発現させ、これを通常の方法によって生物学的活性分子と結合させることにより生産できる。
【００１５】
本発明の一様態に係るポリペプチドは、下記化学式で表される：
Ｎ’−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’
式中、Ｎ’はポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’はポリペプチドのＣ末端であり、
Ｚ１は少なくとも配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端領域、または少なくとも配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列を示し、
Ｙは少なくとも配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基のＣ末端領域、または少なくとも配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列を示し、
Ｚ２は少なくとも配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基のＮ末端領域、または少なくとも配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列を示し、
Ｚ３は少なくとも配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端領域を含むアミノ酸配列を示し、
Ｚ４は少なくとも配列番号１１の２２４〜３３０、配列番号１２の２２０〜３２６、配列番号２４の２７１〜３７７、または配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含むアミノ酸配列を示し、
ｐは０または１の整数であり、
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも８０〜１４０個である。
【００１６】
Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端側から５〜９個の連続したアミノ酸残基、または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端側から５〜９個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい。一様態において、Ｚ１はＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号：１１）またはＩｇＤ ＣＨ１ドメイン（配列番号：１４）の５、６、７、８または９個のＣ末端アミノ酸残基であってもよい。
【００１７】
他の様態において、Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基５〜９個からなるアミノ酸配列であってもよい。また、Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってもよい。
【００１８】
Ｙは、配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基のＣ末端側から５またはそれ以上、または１０またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよく、配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基のＣ末端側から５またはそれ以上、または１０またはそれ以上の連続したアミノ酸残基であってもよい。特定の具体例において、Ｙは配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５８〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５３または１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１４３〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１３３〜１６２位のアミノ酸残基、または配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい。
【００１９】
Ｚ２は配列番号１２（ｈＩｇＧ２）の１１１〜１４７位のアミノ酸残基のＮ末端側から４〜３７個、または６〜３０個の連続したアミノ酸残基、または配列番号１４（ｈＩｇＤ）の１６３〜１９９位のアミノ酸残基のＮ末端側から４〜３７個、または６〜３０個の連続したアミノ酸残基であってもよい。具体的な様態において、Ｚ２はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインの６個のＮ末端アミノ酸残基またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインの８個のＮ末端アミノ酸残基であってもよい。
【００２０】
Ｚ２およびＺ３のアミノ酸の総数は８０〜１４０個であり得る。一つの様態において、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも９０〜１２０個である。他の様態において、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも１０５〜１１５個である。一つの具体的な様態において、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０８個である。別の具体的な様態において、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０９個である。
【００２１】
Ｚ４は配列番号１１（ｈＩｇＧ１）の２２４〜３３０、配列番号１２（ｈＩｇＧ２）の２２０〜３２６、配列番号２４（ｈＩｇＧ３）の２７１〜３７７、または配列番号１３（ｈＩｇＧ４）の２２１〜３２７位の９０またはそれ以上、または１００またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり得る。Ｚ４は配列番号１１の２２４〜３３０、配列番号１２の２２０〜３２６、配列番号２４の２７１〜３７７、配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよい。
【００２２】
本発明の具体例によれば、Ｚ３〜Ｚ４は、（ｉ）配列番号１１の１１８〜２２３位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１１の２２４〜３３０位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１２の１１４〜２１９位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１２の２２０〜３２６位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２４の１６５〜２７０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号２４の２７１〜３７７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域の連続アミノ酸配列よりなる群から選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列である。
【００２３】
本発明の一つの具体的な様態に係るポリペプチドのアミノ酸残基の総数は１５４〜２８８個である。
【００２４】
一つの具体的な様態において、Ｙは少なくとも配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよく、ｐは１または０であってもよく、Ｚ２は少なくとも配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよく、Ｚ３は少なくとも配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよい。このような様態において、ｐが１のとき、Ｚ１は少なくとも配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよい。
【００２５】
さらに具体的な様態において、Ｚ３は配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または配列番号１３の１１５〜２２０位の７３〜１０６個の連続アミノ酸残基であってもよく、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１１０個であってもよい。Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよく、Ｚ３は配列番号１１の１２０〜２２３、配列番号１２の１１６〜２１９、配列番号２４の１６７〜２７０、または配列番号１３の１１８〜２２０位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよい。
【００２６】
他の具体的な様態において、Ｙは少なくとも配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよく、ｐは１または０であってもよく、Ｚ２は少なくとも配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよく、Ｚ３は少なくとも配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよい。このような様態において、ｐが１のとき、Ｚ１は配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい。
【００２７】
さらに具体的な様態において、Ｙは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基のＣ末端側の２０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上、３０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上、４０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上、５０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上、または６０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上であってもよい。Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１７０位のアミノ酸残基であってもよく、Ｚ３は配列番号１１の１２４〜２２３、配列番号１２は１２０〜２１９、配列番号２４の１７１〜２７０、または配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端側の７１〜１００の連続アミノ酸残基を含むことができる。Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０８個であってもよい。
【００２８】
一つの具体的な様態において、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２６、および配列番号２７よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列によってコードできる。ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８および配列番号２９よりなる群から選ばれたアミノ酸配列である。
【００２９】
一つの具体的な様態において、ポリペプチドはそのＮ末端で生物学的活性分子と融合するが、この生物学的活性分子は天然型の循環半減期に比べて増加した循環半減期を示す。生物学的活性分子はポリペプチド、タンパク質、または単一ペプチドであってもよい。生物学的活性分子はポリペプチド、ペプチドまたはタンパク薬物(protein drug)であってもよい。生物学的活性分子は可溶性タンパク質、例えば、ホルモン、サイトカイン、成長因子、共刺激分子、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、成長因子受容体、または短ペプチド(short peptide)であり得るが、これに限定されない。生物学活性分子はＥＰＯまたはその変異体／断片、ｐ４０またはその変異体／断片（例えば、Ａｓｎ３０３Ｇｌｎ置換体を含む変異体）、Ｇ−ＣＳＦまたはその変異体／断片、ＴＮＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０受容体、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β受容体、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７受容体、因子ＶＩＩ、ＣＸＣＬ−１１、ＦＳＨ、ヒト成長ホルモン、ＢＭＰ−１(bone morphogenetic protein-1)、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＧＬＰ−１、ベータセルリン(betacellulin)、ＯＰＧ、ＲＮＡＫ、インターフェロン−α、インターフェロン−βまたはそれらの変異体または断片であり得るが、これに限定されない。生物学的活性分子は成熟形態(mature form)の分泌タンパク質であってもよい。
【００３０】
一つの具体的な様態において、本発明は、次の段階を含む、請求項１に係るポリペプチドの生産方法を提供する：（ｉ）哺乳類宿主細胞に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を導入する段階、（ｉｉ）成長培地でポリペプチドが発現できる条件下で細胞を培養する段階、および（ｉｉｉ）発現されたポリペプチドを収得する段階。哺乳類宿主細胞はＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢＨＫ細胞であってもよい。
【００３１】
他の具体的な様態において、本発明は、前述したポリペプチドの治療学的有効量を投与することを含む、（ｉ）自己免疫疾患の症状を軽減、予防または治療し、（ｉｉ）移植拒否を抑制し、または（ｉｉｉ）内毒素により誘導されたショックを治療または予防する方法を提供し、ここで、ポリペプチドは生物学的活性分子に融合したポリペプチドをいう。
【００３２】
一つの具体的な様態において、本発明は、本発明の様態に係るポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８、および配列番号２９よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を持つことができる。核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２６、または配列番号２７に示されるヌクレオチド配列を持つことができる。核酸分子はシグナル配列またはリーダー配列をさらに含むことができる。
【００３３】
本発明の具体的な様態によれば、本発明は、核酸分子を含む発現ベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞を提供する。発現ベクターの例としては、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５、およびｐＡＤ１１ ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５を含むことができるが、これに限定されない。
【００３４】
一つの具体的な様態において、本発明は、それを必要とする哺乳類に核酸分子を投与する段階を含む、哺乳類に生物学的活性分子を伝達する方法を提供する。
【００３５】
別の具体的な様態において、ポリペプチドはＮ末端でＣ末端方向にヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなるＦｃドメインを含み、前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域またはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含み、ここで、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのＮ末端における４〜３７個の連続アミノ酸残基は少なくともヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域のアミノ酸残基部分で置換され、前記ＣＨ３ドメインは少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基部分を含む。
【００３６】
前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含むことができ、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含み、ここで、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのＮ末端の４〜３７個のアミノ酸残基は少なくともヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインのＮ末端部位のアミノ酸残基部分で置換される。
【００３７】
前記ヒンジ領域は少なくともＩｇＤヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含むことができ、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含み、ここで、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのＮ末端の４〜３７個のアミノ酸残基は少なくともヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端部位のアミノ酸残基部分で置換される。
【００３８】
ポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含むことができるが、ここで、前記ＣＨ１ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基部分を含み、ここで、前記ＣＨ１ドメインは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合する。ポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含むことができるが、ここで、前記ＣＨ１ドメインはヒトＩｇＤ ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基部分を少なくとも含み、ここで、前記ＣＨ１ドメインは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合する。ポリペプチドは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合した２次ポリペプチドをさらに含むことができ、ここで、２次ポリペプチドは生物学的活性非免疫グロブリンポリペプチドである。ポリペプチドは、リンカーを介して前記ＣＨ１ドメインのＮ末端または前記ＣＨ４ドメインのＣ末端に結合した生物学的活性分子をさらに含むことができるが、ここで、前記生物学的活性分子は免疫グロブリンポリペプチドではない。ポリペプチドおよび生物学的活性分子はリンカーを介して互いに結合できる。リンカー分子はアルブミンリンカーまたは合成リンカーである。アルブミンリンカーは、配列番号２５のアミノ酸配列３２１〜３２３、３１８〜３２５、３１６〜３２８、３１３〜３３０、３１１〜３３３、または３０６〜３３８を含む。合成リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基からなるアミノ酸残基の１０〜２０個のペプチドであってもよい。一つの具体的な様態において、このようなＧｌｙ−ＳｅｒリンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号３２）である。
【００３９】
また、本発明は組み換えＦｃ部位を含む抗体分子を含む。組み換えＦｃ部位は上述されている。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】「Ｘ」と明示された生物学的活性分子の担体タンパク質として使用できるハイブリッドＦｃ（ｈＦｃ）を示す概略図である。
【図２】本発明の詳細な説明によるｈＦｃを成すＩｇＧ１（配列番号１１）、ＩｇＧ２（配列番号１２）、ＩｇＧ４（配列番号１３）およびＩｇＤ（配列番号１４）に由来したアミノ酸位置を示す概略代表図である。他に説明がない限り、同じ方式が本出願によるポリペプチドのアミノ酸位置の指示にも適用される。
【図３】「ＡＬ」と明示されたアルブミンリンカーペプチドを介して、Ｃ末端に、「Ｘ」と明示された生物学的活性分子がそれぞれ結合したｈＦｃの概略代表図である。
【図４】リンカーと結合しているｈＦｃの概略代表図であって、前記リンカーは本発明の詳細な説明によってヒトアルブミン（配列番号２５）に由来したアルブミンリンカーのアミノ酸位置を示す。
【図５】ｈＦｃ−６の疎水性区画(hydrophobicity plot)の結果を示す。
【図６】（ａ）は特異的ＥＬＩＳＡ分析を用いたＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）（リツキシマブ(Rituximab)）、ｈＩｇＧ１、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト(entanercept)）、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５のＦｃγＲＩ結合活性結果を示し、（ｂ）は特異的ＥＬＩＳＡ分析を用いたＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）（リツキシマブ(Rituximab)）、ｈＩｇＧ１、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５のＣｌｑ結合活性結果を示す。
【図７】（ａ）はヒトＦ３６Ｅ細胞株におけるＥＰＯの生物活性と比較したＥＰＯ−ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ(darbepoetin alfa)）の生物活性の結果を示し、（ｂ）はマウス造血細胞株（ＮＦＳ−６０）におけるＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ペグフィルグラスチム(pegfilgrastim)）およびＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５の試験管内生物活性の結果を示し、（ｃ）はヒトＰＢＭＣｓにおけるｐ４０およびｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５の試験管内生物活性の結果を示し、（ｄ）はマウス(murine)Ｌ９２９細胞におけるＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）およびＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５の試験管内生物活性の結果を示し、（ｅ）はヒトＷＩＳＨ細胞におけるｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａの試験管内生物活性の結果を示す。
【図８】（ａ）はＳＣ経路（左パネル）およびＩＶ経路（右パネル）を介してカニクイザル(cynomolgus monkeys)に投与されたＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ）、ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、またはＥＰＯ−ｈＦｃ−５の生体内半減期に対する結果を示し、（ｂ）はＳＣ経路（左パネル）およびＩＶ経路（右パネル）を介してＳＤ(Sprague Dawley)ラットに投与されたＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）（フィルグラスチム(filgrastim)）およびＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１の薬動学的結果を示し、（ｃ）はＳＣ経路を介してカニクイザルに投与されたｐ４０Ｎ３０３０Ｑ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）の薬動学的結果を示し、（ｄ）はＳＣ経路を介してＳＤ(Sprague Dawley)ラットに投与されたＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）の薬動学的結果を示す。
【図９】（ａ）はＳＣ経路（左上パネル）およびＩＶ経路（右下パネル）を介してカニクイザルに投与されたＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ）およびＥＰＯ−ｈＦｃ−５の生体内生物活性に対する結果を示し、（ｂ）はＳＣ経路（上パネル）およびＩＶ経路（下パネル）を介してＳＤラットに投与されたＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）（フィルグラスチム）およびＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１の生体内生物活性に対する結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、Ｎ末端でＣ末端方向にヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むハイブリッドヒト免疫グロブリンＦｃ断片を提供するが、ここで、ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域またはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の部分的アミノ酸配列であり、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインであって、そのＮ末端領域がヒトＩｇＧ２ ＣＨ２またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域の４〜３７個のアミノ酸残基で置換されたものである。Ｆｃ融合タンパク質を生産するために、生物学的活性ポリペプチドのような生物学的活性分子に結合するとき、前記ハイブリッドＦｃ断片はＦｃ融合タンパク質の非特異的免疫反応を最小化し、生物学的活性分子の血中半減期を延長させ、生物学的活性分子の活性を最適化する。
【００４２】
本発明の一つの具体的様態に係るＦｃ融合タンパク質において、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインの残余部分とＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端との組み合わせは、融合タンパク質において２つの相異なるＩｇサブユニットが組み換えられる領域が疎水性となるようにした。融合したタンパク質の疎水性領域は、折り畳みタンパク質(folded protein)の内部に位置し、望ましくない非特異的免疫反応を最小化する。
【００４３】
本願で使用される用語「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ」とは、免疫グロブリンの重鎖不変領域１（ＣＨ１）、重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含み、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域および軽鎖不変領域１（ＣＬ１）は含まないタンパク質をいう。それは重鎖不変領域のヒンジ領域をさらに含むことができる。ハイブリッドＦｃまたはハイブリッドＦｃ断片は本願において「ｈＦｃ」と呼ばれることもある。
【００４４】
また、本発明のＦｃ断片は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態である。当業界における公知の方法、例えば化学的方法、酵素的方法、および微生物を用いた遺伝工学的エンジニアリング方法などによって免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増加、減少または除去が行われ得る。Ｆｃ断片からの糖鎖の除去は、１次補体構成要素Ｃ１のＣｌｑへの結合親和力を急激に減少させ、ＡＤＣＣ(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)またはＣＤＣ(complement-dependent cytotoxicity )の減少または消失をもたらし、それにより生体内の不要な免疫反応を誘導しない。このような点で、糖鎖の除去された(deglycosylated)形態あるいは非糖化された(aglycosylated)形態における免疫グロブリンＦｃ断片は、薬物の担体として本発明の目的にさらに適することもある。
【００４５】
ここで、使用された用語「糖鎖の除去(deglycosylation)」はＦｃ断片から酵素的に糖が除去されることを意味し、用語「非糖化(aglycosylation)」はＦｃ断片が原核生物、好ましくは大腸菌(E.coli)によって糖化されていない(unglycosylated)形態で生成されることを意味する。
【００４６】
本願で使用された用語「ハイブリッド」は、互いに異なる起源の２つまたはそれ以上の免疫グロブリンＦｃ断片をコードする配列が単一鎖免疫グロブリンＦｃ断片に存在することを意味する。
【００４７】
一つの具体的な様態において、ハイブリッドヒトＦｃはＮ末端でＣ末端方向にヒンジ領域、ＣＨ２メインおよびＣＨ３ドメインを含み、ここで、前記ヒンジ領域は、少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域またはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の部分的アミノ酸配列であり、ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインであって、その末端領域がヒトＩｇＧ２ ＣＨ２またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域の４〜３７個のアミノ酸残基で置換されたものである。ハイブリッドヒトＦｃは、共有結合によって、そのＮ末端で生物学的活性分子のＣ末端に結合できる。
【００４８】
別の具体的な様態において、生物学的活性分子−ハイブリッドＦｃ融合ポリペプチドは、次の化学式によって表される。
【００４９】
Ｎ’−Ｘ−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’、または
Ｎ’−Ｘ−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−（リンカー）ｑ−Ｘ−Ｃ’
ここで、Ｎ’はポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’はポリペプチドのＣ末端であり；Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端領域を少なくとも含みあるいは配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基部分を少なくとも含むアミノ酸配列を示し；Ｙは配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基のＣ末端領域を少なくとも含みあるいは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基部分を少なくとも含むアミノ酸配列を示し；Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を少なくとも含みあるいは配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基のＮ末端領域を少なくとも含むアミノ酸配列を示し；Ｚ３は配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または配列番号１３の１１５〜２２０のアミノ酸残基のＣ末端領域を少なくとも含むアミノ酸配列を示し；Ｚ４は配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を少なくとも含むアミノ酸配列を示し、ｐおよびｑはそれぞれ整数０または１であり、ここで、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも８０〜１４０個であり、リンカーはリンカー分子であり、Ｘは目的の生物学的活性分子である。
【００５０】
一つの具体的な様態において、Ｚ３〜Ｚ４は、（ｉ）配列番号１１の１１８〜２２３位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１１の２２４〜３３０位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１２の１１４〜２１９位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１２の２２０〜３２６位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２４の１６５〜２７０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号２４の２７１〜３７７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域の連続アミノ酸配列よりなる群から選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列である。
【００５１】
本発明の一つの様態に係るポリペプチドアミノ酸残基の総数は１５４〜２８８個である。
【００５２】
化学式Ｎ’−Ｘ−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’およびＮ’−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−（リンカー）ｑ−Ｘ−Ｃ’のポリペプチドを対象に投与する場合、Ｘを単独で投与した場合の循環半減期に比べて生物学的活性分子Ｘの循環半減期を増加させる。
【００５３】
リンカーはヒトアルブミンに由来できる（配列番号２５ ＣＡＡ００６０６）。リンカーは配列番号２５のアミノ酸配列３２１〜３２３、３１８〜３２５、３１６〜３２８、３１３〜３３０、３１１〜３３３、または３０６〜３３８を含むことができる。場合によって、リンカーは合成リンカーであってもよい。合成リンカーはＧｌｙおよびＳｅｒの総１０〜２０個の残基からなるペプチドである。一つの様態において、Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号３２）である。
【００５４】
Ｚ１はヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメイン（配列番号１１）またはＩｇＤ（配列番号１４）の領域を少なくとも含むことができる。Ｚ１はＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号１１の９０〜９８位）のＣ末端領域またはＩｇＤ ＣＨ１ドメイン（配列番号１４の９０〜９８位）のＣ末端領域の５〜９個または７〜９個の連続したアミノ酸残基を含むことができる。あるいは、Ｚ１はＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインまたはＩｇＤ ＣＨ１ドメインの５、６、７、８または９個のＣ末端アミノ酸残基であってもよい。
【００５５】
一つの具体的な様態において、Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基５〜９個からなるアミノ酸配列であってもよい。また、Ｚ１は配列番号１１のアミノ酸残基９０〜９８個または配列番号１４のアミノ酸残基９０〜９８個からなるアミノ酸配列であってもよい。
【００５６】
ＹはヒトＩｇＧ１またはＩｇＤのヒンジ領域の部分を少なくとも含むことができる。ＹはＣ末端ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号１１のアミノ酸位置９９〜１１３）またはＩｇＤヒンジ領域（配列番号１４のアミノ酸位置９９〜１６２）の５またはそれ以上、または１０またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を含むことができる。特定の様態において、Ｙは配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５８〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５３〜１６２位のアミノ酸残基、または配列番号１４の１４３〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１３３〜１６２位置のアミノ酸残基、または配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい。
【００５７】
Ｚ２はヒトＩｇＧ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域（配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基）またはＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域（配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基）の４〜３７、６〜３０、６〜１２、６〜８、８または６個の連続したアミノ酸残基を含むことができる。特定の様態において、Ｚ２はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインの６個のＮ末端アミノ酸残基（配列番号１２のアミノ酸残基１１１〜１１６）またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインの８個のＮ末端アミノ酸残基（配列番号１４のアミノ酸残基１６３〜１７０）であってもよい。
【００５８】
Ｚ２またはＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも、９０〜１２０個または１０５〜１１５個であり得る。
【００５９】
Ｚ４はＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインの９０またはそれ以上、または１００またはそれ以上の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい（配列番号１１の２２４〜３３０、配列番号１２の２２０〜３２６、配列番号２４の２７１〜３７７、または配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基）。Ｚ４はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基の９８％または９５％以上のアミノ酸残基であってもよい。一つの実施例として、Ｚ４はヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインの全体アミノ酸配列を含むアミノ酸配列である。たとえば、Ｚ４はＫａｂａｔなどによるＥＵインデックスナンバリングで表示されるヒトＩｇＧ４のアミノ酸残基３４１〜３４７に対応するヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列であるが、これは配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基に対応する。
【００６０】
一つの具体的な様態において、ＹはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号１１のアミノ酸残基９９〜１１３）のＣ末端アミノ酸残基部分を少なくとも含むアミノ酸配列であってもよく、ｐは１または０であってもよく、Ｚ２はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２（配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基）のＮ末端領域の部分を少なくとも含むアミノ酸配列であってもよく、Ｚ３はヒトＩｇＧサブクラスのいずれか一つ（配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または少なくとも配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基）のＣ末端領域の部分を含むアミノ酸配列であってもよい。このような様態において、ｐが１のとき、Ｚ１は少なくともヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基）のＣ末端領域の部分を含むアミノ酸配列であり得る。たとえば、Ｚ１は配列番号１１のアミノ酸残基９０〜９８である。
【００６１】
より具体的な様態において、Ｚ３はヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン（配列番号１３の１１５〜２２０位）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン（配列番号１１の１１８〜２２３位）、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメイン（配列番号１２の１１４〜２１９位）、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２ドメイン（配列番号２４の１６５〜２７０位）のＣ末端領域の７３〜１０６個の連続したアミノ酸残基であってもよく、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１１０個であってもよい。たとえば、Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、Ｚ３は配列番号１３の１１７〜２２０位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり得る。
【００６２】
他の具体的な様態において、Ｙは少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域のＣ末端領域の部分を含むアミノ酸配列（配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基）であってもよく、ｐは１または０であってもよく、Ｚ２は少なくともＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域の部分を含むアミノ酸配列（配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基）であってもよく、Ｚ３は少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのＣ末端領域の部分を含むアミノ酸配列（配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基）であってもよい。たとえば、Ｙは配列番号１４の１５８〜１６２、１３３〜１６２、または９９〜１６２位のアミノ酸残基であり、Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１７０位のアミノ酸残基であり、Ｚ３は配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基であり得る。
【００６３】
このような様態において、ｐが１のとき、Ｚ１はヒトＩｇＤ ＣＨ１ドメインのＣ末端領域を含むアミノ酸配列（配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基）であってもよい。たとえば、Ｚ１は配列番号１４の９０〜９８のアミノ酸残基であり得る。
【００６４】
このような様態において、ＹはヒトＩｇＤヒンジ領域のＣ末端側の２０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、３０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、４０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、５０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、６０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上であってもよい（配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基）。Ｚ３は配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端側の７１〜１００個の連続したアミノ酸残基を含むことができる。Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０８個であり得る。
【００６５】
表１は本発明の具体的な様態に係るｈＦｃの構造に有用なヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＤの断片のアミノ酸配列を示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
【００６８】
＊ＥＵインデックスは「Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, United States Department of Health and Human Services」に記述されている．
＊＊各アミノ酸の下線領域は許容可能なアミノ酸残基範囲の最も短い断片を示す。
【００６９】
一つの具体的な様態において、本発明は、図１および図２に示すようにｈＦｃ−１、ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４、ｈＦｃ−５またはｈＦｃ−６のいずれか一つのハイブリッドＦｃを提供し、あるいは図３および図４に示すようにｔｈＦｃ−１またはｔｈＦｃ−２を提供する。図１および図３は二本鎖Ｆｃを示すが、本発明は一本鎖ハイブリッドＦｃ分子も含む。ｈＦｃ−１〜ｈＦｃ−６のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１８〜２３に示されており、ｔｈＦｃ−１またはｔｈＦｃ−２のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２８および配列番号２９に示されている。また、本発明はハイブリッドＦｃをコードするポリヌクレオチド分子を含む。本発明は、配列番号１（ｈＦｃ−１）、配列番号２（ｈＦｃ−２）、配列番号３（ｈＦｃ−３）、配列番号４（ｈＦｃ−４）、配列番号５（ｈＦｃ−５）、配列番号６（ｈＦｃ−６）、配列番号２６（ｔｈＦｃ−１）および配列番号２７（ｔｈＦｃ−２）に示されるようなじポリヌクレオチド配列を含むが、これに限定されない。
【００７０】
ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列は当業界によく知られており、それらは公開的に接近可能な受託機関(publicly accessible depository)に受託されている。例えば、ヒトＩｇＧ１不変領域、ヒトＩｇＧ２不変領域、ヒトＩｇＧ３不変領域、ヒトＩｇＧ４不変領域、およびヒトＩｇＤ不変領域のアミノ酸配列はそれぞれＣＡＡ７５０３２、ＣＡＣ２０４５５、ＣＡＣ２０４５６、ＡＡＨ２５９８５およびＰ０１８８０として用いることができる。このような配列はそれぞれ配列番号１１、１２、２４、１３および１４に示した。
【００７１】
生物学的活性分子Ｘは可溶性タンパク質であってもよい。具体的に、ホルモン、サトカイン、成長因子、共刺激分子、ホルモン受容体、サトカイン受容体、成長因子受容体、または短ペプチドであるが、これに限定されない。例えば、ＸはＥＰＯ、ｐ４０、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ受容体またはこれらの変異体／断片であり得る。ＸはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０受容体、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β受容体、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７受容体、血液因子ＶＩＩ、ＣＸＣＬ−１１、ＦＳＨ、ヒト成長ホルモン、ＢＭＰ−１(bone morphogenetic pritein-1)、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＧＬＰ−１、ベータセルリン(betacellulin)、ＯＰＧ、ＲＮＡＫ、インターフェロン−α、インターフェロン−βまたはこれらの変異体／断片であり得る。また、抗体のＦａｂ領域を含むことができるが、これに限定されない。また、生物学的活性分子は分泌タンパク質であってもよい。一つの様態において、生物学的活性分子は免疫グロブリン群に属しない。
【００７２】
用語「変異体」とは、それらの核心的な特性を保有するが、標準核酸またはポリペプチドとは異なるポリペプチドまたは核酸を意味する。一般に、変異体は、全体的に非常に類似であり、且つ多くの領域で標準核酸またはポリペプチドと同一である。また、用語「変異体」は、本明細書または当業界における公知の、少なくとも一つの機能および／または治療学的特性を維持する生物学的活性分子薬物の生物学的活性部分を意味する。一般に、変異体は全体的に非常に類似であり、多くの領域で、目的とする生物学的活性ポリペプチドのアミノ酸配列と同一である。
【００７３】
また、本発明は、例えば配列番号１８〜２３および２８〜２９で表示されるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいはそのようなアミノ酸配列からなるタンパク質を提供する。また、本発明は、このようなポリペプチドの断片を提供する。また、本発明は、当業界における公知(Ausubel, F. M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc., New York, at pages 6.3.1 6.3.6 and 2.10.3)の、厳しいハイブリッド化条件（例えば、約４５℃で６×ＳＳＣ(Sodium chloride/Sodium citrate)でフィルターに結合したＤＮＡとハイブリッド化した後、約５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに１回以上洗浄）、さらに厳しい条件（約４５℃で６×ＳＳＣでフィルターに結合したＤＮＡとハイブリッド化した後、約６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１回以上洗浄）、あるいは別の厳しいハイブリッド化条件で、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の補体とハイブリッド化したポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。
【００７４】
クエリーアミノ酸配列と例えば少なくとも９５％の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列における１００個のアミノ酸当たり５個までのアミノ酸の置換を含むことを除いては、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一である。すなわち、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドを得るために、対象配列においてアミノ酸残基の最高５％が挿入され、欠損され、あるいは他のアミノ酸で置換され得る。標準配列の置換は、標準アミノ酸配列のアミノ−またはカルボキシ−末端位置で起ることができ、このような末端位置の間であればどこでも起ることができ、標準配列内の残基の間で個別的に、または標準配列内の一つまたはそれ以上の連続的なグループに散在して起ることができる。
【００７５】
実質的な例として、ある特定のポリペプチドが例えば本発明のアルブミン融合タンパク質またはその断片のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するか否かは、公知のコンピュータプログラムを用いて通常決定できる。グローバル配列アラインメント(global sequence alignment)としても言及される、クエリー配列（本発明の配列）と対象配列間の最上の全体的マッチ(match)を決定する好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ等のアルゴリズム(Comp. App. Biosci. 6:237 245 (1990))に基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定できる。配列アラインメントにおいて、クエリーおよび対象シーケンスは全てヌクレオチド配列であり、あるいは全てアミノ酸配列である。グローバル配列アラインメントの結果はパーセント同一性として示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に使用される好ましい基準は：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さであり、どれでもさらに短い。
【００７６】
変異体は、通常、一般なＨＡの長さ、または変異体と同じ長さの治療タンパク質と少なくとも７５％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９５％または９９％）の配列同一性を持つことができる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列水準における相同性または同一性は、配列類似性調査目的で仕立てられたｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｔｎおよびｔｂａｓｔｘ(Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264 2268 (1990)およびAltschul, J. Mol. Evol. 36: 290 300 (1993))プログラムが導入されたアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)分析によって決定される。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード部位、非コード部位、または両方ともにおける変更を含むことができる。特に、好ましくは、コードされたポリペプチドの特性または活性を変更させないサイレント置換、添加、または欠損を生産する変更を含むヌクレオチド変異体である。好ましくは、遺伝的コードの退化(degeneracy)に起因したサイレント置換で生産されたヌクレオチド変異体である。ひいては、ある組み合わせにおいて５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５または１〜２個のアミノ酸が置換、欠損、添加されたポリペプチド変異体も好ましい。ポリヌクレオチド変異体は、多様な理由で生産できるが、例えば、特定宿主へのコドン発現を最適化するために（ヒトｍＲＮＡコドンを酵母または大腸菌などのバクテリア宿主によって好まれるコドンに変化）生産される。
【００７８】
多様なＦｃ融合タンパク質、例えばＥＰＯ−Ｆｃ融合構造物、Ｇ−ＣＳＦ−Ｆｃ融合構造物、またはヒト４０−Ｆｃ融合構造物などを製造するための目的で、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトｐ４０、およびヒトＴＮＦ受容体のアミノ酸配列は、ＮＰ＿０００７９０（配列番号１５）、ＣＡＡ２７２９１（配列番号１６）、ＡＡＧ３２６２０（配列番号１７）、およびＮＰ＿００１０５７（配列番号３１）がそれぞれ使用できる。一つの具体的な様態において、３０３位のアミノ酸残基ＡｓｎがＧｌｎで代替された変形ヒトｐ４０はポリペプチドと連結される。
【００７９】
本発明の他の様態によれば、製造されたＦｃ領域を含む全体抗体を提供する。本願で使用される用語「抗体」は、全体抗体、および少なくともＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも２つを含む抗体断片を含む。好ましくは全体モノクローナル抗体である。抗体の重鎖可変領域はその結合特異性によって選択され、いずれのタイプにもなれるが、例えば、非ヒトのもの、ヒト化のものまたは全部ヒトのものであり得る。抗体の重鎖可変領域が、非ヒトのもの（例えばマウス）であって、本願によって製造されたＦｃ領域と組み換え的に結合する場合、このように生成された組み換え抗体をキメラ抗体という。抗体の重鎖可変領域が、ヒト化のものであって、本願によって製造されたＦｃ領域と組み換え的に結合する場合、このように生成された組み換え抗体をヒト化抗体という。抗体の重鎖可変領域が、ヒトのものであって、本願によって製造されたＦｃ領域と組み換え的に結合する場合、このように生成された組み換え抗体を完全なヒト抗体という。例えば、重鎖の可変領域はヒト化のものであり、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（この場合にはマウス）ＣＤＲｓ(complementary determining regions)を含む。フレームワーク領域は一つのソースまたは一つ以上のソースに由来でき、ＣＤＲは一つのソースまたは一つ以上のソースに由来できる。抗体のヒト化方法は当業者および当業界によく知られている。
【００８０】
抗体の軽鎖はヒト、非ヒトまたはヒト化のものである。図１Ｂに示すように、軽鎖はヒト化のものであり、ヒトフレームワーク領域、非ヒト（この場合にはマウス）ＣＤＲ、およびヒト不変領域を含む。フレームワーク領域は一つのソースまたは一つ以上のソースに由来でき、ＣＤＲは一つのソースまたはそれ以上のソースに由来できる。
【００８１】
製造されたＦｃ部位を含む抗体は、細胞表面分子、または細胞表面分子に結合する可溶性分子と結合する能力に基づいて選択される。よって、例えば、抗体はサイトカイン受容体（ＩＬ−２Ｒ、ＴＮＦ−αＲ、ＩＬ−１５Ｒなど）、接着分子（例えば、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭなど）、細胞分化または活性抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ４０など）などの細胞表面分子と結合する能力に基づいて選択できる。場合によって、抗体は細胞表面分子に結合する可溶性分子と結合する能力に基づいて選択できる。このような可溶性分子はサイトカインおよびケモカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６など）、成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＰＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＢＭＰ−１など）、細胞分化を誘導する分子（例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＰＴＮなど）およびその他のものを含むが、これに限定されない。
【００８２】
一般に、本願に提示された抗体構造は、遺伝工学的技術を用いて公知の方法を使用することにより行われる。例えば、ＤＮＡを分離する技術、ＤＮＡを発現するベクターを製造し選択する技術、核酸を精製し分析する技術、組み換えベクターＤＮＡを製造するための特別な方法に対する技術、制限酵素でＤＮＡを切断し、ＤＮＡを接着し、安定的または限時手段によって宿主細胞にベクターＤＮＡなどのＤＮＡを導入する技術、ＤＮＡを発現する細胞を選別および維持するために選別培地または非選別培地で宿主細胞を培養する技術は、当業界に一般に知られている技術である。
【００８３】
本願に記述されたモノクローナル抗体は、当業界における公知のハイブリドーマ技術、または当業界における公知の他の組み換えＤＮＡ方法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ方法は、マウスまたは他の適切な宿主動物のリンパ球によって抗体が生産できるように、ＤＮＡ、ペプチドまたはタンパク質で免疫されることである。
【００８４】
場合によって、リンパ球は試験管内で免疫できる。抗原に対する反応により生産されたリンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合製剤を用いて骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する。次に、ハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を抑制する一つ以上の物質が含まれた適切な培養培地に接種されて成長する。好ましい骨髄腫細胞は効果的に融合し、選別された抗体生産細胞の安定的な抗体生産を維持するうえ、ＨＡＴ培地(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., Catalog No. H-0262)などの培地に敏感ではない細胞である。
【００８５】
製造されたＦｃ領域を含む抗体は、治療学的製剤と結合して別途投与される組成物としても使用できる。診断目的で、抗体は標識形態でもよく非標識形態でもよい。
【００８６】
非標識抗体は、ヒト免疫グロブリン不変領域に特異的な抗体のように、製造された抗体に反応する他の標識付きの抗体（２次抗体）と共に使用できる。場合によって、抗体は直接標識されてもよい。広範囲で多様な標識、例えば放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素抑制剤、リガンド（特にヘプテン）などが導入できる。多くの種類の免疫分析が可能であり、このような技術は当業界によく知られている。
【００８７】
一つの具体的な様態において、本発明は、（ｉ）哺乳類宿主細胞に、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を導入する段階と、（ｉｉ）融合タンパク質が発現される条件の下に成長培地で細胞を成長させる段階と、（ｉｉｉ）生産された融合タンパク質を収得する段階とを含む、融合タンパク質の生産方法を提供する。
【００８８】
別の実験的具体例として、本発明は、融合タンパク質を含む薬学的組成物、または前述した抗体分子または抗体断片を提供する。また、本発明は、薬学的組成物を投与することにより、特定の症状を治療または予防する方法を提供する。例えば、（ｉ）自己免疫疾患の予防／治療に対する症状を軽減させ、（ｉｉ）移植拒否反応を抑制し、（ｉｉｉ）ハイブリッドＦｃおよびｐ４０タンパク質の融合タンパク質またはその変異体／断片の治療学的有効量を投与することを含む、内毒素により誘導されたショックを治療／予防する方法を提供する。
【００８９】
組成物は薬学的担体を含むことができる。薬学的担体は、患者への抗体伝達に適した非毒性物質であればいずれの担体でも使用可能である。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックスおよび非活性固体が担体として含有できる。薬学的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）も薬学的組成物に含有できる。
【００９０】
抗体組成物は多様な方法で対象に投与できる、例えば、薬学的組成物は非経口的に投与できるが、例えば、皮下、筋肉内または静脈内である。このような組成物は通常良く知られている滅菌技術によって滅菌できる。組成物は、ｐＨ調節などの生理的条件を調節するために要求される、薬学的に許容可能な補助物質および補助剤、毒性調節製剤およびその類似体を含むことができるが、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどがある。このような剤形において、融合タンパク質、抗体、または抗体断片の濃度は非常に多様であり得るが、例えば、重量によって約０．５％以下であり、一般にまたは少なくとも約１％〜１５％または２０％までであり、選択された特定投与方法によって体液量、粘度などに優先的に基づいて選択できる。
【００９１】
また、本発明は、融合タンパク質をコードする単離核酸分子、および核酸分子を運搬する発現ベクターを提供する。前記核酸は、核酸によってコードされるポリペプチドを必要とする対象に直接運搬できる。場合によって、ポリヌクレオチドは培地で核酸を発現することにより生産され、その後、対象に投与される。
【００９２】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、２〜４０個のアミノ酸からなる分子、好ましくは３〜２０個のアミノ酸からなる分子、最も好ましくは６〜１５個のアミノ酸からなる分子を意味する。典型的なペプチドは、前述した方法のいずれか一つ、例えばペプチドライブラリー（例えばファージ提示ライブラリー）で行われる方法あるいはタンパク消化によって誘導される方法によって無作為に生成され得る。
【００９３】
ここで使用された用語「薬物」とは、ヒトまたは動物に投与したときに治療学的活性を示す物質を意味し、例えば、ポリペプチド、化合物、抽出物および核酸などを含むが、これに限定されない。薬物は、好ましくはポリペプチド薬物である。
【００９４】
ここで使用された用語「生理学的活性ポリペプチド」、「生物学的活性分子」、「生理学的活性タンパク質」、「活性ポリペプチド」、「ポリペプチド薬物」および「タンパク薬物」は同一の意味で使用されており、生体内で多様な生理学的機能を示す生理活性型の特徴を有する。
【００９５】
ポリペプチド薬物は、容易に変性される特徴、または体内でタンパク質加水分解酵素によって分解される特徴のため、長期間生理学的活性を維持することができないという欠点がある。ところが、ポリペプチド薬物が本発明に係る免疫グロブリンＦｃ断片に結合（またはカップリング）して融合タンパク質を形成する場合、薬物は構造的安定性および血中半減期が増加する。また、Ｆｃ断片に結合するポリペプチドは他の公知のポリペプチド薬物製剤より生理学的活性が一層少なく減少する。よって、通常のポリペプチド薬物の生体内利用率と比較するとき、本発明のポリペプチド薬物およびＦｃ断片を含む融合ポリペプチド、またはポリペプチド薬物とＦｃ断片との結合体は著しく増加した生体内利用率を有することを特徴とする。これも本発明の実施例によって明確に記述される。すなわち、本発明のＦｃ断片が結合したＩＦＮ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｐ４０、ＴＮＦ受容体および他のタンパク薬物は、それらの天然形態または他の通常の融合形態より生体内利用率を増加させる。
【００９６】
本発明は、Ｆｃ融合タンパク質、本発明によって製造されたＦｃ領域を含む抗体、および本発明の実施に有用な抗体断片を製造するための通常の組み換えＤＮＡ方法論を提供する。Ｆｃ融合構造物は、好ましくはＤＮＡレベルで製造され、製造されたＤＮＡは発現ベクターに挿入され、本発明の融合タンパク質、抗体または抗体断片を生産するために発現される。
【００９７】
ここで使用された用語「ベクター」は、宿主細胞に統合されて宿主細胞ゲノム 内に組み換えおよび挿入でき、あるいはエピソームとして自発的に複製できるヌクレオチド配列を含む核酸手段として理解される。前記ベクターは、線形核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターおよびその類似体を含む。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスを含むが、これに限定されない。ここで使用された用語、目的タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写体の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質生産物または抗体または抗体断片の分泌を意味するものと理解される。
【００９８】
有用な発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）またはその変異体である。有用な発現ベクターは哺乳類細胞で目的遺伝子の連続的な転写を促進するためのヒトＣＭＶ(cytomegalovirus)プロモーター、および転写後ＲＮＡの安定状態水準を高めるためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を含まなければならない。本発明の一つの様態において、発現ベクターはＲｃＣＭＶの変形ベクターｐＡＤ１１である。生物学的活性分子薬物をコードするヌクレオチド配列を運搬する発現ベクターの例は、実施例でさらに詳細に記述されたように、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦＣ−６、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５またはｐＡＤ１１ ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５を含むことができるが、これに限定されない。
【００９９】
適切な宿主細胞は、本発明のＤＮＡ配列で形質転換または形質感染させることができ、目的タンパク質の発現および／または分泌に利用できる。本発明に使用可能な現在好ましい宿主細胞は、不死のハイブリドーマ細胞(immortal hybridoma cells)、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞(NS/0 myeloma cells)、２９３細胞、ＣＨＯ細胞(Chinese hamster ovary cells)、ＨｅＬａ細胞、およびＣＯＳ細胞を含む。
【０１００】
哺乳類細胞において融合タンパク質または抗体または抗体断片を高い水準で発現させるために用いられる一つの発現システムは、５’〜３’方向に、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域、および例えばｐ４０、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ受容体などの標的タンパク質を含む分泌カセットをコードするＤＮＡ構造物である。幾つかの標的タンパク質はこのようなシステムで成功的に発現されているが、例えばＩＬ−２、ＣＤ２６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＯＳＦ−２、ｓｓ；ＩＧ−Ｈ３、ＩｇＥ受容体、ＰＳＭＡ、およびｇｐ１２０などである。このような発現構造物はＬｏ等によって米国登録特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号に開示されており、前記文献の内容は本願に参考として組み込まれる。
【０１０１】
本発明の融合タンパク質または抗体分子または抗体断片は、発現の際にシグナル配列を含んでもよく、含まなくてもよい。ここで使用された用語「シグナル配列」は、生物学的活性分子薬物；融合タンパク質の分泌を指示する断片を意味し、宿主細胞で翻訳された後に切断される。本発明のシグナル配列は、ＥＲ(endoplasmic reticulum)膜を貫通するタンパク質の移動を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明で有用なシグナル配列は、例えば抗体１４．１８(Gillies et al., J. Immunol. Meth. 1989. 125:191-202)などの 抗体軽鎖シグナル配列、例えばＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列(Sakano et al., Nature 1980. 286: 676-683)などの抗体重鎖シグナル配列、および当業界における公知の他のシグナル配列(see, e.g., Watson et al., Nucleic Acids Research 1984. 12:5145-5164)を含む。
【０１０２】
シグナル配列は、当業界にその特徴がよく知られており、通常１６〜３０個のアミノ酸残基を含むものとして知られており、それよりさらに多いあるいはさらに少ないアミノ酸残基を含むことができる。通常のシグナルペプチドは、３つの領域、すなわち基本Ｎ末端領域、中心の疎水性領域、およびより極性のＣ末端領域から構成される。中心の疎水性領域は未成熟ポリペプチドが移動する間に膜脂質二重層を介してシグナル配列を固定させる４〜１２個の疎水性残基を含む。開始以後、シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼとして知られている細胞酵素によってＥＲのルーメン(lumen)内で切断される。シグナルペプチドの潜在的な切断サイトは一般に「（−３、−１）法則」に従う。よって、典型的なシグナルペプチドは小さく、−１および−３位置に中性アミノ酸残基を有し、この部位内にプロリン残基が欠如している。
【０１０３】
シグナルペプチダーゼは、−１および＋１アミノ酸間の前記シグナルペプチドを切断する。よって、シグナル配列は分泌する間に融合タンパク質のアミノ末端から切断できる。これにより、免疫グロブリンＦｃ領域および目的タンパク質から構成されるＦｃ融合タンパク質が分泌される。シグナルペプチド配列の詳細は「von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683」に記述されている。
【０１０４】
特定シグナル配列が分泌カセットへの使用に適するかを調べるためには一般な実験が必要であることは、当業者には明白である。
【０１０５】
このような実験は、融合Ｆｃ融合タンパク質の分泌を誘導するためのシグナル配列の能力に対する決定、最適の形態、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの決定、および融合タンパク質の効果的な分泌を達成するために使用される配列の決定を含むであろう。また、当業者は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）によって提示される方法にしたがって合成シグナルペプチドを製造することができ、一般な実験によって前記合成シグナル配列の有効性をテストすることができる。シグナル配列は「シグナルペプチド」、「リーダー配列」または「リーダーペプチド」を意味することができる。
【０１０６】
シグナル配列と免疫グロブリンＦｃ領域との融合は分泌カセットとも呼ばれる。本発明の実験で有用な代表的な分泌カセットは、５’〜３’方向に、免疫グロブリン軽鎖遺伝子およびヒト免疫グロブリンｙ１遺伝子のＦｃｙ１領域のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫グロブリンＦｃｙ１遺伝子のＦｃｙｌ領域は、好ましくは少なくとも免疫グロブリンヒンジドメインの部分および少なくともＣＨ３ドメインを含み、さらに好ましくは少なくともヒンジドメインの部分、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ここで使用される用語、免疫グロブリンヒンジ領域の「部分」は、鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能な少なくとも一つ、好ましくは２つのシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジの部分を意味する。分泌カセットをコードするＤＮＡは、それのゲノム形態またはそれのｃＤＮＡ形態である。特定の場合には、ヒト免疫グロブリンＦｃｙ２重鎖配列からＦｃ領域を生産することが有利であることもある。ヒト免疫グロブリンｙ１およびｙ２配列に基づいたＦｃ融合はマウスにおいても同様に作用するが、ｙ２配列に基づいたＦｃ融合はヒトにおいて優れた薬動学的特徴を示す。
【０１０７】
他の具体的な様態において、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと目的タンパク質との間に存在するタンパク質分解的切断部位をコードする。切断部位は、コードする融合タンパク質のタンパク質分解的切断を提供し、これにより目的タンパク質からＦｃドメインを分離する。ここで使用される用語「タンパク質分解的切断部位」は、タンパク質分解酵素または他のタンパク質分解製剤によって選択的に切断されるアミノ酸配列を意味する。有用なタンパク質分解的切断部位は、トリプシン(trypsin)、プラスミン(plasmin)またはエンテロキナーゼＫ(enterokinase K)などのタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列を含む。多くの切断部位／切断製剤対が知られている（例えば、米国登録特許第５，２７６，０４４号を参照されたい）。
【０１０８】
また、不変領域ドメインの一つ以上のアミノ酸残基が置換または欠失された不変領域の構造物の置換または欠失が有用であることもある。一つの例は、Ｆｃ受容体に対する親和力を減少させたＦｃ変異体を製造するために上方のＣＨ２部位にアミノ酸置換を導入する(Cole et al. (1997) J. Immunol. 159: 3613)。当業者はよく知られている分子生物学的技術を用いて前記構造物を製造することができる。
【０１０９】
本発明の免疫グロブリンＦｃ断片に結合できるタンパク薬物の例は、ヒト成長ホルモン、ＢＭＰ−１(bone morphogenetic protein-1)、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類およびインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ、受容性タイプＩインターフェロン受容体など）、Ｇ−ＣＳＦ(granulocyte colony stimulating factor)、ＧＭ−ＣＳＦ(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)、グルカゴン様ペプチド(glucagon-like peptides)（例えば、ＧＬＰ−１など）、Ｇタンパク質共役受容体(G-protein-coupled receptor)、インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９−、３０など）およびインターロイキン受容体類（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素（例えば、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、イズロン酸−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、α−ガラクトシダーゼＡ(alpha-galactosidase-A)）、アガルシダーゼαおよびβ(agalsidase alpha and beta)、α−Ｌ−イズロニダーゼ(alpha-L-iduronidase)、ブチリルコリンエステラーゼ、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ(imiglucerase)、リパーゼ、ウリカーゼ(uricase)、血素板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性チエンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)など）、インターロイキンおよびサイトカイン結合タンパク質（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ結合タンパク質など）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制剤、細胞壊死糖タンパク(cell necrosis glycoproteins)、抗毒素(immunotoxin)、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制剤、転移成長因(metastasis growth factor)、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖化赤血球生成因子、アンジオポイエチン；ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩａ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、血液因子ＸＩＩＩ、プラスミノゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジムスターゼ、レプチン、血素板由来成長因子、上皮成長因子、外皮成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨成長因子、骨促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(atriopeptin)、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子(connective tissue activating factor)、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン(follicle stimulating hormone)、黄体形成ホルモン(luteinizing hormone)、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor)、ＡＦ−１(axogenesis factor-1)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(brain natriuretic peptide)、グリア細胞由来神経栄養因子(glial derived neurotrophic factor)、ネトリン(netrin)、好中球抑制因子、神経栄養因子(neurotrophic factor)、ニュートリン(neuturin)など）、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、ココルチコトロピン放出因子(corticotropin releasing factor)、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体例（例えば、ＴＮＦＲ（ｐ７５）、ＴＮＦＲ（ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性化因子受容体など）、受容体拮抗剤（ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、ウイルスワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄ）、およびウイルス由来ワクチン抗原を含む。抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄまたはｓｃＦｖであり得る、このような抗体断片は特異的抗原に結合することができ、好ましくはＦａｂ’である。Ｆａｂ断片は軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）および不変ドメイン（ＣＬ）、および重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、ヒンジ領域からＣＨ１メインのカルボキシル末端まで一つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸残基が添加されたという点で、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆｄ断片はＶＨおよびＣＨ１ンのみを含み、Ｆ（ａｂ’）２断片はジスルフィド結合または化学反応によってＦａｂ’断片が対をなすことにより製造される。ｓｃＦｖ(single-chain Fv)断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＶＬおよびＶＨドメインを含むので、単一ポリペプチド鎖として存在する。
【０１１０】
具体的に、生物学的活性分子として好ましいものは、疾患を治療または予防するために体内に投与されるときに投与頻度が高いもので、ここにはヒト成長ホルモン、インターフェロン（インターフェロン−α、−β、−γなど）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ(erythropoietin)、ＴＮＦ受容体、ｐ４０および抗体断片が含まれる。また、特定誘導体の機能、構造、活性または安定性が生物学的活性分子の天然形態と実質的に同等の場合またはそれより改善された場合、そのような誘導体も本発明の生物学的活性分子の範囲に含まれ、最も好ましいポリペプチド薬物はインターフェロン−αである。
【０１１１】
本発明の別の様態において、例えば、ＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−ＣＨ融合タンパク質は、二量体を形成するために単量体として生産される。典型的に、二量体はＩｇＧヒンジ領域におけるジスルフィド結合によって形成される。ＩｇＧを分泌する細胞からの条件培地は、融合タンパク質はＩｇＧ融合タンパク質単量体および二量体の混合物を含むことができる。ヒトの治療に用いるためには、ＩｇＧ融合タンパク質単量体または二量体の均質集団を使用することが好ましく、２つの形態を混合して使用することは好ましくない。
【０１１２】
また、本発明は、二量体活性ポリペプチド−ＩｇＧ融合タンパク質本来の純粋な形態を得る方法を提供する。その方法は、一般に、ＩｇＧ融合タンパク質を発現させることが可能な宿主細胞を収得し、条件培地を集め、カラムクロマトグラフィーによって単量体融合タンパク質、凝集体および汚染タンパク質から二量体融合タンパク質を精製することにより成し遂げられる。ＩｇＧ融合タンパク質を発現させる適切な宿主細胞は、酵母、昆虫、哺乳類または他の真核細胞を含む。一つの様態において、宿主細胞は哺乳類細胞であってもよく、具体的にＣＯＳ、ＣＨＯはＢＨＫ細胞である。
【０１１３】
また、本発明は、ポリペプチド薬物およびＦｃ断片の新規融合タンパク質を提供する。一つの具体的な様態において、ＥＰＯ、ｐ４０、Ｇ−ＣＳＦまたはＴＮＦ受容体などのポリペプチド薬物はペプチドリンカーの挿入なしでハイブリッドＦｃ断片に直接結合する。他の具体的な様態において、ポリペプチド薬物は１〜５０個のアミノ酸のペプチドリンカーを介して互いに結合し、さらに好ましくは１〜７個のアミノ酸のペプチドリンカーを介して結合する。このような目的に特に有用なリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基からなる（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ配列番号３２）、またはヒトアルブミン由来の配列番号２５の２８２〜３１４位のアミノ酸からなる免疫的に非活性なペプチドを含む。
【０１１４】
リンカーが使用される場合、リンカーおよびポリペプチド薬物は特定の方法で製造できる。すなわち、リンカーはハイブリッドＦｃ断片のＮ末端、Ｃ末端または遊離基に連結でき、またポリペプチド薬物のＮ末端、Ｃ末端または遊離基に連結できる。リンカーがペプチドリンカーの場合、連結は任意の連結部位で起こり得る。ポリペプチド薬物およびハイブリッドＦｃが別個に発現された後で互いに結合するとき、結合(coupling)は当業界における公知の様々な任意の架橋剤を用いて行われ得る。架橋剤の例としては、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸(4-azidosalicylic acid)などのＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むイミドエステル、および例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二機能性マレイミドを含むが、これに限定されない。
【０１１５】
また、本発明は、ポリペプチド薬物−ハイブリッドＦｃ断片の生産方法を提供する。
【０１１６】
また、本発明は、ポリペプチド薬物を投与して疾病を治療する方法を提供する。このような目的は、目的の疾病と直接関連しているあるいは関連していない健康状態を有する哺乳類に本発明のポリペプチドの有効量を投与することを含む。例えば、好ましいポリペプチド薬物−ハイブリッドＦｃ断片融合タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸が個体、好ましくは哺乳類に治療学的製剤として投与できる。また、ポリペプチド薬物−ハイブリッドＦｃ断片融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞は、個体、好ましくは哺乳類に治療学的製剤として投与できる。また、ポリペプチド薬物−ハイブリッドＦｃ断片融合構造物は、個体、好ましくは哺乳類に治療学的有効量で投与できる。前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺経路で投与できる。
【０１１７】
本発明のＥＰＯ（この変異体／断片を含む）−Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳類においてヘマトクリット(hematocrit)を維持し増加させるのに有用である可能性がある。
【０１１８】
ｐ４０はＩＬ−１２のサブユニットである。ＩＬ−１２は生体内で多様な機能を有する７５ｋＤａのヘテロ二量体サイトカインである。例えば、ＩＬ−１２は活性化されたＴおよびＮＫの増殖を促進させ、Ｔｈ−１タイプヘルパー細胞反応を促進させる。ＩＬ−１２は活性化されたＴおよびＮＫ細胞の血漿膜上のＩＬ−１２受容体に結合することにより、生物学的効果を発揮する。ＩＬ−１２がＩＬ−１２受容体に結合する能力はＩＬ−１２のｐ４０サブユニットに起因する。よって、本発明のｐ４０（この変異体／断片を含む）−Ｆｃ融合タンパク質は、（ｉ）自己免疫疾患を予防／治療の症状を緩和させ、（ｉｉ）移植拒否反応を抑制し、または（ｉｉｉ）内毒素により誘導されたショックを治療／予防するのに有用であり得る。また、本発明のｐ４０（この変異体／断片を含む）−Ｆｃ融合タンパク質は、リウマチ性関節炎(rheumatoid arthritis)、強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease)、多発性硬化症(multiple sclerosis)、または乾癬(psoriasis)症状を治療／予防／軽減させるのに有用であり得る。変異体および断片は当業界に知られており、ここに参考として組み込まれる国際公開特許第９７／２００６２号を含むが、これに限定されない。ｐ４０変異体の一様態はＡｓｎ３Ｇｌｎ置換を含むｐ４０を含むが、これに限定されない。
【０１１９】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は顆粒球、特に好中球の増殖および分化に核心的なタンパク質である。顆粒球は、侵入した微生物および細胞残屑を沈めて除去するので、感染反応に核心的である。化学治療は顆粒球を破壊し、および／または顆粒球の生産を減少させる。よって、本発明のＧ−ＣＳＦ（この変異体／断片を含む）−Ｆｃ融合タンパク質は、骨髄移植後に、化学療法によって誘導された好中球減少症骨髄抑制、急性白血病、再生不良性性貧血(aplastic anemia)、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndrome)、重症慢性好中球減少症、または移植のための末消血液前駆細胞の可動化(mobilization of peripheral blood progenitor cells)症状の治療／予防／軽減に有用である。
【０１２０】
本発明の融合タンパク質は、治療学的製剤として有用であるうえ、診断学的使用のための抗体の生産においても有用であることを当業者であれば認識することができる。その他にも、本発明の使用方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの適切な投与、例えばそのような投与目的のベクターまたは他の伝達システムを含む。
【０１２１】
本発明の組成物はいずれの経路でも投与できる。本発明の組成物は直接（例えば、組織部位に注入、移植または局部的に投与することにより、局所的に）またはシステム的に（例えば、非経口または経口で）任意の適切な手段によって動物に提供できる。本発明の組成物が静脈内、皮下、眼、腹腔内、筋肉内、口腔、直腸、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊椎内、脳室内、くも膜下腔、嚢内、カプセル内、鼻内、またはエアロゾル投与のように非経口的に提供される場合、組成物は好ましくは水性、あるいは生理学的に適用可能な体液懸濁液または溶液の部分を含むことが好ましい。これにより、担体またはビヒクルが生理学的に許容可能なので、組成物に添加して患者に伝達できる。これは患者の電解質および／または体積バランスに悪影響を及ぼさない。よって、製剤のための液状媒体として、一般に生理食塩水を含むことができる。
【０１２２】
本発明のＤＮＡ構造物（または遺伝子構造物）は、ポリペプチド薬物またはその融合タンパク質構造物をコードする核酸を運搬する遺伝子治療プロトコルの一部として使用できる。
【０１２３】
本発明は、所望のポリペプチド薬物の機能を再構成または補充するために、特定の細胞タイプで目的のポリペプチド薬物またはその融合タンパク質構造物を生体内感染および発現させる発現ベクターを特徴とする。所望のポリペプチド薬物の発現構造物、またはその融合タンパク質構造物は、任意の生物学的有効担体と共に投与できるが、例えば、生体内細胞に所望のポリペプチド薬物コード遺伝子またはその融合タンパク質を効率よく運搬することが可能な任意の剤形または組成物などがそれである。
【０１２４】
本発明は、組み換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１を含むウイルスベクター、または組み換えバクテリアプラスミドまたは組み換え真核プラスミド内に対象遺伝子を挿入することを含む。本発明の融合タンパク質をコードする核酸の好ましい投与量は、ヒトの場合に０．１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり、さらに好ましくは１ｍｇ〜１０ｍｇ、最も好ましくは２ｍｇ〜１０ｍｇである。最適量および投与形態は当業界の技術水準に属する一般な実験によって決定することができる。
【０１２５】
融合タンパク質の好ましい単位投与量は、ヒトの場合に０．１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、さらに好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇ、および最も好ましくは５ｍｇ〜２０ｍｇである。これが最適量ではあるが、治療対象疾患および副作用の有無によって異なる。ところが、最適の投与量は通常の実験を用いて決定できる。融合タンパク質の投与は周期的な急速注入(periodic bolus injections)により、あるいは外側供給源(external reservoir)（例えば、静脈注射保有袋または内側（例えば、生体腐食性インプラント）からの持続的な静脈内、皮下、または腹膜内投与によることができる。
【０１２６】
しかも、本発明の融合タンパク質は、他の生物学的活性分子と共に対象受容体に投与できる。ところが、融合タンパク質および他の分子の最適の組み合わせ、投与形態、定量は当業界における公知の通常の実験によって決定できる。
【実施例】
【０１２７】
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。但し、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【０１２８】
〔実施例１：ｈＦｃ−１、ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４、ｈＦｃ−５およびｈＦｃ−６融合タンパク質の発現ベクターの製造〕
ｈＦｃ−１はＣ末端ＩｇＧ１ ＣＨ１領域の９個のアミノ酸（９０〜９８）、ＩｇＧ１のヒンジ領域（９９〜１１３）、Ｎ末端ＩｇＧ２ ＣＨ２領域の６個のアミノ酸（１１１〜１１６）、ＩｇＧ４ ＣＨ２領域の１０３個のアミノ酸（１１８〜２２０）、およびＩｇＧ４ ＣＨ３領域の１０７個のアミノ酸（２２１〜３２７）を含む（図１および図２）。ｈＦｃ−１のアミノ酸配列は配列番号１８に示されている。ｈＦｃ−１（配列番号１）、ヒトＥＰＯ（配列番号７）、ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号８）およびヒトｐ４０Ｎ３０３Ｑ（ヒトｐ４０サブユニットの３０３番目のアミノ酸ＡｓｎがＧｌｎで置換された突然変異）（ｐ４０Ｎ３０３Ｑのヌクレオチド配列は配列番号９に示されており、ヒトｐ４０のアミノ酸配列は配列番号１７に示されている）をコードするコドン最適化ヌクレオチドを得るために、それぞれこのようなヌクレオチド分子をＴＯＰ ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）(www.topgenetech.com)のカスタムサービスによって合成した。タンパク質発現水準を増加させるために、遺伝子のコドン使用を最適化させることが非常に効果的である。コドン使用のパターンは有機体間で互いに異なる。あるコドンはいずれか一つの有機体で非常に頻繁に使用されるが、他の有機体では殆ど使用されない。コドン使用におけるこのような傾向は、翻訳効率、コードされたタンパク質を合成するための有機体の能力に影響を与える。発現ベクターｐＡＤ１１（配列番号１０）に各融合遺伝子を挿入させるために、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびｐ４０Ｎ３０３ＱのＡＴＧ配列の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を生成させ、ｈＦｃ−１の終止コドンの３’末端にＸｂａＩ部位を生成させた。発現ベクターｐＡＤ１１はＲｃＣＭＶ骨格から収得した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄから可能）。ｐＡＤ１１はＣＭＶ(cytomegalovirus)に由来したプロモーター、ウシ成長ホルモンに由来したポリ（Ａ）配列、ウサギベータグロビンに由来したｇＩＶＳ(globin intervening sequence) (Mol Cell Biol, 1988 8: 4395)、およびその他の要素を含む。ｐＡＤ１１ベクターを製造するためには、ＲｃＣＭＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を複数箇所変形させる。まず、ネオマイシン抵抗性部位はＸｈｏＩ酵素によって除去させ、ｇＩＶＳをＣＭＶプロモーター部位の３’に追加させた。また、マウスＤＨＦＲ(dihydrofolate reductase)遺伝子(Pubmed, NM 010049)はＣＭＶプロモーターの５’に追加させた。ｐＡＤ１１ベクターは、前述したものを含む幾つかの要素の組み合わせ状態で各種発現テストを経て開発された。われわれの未発表結果において、ｐＡＤ１１ベクターはＲｃＣＭＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と比較するとき、発現水準において約１２倍の増加を示した。フレーム内でＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびｐ４０Ｎ３０３Ｑの３’末端とｈＦｃ−１の５’末端との連結部位を製造するために、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびｐ４０Ｎ３０３Ｑのコード配列の３’末端とｈＦｃ−１のコード配列の５’末端にＮｈｅＩ部位を生成させた。各制限酵素部位を用いたサブクローニングの後、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦまたはｐ４０Ｎ３０３Ｑで融合したｈＦｃ−１最終発現ベクターが製造された。これらをそれぞれｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１およびｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−１と命名した。
【０１２９】
ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４、ｈＦｃ−５およびｈＦｃ−６のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１９〜２３に示されている。ｈＦｃ−６はＩｇＤ ＣＨ１ドメインＣ末端の９個のアミノ酸（９０〜９８）、ＩｇＤのヒンジ領域の６４個のアミノ酸（９９〜１６２）、ＩｇＤ ＣＨ２ドメインＮ末端の８個のアミノ酸（ｓｈｔｑｐｌｇｖ １６３〜１７０）、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインの１００個のアミノ酸（１２１〜２２０）、およびＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインの１０７個のアミノ酸（２２１〜３２７）を含む（図１および図２）。ｈＦｃ−６（配列番号６）をコードするコドン最適化ヌクレオチド分子を収得するために、遺伝子はＴＯＰ Ｇｅｎｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ(www.topgenetech.com)のカスタムサービスによって合成した。フレーム内でＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、またはｐ４０Ｎ３０３Ｑの３’末端およびｈＦｃ−６の５’末端を融合させるために、ｈＦｃ−６のＮ末端コード部位（９０および９１アミノ酸）に含まれたＮｈｅＩ部位（ｇｃｔａｇｃ：Ａｌａ−Ｓｅｒ）を使用した。また、ｐＡＤ１１ベクター内に各ｈＦｃ−６融合遺伝子を挿入するために、ＸｂａＩ部位をｈＦｃ−６遺伝子の３’末端に生成させた。各制限酵素部位を用いてサブクローニングした後、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびｐ４０Ｎ３０３Ｑが融合したｈＦｃ−６を製造するための最終発現ベクターが製造された。これらをそれぞれｐＡＤ１１ ｐＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−６およびｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−６と命名した。ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４、およびｈＦｃ−５は同一のＣＨ２およびＣＨ３部位を有するが、それらはＩｇＤヒンジのサイズが互いに異なる（図１および図２）。ｈＦｃ−２（配列番号１９）、ｈＦｃ−３（配列番号２０）、ｈＦｃ−４（配列番号２１）、およびｈＦｃ−５（配列番号２２）はそれぞれ、Ｃ末端ＩｇＤヒンジの５個のアミノ酸（１５８〜１６２）、１０個のアミノ酸（１５３〜１６２）、２０個のアミノ酸（１４３〜１６２）、３０個のアミノ酸（１３３〜１６２）を含む（図１および図２）。ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ｐ４０Ｎ３０３ＱまたはＴＮＦＲ(tumor necrosis factor receptor II)（配列番号３０）、およびこのようなｈＦｃをコードする核酸分子（配列番号２〜５）間の融合遺伝子を製造するために、融合した遺伝子の全体サイズにおける最小遺伝子断片をＴＯＰ ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ(ww.topgenetech.com)のカスタムサージスによって合成した。各ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４またはｈＦｃ−５のヒンジおよびＮ末端ＣＨ２領域をコードするヌクレオチド分子に融合した各ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ｐ４０Ｎ３０３ＱびＴＮＦＲの断片は、全体ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ｐ４０Ｎ３０３ＱまたはＴＮＦＲ配列からＩｇＧ４内のＣＨ２領域（配列番号１３）の１３８〜１４０番目のアミノ酸残基に位置する同一酵素部位としてのＢｓｔＥＩＩ部位（ＧＧＴＧＡＣＣ）までを含む。各種遺伝子断片を含むサブクローニングベクターは、それぞれ５’末端および３’末端に位置するＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断された後、ｈＦｃ−６のＣＨ２〜ＣＨ３部位に連結される。最終的に、各融合遺伝子はＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位を用いてｐＡＤ１１にサブクローニングさせ、これらをそれぞれｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−２、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−３、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−４、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−２、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−３、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−４、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−２、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−３、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−４、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５、およびｐＡＤ１１ ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５と命名した。
【０１３０】
〔実施例２：ＩＦＮ−βに結合したｔｈＦｃ−１およびｔｈＦｃ−２のための発現ベクターの製造〕
ｔｈＦｃ−１はヒトｔＰＡ(tissue plasminogen activator)のシグナル配列の２３個のアミノ酸（ＭＤＡＭＬＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ）、ＩｇＧ１ヒンジ領域の１５個のアミノ酸（９９〜１１３）、Ｎ末端ＩｇＧ２ ＣＨ２領域の６個のアミノ酸（１１１〜１１６）、ＩｇＧ４ ＣＨ２領域の１０３個のアミノ酸（１１８〜２２０）、およびＩｇＧ４ ＣＨ３部位の１０７個のアミノ酸（２２１〜３２７）を含む。ｔｈＦｃ−１のアミノ酸配列は配列番号２８に示されている。ｔｈＦｃ−２はｔＰＡシグナル配列の２３個のアミノ酸（ＭＤＡＭＬＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ）、ＩｇＤヒンジ領域の１５個のアミノ酸（１４８〜１６２）、Ｎ末端ＩｇＤ ＣＨ２領域の８個のアミノ酸（１６３〜１７０）、ＩｇＧ４ ＣＨ２部位の１００個のアミノ酸（１２１〜２２０）、およびＩｇＧ４ ＣＨ３領域の１０７個のアミノ酸（２２１〜３２７）を含む（図３）。ｔｈＦｃ−２のアミノ酸配列は配列番号２９に示されている。シグナル配列の除去されたヒトＩＦＮ−βのＮ末端に結合したｔｈＦｃ−１（配列番号２６）またはｔｈＦｃ−２（配列番号２７）をコードするコドン最適化ヌクレオチドを収得するために、このようなヌクレオチド分子をＴＯＰ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ、 Ｃａｎａｄａ）(www.topgenetech.com)のカスタムサービスによって合成した。発現ベクターｐＡＤ１１（配列番号１０）に各融合遺伝子を挿入するために、ｔｈＦｃ−１またはｔｈＦｃ−２の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を生成させ、ＩＦＮ−βの終止コドンの３’末端にＮｏｔＩ部位を生成させた。各制限酵素部位を用いてサブクローニングした後、最終発現ベクターをそれぞれｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａと命名した。
【０１３１】
相異なるサイズのアルブミンリンカーまたはＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してＩＦＮ−βに結合したｔｈＦｃを製造するために、結合したｔｈＦｃ−１のＣＨ３領域のＰｓｔＩ部位から相異なるサイズのアルブミンリンカー（３ａａ、８ａａ、１３ａａ、１８ａａ、２３ａａおよび３３ａａ）またはＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（１５ａａ）を介してそのシグナル配列が除去されたＩＦＮ−βの範囲を有する遺伝子断片をＴＯＰ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ(wwww.topgenetech.com)のカスタムサービスによって合成した（図４）。発現ベクターｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａに７個の相異なる遺伝子断片を挿入させるために、ＰｓｔＩ部位をそれらの５’末端に生成させ、ＮｏｔＩ部位をＩＦＮ−βの終止コドンの３’末端に生成させた。各制限酵素部位を用いてサブクローニングした後、最終発現ベクターをｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（１）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（２）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（４）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（５）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（６）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＧＳ−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、およびｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（１）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（２）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（４）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（５）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（６）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、およびｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＧＳ−ＩＦＮ−ｂｅｔａと命名した。
【０１３２】
〔実施例３：ヒトＥＰＯ−ｈＦｃｓ、ヒトＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃｓ、ヒトｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃｓ、ヒトＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびｔｈＦｃｓ−ＩＦＮ−ｂｅｔａタンパク質の発現〕
発現検証のためにＣＯＳ−７細胞を使用し、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ）および抗生物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）の添加されたＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）で培養した。ＥＰＯ−ｈＦｃｓ、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃｓ、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃｓ、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５、ｔｈＦｃｓ−ＩＦＮ−ｂｅｔａをコードするベクターは、通常のエレクトロポレーション方法を用いて５×１０６ＣＯＳ−７細胞に感染させた。感染４８時間後、上澄み液および細胞を収得した。各ベクターからの融合タンパク質の発現を確認するために、全てのサンプルは多数のキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、＃ＤＥＰ００ ｆｏｒ ＥＰＯ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、＃ＫＨＣ２０３２ ｆｏｒ Ｇ−ＣＳＦ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、＃ＤＹ１２４０ ｆｏｒ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、＃ＤＲＴ２００ ｆｏｒ ＴＮＦＲ；ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃４１４１０−１Ａ ｆｏｒ ＩＦＮ−ｂｅｔａ）を用いてＥＬＩＳＡ分析し、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いてウエスタンブロット分析した。その結果、全てのベクターは上澄み液および細胞溶解物で正確な発現様相を示した（データは提示されない）。
【０１３３】
〔実施例４：ｈＦｃ融合タンパク質の精製〕
ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−／−（ＣＨＯ細胞、ＤＧ４４、ＡＴＣＣ）は、α−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）、１０％透析ウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ）、ＨＴ補充剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）および抗生物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）で培養した。通常のＣａＰＯ４共沈法によって発現ベクターをＣＨＯ細胞に感染させた。感染４８時間後、ＣＨＯ細胞をプレートから取り外し、様々な比率（１／２、１／５、１／２０、１／５０、１／１００、１／２００、１／５００）で希釈させた。希釈した細胞は１００ｍｍのディッシュに接種し、ＨＴ補充剤のない培地で培養した。スクリーニング過程中に、継代していない細胞にＨＴ補充剤のない新規培地を供給した。コロニーは接種２〜３週後に生成され、各コロニーを４８ウェルプレートに移した。ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ｐ４０Ｎ３０３ＱおよびＴＮＦＲ検出に対するＥＬＩＳＡ分析によって陽性コロニーをスクリーニングした。最も高い発現を示した各コロニーは無血清培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ）を用いて大規模（５Ｌ）培養した。収得された無血清上澄み液は各融合タンパク質の精製に使用した。精製のために２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）でＨｉＴｒａｐ組み換えタンパク質Ａ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）カラムの均衡を維持させた。濾過された上澄み液をカラムに添加し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出したタンパク質は膜（ＭＷＣＯ １２ １４Ｋ、ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）で３回以上透析した後、最終的に収得した。タンパク質サンプルの全ての濃度は総タンパク質を測定するためのＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）およびＥＰＯ−ｈＦｃｓ、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃｓ、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃｓ、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびｔｈＦｃｓ−ＩＦＮ−ｂｅｔａを測定するためのＥＬＩＳＡキットによって決定した。
【０１３４】
〔実施例５：ＦｃｇＲＩおよびＣｌｑ結合分析〕
ｈＦｃ−５融合タンパク質がＦｃｇＲＩおよびＣｌｑに結合するか否かを調べるために、ＭａｂＴｈｅｒａ（リツキシマブ(Rituximab)、Ｒｏｃｈｅ）、ｈＩｇＧ１（カルバイオケム(Calbiochem)、Ｃａｔ＃、４００１２０）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト(Etanercept)、Ａｍａｇｅｎ）、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５およびｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５を連続的に希釈し（２μｇ／ｍＬから１６ｎｇ／ｍＬまで２培ずつ）、４℃で８ウェルストリップ上に一晩結合させておいた。標準曲線を作るために、ＦｃｇＲＩ（Ｒ＆Ｄ、ｃａａｔ＃ＢＡＦ１２５７）またはＣｌｑ（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃、２２２１〜５５０４）も連続的に希釈し（２μｇ／ｍＬから３２ｎｇ／ｍＬまで２倍ずつ）、４℃で一晩８ウェルストリップ（ＣＯＳＴＡＲ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）上に一晩結合させておいた。洗浄バッファ（０．０５％ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で各サンプルのストリップを洗浄し、室温で１時間ＰＢＳで１０％ＦＢＳで抑制した後、各ウェルに２μｇ／ｍＬのＦｃｇＲＩまたはＣｌｑを添加し、しかる後に、室温で２時間培養した。全てのストリップは洗浄バッファで洗浄した。Ｃｌｑ結合検証のために、各ウェルに２．５μｇ／ｍＬの抗−Ｃｌｑ（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ＃．２２２１〜５００４Ｐ）結合ＨＲＰを添加した後、暗条件の室温で３０分間培養した。ＦｃｇＲＩ結合検証のために、各ウェルに２μｇ／ｍＬのビオニン化抗−ＦｃｇＲＩ（Ｒ＆Ｄ、ｃａｔ＃．１２５７−ＦＣ）を添加した後、室温で１時間培養した。洗浄バッファでこれらを洗浄した後、３０００倍で希釈されたストリプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ、ｃａｔ＃．５５４０６６）を各ストリップに添加し、しかる後に、暗条件の室温で３０分間培養した。ストリップを洗浄した後、ＴＭＢ溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ基質溶液Ｂ、ＫＰＬの１：１混合物、ＫＰＬ、ｃａｔ＃．５０−７６−０１、ｃａｔ＃，５０−６５−００）を添加し、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加した。図６（ａ）および図６（ｂ）に示すように、ＭａｂＴｈｅｒｅ（登録商標）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）およびｈＩｇＧ１はＦｃｇＲＩおよびＣｌｑによく結合したが、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、およびｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５はそうではない。
【０１３５】
〔実施例６：精製されたｈＦｃ融合タンパク質の試験管内生物活性〕
ＥＰＯ−ｈＦｃタンパク質の試験管内生物活性を調べるために、ヒトＦ３５Ｅ細胞株を、１０％ＦＢＳ、抗生物質および５ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＥＰＯ（ＤｏｎｇＡ、韓国）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）で培養した。９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）のテストウェルに２×１０４細胞を接種して生物学的検定を行った。このようなウェルに、ＥＰＯ、ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ＥＰＯ−ＩｇＧ１ ＦｃまたはＡｒａｎｅｓｐ（ダーベポエチンアルファ、Ａｍｇｅｎ）を連続的に希釈した（０、０．０６４ｍＩＵ／ｍＬ〜２５ＩＵ／ｍＬ）サンプルを添加した。プレートは湿っぽい５％ＣＯ２培養器に３７℃で７２時間培養した。製造社のプロトコルによって、細胞成長比色分析キット(cell growth colorimetric assay kit)（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、韓国）を用いてＭＴＴ分析を行った。ヒトＦ３５Ｅ細胞株は、細胞数および吸光度値における用量依存方式によって証明されたように、ｒＥＰＯに対して強い増殖反応を示した。図７（ａ）に示すように、ＩｇＧ１ ＦｃまたはｈＦｃに結合したＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）およびＥＰＯタンパク質はＥＰＯタンパク質に比べて生物学的活性が減少した。ところが、ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＥＰＯ−ｈＦｃ−６はＥＰＯ−ＩｇＧ１ Ｆｃより著しく増加した生物活性を示した。また、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＥＰＯ−ｈＦｃ−６はＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）より若干高い生物活性を示すが、これはｈＦｃ融合タンパク質がＥＰＯタンパク質の生物活性維持においてＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）よりさらに優秀に見えることを意味する。
【０１３６】
試験管内Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃタンパク質の生物活性を調べるために、マウス造血細胞株ＮＦＳ−６０を、１０％ＦＢＳ、抗生物質および１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｎ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）で培養した。９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）のウェルに２×１０４細胞を接種して生物学的検定を行った。このようなウェルに、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５およびＮｅｕｌａｓｔａを連続的に希釈（０〜１００００ｐｇ／ｍＬの範囲で３倍ずつ）したサンプル（ペグフィルグラスチム、Ａｍｇｅｎ）を添加した。プレートは湿っぽい５％ＣＯ２培養器に３７℃で７２時間培養した。タンパク質サンプルはトリプリケートウェル(Tiplicate well)で分析し、このような実験は５回繰返し行われた。７２時間培養後、製造社のプロトコルによって、細胞成長比色分析キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、韓国）を用いてＭＴＴ分析を行った。図７（ｂ）に示すように、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５はＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）より若干高い試験管内生物活性を示した。
【０１３７】
ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃタンパク質の試験管内生物活性を調べるために、１０％ＦＢＳ、および抗生物質を添加したＰＲＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）で、抗ヒトＣＤ３抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、＃ＭＡＢ１００）２μｇ／ｍＬが存在し、ヒトｐ４０（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）１０ｎｇ／ｍＬまたはｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５が存在するまたは非存在しない環境でリウマチ性関節炎患者のＰＢＭＣｓ(peripheral blood mononuclear cells)を培養した。６日の後、ＣＤ４およびＩＬ−１７に対して陽性の細胞をＦＡＣＳ分析によって測定した。図７（ｃ）に示すように、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５はｐ４０タンパク質よりＣＤ４＋／ＩＬ−１７＋細胞の生産においてさらに強力な抑制効果を示したが、これはＴｈ１７の極性化(polarization)におけるｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５の抑制機能を示す。
【０１３８】
ＴＮＦＲ−ｈＦｃタンパク質の試験管内生物活性を調べるために、マウスＬ９２９細胞を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）培地で培養した。９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）のウェルに３×４１０個の細胞を接種して細胞変性抑制分析(cytopathic inhibition assay)を開始し、しかる後に、ＴＮＦ−α １ｎｇ／ｍＬを処理した。このようなウェルに、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト(etanercept)、Ａｍｇｅｎ）が連続的に希釈された（１５．６〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で、２倍ずつ）サンプルを添加した。プレートは湿っぽい５％ＣＯ２培養器に３７℃で７２時間培養した。培養の後、製造社のプロトコルによって、細胞成長比色分析キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、韓国）を用いてＭＴＴ分析を行った。図７（ｄ）に示すように、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５は試験管内でＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より若干高い生物活性を示した。
【０１３９】
ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａタンパク質の試験管内生物活性を調べるために、ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２５）が１０％ＦＢＳおよび抗生物質の添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）培地で培養された。９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）のウェルに３×４１０個の細胞を接種して細胞変性抑制分析を行い、しかる後に、ＶＳＶ（ＡＴＣＣ、ＶＲ−１５８）１５００ＰＦＵ／ｗｅｌｌで処理した。このようなウェルに、組み換えＩＦＮ−ｂｅｔａ（ＷＨＯ標準、ＮＩＢＳＣ ００／５７２）、ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａタンパク質が連続的に希釈されたサンプル（４０ＩＵ／ｍＬから２倍ずつ）を添加した。プレートは湿っぽい５％ＣＯ２培養器に３７℃で７２時間培養した。培養の後、製造社のプロトコルによって、細胞成長比色分析キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、韓国）を用いてＭＴＴ分析を行った。図７（ｅ）に示すように、ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａはｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａより２０倍さらに高い生物活性を示したが、これはＦｃに融合したＩＦＮ−βの生物活性を維持するのにアルブミンリンカーが重要な役割を果たすことを示す。
【０１４０】
〔実施例７：精製されたｈＦｃ融合タンパク質の生体内半減期〕
ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）の半減期を比較するために、１５匹のカニクイザルに単一皮下（subcutaneous、ＳＣ）注入または単一静脈（intravenous、ＩＶ）注入を介して２４００ＩＵ／ｋｇの量でこれらタンパク質を処理した。注入前、および注入後１、３、６、１２、２４、３０、４８、５４、７２、７８、９６、１２０、１６８、３３６、５０４、および６７２時間に各猿の血液サンプルを収得した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温で培養した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、各サンプルから血清を収得し、超低温冷凍庫に貯蔵した。各時間に収得した全てのサンプルを定量化するために、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットを用いてテストした。図８（ａ）に示すように、ＳＣまたはＩＶ経路を経てＥＰＯ−ｈＦｃ−１またはＥＰＯ−ｈＦｃ−５が注入された全ての猿は、ＳＣまたはＩＶ経路を経てＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）が注入された猿より長い半減期を示した。
【０１４１】
Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１の薬動学を調査するために、グループ当り２匹の雄ＳＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）にＳＣまたはＩＶ経路を経て対照群としてＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）（フィルグラスチム(filgrastim) 、ＤｏｎｇＡ、韓国）１００μｇ／ｋｇおよびＧＣＳＦ−ｈＦｃ−１を投与した。注入前、および注入後１、２、３、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０および１９２時間に血液サンプルを収得した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温で培養した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、各サンプルから血清を収得し、超低温冷凍庫に貯蔵した。サンプルはＧ−ＣＳＦキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、＃ＫＨＣ２０３２）を用いて１／２、１／５、１／５０、１／２５０、１／５００などの幾つかの希釈比率で定量した。図８（ｂ）に示すように、ＳＣたはＩＶ経路を経て注入されたＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１はＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）より長い半減期を示した。Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１およびＧ−ＣＳＦは、ＳＣ投与後にそれぞれ８．７６時間および２．３６時間の生体内半減期を有し、ＩＶ投与後にそれぞれ１０．４２時間および１．７８時間の生体内半減期を有した。よって、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１は、ＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）と比較するとき、ＳＣ注入の場合に３．７倍の半減期増加を示し、ＩＶ注入の場合には５．９倍の半減期増加を示した。
【０１４２】
ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）の薬動学を調査するために、グループ当り３匹のカニクイザルに１００μｇ／ｋｇの量でこれらタンパク質を単一ＳＣ注入処理した。各猿の血液サンプルは注入前、および注入後８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、３３６、５０４および６７２時間に収得した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温で培養した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、各サンプルから血清を収得し、超低温冷凍庫に貯蔵した。各時間に収得した全てのサンプルは、ヒトｐ４０およびヒトＴＮＦＲＩＩを定量化するために、ＥＬＩＳＡキットを用いてテストした。図８（ｃ）に示すように、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より低いＣｍａｘ値（平均３ｎｇ／ｍＬ ｖｓ ７ｎｇ／ｍＬ）を示したが、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より長い半減期を示した（平均１９９ｈ ｖｓ １２７ｈ）。
【０１４３】
ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）の薬動学(pharmacokinetics)を調査するために、グループ当り３匹のＳＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）に５００μｇ／ｋｇの量でこれらタンパク質を単一ＳＣ注入した。各ラットの血液サンプルは注入前、および注入後２、４、８、１２、２４、３０、４８、７２、９６および１２０時間に収得した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温で培養した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、各サンプルから血清を収得し、超低温冷凍庫に貯蔵した。各時間に収得した全てのサンプルは、ヒトＴＮＦＲＩＩを定量化するために、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、＃ＤＲＴ２００）を用いてテストした。図８（ｄ）に示すように、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）の半減期と類似であったが（平均２８．６ｈ ｖｓ ２９．４ｈ）、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より高いＡＵＣ水準を示した（平均１９８．１ ｖｓ １７２．９μｇ＊ｈ／ｍＬ）。
【０１４４】
〔実施例８：精製されたｈＦｃ融合タンパク質の生体内生物活性〕
ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）の生体内生物活性を比較するために、グループ当り３匹のカニクイザルに２４００ＩＵ／ｋｇの量でこれらタンパク質を単一ＳＣ注入または単一ＩＶ注入処理した。注入前、および注入後１、３、６、１２、２４、３０、４８、５４、７２、７８、９６、１２０、１６８、３３６、５０４および６７２時間に各猿の血液サンプルを収得した。
【０１４５】
ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）の生体内生物活性を評価するために、網状赤血球を含む多様な血液細胞の数を測定した。図９（ａ）に示すように、猿における網状赤血球の増加に関連し、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５はＳＣおよびＩＶ経路の両方ともでＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）より若干高い生体内効能を示した。
【０１４６】
Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１の生体内生物活性を調査するために、対照群としてＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）（フィルグラスチム、ＤｏｎｇＡ、韓国）、およびＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１を１００μｇ／ｋｇの量でＳＣまたはＩＶ経路を経てグループ当り２匹の雄ＳＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）に投入した。注入前、および注入後１、２、３、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０および１９２時間にＥＤＴＡを用いて血液を収得した。各血液サンプルはＲＢＣ溶解バッファ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）で４分間処理し、ＦＡＣＳバッファで希釈された総ＷＢＣｓ(white blood cells)は血球計数器(hematocytometer)を用いて３回繰返しカウントした。ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いてＦＳＣ（正方向スキャター）で細胞サイズを決定し、ＳＳＣ（側面スキャター）で顆粒のサイズを決定することにより、顆粒球の数を測定した。図９（ｂ）に示すように、ＳＣおよびＩＶ経路を介して処理されたＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）は注入２４時間後にＷＢＣおよび顆粒球のピーク数を誘導した。これに対し、Ｇ−ＣＦＳ−ｈＦｃ−１はＳＣ注入７２時間後、およびＩＶ注入４８時間後にＷＢＣおよび顆粒球のピーク数を誘導した。注入後２４時間〜１２０時間に、ＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）と比較するとき、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１は生体内生物活性をさらに高く持続させた。
【０１４７】
以上、本発明を好適な実施例として開示および記述したが、当業者であれば、添付した請求の範囲によって定められる本発明の精神と範囲から逸脱することなく、発明の形態および詳細の多様な変更が可能であることを理解するであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明は、生物学的活性分子およびこの生物学的活性分子に連結された免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインを含む融合タンパク質に関する。Ｆｃドメインは（ｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４、または（ｉｉ）ＩｇＧ４およびＩｇＤのハイブリッドヒトＦｃドメインである。ハイブリッドＦｃは生物学的活性分子の担体として有用である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ハイブリッドヒトＦｃ、および前記ハイブリッドヒトＦｃが生物学的活性分子に結合した免疫グロブリン融合タンパク質に関する。具体的に、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）サブクラス同士の組み合わせまたはヒトＩｇＤとＩｇＧとの組み合わせに由来するハイブリッドヒトＦｃ、および前記Ｆｃが共有結合を介して生物学的活性分子に結合した融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物学的活性分子は治療学的に非常に重要である。ところが、これらは、生体内安定性が低いため、治療学的製剤として不利になることもある。これら生物学的活性分子は生体内で多様な酵素によって分解されるため、これらの循環半減期(circulating half-life)または血中半減期(serum half-life)は短い。よって、生物学的活性分子の循環半減期を増加させることが要求される。
【０００３】
タンパク質のサイズ増加が腎臓によるタンパク質除去を妨害するので、その半減期が増加できると知られている(Knauf et al., J. Biol. Chem. 1988. 263:15064-15070)。例えば、ヒトアルブミンに活性タンパク質を結合させることによりタンパク質安定性を増加させるということが報告されている(Kinstler et al., Pharm. Res. 1995. 12: 1883-1888)。ところが、ヒトアルブミンに活性タンパク質を結合させることは滞留時間を若干増加させるだけなので、効果的な活性タンパク質含有薬学的剤形を開発するためにヒトアルブミンを結合させることは適切な方法ではない。
【０００４】
この他に報告された方法はタンパク質の糖化(glycosylation)を調節することである。タンパク質における追加糖化およびタンパク質へのシアル酸導入は、肝におけるタンパク質分解の防止を誘導する。ところが、タンパク質糖化の増加はまたタンパク質の生物活性の減少を同時にもたらす。
【０００５】
タンパク質を安定化し且つ腎臓による除去を防止するために、タンパク質はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合してきた。ＰＥＧへの共有結合は長引く半減期を有する薬物を運搬するのに広く用いられている(Delgado et al., 1992. 9: 249-304)。ところが、サイトカイン(cytokines)またはホルモンにＰＥＧを結合させることは、結合による立体障害(steric hindrance)により受容体結合親和力を減少させる結果を引き起こすと報告されている。
【０００６】
最近、免疫グロブリン（Ｉｇ）を用いて製造された融合タンパク質が研究・開発されている。Ｉｇは血液の主要構成成分である。ヒトＩｇ（ｈＩｇ）は多様な部類、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥなどを含む(Roitt et al., "Immunology" 1989, Gower Medical Publishing, London, U. K.; New York, N. Y.)。ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）、ヒトＩｇＧ２（ｈＩｇＧ２）、ヒトＩｇＧ３（ｈＩｇＧ３）、およびヒトＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４）として知られている様々な亜型にさらに分類できる。
【０００７】
免疫グロブリンは４つのポリペプチド鎖からなるが、これら２つの重鎖または２つの軽鎖は四量体を形成するためにジスルフィド結合を介して連結されている。各鎖は可変領域および不変領域から構成されている。重鎖の不変領域はイソタイプによって３つの部位または４つの部位（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４）にさらに分けられる。重鎖不変領域のＦｃ領域は、Ｉｇイソタイプに応じて、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３および／またはＣＨ４ドメインを含む。
【０００８】
血中半減期に関連し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４は２１日の長い半減期を有するが、他の免疫グロブリンは相対的に１週以下の短い半減期を有する。ＩｇＧのＦｃ領域に融合したキメラタンパク質は増加した安定性および増加した血中半減期を示す(Capon et al., Nature 1989. 337: 525-531)。生物学的活性タンパク質はＣＨ１部位のＮ末端、Ｆｃ部位のＮ末端、またはＩｇＧｓのＣＨ３部位のＣ末端に融合してきた。
【０００９】
初めに、ＩｇＧ融合タンパク質は、ＣＤ４(Capon et al., Nature 1989. 337: 525-531)、ＴＮＦＲ(Mohler et al., J. Immunology 1993. 151: 1548-1561)、ＣＴＬＡ４(Linsley et al., J. Exp. Med. 1991. 173: 721-730)、ＣＤ８６(Morton et al., J. Immunology 1996. 156: 1047-1054)などの細胞表面受容体の細胞外ドメインに付着してきた。また、ＩｇＧドメインに融合してきた幾つかのサイトカインおよび成長ホルモンがある。ところが、細胞表面受容体の細胞外ドメインに融合した場合とは異なり、ＩｇＧに水溶性タンパク質が融合した場合、非融合サイトカインまたは成長因子と比較するとき、生物学的活性を減少させる結果を引き起こす。キメラタンパク質は二量体として存在するが、この二量体は互いに近く存在する２つの活性タンパク質の存在により、受容体のようなそれらの標的分子と相互作用するにおいて立体障害を引き起こす。よって、このような問題は効率的なＦｃ融合タンパク質を製造するために克服されなければならない。
【００１０】
Ｆｃ融合技術の別の限界は意図していない免疫反応である。免疫グロブリンのＦｃドメインも抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ、antibody dependent cell-mediated cytotoxicity）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ、complement-dependent cytotoxicity）などのエフェクター機能を有する。このようなエフェクター機能は、一般に、ＩｇのＦｃ部位とエフェクター細胞上のＦｃＲｓ間の相互作用を介してあるいは補体結合を介して達成される。よって、細胞殺滅、サイトカイン分泌または炎症などの望ましくない反応を減少させるために、Ｆｃのエフェクター機能は抑制されなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
要するに、生物学的活性損失が最小化し且つ望ましくない免疫反応に対する危険性が減少した、改善されたＦｃ融合タンパク質が要求される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、ヒトＩｇＧサブクラス同士の組み合わせまたはヒトＩｇＤとＩｇＧとの組み合わせから誘導されるハイブリッドＦｃを提供する。ハイブリッドＦｃは、生物学的活性分子に結合する場合、生物学的活性分子の血中半減期を増加させるだけでなく、Ｆｃ−ポリペプチド融合タンパク質をコードするヌクレオチドが発現されるときにポリペプチドの発現水準を高めるという効果がある。
【００１３】
また、本発明は、ハイブリッドＦｃが生物学的活性分子に結合したハイブリッドＦｃ融合ポリペプチドを提供する。融合タンパク質は、場合によっては「生物学的活性分子Ｆｃ融合タンパク質」または簡単に「融合タンパク質」と呼ばれる。融合タンパク質はＦｃと生物学的活性分子との間にリンカーを持つことができる。ＦｃはそのＮ末端で生物学的活性分子のＣ末端と結合できる。
【００１４】
融合タンパク質は、それをコードし且つ融合タンパク質を発現させることが可能なヌクレオチド構造物を製造し、宿主細胞でそれを発現させ、融合タンパク質を収得することにより生産できる。あるいは、融合タンパク質は、Ｆｃをコードするヌクレオチドを発現させ、これを通常の方法によって生物学的活性分子と結合させることにより生産できる。
【００１５】
本発明の一様態に係るポリペプチドは、下記化学式で表される：
Ｎ’−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’
式中、Ｎ’はポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’はポリペプチドのＣ末端であり、
Ｚ１は少なくとも配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端領域、または少なくとも配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列を示し、
Ｙは少なくとも配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基のＣ末端領域、または少なくとも配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列を示し、
Ｚ２は少なくとも配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基のＮ末端領域、または少なくとも配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列を示し、
Ｚ３は少なくとも配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端領域を含むアミノ酸配列を示し、
Ｚ４は少なくとも配列番号１１の２２４〜３３０、配列番号１２の２２０〜３２６、配列番号２４の２７１〜３７７、または配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含むアミノ酸配列を示し、
ｐは０または１の整数であり、
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも８０〜１４０個である。
【００１６】
Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端側から５〜９個の連続したアミノ酸残基、または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端側から５〜９個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい。一様態において、Ｚ１はＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号：１１）またはＩｇＤ ＣＨ１ドメイン（配列番号：１４）の５、６、７、８または９個のＣ末端アミノ酸残基であってもよい。
【００１７】
他の様態において、Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基５〜９個からなるアミノ酸配列であってもよい。また、Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であってもよい。
【００１８】
Ｙは、配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基のＣ末端側から５またはそれ以上、または１０またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよく、配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基のＣ末端側から５またはそれ以上、または１０またはそれ以上の連続したアミノ酸残基であってもよい。特定の具体例において、Ｙは配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５８〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５３または１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１４３〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１３３〜１６２位のアミノ酸残基、または配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい。
【００１９】
Ｚ２は配列番号１２（ｈＩｇＧ２）の１１１〜１４７位のアミノ酸残基のＮ末端側から４〜３７個、または６〜３０個の連続したアミノ酸残基、または配列番号１４（ｈＩｇＤ）の１６３〜１９９位のアミノ酸残基のＮ末端側から４〜３７個、または６〜３０個の連続したアミノ酸残基であってもよい。具体的な様態において、Ｚ２はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインの６個のＮ末端アミノ酸残基またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインの８個のＮ末端アミノ酸残基であってもよい。
【００２０】
Ｚ２およびＺ３のアミノ酸の総数は８０〜１４０個であり得る。一つの様態において、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも９０〜１２０個である。他の様態において、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも１０５〜１１５個である。一つの具体的な様態において、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０８個である。別の具体的な様態において、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０９個である。
【００２１】
Ｚ４は配列番号１１（ｈＩｇＧ１）の２２４〜３３０、配列番号１２（ｈＩｇＧ２）の２２０〜３２６、配列番号２４（ｈＩｇＧ３）の２７１〜３７７、または配列番号１３（ｈＩｇＧ４）の２２１〜３２７位の９０またはそれ以上、または１００またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり得る。Ｚ４は配列番号１１の２２４〜３３０、配列番号１２の２２０〜３２６、配列番号２４の２７１〜３７７、配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよい。
【００２２】
本発明の具体例によれば、Ｚ３〜Ｚ４は、（ｉ）配列番号１１の１１８〜２２３位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１１の２２４〜３３０位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１２の１１４〜２１９位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１２の２２０〜３２６位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２４の１６５〜２７０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号２４の２７１〜３７７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域の連続アミノ酸配列よりなる群から選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列である。
【００２３】
本発明の一つの具体的な様態に係るポリペプチドのアミノ酸残基の総数は１５４〜２８８個である。
【００２４】
一つの具体的な様態において、Ｙは少なくとも配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよく、ｐは１または０であってもよく、Ｚ２は少なくとも配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよく、Ｚ３は少なくとも配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよい。このような様態において、ｐが１のとき、Ｚ１は少なくとも配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよい。
【００２５】
さらに具体的な様態において、Ｚ３は配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または配列番号１３の１１５〜２２０位の７３〜１０６個の連続アミノ酸残基であってもよく、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１１０個であってもよい。Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよく、Ｚ３は配列番号１１の１２０〜２２３、配列番号１２の１１６〜２１９、配列番号２４の１６７〜２７０、または配列番号１３の１１８〜２２０位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよい。
【００２６】
他の具体的な様態において、Ｙは少なくとも配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよく、ｐは１または０であってもよく、Ｚ２は少なくとも配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよく、Ｚ３は少なくとも配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であってもよい。このような様態において、ｐが１のとき、Ｚ１は配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい。
【００２７】
さらに具体的な様態において、Ｙは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基のＣ末端側の２０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上、３０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上、４０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上、５０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上、または６０個の連続アミノ酸残基またはそれ以上であってもよい。Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１７０位のアミノ酸残基であってもよく、Ｚ３は配列番号１１の１２４〜２２３、配列番号１２は１２０〜２１９、配列番号２４の１７１〜２７０、または配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端側の７１〜１００の連続アミノ酸残基を含むことができる。Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０８個であってもよい。
【００２８】
一つの具体的な様態において、ポリペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２６、および配列番号２７よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列によってコードできる。ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８および配列番号２９よりなる群から選ばれたアミノ酸配列である。
【００２９】
一つの具体的な様態において、ポリペプチドはそのＮ末端で生物学的活性分子と融合するが、この生物学的活性分子は天然型の循環半減期に比べて増加した循環半減期を示す。生物学的活性分子はポリペプチド、タンパク質、または単一ペプチドであってもよい。生物学的活性分子はポリペプチド、ペプチドまたはタンパク薬物(protein drug)であってもよい。生物学的活性分子は可溶性タンパク質、例えば、ホルモン、サイトカイン、成長因子、共刺激分子、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、成長因子受容体、または短ペプチド(short peptide)であり得るが、これに限定されない。生物学活性分子はＥＰＯまたはその変異体／断片、ｐ４０またはその変異体／断片（例えば、Ａｓｎ３０３Ｇｌｎ置換体を含む変異体）、Ｇ−ＣＳＦまたはその変異体／断片、ＴＮＦ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０受容体、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β受容体、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７受容体、因子ＶＩＩ、ＣＸＣＬ−１１、ＦＳＨ、ヒト成長ホルモン、ＢＭＰ−１(bone morphogenetic protein-1)、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＧＬＰ−１、ベータセルリン(betacellulin)、ＯＰＧ、ＲＮＡＫ、インターフェロン−α、インターフェロン−βまたはそれらの変異体または断片であり得るが、これに限定されない。生物学的活性分子は成熟形態(mature form)の分泌タンパク質であってもよい。
【００３０】
一つの具体的な様態において、本発明は、次の段階を含む、請求項１に係るポリペプチドの生産方法を提供する：（ｉ）哺乳類宿主細胞に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を導入する段階、（ｉｉ）成長培地でポリペプチドが発現できる条件下で細胞を培養する段階、および（ｉｉｉ）発現されたポリペプチドを収得する段階。哺乳類宿主細胞はＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢＨＫ細胞であってもよい。
【００３１】
他の具体的な様態において、本発明は、前述したポリペプチドの治療学的有効量を投与することを含む、（ｉ）自己免疫疾患の症状を軽減、予防または治療し、（ｉｉ）移植拒否を抑制し、または（ｉｉｉ）内毒素により誘導されたショックを治療または予防する方法を提供し、ここで、ポリペプチドは生物学的活性分子に融合したポリペプチドをいう。
【００３２】
一つの具体的な様態において、本発明は、本発明の様態に係るポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８、および配列番号２９よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を持つことができる。核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号２６、または配列番号２７に示されるヌクレオチド配列を持つことができる。核酸分子はシグナル配列またはリーダー配列をさらに含むことができる。
【００３３】
本発明の具体的な様態によれば、本発明は、核酸分子を含む発現ベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞を提供する。発現ベクターの例としては、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５、およびｐＡＤ１１ ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５を含むことができるが、これに限定されない。
【００３４】
一つの具体的な様態において、本発明は、それを必要とする哺乳類に核酸分子を投与する段階を含む、哺乳類に生物学的活性分子を伝達する方法を提供する。
【００３５】
別の具体的な様態において、ポリペプチドはＮ末端でＣ末端方向にヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなるＦｃドメインを含み、前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域またはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含み、ここで、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのＮ末端における４〜３７個の連続アミノ酸残基は少なくともヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域のアミノ酸残基部分で置換され、前記ＣＨ３ドメインは少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基部分を含む。
【００３６】
前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含むことができ、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含み、ここで、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのＮ末端の４〜３７個のアミノ酸残基は少なくともヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインのＮ末端部位のアミノ酸残基部分で置換される。
【００３７】
前記ヒンジ領域は少なくともＩｇＤヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含むことができ、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含み、ここで、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのＮ末端の４〜３７個のアミノ酸残基は少なくともヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端部位のアミノ酸残基部分で置換される。
【００３８】
ポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含むことができるが、ここで、前記ＣＨ１ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基部分を含み、ここで、前記ＣＨ１ドメインは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合する。ポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含むことができるが、ここで、前記ＣＨ１ドメインはヒトＩｇＤ ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基部分を少なくとも含み、ここで、前記ＣＨ１ドメインは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合する。ポリペプチドは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合した２次ポリペプチドをさらに含むことができ、ここで、２次ポリペプチドは生物学的活性非免疫グロブリンポリペプチドである。ポリペプチドは、リンカーを介して前記ＣＨ１ドメインのＮ末端または前記ＣＨ４ドメインのＣ末端に結合した生物学的活性分子をさらに含むことができるが、ここで、前記生物学的活性分子は免疫グロブリンポリペプチドではない。ポリペプチドおよび生物学的活性分子はリンカーを介して互いに結合できる。リンカー分子はアルブミンリンカーまたは合成リンカーである。アルブミンリンカーは、配列番号２５のアミノ酸配列３２１〜３２３、３１８〜３２５、３１６〜３２８、３１３〜３３０、３１１〜３３３、または３０６〜３３８を含む。合成リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基からなるアミノ酸残基の１０〜２０個のペプチドであってもよい。一つの具体的な様態において、このようなＧｌｙ−ＳｅｒリンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号３２）である。
【００３９】
また、本発明は組み換えＦｃ部位を含む抗体分子を含む。組み換えＦｃ部位は上述されている。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】「Ｘ」と明示された生物学的活性分子の担体タンパク質として使用できるハイブリッドＦｃ（ｈＦｃ）を示す概略図である。
【図２】本発明の詳細な説明によるｈＦｃを成すＩｇＧ１（配列番号１１）、ＩｇＧ２（配列番号１２）、ＩｇＧ４（配列番号１３）およびＩｇＤ（配列番号１４）に由来したアミノ酸位置を示す概略代表図である。他に説明がない限り、同じ方式が本出願によるポリペプチドのアミノ酸位置の指示にも適用される。
【図３】「ＡＬ」と明示されたアルブミンリンカーペプチドを介して、Ｃ末端に、「Ｘ」と明示された生物学的活性分子がそれぞれ結合したｈＦｃの概略代表図である。
【図４】リンカーと結合しているｈＦｃの概略代表図であって、前記リンカーは本発明の詳細な説明によってヒトアルブミン（配列番号２５）に由来したアルブミンリンカーのアミノ酸位置を示す。
【図５】ｈＦｃ−６の疎水性区画(hydrophobicity plot)の結果を示す。
【図６】（ａ）は特異的ＥＬＩＳＡ分析を用いたＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）（リツキシマブ(Rituximab)）、ｈＩｇＧ１、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト(entanercept)）、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５のＦｃγＲＩ結合活性結果を示し、（ｂ）は特異的ＥＬＩＳＡ分析を用いたＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）（リツキシマブ(Rituximab)）、ｈＩｇＧ１、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５のＣｌｑ結合活性結果を示す。
【図７】（ａ）はヒトＦ３６Ｅ細胞株におけるＥＰＯの生物活性と比較したＥＰＯ−ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ(darbepoetin alfa)）の生物活性の結果を示し、（ｂ）はマウス造血細胞株（ＮＦＳ−６０）におけるＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）（ペグフィルグラスチム(pegfilgrastim)）およびＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５の試験管内生物活性の結果を示し、（ｃ）はヒトＰＢＭＣｓにおけるｐ４０およびｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５の試験管内生物活性の結果を示し、（ｄ）はマウス(murine)Ｌ９２９細胞におけるＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）およびＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５の試験管内生物活性の結果を示し、（ｅ）はヒトＷＩＳＨ細胞におけるｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａの試験管内生物活性の結果を示す。
【図８】（ａ）はＳＣ経路（左パネル）およびＩＶ経路（右パネル）を介してカニクイザル(cynomolgus monkeys)に投与されたＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ）、ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、またはＥＰＯ−ｈＦｃ−５の生体内半減期に対する結果を示し、（ｂ）はＳＣ経路（左パネル）およびＩＶ経路（右パネル）を介してＳＤ(Sprague Dawley)ラットに投与されたＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）（フィルグラスチム(filgrastim)）およびＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１の薬動学的結果を示し、（ｃ）はＳＣ経路を介してカニクイザルに投与されたｐ４０Ｎ３０３０Ｑ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）の薬動学的結果を示し、（ｄ）はＳＣ経路を介してＳＤ(Sprague Dawley)ラットに投与されたＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト）の薬動学的結果を示す。
【図９】（ａ）はＳＣ経路（左上パネル）およびＩＶ経路（右下パネル）を介してカニクイザルに投与されたＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）（ダーベポエチンアルファ）およびＥＰＯ−ｈＦｃ−５の生体内生物活性に対する結果を示し、（ｂ）はＳＣ経路（上パネル）およびＩＶ経路（下パネル）を介してＳＤラットに投与されたＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）（フィルグラスチム）およびＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１の生体内生物活性に対する結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、Ｎ末端でＣ末端方向にヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むハイブリッドヒト免疫グロブリンＦｃ断片を提供するが、ここで、ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域またはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の部分的アミノ酸配列であり、ＣＨ２ドメインはヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインであって、そのＮ末端領域がヒトＩｇＧ２ ＣＨ２またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域の４〜３７個のアミノ酸残基で置換されたものである。Ｆｃ融合タンパク質を生産するために、生物学的活性ポリペプチドのような生物学的活性分子に結合するとき、前記ハイブリッドＦｃ断片はＦｃ融合タンパク質の非特異的免疫反応を最小化し、生物学的活性分子の血中半減期を延長させ、生物学的活性分子の活性を最適化する。
【００４２】
本発明の一つの具体的様態に係るＦｃ融合タンパク質において、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインの残余部分とＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端との組み合わせは、融合タンパク質において２つの相異なるＩｇサブユニットが組み換えられる領域が疎水性となるようにした。融合したタンパク質の疎水性領域は、折り畳みタンパク質(folded protein)の内部に位置し、望ましくない非特異的免疫反応を最小化する。
【００４３】
本願で使用される用語「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ」とは、免疫グロブリンの重鎖不変領域１（ＣＨ１）、重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含み、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域および軽鎖不変領域１（ＣＬ１）は含まないタンパク質をいう。それは重鎖不変領域のヒンジ領域をさらに含むことができる。ハイブリッドＦｃまたはハイブリッドＦｃ断片は本願において「ｈＦｃ」と呼ばれることもある。
【００４４】
また、本発明のＦｃ断片は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態である。当業界における公知の方法、例えば化学的方法、酵素的方法、および微生物を用いた遺伝工学的エンジニアリング方法などによって免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増加、減少または除去が行われ得る。Ｆｃ断片からの糖鎖の除去は、１次補体構成要素Ｃ１のＣｌｑへの結合親和力を急激に減少させ、ＡＤＣＣ(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)またはＣＤＣ(complement-dependent cytotoxicity )の減少または消失をもたらし、それにより生体内の不要な免疫反応を誘導しない。このような点で、糖鎖の除去された(deglycosylated)形態あるいは非糖化された(aglycosylated)形態における免疫グロブリンＦｃ断片は、薬物の担体として本発明の目的にさらに適することもある。
【００４５】
ここで、使用された用語「糖鎖の除去(deglycosylation)」はＦｃ断片から酵素的に糖が除去されることを意味し、用語「非糖化(aglycosylation)」はＦｃ断片が原核生物、好ましくは大腸菌(E.coli)によって糖化されていない(unglycosylated)形態で生成されることを意味する。
【００４６】
本願で使用された用語「ハイブリッド」は、互いに異なる起源の２つまたはそれ以上の免疫グロブリンＦｃ断片をコードする配列が単一鎖免疫グロブリンＦｃ断片に存在することを意味する。
【００４７】
一つの具体的な様態において、ハイブリッドヒトＦｃはＮ末端でＣ末端方向にヒンジ領域、ＣＨ２メインおよびＣＨ３ドメインを含み、ここで、前記ヒンジ領域は、少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域またはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の部分的アミノ酸配列であり、ＣＨ２ドメインは、ヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインであって、その末端領域がヒトＩｇＧ２ ＣＨ２またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域の４〜３７個のアミノ酸残基で置換されたものである。ハイブリッドヒトＦｃは、共有結合によって、そのＮ末端で生物学的活性分子のＣ末端に結合できる。
【００４８】
別の具体的な様態において、生物学的活性分子−ハイブリッドＦｃ融合ポリペプチドは、次の化学式によって表される。
【００４９】
Ｎ’−Ｘ−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’、または
Ｎ’−Ｘ−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−（リンカー）ｑ−Ｘ−Ｃ’
ここで、Ｎ’はポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’はポリペプチドのＣ末端であり；Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端領域を少なくとも含みあるいは配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基部分を少なくとも含むアミノ酸配列を示し；Ｙは配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基のＣ末端領域を少なくとも含みあるいは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基部分を少なくとも含むアミノ酸配列を示し；Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を少なくとも含みあるいは配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基のＮ末端領域を少なくとも含むアミノ酸配列を示し；Ｚ３は配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または配列番号１３の１１５〜２２０のアミノ酸残基のＣ末端領域を少なくとも含むアミノ酸配列を示し；Ｚ４は配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を少なくとも含むアミノ酸配列を示し、ｐおよびｑはそれぞれ整数０または１であり、ここで、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも８０〜１４０個であり、リンカーはリンカー分子であり、Ｘは目的の生物学的活性分子である。
【００５０】
一つの具体的な様態において、Ｚ３〜Ｚ４は、（ｉ）配列番号１１の１１８〜２２３位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１１の２２４〜３３０位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１２の１１４〜２１９位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１２の２２０〜３２６位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２４の１６５〜２７０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号２４の２７１〜３７７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域の連続アミノ酸配列よりなる群から選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列である。
【００５１】
本発明の一つの様態に係るポリペプチドアミノ酸残基の総数は１５４〜２８８個である。
【００５２】
化学式Ｎ’−Ｘ−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’およびＮ’−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−（リンカー）ｑ−Ｘ−Ｃ’のポリペプチドを対象に投与する場合、Ｘを単独で投与した場合の循環半減期に比べて生物学的活性分子Ｘの循環半減期を増加させる。
【００５３】
リンカーはヒトアルブミンに由来できる（配列番号２５ ＣＡＡ００６０６）。リンカーは配列番号２５のアミノ酸配列３２１〜３２３、３１８〜３２５、３１６〜３２８、３１３〜３３０、３１１〜３３３、または３０６〜３３８を含むことができる。場合によって、リンカーは合成リンカーであってもよい。合成リンカーはＧｌｙおよびＳｅｒの総１０〜２０個の残基からなるペプチドである。一つの様態において、Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号３２）である。
【００５４】
Ｚ１はヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメイン（配列番号１１）またはＩｇＤ（配列番号１４）の領域を少なくとも含むことができる。Ｚ１はＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号１１の９０〜９８位）のＣ末端領域またはＩｇＤ ＣＨ１ドメイン（配列番号１４の９０〜９８位）のＣ末端領域の５〜９個または７〜９個の連続したアミノ酸残基を含むことができる。あるいは、Ｚ１はＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインまたはＩｇＤ ＣＨ１ドメインの５、６、７、８または９個のＣ末端アミノ酸残基であってもよい。
【００５５】
一つの具体的な様態において、Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である。Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基または配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基５〜９個からなるアミノ酸配列であってもよい。また、Ｚ１は配列番号１１のアミノ酸残基９０〜９８個または配列番号１４のアミノ酸残基９０〜９８個からなるアミノ酸配列であってもよい。
【００５６】
ＹはヒトＩｇＧ１またはＩｇＤのヒンジ領域の部分を少なくとも含むことができる。ＹはＣ末端ＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号１１のアミノ酸位置９９〜１１３）またはＩｇＤヒンジ領域（配列番号１４のアミノ酸位置９９〜１６２）の５またはそれ以上、または１０またはそれ以上の連続したアミノ酸残基を含むことができる。特定の様態において、Ｙは配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５８〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５３〜１６２位のアミノ酸残基、または配列番号１４の１４３〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１３３〜１６２位置のアミノ酸残基、または配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい。
【００５７】
Ｚ２はヒトＩｇＧ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域（配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基）またはＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域（配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基）の４〜３７、６〜３０、６〜１２、６〜８、８または６個の連続したアミノ酸残基を含むことができる。特定の様態において、Ｚ２はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインの６個のＮ末端アミノ酸残基（配列番号１２のアミノ酸残基１１１〜１１６）またはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインの８個のＮ末端アミノ酸残基（配列番号１４のアミノ酸残基１６３〜１７０）であってもよい。
【００５８】
Ｚ２またはＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも、９０〜１２０個または１０５〜１１５個であり得る。
【００５９】
Ｚ４はＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインの９０またはそれ以上、または１００またはそれ以上の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列であってもよい（配列番号１１の２２４〜３３０、配列番号１２の２２０〜３２６、配列番号２４の２７１〜３７７、または配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基）。Ｚ４はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基の９８％または９５％以上のアミノ酸残基であってもよい。一つの実施例として、Ｚ４はヒトＩｇＧ ＣＨ３ドメインの全体アミノ酸配列を含むアミノ酸配列である。たとえば、Ｚ４はＫａｂａｔなどによるＥＵインデックスナンバリングで表示されるヒトＩｇＧ４のアミノ酸残基３４１〜３４７に対応するヒトＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列であるが、これは配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基に対応する。
【００６０】
一つの具体的な様態において、ＹはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（配列番号１１のアミノ酸残基９９〜１１３）のＣ末端アミノ酸残基部分を少なくとも含むアミノ酸配列であってもよく、ｐは１または０であってもよく、Ｚ２はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２（配列番号１２の１１１〜１４７位のアミノ酸残基）のＮ末端領域の部分を少なくとも含むアミノ酸配列であってもよく、Ｚ３はヒトＩｇＧサブクラスのいずれか一つ（配列番号１１の１１８〜２２３、配列番号１２の１１４〜２１９、配列番号２４の１６５〜２７０、または少なくとも配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基）のＣ末端領域の部分を含むアミノ酸配列であってもよい。このような様態において、ｐが１のとき、Ｚ１は少なくともヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメイン（配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基）のＣ末端領域の部分を含むアミノ酸配列であり得る。たとえば、Ｚ１は配列番号１１のアミノ酸残基９０〜９８である。
【００６１】
より具体的な様態において、Ｚ３はヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン（配列番号１３の１１５〜２２０位）、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン（配列番号１１の１１８〜２２３位）、ヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメイン（配列番号１２の１１４〜２１９位）、ヒトＩｇＧ３ ＣＨ２ドメイン（配列番号２４の１６５〜２７０位）のＣ末端領域の７３〜１０６個の連続したアミノ酸残基であってもよく、Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１１０個であってもよい。たとえば、Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、Ｚ３は配列番号１３の１１７〜２２０位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり得る。
【００６２】
他の具体的な様態において、Ｙは少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域のＣ末端領域の部分を含むアミノ酸配列（配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基）であってもよく、ｐは１または０であってもよく、Ｚ２は少なくともＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域の部分を含むアミノ酸配列（配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基）であってもよく、Ｚ３は少なくともヒトＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのＣ末端領域の部分を含むアミノ酸配列（配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基）であってもよい。たとえば、Ｙは配列番号１４の１５８〜１６２、１３３〜１６２、または９９〜１６２位のアミノ酸残基であり、Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１７０位のアミノ酸残基であり、Ｚ３は配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基であり得る。
【００６３】
このような様態において、ｐが１のとき、Ｚ１はヒトＩｇＤ ＣＨ１ドメインのＣ末端領域を含むアミノ酸配列（配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基）であってもよい。たとえば、Ｚ１は配列番号１４の９０〜９８のアミノ酸残基であり得る。
【００６４】
このような様態において、ＹはヒトＩｇＤヒンジ領域のＣ末端側の２０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、３０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、４０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、５０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、６０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上であってもよい（配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基）。Ｚ３は配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端側の７１〜１００個の連続したアミノ酸残基を含むことができる。Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０８個であり得る。
【００６５】
表１は本発明の具体的な様態に係るｈＦｃの構造に有用なヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＤの断片のアミノ酸配列を示す。
【００６６】
【表１】
【００６７】
【表２】
【００６８】
＊ＥＵインデックスは「Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, United States Department of Health and Human Services」に記述されている．
＊＊各アミノ酸の下線領域は許容可能なアミノ酸残基範囲の最も短い断片を示す。
【００６９】
一つの具体的な様態において、本発明は、図１および図２に示すようにｈＦｃ−１、ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４、ｈＦｃ−５またはｈＦｃ−６のいずれか一つのハイブリッドＦｃを提供し、あるいは図３および図４に示すようにｔｈＦｃ−１またはｔｈＦｃ−２を提供する。図１および図３は二本鎖Ｆｃを示すが、本発明は一本鎖ハイブリッドＦｃ分子も含む。ｈＦｃ−１〜ｈＦｃ−６のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１８〜２３に示されており、ｔｈＦｃ−１またはｔｈＦｃ−２のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号２８および配列番号２９に示されている。また、本発明はハイブリッドＦｃをコードするポリヌクレオチド分子を含む。本発明は、配列番号１（ｈＦｃ−１）、配列番号２（ｈＦｃ−２）、配列番号３（ｈＦｃ−３）、配列番号４（ｈＦｃ−４）、配列番号５（ｈＦｃ−５）、配列番号６（ｈＦｃ−６）、配列番号２６（ｔｈＦｃ−１）および配列番号２７（ｔｈＦｃ−２）に示されるようなじポリヌクレオチド配列を含むが、これに限定されない。
【００７０】
ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列は当業界によく知られており、それらは公開的に接近可能な受託機関(publicly accessible depository)に受託されている。例えば、ヒトＩｇＧ１不変領域、ヒトＩｇＧ２不変領域、ヒトＩｇＧ３不変領域、ヒトＩｇＧ４不変領域、およびヒトＩｇＤ不変領域のアミノ酸配列はそれぞれＣＡＡ７５０３２、ＣＡＣ２０４５５、ＣＡＣ２０４５６、ＡＡＨ２５９８５およびＰ０１８８０として用いることができる。このような配列はそれぞれ配列番号１１、１２、２４、１３および１４に示した。
【００７１】
生物学的活性分子Ｘは可溶性タンパク質であってもよい。具体的に、ホルモン、サトカイン、成長因子、共刺激分子、ホルモン受容体、サトカイン受容体、成長因子受容体、または短ペプチドであるが、これに限定されない。例えば、ＸはＥＰＯ、ｐ４０、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ受容体またはこれらの変異体／断片であり得る。ＸはＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０受容体、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β受容体、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７受容体、血液因子ＶＩＩ、ＣＸＣＬ−１１、ＦＳＨ、ヒト成長ホルモン、ＢＭＰ−１(bone morphogenetic pritein-1)、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＧＬＰ−１、ベータセルリン(betacellulin)、ＯＰＧ、ＲＮＡＫ、インターフェロン−α、インターフェロン−βまたはこれらの変異体／断片であり得る。また、抗体のＦａｂ領域を含むことができるが、これに限定されない。また、生物学的活性分子は分泌タンパク質であってもよい。一つの様態において、生物学的活性分子は免疫グロブリン群に属しない。
【００７２】
用語「変異体」とは、それらの核心的な特性を保有するが、標準核酸またはポリペプチドとは異なるポリペプチドまたは核酸を意味する。一般に、変異体は、全体的に非常に類似であり、且つ多くの領域で標準核酸またはポリペプチドと同一である。また、用語「変異体」は、本明細書または当業界における公知の、少なくとも一つの機能および／または治療学的特性を維持する生物学的活性分子薬物の生物学的活性部分を意味する。一般に、変異体は全体的に非常に類似であり、多くの領域で、目的とする生物学的活性ポリペプチドのアミノ酸配列と同一である。
【００７３】
また、本発明は、例えば配列番号１８〜２３および２８〜２９で表示されるポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいはそのようなアミノ酸配列からなるタンパク質を提供する。また、本発明は、このようなポリペプチドの断片を提供する。また、本発明は、当業界における公知(Ausubel, F. M. et al., eds., 1989 Current protocol in Molecular Biology, Green publishing associates, Inc., and John Wiley & Sons Inc., New York, at pages 6.3.1 6.3.6 and 2.10.3)の、厳しいハイブリッド化条件（例えば、約４５℃で６×ＳＳＣ(Sodium chloride/Sodium citrate)でフィルターに結合したＤＮＡとハイブリッド化した後、約５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに１回以上洗浄）、さらに厳しい条件（約４５℃で６×ＳＳＣでフィルターに結合したＤＮＡとハイブリッド化した後、約６８℃で０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳで１回以上洗浄）、あるいは別の厳しいハイブリッド化条件で、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子の補体とハイブリッド化したポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを提供する。このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲に含まれる。
【００７４】
クエリーアミノ酸配列と例えば少なくとも９５％の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドは、対象ポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列における１００個のアミノ酸当たり５個までのアミノ酸の置換を含むことを除いては、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一である。すなわち、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドを得るために、対象配列においてアミノ酸残基の最高５％が挿入され、欠損され、あるいは他のアミノ酸で置換され得る。標準配列の置換は、標準アミノ酸配列のアミノ−またはカルボキシ−末端位置で起ることができ、このような末端位置の間であればどこでも起ることができ、標準配列内の残基の間で個別的に、または標準配列内の一つまたはそれ以上の連続的なグループに散在して起ることができる。
【００７５】
実質的な例として、ある特定のポリペプチドが例えば本発明のアルブミン融合タンパク質またはその断片のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するか否かは、公知のコンピュータプログラムを用いて通常決定できる。グローバル配列アラインメント(global sequence alignment)としても言及される、クエリー配列（本発明の配列）と対象配列間の最上の全体的マッチ(match)を決定する好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ等のアルゴリズム(Comp. App. Biosci. 6:237 245 (1990))に基づいたＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定できる。配列アラインメントにおいて、クエリーおよび対象シーケンスは全てヌクレオチド配列であり、あるいは全てアミノ酸配列である。グローバル配列アラインメントの結果はパーセント同一性として示される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列に使用される好ましい基準は：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｅｎｇｔｈ、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象アミノ酸配列の長さであり、どれでもさらに短い。
【００７６】
変異体は、通常、一般なＨＡの長さ、または変異体と同じ長さの治療タンパク質と少なくとも７５％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９５％または９９％）の配列同一性を持つことができる。ヌクレオチドまたはアミノ酸配列水準における相同性または同一性は、配列類似性調査目的で仕立てられたｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｔｎおよびｔｂａｓｔｘ(Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264 2268 (1990)およびAltschul, J. Mol. Evol. 36: 290 300 (1993))プログラムが導入されたアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴ(Basic Local Alignment Search Tool)分析によって決定される。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード部位、非コード部位、または両方ともにおける変更を含むことができる。特に、好ましくは、コードされたポリペプチドの特性または活性を変更させないサイレント置換、添加、または欠損を生産する変更を含むヌクレオチド変異体である。好ましくは、遺伝的コードの退化(degeneracy)に起因したサイレント置換で生産されたヌクレオチド変異体である。ひいては、ある組み合わせにおいて５０個以下、４０個以下、３０個以下、２０個以下、１０個以下、または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５または１〜２個のアミノ酸が置換、欠損、添加されたポリペプチド変異体も好ましい。ポリヌクレオチド変異体は、多様な理由で生産できるが、例えば、特定宿主へのコドン発現を最適化するために（ヒトｍＲＮＡコドンを酵母または大腸菌などのバクテリア宿主によって好まれるコドンに変化）生産される。
【００７８】
多様なＦｃ融合タンパク質、例えばＥＰＯ−Ｆｃ融合構造物、Ｇ−ＣＳＦ−Ｆｃ融合構造物、またはヒト４０−Ｆｃ融合構造物などを製造するための目的で、ヒトＥＰＯのアミノ酸配列、ヒトＧ−ＣＳＦ、ヒトｐ４０、およびヒトＴＮＦ受容体のアミノ酸配列は、ＮＰ＿０００７９０（配列番号１５）、ＣＡＡ２７２９１（配列番号１６）、ＡＡＧ３２６２０（配列番号１７）、およびＮＰ＿００１０５７（配列番号３１）がそれぞれ使用できる。一つの具体的な様態において、３０３位のアミノ酸残基ＡｓｎがＧｌｎで代替された変形ヒトｐ４０はポリペプチドと連結される。
【００７９】
本発明の他の様態によれば、製造されたＦｃ領域を含む全体抗体を提供する。本願で使用される用語「抗体」は、全体抗体、および少なくともＣＨ１、ヒンジ領域、ＣＨ２またはＣＨ３の少なくとも２つを含む抗体断片を含む。好ましくは全体モノクローナル抗体である。抗体の重鎖可変領域はその結合特異性によって選択され、いずれのタイプにもなれるが、例えば、非ヒトのもの、ヒト化のものまたは全部ヒトのものであり得る。抗体の重鎖可変領域が、非ヒトのもの（例えばマウス）であって、本願によって製造されたＦｃ領域と組み換え的に結合する場合、このように生成された組み換え抗体をキメラ抗体という。抗体の重鎖可変領域が、ヒト化のものであって、本願によって製造されたＦｃ領域と組み換え的に結合する場合、このように生成された組み換え抗体をヒト化抗体という。抗体の重鎖可変領域が、ヒトのものであって、本願によって製造されたＦｃ領域と組み換え的に結合する場合、このように生成された組み換え抗体を完全なヒト抗体という。例えば、重鎖の可変領域はヒト化のものであり、ヒトフレームワーク領域および非ヒト（この場合にはマウス）ＣＤＲｓ(complementary determining regions)を含む。フレームワーク領域は一つのソースまたは一つ以上のソースに由来でき、ＣＤＲは一つのソースまたは一つ以上のソースに由来できる。抗体のヒト化方法は当業者および当業界によく知られている。
【００８０】
抗体の軽鎖はヒト、非ヒトまたはヒト化のものである。図１Ｂに示すように、軽鎖はヒト化のものであり、ヒトフレームワーク領域、非ヒト（この場合にはマウス）ＣＤＲ、およびヒト不変領域を含む。フレームワーク領域は一つのソースまたは一つ以上のソースに由来でき、ＣＤＲは一つのソースまたはそれ以上のソースに由来できる。
【００８１】
製造されたＦｃ部位を含む抗体は、細胞表面分子、または細胞表面分子に結合する可溶性分子と結合する能力に基づいて選択される。よって、例えば、抗体はサイトカイン受容体（ＩＬ−２Ｒ、ＴＮＦ−αＲ、ＩＬ−１５Ｒなど）、接着分子（例えば、Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ、ＶＣＡＭ、ＩＣＡＭなど）、細胞分化または活性抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２０、ＣＤ２５、ＣＤ４０など）などの細胞表面分子と結合する能力に基づいて選択できる。場合によって、抗体は細胞表面分子に結合する可溶性分子と結合する能力に基づいて選択できる。このような可溶性分子はサイトカインおよびケモカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６など）、成長因子（例えば、ＥＧＦ、ＰＧＤＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ、ＢＭＰ−１など）、細胞分化を誘導する分子（例えば、ＥＰＯ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＰＴＮなど）およびその他のものを含むが、これに限定されない。
【００８２】
一般に、本願に提示された抗体構造は、遺伝工学的技術を用いて公知の方法を使用することにより行われる。例えば、ＤＮＡを分離する技術、ＤＮＡを発現するベクターを製造し選択する技術、核酸を精製し分析する技術、組み換えベクターＤＮＡを製造するための特別な方法に対する技術、制限酵素でＤＮＡを切断し、ＤＮＡを接着し、安定的または限時手段によって宿主細胞にベクターＤＮＡなどのＤＮＡを導入する技術、ＤＮＡを発現する細胞を選別および維持するために選別培地または非選別培地で宿主細胞を培養する技術は、当業界に一般に知られている技術である。
【００８３】
本願に記述されたモノクローナル抗体は、当業界における公知のハイブリドーマ技術、または当業界における公知の他の組み換えＤＮＡ方法を用いて得ることができる。ハイブリドーマ方法は、マウスまたは他の適切な宿主動物のリンパ球によって抗体が生産できるように、ＤＮＡ、ペプチドまたはタンパク質で免疫されることである。
【００８４】
場合によって、リンパ球は試験管内で免疫できる。抗原に対する反応により生産されたリンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適切な融合製剤を用いて骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成する。次に、ハイブリドーマ細胞は、好ましくは融合していない親骨髄腫細胞の成長または生存を抑制する一つ以上の物質が含まれた適切な培養培地に接種されて成長する。好ましい骨髄腫細胞は効果的に融合し、選別された抗体生産細胞の安定的な抗体生産を維持するうえ、ＨＡＴ培地(Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., Catalog No. H-0262)などの培地に敏感ではない細胞である。
【００８５】
製造されたＦｃ領域を含む抗体は、治療学的製剤と結合して別途投与される組成物としても使用できる。診断目的で、抗体は標識形態でもよく非標識形態でもよい。
【００８６】
非標識抗体は、ヒト免疫グロブリン不変領域に特異的な抗体のように、製造された抗体に反応する他の標識付きの抗体（２次抗体）と共に使用できる。場合によって、抗体は直接標識されてもよい。広範囲で多様な標識、例えば放射性核種、蛍光体、酵素、酵素基質、酵素補助因子、酵素抑制剤、リガンド（特にヘプテン）などが導入できる。多くの種類の免疫分析が可能であり、このような技術は当業界によく知られている。
【００８７】
一つの具体的な様態において、本発明は、（ｉ）哺乳類宿主細胞に、融合タンパク質をコードするＤＮＡ分子を導入する段階と、（ｉｉ）融合タンパク質が発現される条件の下に成長培地で細胞を成長させる段階と、（ｉｉｉ）生産された融合タンパク質を収得する段階とを含む、融合タンパク質の生産方法を提供する。
【００８８】
別の実験的具体例として、本発明は、融合タンパク質を含む薬学的組成物、または前述した抗体分子または抗体断片を提供する。また、本発明は、薬学的組成物を投与することにより、特定の症状を治療または予防する方法を提供する。例えば、（ｉ）自己免疫疾患の予防／治療に対する症状を軽減させ、（ｉｉ）移植拒否反応を抑制し、（ｉｉｉ）ハイブリッドＦｃおよびｐ４０タンパク質の融合タンパク質またはその変異体／断片の治療学的有効量を投与することを含む、内毒素により誘導されたショックを治療／予防する方法を提供する。
【００８９】
組成物は薬学的担体を含むことができる。薬学的担体は、患者への抗体伝達に適した非毒性物質であればいずれの担体でも使用可能である。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックスおよび非活性固体が担体として含有できる。薬学的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）も薬学的組成物に含有できる。
【００９０】
抗体組成物は多様な方法で対象に投与できる、例えば、薬学的組成物は非経口的に投与できるが、例えば、皮下、筋肉内または静脈内である。このような組成物は通常良く知られている滅菌技術によって滅菌できる。組成物は、ｐＨ調節などの生理的条件を調節するために要求される、薬学的に許容可能な補助物質および補助剤、毒性調節製剤およびその類似体を含むことができるが、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどがある。このような剤形において、融合タンパク質、抗体、または抗体断片の濃度は非常に多様であり得るが、例えば、重量によって約０．５％以下であり、一般にまたは少なくとも約１％〜１５％または２０％までであり、選択された特定投与方法によって体液量、粘度などに優先的に基づいて選択できる。
【００９１】
また、本発明は、融合タンパク質をコードする単離核酸分子、および核酸分子を運搬する発現ベクターを提供する。前記核酸は、核酸によってコードされるポリペプチドを必要とする対象に直接運搬できる。場合によって、ポリヌクレオチドは培地で核酸を発現することにより生産され、その後、対象に投与される。
【００９２】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、２〜４０個のアミノ酸からなる分子、好ましくは３〜２０個のアミノ酸からなる分子、最も好ましくは６〜１５個のアミノ酸からなる分子を意味する。典型的なペプチドは、前述した方法のいずれか一つ、例えばペプチドライブラリー（例えばファージ提示ライブラリー）で行われる方法あるいはタンパク消化によって誘導される方法によって無作為に生成され得る。
【００９３】
ここで使用された用語「薬物」とは、ヒトまたは動物に投与したときに治療学的活性を示す物質を意味し、例えば、ポリペプチド、化合物、抽出物および核酸などを含むが、これに限定されない。薬物は、好ましくはポリペプチド薬物である。
【００９４】
ここで使用された用語「生理学的活性ポリペプチド」、「生物学的活性分子」、「生理学的活性タンパク質」、「活性ポリペプチド」、「ポリペプチド薬物」および「タンパク薬物」は同一の意味で使用されており、生体内で多様な生理学的機能を示す生理活性型の特徴を有する。
【００９５】
ポリペプチド薬物は、容易に変性される特徴、または体内でタンパク質加水分解酵素によって分解される特徴のため、長期間生理学的活性を維持することができないという欠点がある。ところが、ポリペプチド薬物が本発明に係る免疫グロブリンＦｃ断片に結合（またはカップリング）して融合タンパク質を形成する場合、薬物は構造的安定性および血中半減期が増加する。また、Ｆｃ断片に結合するポリペプチドは他の公知のポリペプチド薬物製剤より生理学的活性が一層少なく減少する。よって、通常のポリペプチド薬物の生体内利用率と比較するとき、本発明のポリペプチド薬物およびＦｃ断片を含む融合ポリペプチド、またはポリペプチド薬物とＦｃ断片との結合体は著しく増加した生体内利用率を有することを特徴とする。これも本発明の実施例によって明確に記述される。すなわち、本発明のＦｃ断片が結合したＩＦＮ−α、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｐ４０、ＴＮＦ受容体および他のタンパク薬物は、それらの天然形態または他の通常の融合形態より生体内利用率を増加させる。
【００９６】
本発明は、Ｆｃ融合タンパク質、本発明によって製造されたＦｃ領域を含む抗体、および本発明の実施に有用な抗体断片を製造するための通常の組み換えＤＮＡ方法論を提供する。Ｆｃ融合構造物は、好ましくはＤＮＡレベルで製造され、製造されたＤＮＡは発現ベクターに挿入され、本発明の融合タンパク質、抗体または抗体断片を生産するために発現される。
【００９７】
ここで使用された用語「ベクター」は、宿主細胞に統合されて宿主細胞ゲノム 内に組み換えおよび挿入でき、あるいはエピソームとして自発的に複製できるヌクレオチド配列を含む核酸手段として理解される。前記ベクターは、線形核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターおよびその類似体を含む。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスを含むが、これに限定されない。ここで使用された用語、目的タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写体の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質生産物または抗体または抗体断片の分泌を意味するものと理解される。
【００９８】
有用な発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）またはその変異体である。有用な発現ベクターは哺乳類細胞で目的遺伝子の連続的な転写を促進するためのヒトＣＭＶ(cytomegalovirus)プロモーター、および転写後ＲＮＡの安定状態水準を高めるためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を含まなければならない。本発明の一つの様態において、発現ベクターはＲｃＣＭＶの変形ベクターｐＡＤ１１である。生物学的活性分子薬物をコードするヌクレオチド配列を運搬する発現ベクターの例は、実施例でさらに詳細に記述されたように、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦＣ−６、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５またはｐＡＤ１１ ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５を含むことができるが、これに限定されない。
【００９９】
適切な宿主細胞は、本発明のＤＮＡ配列で形質転換または形質感染させることができ、目的タンパク質の発現および／または分泌に利用できる。本発明に使用可能な現在好ましい宿主細胞は、不死のハイブリドーマ細胞(immortal hybridoma cells)、ＮＳ／Ｏ骨髄腫細胞(NS/0 myeloma cells)、２９３細胞、ＣＨＯ細胞(Chinese hamster ovary cells)、ＨｅＬａ細胞、およびＣＯＳ細胞を含む。
【０１００】
哺乳類細胞において融合タンパク質または抗体または抗体断片を高い水準で発現させるために用いられる一つの発現システムは、５’〜３’方向に、シグナル配列、免疫グロブリンＦｃ領域、および例えばｐ４０、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ受容体などの標的タンパク質を含む分泌カセットをコードするＤＮＡ構造物である。幾つかの標的タンパク質はこのようなシステムで成功的に発現されているが、例えばＩＬ−２、ＣＤ２６、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＯＳＦ−２、ｓｓ；ＩＧ−Ｈ３、ＩｇＥ受容体、ＰＳＭＡ、およびｇｐ１２０などである。このような発現構造物はＬｏ等によって米国登録特許第５，５４１，０８７号および同第５，７２６，０４４号に開示されており、前記文献の内容は本願に参考として組み込まれる。
【０１０１】
本発明の融合タンパク質または抗体分子または抗体断片は、発現の際にシグナル配列を含んでもよく、含まなくてもよい。ここで使用された用語「シグナル配列」は、生物学的活性分子薬物；融合タンパク質の分泌を指示する断片を意味し、宿主細胞で翻訳された後に切断される。本発明のシグナル配列は、ＥＲ(endoplasmic reticulum)膜を貫通するタンパク質の移動を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明で有用なシグナル配列は、例えば抗体１４．１８(Gillies et al., J. Immunol. Meth. 1989. 125:191-202)などの 抗体軽鎖シグナル配列、例えばＭＯＰＣ１４１抗体重鎖シグナル配列(Sakano et al., Nature 1980. 286: 676-683)などの抗体重鎖シグナル配列、および当業界における公知の他のシグナル配列(see, e.g., Watson et al., Nucleic Acids Research 1984. 12:5145-5164)を含む。
【０１０２】
シグナル配列は、当業界にその特徴がよく知られており、通常１６〜３０個のアミノ酸残基を含むものとして知られており、それよりさらに多いあるいはさらに少ないアミノ酸残基を含むことができる。通常のシグナルペプチドは、３つの領域、すなわち基本Ｎ末端領域、中心の疎水性領域、およびより極性のＣ末端領域から構成される。中心の疎水性領域は未成熟ポリペプチドが移動する間に膜脂質二重層を介してシグナル配列を固定させる４〜１２個の疎水性残基を含む。開始以後、シグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼとして知られている細胞酵素によってＥＲのルーメン(lumen)内で切断される。シグナルペプチドの潜在的な切断サイトは一般に「（−３、−１）法則」に従う。よって、典型的なシグナルペプチドは小さく、−１および−３位置に中性アミノ酸残基を有し、この部位内にプロリン残基が欠如している。
【０１０３】
シグナルペプチダーゼは、−１および＋１アミノ酸間の前記シグナルペプチドを切断する。よって、シグナル配列は分泌する間に融合タンパク質のアミノ末端から切断できる。これにより、免疫グロブリンＦｃ領域および目的タンパク質から構成されるＦｃ融合タンパク質が分泌される。シグナルペプチド配列の詳細は「von Heijne (1986) Nucleic Acids Res. 14:4683」に記述されている。
【０１０４】
特定シグナル配列が分泌カセットへの使用に適するかを調べるためには一般な実験が必要であることは、当業者には明白である。
【０１０５】
このような実験は、融合Ｆｃ融合タンパク質の分泌を誘導するためのシグナル配列の能力に対する決定、最適の形態、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの決定、および融合タンパク質の効果的な分泌を達成するために使用される配列の決定を含むであろう。また、当業者は、ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６）によって提示される方法にしたがって合成シグナルペプチドを製造することができ、一般な実験によって前記合成シグナル配列の有効性をテストすることができる。シグナル配列は「シグナルペプチド」、「リーダー配列」または「リーダーペプチド」を意味することができる。
【０１０６】
シグナル配列と免疫グロブリンＦｃ領域との融合は分泌カセットとも呼ばれる。本発明の実験で有用な代表的な分泌カセットは、５’〜３’方向に、免疫グロブリン軽鎖遺伝子およびヒト免疫グロブリンｙ１遺伝子のＦｃｙ１領域のシグナル配列をコードするポリヌクレオチドである。免疫グロブリンＦｃｙ１遺伝子のＦｃｙｌ領域は、好ましくは少なくとも免疫グロブリンヒンジドメインの部分および少なくともＣＨ３ドメインを含み、さらに好ましくは少なくともヒンジドメインの部分、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。ここで使用される用語、免疫グロブリンヒンジ領域の「部分」は、鎖間ジスルフィド結合を形成することが可能な少なくとも一つ、好ましくは２つのシステイン残基を含む免疫グロブリンヒンジの部分を意味する。分泌カセットをコードするＤＮＡは、それのゲノム形態またはそれのｃＤＮＡ形態である。特定の場合には、ヒト免疫グロブリンＦｃｙ２重鎖配列からＦｃ領域を生産することが有利であることもある。ヒト免疫グロブリンｙ１およびｙ２配列に基づいたＦｃ融合はマウスにおいても同様に作用するが、ｙ２配列に基づいたＦｃ融合はヒトにおいて優れた薬動学的特徴を示す。
【０１０７】
他の具体的な様態において、ＤＮＡ配列は、分泌カセットと目的タンパク質との間に存在するタンパク質分解的切断部位をコードする。切断部位は、コードする融合タンパク質のタンパク質分解的切断を提供し、これにより目的タンパク質からＦｃドメインを分離する。ここで使用される用語「タンパク質分解的切断部位」は、タンパク質分解酵素または他のタンパク質分解製剤によって選択的に切断されるアミノ酸配列を意味する。有用なタンパク質分解的切断部位は、トリプシン(trypsin)、プラスミン(plasmin)またはエンテロキナーゼＫ(enterokinase K)などのタンパク質分解酵素によって認識されるアミノ酸配列を含む。多くの切断部位／切断製剤対が知られている（例えば、米国登録特許第５，２７６，０４４号を参照されたい）。
【０１０８】
また、不変領域ドメインの一つ以上のアミノ酸残基が置換または欠失された不変領域の構造物の置換または欠失が有用であることもある。一つの例は、Ｆｃ受容体に対する親和力を減少させたＦｃ変異体を製造するために上方のＣＨ２部位にアミノ酸置換を導入する(Cole et al. (1997) J. Immunol. 159: 3613)。当業者はよく知られている分子生物学的技術を用いて前記構造物を製造することができる。
【０１０９】
本発明の免疫グロブリンＦｃ断片に結合できるタンパク薬物の例は、ヒト成長ホルモン、ＢＭＰ−１(bone morphogenetic protein-1)、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類およびインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ、受容性タイプＩインターフェロン受容体など）、Ｇ−ＣＳＦ(granulocyte colony stimulating factor)、ＧＭ−ＣＳＦ(granulocyte-macrophage colony stimulating factor)、グルカゴン様ペプチド(glucagon-like peptides)（例えば、ＧＬＰ−１など）、Ｇタンパク質共役受容体(G-protein-coupled receptor)、インターロイキン類（例えば、インターロイキン−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０、−１１、−１２、−１３、−１４、−１５、−１６、−１７、−１８、−１９、−２０、−２１、−２２、−２３、−２４、−２５、−２６、−２７、−２８、−２９−、３０など）およびインターロイキン受容体類（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素（例えば、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、イズロン酸−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、α−ガラクトシダーゼＡ(alpha-galactosidase-A)）、アガルシダーゼαおよびβ(agalsidase alpha and beta)、α−Ｌ−イズロニダーゼ(alpha-L-iduronidase)、ブチリルコリンエステラーゼ、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ(imiglucerase)、リパーゼ、ウリカーゼ(uricase)、血素板活性化因子アセチルヒドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性チエンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)など）、インターロイキンおよびサイトカイン結合タンパク質（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ結合タンパク質など）、マクロファージ活性化因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、タンパク質Ａ、アレルギー抑制剤、細胞壊死糖タンパク(cell necrosis glycoproteins)、抗毒素(immunotoxin)、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制剤、転移成長因(metastasis growth factor)、α−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン、アポリポタンパク質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖化赤血球生成因子、アンジオポイエチン；ヘモグロビン、トロンビン、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩａ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、血液因子ＸＩＩＩ、プラスミノゲン活性化因子、フィブリン結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン、タンパク質Ｃ、Ｃ−反応性タンパク質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジムスターゼ、レプチン、血素板由来成長因子、上皮成長因子、外皮成長因子、アンジオスタチン、アンジオテンシン、骨成長因子、骨促進タンパク質、カルシトニン、インスリン、心房性ナトリウム利尿ペプチド(atriopeptin)、軟骨誘導因子、エルカトニン、結合組織活性因子(connective tissue activating factor)、組織因子経路阻害剤、卵胞刺激ホルモン(follicle stimulating hormone)、黄体形成ホルモン(luteinizing hormone)、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子(ciliary neurotrophic factor)、ＡＦ−１(axogenesis factor-1)、脳性ナトリウム利尿ペプチド(brain natriuretic peptide)、グリア細胞由来神経栄養因子(glial derived neurotrophic factor)、ネトリン(netrin)、好中球抑制因子、神経栄養因子(neurotrophic factor)、ニュートリン(neuturin)など）、副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチド、ココルチコトロピン放出因子(corticotropin releasing factor)、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン、ラクトフェリン、ミオスタチン、受容体例（例えば、ＴＮＦＲ（ｐ７５）、ＴＮＦＲ（ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性化因子受容体など）、受容体拮抗剤（ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、３８、４０、４５、６９など）、ウイルスワクチン抗原、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄ）、およびウイルス由来ワクチン抗原を含む。抗体断片はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄまたはｓｃＦｖであり得る、このような抗体断片は特異的抗原に結合することができ、好ましくはＦａｂ’である。Ｆａｂ断片は軽鎖の可変ドメイン（ＶＬ）および不変ドメイン（ＣＬ）、および重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）および第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、ヒンジ領域からＣＨ１メインのカルボキシル末端まで一つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸残基が添加されたという点で、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆｄ断片はＶＨおよびＣＨ１ンのみを含み、Ｆ（ａｂ’）２断片はジスルフィド結合または化学反応によってＦａｂ’断片が対をなすことにより製造される。ｓｃＦｖ(single-chain Fv)断片は、ペプチドリンカーによって連結されたＶＬおよびＶＨドメインを含むので、単一ポリペプチド鎖として存在する。
【０１１０】
具体的に、生物学的活性分子として好ましいものは、疾患を治療または予防するために体内に投与されるときに投与頻度が高いもので、ここにはヒト成長ホルモン、インターフェロン（インターフェロン−α、−β、−γなど）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ(erythropoietin)、ＴＮＦ受容体、ｐ４０および抗体断片が含まれる。また、特定誘導体の機能、構造、活性または安定性が生物学的活性分子の天然形態と実質的に同等の場合またはそれより改善された場合、そのような誘導体も本発明の生物学的活性分子の範囲に含まれ、最も好ましいポリペプチド薬物はインターフェロン−αである。
【０１１１】
本発明の別の様態において、例えば、ＩｇＧ−ＦｃおよびＩｇＧ−ＣＨ融合タンパク質は、二量体を形成するために単量体として生産される。典型的に、二量体はＩｇＧヒンジ領域におけるジスルフィド結合によって形成される。ＩｇＧを分泌する細胞からの条件培地は、融合タンパク質はＩｇＧ融合タンパク質単量体および二量体の混合物を含むことができる。ヒトの治療に用いるためには、ＩｇＧ融合タンパク質単量体または二量体の均質集団を使用することが好ましく、２つの形態を混合して使用することは好ましくない。
【０１１２】
また、本発明は、二量体活性ポリペプチド−ＩｇＧ融合タンパク質本来の純粋な形態を得る方法を提供する。その方法は、一般に、ＩｇＧ融合タンパク質を発現させることが可能な宿主細胞を収得し、条件培地を集め、カラムクロマトグラフィーによって単量体融合タンパク質、凝集体および汚染タンパク質から二量体融合タンパク質を精製することにより成し遂げられる。ＩｇＧ融合タンパク質を発現させる適切な宿主細胞は、酵母、昆虫、哺乳類または他の真核細胞を含む。一つの様態において、宿主細胞は哺乳類細胞であってもよく、具体的にＣＯＳ、ＣＨＯはＢＨＫ細胞である。
【０１１３】
また、本発明は、ポリペプチド薬物およびＦｃ断片の新規融合タンパク質を提供する。一つの具体的な様態において、ＥＰＯ、ｐ４０、Ｇ−ＣＳＦまたはＴＮＦ受容体などのポリペプチド薬物はペプチドリンカーの挿入なしでハイブリッドＦｃ断片に直接結合する。他の具体的な様態において、ポリペプチド薬物は１〜５０個のアミノ酸のペプチドリンカーを介して互いに結合し、さらに好ましくは１〜７個のアミノ酸のペプチドリンカーを介して結合する。このような目的に特に有用なリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基からなる（Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｓｅｒ配列番号３２）、またはヒトアルブミン由来の配列番号２５の２８２〜３１４位のアミノ酸からなる免疫的に非活性なペプチドを含む。
【０１１４】
リンカーが使用される場合、リンカーおよびポリペプチド薬物は特定の方法で製造できる。すなわち、リンカーはハイブリッドＦｃ断片のＮ末端、Ｃ末端または遊離基に連結でき、またポリペプチド薬物のＮ末端、Ｃ末端または遊離基に連結できる。リンカーがペプチドリンカーの場合、連結は任意の連結部位で起こり得る。ポリペプチド薬物およびハイブリッドＦｃが別個に発現された後で互いに結合するとき、結合(coupling)は当業界における公知の様々な任意の架橋剤を用いて行われ得る。架橋剤の例としては、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸(4-azidosalicylic acid)などのＮ−ヒドロオキシスクシンイミドエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むイミドエステル、および例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二機能性マレイミドを含むが、これに限定されない。
【０１１５】
また、本発明は、ポリペプチド薬物−ハイブリッドＦｃ断片の生産方法を提供する。
【０１１６】
また、本発明は、ポリペプチド薬物を投与して疾病を治療する方法を提供する。このような目的は、目的の疾病と直接関連しているあるいは関連していない健康状態を有する哺乳類に本発明のポリペプチドの有効量を投与することを含む。例えば、好ましいポリペプチド薬物−ハイブリッドＦｃ断片融合タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸が個体、好ましくは哺乳類に治療学的製剤として投与できる。また、ポリペプチド薬物−ハイブリッドＦｃ断片融合タンパク質をコードする核酸を含む細胞は、個体、好ましくは哺乳類に治療学的製剤として投与できる。また、ポリペプチド薬物−ハイブリッドＦｃ断片融合構造物は、個体、好ましくは哺乳類に治療学的有効量で投与できる。前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺経路で投与できる。
【０１１７】
本発明のＥＰＯ（この変異体／断片を含む）−Ｆｃ融合タンパク質は、哺乳類においてヘマトクリット(hematocrit)を維持し増加させるのに有用である可能性がある。
【０１１８】
ｐ４０はＩＬ−１２のサブユニットである。ＩＬ−１２は生体内で多様な機能を有する７５ｋＤａのヘテロ二量体サイトカインである。例えば、ＩＬ−１２は活性化されたＴおよびＮＫの増殖を促進させ、Ｔｈ−１タイプヘルパー細胞反応を促進させる。ＩＬ−１２は活性化されたＴおよびＮＫ細胞の血漿膜上のＩＬ−１２受容体に結合することにより、生物学的効果を発揮する。ＩＬ−１２がＩＬ−１２受容体に結合する能力はＩＬ−１２のｐ４０サブユニットに起因する。よって、本発明のｐ４０（この変異体／断片を含む）−Ｆｃ融合タンパク質は、（ｉ）自己免疫疾患を予防／治療の症状を緩和させ、（ｉｉ）移植拒否反応を抑制し、または（ｉｉｉ）内毒素により誘導されたショックを治療／予防するのに有用であり得る。また、本発明のｐ４０（この変異体／断片を含む）−Ｆｃ融合タンパク質は、リウマチ性関節炎(rheumatoid arthritis)、強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease)、多発性硬化症(multiple sclerosis)、または乾癬(psoriasis)症状を治療／予防／軽減させるのに有用であり得る。変異体および断片は当業界に知られており、ここに参考として組み込まれる国際公開特許第９７／２００６２号を含むが、これに限定されない。ｐ４０変異体の一様態はＡｓｎ３Ｇｌｎ置換を含むｐ４０を含むが、これに限定されない。
【０１１９】
顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は顆粒球、特に好中球の増殖および分化に核心的なタンパク質である。顆粒球は、侵入した微生物および細胞残屑を沈めて除去するので、感染反応に核心的である。化学治療は顆粒球を破壊し、および／または顆粒球の生産を減少させる。よって、本発明のＧ−ＣＳＦ（この変異体／断片を含む）−Ｆｃ融合タンパク質は、骨髄移植後に、化学療法によって誘導された好中球減少症骨髄抑制、急性白血病、再生不良性性貧血(aplastic anemia)、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndrome)、重症慢性好中球減少症、または移植のための末消血液前駆細胞の可動化(mobilization of peripheral blood progenitor cells)症状の治療／予防／軽減に有用である。
【０１２０】
本発明の融合タンパク質は、治療学的製剤として有用であるうえ、診断学的使用のための抗体の生産においても有用であることを当業者であれば認識することができる。その他にも、本発明の使用方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡの適切な投与、例えばそのような投与目的のベクターまたは他の伝達システムを含む。
【０１２１】
本発明の組成物はいずれの経路でも投与できる。本発明の組成物は直接（例えば、組織部位に注入、移植または局部的に投与することにより、局所的に）またはシステム的に（例えば、非経口または経口で）任意の適切な手段によって動物に提供できる。本発明の組成物が静脈内、皮下、眼、腹腔内、筋肉内、口腔、直腸、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊椎内、脳室内、くも膜下腔、嚢内、カプセル内、鼻内、またはエアロゾル投与のように非経口的に提供される場合、組成物は好ましくは水性、あるいは生理学的に適用可能な体液懸濁液または溶液の部分を含むことが好ましい。これにより、担体またはビヒクルが生理学的に許容可能なので、組成物に添加して患者に伝達できる。これは患者の電解質および／または体積バランスに悪影響を及ぼさない。よって、製剤のための液状媒体として、一般に生理食塩水を含むことができる。
【０１２２】
本発明のＤＮＡ構造物（または遺伝子構造物）は、ポリペプチド薬物またはその融合タンパク質構造物をコードする核酸を運搬する遺伝子治療プロトコルの一部として使用できる。
【０１２３】
本発明は、所望のポリペプチド薬物の機能を再構成または補充するために、特定の細胞タイプで目的のポリペプチド薬物またはその融合タンパク質構造物を生体内感染および発現させる発現ベクターを特徴とする。所望のポリペプチド薬物の発現構造物、またはその融合タンパク質構造物は、任意の生物学的有効担体と共に投与できるが、例えば、生体内細胞に所望のポリペプチド薬物コード遺伝子またはその融合タンパク質を効率よく運搬することが可能な任意の剤形または組成物などがそれである。
【０１２４】
本発明は、組み換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、および単純ヘルペスウイルス−１を含むウイルスベクター、または組み換えバクテリアプラスミドまたは組み換え真核プラスミド内に対象遺伝子を挿入することを含む。本発明の融合タンパク質をコードする核酸の好ましい投与量は、ヒトの場合に０．１ｍｇ〜１００ｍｇの範囲であり、さらに好ましくは１ｍｇ〜１０ｍｇ、最も好ましくは２ｍｇ〜１０ｍｇである。最適量および投与形態は当業界の技術水準に属する一般な実験によって決定することができる。
【０１２５】
融合タンパク質の好ましい単位投与量は、ヒトの場合に０．１ｍｇ〜１０００ｍｇであり、さらに好ましくは１ｍｇ〜１００ｍｇ、および最も好ましくは５ｍｇ〜２０ｍｇである。これが最適量ではあるが、治療対象疾患および副作用の有無によって異なる。ところが、最適の投与量は通常の実験を用いて決定できる。融合タンパク質の投与は周期的な急速注入(periodic bolus injections)により、あるいは外側供給源(external reservoir)（例えば、静脈注射保有袋または内側（例えば、生体腐食性インプラント）からの持続的な静脈内、皮下、または腹膜内投与によることができる。
【０１２６】
しかも、本発明の融合タンパク質は、他の生物学的活性分子と共に対象受容体に投与できる。ところが、融合タンパク質および他の分子の最適の組み合わせ、投与形態、定量は当業界における公知の通常の実験によって決定できる。
【実施例】
【０１２７】
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。但し、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
【０１２８】
〔実施例１：ｈＦｃ−１、ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４、ｈＦｃ−５およびｈＦｃ−６融合タンパク質の発現ベクターの製造〕
ｈＦｃ−１はＣ末端ＩｇＧ１ ＣＨ１領域の９個のアミノ酸（９０〜９８）、ＩｇＧ１のヒンジ領域（９９〜１１３）、Ｎ末端ＩｇＧ２ ＣＨ２領域の６個のアミノ酸（１１１〜１１６）、ＩｇＧ４ ＣＨ２領域の１０３個のアミノ酸（１１８〜２２０）、およびＩｇＧ４ ＣＨ３領域の１０７個のアミノ酸（２２１〜３２７）を含む（図１および図２）。ｈＦｃ−１のアミノ酸配列は配列番号１８に示されている。ｈＦｃ−１（配列番号１）、ヒトＥＰＯ（配列番号７）、ヒトＧ−ＣＳＦ（配列番号８）およびヒトｐ４０Ｎ３０３Ｑ（ヒトｐ４０サブユニットの３０３番目のアミノ酸ＡｓｎがＧｌｎで置換された突然変異）（ｐ４０Ｎ３０３Ｑのヌクレオチド配列は配列番号９に示されており、ヒトｐ４０のアミノ酸配列は配列番号１７に示されている）をコードするコドン最適化ヌクレオチドを得るために、それぞれこのようなヌクレオチド分子をＴＯＰ ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）(www.topgenetech.com)のカスタムサービスによって合成した。タンパク質発現水準を増加させるために、遺伝子のコドン使用を最適化させることが非常に効果的である。コドン使用のパターンは有機体間で互いに異なる。あるコドンはいずれか一つの有機体で非常に頻繁に使用されるが、他の有機体では殆ど使用されない。コドン使用におけるこのような傾向は、翻訳効率、コードされたタンパク質を合成するための有機体の能力に影響を与える。発現ベクターｐＡＤ１１（配列番号１０）に各融合遺伝子を挿入させるために、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびｐ４０Ｎ３０３ＱのＡＴＧ配列の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を生成させ、ｈＦｃ−１の終止コドンの３’末端にＸｂａＩ部位を生成させた。発現ベクターｐＡＤ１１はＲｃＣＭＶ骨格から収得した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄから可能）。ｐＡＤ１１はＣＭＶ(cytomegalovirus)に由来したプロモーター、ウシ成長ホルモンに由来したポリ（Ａ）配列、ウサギベータグロビンに由来したｇＩＶＳ(globin intervening sequence) (Mol Cell Biol, 1988 8: 4395)、およびその他の要素を含む。ｐＡＤ１１ベクターを製造するためには、ＲｃＣＭＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を複数箇所変形させる。まず、ネオマイシン抵抗性部位はＸｈｏＩ酵素によって除去させ、ｇＩＶＳをＣＭＶプロモーター部位の３’に追加させた。また、マウスＤＨＦＲ(dihydrofolate reductase)遺伝子(Pubmed, NM 010049)はＣＭＶプロモーターの５’に追加させた。ｐＡＤ１１ベクターは、前述したものを含む幾つかの要素の組み合わせ状態で各種発現テストを経て開発された。われわれの未発表結果において、ｐＡＤ１１ベクターはＲｃＣＭＶベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と比較するとき、発現水準において約１２倍の増加を示した。フレーム内でＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびｐ４０Ｎ３０３Ｑの３’末端とｈＦｃ−１の５’末端との連結部位を製造するために、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびｐ４０Ｎ３０３Ｑのコード配列の３’末端とｈＦｃ−１のコード配列の５’末端にＮｈｅＩ部位を生成させた。各制限酵素部位を用いたサブクローニングの後、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦまたはｐ４０Ｎ３０３Ｑで融合したｈＦｃ−１最終発現ベクターが製造された。これらをそれぞれｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１およびｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−１と命名した。
【０１２９】
ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４、ｈＦｃ−５およびｈＦｃ−６のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号１９〜２３に示されている。ｈＦｃ−６はＩｇＤ ＣＨ１ドメインＣ末端の９個のアミノ酸（９０〜９８）、ＩｇＤのヒンジ領域の６４個のアミノ酸（９９〜１６２）、ＩｇＤ ＣＨ２ドメインＮ末端の８個のアミノ酸（ｓｈｔｑｐｌｇｖ １６３〜１７０）、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインの１００個のアミノ酸（１２１〜２２０）、およびＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインの１０７個のアミノ酸（２２１〜３２７）を含む（図１および図２）。ｈＦｃ−６（配列番号６）をコードするコドン最適化ヌクレオチド分子を収得するために、遺伝子はＴＯＰ Ｇｅｎｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ(www.topgenetech.com)のカスタムサービスによって合成した。フレーム内でＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、またはｐ４０Ｎ３０３Ｑの３’末端およびｈＦｃ−６の５’末端を融合させるために、ｈＦｃ−６のＮ末端コード部位（９０および９１アミノ酸）に含まれたＮｈｅＩ部位（ｇｃｔａｇｃ：Ａｌａ−Ｓｅｒ）を使用した。また、ｐＡＤ１１ベクター内に各ｈＦｃ−６融合遺伝子を挿入するために、ＸｂａＩ部位をｈＦｃ−６遺伝子の３’末端に生成させた。各制限酵素部位を用いてサブクローニングした後、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦおよびｐ４０Ｎ３０３Ｑが融合したｈＦｃ−６を製造するための最終発現ベクターが製造された。これらをそれぞれｐＡＤ１１ ｐＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−６およびｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−６と命名した。ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４、およびｈＦｃ−５は同一のＣＨ２およびＣＨ３部位を有するが、それらはＩｇＤヒンジのサイズが互いに異なる（図１および図２）。ｈＦｃ−２（配列番号１９）、ｈＦｃ−３（配列番号２０）、ｈＦｃ−４（配列番号２１）、およびｈＦｃ−５（配列番号２２）はそれぞれ、Ｃ末端ＩｇＤヒンジの５個のアミノ酸（１５８〜１６２）、１０個のアミノ酸（１５３〜１６２）、２０個のアミノ酸（１４３〜１６２）、３０個のアミノ酸（１３３〜１６２）を含む（図１および図２）。ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ｐ４０Ｎ３０３ＱまたはＴＮＦＲ(tumor necrosis factor receptor II)（配列番号３０）、およびこのようなｈＦｃをコードする核酸分子（配列番号２〜５）間の融合遺伝子を製造するために、融合した遺伝子の全体サイズにおける最小遺伝子断片をＴＯＰ ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ(ww.topgenetech.com)のカスタムサージスによって合成した。各ｈＦｃ−２、ｈＦｃ−３、ｈＦｃ−４またはｈＦｃ−５のヒンジおよびＮ末端ＣＨ２領域をコードするヌクレオチド分子に融合した各ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ｐ４０Ｎ３０３ＱびＴＮＦＲの断片は、全体ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ｐ４０Ｎ３０３ＱまたはＴＮＦＲ配列からＩｇＧ４内のＣＨ２領域（配列番号１３）の１３８〜１４０番目のアミノ酸残基に位置する同一酵素部位としてのＢｓｔＥＩＩ部位（ＧＧＴＧＡＣＣ）までを含む。各種遺伝子断片を含むサブクローニングベクターは、それぞれ５’末端および３’末端に位置するＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＥＩＩで切断された後、ｈＦｃ−６のＣＨ２〜ＣＨ３部位に連結される。最終的に、各融合遺伝子はＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位を用いてｐＡＤ１１にサブクローニングさせ、これらをそれぞれｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−２、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−３、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−４、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−２、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−３、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−４、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−２、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−３、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−４、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５、およびｐＡＤ１１ ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５と命名した。
【０１３０】
〔実施例２：ＩＦＮ−βに結合したｔｈＦｃ−１およびｔｈＦｃ−２のための発現ベクターの製造〕
ｔｈＦｃ−１はヒトｔＰＡ(tissue plasminogen activator)のシグナル配列の２３個のアミノ酸（ＭＤＡＭＬＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ）、ＩｇＧ１ヒンジ領域の１５個のアミノ酸（９９〜１１３）、Ｎ末端ＩｇＧ２ ＣＨ２領域の６個のアミノ酸（１１１〜１１６）、ＩｇＧ４ ＣＨ２領域の１０３個のアミノ酸（１１８〜２２０）、およびＩｇＧ４ ＣＨ３部位の１０７個のアミノ酸（２２１〜３２７）を含む。ｔｈＦｃ−１のアミノ酸配列は配列番号２８に示されている。ｔｈＦｃ−２はｔＰＡシグナル配列の２３個のアミノ酸（ＭＤＡＭＬＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳ）、ＩｇＤヒンジ領域の１５個のアミノ酸（１４８〜１６２）、Ｎ末端ＩｇＤ ＣＨ２領域の８個のアミノ酸（１６３〜１７０）、ＩｇＧ４ ＣＨ２部位の１００個のアミノ酸（１２１〜２２０）、およびＩｇＧ４ ＣＨ３領域の１０７個のアミノ酸（２２１〜３２７）を含む（図３）。ｔｈＦｃ−２のアミノ酸配列は配列番号２９に示されている。シグナル配列の除去されたヒトＩＦＮ−βのＮ末端に結合したｔｈＦｃ−１（配列番号２６）またはｔｈＦｃ−２（配列番号２７）をコードするコドン最適化ヌクレオチドを収得するために、このようなヌクレオチド分子をＴＯＰ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｑｕｅｂｅｃ、 Ｃａｎａｄａ）(www.topgenetech.com)のカスタムサービスによって合成した。発現ベクターｐＡＤ１１（配列番号１０）に各融合遺伝子を挿入するために、ｔｈＦｃ−１またはｔｈＦｃ−２の５’末端にＥｃｏＲＩ部位を生成させ、ＩＦＮ−βの終止コドンの３’末端にＮｏｔＩ部位を生成させた。各制限酵素部位を用いてサブクローニングした後、最終発現ベクターをそれぞれｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａと命名した。
【０１３１】
相異なるサイズのアルブミンリンカーまたはＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーを介してＩＦＮ−βに結合したｔｈＦｃを製造するために、結合したｔｈＦｃ−１のＣＨ３領域のＰｓｔＩ部位から相異なるサイズのアルブミンリンカー（３ａａ、８ａａ、１３ａａ、１８ａａ、２３ａａおよび３３ａａ）またはＧｌｙ−Ｓｅｒリンカー（１５ａａ）を介してそのシグナル配列が除去されたＩＦＮ−βの範囲を有する遺伝子断片をＴＯＰ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ(wwww.topgenetech.com)のカスタムサービスによって合成した（図４）。発現ベクターｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａに７個の相異なる遺伝子断片を挿入させるために、ＰｓｔＩ部位をそれらの５’末端に生成させ、ＮｏｔＩ部位をＩＦＮ−βの終止コドンの３’末端に生成させた。各制限酵素部位を用いてサブクローニングした後、最終発現ベクターをｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（１）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（２）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（４）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（５）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（６）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−１−ＧＳ−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、およびｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（１）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（２）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（４）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（５）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、ｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＡＬ（６）−ＩＦＮ−ｂｅｔａ、およびｐＡＤ１１ ｔｈＦｃ−２−ＧＳ−ＩＦＮ−ｂｅｔａと命名した。
【０１３２】
〔実施例３：ヒトＥＰＯ−ｈＦｃｓ、ヒトＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃｓ、ヒトｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃｓ、ヒトＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびｔｈＦｃｓ−ＩＦＮ−ｂｅｔａタンパク質の発現〕
発現検証のためにＣＯＳ−７細胞を使用し、１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、Ｓｏｕｔｈ Ｌｏｇａｎ）および抗生物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）の添加されたＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）で培養した。ＥＰＯ−ｈＦｃｓ、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃｓ、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃｓ、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５、ｔｈＦｃｓ−ＩＦＮ−ｂｅｔａをコードするベクターは、通常のエレクトロポレーション方法を用いて５×１０６ＣＯＳ−７細胞に感染させた。感染４８時間後、上澄み液および細胞を収得した。各ベクターからの融合タンパク質の発現を確認するために、全てのサンプルは多数のキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、＃ＤＥＰ００ ｆｏｒ ＥＰＯ；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、＃ＫＨＣ２０３２ ｆｏｒ Ｇ−ＣＳＦ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、＃ＤＹ１２４０ ｆｏｒ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ；Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、＃ＤＲＴ２００ ｆｏｒ ＴＮＦＲ；ＰＢＬ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｌａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ、＃４１４１０−１Ａ ｆｏｒ ＩＦＮ−ｂｅｔａ）を用いてＥＬＩＳＡ分析し、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いてウエスタンブロット分析した。その結果、全てのベクターは上澄み液および細胞溶解物で正確な発現様相を示した（データは提示されない）。
【０１３３】
〔実施例４：ｈＦｃ融合タンパク質の精製〕
ＣＨＯ／ＤＨＦＲ−／−（ＣＨＯ細胞、ＤＧ４４、ＡＴＣＣ）は、α−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）、１０％透析ウシ胎仔血清（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ）、ＨＴ補充剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）および抗生物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）で培養した。通常のＣａＰＯ４共沈法によって発現ベクターをＣＨＯ細胞に感染させた。感染４８時間後、ＣＨＯ細胞をプレートから取り外し、様々な比率（１／２、１／５、１／２０、１／５０、１／１００、１／２００、１／５００）で希釈させた。希釈した細胞は１００ｍｍのディッシュに接種し、ＨＴ補充剤のない培地で培養した。スクリーニング過程中に、継代していない細胞にＨＴ補充剤のない新規培地を供給した。コロニーは接種２〜３週後に生成され、各コロニーを４８ウェルプレートに移した。ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ｐ４０Ｎ３０３ＱおよびＴＮＦＲ検出に対するＥＬＩＳＡ分析によって陽性コロニーをスクリーニングした。最も高い発現を示した各コロニーは無血清培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｋａｎｓａｓ）を用いて大規模（５Ｌ）培養した。収得された無血清上澄み液は各融合タンパク質の精製に使用した。精製のために２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）でＨｉＴｒａｐ組み換えタンパク質Ａ ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）カラムの均衡を維持させた。濾過された上澄み液をカラムに添加し、０．１Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出したタンパク質は膜（ＭＷＣＯ １２ １４Ｋ、ｓｐｅｃｔｒａｐｏｒ、Ｒａｎｃｈｏ Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ）で３回以上透析した後、最終的に収得した。タンパク質サンプルの全ての濃度は総タンパク質を測定するためのＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）およびＥＰＯ−ｈＦｃｓ、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃｓ、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃｓ、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびｔｈＦｃｓ−ＩＦＮ−ｂｅｔａを測定するためのＥＬＩＳＡキットによって決定した。
【０１３４】
〔実施例５：ＦｃｇＲＩおよびＣｌｑ結合分析〕
ｈＦｃ−５融合タンパク質がＦｃｇＲＩおよびＣｌｑに結合するか否かを調べるために、ＭａｂＴｈｅｒａ（リツキシマブ(Rituximab)、Ｒｏｃｈｅ）、ｈＩｇＧ１（カルバイオケム(Calbiochem)、Ｃａｔ＃、４００１２０）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト(Etanercept)、Ａｍａｇｅｎ）、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５およびｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５を連続的に希釈し（２μｇ／ｍＬから１６ｎｇ／ｍＬまで２培ずつ）、４℃で８ウェルストリップ上に一晩結合させておいた。標準曲線を作るために、ＦｃｇＲＩ（Ｒ＆Ｄ、ｃａａｔ＃ＢＡＦ１２５７）またはＣｌｑ（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃｈ、Ｃａｔ＃、２２２１〜５５０４）も連続的に希釈し（２μｇ／ｍＬから３２ｎｇ／ｍＬまで２倍ずつ）、４℃で一晩８ウェルストリップ（ＣＯＳＴＡＲ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）上に一晩結合させておいた。洗浄バッファ（０．０５％ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で各サンプルのストリップを洗浄し、室温で１時間ＰＢＳで１０％ＦＢＳで抑制した後、各ウェルに２μｇ／ｍＬのＦｃｇＲＩまたはＣｌｑを添加し、しかる後に、室温で２時間培養した。全てのストリップは洗浄バッファで洗浄した。Ｃｌｑ結合検証のために、各ウェルに２．５μｇ／ｍＬの抗−Ｃｌｑ（ＡｂＤ ｓｅｒｏｔｅｃｈ、ｃａｔ＃．２２２１〜５００４Ｐ）結合ＨＲＰを添加した後、暗条件の室温で３０分間培養した。ＦｃｇＲＩ結合検証のために、各ウェルに２μｇ／ｍＬのビオニン化抗−ＦｃｇＲＩ（Ｒ＆Ｄ、ｃａｔ＃．１２５７−ＦＣ）を添加した後、室温で１時間培養した。洗浄バッファでこれらを洗浄した後、３０００倍で希釈されたストリプトアビジン−ＨＲＰ（ＢＤ、ｃａｔ＃．５５４０６６）を各ストリップに添加し、しかる後に、暗条件の室温で３０分間培養した。ストリップを洗浄した後、ＴＭＢ溶液（ＴＭＢペルオキシダーゼ基質およびペルオキシダーゼ基質溶液Ｂ、ＫＰＬの１：１混合物、ＫＰＬ、ｃａｔ＃．５０−７６−０１、ｃａｔ＃，５０−６５−００）を添加し、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加した。図６（ａ）および図６（ｂ）に示すように、ＭａｂＴｈｅｒｅ（登録商標）、Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標）およびｈＩｇＧ１はＦｃｇＲＩおよびＣｌｑによく結合したが、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、およびｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５はそうではない。
【０１３５】
〔実施例６：精製されたｈＦｃ融合タンパク質の試験管内生物活性〕
ＥＰＯ−ｈＦｃタンパク質の試験管内生物活性を調べるために、ヒトＦ３５Ｅ細胞株を、１０％ＦＢＳ、抗生物質および５ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトＥＰＯ（ＤｏｎｇＡ、韓国）が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）で培養した。９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）のテストウェルに２×１０４細胞を接種して生物学的検定を行った。このようなウェルに、ＥＰＯ、ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ＥＰＯ−ＩｇＧ１ ＦｃまたはＡｒａｎｅｓｐ（ダーベポエチンアルファ、Ａｍｇｅｎ）を連続的に希釈した（０、０．０６４ｍＩＵ／ｍＬ〜２５ＩＵ／ｍＬ）サンプルを添加した。プレートは湿っぽい５％ＣＯ２培養器に３７℃で７２時間培養した。製造社のプロトコルによって、細胞成長比色分析キット(cell growth colorimetric assay kit)（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、韓国）を用いてＭＴＴ分析を行った。ヒトＦ３５Ｅ細胞株は、細胞数および吸光度値における用量依存方式によって証明されたように、ｒＥＰＯに対して強い増殖反応を示した。図７（ａ）に示すように、ＩｇＧ１ ＦｃまたはｈＦｃに結合したＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）およびＥＰＯタンパク質はＥＰＯタンパク質に比べて生物学的活性が減少した。ところが、ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＥＰＯ−ｈＦｃ−６はＥＰＯ−ＩｇＧ１ Ｆｃより著しく増加した生物活性を示した。また、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＥＰＯ−ｈＦｃ−６はＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）より若干高い生物活性を示すが、これはｈＦｃ融合タンパク質がＥＰＯタンパク質の生物活性維持においてＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）よりさらに優秀に見えることを意味する。
【０１３６】
試験管内Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃタンパク質の生物活性を調べるために、マウス造血細胞株ＮＦＳ−６０を、１０％ＦＢＳ、抗生物質および１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬの組み換えマウスＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｎ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）が添加されたＲＰＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）で培養した。９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）のウェルに２×１０４細胞を接種して生物学的検定を行った。このようなウェルに、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５およびＮｅｕｌａｓｔａを連続的に希釈（０〜１００００ｐｇ／ｍＬの範囲で３倍ずつ）したサンプル（ペグフィルグラスチム、Ａｍｇｅｎ）を添加した。プレートは湿っぽい５％ＣＯ２培養器に３７℃で７２時間培養した。タンパク質サンプルはトリプリケートウェル(Tiplicate well)で分析し、このような実験は５回繰返し行われた。７２時間培養後、製造社のプロトコルによって、細胞成長比色分析キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、韓国）を用いてＭＴＴ分析を行った。図７（ｂ）に示すように、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５はＮｅｕｌａｓｔａ（登録商標）より若干高い試験管内生物活性を示した。
【０１３７】
ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃタンパク質の試験管内生物活性を調べるために、１０％ＦＢＳ、および抗生物質を添加したＰＲＭＩ１６４０培地（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）で、抗ヒトＣＤ３抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、＃ＭＡＢ１００）２μｇ／ｍＬが存在し、ヒトｐ４０（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ）１０ｎｇ／ｍＬまたはｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５が存在するまたは非存在しない環境でリウマチ性関節炎患者のＰＢＭＣｓ(peripheral blood mononuclear cells)を培養した。６日の後、ＣＤ４およびＩＬ−１７に対して陽性の細胞をＦＡＣＳ分析によって測定した。図７（ｃ）に示すように、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５はｐ４０タンパク質よりＣＤ４＋／ＩＬ−１７＋細胞の生産においてさらに強力な抑制効果を示したが、これはＴｈ１７の極性化(polarization)におけるｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５の抑制機能を示す。
【０１３８】
ＴＮＦＲ−ｈＦｃタンパク質の試験管内生物活性を調べるために、マウスＬ９２９細胞を、１０％ＦＢＳおよび抗生物質が添加されたＲＰＭＩ１６４０（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）培地で培養した。９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）のウェルに３×４１０個の細胞を接種して細胞変性抑制分析(cytopathic inhibition assay)を開始し、しかる後に、ＴＮＦ−α １ｎｇ／ｍＬを処理した。このようなウェルに、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）（エタネルセプト(etanercept)、Ａｍｇｅｎ）が連続的に希釈された（１５．６〜１０００ｎｇ／ｍＬの範囲で、２倍ずつ）サンプルを添加した。プレートは湿っぽい５％ＣＯ２培養器に３７℃で７２時間培養した。培養の後、製造社のプロトコルによって、細胞成長比色分析キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、韓国）を用いてＭＴＴ分析を行った。図７（ｄ）に示すように、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５は試験管内でＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より若干高い生物活性を示した。
【０１３９】
ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａタンパク質の試験管内生物活性を調べるために、ＷＩＳＨ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２５）が１０％ＦＢＳおよび抗生物質の添加されたＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｃａｍｂｒｅｘ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃｉｔｙ）培地で培養された。９６ウェル細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、オランダ）のウェルに３×４１０個の細胞を接種して細胞変性抑制分析を行い、しかる後に、ＶＳＶ（ＡＴＣＣ、ＶＲ−１５８）１５００ＰＦＵ／ｗｅｌｌで処理した。このようなウェルに、組み換えＩＦＮ−ｂｅｔａ（ＷＨＯ標準、ＮＩＢＳＣ ００／５７２）、ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａおよびｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａタンパク質が連続的に希釈されたサンプル（４０ＩＵ／ｍＬから２倍ずつ）を添加した。プレートは湿っぽい５％ＣＯ２培養器に３７℃で７２時間培養した。培養の後、製造社のプロトコルによって、細胞成長比色分析キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、韓国）を用いてＭＴＴ分析を行った。図７（ｅ）に示すように、ｔｈＦｃ−１−ＡＬ（３）−ＩＦＮ−ｂｅｔａはｔｈＦｃ−１−ＡＬ（０）−ＩＦＮ−ｂｅｔａより２０倍さらに高い生物活性を示したが、これはＦｃに融合したＩＦＮ−βの生物活性を維持するのにアルブミンリンカーが重要な役割を果たすことを示す。
【０１４０】
〔実施例７：精製されたｈＦｃ融合タンパク質の生体内半減期〕
ＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）の半減期を比較するために、１５匹のカニクイザルに単一皮下（subcutaneous、ＳＣ）注入または単一静脈（intravenous、ＩＶ）注入を介して２４００ＩＵ／ｋｇの量でこれらタンパク質を処理した。注入前、および注入後１、３、６、１２、２４、３０、４８、５４、７２、７８、９６、１２０、１６８、３３６、５０４、および６７２時間に各猿の血液サンプルを収得した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温で培養した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、各サンプルから血清を収得し、超低温冷凍庫に貯蔵した。各時間に収得した全てのサンプルを定量化するために、ＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットを用いてテストした。図８（ａ）に示すように、ＳＣまたはＩＶ経路を経てＥＰＯ−ｈＦｃ−１またはＥＰＯ−ｈＦｃ−５が注入された全ての猿は、ＳＣまたはＩＶ経路を経てＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）が注入された猿より長い半減期を示した。
【０１４１】
Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１の薬動学を調査するために、グループ当り２匹の雄ＳＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）にＳＣまたはＩＶ経路を経て対照群としてＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）（フィルグラスチム(filgrastim) 、ＤｏｎｇＡ、韓国）１００μｇ／ｋｇおよびＧＣＳＦ−ｈＦｃ−１を投与した。注入前、および注入後１、２、３、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０および１９２時間に血液サンプルを収得した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温で培養した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、各サンプルから血清を収得し、超低温冷凍庫に貯蔵した。サンプルはＧ−ＣＳＦキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、＃ＫＨＣ２０３２）を用いて１／２、１／５、１／５０、１／２５０、１／５００などの幾つかの希釈比率で定量した。図８（ｂ）に示すように、ＳＣたはＩＶ経路を経て注入されたＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１はＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）より長い半減期を示した。Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１およびＧ−ＣＳＦは、ＳＣ投与後にそれぞれ８．７６時間および２．３６時間の生体内半減期を有し、ＩＶ投与後にそれぞれ１０．４２時間および１．７８時間の生体内半減期を有した。よって、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１は、ＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）と比較するとき、ＳＣ注入の場合に３．７倍の半減期増加を示し、ＩＶ注入の場合には５．９倍の半減期増加を示した。
【０１４２】
ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）の薬動学を調査するために、グループ当り３匹のカニクイザルに１００μｇ／ｋｇの量でこれらタンパク質を単一ＳＣ注入処理した。各猿の血液サンプルは注入前、および注入後８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８、３３６、５０４および６７２時間に収得した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温で培養した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、各サンプルから血清を収得し、超低温冷凍庫に貯蔵した。各時間に収得した全てのサンプルは、ヒトｐ４０およびヒトＴＮＦＲＩＩを定量化するために、ＥＬＩＳＡキットを用いてテストした。図８（ｃ）に示すように、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より低いＣｍａｘ値（平均３ｎｇ／ｍＬ ｖｓ ７ｎｇ／ｍＬ）を示したが、ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より長い半減期を示した（平均１９９ｈ ｖｓ １２７ｈ）。
【０１４３】
ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５およびＥｎｂｒｅｌ（登録商標）の薬動学(pharmacokinetics)を調査するために、グループ当り３匹のＳＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）に５００μｇ／ｋｇの量でこれらタンパク質を単一ＳＣ注入した。各ラットの血液サンプルは注入前、および注入後２、４、８、１２、２４、３０、４８、７２、９６および１２０時間に収得した。血液サンプルは凝集のために３０分間室温で培養した。３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、各サンプルから血清を収得し、超低温冷凍庫に貯蔵した。各時間に収得した全てのサンプルは、ヒトＴＮＦＲＩＩを定量化するために、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、＃ＤＲＴ２００）を用いてテストした。図８（ｄ）に示すように、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）の半減期と類似であったが（平均２８．６ｈ ｖｓ ２９．４ｈ）、ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５はＥｎｂｒｅｌ（登録商標）より高いＡＵＣ水準を示した（平均１９８．１ ｖｓ １７２．９μｇ＊ｈ／ｍＬ）。
【０１４４】
〔実施例８：精製されたｈＦｃ融合タンパク質の生体内生物活性〕
ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）の生体内生物活性を比較するために、グループ当り３匹のカニクイザルに２４００ＩＵ／ｋｇの量でこれらタンパク質を単一ＳＣ注入または単一ＩＶ注入処理した。注入前、および注入後１、３、６、１２、２４、３０、４８、５４、７２、７８、９６、１２０、１６８、３３６、５０４および６７２時間に各猿の血液サンプルを収得した。
【０１４５】
ＥＰＯ−ｈＦｃ−５およびＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）の生体内生物活性を評価するために、網状赤血球を含む多様な血液細胞の数を測定した。図９（ａ）に示すように、猿における網状赤血球の増加に関連し、ＥＰＯ−ｈＦｃ−５はＳＣおよびＩＶ経路の両方ともでＡｒａｎｅｓｐ（登録商標）より若干高い生体内効能を示した。
【０１４６】
Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１の生体内生物活性を調査するために、対照群としてＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）（フィルグラスチム、ＤｏｎｇＡ、韓国）、およびＧ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１を１００μｇ／ｋｇの量でＳＣまたはＩＶ経路を経てグループ当り２匹の雄ＳＤラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）に投入した。注入前、および注入後１、２、３、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１２０および１９２時間にＥＤＴＡを用いて血液を収得した。各血液サンプルはＲＢＣ溶解バッファ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、韓国）で４分間処理し、ＦＡＣＳバッファで希釈された総ＷＢＣｓ(white blood cells)は血球計数器(hematocytometer)を用いて３回繰返しカウントした。ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いてＦＳＣ（正方向スキャター）で細胞サイズを決定し、ＳＳＣ（側面スキャター）で顆粒のサイズを決定することにより、顆粒球の数を測定した。図９（ｂ）に示すように、ＳＣおよびＩＶ経路を介して処理されたＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）は注入２４時間後にＷＢＣおよび顆粒球のピーク数を誘導した。これに対し、Ｇ−ＣＦＳ−ｈＦｃ−１はＳＣ注入７２時間後、およびＩＶ注入４８時間後にＷＢＣおよび顆粒球のピーク数を誘導した。注入後２４時間〜１２０時間に、ＬＥＵＣＯＳＴＩＭ（登録商標）と比較するとき、Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−１は生体内生物活性をさらに高く持続させた。
【０１４７】
以上、本発明を好適な実施例として開示および記述したが、当業者であれば、添付した請求の範囲によって定められる本発明の精神と範囲から逸脱することなく、発明の形態および詳細の多様な変更が可能であることを理解するであろう。
【産業上の利用可能性】
【０１４８】
本発明は、生物学的活性分子およびこの生物学的活性分子に連結された免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインを含む融合タンパク質に関する。Ｆｃドメインは（ｉ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４、または（ｉｉ）ＩｇＧ４およびＩｇＤのハイブリッドヒトＦｃドメインである。ハイブリッドＦｃは生物学的活性分子の担体として有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式で表されるポリペプチド：
Ｎ’−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’
ここで、Ｎ’はポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’はポリペプチドのＣ末端であり、
Ｚ１は少なくとも（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端領域を含むアミノ酸配列であり、
Ｙは少なくとも（ｉ）配列番号１１の９９〜１１３位または（ｉｉ）配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基のＣ末端領域を含むアミノ酸配列であり、
Ｚ２は少なくとも（ｉ）配列番号１２の１１１〜１４７位または（ｉｉ）配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含むアミノ酸配列であり、
Ｚ３〜Ｚ４は（ｉ）配列番号１１の１１８〜２２３位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１１の２２４〜３３０位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１２の１１４〜２１９位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１２の２２０〜３２６位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２４の１６５〜２７０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号２４の２７１〜３７７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域の連続アミノ酸配列よりなる群から選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列であり、
ｐは０または１の整数であり、
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも８０〜１４０個であり、
前記ポリペプチドのアミノ酸残基の総数は両方とも１５４〜２８８個である。
【請求項２】
前記Ｚ１は（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基の５〜９個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｚ１は（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｚ１は（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４の９０〜９８位の５〜９個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｚ１は（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸残基９０〜９８からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｙは（ｉ）配列番号１１の９９〜１１３位または（ｉｉ）配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基の１０個またはそれ以上の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｙは、配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５８〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５３〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１４３〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１３３〜１６２位のアミノ酸残基、または配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｚ２は（ｉ）配列番号１２の１１１〜１４７位または（ｉｉ）配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基４〜３７個の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｚ２は（ｉ）配列番号１２の１１１〜１４７位または（ｉｉ）配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基６〜３０個の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸の総数は両方とも９０〜１２０個または両方とも１０５〜１１５個であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｚ４は配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基９０個またはそれ以上、または１００個またはそれ以上の連続アミノ酸残基であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記Ｚ４は配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記Ｚ１は配列番号１１の９４〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記Ｙは配列番号１１の１０９〜１１３位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記Ｙは配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１４位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ｙは少なくとも配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であり、前記ｐは０であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記Ｚ３は配列番号１３の１５０〜２２０位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記Ｚ３は配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基の７１〜１０６個の連続したアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０９個であることを特徴とする、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、Ｚ３は配列番号１３の１１８〜２２０位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記Ｚ１は配列番号１４の９４〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記Ｚ１は配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記Ｙは配列番号１４の１５８〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記Ｙは配列番号１４の１３３〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記Ｙは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１６６位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１６８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記Ｙは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり、ｐは０であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基の部分を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記Ｙは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基の２０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、３０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、４０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、５０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、または６０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１７０位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記Ｚ３は配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記Ｚ３は配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基の７１〜１００個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０８個であることを特徴とする、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６、配列番号２６および配列番号２７よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２８および配列番号２９よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドは配列番号１８のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドは配列番号２２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドは配列番号２３のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１のポリペプチドおよび生物学的活性を含むキメラポリペプチドにおいて、前記生物学的活性分子は請求項１のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し、前記生物学的活性分子はその生物学的活性分子の天然型の循環半減期に比べて増加した循環半減期を示すことを特徴とする、キメラポリペプチド。
【請求項４５】
前記生物学的活性分子は可溶性タンパク質であることを特徴とする、請求項４４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４６】
前記生物学的活性分子はホルモン、サイトカイン、成長因子、共刺激分子、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、成長因子受容体、または短ペプチドであることを特徴とする、請求項４５に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４７】
前記生物学的活性分子はＥＰＯまたはその変異体／断片であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４８】
前記生物学的活性分子はｐ４０、ＴＮＦ受容体またはその変異体／断片であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４９】
前記生物学的活性分子はＡｓｎ３０３Ｇｌｎ置換を含むｐ４０変異体であることを特徴とする、請求項４８に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５０】
前記生物学的活性分子はＧ−ＣＳＦまたはその変異体／断片であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５１】
前記生物学的活性分子はＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ヒト成長ホルモン、ＢＭＰ−１(bone morphogenetic protein-1)、インターフェロンα、ＩＬ−１０、ＦＳＨ、血液因子ＶＩＩ、ＣＴＬＡ４、ＩＦＮ−β、ＰＤ−１、ＩＬ−１０Ｒ、ＣＸＣＬ−１１、ＴＧＦ−β受容体、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１７Ｒ、ＧＬＰ−１、ＢＴＣ、ＯＰＧ、ＲＡＮＫまたはそれらの変異体／断片であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５２】
前記生物学的活性分子は分泌タンパク質であることを特徴とする、請求項４４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５３】
前記生物学的活性分子は分泌タンパク質の成熟形態(mature form)であることを特徴とする、請求項５２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５４】
前記生物学的活性分子は抗体のＦａｂ領域であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５５】
前記ポリペプチドおよび前記生物学的活性分子はリンカーを介して互いに連結されたことを特徴とする、請求項４４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５６】
前記リンカーはアルブミンリンカーまたは合成リンカーであることを特徴とする、請求項５５に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５７】
前記リンカー分子はアルブミンリンカーであることを特徴とする、請求項５６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５８】
前記アルブミンリンカーは配列番号２５のアミノ酸配列３２１〜３２３、３１８〜３２５、３１６〜３２８、３１３〜３３０、３１１〜３３３、または３０６〜３３８を含むことを特徴とする、請求項５７に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５９】
前記合成リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基からなる１０〜２０個のアミノ酸残基のペプチドであることを特徴とする、請求項５６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６０】
前記Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号３２）であることを特徴とする、請求項５９に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６１】
（ｉ）哺乳類宿主細胞に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を導入する段階と、（ｉｉ）成長培地でポリペプチドが発現できる条件の下で細胞を成長させる段階と、（ｉｉｉ）発現されたポリペプチドを収得する段階とを含む、請求項１によるポリペプチドの生産方法。
【請求項６２】
前記哺乳類宿主細胞はＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢＨＫ細胞であることを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項４４、４８、または４９または９４のいずれか１項によるキメラポリペプチドの治療学的有効量を投与することを含む、（ｉ）自己免疫疾患症状の軽減、予防または治療、（ｉｉ）移植拒否反応の抑制、または（ｉｉｉ）内毒素により誘導されたショックの治療または予防方法。
【請求項６４】
前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺回路を介して投与されることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
請求項４４、４８、または４９または９４のいずれか１項によるキメラポリペプチドの治療学的有効量を投与することを含む、リウマチ性関節炎(rheumatoid arthritis)、強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease)、多発性硬化症(multiple sclerosis)、乾癬(psoriasis)、アトピー(atopy)、骨関節炎(osteoarthritis)、または骨粗しょう症(osteoporosis)の症状を（ｉ）治療、（ｉｉ）予防または（ｉｉｉ）軽減させる方法。
【請求項６６】
前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺回路を介して投与されることを特徴とする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
骨髄移植後の好中球減少骨髄異常(neutropenia myelosuppression)、急性白血病(acute leukemia)、再生不良性貧血(aplastic anemia)、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndrome)、重症慢性好中球減少症(severe chronic neutropenias)、または移植のための末梢血液前駆細胞の可動化(mobilization of peripheral blood progenitor cells)の症状を（ｉ）治療、（ｉｉ）予防または（ｉｉｉ）軽減させる方法。
【請求項６８】
前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺回路を介して投与されることを特徴とする、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項４４または４７のキメラポリペプチドの治療学的有効量を投与することを含む、哺乳類のヘマトクリット水準の（ｉ）増加または（ｉｉ）維持方法。
【請求項７０】
前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺回路を介して投与されることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記キメラポリペプチドは皮下または静脈に投与されることを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
請求項４４のキメラポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項７３】
前記キメラポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８および配列番号２９よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項７２に記載の核酸分子。
【請求項７４】
前記核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号２６および配列番号２７よりなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項７３に記載の核酸分子。
【請求項７５】
前記核酸分子はシグナル配列またはリーダー配列をさらに含むことを特徴とする、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７６】
前記シグナル配列はｔＰＡシグナル配列であることを特徴とする、請求項７５に記載の核酸分子。
【請求項７７】
請求項７２による核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７８】
前記発現ベクターは、ｐＡＤ１１のＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＳＣＦ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１1 ｐ４０ＮＯ３０３Ｑ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤＤ１１ Ｇ−ＳＣＦ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５およびｐＡＤ１１ ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７７に記載の発現ベクター。
【請求項７９】
請求項７７の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８０】
請求項７９の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８１】
必要とする哺乳類に請求項７２による核酸を投与する段階を含む、哺乳類に生物学的活性分子を伝達する方法。
【請求項８２】
前記生物学的活性分子は免疫グロブリン群に属しないことを特徴とする、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
前記ポリペプチドは、抗体の可変領域であるＶＨおよびＶＬが欠如していることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
Ｎ末端でＣ末端方向にヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインよりなるＦｃドメインを含むポリペプチドにおいて、前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＤ部位またはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含むが、そのＣＨ２ドメインのＮ末端４〜３７個のアミノ酸残基はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインまたはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域の対応するアミノ酸残基を含み、前記ＣＨ３ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基部分を含む、ポリペプチド。
【請求項８５】
前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含むが、そのＣＨ２ドメインのＮ末端の４〜３７個のアミノ酸残基はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインのＮ末端の対応するアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩＧＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含むが、そのＣＨ２ドメインのＮ末端の４〜３７個のアミノ酸残基はヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端の対応するアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
前記ポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含み、前記ＣＨ１ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ１ドメインは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合していることを特徴とする、請求項８５に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
前記ポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含み、前記ＣＨ１ドメインは少なくともヒトＩｇＤ ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ１ドメインは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合していることを特徴とする、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
請求項８４のポリペプチドを含むキメラポリペプチドおよび生物学的活性分子において、前記生物学的活性分子は請求項８４のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し、前記生物学的活性分子は前記生物学的活性分子のその天然型の循環半減期に比べて増加した循環半減期を示す、キメラポリペプチド。
【請求項９０】
前記ポリペプチドは配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２８および配列番号２９よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項１】
下記式で表されるポリペプチド：
Ｎ’−（Ｚ１）ｐ−Ｙ−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｃ’
ここで、Ｎ’はポリペプチドのＮ末端であり、Ｃ’はポリペプチドのＣ末端であり、
Ｚ１は少なくとも（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基のＣ末端領域を含むアミノ酸配列であり、
Ｙは少なくとも（ｉ）配列番号１１の９９〜１１３位または（ｉｉ）配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基のＣ末端領域を含むアミノ酸配列であり、
Ｚ２は少なくとも（ｉ）配列番号１２の１１１〜１４７位または（ｉｉ）配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含むアミノ酸配列であり、
Ｚ３〜Ｚ４は（ｉ）配列番号１１の１１８〜２２３位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１１の２２４〜３３０位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１２の１１４〜２１９位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１２の２２０〜３２６位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号２４の１６５〜２７０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号２４の２７１〜３７７位のアミノ酸残基のＮ末端領域を含む連続アミノ酸配列、および（ｉｖ）配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基のＣ末端領域および配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基のＮ末端領域の連続アミノ酸配列よりなる群から選ばれたいずれか一つのアミノ酸配列であり、
ｐは０または１の整数であり、
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は両方とも８０〜１４０個であり、
前記ポリペプチドのアミノ酸残基の総数は両方とも１５４〜２８８個である。
【請求項２】
前記Ｚ１は（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基の５〜９個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｚ１は（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｚ１は（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４の９０〜９８位の５〜９個のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｚ１は（ｉ）配列番号１１または（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸残基９０〜９８からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｙは（ｉ）配列番号１１の９９〜１１３位または（ｉｉ）配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基の１０個またはそれ以上の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｙは、配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５８〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１５３〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１４３〜１６２位のアミノ酸残基、配列番号１４の１３３〜１６２位のアミノ酸残基、または配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列である、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｚ２は（ｉ）配列番号１２の１１１〜１４７位または（ｉｉ）配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基４〜３７個の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｚ２は（ｉ）配列番号１２の１１１〜１４７位または（ｉｉ）配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基６〜３０個の連続アミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸の総数は両方とも９０〜１２０個または両方とも１０５〜１１５個であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記Ｚ４は配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基９０個またはそれ以上、または１００個またはそれ以上の連続アミノ酸残基であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記Ｚ４は配列番号１３の２２１〜３２７位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記Ｚ１は配列番号１１の９４〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記Ｚ１は配列番号１１の９０〜９８位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記Ｙは配列番号１１の１０９〜１１３位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記Ｙは配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１４位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記Ｙは少なくとも配列番号１１の９９〜１１３位のアミノ酸残基部分を含むアミノ酸配列であり、前記ｐは０であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記Ｚ３は配列番号１３の１５０〜２２０位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記Ｚ３は配列番号１３の１１５〜２２０位のアミノ酸残基の７１〜１０６個の連続したアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０９個であることを特徴とする、請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記Ｚ２は配列番号１２の１１１〜１１６位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり、Ｚ３は配列番号１３の１１８〜２２０位のアミノ酸残基のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記Ｚ１は配列番号１４の９４〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記Ｚ１は配列番号１４の９０〜９８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記Ｙは配列番号１４の１５８〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記Ｙは配列番号１４の１３３〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記Ｙは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２８に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１６６位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１６８位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２７に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記Ｙは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であり、ｐは０であることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１９９位のアミノ酸残基の部分を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記Ｙは配列番号１４の９９〜１６２位のアミノ酸残基の２０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、３０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、４０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、５０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上、または６０個の連続したアミノ酸残基またはそれ以上のアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項２５に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
前記Ｚ２は配列番号１４の１６３〜１７０位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
前記Ｚ３は配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３３に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
前記Ｚ３は配列番号１３の１２１〜２２０位のアミノ酸残基の７１〜１００個の連続したアミノ酸残基を含むアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記Ｚ２およびＺ３のアミノ酸残基の総数は１０８個であることを特徴とする、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６、配列番号２６および配列番号２７よりなる群から選ばれたヌクレオチド配列によってコードされることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２８および配列番号２９よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドは配列番号１８のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドは配列番号２２のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドは配列番号２３のアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１のポリペプチドおよび生物学的活性を含むキメラポリペプチドにおいて、前記生物学的活性分子は請求項１のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し、前記生物学的活性分子はその生物学的活性分子の天然型の循環半減期に比べて増加した循環半減期を示すことを特徴とする、キメラポリペプチド。
【請求項４５】
前記生物学的活性分子は可溶性タンパク質であることを特徴とする、請求項４４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４６】
前記生物学的活性分子はホルモン、サイトカイン、成長因子、共刺激分子、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、成長因子受容体、または短ペプチドであることを特徴とする、請求項４５に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４７】
前記生物学的活性分子はＥＰＯまたはその変異体／断片であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４８】
前記生物学的活性分子はｐ４０、ＴＮＦ受容体またはその変異体／断片であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４９】
前記生物学的活性分子はＡｓｎ３０３Ｇｌｎ置換を含むｐ４０変異体であることを特徴とする、請求項４８に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５０】
前記生物学的活性分子はＧ−ＣＳＦまたはその変異体／断片であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５１】
前記生物学的活性分子はＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ヒト成長ホルモン、ＢＭＰ−１(bone morphogenetic protein-1)、インターフェロンα、ＩＬ−１０、ＦＳＨ、血液因子ＶＩＩ、ＣＴＬＡ４、ＩＦＮ−β、ＰＤ−１、ＩＬ−１０Ｒ、ＣＸＣＬ−１１、ＴＧＦ−β受容体、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１７Ｒ、ＧＬＰ−１、ＢＴＣ、ＯＰＧ、ＲＡＮＫまたはそれらの変異体／断片であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５２】
前記生物学的活性分子は分泌タンパク質であることを特徴とする、請求項４４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５３】
前記生物学的活性分子は分泌タンパク質の成熟形態(mature form)であることを特徴とする、請求項５２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５４】
前記生物学的活性分子は抗体のＦａｂ領域であることを特徴とする、請求項４６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５５】
前記ポリペプチドおよび前記生物学的活性分子はリンカーを介して互いに連結されたことを特徴とする、請求項４４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５６】
前記リンカーはアルブミンリンカーまたは合成リンカーであることを特徴とする、請求項５５に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５７】
前記リンカー分子はアルブミンリンカーであることを特徴とする、請求項５６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５８】
前記アルブミンリンカーは配列番号２５のアミノ酸配列３２１〜３２３、３１８〜３２５、３１６〜３２８、３１３〜３３０、３１１〜３３３、または３０６〜３３８を含むことを特徴とする、請求項５７に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５９】
前記合成リンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒ残基からなる１０〜２０個のアミノ酸残基のペプチドであることを特徴とする、請求項５６に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６０】
前記Ｇｌｙ−ＳｅｒリンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号３２）であることを特徴とする、請求項５９に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６１】
（ｉ）哺乳類宿主細胞に、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を導入する段階と、（ｉｉ）成長培地でポリペプチドが発現できる条件の下で細胞を成長させる段階と、（ｉｉｉ）発現されたポリペプチドを収得する段階とを含む、請求項１によるポリペプチドの生産方法。
【請求項６２】
前記哺乳類宿主細胞はＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢＨＫ細胞であることを特徴とする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項４４、４８、または４９または９４のいずれか１項によるキメラポリペプチドの治療学的有効量を投与することを含む、（ｉ）自己免疫疾患症状の軽減、予防または治療、（ｉｉ）移植拒否反応の抑制、または（ｉｉｉ）内毒素により誘導されたショックの治療または予防方法。
【請求項６４】
前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺回路を介して投与されることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
請求項４４、４８、または４９または９４のいずれか１項によるキメラポリペプチドの治療学的有効量を投与することを含む、リウマチ性関節炎(rheumatoid arthritis)、強直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、炎症性腸疾患(inflammatory bowel disease)、多発性硬化症(multiple sclerosis)、乾癬(psoriasis)、アトピー(atopy)、骨関節炎(osteoarthritis)、または骨粗しょう症(osteoporosis)の症状を（ｉ）治療、（ｉｉ）予防または（ｉｉｉ）軽減させる方法。
【請求項６６】
前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺回路を介して投与されることを特徴とする、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
骨髄移植後の好中球減少骨髄異常(neutropenia myelosuppression)、急性白血病(acute leukemia)、再生不良性貧血(aplastic anemia)、骨髄異形成症候群(myelodysplastic syndrome)、重症慢性好中球減少症(severe chronic neutropenias)、または移植のための末梢血液前駆細胞の可動化(mobilization of peripheral blood progenitor cells)の症状を（ｉ）治療、（ｉｉ）予防または（ｉｉｉ）軽減させる方法。
【請求項６８】
前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺回路を介して投与されることを特徴とする、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項４４または４７のキメラポリペプチドの治療学的有効量を投与することを含む、哺乳類のヘマトクリット水準の（ｉ）増加または（ｉｉ）維持方法。
【請求項７０】
前記キメラポリペプチドは静脈内、皮下、経口、口腔、舌下、鼻、非経口、直腸、膣または肺回路を介して投与されることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記キメラポリペプチドは皮下または静脈に投与されることを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
請求項４４のキメラポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項７３】
前記キメラポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２８および配列番号２９よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項７２に記載の核酸分子。
【請求項７４】
前記核酸分子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、配列番号２６および配列番号２７よりなる群から選ばれるいずれか一つであることを特徴とする、請求項７３に記載の核酸分子。
【請求項７５】
前記核酸分子はシグナル配列またはリーダー配列をさらに含むことを特徴とする、請求項７２〜７４のいずれか１項に記載の核酸分子。
【請求項７６】
前記シグナル配列はｔＰＡシグナル配列であることを特徴とする、請求項７５に記載の核酸分子。
【請求項７７】
請求項７２による核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７８】
前記発現ベクターは、ｐＡＤ１１のＥＰＯ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＳＣＦ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１1 ｐ４０ＮＯ３０３Ｑ−ｈＦｃ−１、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤＤ１１ Ｇ−ＳＣＦ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−６、ｐＡＤ１１ ＥＰＯ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ Ｇ−ＣＳＦ−ｈＦｃ−５、ｐＡＤ１１ ｐ４０Ｎ３０３Ｑ−ｈＦｃ−５およびｐＡＤ１１ ＴＮＦＲ−ｈＦｃ−５よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項７７に記載の発現ベクター。
【請求項７９】
請求項７７の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８０】
請求項７９の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項８１】
必要とする哺乳類に請求項７２による核酸を投与する段階を含む、哺乳類に生物学的活性分子を伝達する方法。
【請求項８２】
前記生物学的活性分子は免疫グロブリン群に属しないことを特徴とする、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
前記ポリペプチドは、抗体の可変領域であるＶＨおよびＶＬが欠如していることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
Ｎ末端でＣ末端方向にヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインよりなるＦｃドメインを含むポリペプチドにおいて、前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＤ部位またはヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含むが、そのＣＨ２ドメインのＮ末端４〜３７個のアミノ酸残基はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインまたはヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端領域の対応するアミノ酸残基を含み、前記ＣＨ３ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４ ＣＨ３ドメインのアミノ酸残基部分を含む、ポリペプチド。
【請求項８５】
前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＧ１ヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含むが、そのＣＨ２ドメインのＮ末端の４〜３７個のアミノ酸残基はヒトＩｇＧ２ ＣＨ２ドメインのＮ末端の対応するアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
前記ヒンジ領域は少なくともヒトＩｇＤヒンジ領域のアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ２ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩＧＧ４ ＣＨ２ドメインのアミノ酸残基部分を含むが、そのＣＨ２ドメインのＮ末端の４〜３７個のアミノ酸残基はヒトＩｇＤ ＣＨ２ドメインのＮ末端の対応するアミノ酸残基を含むことを特徴とする、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
前記ポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含み、前記ＣＨ１ドメインは少なくともヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ１ドメインは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合していることを特徴とする、請求項８５に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
前記ポリペプチドはＣＨ１ドメインをさらに含み、前記ＣＨ１ドメインは少なくともヒトＩｇＤ ＣＨ１ドメインのアミノ酸残基部分を含み、前記ＣＨ１ドメインは前記ヒンジ領域のＮ末端に結合していることを特徴とする、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
請求項８４のポリペプチドを含むキメラポリペプチドおよび生物学的活性分子において、前記生物学的活性分子は請求項８４のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合し、前記生物学的活性分子は前記生物学的活性分子のその天然型の循環半減期に比べて増加した循環半減期を示す、キメラポリペプチド。
【請求項９０】
前記ポリペプチドは配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３、配列番号２８および配列番号２９よりなる群から選ばれたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項８４に記載のポリペプチド。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【公表番号】特表２０１０−５３１１３４（Ｐ２０１０−５３１１３４Ａ）
【公表日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１０２２３（Ｐ２０１０−５１０２２３）
【出願日】平成２０年５月３０日（２００８．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００３０６０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４７１４３
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５０９３１２６５１）ポステク アカデミー−インダストリー ファウンデイション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＰＯＳＴＥＣＨ ＡＣＡＤＥＭＹ−ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｐｏｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰＯＳＴＥＣＨ），Ｓａｎ ３１，Ｈｙｏｊａ−ｄｏｎｇ，Ｐｏｈａｎｇ，Ｋｙｕｎｇ−ｂｕｋ ７９０−７８４，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【出願人】（５０６１２２４６４）ジェネクシン カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月２４日（２０１０．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月３０日（２００８．５．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００３０６０
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１４７１４３
【国際公開日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【出願人】（５０９３１２６５１）ポステク アカデミー−インダストリー ファウンデイション (1)
【氏名又は名称原語表記】ＰＯＳＴＥＣＨ ＡＣＡＤＥＭＹ−ＩＮＤＵＳＴＲＹ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】Ｐｏｈａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰＯＳＴＥＣＨ），Ｓａｎ ３１，Ｈｙｏｊａ−ｄｏｎｇ，Ｐｏｈａｎｇ，Ｋｙｕｎｇ−ｂｕｋ ７９０−７８４，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
【出願人】（５０６１２２４６４）ジェネクシン カンパニー リミテッド (1)
【Ｆターム（参考）】
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