免疫応答を誘発する天然痘ＤＮＡワクチンおよびその中の抗原
本発明は、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を生じさせることができるＤＮＡワクチンに関するものであり、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、ＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドとを含む。また、本発明は、中和抗体応答を含む、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳動物の組織に該ＤＮＡワクチンを注射する工程を含む方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６１／０５６，６８７号（２００８年５月２８日出願）および米国仮特許出願第６１／１２１，０５４号（２００８年１２月９日出願）の恩典を主張し、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府により支援された研究に関する声明
米国政府は、本発明における一括払いライセンスを有し、限られた状況において、国防省により与えられている助成金番号ＨＤＴＲＡ１-０７-Ｃ-０１０４の条件によって規定されているように、適当な条件で他の者に使用許諾するように特許権者に要求する権利を有する。
【０００３】
本発明は、コンセンサス天然痘抗原、そのような抗原をコードする核酸コンストラクト、および天然痘ウイルスに対する免疫応答を生じさせるためにそれから作製されワクチン、ならびに天然痘ウイルスから哺乳動物を防御するためにこれらの製品を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ここ四半世紀の大半の間、世間的関心または科学的関心が、天然痘または天然痘ワクチン接種に関する問題に向けられることはほとんどなかったが、昨今の生物テロに関する懸念のために、故意の放出による天然痘発生の潜在的脅威が現実的な懸念となっている。天然痘が第一選択のテロ兵器になる要因はいくつかある。天然痘は大量に製造することができ、保存と輸送の間は安定であり、曝露された非ワクチン接種者での死亡率が３０％のエアロゾルとして製造することができる。１０〜２０またはそれより多くの症例が、１人の感染者が起源となることで起こり得るので、天然痘は非常に感染性が高い。したがって、テロ攻撃によって天然痘が放出された場合、多くの米国人が感染、疾患、および死の危険に曝されることになるという大きな懸念がある。
【０００５】
限定的に使用可能な市販認可された天然痘ワクチンは、確立されたドライバックス（Ｄｒｙｖａｘ）ワクチンとアカンビス（Ａｃａｍｂｉｓ）ワクチンである。このワイス（Ｗｙｅｔｈ）社のワクチンは、仔ウシリンパ液に由来する生ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）の凍結乾燥製剤である。ワイス社は、一般市民への天然痘ワクチン販売を１９８３年に中止した。アカンビスワクチンは、今なおヒトでの重大な副作用を伴う生きた組織培養物に適応したワクチンストックである。過去に、ドライバックスに伴うリスクに関する懸念があった。最近の臨床試験での有害事象によって、こうした懸念は高まっている。重大な懸念は、かなりの数の免疫不全者（ＨＩＶ感染者）や１９７０年に存在していたよりもはるかに多くの高齢者がいるということである。さらに、妊婦、静注薬物使用者、移植を受けた人、および北米で生活する免疫抑制剤の使用者は潜在的なワクチン受容者であり、もとのドライバックスや最近のアカンビスの生ワクチン戦略による危険性がみな高い。北米では、許容できない数の人が重篤な合併症で入院するおそれがあるという懸念が重要な意味を持っている。ワクチンだけが原因で、または生物テロの場合、天然痘の使用が原因で、多くの人が死亡することがあるが、ワクチンに関連する健康への懸念のために、配備の遅れまたは服薬不履行が起こり得る。最近の天然痘ワクチン接種プログラムは生物テロ事象からの防御を意図しているが、ＶＡＣＶ誘導性免疫を持つ人の数が減少しているので、天然のポックスウイルス疾患についても懸念が高まっている。
【０００６】
ＡＩＤＳ患者のサイトメガロウイルス性網膜炎治療用の承認薬であるシドフォビルは、ほとんど全てのＤＮＡウイルスに対する幅広い活性を有する。最近、シドフォビルは、天然痘やサル痘（ＭＰＸＶ）を含むいくつかのポックスウイルスに対するマウスでのインビトロ活性とインビボ活性が証明された。シドフォビルの単回投与は、曝露されてから数日以内に薬物治療を開始すれば、ワクシニアまたは牛痘のいずれかによる致死的呼吸器感染からマウスを防御するのに極めて有効であることを示した。
【０００７】
それでもやはり、現在の治療には限界がある。１９６０年代に発生したよりも著しく高い割合の合併症に対処するために現在備蓄されているワクチンを使用するのは、効果がない可能性がある。なぜなら、需要が満たされないことや、最近の天然痘ウイルスの進化のために有効性が低下することがあり得るからである。免疫不全の人や健康が衰えた人の場合、前述の安全性への懸念もある。ＤＮＡベースのワクチンの実現可能性は、ワクチンへの潜在的基盤になると考えられているが、ヒトで成功することがまだ証明されていない。さらに、天然痘ウイルスは、２００を超える遺伝子をコードし、かつ各々それ自身に固有の膜糖タンパク質と異なる侵入要件とを有する、成熟ビリオン（ＭＶ）とエンベロープビリオン（ＥＶ）という２つの感染形態を有する極めて複雑なＤＮＡウイルスであるので、有効なＤＮＡワクチンを開発するための候補抗原が難しい。
【０００８】
現在の天然痘ワクチンの安全かつ有効な代替物が依然として必要とされている。さらに、十分に許容され、広範な免疫防御を提供し、かつ生物テロの脅威に応えて時宜を得た方法で大規模に製造することができる天然痘ワクチンが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、天然痘ウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を生じさせることができるＤＮＡワクチンを含む。ＤＮＡワクチンは、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドとを含む。好ましくは、ＤＮＡワクチンは、Ａ４Ｌ抗原を発現することができるプラスミドをさらに含む。本発明の別の態様は、中和抗体応答を含む、天然痘ウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳動物の組織に、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、Ａ４Ｌを発現することができるＤＮＡプラスミドとを含むＤＮＡワクチンを注射する工程を含む方法に関する。好ましくは、これらの方法は、電気穿孔量の電気エネルギーを用いて該組織を電気穿孔する工程をさらに含む。
【００１０】
本発明の多くの目的および利点は、添付の図面を参照することにより、当業者によってより良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】多くの天然痘プラスミドに基づく製造に関する表とそれらの物理化学特性のまとめを示す。
【図２】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＡ４Ｌ（配列番号１に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＡ４Ｌ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００１を示す。
【図３】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＡ２７Ｌ（配列番号３に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＡ２７Ｌ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００２を示す。
【図４】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＢ５Ｒ（配列番号５に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＢ５Ｒ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００３を示す。
【図５】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＡ３３Ｒ（配列番号７に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＡ３３Ｒ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００４を示す。
【図６】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＡ５６Ｒ（配列番号９に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＡ５６Ｒ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００５を示す。
【図７】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＦ９Ｌ（配列番号１１に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＦ９Ｌ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００６を示す。
【図８】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＨ３Ｌ（配列番号１３に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＨ３Ｌ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００７を示す。
【図９】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＬ１Ｒ（配列番号１５に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＬ１Ｒ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００８を示す。
【図１０】ウサギでの予備的研究における事象の順序を示す時系列を示す。
【図１１】３つの異なる群に由来するウサギでのＢ５Ｒ抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図１２】３つの異なる群に由来するウサギでのＨ３Ｌ抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図１３】３つの異なる群に由来するウサギでのＡ２７Ｌ抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図１４】３つの異なる群に由来するウサギでのＬ１Ｒ抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図１５】カニクイザル（非ヒト霊長類）での予備的研究における事象の順序を示す時系列を示す。
【図１６】３つの霊長類の群についてのＥＬＩＳｐｏｔの結果を示す棒グラフを示す。
【図１７】ウサギでの皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかへの抗原送達を比較する研究における事象の順序を示す時系列を示す。
【図１８】Ａ群からＪ群の各々１つの群のウサギに投与された複数のプラスミドの電気穿孔条件と送達条件を示す表を示す。
【図１９】様々なＩＭ条件またはＩＤ条件の下での抗体力価（ＨＡ抗原）を示す棒グラフを示す。
【図２０】様々なＩＭ条件またはＩＤ条件の下での抗体力価（Ｂ５Ｒ抗原）を示す棒グラフを示す。
【図２１】様々なＩＭ条件またはＩＤ条件の下での抗体力価（Ａ２７Ｌ抗原）を示す棒グラフを示す。
【図２２】ウサギのＩＭワクチン接種またはＩＤワクチン接種のスケジュールを示す時系列を示す。
【図２３】Ａ群からＪ群の各々１つの群のウサギに投与された複数のプラスミドの電気穿孔条件と送達条件を示す表を示す。
【図２４】様々な群のウサギでのＡ２７Ｌ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２５】様々な群のウサギでのＢ５Ｒ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２６】様々な群のウサギでのＡ４Ｌ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２７】様々な群のウサギでのＨ３Ｌ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２８】様々な群のウサギでのＡ３３Ｒ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２９】様々な群のウサギでのＬ１Ｒ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図３０】４２日目での４つのプラスミド組合せについてのＡ２７Ｌ抗原に対する終点ＥＬＩＳＡ曲線を示す線グラフを示す。
【図３１】４２日目での８つのプラスミド組合せについてのＡ２７Ｌ抗原に対する終点ＥＬＩＳＡ曲線を示す線グラフを示す。
【図３２】８４日目での４つのプラスミド組合せについてのＡ２７Ｌ抗原に対する終点ＥＬＩＳＡ曲線を示す線グラフを示す。
【図３３】８４日目での８つのプラスミド組合せについてのＡ２７Ｌ抗原に対する終点ＥＬＩＳＡ曲線を示す線グラフを示す。
【図３４】各ワクチン接種についてのＩＤ送達およびＩＭ送達後の抗体応答および細胞性応答の増強。０、２８、および５６日目に、カニクイザルにワクチン接種した。図３４ａは、ｐＶＡＸ１対照群と比較した各抗原についての抗体応答を示す棒グラフを示す。図３４ｂは、各ワクチン接種についてのＩＤ送達およびＩＭ送達後の細胞性応答を示す棒グラフを示す（各ワクチン接種（０、２８、および５６日目）由来の個々の免疫付与されたサルからＰＢＭＣを単離し、プールした。各抗原についてのペプチドプールでＰＢＭＣを刺激した後、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行なった）。
【図３５−１】曝露後のワクチン接種を受けたサルにおけるウイルス血症のレベルを示すグラフを示す。血液１ｍｌ当たりのサル痘ウイルスゲノムの数を、定量的ＴａｑＭａｎ ３'-マイナーグルーブバインダーＰＣＲで測定した。検出下限は、５０００ゲノム／ｍｌ血液であった。平均値±標準誤差を示す。
【図３５−２】示されるように、１群につきサル１匹で、手と胴体の病変が示された写真を示す。
【図３５−３】サル痘ウイルスを静脈内曝露した後の痘痕病変の発症を示すための病変総数を示す棒グラフを示す。
【図３６】ワクチン接種を受けたサルにおける抗ＶＡＣＶ結合抗体の曝露前と曝露後の終点力価を示すグラフを示す。終点力価は、陽性反応性が陰性対照血清の平均光学密度＋３標準偏差よりも大きい最大血清希釈の逆数として表す。Ｖはワクチンを接種した日を示す。Ｃは曝露した日を示す。
【図３７】サル痘ウイルス曝露前後の中和抗体応答を示すグラフを示す。各処置群のＰＲＮＴ５０中和抗体力価が示されている。Ｖはワクチンを接種した日を示す。Ｃは曝露した日を示す。
【図３８】ＶＡＣＶ中和抗体力価と痘痕病変の最大数のスピアマン順位相関を示すグラフを示す。
【図３９】免疫付与後の抗原特異的Ｔ細胞機能を示す棒グラフを示す。３回目の免疫付与をしてから２週間後に単離されたＰＢＭＣを、インビトロで、Ａ２７またはＢ５の全ペプチドプール混合物で５時間刺激した。ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ-２の細胞内産生とＣＤ１０７ａによる脱顆粒化について細胞を染色した。ＣＤ４＋（図３９ａ）Ｔ細胞とＣＤ８＋（図３９ｂ）Ｔ細胞について機能的表現型を評価した。積み重ね表示棒グラフは、各々の免疫付与群についてのＡ２７（灰色）とＢ５（黒色）に対する全ての機能的応答の平均の大きさを示す。
【図４０】ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能を示す棒グラフを示す。３回目の免疫付与をしてから４週間後に単離された新鮮ＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、インビトロで５日間、抗原特異的ペプチドで刺激して、抗原特異的ＣＤ４＋（図４０ａ）Ｔ細胞とＣＤ８＋（図４０ｂ）Ｔ細胞の増殖能を測定した。結果は、積み重ね表示の群平均応答±標準誤差として示す。免疫前試料でのバックグラウンド応答が高かったので、Ａ４Ｌ応答は報告しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下の省略された、または短縮された、定義は、本発明の好ましい実施形態の理解を助けるために提供される。本明細書で提供される省略された定義は、決して網羅的なものではなく、また、当該分野で理解されるような定義または辞書的な意味と矛盾するものでもない。省略された定義は、当技術分野で公知の定義を補足するまたはより明確に定義するために本明細書で提供される。
【００１３】
定義
本明細書で使用する場合、「核酸コンストラクト」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列、または「核酸配列をコードする」は、核酸分子が投与される個体の細胞における発現を導くことができるプロモーターやポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに機能的に連結される開始シグナルおよび終結シグナルを含み得る。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「発現可能形態」という用語は、個体の細胞に存在するときにコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結される必要な調節エレメントを含有する核酸コンストラクトを指す。
【００１５】
「定電流」という用語は、組織、または該組織を規定する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間中に受容するまたは経験する電流を定義するために本明細書で使用される。電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達され、本明細書に記載のプラスミドおよびワクチンとともに使用されることが企図される。この電流は、電気パルスの寿命期間中、該組織に定電流量で留まるが、それは、本明細書で提供される電気穿孔装置が、好ましくは瞬間的フィードバックを有する、フィードバック素子を有するからである。フィードバック素子は、パルスの持続期間中の組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を増大させる）ことができるので、同組織中の電流は、電気パルスの間ずっと（約マイクロ秒）、およびパルス毎に、一定であり続ける。いくつかの実施形態では、フィードバック素子は、制御器を含む。
【００１６】
「フィードバック」または「電流フィードバック」という用語は互換的に使用されており、提供される電気穿孔装置の活発な応答を意味するが、これは、電極間の組織の電流を測定することと、電流を一定レベルで維持するために、ＥＰ装置が送達するエネルギー出力を適宜変化させることとを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処理を開始する前に、ユーザが予め設定する。電気穿孔装置の中の電気回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニターし、そのモニターされた電流（または組織中の電流）を予め設定された電流と比較し、連続的にエネルギー出力の調整を行なって、モニターされた電流を予め設定されたレベルで維持することができるように、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えば、制御器によって達成されることが好ましい。いくつかの実施形態では、フィードバックループは瞬間的なものであるが、それは、フィードバックループがアナログ閉ループフィードバックであるからである。
【００１７】
本明細書で互換的に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「動電増強」（「ＥＰ」）という用語は、膜貫通電界パルスを用いて、生体膜に微視的通路（孔）を導入することを指す。これらの通路が存在することにより、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および／または水などの生体分子が細胞膜の一方側から他方側へと通過することができる。
【００１８】
「分散電流」は、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを定義するために本明細書で使用されており、これらのパターンは、電気穿孔される任意の組織領域に対する電気穿孔関連の熱応力の発生を最小限に抑えるか、または好ましくは消失させる。
【００１９】
本明細書で使用される「フィードバック機構」という用語は、ソフトウェアまたはハードウェア（もしくはファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスであって、（エネルギーパルスの送達前、送達中、および／または送達後の）所望の組織の電気抵抗を受容し、それを現在値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーパルスを調整して、予め設定された値を達成するプロセスを指す。「電気抵抗」という用語は、フィードバック機構を論じるときに本明細書で使用されており、オームの法則によって電流値に変換することができるので、予め設定された電流と比較することができる。好ましい実施形態では、「フィードバック機構」は、アナログ閉ループ回路によって実行される。
【００２０】
「アジュバント」という用語は、以下に記載のＤＮＡプラスミドおよびコード核酸配列によってコードされるＶＡＣＶ抗原の抗原性を増強するために本明細書に記載のＤＮＡワクチンに添加される任意の分子を意味するために本明細書で使用される。
【００２１】
「防御免疫応答」という用語は、本明細書で提供されるＤＮＡワクチンによる免疫付与によって生じる、抗体応答と細胞性免疫応答の組合せ、好ましくは、中和抗体応答を意味するために本明細書で使用される。
【００２２】
本発明の好ましい抗原を説明するために互換的に使用される「コンセンサス」または「コンセンサス配列」または「コンセンサス抗原」という用語は、今存在する特定のウイルス分離株に基づいて生成される合成配列を指す。コンセンサスは、所与のどの天然ウイルス分離株よりも、現在広まっているウイルス分離株に遺伝的に近い可能性がある。しかしながら、通常、急性感染期にサンプリングされるウイルスではなく、慢性感染期にサンプリングされるウイルスを用いて全体的な配列決定が行なわれるので、大部分は免れたエピトープに対するコンセンサスワクチン応答を発生させるのは不利な場合がある。この不都合を最小にするために、ワクチン設計の１つの有用な戦略は、早期伝達配列を考慮に入れることである。コンセンサスは、ワクチン株と今広まっているウイルスの配列の相違度を最小にする効果的なアプローチであって、これらのウイルスの「中核を成す」人工配列を作り出することになるアプローチとなる。１つの設計戦略は、アラインメントの位置ごとに最もよく見られるアミノ酸から得られるコンセンサス配列を使用することである。その結果、そのようなコンセンサスは、様々な天然ウイルス分離株に対する広範な免疫応答を誘発することができ、組合せ上の多型はどの天然ウイルスにも見られないはずである。
【００２３】
本発明の一態様は、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を生じさせることができるＤＮＡワクチンを含む。好ましくは、ポックスウイルスは天然痘ウイルスである。ＤＮＡワクチンは、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドとを含む。好ましくは、ＤＮＡワクチンは、Ａ４Ｌ抗原を発現することができるプラスミドをさらに含む。各々の該抗原は、（複数のコード配列を含む）単一のＤＮＡプラスミドによって、または別々のＤＮＡプラスミドによって発現され得る。好ましくは、各々の別々の抗原は、別々のＤＮＡプラスミドによって発現される。ＶＡＣＶ ＭＶ抗原は、Ａ２７Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、またはＬ１Ｒを含み、一方、ＶＡＣＶ ＥＶ抗原は、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、またはＢ５Ｒを含む。好ましくは、各々のＤＮＡプラスミドは、該抗原をコードするコンセンサスＤＮＡ配列を含む。ＶＡＣＶ ＭＶ抗原をコードするコンセンサスＤＮＡ配列は、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１５（Ｌ１Ｒ）を含む。ＶＡＣＶ ＥＶ抗原をコードするコンセンサスＤＮＡ配列は、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、または配列番号９（Ａ５６Ｒ）を含む。Ａ４ＬをコードするコンセンサスＤＮＡ配列は、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができるＤＮＡプラスミドは、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１６（Ｌ１Ｒ）を含む配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含み、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができるＤＮＡプラスミドは、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、または配列番号１０（Ａ５６Ｒ）を含む配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含み、Ａ４Ｌ抗原を発現することができるＤＮＡプラスミドは、配列番号２の配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含む。好ましくは、ＤＮＡワクチンは、コードＤＮＡ配列、すなわち、配列番号１（Ａ４Ｌ）、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、配列番号９（Ａ５６Ｒ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、および配列番号１５（Ｌ１Ｒ）をそれぞれ含む、複数の別々のＤＮＡプラスミドを含む。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡワクチンは、配列、すなわち、配列番号２（Ａ４Ｌ）、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、配列番号１０（Ａ５６Ｒ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、および配列番号１６（Ｌ１Ｒ）をそれぞれ有するタンパク質をコードするコードＤＮＡ配列を含む、複数の別々のＤＮＡプラスミドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、コンセンサスコード配列は、ヒトコドンに最適化されている。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡプラスミドｐＧＸ４００１、ｐＧＸ４００２、ｐＧＸ４００３、ｐＧＸ４００４、ｐＧＸ４００５、ｐＧＸ４００６、ｐＧＸ４００７、もしくはｐＧＸ４００８、またはそれらの組合せを含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、中和抗体応答を含む、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳動物の組織に、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、Ａ４Ｌを発現することができるＤＮＡプラスミドとを含むＤＮＡワクチンを注射する工程を含む方法に関する。好ましくは、ポックスウイルスは天然痘ウイルスである。好ましい実施形態では、注射する工程は、皮内に注射する工程または筋肉内に注射する工程を含む。防御免疫応答を誘導する方法は、電気穿孔量の電気エネルギーを用いて該組織を電気穿孔する工程をさらに含むことができる。好ましくは、電気穿孔する工程は、該組織に定電流を送達する工程を含む。より好ましくは、電気穿孔する工程は、０．２Ａの電流を送達する工程を含む。いくつかの実施形態では、防御免疫応答を誘導する方法は、該注射する工程を繰り返す工程を含む。好ましい実施形態では、送達する工程は、８つの別々のＤＮＡプラスミドを送達する工程を含む。
【００２６】
本明細書に記載のＤＮＡワクチンは、高いＤＮＡ濃度を有するＤＮＡプラスミド処方物を用いて処方される。高いＤＮＡ濃度は、５ｍｇ／ｍＬ以上、６ｍｇ／ｍＬ以上、７ｍｇ／ｍＬ以上、８ｍｇ／ｍＬ以上、９ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ以上、１１ｍｇ／ｍＬ以上、１２ｍｇ／ｍＬ以上、１３ｍｇ／ｍＬ以上、１４ｍｇ／ｍＬ以上、１５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度であり得る。いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡは、５〜１５ｍｇ／ｍＬ、５〜１４ｍｇ／ｍＬ、５〜１３ｍｇ／ｍＬ、５〜１２ｍｇ／ｍＬ、５〜１１ｍｇ／ｍＬ、５〜１０ｍｇ／ｍＬ、５〜９ｍｇ／ｍＬ、５〜８ｍｇ／ｍＬの濃度、６〜１５ｍｇ／ｍＬ、６〜１４ｍｇ／ｍＬ、６〜１３ｍｇ／ｍＬ、６〜１２ｍｇ／ｍＬ、６〜１１ｍｇ／ｍＬ、６〜１０ｍｇ／ｍＬ、６〜９ｍｇ／ｍＬ、６〜８ｍｇ／ｍＬの濃度、７〜１５ｍｇ／ｍＬ、７〜１４ｍｇ／ｍＬ、７〜１３ｍｇ／ｍＬ、７〜１２ｍｇ／ｍＬ、７〜１１ｍｇ／ｍＬ、７〜１０ｍｇ／ｍＬ、７〜９ｍｇ／ｍＬ、８〜１５ｍｇ／ｍＬ、８〜１４ｍｇ／ｍＬ、８〜１３ｍｇ／ｍＬ、８〜１２ｍｇ／ｍＬ、８〜１１ｍｇ／ｍＬ、８〜１０ｍｇ／ｍＬ、９〜１５ｍｇ／ｍＬ、９〜１４ｍｇ／ｍＬ、９〜１３ｍｇ／ｍＬ、９〜１２ｍｇ／ｍＬ、９〜１１ｍｇ／ｍＬ、１０〜１５ｍｇ／ｍＬ、１０〜１４ｍｇ／ｍＬ、１０〜１３ｍｇ／ｍＬ、１０〜１２ｍｇ／ｍＬ、１１〜１５ｍｇ／ｍＬ、１１〜１４ｍｇ／ｍＬ、１１〜１３ｍｇ／ｍＬ、１２〜１５ｍｇ／ｍＬ、１２〜１４ｍｇ／ｍＬ、または１３〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。ＤＮＡプラスミド濃度が高い処方物を用いてＤＮＡワクチンを処方することにより、各々のＤＮＡプラスミドを高い用量で維持したまま、様々な別々のＤＮＡプラスミドの混合物を１つに混合することができる。いくつかの実施形態では、各々の別々のＤＮＡプラスミドは高用量で存在し、これは、５０μｇを超える、６０μｇを超える、７０μｇを超える、８０μｇを超える、９０μｇを超える、１００μｇを超える、１１０μｇを超える、１２０μｇを超える、１３０μｇを超える、１４０μｇを超える、１５０μｇを超える、１６０μｇを超える、１７０μｇを超える、１８０μｇを超える、１９０μｇを超える、２００μｇを超える、２１０μｇを超える、２２０μｇを超える、２３０μｇを超える、２４０μｇを超える、または２５０μｇを超える用量である。好ましくは、高用量は１２０μｇを超えるものであり、より好ましくは１２５μｇである。好ましい一実施形態では、ＤＮＡワクチンは、１２５μｇの用量で存在するＤＮＡプラスミドを含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンは、アジュバントをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ-ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナルペプチドを欠失し、かつ任意でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＩＬ-１５を含む）からなる群から選択される。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１ｐ、ＩＬ-８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ-セレクチン、Ｐ-セレクチン、Ｅ-セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ-１、ＭａｄＣＡＭ-１、ＬＦＡ-１、ＶＬＡ-１、Ｍａｃ-１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ-１、ＩＣＡＭ-２、ＩＣＡＭ-３、ＣＤ２、ＬＦＡ-３、Ｍ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ-４、突然変異型ＩＬ-１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ-７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ-１、ｐ５５、ＷＳＬ-１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ-３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ-Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ-ｊｕｎ、Ｓｐ-１、Ａｐ-１、Ａｐ-２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ-１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ-Ｒ３、ＴＲＡＩＬ-Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードする遺伝子が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、アジュバントは、ＩＬ-８、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２８、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１ｐ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、もしくはＭＥＣ、またはそれらの組合せから選択され、より好ましくは、アジュバントは、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-２８、またはＲＡＮＴＥＳである。
【００２８】
ポックスウイルスは、ポックスウイルス科由来の巨大複合ウイルスであり、ＶＡＣＶと痘瘡ウイルス（天然痘）とを含む。４つのポックスウイルス属がヒトに感染することが知られており、オルトポックス、パラポックス、ヤタポックス、モラシポックスを含む。オルトポックス：痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、天然痘（撲滅された）；パラポックス：オルフウイルス、偽牛痘ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス；ヤタポックス：タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス；モラシポックス：伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）。他のポックスウイルスとしては、とりわけ、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、サル痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス（Ｔａｔｅｒａ ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ウアシン・ギシュ（Ｕａｓｉｎ Ｇｉｓｈｕ）ウイルス、痘瘡ウイルス、ハタネズミ痘ウイルス（Ｖｏｌｅｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）などのオルトポックスウイルス、アウスディーク（Ａｕｓｄｙｋ）ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘ウイルス、アカシカ痘ウイルス、アザラシ痘ウイルスなどのパラポックスウイルス、ヒツジ痘ウイルス、ヤギ痘ウイルス、塊皮病ウイルスなどのカプリポックスウイルス、豚痘ウイルスなどのスイポックスウイルス、粘液腫ウイルス、線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルス、西洋リス（ｗｅｓｔｅｒｎ ｓｑｕｉｒｒｅｌ）線維腫、多くの種のアビポックスウイルスなどのレポリポックスウイルス、タントポックス（Ｔａｎｔｐｏｘ）ウイルス、ヤバポックスウイルスなどのヤタポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、カンガルー類ポックスウイルス、ワニ類ポックスウイルスなどのモラシポックスウイルスが挙げられる。本明細書に記載のＤＮＡワクチンの天然痘に対する高い交差反応性（広範な防御）に加えて、ポックスウイルス間での同一性が高いために、本発明のＤＮＡワクチンが異なるポックスウイルス間での交差防御も提供すると予想される。
【００２９】
投与経路としては、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼球内、および経口、ならびに局所、経皮、吸入もしくは坐薬によるもの、または粘膜組織へのもの（例えば、膣組織、直腸組織、尿道組織、頬組織、および舌下組織の洗浄によるもの）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路としては、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、および皮下注射が挙げられる。遺伝子コンストラクトは、従来のシリンジ、無針注射装置、「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法を含むが、これらに限定されない、手段で投与してもよい。
【００３０】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を容易にするのに好ましい電気穿孔装置および電気穿孔法の例としては、Ｄｒａｇｈｉａ-Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが挙げられ、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許法１１９条（ｅ）項の下、米国仮特許出願第６０／８５２，１４９号（２００６年１０月１７日出願）および同第６０／９７８，９８２号（２００７年１０月１０日出願）に対する恩典を主張する、同時係属かつ共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（２００７年１０月１７日出願）に提供されているＤＮＡワクチンの送達を容易にするための電気穿孔装置および電気穿孔法も好ましく、これらの文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
以下は、本発明の好ましい実施形態の一例であり、上で考察した特許参考文献においてより詳細に考察されている。電気穿孔装置は、ユーザによって入力された予め設定された電流と同様の定電流を生じさせるエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる。電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネントと電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含む。電気穿孔コンポーネントは、制御器、電流波形発生器、電気抵抗試験器、波形自動記録装置、入力素子、状況報告素子、通信ポート、メモリコンポーネント、電源、および電源スイッチを含む様々な電気穿孔装置素子の１つまたは複数を含み、かつ組み入れることができる。電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の１つの素子として機能することができ、他の素子は、電気穿孔コンポーネントと連通している独立した素子（要素）である。いくつかの実施形態では、電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の２つ以上の素子として機能し、これは、電気穿孔コンポーネントから離れている電気穿孔装置のさらに他の素子と連通することができる。本発明は、１つの電気機械装置または機械装置の部分として存在する電気穿孔装置の素子によって限定されるものではない。なぜなら、これらの素子は、１つの装置または互いに連通する独立した素子として機能することができるからである。電気穿孔コンポーネントは、所望の組織で定電流を生じさせるエネルギーパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、複数の電極をある空間的配置で有する電極アレイを含むが、その場合、電極アセンブリは、電気穿孔コンポーネントからのエネルギーパルスを受容し、電極を通してそれを所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達の間、中性であり、所望の組織中の電気抵抗を測定し、この電気抵抗を電気穿孔コンポーネントに伝達する。フィードバック機構は、測定された電気抵抗を受容し、電気穿孔コンポーネントによって送達されるエネルギーパルスを調整して、定電流を維持することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、複数の電極は、分散形式のエネルギーパルスを送達することができる。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされたシーケンス下にある電極の制御を通じて分散形式のエネルギーパルスを送達することができ、プログラムされたシーケンスは、ユーザによって電気穿孔コンポーネントに入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされたシーケンスは、順々に送達される複数のパルスを含み、その場合、複数のパルスの各々のパルスは、少なくとも２つの活性電極と、電気抵抗を測定する１つの中性電極とによって送達され、複数のパルスの次のパルスは、少なくとも２つの活性電極のうちの異なる電極と、電気抵抗を測定する１つの中性電極とによって送達される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって行なわれる。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行なわれる。好ましくは、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に起こるが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは瞬間的なものである（すなわち、応答時間を決定するための利用可能な技術で測定した場合に実質的に瞬間的なものである）。いくつかの実施形態では、中性電極は、所望の組織中の電気抵抗を測定し、この電気抵抗をフィードバック機構に伝達し、このフィードバック機構が電気抵抗に応答し、電気パルスを調整して、予め設定された電流と同様の値で定電流を維持する。いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達の間、連続的かつ瞬間的に定電流を維持する。
【００３４】
薬学的に許容される賦形剤としては、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤のような機能分子を挙げることができるが、これらは公知であり、かつ公に容易に入手可能である。好ましくは、薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントまたはトランスフェクション促進剤である。いくつかの実施形態では、核酸分子、またはＤＮＡプラスミドは、ポリヌクレオチド機能増強剤または遺伝子ワクチン促進剤（もしくはトランスフェクション促進剤）の投与と併せて細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能増強剤は、米国特許出願第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号（１９９４年１月２６日出願）に記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、米国特許出願第０２１，５７９号（１９９４年４月１日出願）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。トランスフェクション促進剤は、核酸分子との混合物として、核酸分子と併せて投与するか、または核酸分子の投与の前もしくは後に、別々に同時に投与することができる。トランスフェクション促進剤の例としては、界面活性剤（例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ））、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリル脂質Ａを含む）、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびに小胞（例えば、スクアレン）およびスクアレンが挙げられるが、ヒアルロン酸も遺伝子コンストラクトと併せて用いて投与してもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンはまた、脂質、ＤＮＡ-リポソーム混合物（例えば、ＷＯ９３２４６４０号参照）としてのリポソーム（レシチンリポソームもしくは当技術分野で公知の他のリポソームを含む）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などのトランスフェクション促進剤、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含み得る。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ-Ｌ-グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。
【００３５】
いくつかの好ましい実施形態では、そのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに増強するタンパク質の遺伝子であるＤＮＡプラスミドは、アジュバントとともに送達される。そのような遺伝子の例は、他のサイトカインおよびリンホカイン、例えば、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ-ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２、ＩＬ-１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＬ-１５（シグナル配列を欠失し、かつ任意でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＩＬ-１５を含む）をコードする遺伝子である。有用であり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１ｐ、ＩＬ-８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ-セレクチン、Ｐ-セレクチン、Ｅ-セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ-１、ＭａｄＣＡＭ-１、ＬＦＡ-１、ＶＬＡ-１、Ｍａｃ-１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ-１、ＩＣＡＭ-２、ＩＣＡＭ-３、ＣＤ２、ＬＦＡ-３、Ｍ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ-４、突然変異型ＩＬ-１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ-７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ-１、ｐ５５、ＷＳＬ-１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ-３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ-Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ-ｊｕｎ、Ｓｐ-１、Ａｐ-１、Ａｐ-２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ-１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ-Ｒ３、ＴＲＡＩＬ-Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３６】
本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１０マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約２００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約３００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約４００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約５００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１マイクログラム〜約１ミリグラム、約１０マイクログラム〜約１ミリグラム、約１００マイクログラム〜約１ミリグラム、約２００マイクログラム〜約１ミリグラム、約３００マイクログラム〜約１ミリグラム、約４００マイクログラム〜約１ミリグラム、約５００マイクログラム〜約１ミリグラム、約１００マイクログラム〜約１ミリグラム、約２００マイクログラム〜約１ミリグラム、約３００マイクログラム〜約１ミリグラム、約４００マイクログラム〜約１ミリグラム、または約５００マイクログラム〜約１ミリグラムのＤＮＡ量を含む。好ましくは、ワクチン中に存在するＤＮＡ量は、約１００マイクログラム〜約１ミリグラムである。
【００３７】
本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、使用すべき投与様式に従って処方される。ＤＮＡプラスミドワクチンが注射可能な組成物である場合、それらは、滅菌されている、および／または発熱物質を含まない、および／または微粒子を含まない。等張処方物が使用されることが好ましい。通常、等張性を得るための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝化生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定化剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤を処方物に添加する。いくつかの実施形態では、長期間にわたって室温または周囲温度で処方物を安定にさせる安定化剤（例えば、ＬＧＳもしくは他のポリカチオンまたはポリアニオン）を処方物に添加する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、コンセンサス天然痘抗原に対する哺乳動物での免疫応答を誘発する方法として、粘膜免疫応答を誘導する方法が挙げられる。そのような方法は、上記のコンセンサス天然痘抗原を含むＤＮＡプラスミドと組み合わせて、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能断片またはそれらの発現可能なコード配列のうちの１つまたは複数を哺乳動物に投与する工程を含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能断片のうちの１つまたは複数を、本明細書で提供されるＤＮＡプラスミド天然痘ワクチンの投与の前、投与と同時、または投与の後に、投与し得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびそれらの機能断片からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードする単離された核酸分子を哺乳動物に投与する。
【実施例】
【００３９】
本発明を以下の実施例でさらに説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、例示のためだけに提示されることが理解されるべきである。上記の考察とこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神と範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用法および条件に適合させるために、本発明の様々な変更および修正を行なうことができる。したがって、本明細書に示され、記載されたものに加えた、本発明の様々な修正が、上述の記載から当業者には明白となるであろう。そのような修正もまた、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【００４０】
好ましくは、本明細書に記載の筋肉または皮膚用のＥＰ装置とともに使用されるＤＮＡ処方物は、皮膚への送達に最適な少ない容量、好ましくは少ない注射容量、好ましくは２５〜２００マイクロリットル（μＬ）中に、高いＤＮＡ濃度、好ましくはマイクログラムから数十ミリグラム量のＤＮＡ、および好ましくはミリグラム量のＤＮＡを含む濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ処方物は、１ｍｇ／ｍＬ以上などの高いＤＮＡ濃度（ｍｇＤＮＡ／処方物の容量）を有する。より好ましくは、ＤＮＡ処方物は、２００μＬの処方物中にグラム量のＤＮＡを、より好ましくは１００μＬの処方物中にグラム量のＤＮＡを提供するＤＮＡ濃度を有する。
【００４１】
本発明のＥＰ装置とともに使用されるＤＮＡプラスミドは、公知の装置および技術の組合せを用いて処方または製造することができるが、好ましくは、共同所有された、同時係属中の米国仮特許出願である、米国特許出願第６０／９３９，７９２号（２００７年５月２３日出願）に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を用いて製造する。いくつかの例では、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で処方することができる。製造技術には、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されているもの（共同所有の特許である米国特許第７，２３８，５２２号（２００７年７月３日発行）に記載されているものを含む）に加えて、当業者によく知られている様々な装置およびプロトコルも含まれるかまたは組み込まれる。本明細書に記載の皮膚用のＥＰ装置および送達技術とともに使用される高濃度のプラスミドは、適度に少ない容量でＩＤ／ＳＣ空間にプラスミドを投与することを可能にし、発現と免疫付与効果とを増強するのに役立つ。それぞれ、米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号という、共同所有の出願および特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
方法
適用可能であり、かつ特定の方法が特定の実施例で別途提供されない場合、以下の方法を以下の実施例に利用する。
【００４３】
ＤＮＡ発現コンストラクトのクローニング。ＶＡＣＶ遺伝子、Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒ（ウェスタンリザーブ株由来）を合成オリゴヌクレオチドから化学合成し、ヒトコドンに最適化し、ＤＮＡ配列の５'末端にコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列とＩｇＥリーダー配列を、ＤＮＡ配列の３'末端にＨＡエピトープタグを含有するように修飾した。各々のこれらの修飾された遺伝子カセットを、従来のクローニング法を用いて、真核生物発現プラスミドである、ＧＥＮＥＡＲＴ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）製のｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。各遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターによって調節される。それぞれ、発現プラスミドｐＧＸ４００１とｐＧＸ４００３を作製するために、Ａ４ＬとＢ５Ｒの合成遺伝子カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｈｏＩ部位にクローニングした。Ａ３３Ｒ（ｐＧＸ４００４）とＡ５６Ｒ（ｐＧＸ４００５）の発現プラスミドを作製するために、合成遺伝子カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位にクローニングした。ｐＧＸ４００７とｐＧＸ４００８は、Ｈ３ＬとＬ１Ｒの合成遺伝子カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位にクローニングすることによって調製した。残りのプラスミドである、ｐＧＸ４００２とｐＧＸ４００６は、Ａ２７ＬとＦ９Ｌの合成遺伝子カセットを、それぞれ、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ制限部位とＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ制限部位にクローニングすることによって作製した。クローニング後、抗原は全て、シークエンシングで確認した。
【００４４】
ワクチン調製および免疫付与。プラスミドを高濃度に製造し、米国特許第７，２３８，５２２号でＨｅｂｅｌらによって記載された製造手順を修正して用いて精製した。この方法により、ワクチンの生物薬剤的送達に適した、内毒素を含まない非常に高いプラスミド濃度のプラスミド処方物（≦１０ＥＵ／ｍｇ）が得られた。プラスミド製剤は全て、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した低分子量ポリ-Ｌ-グルタメート（ＬＧＳ、平均ＭＷ１０，９００）を含む滅菌水を用いて１％重量／重量で処方および調製した。全てのプラスミド（ｐＧＸ４００１〜ｐＧＸ４００８）を組み合わせて、ＩＤ用に０．１ｍＬまたはＩＭ投与用に０．５ｍＬの総容量の、１２５μｇの各プラスミドからなる単一のワクチン製剤を作製した。
【００４５】
ケタミンＨＣＬ（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ）を用いて動物に筋肉内麻酔を施した。ワクチンを各大腿部（１回のワクチン接種につき大腿部当たり１つの注射部位）に投与し、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００装置（ヒト使用に有効な装置；ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）を用いるＥＰと組み合わせて、半膜様筋肉内にＩＤまたはＩＭのいずれかで送達した。注射のすぐ後、０．２Ａの定電流、５２ｍｓのパルス長、パルス間隔１秒の２×２回のパルスを皮内投与に適用し、０．５Ａの定電流、５２ｍｓのパルス長、パルス間隔１秒の３回のパルスを静脈内投与に適用した。０、２８、および５６日目に免疫付与を行ない、免疫付与した日に血清を回収して、抗体応答を測定した。
【００４６】
試料回収とＰＢＭＣ単離。ワクチン接種スケジュール中、２週間おきに、および３回曝露した後ごとに、カニクイザルから採血した。ケタミンＨＣＬ（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ）を用いて動物に筋肉内麻酔を施した。ＥＤＴＡチューブに血液を回収した。標準的なＦｉｃｏｌｌ-Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離で全血からＰＢＭＣを単離し、完全培養培地（１０％熱非働化ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および５５μＭ β-メルカプトエタノールを補充した、２ｍＭ Ｌ-グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁した。
【００４７】
抗原特異的ＥＬＩＳＡ用の抗原の調製。適当な制限酵素部位を含有する遺伝子特異的プライマーを用いてウェスタンリザーブ株のＶＡＣＶから各抗原のオープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅し、原核生物発現ベクターのｐＥｔ２１９ａ（＋）（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）にクローニングした。ｐＥｔ２１ａ（＋）に存在する６×ヒスチジンタグとの融合が可能になるように３'-末端オリゴヌクレオチドを設計した。タンパク質は、標準的なニッケルカラム精製法（Ａｂｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて精製した。
【００４８】
抗原特異的ＥＬＩＳＡ。ＩｇＧ抗体応答を測定するために、ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に、ＰＢＳに希釈した５０ｎｇの精製抗原（Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、またはＬ１Ｒ）をコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡを行なった。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で洗浄し、次に、３％ＢＳＡを補充したＰＢＳで、室温で１時間ブロッキングした。個々のカニクイザルから回収した血清を、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳに希釈し、希釈血清５０μｌとして、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳ-Ｔで洗浄した後、２次抗体のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とインキュベートし、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳに１：１０，０００で希釈した（１００μＬ／ウェル）。ウェルを室温で１時間インキュベートし、洗浄した。製造元の推奨（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従って、ＴＭＢ基質と停止溶液を各ウェルに添加した。
【００４９】
Ｌｕｍｉｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。終点力価は、陰性対照血清の２倍よりも大きい陽性反応性を生じる最大血清希釈の逆数として表す。
【００５０】
ＶＡＣＶ ＥＬＩＳＡ。マイクロタイタープレートに、パラホルムアルデヒド固定し、ショ糖勾配精製したＶＡＣＶ ＷＲ株（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を０．６μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、５％脱脂粉乳を補充したＰＢＳ-Ｔ（ＰＢＳ-ＴＭ）を用いて、３７℃で２時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳ-Ｔで８回洗浄し、サル血清の連続希釈とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを、２次抗体、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＫＰＬ）にコンジュゲートしたヤギ抗サルＩｇＧおよびＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）とともにインキュベートした。１００μＬの１０％ＳＤＳを添加して反応を停止させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４を用いて４０５ｎｍで読み取った。
【００５１】
終点力価は、陰性対照血清の平均光学密度＋３標準偏差よりも大きい陽性反応性を生じる最大血清希釈の逆数として表す。
【００５２】
合成ペプチド。この研究に使用したペプチドは、ＷＲ株のＶＡＣＶのＡ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒのコード領域に由来するものであった。Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒについて、全抗原ペプチドライブラリーを合成した。ペプチドは全て、９アミノ酸（Ａ２７Ｌの場合）、１１アミノ酸（Ａ４Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒの場合）、または６アミノ酸（Ｂ５Ｒの場合）のいずれかだけ重複する１５ｍｅｒであった。Ａ２７ＬライブラリーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより調製された。他のライブラリーは全て、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により調製された。ライブラリーは、ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度の対応するペプチドプールとして調製された。
【００５３】
ＩＦＮ-γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。非ヒト霊長類ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行なった（Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．３４，２６２-２７０（２００５）参照）。ペプチドを含有するウェルから陰性対照ウェル中のスポットの数を差し引くことによって、抗原特異的応答を測定した。結果は、３通りのウェルについて得られた平均値（スポット／１００万個の脾細胞）として示す。
【００５４】
ＰＢＭＣのカルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）コンジュゲーションおよびフローサイトメトリー解析。細胞をペレット化し、ＰＢＳ中の二酢酸カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（ＣＦＤＡ-ＳＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（１：２０００希釈）１ｍｌに再懸濁した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を完全培地で洗浄し、１×１０６細胞／１００μｌの濃度に再懸濁し、全ペプチドプール１００μｌとともに９６ウェル丸底プレート中にプレーティングした。コンカバリンＡ ５μｇ／ｍｌ（陽性）と完全培地（陰性）とを対照として用いた。培養物を５日間インキュベートした。細胞をまず、生細胞／死細胞マーカーである、Ｖｉｖｉｄ色素バイオレットで、３７℃で１０分間染色した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次に、細胞を、抗ヒトＣＤ３-ＡＰＣ Ｃｙ７（クローンＳＰ３４-２）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と抗ヒトＣＤ４-ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５（クローンＬ２００）と抗ヒトＣＤ８-ＡＰＣ（クローンＳＫ１）を用いて４℃で１時間染色した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いてデータを回収した。フローサイトメトリーデータは、ＣＤ３＋リンパ球に対してゲートをかけて、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて解析した。試料１つにつき３万〜５万個のＣＤ３＋リンパ球を回収した。培地差し引き後のデータを示す。免疫前試料中でのバックグラウンド増殖が高かったので、Ａ４に対する増殖応答は評価しなかった。
【００５５】
細胞内サイトカイン染色。抗体試薬：直接コンジュゲート抗体は以下から入手した：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）：ＩＬ-２（ＰＥ）、ＣＤ３（ＡＰＣ Ｃｙ７）、ＣＤ８（ＡＰＣ）、ＩＦＮ-γ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００）、ＴＮＦ-α（ＰＥ Ｃｙ７）、ＣＤ９５（ＰＥ Ｃｙ５）、およびＣＤ４（ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５）。ＣＤ２８（ＥＣＤ）はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから入手した。
【００５６】
細胞の刺激と染色。ＰＢＭＣを、完全ＲＰＭＩ中で１×１０６細胞／１００μｌに再懸濁し、１：２００希釈の刺激ペプチドＡ２７ＬおよびＢ５Ｒ １００μｌとともに９６ウェルプレート中にプレーティングした。刺激しない陽性対照（ブドウ球菌腸毒素Ｂ、１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を各アッセイに含めた。細胞を３７℃で５時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄（ＰＢＳ）し、表面抗体で染色した。細胞を洗浄し、説明書に従って、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて固定した。固定後、細胞をこのｐｅｒｍ緩衝液中で２回洗浄し、細胞内マーカーに対する抗体で染色した。染色後、細胞を洗浄し、固定し（１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ）、解析するまで４℃で保存した。
【００５７】
フローサイトメトリー。細胞を改良型のＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で解析した。試料１つにつき５万回のＣＤ３＋事象を回収した。ＦｌｏｗＪｏバージョン８．６．３（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を用いてデータ解析を行なった。最初のゲーティングでは、前方散乱面積（ＦＳＣ-Ａ）対高さ（ＦＳＣ-Ｈ）プロットを用いて、ダブレットを取り除いた。これらの事象に、ＦＳＣ-Ａ対ＳＳＣプロットにより、リンパ球ゲートをかけた。生きたＴ細胞は、生／死対ＣＤ３＋プロットにより同定した。この後、事象に、ＣＤ８＋事象対ＩＦＮ-γとＣＤ４-事象対ＩＦＮ-γとで順次ゲートをかけて、下方調節を明らかにした。ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定した後、最適に分離する組合せを用いるそれぞれの関数の各々についてゲートを作成した。各々の関数についてのゲートを作成した後、本発明者らは、ブーリアンゲートプラットフォームを用いて、４つの関数を試験したときの１５の応答パターンに等しい、可能な組合せの完全なアレイを作成した。データはバックグラウンド補正後に報告される。免疫前応答が高かったので、１匹のｐＶＡＸ１動物（＃４３８４）についての応答は解析に含めなかった。
【００５８】
ウイルスの繁殖と調製。ザイール株、Ｖ７９-Ｉ-００５（サル痘ウイルスマスターシードＮＲ-５２３）のサル痘ウイルスは、米国立衛生研究所の生体防御および新興感染症研究資源レポジトリ（Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から入手した。このザイール株は、もともと、１９７９年にザイール出身の致死感染を受けたヒトから入手された（米国疾病対策予防センターにある天然痘および他のポックスウイルス感染症に関するＷＨＯ指定研究協力センター（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌｐｏｘ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｐｏｘｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）により単離された）。このウイルスをニワトリ胚線維芽細胞内で継代することによって摂取材料を調製し、標準的なショ糖勾配による沈降によって精製した。これをニワトリ胚線維芽細胞内で繁殖させて、精製した。
【００５９】
サル痘ウイルス曝露。最後のワクチン接種から４週間後（９１日目）に、本明細書に記載の通りにカニクイザルに麻酔をかけ、２×１０７ＰＦＵのサル痘ウイルスＮＲ-５２３を、２３ゲージのバタフライ針を用いて伏在静脈に筋肉内注入した。実際に送達された用量を確認するために、標準的なプラークアッセイ技術を用いて、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に対して、曝露用摂取材料の事後力価測定（ｂａｃｋ-ｔｉｔｔｅｒ）を行なった。
【００６０】
サル痘ウイルスゲノム検出のためのリアルタイムＰＣＲ。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて凍結血液試料からＤＮＡを抽出した。定量的汎オルトポックスＨＡ ＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）についての製造元の指示書に従ってリアルタイムＰＣＲを準備したが、これは、ヘマグルチニン遺伝子増幅用の以下のプライマー：ＯＰＨＡ Ｆ８９：５'-ＡＴＧＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＡＣＧＴＡＧＴＡＧ-３'（配列番号１７）と、ＯＰＨＡ Ｒ２１９：５'-ＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＡＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧ-３'（配列番号１８）とからなっていた。ＴａｑＭａｎプローブ（ＯＰＨＡ Ｐ１４３Ｓ-ＭＧＢ：６ＦＡＭ ＡＧＴＧＣＴＴＧＧＴＡＴＡＡＧＧＡＧ ＭＧＢＮＦＱ（配列番号１９および配列番号２０））は５'末端でＦＡＭ標識されており、非蛍光性クエンチャーを含んでいた。ウイルスゲノムのコピーを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行なった。
【００６１】
ＶＡＣＶ中和抗体の測定。サル由来の血清を試験の継続期間を通じて回収し、熱で非働化し（５６℃、３０分間）、古典的なプラーク減少中和試験を用いて、ＶＡＣＶ中和抗体の存在について評価した。各アッセイには、ＦＤＡの生物学的製剤評価研究センターで確認されたＦＤＡ標準参照ワクシニアＩｇ（Ｃａｎｇｅｎｅ）が陽性対照として含まれた。陰性対照には、ワクチン接種を受けていないサル由来の血清が含まれた。１〜４つの血清連続希釈を完全培養培地中に調製し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（１００％コンフルエント）入りの２４ウェルプレートに３つ１組で添加した。４．５×１０５ＰＦＵのザイール７９株を２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。事前に温めたメチルセルロースの半固体オーバーレイ（等容量の４％ＭＥＭ（４％ＦＢＳ、４ｍＭ Ｌ-グルタミン、および１％メチルセルロースが添加されている）から構成されたもの）５００μＬを各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で、７２時間インキュベートした。細胞単層を２５０μＬの０．１％クリスタルバイオレット染色溶液（２０％メタノール中に調製）で染色した。
【００６２】
プラークを計数し、抗体が存在しないときのプラーク数と比較した中和パーセントを算出した。力価は、プラーク数の５０％低下をもたらす最大希釈の逆数を表す。
【００６３】
全血算値の解析。ＨｅｖａＶｅｔ ９５０ ＦＳ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、全血算値（ＣＢＣ）を測定した。ＣＢＣは、ワクチン接種期間中の各採血時点と、０、６、１２、２１、および２７日目の曝露時に行なった。血液学的パラメータには、以下のものが含まれた：ヘマトクリット値、ヘモグロビン数、全白血球数、および各種白血球数（好中球、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基球）、血小板数、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球およびヘモグロビン濃度。
【００６４】
統計解析。言及されている場合、スチューデントの対応のあるｔ検定を比較に用いた。データを平均±標準誤差として表し、Ｐ＜０．０５（両側Ｔ検定）を統計的有意とみなした。スピアマン順位相関（ノンパラメトリック）検定を用いて、中和抗体力価（ＰＲＮＴアッセイで測定）と病変数の相関を評価した。
【００６５】
実施例１
天然痘抗原を発現するプラスミドのクローニング、インビトロ発現、および製造
各遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）により、オリゴヌクレオチドから合成で構築され、調製された。これらのオリゴヌクレオチドを、ワクシニアウイルス・ウェスタンリザーブ（ＷＲ）株からコドン最適化し、標準的なクローニング法を用いて、ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。それぞれ、Ａ４ＬとＢ５Ｒについて最適化された遺伝子をコードするＤＮＡワクチンプラスミドである、ｐＧＸ４００１とｐＧＸ４００３は、合成で構築された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位にクローニングすることによって調製された。ｐＧＸ４００４（Ａ３３Ｒをコードする）とｐＧＸ４００５（Ａ５６Ｒをコードする）は、ＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位にクローニングすることによって調製された。ｐＧＸ４００７とｐＧＸ４００８は、それぞれ、Ｈ３ＬとＬ１ＲをコードするＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位にクローニングすることによって調製された。Ｆ９Ｌをコードするプラスミド（ｐＧＸ４００６）とＡ２７Ｌをコードするプラスミド（ｐＧＸ４００２）については、ＤＮＡ断片を、それぞれ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ制限部位とＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ制限部位にクローニングした。より効率的なタンパク質発現を可能にするために、コザックコンセンサス配列とＩｇＥリーダー配列を各遺伝子の５'末端に付加した。さらに、局在解析と発現解析を助けるために、ＨＡエピトープタグを遺伝子の３'末端に付加した。
【００６６】
クローニングした後、全ての抗原をシークエンシングで確認し、挿入物の発現について試験した。その後、部分的に、米国特許第７，２３８，５２２号でＨｅｂｅｌらによって記載された製造手順を修正して用いてプラスミドを製造し、それによって、ワクチンの生物薬剤的送達に適した、非常に高いプラスミド濃度のプラスミド処方物が得られた（目的の例については図１を参照）。この方法を用いて、ＶＡＣＶ抗原Ａ４Ｌ、Ａ２７、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒから構成される天然痘多価ＤＮＡワクチンを製造した。製品は高純度で、ＲＮＡ、タンパク質、および内毒素が検出されず、-８０℃で１年以上保存した後に、平均濃度が１０．７±０．７ｍｇ／ｍＬで、スーパコイル状のパーセンテージが９４．５±１．１％であることが示された（データは示さない）。ワクチン製剤中の各抗原は、マウスまたはウサギにおいて強力な抗体免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘発した（データは示さない）。
【００６７】
天然痘抗原をコードするプラスミドのうちのいくつかも示す（図２〜９）。
【表１】
【００６８】
本明細書に記載の全ての実験において、Ｄｒａｇｈｉａ-Ａｋｌｉ Ｒ，Ｋｈａｎ ＡＳ，Ｐｏｐｅ ＭＡ，Ｂｒｏｗｎ ＰＡ．Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；９：３２９-３８（２００５）に以前に記載されているように、内毒素を含まないプラスミド製剤を滅菌水に希釈し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した低分子量ポリ-Ｌ-グルタメート（ＬＧＳ、平均ＭＷ１０，９００）を用いて１％重量／重量で処方した。
【００６９】
こうしたプラスミドに基づく治療が効果的にヒトに移されるためには、より大量のプラスミドを少ない処方容量（古典的なワクチンの処方容量と同様の容量）で有することが好ましい。さらに、導入遺伝子産物は、標的器官から効率的に分泌されるべきであり、また、検出可能でかつ活性があるべきである。
【００７０】
実施例２
プラスミドの投与と電気穿孔
微小電極（ｍＥＰ）が滅菌可能な使い捨てのプラスチックアレイに取り付けられた、ＩＤ適用のための定電流電気穿孔装置（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）、ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）が開発されたが、このアレイは、（交差汚染を防ぐために）患者の皮膚に実際に接触する唯一のコンポーネントである。少ない容量（古典的なワクチンの容量と同様の容量、すなわち、５０〜３００μＬ、より好ましくは５０〜１００μＬまたは１００〜２００μＬ）の濃縮された高純度ワクチン処方物を選択領域、標的領域に送達した後、この標的領域をマイクロアレイで囲む。微小電極を皮膚に挿入する。プラスチックアレイは、皮膚に挿入された微小電極の周りの圧力を均一にし、これにより、標的領域でのＥＰプロセスの間、電場を均一にすることができる。
【００７１】
実施例３
天然痘発現コンストラクトを用いたウサギへの免疫付与
予備実験において、上記実施例１のプラスミドワクチンによって送達される天然痘抗原に対する免疫応答とインビボでの定電流電気穿孔とをウサギの群（ｎ＝３／群）で解析した（図１０の時系列参照）。ウサギには餌と水を自由に摂らせ、ＩＵＣＵＣ標準とＳｔｉｌｌｍｅａｄｏｗ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｇａｒｌａｎｄ，ＴＸ）での慣例に従って飼育した。ＤＮＡワクチン投与の前に、注射部位の毛を剃り、徹底的に洗浄して、余分な毛や残屑を除去した。ＤＮＡワクチン接種の日に、ウサギの体重を量り、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、採血し、治療の継続期間中、イソフロウラン（ｉｓｏｆｌｏｕｒａｎｅ）（２％）を維持した。
【００７２】
８００μｇの単回筋肉内（ＩＭ）注射（注射１回につき１００μｇの各抗原および／または最大８００μｇの空ベクター）により、プラスミドを以下の組合せで投与した。すなわち、第１群のウサギは、様々な天然痘抗原（Ａ１３Ｌ、Ａ１４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｌ１Ｒ）を発現する８つのプラスミドの組合せで免疫付与し、第２群のウサギは、４つの異なる抗原（Ａ２７Ｌ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｌ１Ｒ）の組合せで免疫付与し、第３群のウサギは、単一の抗原（Ｂ５Ｒ）を発現する個々のプラスミドで免疫付与した。プラスミドは全て、半膜様筋肉内に投与し、次いで、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）を用いて、０．６Ａｍｐ、パルス３回、５２ｍｓ／パルス、パルス間隔１秒で、電気穿孔した。様々な時点でウサギから血清を回収し、タンパク質ＥＬＩＳＡで抗体応答を測定するために使用した。
【００７３】
抗体応答は、送達された抗原の数に関係なく、電気穿孔によって両方の免疫付与群で向上した。様々な抗原、すなわち、Ｂ５Ｒ（図１１）、Ｈ３Ｌ（図１２）、Ａ２７Ｌ（図１３）、Ｌ１Ｒ（図１４）に対する液性応答もＥＬＩＳｐｏｔで測定した。各群（ｎ＝３）の動物由来の血清をプールし、１：５０に希釈した。第１群と第２群由来の血清は、Ａ２７ＬとＬ１Ｒに対する有意な応答を示し（＊第３群と比較してｐ＜０．０５）、単一のワクチンに対する免疫応答は、これらの抗原が４つの抗原または８つの抗原のいずれかの群で投与された場合にも、影響を受けなかった。
【００７４】
実施例４
天然痘発現コンストラクトを用いた非ヒト霊長類への免疫付与
ＤＮＡ注射と、その後の電気穿孔（ＥＰ）によって、有意に高い免疫応答が誘発されるかどうかを調べるために、最初の予備的研究を少数のカニクイザル（６匹の動物）で実施した。実験は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置を用いて行なった。２匹のサルの群（ｎ＝２／群）に、ウイルス抗原、すなわち、最適化されたＡ４Ｌ（すなわち、Ａ４Ｌｏｐｔ）、Ａ２７Ｌｏｐｔ、およびＢ５Ｒｏｐｔ（上記実施例１のプラスミド参照）をコードする漸増用量のプラスミドを筋肉内（ＩＭ）注射した。
【００７５】
０、２８、および５６日目に、動物に、それぞれ（０．５ｍＬ滅菌水＋０．０１ｍｇ／ｍＬ ＬＧＳ中）０．０３、０．１、および０．３ｍｇの各プラスミドを、無傷の皮膚を通して半膜様筋肉内に注射し、その後、０．６Ａｍｐ、パルス長５２ｍｓｅｃ、パルス間隔１秒という条件下で電気穿孔した。８４日目に、全ての動物にタンパク質追加免疫を与え、ベースラインでの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答と、２８、５６、８４、および１１２日目でのＣＴＬ応答を測定した（図１６）。図１６に示すように、最初の免疫付与から２週間後のＥＬＩＳｐｏｔの結果から、ＩＭ注射と電気穿孔を受けた群は、ＩＭ注射のみを受けた群よりも、平均で２．５倍多いインターフェロン-γ（ＩＦＮγ）産生細胞を有することが示された。
【００７６】
実施例５
動物で生じる抗体応答のレベルにより測定されるような併用ワクチンの有効性を明らかにするために、いくつかの異なるワクシニアウイルス抗原からなる併用ワクチンを評価した。さらに、皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかへの送達を比較して、ＤＮＡ送達方法を有効性について評価した。ＤＮＡは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）定電流装置を用いて送達した。
【００７７】
動物：ＥＬＩＳＡを用いて、ニュージーランド白ウサギ（１群当たりｎ＝３〜４）の抗体免疫応答を評価した。ウサギには餌と水を自由に摂らせ、ＩＵＣＵＣ標準とＳｔｉｌｌｍｅａｄｏｗ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｇａｒｌａｎｄ，ＴＸ）での慣例に従って飼育した。ＤＮＡワクチン投与の前に、注射部位の毛を剃り、徹底的に洗浄して、余分な毛や残屑を除去した。
【００７８】
ＤＮＡワクチン接種の日に、ウサギの体重を量り、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、採血し、治療の継続期間中、イソフロウラン（２％）を維持した。様々なワクシニアウイルス抗原をコードするプラスミドを含むＤＮＡワクチンを（０、２１、および３５日目に）皮内（ＩＤ）（１００μｌ）または筋肉内（ＩＭ）（５００μｌもしくは１０００μｌ）のいずれかに投与したが、各ワクチンは、ウサギ１羽当たり合計１ｍｇのプラスミド総量（抗原１つ当たり２５０μｇ）からなっていた。ワクチン処方物中で利用されたプラスミド組合せは、インフルエンザＨ５ヘマグルチニン発現プラスミド（Ｈ５ＨＡ）（アッセイの陽性対照として使用）と、３つのワクシニアウイルス抗原（Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、およびＢ５Ｒ；上記実施例１参照）の組合せとからなっていた。各ＤＮＡワクチン処方物は、１％ＬＧＳ中に調製された。
【００７９】
ＤＮＡワクチンは全て、半膜様筋肉内に投与し、次いで、図１８に示すような種々の電気穿孔条件を用いて、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）定電流装置を用いて電気穿孔した。Ａ群〜Ｄ群には１００μｌのＩＤ注射を受けさせ、０．２Ａｍｐで電気穿孔し、２回のパルス（Ａ群）、３回のパルス（Ｂ群）、４回のパルス（Ｃ群）、６回のパルス（Ｄ群）を与えた。Ｅ群にはＩＤ注射を与えたが、電気穿孔は与えなかった。Ｆ群、Ｇ群、およびＩ群には、５００μｌのＤＮＡワクチン処方物を筋肉内（ＩＭ）投与し、０．５Ａｍｐで電気穿孔し、３回のパルスを与えたが、各々のパルスは、それぞれ、８０秒、４秒、４秒、および１０〜１５秒の遅延期間からなっていた。Ｊ群には電気穿孔を与えなかった（ＩＭ、５００μｌ）。Ｈ群には、１０００μｌの筋肉内注射を与え、電気穿孔条件は、０．５Ａｍｐ、遅延４秒、およびパルス３回からなっていた。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）定電流装置は、５２ｍｓ／パルス、パルス間隔１秒で送達するようにプログラムされた。様々な時点でウサギから血清を回収し、ＥＬＩＳＡで抗体応答を測定するために使用した（図１９〜２１の結果を参照のこと）。
【００８０】
実施例６
ＥＬＩＳＡを用いて、８〜９週齢のニュージーランド白ウサギ（１群当たりｎ＝４）を抗体免疫応答について評価した。ウサギには餌と水を自由に摂らせ、ＩＵＣＵＣ標準とＳｔｉｌｌｍｅａｄｏｗ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｇａｒｌａｎｄ，ＴＸ）での慣例に従って飼育した。ＤＮＡワクチン投与の前に、注射部位の毛を剃り、徹底的に洗浄して、余分な毛や残屑を除去した。ＤＮＡワクチン接種の日に、ウサギの体重を量り、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、採血し、治療の継続期間中、イソフロウラン（２％）を維持した。
【００８１】
様々なワクシニアウイルス抗原（上記実施例１を参照）をコードするプラスミドは、（０、２１、４２、および８４日目に）皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかに、それぞれ、１００μｌおよび５００μｌの容量で投与されたが、これらのプラスミドはウサギ１羽当たり１ｍｇのプラスミド総量（注射１回当たり、抗原１つにつき１２５μｇおよび／または最大１ｍｇの空ベクター）からなっていた。図２２と図２３には、ワクチン接種スケジュールとワクチン摂取パラメータが詳細に示されている。以下の組合せを用いて、電気穿孔を行なった（Ａ群〜Ｊ群）。Ａ群とＦ群のウサギは、単一の抗原（Ｂ５Ｒ）抗原を発現する個々のプラスミドで免疫付与した。Ｂ群とＧ群のウサギは、４つの異なる抗原（Ａ２７Ｌ、Ｂ５Ｒ、Ｈ３Ｌ、Ｌ１Ｒ）の組合せで免疫付与した。Ｃ群とＨ群は、様々な抗原（Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｌ１Ｒ）を発現する８つのプラスミドの組合せからなっていた。Ｄ群とＩ群は、抗体応答の陰性対照としての役割を果たし、空ベクター、ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で免疫付与した。Ｅ群とＪ群は、同じ組合せの８つの抗原を用いてワクチン接種したが、電気穿孔しなかった。各抗原処方物は、１％ＬＧＳ中に調製された。
【００８２】
プラスミドは全て、半膜様筋肉内に投与し、次いで、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）定電流装置を用いて、ＩＭ注射については、０．５Ａｍｐ、パルス３回、５２ｍｓ／パルス、パルス間隔１秒で、およびＩＤ注射については、０．２Ａｍｐ、パルス４回、５２ｍｓ／パルス、パルス間隔１秒で電気穿孔した（第５群以外）。様々な時点でウサギから血清を回収し、タンパク質ＥＬＩＳＡで抗体応答を測定するために使用した（図２４〜３３）。
【００８３】
ＥＬＩＳＡ抗原調製：ＥＬＩＳＡ用の抗原は、Ａｂｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により調製された。クローニング用の適当な制限部位を含有する遺伝子特異的プライマーを用いて、遺伝子をコードするＯＲＦをＰＣＲ増幅した。原核生物発現ベクターのｐＥｔ２１ａ（＋）に存在する６×ヒスチジンタグとの融合が可能になるように３'-末端オリゴヌクレオチドを設計した。タンパク質は、標準的なニッケルカラム精製法を用いて精製した。
【００８４】
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＩｇＧ応答を測定するために、ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に、ＰＢＳに希釈した５０ｎｇの抗原（Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｈ３Ｌ、またはＬ１Ｒ）をコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡアッセイを行ない、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で洗浄した後、プレートを、３％ＢＳＡを補充したＰＢＳでブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。ウサギ血清を、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳに希釈し、４℃で一晩インキュベートした（５０μｌ）。ＰＢＳ-Ｔで洗浄した後、ウェルを、２次抗体のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とインキュベートし、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳに１／１０，０００に希釈した（１００μＬ／ウェル）。ウェルを室温で１時間インキュベートし、適宜洗浄した。製造元の推奨（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従って、ＴＭＢ基質と停止溶液を各ウェルに添加した。Ｌｕｍｉｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【００８５】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（商標）-ＩＰ ９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に、ＰＢＳ中で１：１００に希釈したサルＩＦＮ-γ（ＧＺ-４）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄した後、プレートを、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０）で、室温で２時間ブロッキングした。ＰＢＭＣを、入力細胞数を２×１０５細胞にして、１００μｌの完全培養培地中に３つ１組で添加した。ペプチドを、最終濃度２５μｇ／ｍｌで完全培養培地中に希釈し、希釈液１００μｌをウェル毎に添加した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を陽性対照として使用し、完全培養培地のみに再懸濁した細胞は陰性対照としての役割を果たした。３７℃で２４時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中で１０００倍に希釈した、１００μｌ／ウェルのサルＩＮＦ-γに対するビオチン化検出ｍＡｂ（７-Ｂ６-１）とともに４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中で１：１０００に希釈した、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲートを添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、ウェルを洗浄し、１００μｌの基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ，Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）をウェル毎に添加した。室温で１０分後、水道水で数回洗浄することにより呈色反応を停止させた。プレートを風乾させ、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）ソフトウェアが入った自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダーシステム（ＣＴＬ ａｎａｌｙｚｅｒｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて、スポットを計数した。３つ１組のウェルから得たスポットの平均数を、脾細胞１×１０６個に合わせた。ＥＬＩＳｐｏｔデータは、平均＋標準偏差として表す。
【００８６】
対照培地ウェルで形成されたスポットを、刺激に使用した対応するペプチドに応答して形成されたスポットの数から差し引いた後に、抗原特異的ＩＦＮ-γ応答を算出した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、ＣＤ８除去ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＣＤ８＋リンパ球をＰＢＭＣから除去した後にも行なった。
【００８７】
実施例７
ウサギに高濃度の多価ＤＮＡワクチンを皮内接種するための電気穿孔条件の最適化
ＥＰ条件の最適化は、タンパク質発現のための重要な要素である。ＥＰ条件を最適化するための実験を、高濃度併用ワクチンを用いてウサギで実施した。検討したＥＰ条件を表２に示す。
【表２】
【００８８】
動物に、様々なＩＤ-ＥＰパラメータの下で、陽性対照インフルエンザＨ５ヘマグルチニン発現プラスミド（ＨＡ）（Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．ら．Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｖｉａ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＤＮＡ ａｎｔｉｇｅｎｓ．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ．３，ｅ２５１７（２００８））と、Ｂ５Ｒ、Ａ２７Ｌ、およびＡ４Ｌの組合せとをワクチン接種した。結果は、２×２回の皮内ＥＰパルスパターンによってより良好な応答が得られ、ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）と２つの天然痘抗原の力価とが最も強力となることを示した。第３の天然痘抗原は、３回のパルスパターンでより良好な結果をもたらした。「多数決原理」の基準を用いて、２×２回のＥＰパルス条件を次の非ヒト霊長類研究に利用した。
【００８９】
実施例８
非ヒト霊長類における多価ワクチンの接種
ＤＮＡ多価ワクチンは強力な抗体応答を誘発する
カニクイザルは、Ｔｈｒｅｅ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｅｒｋａｓｉｅ，ＰＡ）から購入し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）によって飼育および管理された。合計２４匹のサル（雌１４匹と雄１０匹）を１匹ずつケージで飼育し、体重と性別の類似性に基づいて各群に割り当てた。サルは全て、ＳＩＶ、ＳＴＬＶ、ＳＲＶ、およびＨＢＶの検査で陰性と出た。受け取った後すぐに、全ての動物を隔離し、研究室に馴化させた。隔離と研究の間、サルにＴｅｋｌａｄ ２０５０Ｃ Ｄｉｅｔを与えた。餌は、約ひとすくいの量の餌（ビスケット６〜１０枚）で１日に２回与えた。実験デザインは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩＡＣＵＣが示したガイドラインである、ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，第７版（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；１９９６）と、米農務省が動物福祉法を通じて示したガイドライン（公法９９〜１９８）とに準拠するものであった。
【００９０】
４つのカニクイザルの群を、免疫付与ごとに１か月おいて、８つのＶＡＣＶウェスタンリザーブ株遺伝子：Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒから構成された多価ＤＮＡワクチンで３回免疫付与した。１つの群（ｎ＝６）には、皮内（ＩＤ）経路で高用量（ＨＤ）のＤＮＡ（２５０μｇ／抗原）を与え、一方、別の群（ｎ＝６）には、同じ経路で低用量（ＬＤ）のＤＮＡ（１２５μｇ／抗原）を与えた。さらに、２つのサルの群（ｎ＝４）を、筋肉内（ＩＭ）経路で、高用量または低用量のいずれかのワクチンで免疫付与した。ｐＶＡＸ１で免疫付与した動物の群（ｎ＝４）を陰性対照として使用した。３回目の免疫付与の１か月後、動物を、致死用量のザイール７９株のサル痘ウイルス（静脈内送達で２×１０７ＰＦＵを導入）に曝露させた。
【００９１】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、多価ＤＮＡワクチン製剤中の各抗原に対する抗体特異的応答を評価した（表３ａ）。表３のグラフによる表示は、図３４ａに示す棒グラフに見ることができる。
【表３ａ】
ＥＬＩＳＡで測定された各抗原についての平均光学密度測定値（４５０ｎｍ）を標準誤差とともに示す。抗体応答は７０日目に測定した。
＊は、それぞれの処置群とｐＶＡＸ１の間の統計的有意性、Ｐ＜０．０５（分散が等しい両側Ｔ検定）を示す。
＊＊は、ｐＶＡＸ１光学密度値を超える増加倍数を示す。
【００９２】
最後のワクチン接種の２週間後の抗体応答を示す。多価ワクチン中の抗原は全て、ワクチン接種の投薬量と経路に関係なく、様々な程度に抗体応答を誘発した（表３ａ）。用量効果は、ＩＤ高用量（ＨＤ、２５０μｇ／プラスミド）の抗原について観察され、ほとんどの場合、低用量（ＬＤ、１２５μｇ／プラスミド）ワクチンよりも良い成績を収めた。ＩＭワクチン接種について、抗原特異的応答は両方の用量で観察され、用量効果はなかった。応答の観点からは、ＨＤワクチンの場合、同等であったＢ５Ｒを例外として、ＩＤ経路の送達の方がＩＭ送達よりもうまく行った。ＩＤ-ＨＤ経路の送達について、本発明者らは、１４倍（Ａ２７ＬおよびＡ３３Ｒ）ならびに９倍（Ｈ３Ｌ）の抗体応答誘導を観察した。ＩＭ-ＨＤ経路を用いた場合、本発明者らは、Ａ２７ＬおよびＡ３３Ｒの対照に対して、それぞれ、１０．６倍および１３．３倍の応答の増加を観察した。
【００９３】
さらに、抗原特異的抗体力価を測定した。多価ワクチン中のほとんどの抗原は、ワクチン接種の投薬量と経路に関係なく、様々な程度に抗体応答を誘発した。下記、表３ｂの結果を参照されたい。
【表３ｂ】
【００９４】
用量効果は、ＩＤ-ＨＤの抗原について観察され、ほとんどの場合、ＩＤ-ＬＤワクチンよりも良い成績を収めた。ＩＭワクチン接種について、抗原特異的応答は両方の用量で観察され、用量効果はなかった。応答の観点からは、ＨＤワクチンの場合、ＩＤ経路の送達の方がＩＭ送達よりもうまく行った。免疫付与群は全て、Ｌ１に対する抗体応答をそれほど示さなかった。
【００９５】
Ｂ．非ヒト霊長類における細胞介在性免疫の誘導
多価ワクチンによって誘導される細胞性免疫応答も評価した（図３４ｂ）。ＩＤ-ＥＰについては、ＬＤとＨＤの間にわずかな応答レベルの差しか見られなかったが、ＩＭ-ＥＰワクチン接種後に、はるかにより顕著な投薬量効果が観察された。ＩＤ注射とＩＭ注射の両方の後に、全体の細胞性免疫が顕著に増加し、２回目と３回目のワクチン接種ＨＤ注射後に強力な免疫応答が観察された（図３４ｂ）。ＩＤ-ＨＤ送達については増強効果が観察され、細胞性応答が全体で８倍増加した（１０６ＳＦＵ当たり６８７±３１．５対５６７５±５３８．１、Ｐ＜０．０３）。同様の効果がＩＭ-ＨＤ送達について観察された。本発明者らは、最初のＩＭ-ＨＤワクチン接種と２回目または３回目のＩＭ-ＨＤワクチン接種の間に、３倍の細胞性応答の増加を観察した（１０６ＳＦＵ当たり、それぞれ、２３８８±１９９対８０２８±７１９または２３８８±１９９対７０９８±５８７、Ｐ＜０．０２）。
【００９６】
Ｃ．Ｔ細胞機能と増殖の結果
いくつかのＴ細胞機能を、ＩＦＮγ、ＩＬ-２、およびＴＮＦα産生、ならびに脱顆粒化の代用マーカーとしてのＣＤ１０７ａを含む、細胞内サイトカイン染色によって評価した。費用と試料制限に基づいて、Ａ２７とＢ５の２つの抗原に対する機能的Ｔ細胞応答を解析した。Ａ２７とＢ５に対する機能的応答の全体的な大きさは、ＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントよりもＣＤ４＋Ｔ細胞コンパートメントで高かった。ＩＤ-ＨＤ群はＣＤ４＋Ｔ細胞応答が最大で、平均の大きさが０．３±０．０６％であり、全ての動物が２つの抗原のうちの少なくとも１つに応答した（図３９ａ）。ＩＭで免疫付与した動物は、平均の応答がより低かったが、高用量群と低用量群の間の応答に有意差はなかった（それぞれ、０．２±０．０８％および０．２±０．１％）。ＩＤ-ＬＤ群は、ＣＤ４＋応答が最も低かった（０．１３±０．０３％）。ＣＤ４＋応答とは対照的に、Ａ２７とＢ５に対するＣＤ８＋応答の大きさは、わずかにより低かった（図３９ｂ）。ＩＭ-ＬＤ群は、ＩＤ-ＨＤ群よりもわずかに高い応答を有した（それぞれ、０．１８±０．０８％および０．１５±０．０４％）。ＩＤ-ＬＤとＩＭ-ＨＤは両方とも、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が中程度であった（それぞれ、０．０７±０．０２％および０．０８±０．０５％）。
【００９７】
ブーリアンゲーティング（Ｂｏｏｌｅａｎ ｇａｔｉｎｇ）を用いて、本発明者らは、細胞性応答の多機能性を調べた。一般に、応答動物は、ＣＤ１０７ａが主な機能となって、単機能性応答を示し、ＩＭ-ＬＤ群の動物１匹のみが、Ｂ５に対する３機能のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を示した（データは示さない）。
【００９８】
細胞性免疫応答の別のパラメータは、ワクチン誘導性Ｔ細胞応答の増殖能である。３回目の免疫付与の後、ＰＢＭＣを単離し、エクスビボで刺激し、その後、ＣＦＳＥ希釈によって増殖を評価した。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖はＩＤ-ＨＤ群で最も高かった（１０．２±６．２％）（図４０ａ）。ＩＤ-ＬＤ群とＩＭ-ＨＤ群は、（それぞれ、１．７±０．６７％および１．４±１．１％）という低いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を有した。ＩＭ-ＬＤはバックグラウンドよりも高い応答を有さなかった。同様の結果はＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントで見られ、ＩＤ-ＨＤ群の応答が最も高かった（６．７±５．４％）（図４０ｂ）。ＩＤ-ＬＤ群、ＩＭ-ＨＤ群、およびＩＭ-ＬＤ群は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖のレベルが似ていた（それぞれ、１．６±０．６９％、１．９±１．１％、および１．８±１．６％）。
【００９９】
ＥＬＩＳｐｏｔによる強いＩＦＮγ応答が非ヒト霊長類研究で観察されたが、ＩＭで免疫付与した群は、ＩＤで免疫付与した群よりも高い総ＩＦＮγ応答を示した。また、ＩＤ-ＨＤ群は、他の免疫付与群と比較して、より良好なＣＤ４＋Ｔ細胞増殖とＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を示した。Ａ２７とＢ５に対するワクチン誘導性免疫応答の多機能性解析は、ＩＤ-ＨＤワクチン接種によって誘導されるより高い全体のＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示したのに対し、ＩＭ-ＬＤワクチン接種は、ＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントでのより高い応答を生じさせた。しかしながら、免疫付与の経路または用量に関係なく、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞は両方とも、主に単機能性であり、殺傷表現型と関連している可能性があった。（当技術分野で報告されているような）ＨＩＶ抗原のＩＭ電気穿孔の経験に基づいて、Ａ２７とＢ５に対する４機能の応答を示した動物はなかったが、本研究で観察されたワクチン誘導性免疫応答の機能プロファイルは、抗原特異的現象である可能性が最も高い。
【０１００】
実施例９
曝露：ワクチン接種を受けた非ヒト霊長類とサル痘ザイール７９による曝露
Ａ．多価ＤＮＡワクチンは非ヒト霊長類を重度のサル痘疾患から防御する
応答の有効性を十分に評価するために、動物をザイール７９株のサル痘ウイルスのＮＲ-５２３分離株に曝露させた。投与経路に関係なく、多価ワクチンによって防御がもたらされた（表４）。
【表４】
ＴＮＴＣ＝多過ぎて計数不能、ＲＥ＝記録エラー。＊１５日目の４３８９の写真を再検討してみると、いくつかの病変が見られたので、０個の病変と記載されるべきではない。これは明らかに記録エラー（ＲＥ）である。しかしながら、１８日目の写真はどれも（全ての領域を図示しているわけではないが）、病変の証拠していない。＊＊２４日目の４３８４の写真を再検討してみると、背中（２１日目に２個の病変しかなかった）にＴＮＴＣの証拠はなかった。病変は、この時点ではっきりと消失していたので、病変総数がＴＮＴＣであった可能性は低く、したがって、２４日目のＴＮＴＣは記録エラーであるように思われる。
【０１０１】
データは、図３５ｂ２でグラフとして見ることができる。
【０１０２】
ワクチンは、ｐＶＡＸ１処置対照群で記録された数え切れないほどの病変数と７５％の死亡率と比較して、病変数を大幅に減少させ、低用量と高用量の両方での死からの１００％の防御をもたらした。病変数が最高に達した時には、ｐＶＡＸ１処置動物の４匹中３匹が数え切れないほどの病変を有し、４匹目の動物にとっては疾患が致死的であった。対照群のサルは１匹だけが曝露を切り抜けて生き残ったが、病変は観察期間の最後(曝露後２７日目)にまだ存在していた。ワクチン接種を受けた動物では、病変は１５日目までに消失し始め、ＩＤ-ＨＤ注射を受けた動物で効果がより顕著であった。２１日目に、６匹中１匹の動物だけが、病変を有していた（４つの病変しか観察されなかった）。観察の最後の日（２７日目）、サル痘病変の兆候を示した動物はいなかった。ＩＤ-ＬＤでの処置によって、６匹中３匹のサルで、２１日目までに痘症がなくなり、２７日目までに全ての動物で病変が完全に消失していた。非ヒト霊長類をＩＭ-ＥＰによって処置した場合には、わずかにより早く治癒の兆候が見えた。２１日目までに、４匹中３匹のサルに病変がなかった。曝露研究の最後に、１匹のサルに病変が２つ残っていた。ＩＭ-ＬＤワクチンによる処置も４匹中１匹のサルで効果的であり、１８日目までに病変がなかった。２１日目までに、１匹のサルに８つの病変があったものの、４匹中３匹のサルには痘症がなかった。観察時間の最後までに、ＩＭ-ＬＤ群の４匹全てのサルに病変がなかった。
【０１０３】
Ｂ．多価ワクチンによって誘発されるウイルス血症レベルの低下
全てのサルが、サル痘ウイルス感染の樹立を示し、ウイルス血症レベルは曝露後６〜９日後に最大に達した（図３５ａ）。ｐＶＡＸ１対照動物は、サル痘疾患の典型的症状を発症し、疾患が重症であったために、４匹中３匹の動物を安楽死させた。ウイルス血症レベルは、７．５対数と８．５対数の間のｐＶＡＸ１ワクチン接種動物で、それぞれ、曝露後９日後と１２日後に最大に達した。曝露を切り抜けて生き残ったサル（＃４３８４）は、ウイルス血症をある程度制御しているように見えた。２１日目に、ウイルス血症レベルは、ＨＤワクチン接種動物を１対数未満しか超えていなかった。対照的に、ワクチン接種を受けた動物については、ウイルス血症レベルが９日目に少なくとも３対数分、有意に低下しており（Ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ）、研究の最後には検出不可能なレベル（１ｍＬ当たり＜５０００コピー）しか観察されなかった。１５日目までに、ＩＤ-ＨＤ群の６匹中４匹のサルとＩＭ-ＨＤ群の１００％のサルは、両方のＬＤワクチン接種の場合の５０％と比較して、検出不可能なレベルのウイルス血症を有していた。１８日目までに、両方のワクチン接種群のサルのうちの１匹だけが検出可能なレベルのウイルス血症を有していた。したがって、これらの知見は、サル痘ウイルスのウイルス血症の制御と重症疾患の予防とにおけるＤＮＡワクチンの防御的有効性を示している。
【０１０４】
Ｃ．多価ワクチンによって誘発される抗ＶＡＣＶ抗体の誘導
ＤＮＡワクチンとサル痘ウイルス曝露とで誘導された抗体の検出を、精製され、不活化された全ＶＡＣＶをコーティング抗原として用いるＥＬＩＳＡで測定した（図３６）。ウイルス特異的ＶＡＣＶ特異的抗体の低レベル力価は、ＤＮＡワクチンを受容した動物で２８日目に検出され、動物全てが、ワクチン接種群と投薬量の両方について、１：１００の終点力価を有していた。抗体力価はそれ以降増加し始め、平均終点力価は、９１日目に、ＩＤ-ＨＤ送達経路とＩＭ-ＨＤ送達経路について、それぞれ、１：６３３と１：３００であり、投与量間にはほんのわずかな差しか存在しなかった。曝露後、ワクチン接種を受けたサルで抗ＶＡＣＶ抗体力価の劇的な増加が観察された。ｐＶＡＸ１ワクチン接種動物と比べて約１００倍の増加が、曝露６日後（研究９７日目）に、ワクチン接種を受けたサルで観察され、終点力価は、ＨＤワクチン接種を受けたサルで約１：１０，０００であった。ＬＤをワクチン接種した動物について、より低いかまたは同様の終点力価が観察され、平均終点力価は、ＩＤ注射とＩＭ注射について、それぞれ、１：３６００±１８６７と１：８８００±２４００であった。対照的に、ｐＶＡＸ１処置動物は、曝露後１２日（研究１０３日目）まで顕著な応答を示さず、平均最大終点力価は１：８００であった。曝露を切り抜けて生き残ったサルは、曝露１８日後（研究１０９日目）に、最大終点抗体力価が１：１６００でしかなかった。
【０１０５】
Ｄ．多価ワクチンによって誘発される中和抗体力価の誘導
全ＶＡＣＶに対する結合抗体が同定されたので、インビトロでの機能的ＰＲＮＴアッセイでサル痘ウイルスを中和するその能力を検討し、インビボでのサル痘ウイルス曝露に対する防御におけるワクチンで誘導された抗体の役割を明らかにした。サル痘ウイルス中和抗体力価を様々な群で測定した（表５参照）。
【表５】
＊力価はＰＲＮＴ５０値として表されている。０、２８、および５６日目に、動物にワクチン接種し、９１日目（曝露０日目）に曝露した。９７、１０３、１０９、および１１８日目は、それぞれ、曝露６、１２、１８、および２７日目に対応する。
【０１０６】
曝露前にｐＶＡＸ１処置対照動物から回収した血清は、ウイルスを中和することができなかった。しかしながら、曝露６日後（研究９７日目）、全てのサルが検出可能な力価を示し始めた。曝露を切り抜けて生き残った対照サルは、最大の中和抗体力価を有していた。対照的に、多価ワクチンを接種した動物は、ワクチン接種経路または投薬量に関係なく、２回目のワクチン接種の２週間後（４２日目）に、中程度の中和抗体応答を示し始めた。重要なことに、中和抗体応答は、曝露後、大いにかつ急速に増強された。結果のグラフを図３７に見ることができる。予想通り、ＨＤワクチンは、全ての時点について、ＬＤワクチンよりも大きい抗体応答を誘発した（表５）。
【０１０７】
さらに、中和抗体力価は病変数スコアと相関した（スピアマン順位相関、ノンパラメトリック、Ｐ＜０．００８− 図３８参照）。
【０１０８】
実施例１０
サル痘曝露後の臨床的観察
ｐＶＡＸ１処置動物は、感染の急性期に、顕著な体重損失、体温上昇、鬱、および無気力を経験した。最も顕著な体重損失は、痘痕病変とウイルス血症がピークに達した曝露後１２日目に観察された（表６）。
【表６】
＊曝露６〜２７日目の欄内の数は、０日目と比較した体重変化％として表されている。
体重は０日目の欄に示されている。
【０１０９】
曝露１２日目、平均体重損失は８．７３％であった（体重損失は、曝露前の体重と比較して、５．６〜１１．１％の範囲である）。群内で生き残った１匹のサル（＃４３８４）は、最終的には体重が回復したが、曝露後２１日目までは回復しなかった。対照的に、ワクチン接種動物は、曝露後にそれほどの体重損失を経験しなかった。体重損失は、ＨＤワクチン接種動物でよりも両方のＬＤワクチンで処置した動物でより顕著であった。ＩＤ-ＨＤワクチンで処置した動物については、体重変動が曝露後１２日目に観察され、平均損失は、曝露前の体重に対して１．３４％であった。この同じ日、ＩＭ経路でワクチン接種した動物は、曝露前の体重に対して１．７％の体重増加を経験した。ＬＤワクチンを接種した動物は、ＨＤワクチン接種動物について観察された体重損失よりも大きい体重損失を経験した。ＩＤワクチン接種とＩＭワクチン接種について、動物は、それぞれ、２．９％±１．３と６．０％±２．３８という平均±標準誤差損失を経験した。
【０１１０】
ｐＶＡＸ１処置動物については、曝露１２日後まで体温上昇が観察された（データは示さない）。最大の体温上昇は、曝露後３日目に観察され、平均温度は華氏１０３．１度（範囲：華氏１０１．５〜１０４．４度）であった。曝露を切り抜けて生き残ったサルは、２７日目までに正常体温を有していた。予想通り、ワクチン接種を受けたサルの温度は、ワクチン接種経路と投薬量に関係なく、曝露期間中ずっと変動した。しかしながら、ワクチン接種動物の平均温度は、曝露期間中、正常体温（華氏９９〜１０２度）の範囲内に維持された（データは示さない）。
【０１１１】
臨床パラメータ：研究期間中の全血数（ＣＢＣ）モニタリングは、サル痘曝露の間、わずかな血液学的パラメータの変化しか示さなかった。サル痘疾患のために安楽死させた対照動物は、ウイルス血症レベルがピークに達した１２日目に、曝露前のレベルと比較して、５８．２％（＃４４０３、１μＬ当たり１１，５００対１８，２００）、６５．６％（＃４３９２、１μＬ当たり６，１００対１０，１００）、および１２１％（＃４３９３、１μＬ当たり８，６００対１９，０００）という増加した白血球（ＷＢＣ）を有していた。ワクチン接種動物は、１２日目に、同じ程度まで増加したＷＢＣ数も有しており、平均増加パーセントは、曝露前のレベルに対して、ＩＤ-ＬＤ、ＩＤ-ＨＤ、ＩＭ-ＬＤ、ＩＭ-ＨＤについて、それぞれ、６９．４±１５．８、６８．８±１５．６、８０．９±１７．２、７０．０±２８．０であった。研究の終わりまでに、各群のほとんどのワクチン接種動物は、ＷＢＣ数を曝露前のレベルにまで復帰させたが、対照群由来の生き残ったサルは、１μＬ当たり２２，３００の増加したＷＢＣ数を有し続けた。
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６１／０５６，６８７号（２００８年５月２８日出願）および米国仮特許出願第６１／１２１，０５４号（２００８年１２月９日出願）の恩典を主張し、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府により支援された研究に関する声明
米国政府は、本発明における一括払いライセンスを有し、限られた状況において、国防省により与えられている助成金番号ＨＤＴＲＡ１-０７-Ｃ-０１０４の条件によって規定されているように、適当な条件で他の者に使用許諾するように特許権者に要求する権利を有する。
【０００３】
本発明は、コンセンサス天然痘抗原、そのような抗原をコードする核酸コンストラクト、および天然痘ウイルスに対する免疫応答を生じさせるためにそれから作製されワクチン、ならびに天然痘ウイルスから哺乳動物を防御するためにこれらの製品を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ここ四半世紀の大半の間、世間的関心または科学的関心が、天然痘または天然痘ワクチン接種に関する問題に向けられることはほとんどなかったが、昨今の生物テロに関する懸念のために、故意の放出による天然痘発生の潜在的脅威が現実的な懸念となっている。天然痘が第一選択のテロ兵器になる要因はいくつかある。天然痘は大量に製造することができ、保存と輸送の間は安定であり、曝露された非ワクチン接種者での死亡率が３０％のエアロゾルとして製造することができる。１０〜２０またはそれより多くの症例が、１人の感染者が起源となることで起こり得るので、天然痘は非常に感染性が高い。したがって、テロ攻撃によって天然痘が放出された場合、多くの米国人が感染、疾患、および死の危険に曝されることになるという大きな懸念がある。
【０００５】
限定的に使用可能な市販認可された天然痘ワクチンは、確立されたドライバックス（Ｄｒｙｖａｘ）ワクチンとアカンビス（Ａｃａｍｂｉｓ）ワクチンである。このワイス（Ｗｙｅｔｈ）社のワクチンは、仔ウシリンパ液に由来する生ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）の凍結乾燥製剤である。ワイス社は、一般市民への天然痘ワクチン販売を１９８３年に中止した。アカンビスワクチンは、今なおヒトでの重大な副作用を伴う生きた組織培養物に適応したワクチンストックである。過去に、ドライバックスに伴うリスクに関する懸念があった。最近の臨床試験での有害事象によって、こうした懸念は高まっている。重大な懸念は、かなりの数の免疫不全者（ＨＩＶ感染者）や１９７０年に存在していたよりもはるかに多くの高齢者がいるということである。さらに、妊婦、静注薬物使用者、移植を受けた人、および北米で生活する免疫抑制剤の使用者は潜在的なワクチン受容者であり、もとのドライバックスや最近のアカンビスの生ワクチン戦略による危険性がみな高い。北米では、許容できない数の人が重篤な合併症で入院するおそれがあるという懸念が重要な意味を持っている。ワクチンだけが原因で、または生物テロの場合、天然痘の使用が原因で、多くの人が死亡することがあるが、ワクチンに関連する健康への懸念のために、配備の遅れまたは服薬不履行が起こり得る。最近の天然痘ワクチン接種プログラムは生物テロ事象からの防御を意図しているが、ＶＡＣＶ誘導性免疫を持つ人の数が減少しているので、天然のポックスウイルス疾患についても懸念が高まっている。
【０００６】
ＡＩＤＳ患者のサイトメガロウイルス性網膜炎治療用の承認薬であるシドフォビルは、ほとんど全てのＤＮＡウイルスに対する幅広い活性を有する。最近、シドフォビルは、天然痘やサル痘（ＭＰＸＶ）を含むいくつかのポックスウイルスに対するマウスでのインビトロ活性とインビボ活性が証明された。シドフォビルの単回投与は、曝露されてから数日以内に薬物治療を開始すれば、ワクシニアまたは牛痘のいずれかによる致死的呼吸器感染からマウスを防御するのに極めて有効であることを示した。
【０００７】
それでもやはり、現在の治療には限界がある。１９６０年代に発生したよりも著しく高い割合の合併症に対処するために現在備蓄されているワクチンを使用するのは、効果がない可能性がある。なぜなら、需要が満たされないことや、最近の天然痘ウイルスの進化のために有効性が低下することがあり得るからである。免疫不全の人や健康が衰えた人の場合、前述の安全性への懸念もある。ＤＮＡベースのワクチンの実現可能性は、ワクチンへの潜在的基盤になると考えられているが、ヒトで成功することがまだ証明されていない。さらに、天然痘ウイルスは、２００を超える遺伝子をコードし、かつ各々それ自身に固有の膜糖タンパク質と異なる侵入要件とを有する、成熟ビリオン（ＭＶ）とエンベロープビリオン（ＥＶ）という２つの感染形態を有する極めて複雑なＤＮＡウイルスであるので、有効なＤＮＡワクチンを開発するための候補抗原が難しい。
【０００８】
現在の天然痘ワクチンの安全かつ有効な代替物が依然として必要とされている。さらに、十分に許容され、広範な免疫防御を提供し、かつ生物テロの脅威に応えて時宜を得た方法で大規模に製造することができる天然痘ワクチンが必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様は、天然痘ウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を生じさせることができるＤＮＡワクチンを含む。ＤＮＡワクチンは、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドとを含む。好ましくは、ＤＮＡワクチンは、Ａ４Ｌ抗原を発現することができるプラスミドをさらに含む。本発明の別の態様は、中和抗体応答を含む、天然痘ウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳動物の組織に、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、Ａ４Ｌを発現することができるＤＮＡプラスミドとを含むＤＮＡワクチンを注射する工程を含む方法に関する。好ましくは、これらの方法は、電気穿孔量の電気エネルギーを用いて該組織を電気穿孔する工程をさらに含む。
【００１０】
本発明の多くの目的および利点は、添付の図面を参照することにより、当業者によってより良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】多くの天然痘プラスミドに基づく製造に関する表とそれらの物理化学特性のまとめを示す。
【図２】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＡ４Ｌ（配列番号１に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＡ４Ｌ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００１を示す。
【図３】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＡ２７Ｌ（配列番号３に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＡ２７Ｌ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００２を示す。
【図４】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＢ５Ｒ（配列番号５に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＢ５Ｒ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００３を示す。
【図５】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＡ３３Ｒ（配列番号７に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＡ３３Ｒ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００４を示す。
【図６】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＡ５６Ｒ（配列番号９に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＡ５６Ｒ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００５を示す。
【図７】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＦ９Ｌ（配列番号１１に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＦ９Ｌ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００６を示す。
【図８】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＨ３Ｌ（配列番号１３に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＨ３Ｌ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００７を示す。
【図９】ヒトコドンに最適化されたコンセンサスＬ１Ｒ（配列番号１５に示すＤＮＡ配列をコードする）を含むＬ１Ｒ抗原を発現するプラスミド地図ｐＧＸ４００８を示す。
【図１０】ウサギでの予備的研究における事象の順序を示す時系列を示す。
【図１１】３つの異なる群に由来するウサギでのＢ５Ｒ抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図１２】３つの異なる群に由来するウサギでのＨ３Ｌ抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図１３】３つの異なる群に由来するウサギでのＡ２７Ｌ抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図１４】３つの異なる群に由来するウサギでのＬ１Ｒ抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図１５】カニクイザル（非ヒト霊長類）での予備的研究における事象の順序を示す時系列を示す。
【図１６】３つの霊長類の群についてのＥＬＩＳｐｏｔの結果を示す棒グラフを示す。
【図１７】ウサギでの皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかへの抗原送達を比較する研究における事象の順序を示す時系列を示す。
【図１８】Ａ群からＪ群の各々１つの群のウサギに投与された複数のプラスミドの電気穿孔条件と送達条件を示す表を示す。
【図１９】様々なＩＭ条件またはＩＤ条件の下での抗体力価（ＨＡ抗原）を示す棒グラフを示す。
【図２０】様々なＩＭ条件またはＩＤ条件の下での抗体力価（Ｂ５Ｒ抗原）を示す棒グラフを示す。
【図２１】様々なＩＭ条件またはＩＤ条件の下での抗体力価（Ａ２７Ｌ抗原）を示す棒グラフを示す。
【図２２】ウサギのＩＭワクチン接種またはＩＤワクチン接種のスケジュールを示す時系列を示す。
【図２３】Ａ群からＪ群の各々１つの群のウサギに投与された複数のプラスミドの電気穿孔条件と送達条件を示す表を示す。
【図２４】様々な群のウサギでのＡ２７Ｌ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２５】様々な群のウサギでのＢ５Ｒ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２６】様々な群のウサギでのＡ４Ｌ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２７】様々な群のウサギでのＨ３Ｌ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２８】様々な群のウサギでのＡ３３Ｒ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図２９】様々な群のウサギでのＬ１Ｒ抗原に対する抗体応答を示す棒グラフを示す。
【図３０】４２日目での４つのプラスミド組合せについてのＡ２７Ｌ抗原に対する終点ＥＬＩＳＡ曲線を示す線グラフを示す。
【図３１】４２日目での８つのプラスミド組合せについてのＡ２７Ｌ抗原に対する終点ＥＬＩＳＡ曲線を示す線グラフを示す。
【図３２】８４日目での４つのプラスミド組合せについてのＡ２７Ｌ抗原に対する終点ＥＬＩＳＡ曲線を示す線グラフを示す。
【図３３】８４日目での８つのプラスミド組合せについてのＡ２７Ｌ抗原に対する終点ＥＬＩＳＡ曲線を示す線グラフを示す。
【図３４】各ワクチン接種についてのＩＤ送達およびＩＭ送達後の抗体応答および細胞性応答の増強。０、２８、および５６日目に、カニクイザルにワクチン接種した。図３４ａは、ｐＶＡＸ１対照群と比較した各抗原についての抗体応答を示す棒グラフを示す。図３４ｂは、各ワクチン接種についてのＩＤ送達およびＩＭ送達後の細胞性応答を示す棒グラフを示す（各ワクチン接種（０、２８、および５６日目）由来の個々の免疫付与されたサルからＰＢＭＣを単離し、プールした。各抗原についてのペプチドプールでＰＢＭＣを刺激した後、ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行なった）。
【図３５−１】曝露後のワクチン接種を受けたサルにおけるウイルス血症のレベルを示すグラフを示す。血液１ｍｌ当たりのサル痘ウイルスゲノムの数を、定量的ＴａｑＭａｎ ３'-マイナーグルーブバインダーＰＣＲで測定した。検出下限は、５０００ゲノム／ｍｌ血液であった。平均値±標準誤差を示す。
【図３５−２】示されるように、１群につきサル１匹で、手と胴体の病変が示された写真を示す。
【図３５−３】サル痘ウイルスを静脈内曝露した後の痘痕病変の発症を示すための病変総数を示す棒グラフを示す。
【図３６】ワクチン接種を受けたサルにおける抗ＶＡＣＶ結合抗体の曝露前と曝露後の終点力価を示すグラフを示す。終点力価は、陽性反応性が陰性対照血清の平均光学密度＋３標準偏差よりも大きい最大血清希釈の逆数として表す。Ｖはワクチンを接種した日を示す。Ｃは曝露した日を示す。
【図３７】サル痘ウイルス曝露前後の中和抗体応答を示すグラフを示す。各処置群のＰＲＮＴ５０中和抗体力価が示されている。Ｖはワクチンを接種した日を示す。Ｃは曝露した日を示す。
【図３８】ＶＡＣＶ中和抗体力価と痘痕病変の最大数のスピアマン順位相関を示すグラフを示す。
【図３９】免疫付与後の抗原特異的Ｔ細胞機能を示す棒グラフを示す。３回目の免疫付与をしてから２週間後に単離されたＰＢＭＣを、インビトロで、Ａ２７またはＢ５の全ペプチドプール混合物で５時間刺激した。ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ-２の細胞内産生とＣＤ１０７ａによる脱顆粒化について細胞を染色した。ＣＤ４＋（図３９ａ）Ｔ細胞とＣＤ８＋（図３９ｂ）Ｔ細胞について機能的表現型を評価した。積み重ね表示棒グラフは、各々の免疫付与群についてのＡ２７（灰色）とＢ５（黒色）に対する全ての機能的応答の平均の大きさを示す。
【図４０】ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能を示す棒グラフを示す。３回目の免疫付与をしてから４週間後に単離された新鮮ＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、インビトロで５日間、抗原特異的ペプチドで刺激して、抗原特異的ＣＤ４＋（図４０ａ）Ｔ細胞とＣＤ８＋（図４０ｂ）Ｔ細胞の増殖能を測定した。結果は、積み重ね表示の群平均応答±標準誤差として示す。免疫前試料でのバックグラウンド応答が高かったので、Ａ４Ｌ応答は報告しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下の省略された、または短縮された、定義は、本発明の好ましい実施形態の理解を助けるために提供される。本明細書で提供される省略された定義は、決して網羅的なものではなく、また、当該分野で理解されるような定義または辞書的な意味と矛盾するものでもない。省略された定義は、当技術分野で公知の定義を補足するまたはより明確に定義するために本明細書で提供される。
【００１３】
定義
本明細書で使用する場合、「核酸コンストラクト」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を指す。コード配列、または「核酸配列をコードする」は、核酸分子が投与される個体の細胞における発現を導くことができるプロモーターやポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに機能的に連結される開始シグナルおよび終結シグナルを含み得る。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「発現可能形態」という用語は、個体の細胞に存在するときにコード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に機能的に連結される必要な調節エレメントを含有する核酸コンストラクトを指す。
【００１５】
「定電流」という用語は、組織、または該組織を規定する細胞が、同組織に送達される電気パルスの持続期間中に受容するまたは経験する電流を定義するために本明細書で使用される。電気パルスは、本明細書に記載の電気穿孔装置から送達され、本明細書に記載のプラスミドおよびワクチンとともに使用されることが企図される。この電流は、電気パルスの寿命期間中、該組織に定電流量で留まるが、それは、本明細書で提供される電気穿孔装置が、好ましくは瞬間的フィードバックを有する、フィードバック素子を有するからである。フィードバック素子は、パルスの持続期間中の組織（または細胞）の抵抗を測定し、電気穿孔装置の電気エネルギー出力を変化させる（例えば、電圧を増大させる）ことができるので、同組織中の電流は、電気パルスの間ずっと（約マイクロ秒）、およびパルス毎に、一定であり続ける。いくつかの実施形態では、フィードバック素子は、制御器を含む。
【００１６】
「フィードバック」または「電流フィードバック」という用語は互換的に使用されており、提供される電気穿孔装置の活発な応答を意味するが、これは、電極間の組織の電流を測定することと、電流を一定レベルで維持するために、ＥＰ装置が送達するエネルギー出力を適宜変化させることとを含む。この一定レベルは、パルスシーケンスまたは電気処理を開始する前に、ユーザが予め設定する。電気穿孔装置の中の電気回路が、電極間の組織の電流を連続的にモニターし、そのモニターされた電流（または組織中の電流）を予め設定された電流と比較し、連続的にエネルギー出力の調整を行なって、モニターされた電流を予め設定されたレベルで維持することができるように、フィードバックは、電気穿孔装置の電気穿孔コンポーネント、例えば、制御器によって達成されることが好ましい。いくつかの実施形態では、フィードバックループは瞬間的なものであるが、それは、フィードバックループがアナログ閉ループフィードバックであるからである。
【００１７】
本明細書で互換的に使用される「電気穿孔」、「電気透過」、または「動電増強」（「ＥＰ」）という用語は、膜貫通電界パルスを用いて、生体膜に微視的通路（孔）を導入することを指す。これらの通路が存在することにより、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および／または水などの生体分子が細胞膜の一方側から他方側へと通過することができる。
【００１８】
「分散電流」は、本明細書に記載の電気穿孔装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを定義するために本明細書で使用されており、これらのパターンは、電気穿孔される任意の組織領域に対する電気穿孔関連の熱応力の発生を最小限に抑えるか、または好ましくは消失させる。
【００１９】
本明細書で使用される「フィードバック機構」という用語は、ソフトウェアまたはハードウェア（もしくはファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスであって、（エネルギーパルスの送達前、送達中、および／または送達後の）所望の組織の電気抵抗を受容し、それを現在値、好ましくは電流と比較し、送達されるエネルギーパルスを調整して、予め設定された値を達成するプロセスを指す。「電気抵抗」という用語は、フィードバック機構を論じるときに本明細書で使用されており、オームの法則によって電流値に変換することができるので、予め設定された電流と比較することができる。好ましい実施形態では、「フィードバック機構」は、アナログ閉ループ回路によって実行される。
【００２０】
「アジュバント」という用語は、以下に記載のＤＮＡプラスミドおよびコード核酸配列によってコードされるＶＡＣＶ抗原の抗原性を増強するために本明細書に記載のＤＮＡワクチンに添加される任意の分子を意味するために本明細書で使用される。
【００２１】
「防御免疫応答」という用語は、本明細書で提供されるＤＮＡワクチンによる免疫付与によって生じる、抗体応答と細胞性免疫応答の組合せ、好ましくは、中和抗体応答を意味するために本明細書で使用される。
【００２２】
本発明の好ましい抗原を説明するために互換的に使用される「コンセンサス」または「コンセンサス配列」または「コンセンサス抗原」という用語は、今存在する特定のウイルス分離株に基づいて生成される合成配列を指す。コンセンサスは、所与のどの天然ウイルス分離株よりも、現在広まっているウイルス分離株に遺伝的に近い可能性がある。しかしながら、通常、急性感染期にサンプリングされるウイルスではなく、慢性感染期にサンプリングされるウイルスを用いて全体的な配列決定が行なわれるので、大部分は免れたエピトープに対するコンセンサスワクチン応答を発生させるのは不利な場合がある。この不都合を最小にするために、ワクチン設計の１つの有用な戦略は、早期伝達配列を考慮に入れることである。コンセンサスは、ワクチン株と今広まっているウイルスの配列の相違度を最小にする効果的なアプローチであって、これらのウイルスの「中核を成す」人工配列を作り出することになるアプローチとなる。１つの設計戦略は、アラインメントの位置ごとに最もよく見られるアミノ酸から得られるコンセンサス配列を使用することである。その結果、そのようなコンセンサスは、様々な天然ウイルス分離株に対する広範な免疫応答を誘発することができ、組合せ上の多型はどの天然ウイルスにも見られないはずである。
【００２３】
本発明の一態様は、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を生じさせることができるＤＮＡワクチンを含む。好ましくは、ポックスウイルスは天然痘ウイルスである。ＤＮＡワクチンは、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドとを含む。好ましくは、ＤＮＡワクチンは、Ａ４Ｌ抗原を発現することができるプラスミドをさらに含む。各々の該抗原は、（複数のコード配列を含む）単一のＤＮＡプラスミドによって、または別々のＤＮＡプラスミドによって発現され得る。好ましくは、各々の別々の抗原は、別々のＤＮＡプラスミドによって発現される。ＶＡＣＶ ＭＶ抗原は、Ａ２７Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、またはＬ１Ｒを含み、一方、ＶＡＣＶ ＥＶ抗原は、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、またはＢ５Ｒを含む。好ましくは、各々のＤＮＡプラスミドは、該抗原をコードするコンセンサスＤＮＡ配列を含む。ＶＡＣＶ ＭＶ抗原をコードするコンセンサスＤＮＡ配列は、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１５（Ｌ１Ｒ）を含む。ＶＡＣＶ ＥＶ抗原をコードするコンセンサスＤＮＡ配列は、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、または配列番号９（Ａ５６Ｒ）を含む。Ａ４ＬをコードするコンセンサスＤＮＡ配列は、配列番号１を含む。いくつかの実施形態では、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができるＤＮＡプラスミドは、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１６（Ｌ１Ｒ）を含む配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含み、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができるＤＮＡプラスミドは、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、または配列番号１０（Ａ５６Ｒ）を含む配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含み、Ａ４Ｌ抗原を発現することができるＤＮＡプラスミドは、配列番号２の配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含む。好ましくは、ＤＮＡワクチンは、コードＤＮＡ配列、すなわち、配列番号１（Ａ４Ｌ）、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、配列番号９（Ａ５６Ｒ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、および配列番号１５（Ｌ１Ｒ）をそれぞれ含む、複数の別々のＤＮＡプラスミドを含む。別の好ましい実施形態では、ＤＮＡワクチンは、配列、すなわち、配列番号２（Ａ４Ｌ）、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、配列番号１０（Ａ５６Ｒ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、および配列番号１６（Ｌ１Ｒ）をそれぞれ有するタンパク質をコードするコードＤＮＡ配列を含む、複数の別々のＤＮＡプラスミドを含む。いくつかの好ましい実施形態では、コンセンサスコード配列は、ヒトコドンに最適化されている。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、ＤＮＡワクチンは、ＤＮＡプラスミドｐＧＸ４００１、ｐＧＸ４００２、ｐＧＸ４００３、ｐＧＸ４００４、ｐＧＸ４００５、ｐＧＸ４００６、ｐＧＸ４００７、もしくはｐＧＸ４００８、またはそれらの組合せを含む。
【００２５】
本発明の別の態様は、中和抗体応答を含む、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を誘導する方法であって、該哺乳動物の組織に、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、Ａ４Ｌを発現することができるＤＮＡプラスミドとを含むＤＮＡワクチンを注射する工程を含む方法に関する。好ましくは、ポックスウイルスは天然痘ウイルスである。好ましい実施形態では、注射する工程は、皮内に注射する工程または筋肉内に注射する工程を含む。防御免疫応答を誘導する方法は、電気穿孔量の電気エネルギーを用いて該組織を電気穿孔する工程をさらに含むことができる。好ましくは、電気穿孔する工程は、該組織に定電流を送達する工程を含む。より好ましくは、電気穿孔する工程は、０．２Ａの電流を送達する工程を含む。いくつかの実施形態では、防御免疫応答を誘導する方法は、該注射する工程を繰り返す工程を含む。好ましい実施形態では、送達する工程は、８つの別々のＤＮＡプラスミドを送達する工程を含む。
【００２６】
本明細書に記載のＤＮＡワクチンは、高いＤＮＡ濃度を有するＤＮＡプラスミド処方物を用いて処方される。高いＤＮＡ濃度は、５ｍｇ／ｍＬ以上、６ｍｇ／ｍＬ以上、７ｍｇ／ｍＬ以上、８ｍｇ／ｍＬ以上、９ｍｇ／ｍＬ以上、１０ｍｇ／ｍＬ以上、１１ｍｇ／ｍＬ以上、１２ｍｇ／ｍＬ以上、１３ｍｇ／ｍＬ以上、１４ｍｇ／ｍＬ以上、１５ｍｇ／ｍＬ以上の濃度であり得る。いくつかの実施形態では、プラスミドＤＮＡは、５〜１５ｍｇ／ｍＬ、５〜１４ｍｇ／ｍＬ、５〜１３ｍｇ／ｍＬ、５〜１２ｍｇ／ｍＬ、５〜１１ｍｇ／ｍＬ、５〜１０ｍｇ／ｍＬ、５〜９ｍｇ／ｍＬ、５〜８ｍｇ／ｍＬの濃度、６〜１５ｍｇ／ｍＬ、６〜１４ｍｇ／ｍＬ、６〜１３ｍｇ／ｍＬ、６〜１２ｍｇ／ｍＬ、６〜１１ｍｇ／ｍＬ、６〜１０ｍｇ／ｍＬ、６〜９ｍｇ／ｍＬ、６〜８ｍｇ／ｍＬの濃度、７〜１５ｍｇ／ｍＬ、７〜１４ｍｇ／ｍＬ、７〜１３ｍｇ／ｍＬ、７〜１２ｍｇ／ｍＬ、７〜１１ｍｇ／ｍＬ、７〜１０ｍｇ／ｍＬ、７〜９ｍｇ／ｍＬ、８〜１５ｍｇ／ｍＬ、８〜１４ｍｇ／ｍＬ、８〜１３ｍｇ／ｍＬ、８〜１２ｍｇ／ｍＬ、８〜１１ｍｇ／ｍＬ、８〜１０ｍｇ／ｍＬ、９〜１５ｍｇ／ｍＬ、９〜１４ｍｇ／ｍＬ、９〜１３ｍｇ／ｍＬ、９〜１２ｍｇ／ｍＬ、９〜１１ｍｇ／ｍＬ、１０〜１５ｍｇ／ｍＬ、１０〜１４ｍｇ／ｍＬ、１０〜１３ｍｇ／ｍＬ、１０〜１２ｍｇ／ｍＬ、１１〜１５ｍｇ／ｍＬ、１１〜１４ｍｇ／ｍＬ、１１〜１３ｍｇ／ｍＬ、１２〜１５ｍｇ／ｍＬ、１２〜１４ｍｇ／ｍＬ、または１３〜１５ｍｇ／ｍＬの濃度であってもよい。ＤＮＡプラスミド濃度が高い処方物を用いてＤＮＡワクチンを処方することにより、各々のＤＮＡプラスミドを高い用量で維持したまま、様々な別々のＤＮＡプラスミドの混合物を１つに混合することができる。いくつかの実施形態では、各々の別々のＤＮＡプラスミドは高用量で存在し、これは、５０μｇを超える、６０μｇを超える、７０μｇを超える、８０μｇを超える、９０μｇを超える、１００μｇを超える、１１０μｇを超える、１２０μｇを超える、１３０μｇを超える、１４０μｇを超える、１５０μｇを超える、１６０μｇを超える、１７０μｇを超える、１８０μｇを超える、１９０μｇを超える、２００μｇを超える、２１０μｇを超える、２２０μｇを超える、２３０μｇを超える、２４０μｇを超える、または２５０μｇを超える用量である。好ましくは、高用量は１２０μｇを超えるものであり、より好ましくは１２５μｇである。好ましい一実施形態では、ＤＮＡワクチンは、１２５μｇの用量で存在するＤＮＡプラスミドを含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態では、ＤＮＡワクチンは、アジュバントをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、アジュバントは、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ-ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６（シグナルペプチドを欠失し、かつ任意でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＩＬ-１５を含む）からなる群から選択される。有用なアジュバントであり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１ｐ、ＩＬ-８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ-セレクチン、Ｐ-セレクチン、Ｅ-セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ-１、ＭａｄＣＡＭ-１、ＬＦＡ-１、ＶＬＡ-１、Ｍａｃ-１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ-１、ＩＣＡＭ-２、ＩＣＡＭ-３、ＣＤ２、ＬＦＡ-３、Ｍ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ-４、突然変異型ＩＬ-１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ-７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ-１、ｐ５５、ＷＳＬ-１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ-３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ-Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ-ｊｕｎ、Ｓｐ-１、Ａｐ-１、Ａｐ-２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ-１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ-Ｒ３、ＴＲＡＩＬ-Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードする遺伝子が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、アジュバントは、ＩＬ-８、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２８、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１ｐ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、もしくはＭＥＣ、またはそれらの組合せから選択され、より好ましくは、アジュバントは、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-２８、またはＲＡＮＴＥＳである。
【００２８】
ポックスウイルスは、ポックスウイルス科由来の巨大複合ウイルスであり、ＶＡＣＶと痘瘡ウイルス（天然痘）とを含む。４つのポックスウイルス属がヒトに感染することが知られており、オルトポックス、パラポックス、ヤタポックス、モラシポックスを含む。オルトポックス：痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、天然痘（撲滅された）；パラポックス：オルフウイルス、偽牛痘ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス；ヤタポックス：タナポックスウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス；モラシポックス：伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ）。他のポックスウイルスとしては、とりわけ、ラクダ痘ウイルス、牛痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、サル痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス、スカンク痘ウイルス、アレチネズミ痘ウイルス（Ｔａｔｅｒａ ｐｏｘｖｉｒｕｓ）、ウアシン・ギシュ（Ｕａｓｉｎ Ｇｉｓｈｕ）ウイルス、痘瘡ウイルス、ハタネズミ痘ウイルス（Ｖｏｌｅｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）などのオルトポックスウイルス、アウスディーク（Ａｕｓｄｙｋ）ウイルス、ウシ丘疹性口炎ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘ウイルス、アカシカ痘ウイルス、アザラシ痘ウイルスなどのパラポックスウイルス、ヒツジ痘ウイルス、ヤギ痘ウイルス、塊皮病ウイルスなどのカプリポックスウイルス、豚痘ウイルスなどのスイポックスウイルス、粘液腫ウイルス、線維腫ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス、リス線維腫ウイルス、西洋リス（ｗｅｓｔｅｒｎ ｓｑｕｉｒｒｅｌ）線維腫、多くの種のアビポックスウイルスなどのレポリポックスウイルス、タントポックス（Ｔａｎｔｐｏｘ）ウイルス、ヤバポックスウイルスなどのヤタポックスウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、カンガルー類ポックスウイルス、ワニ類ポックスウイルスなどのモラシポックスウイルスが挙げられる。本明細書に記載のＤＮＡワクチンの天然痘に対する高い交差反応性（広範な防御）に加えて、ポックスウイルス間での同一性が高いために、本発明のＤＮＡワクチンが異なるポックスウイルス間での交差防御も提供すると予想される。
【００２９】
投与経路としては、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼球内、および経口、ならびに局所、経皮、吸入もしくは坐薬によるもの、または粘膜組織へのもの（例えば、膣組織、直腸組織、尿道組織、頬組織、および舌下組織の洗浄によるもの）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい投与経路としては、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射、および皮下注射が挙げられる。遺伝子コンストラクトは、従来のシリンジ、無針注射装置、「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子銃」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学法」、もしくは超音波などの他の物理的方法を含むが、これらに限定されない、手段で投与してもよい。
【００３０】
本発明のＤＮＡワクチンの送達を容易にするのに好ましい電気穿孔装置および電気穿孔法の例としては、Ｄｒａｇｈｉａ-Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されているものが挙げられ、これらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許法１１９条（ｅ）項の下、米国仮特許出願第６０／８５２，１４９号（２００６年１０月１７日出願）および同第６０／９７８，９８２号（２００７年１０月１０日出願）に対する恩典を主張する、同時係属かつ共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（２００７年１０月１７日出願）に提供されているＤＮＡワクチンの送達を容易にするための電気穿孔装置および電気穿孔法も好ましく、これらの文献は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
以下は、本発明の好ましい実施形態の一例であり、上で考察した特許参考文献においてより詳細に考察されている。電気穿孔装置は、ユーザによって入力された予め設定された電流と同様の定電流を生じさせるエネルギーパルスを哺乳動物の所望の組織に送達するように構成することができる。電気穿孔装置は、電気穿孔コンポーネントと電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含む。電気穿孔コンポーネントは、制御器、電流波形発生器、電気抵抗試験器、波形自動記録装置、入力素子、状況報告素子、通信ポート、メモリコンポーネント、電源、および電源スイッチを含む様々な電気穿孔装置素子の１つまたは複数を含み、かつ組み入れることができる。電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の１つの素子として機能することができ、他の素子は、電気穿孔コンポーネントと連通している独立した素子（要素）である。いくつかの実施形態では、電気穿孔コンポーネントは、電気穿孔装置の２つ以上の素子として機能し、これは、電気穿孔コンポーネントから離れている電気穿孔装置のさらに他の素子と連通することができる。本発明は、１つの電気機械装置または機械装置の部分として存在する電気穿孔装置の素子によって限定されるものではない。なぜなら、これらの素子は、１つの装置または互いに連通する独立した素子として機能することができるからである。電気穿孔コンポーネントは、所望の組織で定電流を生じさせるエネルギーパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極アセンブリは、複数の電極をある空間的配置で有する電極アレイを含むが、その場合、電極アセンブリは、電気穿孔コンポーネントからのエネルギーパルスを受容し、電極を通してそれを所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達の間、中性であり、所望の組織中の電気抵抗を測定し、この電気抵抗を電気穿孔コンポーネントに伝達する。フィードバック機構は、測定された電気抵抗を受容し、電気穿孔コンポーネントによって送達されるエネルギーパルスを調整して、定電流を維持することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、複数の電極は、分散形式のエネルギーパルスを送達することができる。いくつかの実施形態では、複数の電極は、プログラムされたシーケンス下にある電極の制御を通じて分散形式のエネルギーパルスを送達することができ、プログラムされたシーケンスは、ユーザによって電気穿孔コンポーネントに入力される。いくつかの実施形態では、プログラムされたシーケンスは、順々に送達される複数のパルスを含み、その場合、複数のパルスの各々のパルスは、少なくとも２つの活性電極と、電気抵抗を測定する１つの中性電極とによって送達され、複数のパルスの次のパルスは、少なくとも２つの活性電極のうちの異なる電極と、電気抵抗を測定する１つの中性電極とによって送達される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって行なわれる。好ましくは、フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行なわれる。好ましくは、このフィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に起こるが、好ましくはリアルタイムフィードバックまたは瞬間的なものである（すなわち、応答時間を決定するための利用可能な技術で測定した場合に実質的に瞬間的なものである）。いくつかの実施形態では、中性電極は、所望の組織中の電気抵抗を測定し、この電気抵抗をフィードバック機構に伝達し、このフィードバック機構が電気抵抗に応答し、電気パルスを調整して、予め設定された電流と同様の値で定電流を維持する。いくつかの実施形態では、フィードバック機構は、エネルギーパルスの送達の間、連続的かつ瞬間的に定電流を維持する。
【００３４】
薬学的に許容される賦形剤としては、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤のような機能分子を挙げることができるが、これらは公知であり、かつ公に容易に入手可能である。好ましくは、薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントまたはトランスフェクション促進剤である。いくつかの実施形態では、核酸分子、またはＤＮＡプラスミドは、ポリヌクレオチド機能増強剤または遺伝子ワクチン促進剤（もしくはトランスフェクション促進剤）の投与と併せて細胞に送達される。ポリヌクレオチド機能増強剤は、米国特許出願第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号、および国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号（１９９４年１月２６日出願）に記載されており、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、米国特許出願第０２１，５７９号（１９９４年４月１日出願）に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。トランスフェクション促進剤は、核酸分子との混合物として、核酸分子と併せて投与するか、または核酸分子の投与の前もしくは後に、別々に同時に投与することができる。トランスフェクション促進剤の例としては、界面活性剤（例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ））、フロイント不完全アジュバント、ＬＰＳ類似体（モノホスホリル脂質Ａを含む）、ムラミルペプチド、キノン類似体、ならびに小胞（例えば、スクアレン）およびスクアレンが挙げられるが、ヒアルロン酸も遺伝子コンストラクトと併せて用いて投与してもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡプラスミドワクチンはまた、脂質、ＤＮＡ-リポソーム混合物（例えば、ＷＯ９３２４６４０号参照）としてのリポソーム（レシチンリポソームもしくは当技術分野で公知の他のリポソームを含む）、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子などのトランスフェクション促進剤、または他の公知のトランスフェクション促進剤を含み得る。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリカチオン（ポリ-Ｌ-グルタメート（ＬＧＳ）を含む）、または脂質である。
【００３５】
いくつかの好ましい実施形態では、そのような標的タンパク質に対する免疫応答をさらに増強するタンパク質の遺伝子であるＤＮＡプラスミドは、アジュバントとともに送達される。そのような遺伝子の例は、他のサイトカインおよびリンホカイン、例えば、α-インターフェロン、γ-インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ-ＣＳＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-１０、ＩＬ-１２、ＩＬ-１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＩＬ-１５（シグナル配列を欠失し、かつ任意でＩｇＥ由来のシグナルペプチドを含むＩＬ-１５を含む）をコードする遺伝子である。有用であり得る他の遺伝子としては、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１ｐ、ＩＬ-８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ-セレクチン、Ｐ-セレクチン、Ｅ-セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ-１、ＭａｄＣＡＭ-１、ＬＦＡ-１、ＶＬＡ-１、Ｍａｃ-１、ｐ１５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ-１、ＩＣＡＭ-２、ＩＣＡＭ-３、ＣＤ２、ＬＦＡ-３、Ｍ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ-４、突然変異型ＩＬ-１８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ-７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ-１、ｐ５５、ＷＳＬ-１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ-３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ-Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ-ｊｕｎ、Ｓｐ-１、Ａｐ-１、Ａｐ-２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ-１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ-Ｒ３、ＴＲＡＩＬ-Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能断片をコードする遺伝子が挙げられる。
【００３６】
本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１０マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約２００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約３００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約４００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約５００マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１マイクログラム〜約１ミリグラム、約１０マイクログラム〜約１ミリグラム、約１００マイクログラム〜約１ミリグラム、約２００マイクログラム〜約１ミリグラム、約３００マイクログラム〜約１ミリグラム、約４００マイクログラム〜約１ミリグラム、約５００マイクログラム〜約１ミリグラム、約１００マイクログラム〜約１ミリグラム、約２００マイクログラム〜約１ミリグラム、約３００マイクログラム〜約１ミリグラム、約４００マイクログラム〜約１ミリグラム、または約５００マイクログラム〜約１ミリグラムのＤＮＡ量を含む。好ましくは、ワクチン中に存在するＤＮＡ量は、約１００マイクログラム〜約１ミリグラムである。
【００３７】
本発明によるＤＮＡプラスミドワクチンは、使用すべき投与様式に従って処方される。ＤＮＡプラスミドワクチンが注射可能な組成物である場合、それらは、滅菌されている、および／または発熱物質を含まない、および／または微粒子を含まない。等張処方物が使用されることが好ましい。通常、等張性を得るための添加物としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。場合によっては、リン酸緩衝化生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定化剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。いくつかの実施形態では、血管収縮剤を処方物に添加する。いくつかの実施形態では、長期間にわたって室温または周囲温度で処方物を安定にさせる安定化剤（例えば、ＬＧＳもしくは他のポリカチオンまたはポリアニオン）を処方物に添加する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、コンセンサス天然痘抗原に対する哺乳動物での免疫応答を誘発する方法として、粘膜免疫応答を誘導する方法が挙げられる。そのような方法は、上記のコンセンサス天然痘抗原を含むＤＮＡプラスミドと組み合わせて、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能断片またはそれらの発現可能なコード配列のうちの１つまたは複数を哺乳動物に投与する工程を含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、およびそれらの機能断片のうちの１つまたは複数を、本明細書で提供されるＤＮＡプラスミド天然痘ワクチンの投与の前、投与と同時、または投与の後に、投与し得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびそれらの機能断片からなる群から選択される１つまたは複数のタンパク質をコードする単離された核酸分子を哺乳動物に投与する。
【実施例】
【００３９】
本発明を以下の実施例でさらに説明する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものの、例示のためだけに提示されることが理解されるべきである。上記の考察とこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その精神と範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用法および条件に適合させるために、本発明の様々な変更および修正を行なうことができる。したがって、本明細書に示され、記載されたものに加えた、本発明の様々な修正が、上述の記載から当業者には明白となるであろう。そのような修正もまた、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【００４０】
好ましくは、本明細書に記載の筋肉または皮膚用のＥＰ装置とともに使用されるＤＮＡ処方物は、皮膚への送達に最適な少ない容量、好ましくは少ない注射容量、好ましくは２５〜２００マイクロリットル（μＬ）中に、高いＤＮＡ濃度、好ましくはマイクログラムから数十ミリグラム量のＤＮＡ、および好ましくはミリグラム量のＤＮＡを含む濃度を有する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ処方物は、１ｍｇ／ｍＬ以上などの高いＤＮＡ濃度（ｍｇＤＮＡ／処方物の容量）を有する。より好ましくは、ＤＮＡ処方物は、２００μＬの処方物中にグラム量のＤＮＡを、より好ましくは１００μＬの処方物中にグラム量のＤＮＡを提供するＤＮＡ濃度を有する。
【００４１】
本発明のＥＰ装置とともに使用されるＤＮＡプラスミドは、公知の装置および技術の組合せを用いて処方または製造することができるが、好ましくは、共同所有された、同時係属中の米国仮特許出願である、米国特許出願第６０／９３９，７９２号（２００７年５月２３日出願）に記載されている最適化されたプラスミド製造技術を用いて製造する。いくつかの例では、これらの研究で使用されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で処方することができる。製造技術には、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されているもの（共同所有の特許である米国特許第７，２３８，５２２号（２００７年７月３日発行）に記載されているものを含む）に加えて、当業者によく知られている様々な装置およびプロトコルも含まれるかまたは組み込まれる。本明細書に記載の皮膚用のＥＰ装置および送達技術とともに使用される高濃度のプラスミドは、適度に少ない容量でＩＤ／ＳＣ空間にプラスミドを投与することを可能にし、発現と免疫付与効果とを増強するのに役立つ。それぞれ、米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号という、共同所有の出願および特許は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
方法
適用可能であり、かつ特定の方法が特定の実施例で別途提供されない場合、以下の方法を以下の実施例に利用する。
【００４３】
ＤＮＡ発現コンストラクトのクローニング。ＶＡＣＶ遺伝子、Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒ（ウェスタンリザーブ株由来）を合成オリゴヌクレオチドから化学合成し、ヒトコドンに最適化し、ＤＮＡ配列の５'末端にコザック（Ｋｏｚａｋ）コンセンサス配列とＩｇＥリーダー配列を、ＤＮＡ配列の３'末端にＨＡエピトープタグを含有するように修飾した。各々のこれらの修飾された遺伝子カセットを、従来のクローニング法を用いて、真核生物発現プラスミドである、ＧＥＮＥＡＲＴ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）製のｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。各遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターによって調節される。それぞれ、発現プラスミドｐＧＸ４００１とｐＧＸ４００３を作製するために、Ａ４ＬとＢ５Ｒの合成遺伝子カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位とＸｈｏＩ部位にクローニングした。Ａ３３Ｒ（ｐＧＸ４００４）とＡ５６Ｒ（ｐＧＸ４００５）の発現プラスミドを作製するために、合成遺伝子カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位にクローニングした。ｐＧＸ４００７とｐＧＸ４００８は、Ｈ３ＬとＬ１Ｒの合成遺伝子カセットを、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位にクローニングすることによって調製した。残りのプラスミドである、ｐＧＸ４００２とｐＧＸ４００６は、Ａ２７ＬとＦ９Ｌの合成遺伝子カセットを、それぞれ、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ制限部位とＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ制限部位にクローニングすることによって作製した。クローニング後、抗原は全て、シークエンシングで確認した。
【００４４】
ワクチン調製および免疫付与。プラスミドを高濃度に製造し、米国特許第７，２３８，５２２号でＨｅｂｅｌらによって記載された製造手順を修正して用いて精製した。この方法により、ワクチンの生物薬剤的送達に適した、内毒素を含まない非常に高いプラスミド濃度のプラスミド処方物（≦１０ＥＵ／ｍｇ）が得られた。プラスミド製剤は全て、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した低分子量ポリ-Ｌ-グルタメート（ＬＧＳ、平均ＭＷ１０，９００）を含む滅菌水を用いて１％重量／重量で処方および調製した。全てのプラスミド（ｐＧＸ４００１〜ｐＧＸ４００８）を組み合わせて、ＩＤ用に０．１ｍＬまたはＩＭ投与用に０．５ｍＬの総容量の、１２５μｇの各プラスミドからなる単一のワクチン製剤を作製した。
【００４５】
ケタミンＨＣＬ（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ）を用いて動物に筋肉内麻酔を施した。ワクチンを各大腿部（１回のワクチン接種につき大腿部当たり１つの注射部位）に投与し、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）２０００装置（ヒト使用に有効な装置；ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）を用いるＥＰと組み合わせて、半膜様筋肉内にＩＤまたはＩＭのいずれかで送達した。注射のすぐ後、０．２Ａの定電流、５２ｍｓのパルス長、パルス間隔１秒の２×２回のパルスを皮内投与に適用し、０．５Ａの定電流、５２ｍｓのパルス長、パルス間隔１秒の３回のパルスを静脈内投与に適用した。０、２８、および５６日目に免疫付与を行ない、免疫付与した日に血清を回収して、抗体応答を測定した。
【００４６】
試料回収とＰＢＭＣ単離。ワクチン接種スケジュール中、２週間おきに、および３回曝露した後ごとに、カニクイザルから採血した。ケタミンＨＣＬ（１０〜３０ｍｇ／ｋｇ）を用いて動物に筋肉内麻酔を施した。ＥＤＴＡチューブに血液を回収した。標準的なＦｉｃｏｌｌ-Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離で全血からＰＢＭＣを単離し、完全培養培地（１０％熱非働化ＦＢＳ、１００ＩＵ／ｍｌ ペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および５５μＭ β-メルカプトエタノールを補充した、２ｍＭ Ｌ-グルタミンを含むＲＰＭＩ １６４０）に再懸濁した。
【００４７】
抗原特異的ＥＬＩＳＡ用の抗原の調製。適当な制限酵素部位を含有する遺伝子特異的プライマーを用いてウェスタンリザーブ株のＶＡＣＶから各抗原のオープンリーディングフレームをＰＣＲ増幅し、原核生物発現ベクターのｐＥｔ２１９ａ（＋）（ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）にクローニングした。ｐＥｔ２１ａ（＋）に存在する６×ヒスチジンタグとの融合が可能になるように３'-末端オリゴヌクレオチドを設計した。タンパク質は、標準的なニッケルカラム精製法（Ａｂｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて精製した。
【００４８】
抗原特異的ＥＬＩＳＡ。ＩｇＧ抗体応答を測定するために、ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に、ＰＢＳに希釈した５０ｎｇの精製抗原（Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、またはＬ１Ｒ）をコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡを行なった。４℃で一晩インキュベートした後、プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で洗浄し、次に、３％ＢＳＡを補充したＰＢＳで、室温で１時間ブロッキングした。個々のカニクイザルから回収した血清を、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳに希釈し、希釈血清５０μｌとして、４℃で一晩インキュベートした。ウェルをＰＢＳ-Ｔで洗浄した後、２次抗体のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とインキュベートし、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳに１：１０，０００で希釈した（１００μＬ／ウェル）。ウェルを室温で１時間インキュベートし、洗浄した。製造元の推奨（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従って、ＴＭＢ基質と停止溶液を各ウェルに添加した。
【００４９】
Ｌｕｍｉｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。終点力価は、陰性対照血清の２倍よりも大きい陽性反応性を生じる最大血清希釈の逆数として表す。
【００５０】
ＶＡＣＶ ＥＬＩＳＡ。マイクロタイタープレートに、パラホルムアルデヒド固定し、ショ糖勾配精製したＶＡＣＶ ＷＲ株（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を０．６μｇ／ｍｌの濃度でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを、５％脱脂粉乳を補充したＰＢＳ-Ｔ（ＰＢＳ-ＴＭ）を用いて、３７℃で２時間ブロッキングした。ウェルをＰＢＳ-Ｔで８回洗浄し、サル血清の連続希釈とともに３７℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ウェルを、２次抗体、すなわち、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＫＰＬ）にコンジュゲートしたヤギ抗サルＩｇＧおよびＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）とともにインキュベートした。１００μＬの１０％ＳＤＳを添加して反応を停止させ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｐｌｕｓ ３８４を用いて４０５ｎｍで読み取った。
【００５１】
終点力価は、陰性対照血清の平均光学密度＋３標準偏差よりも大きい陽性反応性を生じる最大血清希釈の逆数として表す。
【００５２】
合成ペプチド。この研究に使用したペプチドは、ＷＲ株のＶＡＣＶのＡ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒのコード領域に由来するものであった。Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒについて、全抗原ペプチドライブラリーを合成した。ペプチドは全て、９アミノ酸（Ａ２７Ｌの場合）、１１アミノ酸（Ａ４Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒの場合）、または６アミノ酸（Ｂ５Ｒの場合）のいずれかだけ重複する１５ｍｅｒであった。Ａ２７ＬライブラリーはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより調製された。他のライブラリーは全て、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により調製された。ライブラリーは、ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度の対応するペプチドプールとして調製された。
【００５３】
ＩＦＮ-γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。非ヒト霊長類ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行なった（Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．Ｄ．ら．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｐｒｉｍａｔｏｌ．３４，２６２-２７０（２００５）参照）。ペプチドを含有するウェルから陰性対照ウェル中のスポットの数を差し引くことによって、抗原特異的応答を測定した。結果は、３通りのウェルについて得られた平均値（スポット／１００万個の脾細胞）として示す。
【００５４】
ＰＢＭＣのカルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）コンジュゲーションおよびフローサイトメトリー解析。細胞をペレット化し、ＰＢＳ中の二酢酸カルボキシフルオレセインスクシニミジルエステル（ＣＦＤＡ-ＳＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（１：２０００希釈）１ｍｌに再懸濁した。細胞を３７℃で１０分間インキュベートした。細胞を完全培地で洗浄し、１×１０６細胞／１００μｌの濃度に再懸濁し、全ペプチドプール１００μｌとともに９６ウェル丸底プレート中にプレーティングした。コンカバリンＡ ５μｇ／ｍｌ（陽性）と完全培地（陰性）とを対照として用いた。培養物を５日間インキュベートした。細胞をまず、生細胞／死細胞マーカーである、Ｖｉｖｉｄ色素バイオレットで、３７℃で１０分間染色した。細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次に、細胞を、抗ヒトＣＤ３-ＡＰＣ Ｃｙ７（クローンＳＰ３４-２）（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と抗ヒトＣＤ４-ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５（クローンＬ２００）と抗ヒトＣＤ８-ＡＰＣ（クローンＳＫ１）を用いて４℃で１時間染色した。次に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１％パラホルムアルデヒドで固定した。ＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を用いてデータを回収した。フローサイトメトリーデータは、ＣＤ３＋リンパ球に対してゲートをかけて、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて解析した。試料１つにつき３万〜５万個のＣＤ３＋リンパ球を回収した。培地差し引き後のデータを示す。免疫前試料中でのバックグラウンド増殖が高かったので、Ａ４に対する増殖応答は評価しなかった。
【００５５】
細胞内サイトカイン染色。抗体試薬：直接コンジュゲート抗体は以下から入手した：ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）：ＩＬ-２（ＰＥ）、ＣＤ３（ＡＰＣ Ｃｙ７）、ＣＤ８（ＡＰＣ）、ＩＦＮ-γ（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００）、ＴＮＦ-α（ＰＥ Ｃｙ７）、ＣＤ９５（ＰＥ Ｃｙ５）、およびＣＤ４（ＰｅｒＣＰ Ｃｙ５．５）。ＣＤ２８（ＥＣＤ）はＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒから入手した。
【００５６】
細胞の刺激と染色。ＰＢＭＣを、完全ＲＰＭＩ中で１×１０６細胞／１００μｌに再懸濁し、１：２００希釈の刺激ペプチドＡ２７ＬおよびＢ５Ｒ １００μｌとともに９６ウェルプレート中にプレーティングした。刺激しない陽性対照（ブドウ球菌腸毒素Ｂ、１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）を各アッセイに含めた。細胞を３７℃で５時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄（ＰＢＳ）し、表面抗体で染色した。細胞を洗浄し、説明書に従って、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて固定した。固定後、細胞をこのｐｅｒｍ緩衝液中で２回洗浄し、細胞内マーカーに対する抗体で染色した。染色後、細胞を洗浄し、固定し（１％パラホルムアルデヒドを含有するＰＢＳ）、解析するまで４℃で保存した。
【００５７】
フローサイトメトリー。細胞を改良型のＬＳＲ ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で解析した。試料１つにつき５万回のＣＤ３＋事象を回収した。ＦｌｏｗＪｏバージョン８．６．３（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）を用いてデータ解析を行なった。最初のゲーティングでは、前方散乱面積（ＦＳＣ-Ａ）対高さ（ＦＳＣ-Ｈ）プロットを用いて、ダブレットを取り除いた。これらの事象に、ＦＳＣ-Ａ対ＳＳＣプロットにより、リンパ球ゲートをかけた。生きたＴ細胞は、生／死対ＣＤ３＋プロットにより同定した。この後、事象に、ＣＤ８＋事象対ＩＦＮ-γとＣＤ４-事象対ＩＦＮ-γとで順次ゲートをかけて、下方調節を明らかにした。ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定した後、最適に分離する組合せを用いるそれぞれの関数の各々についてゲートを作成した。各々の関数についてのゲートを作成した後、本発明者らは、ブーリアンゲートプラットフォームを用いて、４つの関数を試験したときの１５の応答パターンに等しい、可能な組合せの完全なアレイを作成した。データはバックグラウンド補正後に報告される。免疫前応答が高かったので、１匹のｐＶＡＸ１動物（＃４３８４）についての応答は解析に含めなかった。
【００５８】
ウイルスの繁殖と調製。ザイール株、Ｖ７９-Ｉ-００５（サル痘ウイルスマスターシードＮＲ-５２３）のサル痘ウイルスは、米国立衛生研究所の生体防御および新興感染症研究資源レポジトリ（Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から入手した。このザイール株は、もともと、１９７９年にザイール出身の致死感染を受けたヒトから入手された（米国疾病対策予防センターにある天然痘および他のポックスウイルス感染症に関するＷＨＯ指定研究協力センター（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌｐｏｘ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｐｏｘｖｉｒｕｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ）により単離された）。このウイルスをニワトリ胚線維芽細胞内で継代することによって摂取材料を調製し、標準的なショ糖勾配による沈降によって精製した。これをニワトリ胚線維芽細胞内で繁殖させて、精製した。
【００５９】
サル痘ウイルス曝露。最後のワクチン接種から４週間後（９１日目）に、本明細書に記載の通りにカニクイザルに麻酔をかけ、２×１０７ＰＦＵのサル痘ウイルスＮＲ-５２３を、２３ゲージのバタフライ針を用いて伏在静脈に筋肉内注入した。実際に送達された用量を確認するために、標準的なプラークアッセイ技術を用いて、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞に対して、曝露用摂取材料の事後力価測定（ｂａｃｋ-ｔｉｔｔｅｒ）を行なった。
【００６０】
サル痘ウイルスゲノム検出のためのリアルタイムＰＣＲ。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて凍結血液試料からＤＮＡを抽出した。定量的汎オルトポックスＨＡ ＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）についての製造元の指示書に従ってリアルタイムＰＣＲを準備したが、これは、ヘマグルチニン遺伝子増幅用の以下のプライマー：ＯＰＨＡ Ｆ８９：５'-ＡＴＧＴＡＣＴＡＴＣＴＣＡＡＣＧＴＡＧＴＡＧ-３'（配列番号１７）と、ＯＰＨＡ Ｒ２１９：５'-ＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＴＡＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＴＡＴＧ-３'（配列番号１８）とからなっていた。ＴａｑＭａｎプローブ（ＯＰＨＡ Ｐ１４３Ｓ-ＭＧＢ：６ＦＡＭ ＡＧＴＧＣＴＴＧＧＴＡＴＡＡＧＧＡＧ ＭＧＢＮＦＱ（配列番号１９および配列番号２０））は５'末端でＦＡＭ標識されており、非蛍光性クエンチャーを含んでいた。ウイルスゲノムのコピーを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ １．５（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行なった。
【００６１】
ＶＡＣＶ中和抗体の測定。サル由来の血清を試験の継続期間を通じて回収し、熱で非働化し（５６℃、３０分間）、古典的なプラーク減少中和試験を用いて、ＶＡＣＶ中和抗体の存在について評価した。各アッセイには、ＦＤＡの生物学的製剤評価研究センターで確認されたＦＤＡ標準参照ワクシニアＩｇ（Ｃａｎｇｅｎｅ）が陽性対照として含まれた。陰性対照には、ワクチン接種を受けていないサル由来の血清が含まれた。１〜４つの血清連続希釈を完全培養培地中に調製し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（１００％コンフルエント）入りの２４ウェルプレートに３つ１組で添加した。４．５×１０５ＰＦＵのザイール７９株を２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。事前に温めたメチルセルロースの半固体オーバーレイ（等容量の４％ＭＥＭ（４％ＦＢＳ、４ｍＭ Ｌ-グルタミン、および１％メチルセルロースが添加されている）から構成されたもの）５００μＬを各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で、７２時間インキュベートした。細胞単層を２５０μＬの０．１％クリスタルバイオレット染色溶液（２０％メタノール中に調製）で染色した。
【００６２】
プラークを計数し、抗体が存在しないときのプラーク数と比較した中和パーセントを算出した。力価は、プラーク数の５０％低下をもたらす最大希釈の逆数を表す。
【００６３】
全血算値の解析。ＨｅｖａＶｅｔ ９５０ ＦＳ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、全血算値（ＣＢＣ）を測定した。ＣＢＣは、ワクチン接種期間中の各採血時点と、０、６、１２、２１、および２７日目の曝露時に行なった。血液学的パラメータには、以下のものが含まれた：ヘマトクリット値、ヘモグロビン数、全白血球数、および各種白血球数（好中球、リンパ球、単球、好酸球、および好塩基球）、血小板数、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球およびヘモグロビン濃度。
【００６４】
統計解析。言及されている場合、スチューデントの対応のあるｔ検定を比較に用いた。データを平均±標準誤差として表し、Ｐ＜０．０５（両側Ｔ検定）を統計的有意とみなした。スピアマン順位相関（ノンパラメトリック）検定を用いて、中和抗体力価（ＰＲＮＴアッセイで測定）と病変数の相関を評価した。
【００６５】
実施例１
天然痘抗原を発現するプラスミドのクローニング、インビトロ発現、および製造
各遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ）により、オリゴヌクレオチドから合成で構築され、調製された。これらのオリゴヌクレオチドを、ワクシニアウイルス・ウェスタンリザーブ（ＷＲ）株からコドン最適化し、標準的なクローニング法を用いて、ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングした。それぞれ、Ａ４ＬとＢ５Ｒについて最適化された遺伝子をコードするＤＮＡワクチンプラスミドである、ｐＧＸ４００１とｐＧＸ４００３は、合成で構築された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＸｈｏＩ制限部位にクローニングすることによって調製された。ｐＧＸ４００４（Ａ３３Ｒをコードする）とｐＧＸ４００５（Ａ５６Ｒをコードする）は、ＤＮＡ断片をＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位にクローニングすることによって調製された。ｐＧＸ４００７とｐＧＸ４００８は、それぞれ、Ｈ３ＬとＬ１ＲをコードするＤＮＡ断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位にクローニングすることによって調製された。Ｆ９Ｌをコードするプラスミド（ｐＧＸ４００６）とＡ２７Ｌをコードするプラスミド（ｐＧＸ４００２）については、ＤＮＡ断片を、それぞれ、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ制限部位とＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ制限部位にクローニングした。より効率的なタンパク質発現を可能にするために、コザックコンセンサス配列とＩｇＥリーダー配列を各遺伝子の５'末端に付加した。さらに、局在解析と発現解析を助けるために、ＨＡエピトープタグを遺伝子の３'末端に付加した。
【００６６】
クローニングした後、全ての抗原をシークエンシングで確認し、挿入物の発現について試験した。その後、部分的に、米国特許第７，２３８，５２２号でＨｅｂｅｌらによって記載された製造手順を修正して用いてプラスミドを製造し、それによって、ワクチンの生物薬剤的送達に適した、非常に高いプラスミド濃度のプラスミド処方物が得られた（目的の例については図１を参照）。この方法を用いて、ＶＡＣＶ抗原Ａ４Ｌ、Ａ２７、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒから構成される天然痘多価ＤＮＡワクチンを製造した。製品は高純度で、ＲＮＡ、タンパク質、および内毒素が検出されず、-８０℃で１年以上保存した後に、平均濃度が１０．７±０．７ｍｇ／ｍＬで、スーパコイル状のパーセンテージが９４．５±１．１％であることが示された（データは示さない）。ワクチン製剤中の各抗原は、マウスまたはウサギにおいて強力な抗体免疫応答と細胞性免疫応答の両方を誘発した（データは示さない）。
【００６７】
天然痘抗原をコードするプラスミドのうちのいくつかも示す（図２〜９）。
【表１】
【００６８】
本明細書に記載の全ての実験において、Ｄｒａｇｈｉａ-Ａｋｌｉ Ｒ，Ｋｈａｎ ＡＳ，Ｐｏｐｅ ＭＡ，Ｂｒｏｗｎ ＰＡ．Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｎｄ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；９：３２９-３８（２００５）に以前に記載されているように、内毒素を含まないプラスミド製剤を滅菌水に希釈し、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した低分子量ポリ-Ｌ-グルタメート（ＬＧＳ、平均ＭＷ１０，９００）を用いて１％重量／重量で処方した。
【００６９】
こうしたプラスミドに基づく治療が効果的にヒトに移されるためには、より大量のプラスミドを少ない処方容量（古典的なワクチンの処方容量と同様の容量）で有することが好ましい。さらに、導入遺伝子産物は、標的器官から効率的に分泌されるべきであり、また、検出可能でかつ活性があるべきである。
【００７０】
実施例２
プラスミドの投与と電気穿孔
微小電極（ｍＥＰ）が滅菌可能な使い捨てのプラスチックアレイに取り付けられた、ＩＤ適用のための定電流電気穿孔装置（ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）、ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）が開発されたが、このアレイは、（交差汚染を防ぐために）患者の皮膚に実際に接触する唯一のコンポーネントである。少ない容量（古典的なワクチンの容量と同様の容量、すなわち、５０〜３００μＬ、より好ましくは５０〜１００μＬまたは１００〜２００μＬ）の濃縮された高純度ワクチン処方物を選択領域、標的領域に送達した後、この標的領域をマイクロアレイで囲む。微小電極を皮膚に挿入する。プラスチックアレイは、皮膚に挿入された微小電極の周りの圧力を均一にし、これにより、標的領域でのＥＰプロセスの間、電場を均一にすることができる。
【００７１】
実施例３
天然痘発現コンストラクトを用いたウサギへの免疫付与
予備実験において、上記実施例１のプラスミドワクチンによって送達される天然痘抗原に対する免疫応答とインビボでの定電流電気穿孔とをウサギの群（ｎ＝３／群）で解析した（図１０の時系列参照）。ウサギには餌と水を自由に摂らせ、ＩＵＣＵＣ標準とＳｔｉｌｌｍｅａｄｏｗ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｇａｒｌａｎｄ，ＴＸ）での慣例に従って飼育した。ＤＮＡワクチン投与の前に、注射部位の毛を剃り、徹底的に洗浄して、余分な毛や残屑を除去した。ＤＮＡワクチン接種の日に、ウサギの体重を量り、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、採血し、治療の継続期間中、イソフロウラン（ｉｓｏｆｌｏｕｒａｎｅ）（２％）を維持した。
【００７２】
８００μｇの単回筋肉内（ＩＭ）注射（注射１回につき１００μｇの各抗原および／または最大８００μｇの空ベクター）により、プラスミドを以下の組合せで投与した。すなわち、第１群のウサギは、様々な天然痘抗原（Ａ１３Ｌ、Ａ１４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｌ１Ｒ）を発現する８つのプラスミドの組合せで免疫付与し、第２群のウサギは、４つの異なる抗原（Ａ２７Ｌ、Ｂ５Ｒ、Ｄ８Ｌ、Ｌ１Ｒ）の組合せで免疫付与し、第３群のウサギは、単一の抗原（Ｂ５Ｒ）を発現する個々のプラスミドで免疫付与した。プラスミドは全て、半膜様筋肉内に投与し、次いで、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置（ＶＧＸ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ，ＰＡ）を用いて、０．６Ａｍｐ、パルス３回、５２ｍｓ／パルス、パルス間隔１秒で、電気穿孔した。様々な時点でウサギから血清を回収し、タンパク質ＥＬＩＳＡで抗体応答を測定するために使用した。
【００７３】
抗体応答は、送達された抗原の数に関係なく、電気穿孔によって両方の免疫付与群で向上した。様々な抗原、すなわち、Ｂ５Ｒ（図１１）、Ｈ３Ｌ（図１２）、Ａ２７Ｌ（図１３）、Ｌ１Ｒ（図１４）に対する液性応答もＥＬＩＳｐｏｔで測定した。各群（ｎ＝３）の動物由来の血清をプールし、１：５０に希釈した。第１群と第２群由来の血清は、Ａ２７ＬとＬ１Ｒに対する有意な応答を示し（＊第３群と比較してｐ＜０．０５）、単一のワクチンに対する免疫応答は、これらの抗原が４つの抗原または８つの抗原のいずれかの群で投与された場合にも、影響を受けなかった。
【００７４】
実施例４
天然痘発現コンストラクトを用いた非ヒト霊長類への免疫付与
ＤＮＡ注射と、その後の電気穿孔（ＥＰ）によって、有意に高い免疫応答が誘発されるかどうかを調べるために、最初の予備的研究を少数のカニクイザル（６匹の動物）で実施した。実験は、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）装置を用いて行なった。２匹のサルの群（ｎ＝２／群）に、ウイルス抗原、すなわち、最適化されたＡ４Ｌ（すなわち、Ａ４Ｌｏｐｔ）、Ａ２７Ｌｏｐｔ、およびＢ５Ｒｏｐｔ（上記実施例１のプラスミド参照）をコードする漸増用量のプラスミドを筋肉内（ＩＭ）注射した。
【００７５】
０、２８、および５６日目に、動物に、それぞれ（０．５ｍＬ滅菌水＋０．０１ｍｇ／ｍＬ ＬＧＳ中）０．０３、０．１、および０．３ｍｇの各プラスミドを、無傷の皮膚を通して半膜様筋肉内に注射し、その後、０．６Ａｍｐ、パルス長５２ｍｓｅｃ、パルス間隔１秒という条件下で電気穿孔した。８４日目に、全ての動物にタンパク質追加免疫を与え、ベースラインでの細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答と、２８、５６、８４、および１１２日目でのＣＴＬ応答を測定した（図１６）。図１６に示すように、最初の免疫付与から２週間後のＥＬＩＳｐｏｔの結果から、ＩＭ注射と電気穿孔を受けた群は、ＩＭ注射のみを受けた群よりも、平均で２．５倍多いインターフェロン-γ（ＩＦＮγ）産生細胞を有することが示された。
【００７６】
実施例５
動物で生じる抗体応答のレベルにより測定されるような併用ワクチンの有効性を明らかにするために、いくつかの異なるワクシニアウイルス抗原からなる併用ワクチンを評価した。さらに、皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかへの送達を比較して、ＤＮＡ送達方法を有効性について評価した。ＤＮＡは、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）定電流装置を用いて送達した。
【００７７】
動物：ＥＬＩＳＡを用いて、ニュージーランド白ウサギ（１群当たりｎ＝３〜４）の抗体免疫応答を評価した。ウサギには餌と水を自由に摂らせ、ＩＵＣＵＣ標準とＳｔｉｌｌｍｅａｄｏｗ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｇａｒｌａｎｄ，ＴＸ）での慣例に従って飼育した。ＤＮＡワクチン投与の前に、注射部位の毛を剃り、徹底的に洗浄して、余分な毛や残屑を除去した。
【００７８】
ＤＮＡワクチン接種の日に、ウサギの体重を量り、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、採血し、治療の継続期間中、イソフロウラン（２％）を維持した。様々なワクシニアウイルス抗原をコードするプラスミドを含むＤＮＡワクチンを（０、２１、および３５日目に）皮内（ＩＤ）（１００μｌ）または筋肉内（ＩＭ）（５００μｌもしくは１０００μｌ）のいずれかに投与したが、各ワクチンは、ウサギ１羽当たり合計１ｍｇのプラスミド総量（抗原１つ当たり２５０μｇ）からなっていた。ワクチン処方物中で利用されたプラスミド組合せは、インフルエンザＨ５ヘマグルチニン発現プラスミド（Ｈ５ＨＡ）（アッセイの陽性対照として使用）と、３つのワクシニアウイルス抗原（Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、およびＢ５Ｒ；上記実施例１参照）の組合せとからなっていた。各ＤＮＡワクチン処方物は、１％ＬＧＳ中に調製された。
【００７９】
ＤＮＡワクチンは全て、半膜様筋肉内に投与し、次いで、図１８に示すような種々の電気穿孔条件を用いて、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）定電流装置を用いて電気穿孔した。Ａ群〜Ｄ群には１００μｌのＩＤ注射を受けさせ、０．２Ａｍｐで電気穿孔し、２回のパルス（Ａ群）、３回のパルス（Ｂ群）、４回のパルス（Ｃ群）、６回のパルス（Ｄ群）を与えた。Ｅ群にはＩＤ注射を与えたが、電気穿孔は与えなかった。Ｆ群、Ｇ群、およびＩ群には、５００μｌのＤＮＡワクチン処方物を筋肉内（ＩＭ）投与し、０．５Ａｍｐで電気穿孔し、３回のパルスを与えたが、各々のパルスは、それぞれ、８０秒、４秒、４秒、および１０〜１５秒の遅延期間からなっていた。Ｊ群には電気穿孔を与えなかった（ＩＭ、５００μｌ）。Ｈ群には、１０００μｌの筋肉内注射を与え、電気穿孔条件は、０．５Ａｍｐ、遅延４秒、およびパルス３回からなっていた。ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）定電流装置は、５２ｍｓ／パルス、パルス間隔１秒で送達するようにプログラムされた。様々な時点でウサギから血清を回収し、ＥＬＩＳＡで抗体応答を測定するために使用した（図１９〜２１の結果を参照のこと）。
【００８０】
実施例６
ＥＬＩＳＡを用いて、８〜９週齢のニュージーランド白ウサギ（１群当たりｎ＝４）を抗体免疫応答について評価した。ウサギには餌と水を自由に摂らせ、ＩＵＣＵＣ標準とＳｔｉｌｌｍｅａｄｏｗ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｇａｒｌａｎｄ，ＴＸ）での慣例に従って飼育した。ＤＮＡワクチン投与の前に、注射部位の毛を剃り、徹底的に洗浄して、余分な毛や残屑を除去した。ＤＮＡワクチン接種の日に、ウサギの体重を量り、ケタミン／キシラジンで麻酔をかけ、採血し、治療の継続期間中、イソフロウラン（２％）を維持した。
【００８１】
様々なワクシニアウイルス抗原（上記実施例１を参照）をコードするプラスミドは、（０、２１、４２、および８４日目に）皮内（ＩＤ）または筋肉内（ＩＭ）のいずれかに、それぞれ、１００μｌおよび５００μｌの容量で投与されたが、これらのプラスミドはウサギ１羽当たり１ｍｇのプラスミド総量（注射１回当たり、抗原１つにつき１２５μｇおよび／または最大１ｍｇの空ベクター）からなっていた。図２２と図２３には、ワクチン接種スケジュールとワクチン摂取パラメータが詳細に示されている。以下の組合せを用いて、電気穿孔を行なった（Ａ群〜Ｊ群）。Ａ群とＦ群のウサギは、単一の抗原（Ｂ５Ｒ）抗原を発現する個々のプラスミドで免疫付与した。Ｂ群とＧ群のウサギは、４つの異なる抗原（Ａ２７Ｌ、Ｂ５Ｒ、Ｈ３Ｌ、Ｌ１Ｒ）の組合せで免疫付与した。Ｃ群とＨ群は、様々な抗原（Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、Ｌ１Ｒ）を発現する８つのプラスミドの組合せからなっていた。Ｄ群とＩ群は、抗体応答の陰性対照としての役割を果たし、空ベクター、ｐＶＡＸ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で免疫付与した。Ｅ群とＪ群は、同じ組合せの８つの抗原を用いてワクチン接種したが、電気穿孔しなかった。各抗原処方物は、１％ＬＧＳ中に調製された。
【００８２】
プラスミドは全て、半膜様筋肉内に投与し、次いで、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（登録商標）定電流装置を用いて、ＩＭ注射については、０．５Ａｍｐ、パルス３回、５２ｍｓ／パルス、パルス間隔１秒で、およびＩＤ注射については、０．２Ａｍｐ、パルス４回、５２ｍｓ／パルス、パルス間隔１秒で電気穿孔した（第５群以外）。様々な時点でウサギから血清を回収し、タンパク質ＥＬＩＳＡで抗体応答を測定するために使用した（図２４〜３３）。
【００８３】
ＥＬＩＳＡ抗原調製：ＥＬＩＳＡ用の抗原は、Ａｂｇｅｎｔ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）により調製された。クローニング用の適当な制限部位を含有する遺伝子特異的プライマーを用いて、遺伝子をコードするＯＲＦをＰＣＲ増幅した。原核生物発現ベクターのｐＥｔ２１ａ（＋）に存在する６×ヒスチジンタグとの融合が可能になるように３'-末端オリゴヌクレオチドを設計した。タンパク質は、標準的なニッケルカラム精製法を用いて精製した。
【００８４】
ＥＬＩＳＡアッセイ：ＩｇＧ応答を測定するために、ＭａｘｉＳｏｒｐ Ｉｍｍｕｎｏ ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）に、ＰＢＳに希釈した５０ｎｇの抗原（Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｈ３Ｌ、またはＬ１Ｒ）をコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡアッセイを行ない、４℃で一晩インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ（ＰＢＳ-Ｔ）で洗浄した後、プレートを、３％ＢＳＡを補充したＰＢＳでブロッキングし、室温で１時間インキュベートした。ウサギ血清を、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳに希釈し、４℃で一晩インキュベートした（５０μｌ）。ＰＢＳ-Ｔで洗浄した後、ウェルを、２次抗体のＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とインキュベートし、０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳに１／１０，０００に希釈した（１００μＬ／ウェル）。ウェルを室温で１時間インキュベートし、適宜洗浄した。製造元の推奨（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に従って、ＴＭＢ基質と停止溶液を各ウェルに添加した。Ｌｕｍｉｓｔａｒ Ｇａｌａｘｙプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いて吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【００８５】
ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ：ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ（商標）-ＩＰ ９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に、ＰＢＳ中で１：１００に希釈したサルＩＦＮ-γ（ＧＺ-４）に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄した後、プレートを、完全培養培地（１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ １６４０）で、室温で２時間ブロッキングした。ＰＢＭＣを、入力細胞数を２×１０５細胞にして、１００μｌの完全培養培地中に３つ１組で添加した。ペプチドを、最終濃度２５μｇ／ｍｌで完全培養培地中に希釈し、希釈液１００μｌをウェル毎に添加した。コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ、５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を陽性対照として使用し、完全培養培地のみに再懸濁した細胞は陰性対照としての役割を果たした。３７℃で２４時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、次いで、ＰＢＳ中で１０００倍に希釈した、１００μｌ／ウェルのサルＩＮＦ-γに対するビオチン化検出ｍＡｂ（７-Ｂ６-１）とともに４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄し、ＰＢＳ中で１：１０００に希釈した、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲートを添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、ウェルを洗浄し、１００μｌの基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ，Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）をウェル毎に添加した。室温で１０分後、水道水で数回洗浄することにより呈色反応を停止させた。プレートを風乾させ、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ（登録商標）ソフトウェアが入った自動ＥＬＩＳｐｏｔリーダーシステム（ＣＴＬ ａｎａｌｙｚｅｒｓ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）を用いて、スポットを計数した。３つ１組のウェルから得たスポットの平均数を、脾細胞１×１０６個に合わせた。ＥＬＩＳｐｏｔデータは、平均＋標準偏差として表す。
【００８６】
対照培地ウェルで形成されたスポットを、刺激に使用した対応するペプチドに応答して形成されたスポットの数から差し引いた後に、抗原特異的ＩＦＮ-γ応答を算出した。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、ＣＤ８除去ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＣＤ８＋リンパ球をＰＢＭＣから除去した後にも行なった。
【００８７】
実施例７
ウサギに高濃度の多価ＤＮＡワクチンを皮内接種するための電気穿孔条件の最適化
ＥＰ条件の最適化は、タンパク質発現のための重要な要素である。ＥＰ条件を最適化するための実験を、高濃度併用ワクチンを用いてウサギで実施した。検討したＥＰ条件を表２に示す。
【表２】
【００８８】
動物に、様々なＩＤ-ＥＰパラメータの下で、陽性対照インフルエンザＨ５ヘマグルチニン発現プラスミド（ＨＡ）（Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．ら．Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ ｖｉａ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ＤＮＡ ａｎｔｉｇｅｎｓ．ＰＬｏＳ．ＯＮＥ．３，ｅ２５１７（２００８））と、Ｂ５Ｒ、Ａ２７Ｌ、およびＡ４Ｌの組合せとをワクチン接種した。結果は、２×２回の皮内ＥＰパルスパターンによってより良好な応答が得られ、ヘマグルチニン阻害（ＨＩ）と２つの天然痘抗原の力価とが最も強力となることを示した。第３の天然痘抗原は、３回のパルスパターンでより良好な結果をもたらした。「多数決原理」の基準を用いて、２×２回のＥＰパルス条件を次の非ヒト霊長類研究に利用した。
【００８９】
実施例８
非ヒト霊長類における多価ワクチンの接種
ＤＮＡ多価ワクチンは強力な抗体応答を誘発する
カニクイザルは、Ｔｈｒｅｅ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｅｒｋａｓｉｅ，ＰＡ）から購入し、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）によって飼育および管理された。合計２４匹のサル（雌１４匹と雄１０匹）を１匹ずつケージで飼育し、体重と性別の類似性に基づいて各群に割り当てた。サルは全て、ＳＩＶ、ＳＴＬＶ、ＳＲＶ、およびＨＢＶの検査で陰性と出た。受け取った後すぐに、全ての動物を隔離し、研究室に馴化させた。隔離と研究の間、サルにＴｅｋｌａｄ ２０５０Ｃ Ｄｉｅｔを与えた。餌は、約ひとすくいの量の餌（ビスケット６〜１０枚）で１日に２回与えた。実験デザインは、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＩＡＣＵＣが示したガイドラインである、ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ，第７版（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ；Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ；１９９６）と、米農務省が動物福祉法を通じて示したガイドライン（公法９９〜１９８）とに準拠するものであった。
【００９０】
４つのカニクイザルの群を、免疫付与ごとに１か月おいて、８つのＶＡＣＶウェスタンリザーブ株遺伝子：Ａ４Ｌ、Ａ２７Ｌ、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、Ｂ５Ｒ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、およびＬ１Ｒから構成された多価ＤＮＡワクチンで３回免疫付与した。１つの群（ｎ＝６）には、皮内（ＩＤ）経路で高用量（ＨＤ）のＤＮＡ（２５０μｇ／抗原）を与え、一方、別の群（ｎ＝６）には、同じ経路で低用量（ＬＤ）のＤＮＡ（１２５μｇ／抗原）を与えた。さらに、２つのサルの群（ｎ＝４）を、筋肉内（ＩＭ）経路で、高用量または低用量のいずれかのワクチンで免疫付与した。ｐＶＡＸ１で免疫付与した動物の群（ｎ＝４）を陰性対照として使用した。３回目の免疫付与の１か月後、動物を、致死用量のザイール７９株のサル痘ウイルス（静脈内送達で２×１０７ＰＦＵを導入）に曝露させた。
【００９１】
ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、多価ＤＮＡワクチン製剤中の各抗原に対する抗体特異的応答を評価した（表３ａ）。表３のグラフによる表示は、図３４ａに示す棒グラフに見ることができる。
【表３ａ】
ＥＬＩＳＡで測定された各抗原についての平均光学密度測定値（４５０ｎｍ）を標準誤差とともに示す。抗体応答は７０日目に測定した。
＊は、それぞれの処置群とｐＶＡＸ１の間の統計的有意性、Ｐ＜０．０５（分散が等しい両側Ｔ検定）を示す。
＊＊は、ｐＶＡＸ１光学密度値を超える増加倍数を示す。
【００９２】
最後のワクチン接種の２週間後の抗体応答を示す。多価ワクチン中の抗原は全て、ワクチン接種の投薬量と経路に関係なく、様々な程度に抗体応答を誘発した（表３ａ）。用量効果は、ＩＤ高用量（ＨＤ、２５０μｇ／プラスミド）の抗原について観察され、ほとんどの場合、低用量（ＬＤ、１２５μｇ／プラスミド）ワクチンよりも良い成績を収めた。ＩＭワクチン接種について、抗原特異的応答は両方の用量で観察され、用量効果はなかった。応答の観点からは、ＨＤワクチンの場合、同等であったＢ５Ｒを例外として、ＩＤ経路の送達の方がＩＭ送達よりもうまく行った。ＩＤ-ＨＤ経路の送達について、本発明者らは、１４倍（Ａ２７ＬおよびＡ３３Ｒ）ならびに９倍（Ｈ３Ｌ）の抗体応答誘導を観察した。ＩＭ-ＨＤ経路を用いた場合、本発明者らは、Ａ２７ＬおよびＡ３３Ｒの対照に対して、それぞれ、１０．６倍および１３．３倍の応答の増加を観察した。
【００９３】
さらに、抗原特異的抗体力価を測定した。多価ワクチン中のほとんどの抗原は、ワクチン接種の投薬量と経路に関係なく、様々な程度に抗体応答を誘発した。下記、表３ｂの結果を参照されたい。
【表３ｂ】
【００９４】
用量効果は、ＩＤ-ＨＤの抗原について観察され、ほとんどの場合、ＩＤ-ＬＤワクチンよりも良い成績を収めた。ＩＭワクチン接種について、抗原特異的応答は両方の用量で観察され、用量効果はなかった。応答の観点からは、ＨＤワクチンの場合、ＩＤ経路の送達の方がＩＭ送達よりもうまく行った。免疫付与群は全て、Ｌ１に対する抗体応答をそれほど示さなかった。
【００９５】
Ｂ．非ヒト霊長類における細胞介在性免疫の誘導
多価ワクチンによって誘導される細胞性免疫応答も評価した（図３４ｂ）。ＩＤ-ＥＰについては、ＬＤとＨＤの間にわずかな応答レベルの差しか見られなかったが、ＩＭ-ＥＰワクチン接種後に、はるかにより顕著な投薬量効果が観察された。ＩＤ注射とＩＭ注射の両方の後に、全体の細胞性免疫が顕著に増加し、２回目と３回目のワクチン接種ＨＤ注射後に強力な免疫応答が観察された（図３４ｂ）。ＩＤ-ＨＤ送達については増強効果が観察され、細胞性応答が全体で８倍増加した（１０６ＳＦＵ当たり６８７±３１．５対５６７５±５３８．１、Ｐ＜０．０３）。同様の効果がＩＭ-ＨＤ送達について観察された。本発明者らは、最初のＩＭ-ＨＤワクチン接種と２回目または３回目のＩＭ-ＨＤワクチン接種の間に、３倍の細胞性応答の増加を観察した（１０６ＳＦＵ当たり、それぞれ、２３８８±１９９対８０２８±７１９または２３８８±１９９対７０９８±５８７、Ｐ＜０．０２）。
【００９６】
Ｃ．Ｔ細胞機能と増殖の結果
いくつかのＴ細胞機能を、ＩＦＮγ、ＩＬ-２、およびＴＮＦα産生、ならびに脱顆粒化の代用マーカーとしてのＣＤ１０７ａを含む、細胞内サイトカイン染色によって評価した。費用と試料制限に基づいて、Ａ２７とＢ５の２つの抗原に対する機能的Ｔ細胞応答を解析した。Ａ２７とＢ５に対する機能的応答の全体的な大きさは、ＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントよりもＣＤ４＋Ｔ細胞コンパートメントで高かった。ＩＤ-ＨＤ群はＣＤ４＋Ｔ細胞応答が最大で、平均の大きさが０．３±０．０６％であり、全ての動物が２つの抗原のうちの少なくとも１つに応答した（図３９ａ）。ＩＭで免疫付与した動物は、平均の応答がより低かったが、高用量群と低用量群の間の応答に有意差はなかった（それぞれ、０．２±０．０８％および０．２±０．１％）。ＩＤ-ＬＤ群は、ＣＤ４＋応答が最も低かった（０．１３±０．０３％）。ＣＤ４＋応答とは対照的に、Ａ２７とＢ５に対するＣＤ８＋応答の大きさは、わずかにより低かった（図３９ｂ）。ＩＭ-ＬＤ群は、ＩＤ-ＨＤ群よりもわずかに高い応答を有した（それぞれ、０．１８±０．０８％および０．１５±０．０４％）。ＩＤ-ＬＤとＩＭ-ＨＤは両方とも、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が中程度であった（それぞれ、０．０７±０．０２％および０．０８±０．０５％）。
【００９７】
ブーリアンゲーティング（Ｂｏｏｌｅａｎ ｇａｔｉｎｇ）を用いて、本発明者らは、細胞性応答の多機能性を調べた。一般に、応答動物は、ＣＤ１０７ａが主な機能となって、単機能性応答を示し、ＩＭ-ＬＤ群の動物１匹のみが、Ｂ５に対する３機能のＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を示した（データは示さない）。
【００９８】
細胞性免疫応答の別のパラメータは、ワクチン誘導性Ｔ細胞応答の増殖能である。３回目の免疫付与の後、ＰＢＭＣを単離し、エクスビボで刺激し、その後、ＣＦＳＥ希釈によって増殖を評価した。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖はＩＤ-ＨＤ群で最も高かった（１０．２±６．２％）（図４０ａ）。ＩＤ-ＬＤ群とＩＭ-ＨＤ群は、（それぞれ、１．７±０．６７％および１．４±１．１％）という低いＣＤ４＋Ｔ細胞応答を有した。ＩＭ-ＬＤはバックグラウンドよりも高い応答を有さなかった。同様の結果はＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントで見られ、ＩＤ-ＨＤ群の応答が最も高かった（６．７±５．４％）（図４０ｂ）。ＩＤ-ＬＤ群、ＩＭ-ＨＤ群、およびＩＭ-ＬＤ群は、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖のレベルが似ていた（それぞれ、１．６±０．６９％、１．９±１．１％、および１．８±１．６％）。
【００９９】
ＥＬＩＳｐｏｔによる強いＩＦＮγ応答が非ヒト霊長類研究で観察されたが、ＩＭで免疫付与した群は、ＩＤで免疫付与した群よりも高い総ＩＦＮγ応答を示した。また、ＩＤ-ＨＤ群は、他の免疫付与群と比較して、より良好なＣＤ４＋Ｔ細胞増殖とＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を示した。Ａ２７とＢ５に対するワクチン誘導性免疫応答の多機能性解析は、ＩＤ-ＨＤワクチン接種によって誘導されるより高い全体のＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示したのに対し、ＩＭ-ＬＤワクチン接種は、ＣＤ８＋Ｔ細胞コンパートメントでのより高い応答を生じさせた。しかしながら、免疫付与の経路または用量に関係なく、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞は両方とも、主に単機能性であり、殺傷表現型と関連している可能性があった。（当技術分野で報告されているような）ＨＩＶ抗原のＩＭ電気穿孔の経験に基づいて、Ａ２７とＢ５に対する４機能の応答を示した動物はなかったが、本研究で観察されたワクチン誘導性免疫応答の機能プロファイルは、抗原特異的現象である可能性が最も高い。
【０１００】
実施例９
曝露：ワクチン接種を受けた非ヒト霊長類とサル痘ザイール７９による曝露
Ａ．多価ＤＮＡワクチンは非ヒト霊長類を重度のサル痘疾患から防御する
応答の有効性を十分に評価するために、動物をザイール７９株のサル痘ウイルスのＮＲ-５２３分離株に曝露させた。投与経路に関係なく、多価ワクチンによって防御がもたらされた（表４）。
【表４】
ＴＮＴＣ＝多過ぎて計数不能、ＲＥ＝記録エラー。＊１５日目の４３８９の写真を再検討してみると、いくつかの病変が見られたので、０個の病変と記載されるべきではない。これは明らかに記録エラー（ＲＥ）である。しかしながら、１８日目の写真はどれも（全ての領域を図示しているわけではないが）、病変の証拠していない。＊＊２４日目の４３８４の写真を再検討してみると、背中（２１日目に２個の病変しかなかった）にＴＮＴＣの証拠はなかった。病変は、この時点ではっきりと消失していたので、病変総数がＴＮＴＣであった可能性は低く、したがって、２４日目のＴＮＴＣは記録エラーであるように思われる。
【０１０１】
データは、図３５ｂ２でグラフとして見ることができる。
【０１０２】
ワクチンは、ｐＶＡＸ１処置対照群で記録された数え切れないほどの病変数と７５％の死亡率と比較して、病変数を大幅に減少させ、低用量と高用量の両方での死からの１００％の防御をもたらした。病変数が最高に達した時には、ｐＶＡＸ１処置動物の４匹中３匹が数え切れないほどの病変を有し、４匹目の動物にとっては疾患が致死的であった。対照群のサルは１匹だけが曝露を切り抜けて生き残ったが、病変は観察期間の最後(曝露後２７日目)にまだ存在していた。ワクチン接種を受けた動物では、病変は１５日目までに消失し始め、ＩＤ-ＨＤ注射を受けた動物で効果がより顕著であった。２１日目に、６匹中１匹の動物だけが、病変を有していた（４つの病変しか観察されなかった）。観察の最後の日（２７日目）、サル痘病変の兆候を示した動物はいなかった。ＩＤ-ＬＤでの処置によって、６匹中３匹のサルで、２１日目までに痘症がなくなり、２７日目までに全ての動物で病変が完全に消失していた。非ヒト霊長類をＩＭ-ＥＰによって処置した場合には、わずかにより早く治癒の兆候が見えた。２１日目までに、４匹中３匹のサルに病変がなかった。曝露研究の最後に、１匹のサルに病変が２つ残っていた。ＩＭ-ＬＤワクチンによる処置も４匹中１匹のサルで効果的であり、１８日目までに病変がなかった。２１日目までに、１匹のサルに８つの病変があったものの、４匹中３匹のサルには痘症がなかった。観察時間の最後までに、ＩＭ-ＬＤ群の４匹全てのサルに病変がなかった。
【０１０３】
Ｂ．多価ワクチンによって誘発されるウイルス血症レベルの低下
全てのサルが、サル痘ウイルス感染の樹立を示し、ウイルス血症レベルは曝露後６〜９日後に最大に達した（図３５ａ）。ｐＶＡＸ１対照動物は、サル痘疾患の典型的症状を発症し、疾患が重症であったために、４匹中３匹の動物を安楽死させた。ウイルス血症レベルは、７．５対数と８．５対数の間のｐＶＡＸ１ワクチン接種動物で、それぞれ、曝露後９日後と１２日後に最大に達した。曝露を切り抜けて生き残ったサル（＃４３８４）は、ウイルス血症をある程度制御しているように見えた。２１日目に、ウイルス血症レベルは、ＨＤワクチン接種動物を１対数未満しか超えていなかった。対照的に、ワクチン接種を受けた動物については、ウイルス血症レベルが９日目に少なくとも３対数分、有意に低下しており（Ｐ＜０．０５、一方向ＡＮＯＶＡ）、研究の最後には検出不可能なレベル（１ｍＬ当たり＜５０００コピー）しか観察されなかった。１５日目までに、ＩＤ-ＨＤ群の６匹中４匹のサルとＩＭ-ＨＤ群の１００％のサルは、両方のＬＤワクチン接種の場合の５０％と比較して、検出不可能なレベルのウイルス血症を有していた。１８日目までに、両方のワクチン接種群のサルのうちの１匹だけが検出可能なレベルのウイルス血症を有していた。したがって、これらの知見は、サル痘ウイルスのウイルス血症の制御と重症疾患の予防とにおけるＤＮＡワクチンの防御的有効性を示している。
【０１０４】
Ｃ．多価ワクチンによって誘発される抗ＶＡＣＶ抗体の誘導
ＤＮＡワクチンとサル痘ウイルス曝露とで誘導された抗体の検出を、精製され、不活化された全ＶＡＣＶをコーティング抗原として用いるＥＬＩＳＡで測定した（図３６）。ウイルス特異的ＶＡＣＶ特異的抗体の低レベル力価は、ＤＮＡワクチンを受容した動物で２８日目に検出され、動物全てが、ワクチン接種群と投薬量の両方について、１：１００の終点力価を有していた。抗体力価はそれ以降増加し始め、平均終点力価は、９１日目に、ＩＤ-ＨＤ送達経路とＩＭ-ＨＤ送達経路について、それぞれ、１：６３３と１：３００であり、投与量間にはほんのわずかな差しか存在しなかった。曝露後、ワクチン接種を受けたサルで抗ＶＡＣＶ抗体力価の劇的な増加が観察された。ｐＶＡＸ１ワクチン接種動物と比べて約１００倍の増加が、曝露６日後（研究９７日目）に、ワクチン接種を受けたサルで観察され、終点力価は、ＨＤワクチン接種を受けたサルで約１：１０，０００であった。ＬＤをワクチン接種した動物について、より低いかまたは同様の終点力価が観察され、平均終点力価は、ＩＤ注射とＩＭ注射について、それぞれ、１：３６００±１８６７と１：８８００±２４００であった。対照的に、ｐＶＡＸ１処置動物は、曝露後１２日（研究１０３日目）まで顕著な応答を示さず、平均最大終点力価は１：８００であった。曝露を切り抜けて生き残ったサルは、曝露１８日後（研究１０９日目）に、最大終点抗体力価が１：１６００でしかなかった。
【０１０５】
Ｄ．多価ワクチンによって誘発される中和抗体力価の誘導
全ＶＡＣＶに対する結合抗体が同定されたので、インビトロでの機能的ＰＲＮＴアッセイでサル痘ウイルスを中和するその能力を検討し、インビボでのサル痘ウイルス曝露に対する防御におけるワクチンで誘導された抗体の役割を明らかにした。サル痘ウイルス中和抗体力価を様々な群で測定した（表５参照）。
【表５】
＊力価はＰＲＮＴ５０値として表されている。０、２８、および５６日目に、動物にワクチン接種し、９１日目（曝露０日目）に曝露した。９７、１０３、１０９、および１１８日目は、それぞれ、曝露６、１２、１８、および２７日目に対応する。
【０１０６】
曝露前にｐＶＡＸ１処置対照動物から回収した血清は、ウイルスを中和することができなかった。しかしながら、曝露６日後（研究９７日目）、全てのサルが検出可能な力価を示し始めた。曝露を切り抜けて生き残った対照サルは、最大の中和抗体力価を有していた。対照的に、多価ワクチンを接種した動物は、ワクチン接種経路または投薬量に関係なく、２回目のワクチン接種の２週間後（４２日目）に、中程度の中和抗体応答を示し始めた。重要なことに、中和抗体応答は、曝露後、大いにかつ急速に増強された。結果のグラフを図３７に見ることができる。予想通り、ＨＤワクチンは、全ての時点について、ＬＤワクチンよりも大きい抗体応答を誘発した（表５）。
【０１０７】
さらに、中和抗体力価は病変数スコアと相関した（スピアマン順位相関、ノンパラメトリック、Ｐ＜０．００８− 図３８参照）。
【０１０８】
実施例１０
サル痘曝露後の臨床的観察
ｐＶＡＸ１処置動物は、感染の急性期に、顕著な体重損失、体温上昇、鬱、および無気力を経験した。最も顕著な体重損失は、痘痕病変とウイルス血症がピークに達した曝露後１２日目に観察された（表６）。
【表６】
＊曝露６〜２７日目の欄内の数は、０日目と比較した体重変化％として表されている。
体重は０日目の欄に示されている。
【０１０９】
曝露１２日目、平均体重損失は８．７３％であった（体重損失は、曝露前の体重と比較して、５．６〜１１．１％の範囲である）。群内で生き残った１匹のサル（＃４３８４）は、最終的には体重が回復したが、曝露後２１日目までは回復しなかった。対照的に、ワクチン接種動物は、曝露後にそれほどの体重損失を経験しなかった。体重損失は、ＨＤワクチン接種動物でよりも両方のＬＤワクチンで処置した動物でより顕著であった。ＩＤ-ＨＤワクチンで処置した動物については、体重変動が曝露後１２日目に観察され、平均損失は、曝露前の体重に対して１．３４％であった。この同じ日、ＩＭ経路でワクチン接種した動物は、曝露前の体重に対して１．７％の体重増加を経験した。ＬＤワクチンを接種した動物は、ＨＤワクチン接種動物について観察された体重損失よりも大きい体重損失を経験した。ＩＤワクチン接種とＩＭワクチン接種について、動物は、それぞれ、２．９％±１．３と６．０％±２．３８という平均±標準誤差損失を経験した。
【０１１０】
ｐＶＡＸ１処置動物については、曝露１２日後まで体温上昇が観察された（データは示さない）。最大の体温上昇は、曝露後３日目に観察され、平均温度は華氏１０３．１度（範囲：華氏１０１．５〜１０４．４度）であった。曝露を切り抜けて生き残ったサルは、２７日目までに正常体温を有していた。予想通り、ワクチン接種を受けたサルの温度は、ワクチン接種経路と投薬量に関係なく、曝露期間中ずっと変動した。しかしながら、ワクチン接種動物の平均温度は、曝露期間中、正常体温（華氏９９〜１０２度）の範囲内に維持された（データは示さない）。
【０１１１】
臨床パラメータ：研究期間中の全血数（ＣＢＣ）モニタリングは、サル痘曝露の間、わずかな血液学的パラメータの変化しか示さなかった。サル痘疾患のために安楽死させた対照動物は、ウイルス血症レベルがピークに達した１２日目に、曝露前のレベルと比較して、５８．２％（＃４４０３、１μＬ当たり１１，５００対１８，２００）、６５．６％（＃４３９２、１μＬ当たり６，１００対１０，１００）、および１２１％（＃４３９３、１μＬ当たり８，６００対１９，０００）という増加した白血球（ＷＢＣ）を有していた。ワクチン接種動物は、１２日目に、同じ程度まで増加したＷＢＣ数も有しており、平均増加パーセントは、曝露前のレベルに対して、ＩＤ-ＬＤ、ＩＤ-ＨＤ、ＩＭ-ＬＤ、ＩＭ-ＨＤについて、それぞれ、６９．４±１５．８、６８．８±１５．６、８０．９±１７．２、７０．０±２８．０であった。研究の終わりまでに、各群のほとんどのワクチン接種動物は、ＷＢＣ数を曝露前のレベルにまで復帰させたが、対照群由来の生き残ったサルは、１μＬ当たり２２，３００の増加したＷＢＣ数を有し続けた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドとを含む、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を生じさせることができるＤＮＡワクチン。
【請求項２】
Ａ４Ｌ抗原を発現することができるプラスミドをさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項３】
各々の前記抗原が別々のＤＮＡプラスミドによって発現される、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４】
前記ＶＡＣＶ ＭＶ抗原が、Ａ２７Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、またはＬ１Ｒを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５】
前記ＶＡＣＶ ＥＶ抗原が、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、またはＢ５Ｒを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項６】
前記ＤＮＡプラスミドが、前記抗原をコードするコンセンサスＤＮＡ配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項７】
ＶＡＣＶ ＭＶ抗原をコードする前記コンセンサスＤＮＡ配列が、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１５（Ｌ１Ｒ）を含む、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項８】
複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる前記ＤＮＡプラスミドが、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１６（Ｌ１Ｒ）を含む配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項９】
ＶＡＣＶ ＥＶ抗原をコードする前記コンセンサスＤＮＡ配列が、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、または配列番号９（Ａ５６Ｒ）を含む、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１０】
複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる前記ＤＮＡプラスミドが、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、または配列番号１０（Ａ５６Ｒ）を含む配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１１】
Ａ４Ｌをコードする前記コンセンサスＤＮＡ配列が、配列番号１、または配列番号２の配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１２】
前記ＤＮＡワクチンが、それぞれ、配列番号１（Ａ４Ｌ）、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、配列番号９（Ａ５６Ｒ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、および配列番号１５（Ｌ１Ｒ）というコードＤＮＡ配列を含む複数の別々のＤＮＡプラスミドを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１３】
前記ＤＮＡワクチンが、それぞれ、配列番号２（Ａ４Ｌ）、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、配列番号１０（Ａ５６Ｒ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、および配列番号１６（Ｌ１Ｒ）という配列を有するタンパク質をコードするコードＤＮＡ配列を含む複数の別々のＤＮＡプラスミドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１４】
前記ＤＮＡワクチンが、ＤＮＡプラスミドｐＧＸ４００１、ｐＧＸ４００２、ｐＧＸ４００３、ｐＧＸ４００４、ｐＧＸ４００５、ｐＧＸ４００６、ｐＧＸ４００７、もしくはｐＧＸ４００８、またはそれらの組合せを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１５】
各々の前記ＤＮＡプラスミドが、５０μｇを超える用量で存在する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１６】
各々の前記ＤＮＡプラスミドが、１２５μｇの用量で存在する、請求項１５に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１７】
ＩＬ-８、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２８、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１ｐ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、もしくはＭＥＣ、またはそれらの組合せから選択されるアジュバントをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１８】
前記アジュバントが、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-２８、またはＲＡＮＴＥＳである、請求項１７に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１９】
前記ＤＮＡワクチンが、天然痘ウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を生じさせることができる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項２０】
中和抗体応答を含む、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を誘導する方法であって、前記哺乳動物の組織に、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、Ａ４Ｌを発現することができるＤＮＡプラスミドとを含むＤＮＡワクチンを注射する工程を含む方法。
【請求項２１】
前記注射する工程が、皮内に注射する工程または筋肉内に注射する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
電気穿孔量の電気エネルギーを用いて前記組織を電気穿孔する工程をさらに含む、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記電気穿孔する工程が、前記組織に定電流を送達する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記電気穿孔する工程が、０．２Ａの電流を送達する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記注射する工程を繰り返す工程をさらに含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡプラスミドが、配列番号１（Ａ４Ｌ）、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、配列番号９（Ａ５６Ｒ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１５（Ｌ１Ｒ）の配列を有するコード配列を含む、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡプラスミドが、配列番号２（Ａ４Ｌ）、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、配列番号１０（Ａ５６Ｒ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１６（Ｌ１Ｒ）の配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含む、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記送達する工程が、８つの別々のＤＮＡプラスミドを送達する工程を含む、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記８つの別々のＤＮＡプラスミドが、ｐＧＸ４００１、ｐＧＸ４００２、ｐＧＸ４００３、ｐＧＸ４００４、ｐＧＸ４００５、ｐＧＸ４００６、ｐＧＸ４００７、およびｐＧＸ４００８を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、天然痘ウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を誘導する、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１】
複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドとを含む、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を生じさせることができるＤＮＡワクチン。
【請求項２】
Ａ４Ｌ抗原を発現することができるプラスミドをさらに含む、請求項１に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項３】
各々の前記抗原が別々のＤＮＡプラスミドによって発現される、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項４】
前記ＶＡＣＶ ＭＶ抗原が、Ａ２７Ｌ、Ｆ９Ｌ、Ｈ３Ｌ、またはＬ１Ｒを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項５】
前記ＶＡＣＶ ＥＶ抗原が、Ａ３３Ｒ、Ａ５６Ｒ、またはＢ５Ｒを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項６】
前記ＤＮＡプラスミドが、前記抗原をコードするコンセンサスＤＮＡ配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項７】
ＶＡＣＶ ＭＶ抗原をコードする前記コンセンサスＤＮＡ配列が、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１５（Ｌ１Ｒ）を含む、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項８】
複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる前記ＤＮＡプラスミドが、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１６（Ｌ１Ｒ）を含む配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項９】
ＶＡＣＶ ＥＶ抗原をコードする前記コンセンサスＤＮＡ配列が、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、または配列番号９（Ａ５６Ｒ）を含む、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１０】
複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる前記ＤＮＡプラスミドが、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、または配列番号１０（Ａ５６Ｒ）を含む配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１１】
Ａ４Ｌをコードする前記コンセンサスＤＮＡ配列が、配列番号１、または配列番号２の配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む、請求項６に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１２】
前記ＤＮＡワクチンが、それぞれ、配列番号１（Ａ４Ｌ）、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、配列番号９（Ａ５６Ｒ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、および配列番号１５（Ｌ１Ｒ）というコードＤＮＡ配列を含む複数の別々のＤＮＡプラスミドを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１３】
前記ＤＮＡワクチンが、それぞれ、配列番号２（Ａ４Ｌ）、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、配列番号１０（Ａ５６Ｒ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、および配列番号１６（Ｌ１Ｒ）という配列を有するタンパク質をコードするコードＤＮＡ配列を含む複数の別々のＤＮＡプラスミドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１４】
前記ＤＮＡワクチンが、ＤＮＡプラスミドｐＧＸ４００１、ｐＧＸ４００２、ｐＧＸ４００３、ｐＧＸ４００４、ｐＧＸ４００５、ｐＧＸ４００６、ｐＧＸ４００７、もしくはｐＧＸ４００８、またはそれらの組合せを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１５】
各々の前記ＤＮＡプラスミドが、５０μｇを超える用量で存在する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１６】
各々の前記ＤＮＡプラスミドが、１２５μｇの用量で存在する、請求項１５に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１７】
ＩＬ-８、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-１８、ＩＬ-２８、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＭＩＰ-１ｐ、ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、もしくはＭＥＣ、またはそれらの組合せから選択されるアジュバントをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１８】
前記アジュバントが、ＩＬ-１２、ＩＬ-１５、ＩＬ-２８、またはＲＡＮＴＥＳである、請求項１７に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項１９】
前記ＤＮＡワクチンが、天然痘ウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を生じさせることができる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＤＮＡワクチン。
【請求項２０】
中和抗体応答を含む、ポックスウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を誘導する方法であって、前記哺乳動物の組織に、複数のＶＡＣＶ ＭＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、複数のＶＡＣＶ ＥＶ抗原を発現することができる少なくとも１つのＤＮＡプラスミドと、Ａ４Ｌを発現することができるＤＮＡプラスミドとを含むＤＮＡワクチンを注射する工程を含む方法。
【請求項２１】
前記注射する工程が、皮内に注射する工程または筋肉内に注射する工程を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
電気穿孔量の電気エネルギーを用いて前記組織を電気穿孔する工程をさらに含む、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記電気穿孔する工程が、前記組織に定電流を送達する工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記電気穿孔する工程が、０．２Ａの電流を送達する工程を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記注射する工程を繰り返す工程をさらに含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＤＮＡプラスミドが、配列番号１（Ａ４Ｌ）、配列番号３（Ａ２７Ｌ）、配列番号５（Ｂ５Ｒ）、配列番号７（Ａ３３Ｒ）、配列番号９（Ａ５６Ｒ）、配列番号１１（Ｆ９Ｌ）、配列番号１３（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１５（Ｌ１Ｒ）の配列を有するコード配列を含む、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡプラスミドが、配列番号２（Ａ４Ｌ）、配列番号４（Ａ２７Ｌ）、配列番号６（Ｂ５Ｒ）、配列番号８（Ａ３３Ｒ）、配列番号１０（Ａ５６Ｒ）、配列番号１２（Ｆ９Ｌ）、配列番号１４（Ｈ３Ｌ）、または配列番号１６（Ｌ１Ｒ）の配列を有するタンパク質をコードするコード配列を含む、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記送達する工程が、８つの別々のＤＮＡプラスミドを送達する工程を含む、請求項２６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記８つの別々のＤＮＡプラスミドが、ｐＧＸ４００１、ｐＧＸ４００２、ｐＧＸ４００３、ｐＧＸ４００４、ｐＧＸ４００５、ｐＧＸ４００６、ｐＧＸ４００７、およびｐＧＸ４００８を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記方法が、天然痘ウイルスに対する哺乳動物での防御免疫応答を誘導する、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５−１】
【図３５−２】
【図３５−３】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５−１】
【図３５−２】
【図３５−３】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【公表番号】特表２０１１−５２２８０４（Ｐ２０１１−５２２８０４Ａ）
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１１８０７（Ｐ２０１１−５１１８０７）
【出願日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５４２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４４９１９
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（５１０３１２１１２）ブイジーエックス ファーマシューティカルズ， エルエルシー (2)
【出願人】（５０４０７４７１０）ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア (20)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年８月４日（２０１１．８．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年５月２８日（２００９．５．２８）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４５４２０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／０４４９１９
【国際公開日】平成２２年４月２２日（２０１０．４．２２）
【出願人】（５１０３１２１１２）ブイジーエックス ファーマシューティカルズ， エルエルシー (2)
【出願人】（５０４０７４７１０）ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア (20)
【Ｆターム（参考）】
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